Схема коннекторного метода получения гибридных молекул ДНК

С 1970 года начинается беспрецендентный рост медицинских
инноваций, отражающих растущее понимание молекулярных основ
существования здорового организма.
Огромна роль двух революционных технологий в биологии
ГОУ ВПО ЮФУ, каф. биохимии и
микробиологии
3
Технология стала возможной в результате выделения и
биохимической характеристики ферментов, которые бактерии
используют для манипуляций с ДНК.
1.
Эндонуклеазы рестрикции
Образование «липких концов»
Образование «тупых концов»
2.
ДНК –полимеразы
3.
Обратные транскриптазы
4.
Модифицирующие ДНК ферменты (щелочная фосфатаза, полинуклеотидкиназа)
5.
Метод молекулярного клонирования (Увеличение числа копий с определённой
последовательностью ДНК со специальной матрицы)
6.
Применение генетических элементов бактерий (плазмиды и умеренные
бактериофаги с автономной репликацией)
7.
Метод ПЦР
ГОУ ВПО ЮФУ, каф. биохимии и
микробиологии
4
Создание
библиотеки ДНК
Источник ДНК
геномная ДНК
комплиментарная
кДНК
Скрининг
библиотеки
ГОУ ВПО ЮФУ, каф. биохимии и
микробиологии
5
Эндонуклеазы
рестрикции,
рестриктазы
(от
лат.
restrictio
—
ограничение) — группа ферментов, относящихся к классу гидролаз,
катализирующих реакцию гидролиза нуклеиновых кислот.
1.
В отличие от экзонуклеаз, рестриктазы расщепляют нуклеиновые
кислоты не с конца молекулы, а в середине. При этом каждая
рестриктаза узнаёт определённый участок ДНК длиной от четырёх
пар нуклеотидов и расщепляет нуклеотидную цепь внутри участка
узнавания или вне его.
2.
Защита бактериального генома от собственной рестриктазы
осуществляется с помощью метилирования нуклеотидных остатков
аденина и цитозина (маскирование).
3.
К 2007 году выделено более трех тысяч эндонуклеаз рестрикции.[3]
Более шестисот рестриктаз доступны в виде коммерческих
препаратов и повседневно используются в лабораториях для
модификации ДНК и решения генно-инженерных задач.[4][5][6]
ГОУ ВПО ЮФУ, каф. биохимии и
микробиологии
7
Выделяют три основных типа (или класса) ферментов рестрикции, сайты узнавания для которых
могут быть симметричными (палиндромными) и несимметричными:
1.
Рестриктазы первого типа (например, ЕсоK из Escherichia coli К12) узнают определённую
последовательность нуклеотидов и разрезают двухцепочную молекулу ДНК неподалёку от этой
последовательности в произвольной точке и само место разреза не строго специально
2.
Рестриктазы второго типа (например, EcoRI) узнают определённую последовательность и
разрезают двойную спираль ДНК в определённой фиксированной точке внутри этой
последовательности. Рестриктазы этого типа узнают палиндромальные последовательности,
которые обладают центральной осью и считываются одинаково в обе стороны от оси симметрии.
3.
Рестриктазы
третьего
промежуточного
типа
(например,
EcoPI)
узнают
нужную
последовательность и разрезают двухцепочную молекулу ДНК, отступив определённое число
нуклеотидных пар от её конца (или в нескольких точках на разном удалении от сайта узнавания).
При этом образуются фрагменты ДНК либо с ровными (тупыми) концами, либо с выступающими
(липкими) 5'- или 3'-концами. Эти рестриктазы узнают асимметричные сайты.
ГОУ ВПО ЮФУ, каф. биохимии и
микробиологии
8
Сайт узнавания и разрезания для рестриктирующей эндонуклеазы EcoR1
Разрезание происходит в два этапа: сначала гидролизуется одна цепь, потом – другая. При обычных
условиях
продуктами
реакции
являются
два
дуплексных
фрагмента
с
комплементарными
одноцепочечными концами. В условиях, способствующих стабилизации водородных связей между
четырьмя нуклеотидами из разных цепей, фрагменты могут реассоциировать.
ГОУ ВПО ЮФУ, каф. биохимии и
микробиологии
9
Группа рестриктирующих эндонуклеаз типа 2, разрезающих палиндромные последовательности с
образованием липких концов.
Фермент
Сайт узнавания и
разрезания
Фермент
BamH1
Hind2
BclI
Hinf1
BglI
Hpa2
ClaI
MboI
Sau3A
EcoR1
Msp1
Hae2
Noti
ГОУ ВПО ЮФУ, каф. биохимии и
микробиологии
Сайт узнавания и
разрезания
10
Группа рестриктирующих эндонуклеаз типа 2, разрезающих палиндромные
последовательности с образованием тупых концов.
Фермент
Сайт узнавания и разрезания
AluI
HaeIII
HpaI
SmaI
ГОУ ВПО ЮФУ, каф. биохимии и
микробиологии
11
Специфические фрагменты, образующиеся при расщеплении ДНК какой-либо
рестриктазой, легко разделить с помощью электрофореза в полиакриламидном геле.
ГОУ ВПО ЮФУ, каф. биохимии и
микробиологии
12
Подробная рестрикционная карта плазмиды рBR 322.
ГОУ ВПО ЮФУ, каф. биохимии и
микробиологии
13
ГОУ ВПО ЮФУ, каф. биохимии и
микробиологии
14
Два фрагмента ДНК с тупыми концами
соединяют между собой, присоединив к ним
по
концам
poly(dA)
или
poly(dT).
Эти
комплементарные одноцепочечные участки
спариваются между собой, а для заполнения
остающихся
пробелов
и
ковалентного
соединения фрагментов можно использовать
соответствующие ферменты.
ГОУ ВПО ЮФУ, каф. биохимии и
микробиологии
15
Схема коннекторного метода получения гибридных
молекул ДНК
ГОУ ВПО ЮФУ, каф. биохимии и
микробиологии
16
Схема рестриктазно - лигазного метода получения
гибридных молекул ДНК
ГОУ ВПО ЮФУ, каф. биохимии и
микробиологии
17
Схема линкерного метода получения гибридных молекул ДНК
1.
Клонирование кДНК с использованием BamН1линкеров. К концам двухцепочечной кДНК
присоединяют BamHI-линкеры, которые затем
расщепляют с помощью BamHl/
2.
Эту же рестриктазу используют для расщепления pBR322.
3.
Липкие концы в кДНК и в месте расщепления
плазмиды комплементарны, что позволяет
встроить данную кДНК в плазмиду.
ГОУ ВПО ЮФУ, каф. биохимии и
микробиологии
18
1. Фаги (фаг лямбда)
2. Плазмиды (плазмида pBR322)
3. Космиды (позволяют встраивать фрагменты ДНК до 40000 п.н.)
4. Дрожжевые искусственные хромосомы (Способны нести вставки более 1 МБ.
Отрицательные стороны – тенденция к включению в себя химерных вставок (ДНК из
нескольких неприлегающих участков генома)
5. Бактериальные искусственные хромосомы (ВАС) и искусственные
хромосомы (РАС). (Включают вставки до 200-300 тыс. п. н)
ГОУ ВПО ЮФУ, каф. биохимии и
микробиологии
19
ГОУ ВПО ЮФУ, каф. биохимии и
микробиологии
20
Высокомолекулярную геномную ДНК
фрагментируют путём частичного
гидролиза рестриктирующей
эндонуклеазой или физическими
методами. Фрагменты встраивают в
плазмидный вектор и вводят полученную
рекомбинантную ДНК в популяцию
бактерий, получая геномную библиотеку.
ГОУ ВПО ЮФУ, каф. биохимии и
микробиологии
21
Синтез двухцепочечной кДНК на мРНК.
1.
С ро1у(А)-«хвостом» мРНК гибридизуют корогкий
фрагмент oligo(dT). Этот фрагмент служит затравкой для
обратной транскриптазы, которая использует мРНК в
качестве матрицы для синтеза комплементарной цепи
ДНК.
2.
Образующаяся при этом кДНК заканчивается шпилькой.
мРНК разрушают обработкой NaOH и эта шпилька служит
затравкой для ДНК-полимеразы I, которая завершает
синтез второй цепи ДНК.
3.
Затем шпильку расщепляют нуклеазой S1, в результате
чего получается двухепочечная молекула кДНК.
ГОУ ВПО ЮФУ, каф. биохимии и
микробиологии
22
ГОУ ВПО ЮФУ, каф. биохимии и
микробиологии
23
ГОУ ВПО ЮФУ, каф. биохимии и
микробиологии
24
cos-Сайты ДНК фага лямда клонируют в плазмиде
pBR322; при этом ген устойчивости к тетрациклину
остается интактным.
Эукариотическую ДНК частично гидролизуют какой-либо
рестриктазой, в результате чего образуются крупные
фрагменты.
Эти фрагменты лигируют с клонированными в плазмиде
cos-сайтами.
После этого добавляют экстракт из зараженных фагом
лямда бактерий, детерминирующий упаковку фаговой
ДНК; присутствующие в нем ферменты узнают
фрагменты эукариотической ДНК длиной 35-45 kb,
фланкированные cos-сайтами, выщепляют их и
упаковывают в фаговые головки.
Более короткие фрагменты эукариотической ДНК не
упаковываются.
ГОУ ВПО ЮФУ, каф. биохимии и
микробиологии
25
Сиквенс-специфический
скрининг
Функциональный
скрининг
Осуществляется путём гибридизации с
использованием меченого ДНК или РНК-зонда,
или ПЦР
Саузерн-блоттинг
(ДНК-зонд)
Нозерн-блоттинг
(РНК-зонд)
Гибридизация in situ
Экспрессионная
библиотека
Продукция белка
Иммунологический
скрининг
Получение
экспрессионной
библиотеки кДНК
Продукция белков
клонами
Взаимодействие
антитела и белка
Тестирование функций
белка
ГОУ ВПО ЮФУ, каф. биохимии и
микробиологии
28
ГОУ ВПО ЮФУ, каф. биохимии и
микробиологии
30
Фаза генетического и
физического
картирования
Усовершенствование
технологий:
Картирования
Клонирования
Секвенирования
Биоинформатики
ПРОЕКТ ELSI
Фаза секвенирования
генома
Фаза аннотирования
генома
Секвенирование
модельных организмов:
Escherichia coli
Saccharomyces cerevisiae
Caenorhabditis elegans
Drosophila melanogaster
Mus musculus
Секвенирование генома
человека
ГОУ ВПО ЮФУ, каф. биохимии и
микробиологии
31
Цели проекта:
1.
Изучение этических, правовых и социальных последствий картирования и
секвенирования генома человека
2.
Доведение до сведения и разъяснения отдельным людям и всему обществу
значение картирования и секвенирования генома человека
3.
тимулирования публичного обсуждения проблем
4.
Разработка правовой базы, в том числе тактических приёмов, гарантирующих
использование получаемой научной информации во благо отдельного человека и
общества в целом
5.
Этическое, правовое и социальное сопровождение проектов КАРТИРОВАНИЯ ОНП
и КАРТИРОВАНИЯ ГАПЛОТИПОВ
ГОУ ВПО ЮФУ, каф. биохимии и
микробиологии
32
Последовательности геномов ЛЮБЫХ двух неродственных человеческих индивидуумов идентичны лишь
на 99,9% и 0,1% генома является уникальным.
Генетические
мутации
Полиморфизм
последовательностей ДНК
Однонуклеотидные
полиморфизмы (ОНП, SNP)
95%
ГОУ ВПО ЮФУ, каф. биохимии и
микробиологии
Полиморфизм простых
повторов (ППП, SSRPs)
5%
33
Мозаичная кодирующая область
Ген
Экзоны
Интроны
Фланкирующие нетранслируемые
последовательности (5` и 3` - НТП)
1.
Средний размер экзона эукариот – 300 п. н.
2.
Размер интрона превышает экзон от 2 до 10 раз
3.
Среднее число экзонов в геноме человека - 8,8
4.
Средний размер интрона 3365 п. н.
5.
Средняя длина гена человека 27 т.п.н. (Исключение! Ген белка
титина: размер гена 81 т.п.н, длина экзона 17,1 т.п.н, количество
интронов 178)
1.
«Эгоистичная» ДНК.
2.
Наличие альтернативного сплайсинга, т. е. в одних случаях интрон
проявляет себя как экзон, в других как кодирующая единица.
3.
В интроне могут находится промоторы транскрипции.
4.
В одном из интронов расположен другой ген («ген в гене»)
Молекулярные
механизмы сплайсинга
Белковый
(ферментативный сплайсинг)
Аутосплайсинг
Структурнофункциональные
типы сплайсинга
Внутримолекулярный
цис-сплайсинг
Альтернативный
сплайсинг
Образование
изотипов или
изоформ белков
(ферментов)
Межмолекулярный
(транс-сплайсинг)
Образование ковалентных
связей между фрагментами
ДНК, синтезированными на
разных генах
45
46
47
48
49
IS-элементы – это сегменты ДНК, способные
как целое перемещаться из одного участка
локализации в другой. IS – элементы
содержат лишь те гены, которые необходимы
для их собственного перемещения –
транспозиции.
Транспозон – сегмент ДНК, обладающий теми
же свойствами, что и IS – элементы, но
содержащие также гены, не имеющие
непосредственного отношения к транспозиции
(гены устойчивостик антибиотикам, гены
токсинов…)
50
Aspergillus fumigatus
Candida
Нобелевский лауреат, биолог Дэвид Балтимор, предложил свою схему классификации вирусов,
основываясь на различиях в механизме продукции мРНК. Эта система включает в себя семь основных
групп:[8
(I)
Вирусы, содержащие двуцепочечную ДНК и не имеющие РНК-стадии
(например, герпесвирусы, поксвирусы, паповавирусы, мимивирус).
(II)
Вирусы, содержащие двуцепочечную РНК (например, ротавирусы).
(III)
Вирусы, содержащие одноцепочечную молекулу ДНК (например, парвовирусы).
(IV)
Вирусы, содержащие одноцепочечную молекулу РНК положительной полярности
(например, пикорнавирусы, флавивирусы).
(V)
Вирусы, содержащие одноцепочечную молекулу РНК негативной или двойной полярности ( (
(например, ортомиксовирусы, филовирусы).
(VI)
Вирусы, содержащие одноцепочечную молекулу РНК и имеющие в своем жизненном цикле
стадию синтеза ДНК на матрице РНК, ретровирусы (например, ВИЧ).
(VII) Вирусы, содержащие двуцепочечную ДНК и имеющие в своем жизненном цикле стадию синтеза
ДНК на матрице РНК, ретроидные вирусы (например, вирус гепатита B).
Пути возникновения ассоциаций
между причинным
однонуклеотидным
полиморфизмом и конкретным
гаплотипом.
Наследование HLA – гаплотипов. Обычно гаплотип передаётся как единое целое и
очень редко родитель передаёт ребёнку рекомбинантный гаплотип.
Наследование HLA – гаплотипов. Обычно гаплотип передаётся как единое целое и
очень редко родитель передаёт ребёнку рекомбинантный гаплотип.