012884 - 1 - Область техники, к которой относится изобретение

012884
Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к фармакологии и медицине, в частности к эндокринологии, и может быть
использовано для получения препарата инсулина для перорального применения.
Предшествующий уровень техники
Инсулин является полипептидным гормоном с молекулярной массой около 6000. Он оказывает
влияние на все виды обмена веществ в организме: повышает проникновение глюкозы в ткани организма
и ее использование ими, снижает содержание гликогена в печени и повышает его количество в мышцах,
повышает интенсивность синтеза белка и т.д.
Основным способом введения инсулина в организм человека являются подкожные или внутримышечные инъекции препарата. Попытки введения инсулина наиболее физиологическим и удобным для
больных пероральным путем (через рот) оказались безуспешными, поскольку инсулин легко гидролизуется пищеварительными ферментами с потерей активности.
Преимущества перорального инсулина по сравнению с инъекционными коммерческими формами
очевидны, поскольку длительные ежедневные инъекции могут вызывать различные серьезные осложнения: сопровождаются болевыми синдромами; приводят к развитию липодистрофии, представляющей не
только косметический дефект, но и вызывающей потребность в увеличении доз гормона; травмируют
психику, особенно у детей; вызывают стрессовые состояния, приводящие к еще более выраженной гипергликемии, что, в свою очередь, увеличивает потребность в гормоне и т.д.
Известен препарат инсулина перорального назначения, представляющий собой водно-масляную
микроэмульсию, состоящую из инсулина, липидов и протеазного ингибитора. Микроэмульсия покрывается затем карбоксиметилцеллюлозой (Y.W. Cho, M. Flynm, Lancet, 1989, 30, p. 1518)
Существенным недостатком этого препарата, наряду с трудоемкой и дорогостоящей технологией
изготовления, является использование в качестве носителя карбоксиметилцеллюлозы, которая подвержена воздействию микробов, особенно в условиях промышленного производства. Кроме того, целлюлоза
способна сорбировать значительные количества белка, который необходимо отмывать буфером с высокой ионной силой. Проведение такой процедуры в больших масштабах является дорогостоящим и может
приводить к значительной инактивации инсулина.
Известен способ получения препарата инсулина для перорального применения путем инкубации
инсулина с эритроцитами, взятых в соотношении 1-4:100 в присутствии многофункционального связующего агента, в конечной концентрации 0,15-0,25%. При этом обычно в качестве носителя используют
эритроциты, выделенные из крови крупного рогатого скота, свиней или крови человека, а в качестве связующего агента используют преимущественно бромистый циан, хлористый цианур или глутаровый диальдегид (патент РФ № 2058788, кл. А61К 38/28, оп. 27.04.96). Перед использованием препарат эмульгируют в воде.
Недостатком известного способа являются высокая токсичность связующих агентов и связанная с
этим необходимость в дорогостоящей очистке конечного продукта.
Известен способ получения препарата инсулина в виде геля для перорального применения путем
иммобилизации инсулина в объеме сшитого полимера, модифицированного ингибитором протеолитических ферментов (R.Z. Creenley, et al. Polymer Matrices for orol delivery, Polymer Preprits, 1990, V.31, № 2,
p. 182-183). В качестве сшитого полимера используют акриловую или метакриловую кислоты, сшитые
триэтиленгликоль-ди(мет)акрилатом, а в качестве ингибитора протеолитических ферментов используют
апротенин - панкреатический ингибитор трипсина.
Недостатком этого способа является невысокая устойчивость полученного препарата к действию
пищеварительных ферментов, следствием чего является низкая активность проникающего в кровь инсулина.
Наиболее близким к заявляемому способу-прототипу является способ получения препарата инсулина в виде геля путем иммобилизации инсулина в объеме сшитого полимера, модифицированного ингибитором протеолитических ферментов, в качестве которого используют овомукоид из яичного белка в
концентрации 0,2-25 мг/г (набухшего в воде гидрогеля). Иммобилизацию проводят путем погружения
сшитого модифицированного полимера в водный раствор инсулина с концентрацией 0,01-5 мг/мл на
1-2 ч до полного набухания полимера. Модифицированный полимер используют в количестве 0,01-1,0 г
на 1 мл раствора инсулина (патент РФ № 2066551, кл. А61К 38/28, оп. 20.09.96).
Недостатками известного способа являются технологическая сложность выделения овомукоида и
получение сшитого полимера, им модифицированного, дороговизна и низкая терапевтическая эффективность получаемого препарата.
Сущность изобретения
Технической задачей предлагаемого изобретения является упрощение и удешевление способа получения препарата инсулина для перорального применения, а также повышение его терапевтической
эффективности путем иммобилизации инсулина на водорастворимом полимере. Определяющим отличием заявляемого способа, по сравнению с прототипом, является то, что инсулин модифицируют полимером, активированным ионизирующим излучением, что позволяет упростить способ и повысить терапевтическую эффективность препарата. При облучении в ходе радиационно-химического окисления в поли-1-
012884
мере образуются высокоактивные карбонильные группы. Активированный таким способом полимер образует с инсулином водорастворимый комплекс, который эффективно снижает уровень глюкозы при пероральном введении. Вследствие высокой растворимости в водных растворах комплекс инсулина с полимером полностью всасывается в кровь без диффузионных ограничений. Примеры полимеров включают, но ими не ограничиваются, декстраны, поливинилпирролидон, изопренолы, полиакриламид, полиуретан.
Наилучший вариант осуществления изобретения
Техническая задача достигается предлагаемым способом, заключающимся в следующем.
Готовят 1-50% водный раствор полиэтиленоксида с молекулярной массой от 0,4 до 40 кДа. Затем
раствор облучают высокоэнергетическим ионизирующим излучением, преимущественно гаммаизлучением или потоком ускоренных электронов в дозах, обеспечивающих протекание свободнорадикальных реакций, преимущественно 1,0-5,0 Мрад. Далее в раствор радиационно-активированного
полиэтиленоксида вводят инсулин до конечной концентрации (по белку) от 1-10 мг/мл (или по активности инсулина 10-100 МЕ/мл соответственно) в соотношении полиэтиленоксид:инсулин, равном (1-500):1,
смесь перемешивают в течение 10-30 мин до получения однородного прозрачного или слегка опалесцирующего раствора.
Использование овомукоида в качестве ингибитора протеаз в способе-прототипе позволяет защитить
инсулин от протеолитических ферментов, а полиакриламидный гель выполняет функцию депонирования
модифицированного инсулина. При частичном проникновении в кровь через стенку кишечника инсулин
целенаправленно не депонируется в печени, так как не обладает сродством к органам ретикулоэндотелиальной системы и в связи с этим его действие будет аналогичным действию инсулина при парентеральном введении. Напротив, инсулин, модифицированный радиационно-активированным полимером, проявляет свойства базального инсулина, то есть его фармакологический эффект максимально приближен к
физиологическому механизму. Этому способствует полимер, обладающий способностью захватываться
клетками печени.
Полученный технический результат не был очевиден из известных научно-технических данных о
свойствах указанных полимеров и инсулина, так как в результате модификации инсулина радиационноактивированным полимером могла бы произойти полная потеря специфической гипогликемической активности инсулина за счет изменения его конформации и взаимодействия с инсулиновым рецептором
клеток. Однако заявляемый способ позволяет не только сохранить специфическую гипогликемическую
активность препарата инсулина, но и обеспечивает максимально физиологический механизм его действия за счет того, что активированный полимерный носитель образует с инсулином химически лабильные
связи и используется только в качестве транспортирующего носителя инсулина в клетки печени, где и
происходит высвобождение нативного инсулина.
Примеры.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного получения препарата инсулина.
Пример 1.
10% водный раствор полиэтиленоксида с молекулярной массой 1,5 кДа облучают потоком ускоренных электронов в дозе 5,0 Мрад. В облученный раствор вносят инсулин до конечной концентрации 10 мг
в 1 мл (соотношение полиэтиленоксид:инсулин равно 10:1). Смесь перемешивают 10 мин и получают
препарат инсулина в виде слегка опалесцирующего раствора. Выход готового продукта составляет 98%.
Пример 2.
50,0% водный раствор полиэтиленоксида с молекулярной массой 0,4 кДа облучают тормозным
гамма-излучением в дозе 1,0 Мрад. В облученный раствор вносят инсулин до конечной концентрации
1 мг в 1 мл (соотношение полиэтиленоксид:инсулин равно 500:1). Смесь перемешивают 30 мин и получают препарат инсулина в виде прозрачного раствора. Выход готового продукта составляет 97%.
Пример 3.
5% водный раствор полиэтиленоксида с молекулярной массой 15 кДа облучают потоком ускоренных электронов в дозе 2,5 Мрад. В облученный раствор вносят инсулин до конечной концентрации 10 мг
в 1 мл (соотношение полиэтиленоксид:инсулин равно 5:1). Смесь перемешивают 15 мин и получают препарат инсулина в виде слегка опалесцирующего раствора. Выход готового продукта составляет 99%.
В табл. 1 представлены результаты исследования гипогликемического действия на интактных крысах линии Wistar комплекса инсулина с радиационно-активированным полиэтиленоксидом. В опытной
группе экспериментальным животным внутрижелудочно однократно введено по 1 мл модифицированного полиэтиленоксидом свиного инсулина (состав: 30 МЕ/мл свиного инсулина, 12,5 мас.% радиационноактивированного полиэтиленоксида 1500, соотношение полиэтиленоксид:инсулин равно 125:1). В контрольной группе животным однократно внутрижелудочно введено по 1 мл свиного инсулина с активностью 30 МЕ/мл.
-2-
012884
Таблица 1
Как видно из результатов, представленных в табл. 1, модифицированный полиэтиленоксидом инсулин начинает проявлять основную гипогликемическую активность через 3 ч после внутрижелудочного
введения и сохраняет ее до 10 ч. Полученные данные свидетельствуют о приближении действия модифицированного инсулина к базальной секреции инсулина поджелудочной железой.
В табл. 2 представлены данные по исследованию гипогликемической активности модифицированного полиэтиленоксидом человеческого генно-инженерного инсулина на модели аллоксанового диабета
у крыс. В опытной группе экспериментальным животным в/ж однократно введено по 1 мл модифицированного полиэтиленоксидом инсулина (состав: 50 МЕ/мл человеческого инсулина, 12,5 мас.% радиационно-активированного полиэтиленоксида 1500, соотношение полиэтиленоксид:инсулин равно 70:1). В
контрольной группе животным введено по 1 мл человеческого инсулина с активностью 50 МЕ/мл.
Таблица 2
Как видно из представленных результатов, модифицированный инсулин обладает выраженной гипогликемической активностью при в/ж введении крысам с аллоксановой моделью диабета.
В табл. 3 представлены сравнительные данные по влиянию модифицированного полиэтиленоксидом инсулина (соотношение полиэтиленоксид:инсулин равно 70:1) на абсолютные значения уровня инсулина в плазме крови у крыс при однократном в/ж введении. В опытной группе интактным крысам линии Wistar массой 200-240 г в/ж введен модифицированный полиэтиленоксидом человеческий инсулин
из расчета 250 МЕ/кг. В контрольной группе животным было введено в/ж эквивалентное количество не-3-
012884
модифицированного инсулина. Содержание инсулина в плазме крови у крыс (в μЕД/мл) определяли иммуноферментным методом.
Таблица 3
Из данных, приведенных в таблице, видно, что инсулин, модифицированный полиэтиленоксидом,
при в/ж введении либо приводит к повышению уровня инсулина в плазме крови, либо препятствует его
снижению, т.е. модифицированный инсулин максимально приближается к базальному инсулину, секретируемому поджелудочной железой в рамках физиологической нормы.
Заявляемый способ получения препарата инсулина для перорального применения, в отличие от
способа прототипа, отличается простотой и экономичностью, так как его получение состоит всего из
двух стадий, в которых используется полимерный носитель - полиэтиленоксид, технологически простой
способ его активации - воздействие ионизирующего излучения на раствор полимера, а также простой
способ модификации инсулина активированным полимером посредством введения в раствор активированного полимера инсулина до требуемой концентрации (активности). Препарат инсулина, получаемый
заявляемым способом, обладает высокой терапевтической активностью, определяемой как по снижению
концентрации глюкозы в крови, так и по прямому определению уровня инсулина в крови.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ получения препарата инсулина для перорального применения, включающий смешивание
инсулина с водорастворимым полимером, предварительно активированным путем облучения ионизирующим излучением.
2. Способ по п.1, где полимером является полиэтиленоксид с молекулярной массой 0,4-40 кДа и
концентрацией 1,0-50,0%, отношение инсулин:полиэтиленоксид составляет 1:(1-500) до конечной концентрации инсулина в смеси 1-10 мг/мл.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что полиэтиленоксид активируют путем облучения потоком
ускоренных электронов или гамма-излучением в дозах 1,0-5,0 Мрад.
Евразийская патентная организация, ЕАПВ
Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
-4-