Ферменты морских организмов и перспективы их использования
реклама
Биоорганическая химия Вестник ДВО РАН. 2014. № 1 УДК 577.112.6 + 579.69 В.А. РАССКАЗОВ Ферменты морских организмов и перспективы их использования в медицине и биотехнологии Приведены результаты исследований свойств ряда гидролитических ферментов морских организмов, способных расщеплять основные клеточные биополимеры, такие как полисахариды, белки и нуклеиновые кислоты. Выявлены наиболее перспективные из них для практического применения в медицине и биотехнологии. Даны примеры использования ферментов морского происхождения в медицине и биотехнологии. Ключевые слова: ДНКаза из гепатопанкреаса камчатского краба, высокоактивная щелочная фосфатаза из морской бактерии Cobetia marina, эндо-1,3-β-D-глюканазы из двустворчатых моллюсков, гликозидгидролазы из морских бактерий, применение в медицине и биотехнологии. Enzymes of marine organisms and prospects of their application in medicine and biotechnology. V.A. RASSKAZOV (G.B. Elyakov Pacific Institute of Bioorganic Chemistry, FEB RAS, Vladivostok). The paper contains the results of the studies of properties of some hydrolytic enzymes of marine organisms capable of breaking down the main cellular biopolymers such as polysaccharides, proteins and nucleic acids. The most promising ones to find practical applications in medicine and biotechnology have been identified. The examples of the application of some marine enzymes in medicine and biotechnology are shown. Key words: DNAse from hepatopancreas of Kamchatka crab, high-potency alkaline phosphatase from the marine bacterium Cobetia marina, endo-1,3-β-D-glucanase from bivalves, glycosylhydrolases from the marine bacteria, application in medicine and biotechnology. Значительный интерес морских биохимиков к гидролитическим ферментам морских организмов вызван исключительно важной их ролью в морской жизни. Способность гидролаз расщеплять основные клеточные биополимеры, такие как полисахариды, белки и нуклеиновые кислоты, определяет не только их регуляторную функцию в метаболизме клеток, но также их прямое включение в процессы утилизации экзогенных биополимеров различными сообществами морских организмов. Для понимания процессов, определяющих продуктивность Мирового океана, крайне необходимо выяснение путей круговорота органических фосфора, азота и углерода в морских биологических сообществах. В связи с этим весьма актуально изучение молекулярных механизмов утилизации нуклеиновых кислот, являющихся, в силу своей распространенности, одним из основных источников органических фосфора, азота и углерода в морских экосистемах. Установление ключевой функции нуклеаз (ДНКаз, РНКаз), фосфатаз и нуклеозидкиназ в процессах деполимеризации и биосинтеза нуклеиновых кислот в бактериальных и эукариотических клетках предполагает возможное участие этих ферментов утилизации нуклеиновых кислот в морских биологических сообществах. Исходя из этого для выяснения молекулярных механизмов круговорота органических фосфора, азота и углерода в морских экосистемах необходимым этапом является изучение свойств, специфичности и биологической роли указанных ферментов. РАССКАЗОВ Валерий Александрович – кандидат биологических наук, заместитель директора по научной работе (Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН, Владивосток). E-mail: [email protected] 61 Другая причина значительного внимания биотехнологов к подобным ферментам – возможность их применения в качестве новых катализаторов для различных биотехнологических процессов. В этом случае ферменты морского происхождения должны обладать рядом преимуществ в сравнении с хорошо известными ферментами, а именно: иметь уникальные свойства и специфичность, быть более устойчивыми к воздействию вредных факторов, таких как температура или соленость. Признано, что одно из важных условий для практического применения ферментов – доступность и дешевизна источников для их изоляции. С этой точки зрения морские организмы являются весьма перспективным источником для производства ферментов в связи с возможностью их постоянного воспроизводства методами марикультуры, что определяет экономические выгоды процесса. Методической основой для выяснения функции нуклеаз, фосфатаз, нуклеозидкиназ в утилизации нуклеиновых кислот в морских экосистемах является установление общих закономерностей между распространением, свойствами и специфичностью разных типов ферментов и особенностями метаболизма нуклеиновых кислот у этих организмов, изучение природы ингибиторов и активаторов ферментативной активности, механизмов индукции и сопряженности биосинтеза отдельных ферментов у морских макроорганизмов и симбионтных микроорганизмов. Не меньший интерес к выделению и исследованию свойств новых высокомолекулярных нуклеаз и фосфатаз определяется большой перспективой их использования в генной инженерии, биотехнологии и медицине. Проведенные в Тихоокеанском институте биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН исследования показали, что одним из перспективнейших источников для выделения вышеуказанных ферментов являются морские гидробионты и морские микроорганизмы. В настоящее время в институте получена предварительная информация о свойствах и специфичности основных типов ферментов метаболизма нуклеиновых кислот морских организмов. Систематические исследования свойств ДНК деполимеризующих ферментов морских беспозвоночных, находящихся на различных этапах эволюционного развития, показали, что в их тканях наиболее широко представлены два типа эндодезоксирибонуклеаз, а именно: активируемые ионами двухвалентных металлов с оптимумом рН в щелочной области, так называемые щелочные ДНКазы, и кислые металлонезависимые ДНКазы [19]. Предварительное изучение свидетельствует о том, что наиболее перспективными источниками для препаративного выделения Ca2+, Mg2+-зависимых ДНКаз и в то же время одной из наиболее интересных в плане изучения специфичности групп ферментов среди щелочных металлозависимых ДНКаз являются эмбрионы морского ежа и гепатопанкреас камчатского краба Paralithodes kamchatica [3, 5]. В отличие от хорошо изученных металлозависимых ДНКаз млекопитающих, в частности панкреатической ДНКазы, Ca2+,Mg2+-зависимые ДНКазы морских беспозвоночных представлены кислыми белками с изоэлектрической точкой при pH 4,0 и молекулярной массой, в 1,5 раза превышающей таковую панкреатической ДНКазы. Отсутствие у этих ферментов способности связываться с Конкавалин А-Сефарозой, как это показано для ферментов группы панкреатической ДНКазы, позволяет предположить, что эти белки не являются гликопротеинами. В отличие от последних Ca2+,Mg2+-зависимые ДНКазы морских беспозвоночных не ингибируются актином G. Таким образом, существенные различия в ряде физико-химических свойств Ca2+,Mg2+-зависимых ДНКаз морского происхождения в сравнении с аналогичными ферментами, полученными из других источников, позволили выделить их в отдельную подгруппу эукариотических металлозависимых ДНКаз [4]. Исследование влияния различных денатурирующих факторов на активность Ca2+,Mg2+-зависимой ДНКазы из гепатопанкреаса краба P. kamchatica показало, что этот фермент отличается довольно высокой термостабильностью и выдерживает нагревание до 100 оС в течение 10 мин [4]. Одной из основных причин выраженной термостабильности 62 фермента является относительно высокое содержание (около 18) дисульфидных мостиков в молекуле этого белка. Дополнительным фактором, определяющим термостабильность этой молекулы, является высокая упорядоченность вторичной структуры фермента, доля β-складчатых элементов в которой составляет 77 % [1, 4]. Детальный анализ способности Ca2+,Mg2+-зависимой ДНКазы из эмбрионов морского ежа гидролизовать природные и синтетические субстраты выявил наличие у этого фермента выраженной специфичности к вторичной структуре субстратов. Фермент обладал способностью гидролизовать только двуцепочечные ДНК и полидезоксинуклеотиды, тогда как одноцепочечные полидезоксинуклеотиды были абсолютно устойчивы к его действию. Ca2+,Mg2+-зависимая ДНКаза, выделенная из гепатопанкреаса камчатского краба, обладает выраженной специфичностью к вторичной структуре ДНК и преимущественно расщепляет двуцепочечные субстраты с В-подобной конформацией сахаро-фосфатного остова. В сотрудничестве с академиком С.А. Лукьяновым (лаборатория молекулярных технологий Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН) установлена первичная структура этого фермента – дуплекс-специфической нуклеазы (DSN от «duplex-specific nuclease»), специфически расщепляющей двуцепочечную ДНК [7]. Уникальная способность Ca2+,Mg2+-зависимой ДНКазы из гепатопанкреаса камчатского краба позволила использовать этот фермент для специфического расщепления одноцепочечных ДНК после гибридизации со специфическими олигонуклеотидами. Более того, тот факт, что фермент расщепляет только совершенные дуплексы величиной не менее десяти нуклеотидов, позволил эффективно использовать его для быстрого анализа однонуклеотидных полиморфизмов в геноме человека. В этом инновационном методе участки геномной ДНК, содержащей однонуклеотидные замены азотистых оснований (SNP сайты), амплифицировались с помощью ПЦР, и полученный продукт смешивался с флуоресцентно-меченным олигонуклеотидным зондом и крабовой ДНКазой. Во время инкубации только полностью спаренный дуплекс между ДНК матрицей и сигнальным зондом расщеплялся ферментом, что сопровождалось появлением специфической флюоресценции [20]. Другой областью применения фермента является нормализация кДНК с целью повышения эффективности поиска редких генов при анализе библиотек кДНК в различных типах клеток. Известно, что разница в уровнях экспрессии генов в различных типах клеток существенно осложняет анализ библиотек кДНК и выявление новых генов в ходе масштабного секвенирования таких библиотек. Использование нормализованных библиотек кДНК, разные виды кДНК в которых имеют приблизительно равную представленность, позволяет значительно повысить эффективность поиска редких генов. Наиболее эффективный подход к созданию нормализованных библиотек основан на том, что при реассоциации денатурированной двухцепочечной кДНК (дц-кДНК) или при гибридизации первой цепи кДНК с комплементарной ей РНК мажорные (высокопредставленные) последовательности переходят в двухцепочечную форму значительно быстрее, чем минорные (редкие). Вследствие этого фракция одноцепочечной кДНК (оц-фракция) становится в значительной мере нормализованной. Таким образом, большинство существующих в настоящее время методов нормализации кДНК включают следующие стадии: (1) получение оц-кДНК (например, путем денатурации дц-кДНК); (2) гибридизация этой кДНК в присутствии комплементарной цепи кДНК или РНК. Во время гибридизации формируются нормализованная оц- и дц-фракция мажорных последовательностей; (3) отделение нормализованной фракции и (4) клонирование нормализованной библиотеки кДНК [6, 20]. Использование Ca2+,Mg2+-зависимой ДНКазы из гепатопанкреаса камчатского краба (ДСН), способной специфически расщеплять дц-ДНК, позволило разработать новый простой и эффективный метод нормализации кДНК, обогащенной полноразмерными последовательностями [6, 23]. 63 Дальнейшие исследования показали, что весьма перспективным источником для поиска новых ДНК- и РНК-деполимераз являются морские грибы. Полученные нами результаты исследования специфичности внеклеточных нуклеаз, продуцируемых морскими грибами, относящимися к 11 родам, а именно: Alternaria, Aspergillus, Aureobasidium, Chaetomium, Fusarium, Gliomastix, Humicola, Penicillium, Scopulariopsis, Wardomyces, Periconia, позволяют предположить не менее важную их функцию в круговороте органического фосфора и азота в Мировом океане. В результате исследований нуклеазной активности 64 изолятов грибов обнаружены более или менее специфичные к одноцепочечной ДНК с высокой удельной активностью по отношению к полиуридиловой кислоте, которые при расщеплении одноцепочечных субстратов образовывали 5’-фосфататнуклеотиды. Дальнейшие исследования свойств внеклеточной нуклеазы, которую выделили из культуральной жидкости морского гриба Penicillium melinii, высеянного из колониальной асцидии, собранной в районе о-ва Шикотан (Охотское море) с глубины 123 м, показали значительное сходство этого фермента с нуклеазами S1-типа [11]. Выявлена тесная корреляция между увеличением активности внеклеточных нуклеаз и скоростью включения Н3 тимидина в высокополимерную ДНК морского гриба P. melinii во время фазы активного роста и спорообразования этих клеток, что позволяет предположить наличие у этих грибов важной функции этого фермента в пополнении нуклеотидного пула в процессе трансформации гифов в воздушный мицелий и конидии в стрессовых условиях окружающей среды [9]. Значительный интерес к ферментам гидролазам морского происхождения определяется возможностью их использования для эффективного разрушения биопленок – одной из наиболее распространенных, в том числе патогенных, форм существования бактерий. Колонии бактерий в биопленках наиболее устойчивы к воздействию неблагоприятных факторов физической, химической и биологической природы по сравнению со свободно плавающими бактериями [22]. Фактором устойчивости биопленок является слизисто-полимерный слой, вырабатываемый сразу после адгезии и представляющий собой сложную смесь макромолекул, в том числе полисахаридов, белков и ДНК. Недавно группа английских ученых успешно использовала подобный нашему фермент – новую нетоксичную ДНКазу NucB из морской бактерии Bacillus licheniformis для удаления бактериальных пленок патогенных бактерий с голосовых связок человека [21]. Неменьший интерес для биохимических исследований представляет обширная группа щелочных фосфатаз морских бактерий. Этот интерес определяется, с одной стороны, их ключевой ролью в метаболизме различных фосфорсодержащих органических соединений в морских экосистемах, а с другой стороны, возможным их использованием для исследования структуры нуклеиновых кислот и получения конъюгатов с антителами для иммунологических исследований. Предварительные исследования показали, что наиболее перспективными продуцентами щелочных фосфатаз являются представители морских бактерий, относящихся к родам Vibrio, Alteromonas и Bacillus. В результате исследований нами выделены три новые щелочные фосфатазы, отличающиеся от аналогичных ферментов наземных бактерий необычайно высокой удельной активностью. Так, удельная активность препаратов щелочных фосфатаз, выделенных из Alteromonas elyakovii KMM 162 и, соответственно, Halomonas marina KMM 296, составляла 6000–6700 и 15000 единиц на 1 мг белка, соответственно. Необходимо отметить, что оба бактериальных продуцента высокоактивных щелочных фосфатаз были выделены из целомической жидкости мидии Grenomytilus grayanus, что предполагает вероятность участия этих ферментов в усиленной наработке неорганического фосфата при росте и формировании раковины. Оба фермента имеют довольно сходные свойства, такие как оптимум pH в диапазоне 9,0–10,0, способность инактивироваться при нагревании при 60 оC в присутствии 10 мМ дитиотриэтола и довольно широкую 64 субстратную специфичность с более выраженной активностью по отношению к адениловым и цитидиловым нуклеотидам [18]. Анализ пространственной структуры щелочной фосфатазы CmAP, полученной на основе кристаллической структуры щелочной фосфатазы из морской γ-протеобактерии Vibrio sp. G15-21 (код PDB 3E2D), выявил структурно-функциональные особенности фермента. Введение мутаций в предполагаемые сайты связывания ионов Mg2+ приводило к потере активности, что подтверждает наличие эндогенного иона Mg2+ в структуре CmAP. На модели пространственной структуры показано, что ион Mg2+ принимает участие в формировании сети водородных связей, пронизывающей всю структуру CmAP. Очевидно, что структурно-функциональные особенности щелочной фосфатазы CmAP можно отнести к адаптивным механизмам выживания в симбиотическом сообществе, возникшим в процессе эволюции для функционирования при пониженных температурах в морской среде [2]. Другое направление исследований, проводимых в лаборатории морской биохимии, – изучение первичной структуры уникальных ферментов и белков, в том числе гликопротеинов – лектинов из морских беспозвоночных и микроорганизмов, и получение рекомбинантных белков на базе технологий рекомбинантных ДНК с привлечением последних достижений генной инженерии с полным циклом работ: от выбора стратегии клонирования индивидуального гена и его химико-ферментативного синтеза до разработки методов выделения, очистки и тестирования целевого белка. Основные усилия сосредоточены на использовании прокариотических штаммов-продуцентов. Результаты исследований лаборатории химии ферментов ТИБОХ ДВО РАН показали, что эндо-1,3-β-D-глюканазы двустворчатых моллюсков Spisula sachalinensis и Chlamys albidus представляют значительный практический интерес, поскольку обработанные с помощью этих ферментов 1,3-β-D-глюканы обладают мощным иммуностимулирующим, противоопухолевым и радиопротекторным действием. Совместно с этой лабораторией нами установлена первичная структура эндо-1,3-β-Dглюканаз двустворчатых моллюсков S. sachalinensis, C. albidus и Patinopecten yessoensis, исследована зависимость между структурной организацией и каталитической активностью эндо-1,3-β-D-глюканаз двустворчатых моллюсков. В настоящее время проводятся исследования возможности получения ферментативно активных рекомбинантных белков с целью использования рекомбинантных эндо-1,3-β-D-глюканаз двустворчатых моллюсков и морских микроорганизмов в биотехнологическом производстве [15–17]. Не менее перспективными для практического применения в медицине и биотехнологии являются другие представители гликозидгидролаз из морских бактерий, широко изучаемые в лаборатории химии ферментов. В частности, показано, что α-N-ацетилгалактозаминидаза, выделенная из новой морской бактерии рода Arenibacter latericius KMM 426T, способна при рН 7,3 инактивировать групповую специфичность эритроцитов крови человека группы А, тогда как α-галактозидаза морской бактерии рода из морской бактерии Pseudoalteromonas sp. КММ 701 инактивирует групповую специфичность B эритроцитов крови человека и прерывает адгезию патогенной бактерии Corinebacterium diphtheria к клеткам буккального эпителия. Исследованиями с привлечением последних достижений генной инженерии нами совместно с лабораторией химии ферментов установлена аминокислотная последовательность двух весьма перспективных для практического применения ферментов морских бактерий: α-N-ацетилгалактозаминидазы, выделенной из новой морской бактерии Arenibacter latericius KMM 426T, а также термолабильной α-галактозидазы из Pseudoalteromonas sp. КММ 701. Разработаны способы получения рекомбинантных гликозидаз морских бактерий Pseudoalteromonas sp. КММ 701 (α-PsGal) и A. latericius (α-AlNaGal) с использованием генетических конструкций в виде рекомбинантных плазмид 40Gal и 40NaGal и трансгенных штаммов Escherichia coli Rosetta(DE3)/40Gal и Rosetta(DE3)/40NaGal, обеспечивающих индуцируемый синтез с высоким и стабильным выходом в периплазму клетки растворимых рекомбинантных белков с гликозидазной 65 активностью. Полученные данные о физико-химических характеристиках и ферментативной активности продуктов экспрессии генов α-PsGal и α-AlNaGal свидетельствуют о соответствии рекомбинантных полипептидов их природным аналогам [8, 10, 14]. Значительные перспективы открывает использование генно-инженерных методов для установления первичной структуры и получения на базе технологий рекомбинантных ДНК уникальных белков, не обладающих ферментативной активностью, но проявляющих другие весьма перспективные для применения в медицине и биотехнологии свойства. Среди них широко исследуемые в ТИБОХ (лаборатория неинфекционного иммунитета) лектины морских беспозвоночных, обладающие общим свойством обратимо и избирательно связываться с углеводами и углеводными детерминантами белков на поверхности клеток. Наиболее изученными лектинами, выполняющими барьерную функцию, являются лектины С-типа, и в частности маннан-связывающие лектины (МСЛ). Установлено, что МСЛ в комплексе с сериновыми протеазами участвуют в активации системы комплемента по лектиновому пути, активизируют фагоцитоз, выступая в роли опсонинов. У представителей беспозвоночных животных структура и функции МСЛ исследованы значительно меньше, чем у позвоночных, несмотря на то что данные лектины обнаружены как у первичноротых (коралловые полипы, моллюски, ракообразные, насекомые), так и у вторичноротых животных (иглокожие, низшие хордовые – асцидии, ланцетник). Вместе с тем МСЛ – часть древней системы защиты, составляющей основу неспецифического иммунитета беспозвоночных и послужившей предшественником сложного иммунитета позвоночных животных. Поэтому исследование системы неспецифического иммунитета беспозвоночных, в частности МСЛ, имеет большое значение для понимания процесса формирования и становления функций этого компонента защитной системы в эволюции Metazoa. Ранее у двух представителей голотурий – Cucumaria japonica и Apostichopus japonicus – обнаружены и охарактеризованы МСЛ, гомологичные МСЛ позвоночных [13]. Исследована биологическая активность этих лектинов, их роль в иммунной защите. Кроме того, показано, что МСЛ A. japonicus задействованы в процессе регенерации пищеварительного тракта после его эвисцерации, что является доказательством наличия у иммунной системы интегративной функции и участия ее компонентов в процессах поддержания структурного гомеостаза организма. В серии предварительных исследований показано наличие лектинной активности целомической жидкости морского ежа Strongylocentrotus nudus по отношению к маннанам – полисахаридам, построенным из остатков маннозы [12]. Методами молекулярного клонирования установлена структура лектина [GenBank, код доступа AAT42221]. На основе наличия у данного белка уникального углевод-распознающего домена, определяющего способность белка распознавать микрогетерогенность гликоконъюгатов раковых и нормальных клеток, разработан новый лектин-иммуноферментный метод для диагностики рака на примере распознавания раковых клеток в вагинальном секрете обследуемых женщин. МСЛ-Т специфически взаимодействует с углеводными цепями раковоэмбрионального антигена (РЭА), обнаруженного в секрете эпителия. Различие в содержании РЭА / РЭА-подобных антигенов в экстрактах эпителиальных секретов обследуемых женщин позволило на ранних этапах с высокой точностью выявить женщин с доброкачественными изменениями и злокачественными новообразованиями. Определение концентрации лектин-связанных структур в эпителиальном секрете – принципиально новый подход при выявлении злокачественных новообразований, требующий дальнейших исследований для получения статистически достоверных данных. Для такого анализа необходимо повышение эффективности наряду с простотой выполнения, что возможно при использовании методов генной и белковой инженерии. Для усовершенствования нового лектин-иммуноферментного метода диагностики рака, основанного на свойстве лектина трепанга определять тонкие структурные различия в углеводных детерминантах раковоэмбриональных или онкофетальных антигенов, нами предложено 66 несколько генно-инженерных бифункциональных химерных конструкций на основе высокоактивной щелочной фосфатазы морской бактерии C. marina и маннан-связывающего лектина дальневосточного трепанга (голотурии) Apostichopus japonicus. Можно надеяться, что дальнейшие исследования структуры и структурных взаимодействий компонентов химерного белка, сохраняющего способность распознавать и специфически связываться с онкомаркерами и проявляющего активность щелочной фосфатазы, позволят оптимизировать экспрессию и правильный фолдинг (сборку) рекомбинантного белка, и это послужит основой для создания недорогого и простого метода ранней диагностики. ЛИТЕРАТУРА 1. Вакорина Т.И., Мензорова Н.И., Рассказов В.А. Исследование конформационной стабильности ДНКазы из гепатопанкреаса краба Paralithodes camtchatica // Биохимия. 1997. Т. 62, № 12. С. 1404–1408. 2. Голотин В.А., Балабанова Л.А., Лихацкая Г.Н., Рассказов В.А. Структурно-функциональные особенности щелочной фосфатазы морской бактерии Cobetia marina // Взгляд в будущее: сб. работ. Всерос. молодеж. конф. (Владивосток, 2013). Владивосток, 2013. С. 30–40. 3. Мензорова Н.И., Зинатуллин Р.Ф., Фаворов В.В., Рассказов В.А. Выделение и исследование свойств Ca,Mg-зависимой эндонуклеазы из гепатопанкреаса краба // Биохимия. 1993. Т. 58, вып. 5. С. 681–691. 4. Мензорова Н.И., Маркова А.В., Рассказов В.А. Высокостабильная Ca, Mg-зависимая ДНКаза из гепатопанкреаса краба // Биохимия. Т. 50, вып. 3. С. 448–456. 5. Мензорова Н.И., Гафуров Ю.М., Рассказов В.А. Исследование свойств щелочной ДНКазы из эмбрионов морского ежа // Биохимия. 1976. Т. 41, № 11. С. 2007–2017. 6. Шагина И.А., Богданова Е.А., Альтшулер И.М., Лукьянов С.А., Шагин Д.А. Использование дуплекс-специфической нуклеазы краба для быстрого анализа однонуклеотидных полиморфизмов и выявления ДНК-мишеней в комплексном продукте ПЦР // Биоорган. химия. 2011. Т. 37, № 4. С. 522–529. 7. Anisimova V.E., Rebrikov D.V., Shagin D.A., Kozhemyako V.B., Menzorova N.I., Staroverov D.B., Ziganshin R., Vagner L.L., Rasskazov V.A., Lukyanov S.A., Shcheglov A.S. Isolation, characterization and molecular cloning of duplex-specific nuclease from the hepatopancreas of the Kamchatka crab // BMC Biochem. 2008. Vol. 9. P. 14–25. 8. Bakunina I.Yu., Nedashkovskaya O.I., Balabanova L.A., Zvyagintseva T.N., Rasskasov V.A., Mikhailov V.V. Comparative analysis of glycoside hydrolases activities from phylogenetically diverse marine bacteria of the Arenibacter genus // Mar. Drugs. 2013. Vol. 11, N 6. P. 1977–1998. 9. Balabanova L.A., Gafurov Y.M., Pivkin M.V., Terentyeva N.A., Likhatskaya G.N., Rasskazov V. An extracellular S1-type nuclease of marine fungus Penicillium melinii // Mar. Biotechnol. 2012. Vol. 14. P. 87–95. 10. Balabanova L.A., Bakunina I.Y., Likhatskaya G.N., Zvyagintseva T.N., Rasskazov V.A. Glycoside hydrolases of marine bacteria are promising tools in haemotherapy // BIONATURE 2011: The Second Intern. Conf. on Bioenvironment, Biodiversity and Renewable Energies (May 22–27, 2011, Venice, Italy). Venice: IARIA, 2011. P. 47–50. 11. Balabanova L.A., Pivkin M.V., Rasskazov V.A. The distribution and substrate specificity of extracellular nuclease activity in marine fungi // Open J. Mar. Sci. 2012. Vol. 2. P. 188–195. 12. Bulgakov A.A., Eliseikina M.G., Kovalchuk S.N., Petrova I.Y., Likhatskaya G.N., Shamshurina E.V., Rasskazov V.A. Mannan-binding lectin of the sea urchin Strongylocentrotus nudus // Mar. Biotechnol. (NY). 2013. Vol. 15, N 1. P. 73–86. 13. Bulgakov A.A., Eliseikina M.G., Petrova I.Yu., Nazarenko E.L., Kovalchuk S.N., Kozhemyako V.B., Rasskazov V.A. Molecular and biological characterization of a mannan-binding lectin from the holothurian Apostichopus japonicus // Glycobiol. 2007. Vol. 17, N 12. P. 1284–1298. 14. Golotin V.A., Balabanova L.A., Bakunina I.Y., Rasskazov V.A. The expression of recombinant aplha-galactosidase of marine bacterium Pseudoalteromonas sp. KMM 701 // 1th Symp. on Marine Enzymes and Polysaccharides (10–17 Dec. 2012, Nha Trang, Vietnam): abstrs book and sci. progr. Nha Trang: VAST, 2012. P. 43. 15. Kovalchuk S.N., Bakunina I.Y., Burtseva Y.V., Emelyanenko V.I., Kim N.Y., Guzev K.V., Kozhemyako V.B., Rasskazov V.A., Zvyagintseva T.N. An endo-(1-->3)-beta-D-glucanase from the scallop Chlamys albidus: catalytic properties, cDNA cloning and secondary-structure characterization // Carbohydr. Res. 2009. Vol. 344, N 2. P. 191–107. 16. Kovalchuk S.N., Sundukova E.V., Kusaykin M.I., Guzev K.V., Anastiuk S.D., Likhatskaya G.N., Trifonov E.V., Nurminski E.A., Kozhemyako V.B., Zvyagintseva T.N., Rasskazov V.A. Purification, cDNA cloning and homology modeling of endo-1,3-beta-D-glucanase from scallop Mizuhopecten yessoensis // Comp. Biochem. Physiol. B. Biochem. Mol. Biol. 2006. Vol. 143, N 4. P. 473–485. 17. Kozhemyako V.B., Rebrikov D.V., Lukyanov S.A., Bogdanova E.A., Marin A., Mazur A.K., Kovalchuk S.N., Agafonova E.V., Sova V.V., Elyakova L.A., Rasskazov V.A. Molecular cloning and characterization of an endo-1,3-beta-D-glucanase from the mollusk Spisula sachalinensis // Comp. Biochem. Physiol. B. Biochem Mol. Biol. 2004. Vol. 137, N 2. P. 169–78. 18. Plisova E.Y., Balabanova L.A., Ivanova E.P., Kozhemyako V.B., Mikhailov V.V., Agafonova E.V., Rasskazov V.A. A highly active alkaline phosphatase from the marine bacterium Cobetia marina // Mar. Biotechnol. 2005. Vol. 7. P. 173–178. 67 19. Rasskazov V.A., Pirozhnikova V.V., Galkin V.V. Some properties and specificity of DNases in marine invertebrates and fishes // Comp. Biochem. Physiol. 1975. Vol. 51B, N 3. P. 343–347. 20. Shagin D.A., Rebrikov D.V., Kozhemyako V.B., Altshuler I.M., Shcheglov A.S., Zhulidov P.A., Bogdanova E.A., Staroverov D.B., Rasskazov V.A., Lukyanov S.А. A novel method for SNP detection using a new duplex-specific nuclease from crab hepatopancreas // Genome Res. 2002. Vol. 12, N. 12. P. 1935–42. 21. Shakir A., ElBadawey M.R., Shields R.C., Jakubovics N.S., Burgess J.G. Removal of biofilms from tracheoesophageal speech valves using a novel marine microbial deoxyribonuclease // Otolaryngology Head Neck Surgery. 2012. Vol. 147, N 3. P. 509–514. 22. Watnick P., Kolter R. Biofilm, city of microbes // J. Bacteriol. 2000. Vol. 182. P. 2675–2679. 23. Zhulidov P.A., Bogdanova E.A., Shcheglov A.S., Vagner L.L., Khaspekov G.L., Kozhemyako V.B., Matz M.V., Meleshkevitch E., Moroz L.L., Lukyanov S.A., Shagin D.A. Simple cDNA normalization using kamchatka crab duplex-specific nuclease // Nucleic Acids Res. 2004 Vol. 32, N 3. P. 37. 68
