ЭКСПЕРИМЕНТаЛЬНЫЕ ИССЛЕдоваНИя

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
УДК: 618.146–006.6:615.28:616.15–018
Исследование влияния химиопрепаратов
на уровень эндогенной интоксикации,
интенсивность свободнорадикального окисления
и мембранный аппарат клеток крови больных
с рецидивами рака шейки матки в опытах in vitro
Е.В. Шалашная, И.А. Горошинская, Г.А. Неродо, Е.А. Гуськова,
Е.И. Сурикова, Л.А. Немашкалова, И.В. Нескубина, П.С. Качесова
ФГУ «Ростовский научно-исследовательский онкологический институт
Федерального агентства по высоким технологиям», г. Ростов-на-Дону
Для расширения представления о механизмах действия аутогемохимиотерапии (высокоэффективного метода аутобиохимиотерапии) были изучены некоторые показатели свободнорадикального окисления и эндогенной интоксикации в плазме
крови 10 больных с рецидивами РШМ I–III стадий процесса до и после инкубации с циклофосфаном и цисплатином, а
также структурно-функциональные показатели мембран лимфоцитов и эритроцитов. Было обнаружено, что инкубация крови
больных с рецидивами РШМ с циклофосфаном и цисплатином приводит к фрагментации белковых молекул с накоплением
токсических продуктов их деградации, вследствие снижения связывающей способности альбумина, что обусловлено ассоциацией химиопрепаратов со связывающими центрами молекулы альбумина. Инкубация крови с цитостатиками вызывает
стимуляцию лимфоцитов, о чем свидетельствует увеличение текучести лимфоцитарных мембран. Преимущественное
связывание химиопрепаратов происходит с мембранами эритроцитов, очевидно, путем встраивания в область липидного
бислоя. Изначальная целостность мембран красных клеток крови у обследуемой категории больных может иметь важное
значение для реализации клинического эффекта аутогемохимиотерапии.
Ключевые слова: аутогемохимиотерапия, эндогенная интоксикация, свободнорадикальное окисление.
STUDY OF THE INFLUENCE OF CHEMOTHERAPY DRUGS ON THE LEVEL OF ENDOGENOUS INTOXICATION,
INTENSITY OF FREE RADICAL OXIDATION AND MEMBRANE APPARATUS OF BLOOD CELLS OF PATIENTS WITH
CERVICAL CANCER RECURRENCE IN VITRO EXPERIMENTS
E.V. Shalashnaya, I.A. Goroshinskaya, G.A. Nerodo, E.A. Guskova, E.I. Surikova, L.A. Nemashkalova,
I.V. Neskubina, P.S. Kachesova
Rostov Research Institute of Oncology of Federal Agency on High Technologies, Rostov-na-Donu
In order to provide a more thorough evaluation of the mechanisms of autohemochemotherapy (high-effective autobiochemotherapy
method), some parameters of free-radical oxidation and endogenous intoxication as well as structural-functional parameters of
lymphocyte and erythrocyte membranes were studied in plasma of 10 patients with stage I-III cervical cancer recurrence before
and after incubation with cyclophosphane and cisplatin. Blood incubation with cyclophosphane and cisplatin was found to result
in protein molecule fragmentation with accumulation of toxic products due to deterioration of binding ability of albumin caused
by association of chemotherapy drugs with binding centers of albumin molecule. Blood incubation with cytostatic agents induces
lymphocytic stimulation. Preferential binding of chemotherapy agents with erythrocyte membranes occurs obviously by means of
building into lipid bi-layer. The initial integrity of blood red cell membranes in the studied patients may be of great importance for
realization of clinical autohemochemotherapy effect.
Key words: autohemochemotherapy, endogenous intoxication, free-radical oxidation.
СИБИРСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ. 2008. №2 (26)
Исследование влияния химиопрепаратов на уровень эндогенной интоксикации ...
Рак шейки матки (РШМ) является одним
из самых распространенных злокачественных
новообразований у женщин [16]. Несмотря
на относительно удовлетворительную (37,8–
58 %) 5-летнюю выживаемость больных РШМ,
достаточно большое число пациенток этой
категории погибают от прогрессирования заболевания, рецидивов и метастазов опухоли [17].
Лечение рецидивов РШМ является сложной
клинической задачей, что обусловлено относительной резистентностью плоскоклеточного
рака к большинству имеющихся цитостатиков,
развитием массивных постлучевых изменений
окружающих тканей, затрудняющих подвод
адекватных доз препарата к опухолевому очагу,
а также вследствие поражения мочевыводящих
путей [8, 15].
В Ростовском научно-исследовательском
онкологическом институте для лечения данной
категории больных применяется метод аутогемохимиотерапии (АГХТ), где в качестве среды
для растворения химиопрепаратов используется
аутокровь больного. В связи с этим представлялось целесообразным исследовать влияние
цитостатиков в опытах in vitro на показатели,
отражающие степень эндогенной интоксикации, интенсивность свободнорадикального
окисления и мембранный аппарат клеток крови
у больных с рецидивами РШМ, что позволит
расширить представление о механизмах действия АГХТ.
Материал и методы
В плазме крови 10 больных с рецидивами
РШМ I–III стадий процесса были изучены
интенсивность перекись-индуцированной люминолзависимой хемилюминесценции [18],
активность церулоплазмина [7], содержание
веществ средней молекулярной массы (МСМ254
и МСМ280) [2], уровень общей и эффективной
концентрации альбумина (соответственно ОКА
и ЭКА) [11], резервная связывающая способность альбумина (ССА=ЭКА/ОКА × 100 %)
[10], коэффициент интоксикации (КИ), рассчитанный как (МСМ254/ЭКА) × 1000 [10], а
также структурно-функциональные показатели
мембран лимфоцитов и эритроцитов – текучесть в области белок-липидных контактов и
липидного бислоя, полярность липидной фазы
51
и погруженность белков в липидный матрикс
мембран [1]. Исследования проводились до и
после инкубации крови с химиопрепаратами
– цисплатином и циклофосфаном, взятыми в
количестве, соотносимом с терапевтической
дозой. Время экспозиции составляло 40 мин,
при температуре инкубации 37ºС. В качестве
контроля использовали показатели 12–18 здоровых женщин, сопоставимых по возрасту с
обследованными больными.
Результаты и обсуждение
До инкубации с химиопрепаратами у больных с рецидивами РШМ большинство изученных показателей характеризовались
значительными изменениями. Так, содержание
МСМ280 на 74,3 % превышало норму, эффективная концентрация альбумина была снижена на
31,5 %, а его связывающая способность, свидетельствующая о степени сорбции токсических
лигандов, – на 31,1 % (табл. 1). Мы полагаем,
что существенный вклад в выявленные нами
метаболические нарушения вносит интенсификация свободнорадикальных процессов у
больных с рецидивами РШМ, на что указывает
увеличение уровня хемилюминесценции в 3,9
раза относительно донорских значений (табл.
1). По данным литературы, активация свободнорадикального окисления при неопластическом
процессе приводит к накоплению в организме
больных эндогенных липопероксидов, продуктов деградации белковых молекул, что вызывает
блокирование или аллостерические изменения
центров связывания на молекуле альбумина,
снижение его комплексообразующей способности и транспортной функции [14]. Снижение
ЭКА у обследуемой категории больных привело
к почти двукратному увеличению коэффициента
интоксикации (табл. 1), что свидетельствует
о глубоком дисбалансе между накоплением и
связыванием токсических лигандов.
Увеличение интенсивности свободнорадикальных процессов у больных с рецидивами
РШМ сопровождалось повышением содержания
церулоплазмина – основного белкового антиоксиданта плазмы крови, в 2,1 раза по сравнению с
нормой (табл. 1). Известно, что церулоплазмин
оказывает мембраностабилизирующее действие
на эритроциты, проявляющееся в повышении
СИБИРСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ. 2008. №2 (26)
Е.В. Шалашная, И.А. Горошинская, Г.А. Неродо, Е.А. Гуськова И ДР.
52
Таблица 1
Показатели эндогенной интоксикации и свободнорадикального окисления
в плазме крови больных с рецидивами рака шейки матки до и после инкубации
с химиопрепаратами
Альбумин
Группы
ОКА,
г/л
ЭКА,
г/л
Контроль
45,3±0,77 43,01±1,11
n=12
До
инкуба- 45,18±1,95 29,47±2,52
ции
p>0,1
p<0,001
n=10
После
инкубации
n=10
39,04±1,3
p<0,001
p1<0,05
16,57±2,4
p<0,001
p1<0,01
МСМ (усл. ед.)
ССА
(ОКА/
ЭКА)
× 100 %
254 нм
280 нм
Коэффициент
интоксикации
(МСМ254/
ЭКА)
×1000
ЦП,
мкМ/л
ХЛ,
имп./6 с
94,8±2,014
0,279±0,004 0,206±0,005
6,56±0,243
0,995±0,054
3310±219
65,38±4,64
p<0,001
0,296±0,01
p>0,1
0,359±0,053
p<0,05
12,19±2,02
p<0,05
2,06±0,19
p<0,001
12825±896
p<0,001
42,45±5,93
p<0,001
p1<0,05
0,4±0,03
p<0,001
p1<0,05
0,325±0,039
p<0,01
p1>0,1
25,89±2,97
p<0,001
p1<0,01
1,57±0,18
p<0,05
0,05<p1<0,1
12914±534
p<0,001
p1>0,1
Примечание: р – достоверность различий по сравнению с контрольной группой, р1 – достоверность различий по сравнению со
значениями до инкубации.
Таблица 2
Показатели структурно-функционального состояния мембран лимфоцитов
и эритроцитов у больных с рецидивами рака шейки матки до и после инкубации
с химиопрепаратами
Лимфоциты
Эритроциты
(у.е. флуоресценции)
(у.е. флуоресценции)
текучесть
текучесть
Группы
погруженбелокбелоклипидный полярность
липидный полярность
ность
липидный
липидный
бислой
бислой
контакт
контакт
Кон0,488±0,021 0,696±0,015 0,930±0,012 0,211±0,01 0,578±0,025 0,356±0,021 1,443±0,013
троль
n=18
До
0,563±0,012 0,540±0,06 0,947±0,03 0,273±0,02 0,575±0,015 0,374±0,015 1,413±0,02
инкубаp<0,01
p<0,05
p>0,1
p<0,05
p>0,1
p>0,1
p>0,1
ции
n=10
После 0,828±0,088 0,745±0,06 0,959±0,03 0,312±0,03 0,569±0,04 0,266±0,026 1,428±0,018
инкубаp<0,01
p>0,1
p>0,1
p<0,01
p>0,1
p<0,01
p>0,1
ции
0,05<p1<0,1
р1<0,05
p1>0,1
p1>0,1
p1>0,1
p1<0,01
p1>0,1
n=10
погруженность
0,215±0,009
0,269±0,03
0,05<p<0,1
0,236±0,02
p>0,1
0,05<p1<0,1
Примечание: р – достоверность различий по сравнению с контрольной группой, р1 – достоверность различий по сравнению со
значениями до инкубации.
СИБИРСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ. 2008. №2 (26)
Исследование влияния химиопрепаратов на уровень эндогенной интоксикации ...
их перекисной резистентности [9]. Возможно,
этим объясняется тот факт, что большинство
структурных показателей мембран эритроцитов
у больных с рецидивами РШМ не отличалось
от нормы, лишь для погруженности белков в
липидный матрикс эритроцитов отмечалась
тенденция к ее увеличению на 25,1 % (табл.
2). В то же время другая картина наблюдалась
в лимфоцитах: текучесть мембран в липидном
бислое была снижена на 22,4 %, а текучесть в
области белок-липидных контактов и погруженность белков в липидный матрикс были увеличены и достоверно превышали уровень доноров
на 15,4 % и на 29 % соответственно (табл. 2).
Тот факт, что негативному воздействию ПОЛ
оказались подвержен в первую очередь мембраны лимфоцитов, может также объясняться
повышенным содержанием свободных жирных
кислот в лимфоцитарных мембранах по сравнению с эритроцитарными [6]. Известно, что
окислительная модификация белковых компонентов мембраны вследствие интенсификации
свободнорадикальных процессов сопровождается изменениями организации мембраны, в том
числе и нарушением подвижности мембранных
полипептидов, повышенной чувствительностью
белков к протеолизу и конформационным изменениям [12]. Именно с этим мы связываем
увеличение текучести мембран лимфоцитов в
области белок-липидных контактов. Снижение
текучести липидного бислоя мембран лимфоцитов, уменьшение подвижности белков в
бислое ингибируют пролиферацию лимфоцитов и приводят к нарушениям в их мембранорецепторных комплексах, что влечет за собой
угнетение функциональной активности этих
иммунокомпетентных клеток [6, 13].
После инкубации крови с цитостатиками
было обнаружено нарастание уровня МСМ254
на 35,1 % по сравнению с фоновыми значениями (табл. 1). Увеличение содержания веществ
средней молекулярной массы мы связываем
с фрагментацией белковых молекул под действием химиопрепаратов. Действительно, нами
были выявлены достоверное снижение общей
концентрации альбумина на 13,6 % и тенденция к
снижению содержания церулоплазмина на 23,8 %
(табл. 1). Также было обнаружено уменьшение
эффективной концентрации альбумина и его
53
связывающей способности на 43,8 % и 35,1 %
соответственно (табл. 1), что свидетельствует о
связывании химиопрепаратов молекулой альбумина. Подобные изменения привели к возрастанию коэффициента интоксикации в 2,1 раза
по сравнению с фоновыми значениями.
Тот факт, что не все центры связывания
молекулы альбумина оказались занятыми,
указывает на преимущественное связывание
циклофосфана и цисплатина с мембранами
эритроцитов. По данным литературы, в присутствии белков определяющую роль в связывании
лекарственных препаратов с эритроцитами
играет величина свободной фракции препаратов в плазме [3]. После инкубации крови с
химиопрепаратами большинство структурных
характеристик мембран красных клеток крови,
за исключением текучести в области липидного
бислоя, остались в пределах нормы (табл. 2).
Снижение текучести мембран эритроцитов в
области липидного бислоя составляло 25,3 %
относительно донорских величин и 28,9 % относительно фоновых значений. Мы полагаем,
что выявленные нами структурные нарушения
происходят за счет встраивания цитостатиков
в липидный бислой мембраны эритроцитов, а
не активации свободнорадикальных процессов,
поскольку интенсивность хемилюминесценции
осталась на прежнем уровне (табл. 1).
При исследовании структурно-функционального состояния мембран лимфоцитов после
инкубации крови с химиопрепаратами было
выявлено, что полярность липидной фазы и
погруженность белков в липидный матрикс
лимфоцитарных мембран достоверно не изменялись по сравнению с фоновыми значениями,
а их текучесть возросла как в области белоклипидных контактов, так и в липидном бислое
на 47,1 % и 38,0 % соответственно (табл. 2).
При этом текучесть в области белок-липидных
контактов возросла на 69,7 % относительно значений у доноров, а в области липидного бислоя
достигла нормальных величин. В связи с тем,
что текучесть клеточных мембран во многом
определяется содержанием в них сфингомиелина [4, 5], то выявленное нами увеличение
текучести мембран лимфоцитов может быть
вызвано расщеплением сфингомиелина под
действием цитостатиков. Обнаруженное нами
СИБИРСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ. 2008. №2 (26)
54
Е.В. Шалашная, И.А. Горошинская, Г.А. Неродо, Е.А. Гуськова И ДР.
увеличение текучести лимфоцитарных мембран
может свидетельствовать о стимуляции этих иммунокомпетентных клеток, поскольку известно,
что активация лимфоцитов непосредственно
связана с процессами, определяющими подвижность мембраны [6].
Таким образом, полученные нами результаты
свидетельствуют о том, что инкубация крови
больных с рецидивами РШМ с циклофосфаном
и цисплатином в используемой концентрации
приводит к фрагментации белковых молекул
с накоплением токсических продуктов их деградации, вследствие снижения связывающей
способности альбумина, что обусловлено ассоциацией химиопрепаратов со связывающими
центрами молекулы альбумина. Исходя из данных нашего исследования, преимущественное
связывание химиопрепаратов происходит с
мембранами эритроцитов, очевидно, путем
встраивания в область липидного бислоя. Мы
полагаем, что изначальная целостность мембран
красных клеток крови у обследуемой категории
больных и стимуляция лимфоцитов в результате
действия химиопрепаратов имеют важное значение для реализации клинического эффекта
аутогемохимиотерапии.
Литература
1. Владимиров Ю.А., Добрецов Г.Е. // Флюоресцентные зонды
в исследовании биологических мембран. М., 1980. 320 с.
2. Габриэлян Н.И., Липатова В.И. // Лаб. дело. 1984. № 3.
С. 138–140.
СИБИРСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ. 2008. №2 (26)
3. Гнеушев Е.Т., Гнеушева И.А. // Экспериментальная и
клиническая фармакология. 1996. Т. 59. № 5. С. 71–75.
4. Дятловицкая Э.В. // Биохимия. 1995. Т. 60, вып. 6. С.
843–850.
5. Дятловицкая Э.В., Кандыба А.Г. // Биохимия. 2006. Т. 71,
№1. С. 17–25.
6. Извекова В.А. // Успехи современной биологии. 1991. Т. 3,
вып. 4. С. 577–590.
7. Колб В.Г., Камышников В.С. Справочник по клинической
химии. Минск, 1982. 326 с.
8. Крейнина Ю.М., Титова В.А., Шипилова А.Н. и др. //
Вопросы онкологии. 2006. Т. 52, № 1. С. 83–88.
9. Кузьмина Е.И., Перетягин С.П., Костина О.В. // Национальная науч.-практ. конф. с междунар. участием «Свободные
радикалы, антиоксиданты и болезни человека». Смоленск, 2001.
С. 43–45.
10. Матвеев С.Б., Спиридонова Т.Г., Клычникова Е.В. и др. //
Клиническая лаб. диагностика. 2003. № 10. С. 52–53.
11. Мельник И.А., Барановский П.В., Нестеренко Л.И. // Лаб.
дело. 1985. № 4. С. 202–204.
12. Новицкий В.В., Рязанцева Н.В., Степовая Е.А. и др. //
Бюллетень сибирской медицины. 2006. № 2. С. 62–69.
13. Русин Е.В., Афонина Г.Б., Брюзгина Т.С., Белый А.В. //
Междунар. симп. в рамках Междунар. выставки «Медицина
и охрана здоровья. Медтехника и аптека». Тюмень, 1997. С.
116–118.
14. Смолякова Р.М., Машевский А.А., Моисеев П.И., Жарков
В.В. // Cибирский онкологический журнал. 2003. № 4. С. 12–16.
15. Тархов А.В. // Материалы Рос. науч.-практ. конф с
междунар. участием «Новые технологии в онкологической
практике». Барнаул, 2005. С. 107.
16. Трушина О.И., Новикова Е.Г. // Российский онкологический журнал. 2005. № 1. С.45–51.
17. Чиссов В.И., Старинский В.В., Петрова Г.В. Злокачественные новообразования в России в 2002 г. (заболеваемость и
смертность). М., 2004.
18. Шестаков В.А., Бойчевская Н.О., Шерстнев М.П. //
Вопросы медицинской химии. 1979. Т. 25, вып. 2. С. 132–137.
Поступила 26.07.07