Крылов А.С., Хорлин А.А., Гроховский С.Л., Жузе А.Л

Доклады
Академии н а у к
СССР
1980. Том 254, № 1
УДК 547.963.3
БИОХИМИЯ
А.С. КРЫЛОВ, А.А.ХОРЛИН, С.Л. ГРОХОВСКИЙ, А.Л. ЖУЗЕ,
А.С. ЗАСЕДАТЕЛЕВ, Г.В. ГУРСКИЙ, Б.П. ГОТТИХ
СИНТЕТИЧЕСКИЕ ЛИГАНДЫ, СПОСОБНЫЕ "УЗНАВАТЬ"
АТ-ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ДНК,
ОБЛАДАЮЩИЕ ОСЬЮ СИММЕТРИИ ВТОРОГО ПОРЯДКА
(Представлено академиком В.А. Энгельгардтом 15 IV 1980)
Выяснение стереохимических основ "узнавания" регуляторными белками
определенных последовательностей нуклеотидов в двойных спиралях нуклеиновых
кислот является одной из центральных задач молекулярной биологии. В системах,
моделирующих процесс белковонуклеинового узнавания, находят применение
низкомолекулярные вещества, обладающие сродством к определенным коротким
последовательностям оснований в ДНК ( 1 , 2 ) . Эти соединения являются также объек­
тами самостоятельного изучения, так как они служат в качестве конкурентных ин­
гибиторов специфического связывания регуляторных белков с соответствующими
последовательностями оснований в ДНК.
Среди этих соединений наиболее изученными являются антибиотики дистамицин А (ДМ) и нетропсин (НТ), преимущественно связывающиеся с последова­
тельностями ДНК, содержащими подряд 4 или 3 АТ-пары соответственно. Моле­
кулярная структура комплексов ДМ и НТ с ДНК была предложена и подтверждена
экспериментально ( 3 , 4 ) . Эта структура является в настоящее время общепризнан­
ной и пока — наиболее обоснованной пространственной структурой комплекса
ДНК-лиганд ( 5 ) . В соответствии с установленным авторами механизмом "узнава­
ния" олигопирролкарбоксамидный остов молекул ДМ и НТ локализуется при свя­
зывании в узкой бороздке, образуя спираль, изогеометричную В-форме ДНК. При
этом АТ-специфичность связывания достигается посредством образования водо­
родных связей между атомами азота амидных групп антибиотиков и атомами кис­
лорода О2 тиминов, а также атомами азота N3 аденинов, выходящими в узкую
бороздку ДНК ( 3 ) .
В настоящей работе, исходя из структурных параметров комплексов НТ и
ДМ с ДНК, предложен и осуществлен синтез соединений I ( а - в ) , представляющих
по своей структуре 2 молекулы НТ, симметрично соединенные между собой цепоч­
кой, содержащей определённое число метиленовых звеньев (рис. 1). Все соединения
были испытаны на наличке АТ-специфичности при связывании ДНК. При этом ре­
шались следующие задачи: во-первых, продемонстрировать к изучить возможность
создания соединений, состоящих из 2 молекул антибиотика, соединенных, гибкой
цепочкой; во-вторых, увеличить число АТ-пар, "узнаваемых" молекулой антибио­
тика (поскольку непосредственное увеличение длины пирролкарбоксамидного осто­
ва приводит к повышенной неустойчивости таких соединений ( 6 ) ; и, наконец,
в-третьих, получить соединения, моделирующие реальные репрессоры своей спо­
собностью избирательно связываться с последовательностями ДНК, обладающими
осью симметрии второго порядка. Последнее свойство синтезируемых соединений
обусловливается тем, что. связанные с ДНК молекулы ДМ и НТ образуют водород­
ные связи лишь с основаниями одной нити двойной спирали, причем из модельных
234
Рис. 1. Химические структуры синтезированных соединений и нетропсина (НТ)
Рис. 2. Схематическое представление комплексов с ДНК соединения IIа или НТ (а) и соединений типа I (б)
Рис. 3. Спектры молярного поглощения НТ (1) и соединения Iб (2) в свободном состоянии
(сплошная линия) и в комплексе с ДНК (штриховая линия)
построений следует, что направление СО -> NH амидных связей антибиотика совпа­
дает с 5' -> 3' направлением полинуклеотидной нити. При этом следует учесть, что
СО -> NH направления амидных связей обеих половинок синтезированных соеди­
нений взаимопротивоположны, т.е. все синтезированные соединения обладают осью
симметрии второго порядка (рис. 1 и 2 ) .
Синтез соединений 1а, 1б, 1в был осуществлен, исходя из соединения II и диN-оксисукцикимидных эфиров адипиновой, пробковой и декандикарбоновой кислот
соответственно. Конденсацию проводили в диметилформамиде, активированный
эфир и вещество II вводили в реакцию в соотношении 0,5 : 1,05. Выделение и очистку
соединений 1 (а—в) выполняли методом гель-хроматографии в метаноле на колонке
с сефадексом LH-20 ("Pharmacia", Швеция). После двухкратной гель-фильтрации
получали вещества, гомогенные по данным электрофореза (1 М СН3СООН, рН 2,4)
к тонкослойной хроматографии.
Спектры поглощения снимались на спектрофотометре "Сагу-118" (США),
спектры к.д. — на дихрографе фирмы "Jobin-Ivon", модель III (Франция), а флуо235
Рис. 4. Молярный дихроизм ^е315 соединения Iб (1) и НТ (2), связанных с поли(dА)•по­
ли(dT) (темные кружки) и тимусной ДНК (светлые кружки), в зависимости от количества
добавленного лиганда в расчете на пару основами полимера, r. Пересечения штриховых ли­
ний с осью абсцисс указывают значения r = r т а х соответствующие насыщающим уровням свя­
зывания лигандов с поли (dА)•поли(dТ). Число L пар оснований ДНК, накрываемых связан­
ной молекулой лиганда, рассчитывается по формуле L = 1/rтах Для НТ rтах = 0,2 и соответст­
венно L = 5 пар оснований, для соединения Iб rтах = 0,1 и L =10 пар оснований ДНК
ресцентные измерения проводили на приборе "AMINCO SPF-1000" (США). Все
эксперименты проводили в 0,06 М фосфатном буфере рН 5,9, t = 20 °С. Концентра­
ция нуклеиновой кислоты была ~ 3 • 1 0 - 5 М пар оснований. Использовалась ДНК
из тимуса теленка ("Sigma", США) и п о л и ( d А ) • п о л и ( d T ) ("P-L Biochemicals", С Ш A ) .
Спектры поглощения соединения Iб и НТ приведены на рис. 3. Спектр Iб
очень близок к спектру поглощения НТ по форме, но амплитуда спектра Iб в
2 раза больше. Такая аддитивность спектров обоих хромофоров соединения Iб
свидетельствует о том, что в растворе молекула Iб находится в относительно рас­
тянутой конформации и оба нетропсиновых фрагмента молекулы не. взаимодей­
ствуют друг с другом. Из спектров поглощения соединений Iб и НТ, приведенных
ка рис. 3, видно, что в присутствии ДНК форма спектра соединения Iб меняется,
причем изменения в спектре аналогичны тем, которые наблюдаются при связыва­
нии НТ с ДНК. То же самое имеет место и при связывании с ДНК соединений
Ia и Iв.
На рис. 4 приведены зависимости амплитуды к.д. в 315 нм при титровании
поли(dA)•поли(dТ) соединениями Iб и НТ. В свободном состоянии в растворе
все исследуемые соединения не имеют дихроизма. При связывании с ДНК или с
поли(dА)•поли(dТ) молярный дихроизм НТ ^е315 = 40, а при связывании соеди­
нения Iб эта величина в 2 раза больше. Обнаружейная аддитивность спектров к.д.
свидетельствует о том, что не только в свободном состоянии, но и при связывают
с ДНК оба нетропсиновых фрагмента молекулы Iб ведут себя независимо. Можно
заключить, таким образом, что каждая из частей молекулы соединения Iб образует
с ДНК комплекс, близкий по своей структуре к структуре изученного ранее комп­
лекса НТ-ДНК ( 3 , 7 ) . Об этом же свидетельствует и измеренное соотношение разме­
ров участков ДНК, занимаемых связанными молекулами НТ и соединения Iб. Как
следует из значений насыщающих уровней связывания, молекула НТ занимает на
поли(dA)•поли(dT) 5 пар оснований, а молекула соединения Iб — 10,5 ± 0,5 пар
236
оснований (рис. 4 ) . Из аналогичных кривых титрования было установлено, что
соединения Iа и Iв занимают на ДНК 10,0 ± 0,5 и 11,5 ± 0,5 пар оснований соответ­
ственно, т.е. фрагмент цепочки из 4 метиленовых звеньев накрывает одну пару
оснований ДНК. Таким образом, все соединения типа Т занимгют при связывании
приблизительно опин виток двойной спирали ДНК.
Как следует из рис. 4, АТ-специфичные лиганды НТ и Iб имеют меньший
насыщающий уровень при связывании с тимусной ДНК (58% АТ-пар), по сравне­
нию со связыванием с поли(dА)•поли(dT). Отношение значения г, при котором
наступает насыщение ДНК, к значению, при котором наступает насыщение поли(dА)•
•поли(dT), характеризует степень специфичности связывания каждого соединения,
причем чем меньше такое отношение, тем выше специфичность связывания ( ' , 8 ) .
Для НТ и соединения Iб эти отношения равны 0,9 и 0,55 соответственно. Следова­
тельно, соединение Iб является специфичным к большему числу АТ-пар, чем НТ.
Аналогичные данные были получены и для соединений Iа и 1в.
Изучение конкуренции за связывающие места на поли(dА)•поли(dT) меж­
ду соединением Iб и несущим дансилькую (Dns) группу флуоресцентным аналогом
НТ (На), константа связывания которого составляет 2 • 1 0 6 М - 1 ( 2 ) , показало,
что последний вытесняется при титровании комплекса соединением Iб. Полное
вытеснение наблюдается, если 1 молекула лиганда Iб приходится на 10 пар основа­
ний. Этот эксперимент свидетельствует о том, что лиганд Iб занимает на ДНК те же
связывающие места, что и НТ, т.е. он присоединяется к АТ-парам по узкой бороздке
ДНК. Одновременно, из этих данных можно оценить, что константа связывания
соединения Iб с поли(dА)•поли(dT) превосходит константу связывания соеди­
нения IIа по крайней мере в 100 раз.
Ранее нами было показано, что свободная энергия связывания аналогов ДМ
зависит линейно от числа амидных групп в молекуле, причем присоединение каж­
дого пирролкарбоксамидного фрагмента к АТ-паре в поли(dА)•поли(dT) приво­
дит к изменению свободной энергии на 2 ккал/М ( 2 ) . Энергия связывания анало­
гов ДМ с поли(dA-dT)•поли(dA-dT) оказались очень близкими по величине к
энергии их связывания с поли(dА)•поли(dT). На основании этих экспериментов
можно заключить, что константа связывания соединений типа I с поли(dА)•по­
ли(dT) должна быть равна по порядку величины квадрату константы связывания
каждой половинки молекулы, т.е. квадрату константы связывания лигандов типа
НТ или соединения IIа. Проведенная оценка дает для константы связывания соеди­
нений типа I значение ~ 10 1 2 М-1, что соответствует по порядку величины констан­
9
те связывания lac репрессора с lac оператором ( ) .
Таким образом, полученные к настоящему времени экспериментальные
данные свидетельствуют о том, что оба нетропсиновых фрагмента соединений ти­
па I в комплексе с ДНК взаимодействуют с основаниями и связаны друг с другом
осью симметрии второго Порядка. Предварительные эксперименты, а также рас­
смотрение молекулярных моделей свидетельствуют в пользу того, что соедине­
ния 1(а—в) взаимодействуют преимущественно с последовательностями типа
где отдельные точки символизируют основания ДНК, с которыми исследуемые
соединения не образуют специфических связей, причем у соединения Iв k = 3, а у
соединений Iа и Iб к = 2. Таким образом, изменяя длину гибкой цепочки, можно
регулировать расстояние между частями молекулы соединений типа I, ответствен­
ными за узнавание АТ-пар. Однако соединения типа I могут связываться, хотя и
менее прочно, с аналогичными последовательностями, в которых АТ-пары заме-
237
нены на ТА, поскольку атом кислорода O2 тимина и атом азота N3 аденина зани­
мают в двойной спирали ДНК геометрически эквивалентные положения и обла­
2
дают примерно одинаковой способностью к образованию водородной связи ( ) .
Институт молекулярной биологии
Академии наук СССР, Москва
Поступило
29 IV 1980
ЛИТЕРАТУРА
1
G.V. Gursky, A.S. Zasedatelev et al., FEBS 12th Meeting, Dresden, 1978, v. 51, N.Y., 1979,
2
3
p. 23.
A.S. Krylov, S.L. Grokhovsky et a!., Nucl. Acids Res., v. 6, 289 (1979).
A.C. Заседате4
лее, АЛ.Жузе и др., ДАН, т. 231, 1006 (1976).
A.S. Zasedatelev, A.L. Zhuze et al., Studia Biophysica, v. 67, 47 (1978). s J.C. Martin, R.M. Wartell, D.C.O'Shea, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, v. 75,
5483 (1978). 6 P. Chandra, F. Zunino et al., FEBS Lett., v. 21, 154 (1972). 7 A.S. Zasedatelev,
G.V. Gurskv et al., Mol. Biol. Rep., v. 1, 337 (1974). 8 A.S. Zasedatelev, G.V. Gursky, M.V. Volkenstein, Studia Biophys., v. 40, 79 (1973). 9 W. Gilbert, B. Muller-Hill, Proc. Nat. Acad. Sci. USA,
v. 58, 2415 (1967).