УДК 575.28:[578.891:615.281] АНАЛИЗ МУТАЦИЙ

УДК 575.28:[578.891:615.281]
АНАЛИЗ МУТАЦИЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИ К
ПРОТИВОВИРУСНЫМ ПРЕПАРАТАМ ВИРУСА ГЕПАТИТА В НА ТЕРРИТОРИИ
Г.АСТАНА
1
А.П. Кравченко , А.Б. Шевцов 2 , Л.С. Киянбекова3
1
ЕНУ им. Л.Н.Гумилева, 2 Национальный центр биотехнологии РК,
3
РГКП «Центр санитарно-эпидемиологической экспертизы г.Астана»
Республика Казахстан, Астана
[email protected]
Хронический гепатит
В
является глобальной проблемой общественного
здравоохранения [1]. В мире около двух миллиардов человек в течение жизни были
инфицированы вирусом гепатитом В, из них у более 350 миллионов человек инфекция
перешла в хроническое течение [2]. Хроническое течение гепатита В
является
результатом неэффективной борьбы иммунного ответа с вирусом [3]. Вирус гепатита В
(ВГВ) поражает печень как основную цель и может вызывать прогрессивные поражения
печени, приводящие к повышенному риску развития цирроза печени, печеночной
недостаточности и в конечном итоге может привести к гепатакарциноме. В настоящее
время рекомендуется несколько препаратов для лечения пациентов с хроническим
гепатитом В. Эти препараты можно разделить на две основные группы в зависимости от
механизма их действия, а именно иммуномодулирующие препараты, как интерфероны-α,
и противовирусные препараты
(аналоги нуклеозидов и нуклеотидов) - ламивудин,
адефовир, энтекавир, тенофовир и телбивудин [4].
Серьезной проблемой применения нуклеозидных и нуклеотидных аналогов является
развитие к ним резистентности вследствие мутаций вируса, которое приводит к
реактивации
инфекции
и
обострению
заболевания.
Учитывая
то,
что
нуклеозидные/тидные аналоги являются ингибиторами обратной транскриптазы вируса,
развитие резистентности происходит при появлении мутаций в Р-гене. Например,
лечение ламивудином приводит к изменению последовательности аминокислотных
остатков в С регионе Р-гена (YMDD мотиф-тирозин[Y]-метионин[M]-аспартат[D]аспартат[D]). Этот участок является ключевым для фермента и отвечает за захват
нуклеозидов. Чаще всего встречаются два типа мутаций: замена метионина на
валин/изолейцин/серин в позиции rtM204V/I/S и лейцина на метионин в позиции rtL180M.
Мутация rtM204V/I/S является основной и определяет резистентность вируса к
ламивудину, а rtL180M – дополнительной, которая усиливает репликативную активность
мутантного штамма [5]. При лечении адефовиром описаны две основные мутации,
определяющие резистентность к адефовиру, – rtN236T и rtA181V. Кроме того, выделяют
целый ряд других мутаций (rtL80V/I, rtV84M, rtV214A, rtS85A, rtQ215S, rtP237H и
rtN238T/D), которые сочетаются с одной из основных, или, реже – встречаются
изолированно . При лечении энтекавиром описано развитие ряда специфичных для
препарата мутантных штаммов – rtT184S/A/I/L, rtS202G/C и rtM250I/V в регионах В, С и Е
обратной транскриптазы вируса соответственно, а также мутаций, характерных для
лечения ламивудином – rtM204V/I/S и rtL180M. При лечении телбивудином описано
развитие мутаций, аналогичных при использовании ламивудина – rtM204I, rtL180M и
rtL80V/I, поэтому между обоими препаратами существует перекрестная резистентность
[6]. Определение лекарственной устойчивости обеспечивает правильную стратегию
лечения, профилактику резистентности и своевременную модификацию схемы лечения с
учетом резистентности.
Нашей главной целью являлось определение лекарственной резистентности к
противовирусным препаратам вируса гепатита В методом определения нуклеотидной
последовательности полимеразного гена.
Материалы и методы:
Исследование было проведено на 111 образцах ДНК, выделенных из плазмы крови
пациентов, обратившихся на диагностическое обследование в РГКП «Центр санитарноэпидемиологической экспертизы г.Астана». Для амплификации был использован
вложенный (nested) ПЦР с праймерами, описанный D. Vincenti с соавторами [7]. Очистку
ПЦР продуктов проводили ферментативным методом [8]. Определение нуклеотидной
последовательности осуществляли с использованием автоматического генетического
анализатора 3730xl DNA Analyzer,
комплекта реагентов BigDye terminator cycle
sequencing kit v 3.1 и внутренних праймеров. В анализ были включены референтные
последовательности различных генотипов вируса гепатита В, взятые из Gene Bank
http://www.ncbi.nih.gov.
Результаты:
При анализе аминокислотных последовательностей гена полимеразы ВГВ были
обнаружены мутация rtS213T(1,8%;n=2), ассоциированная с развитием лекарственной
устойчивости
при
терапии
ламивудином[9],
мутации
rtQ215S(1,8%;n=2),
rtQ215H(1,8%;n=2), rtQ215P(2,7%;n=3), описанные в литературе как вторичные мутации
резистентности к ламивудину и адефовиру (рис.1). Как показывает исследование AminiBavil-Olyaee S. с соавторами[10], rtQ215 замены в полимеразном гене HBV часто
возникают при хроническом гепатите, даже без экзогенных факторов, rtQ215 замены
вероятнее всего представляют
полиморфизмы, а не мутации резистентности с
клиническими проявлениями.
Рис.1. rtQ215 замены в полимеразном гене HBV
В одном случае была установлена замена тирозина на серин в 184 позиции
rtT184S(1,1%, n=1), которая является определяющей в развитии резистентности к
энтекавиру, обнаружены полиморфизмы rtV214A(1,8%;n=2), rtL229M(1,8%;n=2)
ассоциируемые с развитием резистентности к ламивудину; rtN238D(1,1%, n=1),
rtV207L(1,1%, n=1) ассоциируемые с развитием резистентности к адефовиру.
Выводы
Результаты исследования показали, что распространенность мутаций, описанных в
литературе и достоверно ассоциированных с развитием лекарственной резистентности, у
исследуемых
пациентов в РК
составила 14%(1,1% значимые аминокислотные
замены(n=1) и 12,9% потенциально значимые аминокислотные замены(n=15)).
Полученные данные распространенности резистентности ВГВ к лекарственным
препаратам указывают на необходимость скрининга пациентов на наличие мутаций, что
обеспечит правильную стратегию лечения, профилактику резистентности и
своевременную модификацию схемы лечения.
Список использованной литературы:
1. Safioleas M, Lygidakis NJ, Manti C. Hepatitis B today. Hepatogastroenterology.
2007;54:545–548.
2. Poland GA, Jacobson RM. Clinical practice: prevention of hepatitis B with the hepatitis B
vaccine. N Engl J Med. 2004;351:2832–2838. Doi: 10.1056/NEJMcp041507.
3. Ganem D, Prince. Hepatitis B virus infection–natural history and clinical consequences.
N Engl J Med AM. 2004; 350 1118 1129
4. Bryant ML, Bridges EG, Placidi L, Faraj A, Loi AG, Pierra C, Dukhan D, Gosselin G,
Imbach JL, Hernandez B. et al. Antiviral L-nucleosides specific for hepatitis B virus infection.
Antimicrob Agents Chemother. 2001;45:229–235. Doi: 10.1128/AAC.45.1.229-235.2001.
5. Allen M.I., Deslauriers M., Andrews C.W. et al. Identification and characterization of
mutations in hepatitis B virus resistant to lamivudine.Hepatology, 1998, 27, 1670-1677.
6. Locarnini S., Hatzakis A., Heathcote J. et al. Management of antiviral resistance in
patients with chronic hepatitis B. Antivir Ther., 2004, 9, 679-693.
7. D. Vincenti, M. Solmone, A. R. Garbuglia, F. Iacomi, M. R. Capobianchi. A sensitive
direct sequencing assay based on nested PCR for the detection of HBV polymerase and
surface glycoprotein mutations // Journal of Virological Methods . – 2009. – Vol. 159. –P.
53–57.
8. Werle E., Schneider C., Renner M., Völker M., Fiehn W. Convenient single-step, one
tube purification of PCR products for direct sequencing // Nucleic Acids Res. – 1994. – Vol.
22. - P. 4354-4355.
9. Chaudhuri V., Tayal R., Nayak B. et al. Occult hepatitis B virus infection in chronic liver
disease: full- length genome and analysis of mutant surface promoter // Gastroenterol.
2004. V. 127. P. 1356 – 1371.
10. Amini- Bavil-Olyaee S, Herbers U, Mohebbi SR, Sabahi F, Zali MR, Luedde T, Trautwein
C, Tacke F.// J Hepatol. 2009 Oct;51(4):647-54. Epub 2009 May 27.