Текст диссертации - НИИ Фармакологии им. В.В.Закусова
advertisement
МЕДИЦИНСКИЙ РАДИОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР имени А.Ф.ЦЫБА –
филиал федерального государственного бюджетного учреждения «Федеральный медицинский
исследовательский центр имени П.А. Герцена»
(МРНЦ им. А.Ф.Цыба – филиал ФГБУ «ФМИЦ им. П.А. Герцена» Минздрава России)
На правах рукописи
ФИЛИМОНОВА
Марина Владимировна
ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА И РАДИОБИОЛОГИЧЕСКИЕ
ЭФФЕКТЫ ЛИНЕЙНЫХ И ЦИКЛИЧЕСКИХ ПРОИЗВОДНЫХ
ИЗОТИОМОЧЕВИНЫ – КОНКУРЕНТНЫХ ИНГИБИТОРОВ СИНТАЗ ОКСИДА
АЗОТА
14.03.06 – фармакология, клиническая фармакология
03.01.01 – радиобиология
Диссертация
на соискание учѐной степени
доктора биологических наук
Научные консультанты:
доктор медицинских наук,
профессор Е.В. Арзамасцев
доктор медицинских наук,
Л.П. Жаворонков
Обнинск - 2015
2
ОГЛАВЛЕНИЕ
Список терминов, обозначений и сокращений …………….…………..............
4
Введение ………….…………………………………………………..……………...
6
Глава 1. Обзор литературы. Биологические и физиологические функции
оксида азота. NO-синтазы, регулирование их активности в
организме в норме и при патологии …...………………………………..
21
1.1. Свойства, эндогенный синтез и пул оксида азота в организме ................
21
1.2. Семейство синтаз оксида азота …………………………………………...
28
1.3. Биологические и физиологические функции оксида азота ……………..
34
1.3.1. Участие в регуляции тонуса сосудов и других
гладкомышечных клеток …………………..……………………….
36
1.3.2. Участие в регуляции адгезии клеток крови, защите эндотелия,
сократимости и тонуса кардиомиоцитов и скелетных мышц .…..
39
1.3.3. Нейромедиаторные функции …….……..………………………….
42
1.3.4. Участие в ангиогенезе и регенераторных процессах …....………
44
1.3.5. Участие в регуляции процессов апоптоза ……….………….........
47
1.3.6. Участие в иммунных и воспалительных реакциях ………………
48
1.4. Химические субстрат-подобные ингибиторы эндогенного синтеза
оксида азота ………………………………………………………………...
51
Глава 2. Материалы и методы исследований ……………….……………….
70
Глава 3. Химическое строение, токсичность и NOS-ингибирующая
активность изучаемых производных ИТМ ..………….………...………….
88
3.1. Обоснование химической области фармакологического скрининга ......
88
3.2. Химическое строение и физико-химические свойства изучаемых
N,S-замещѐнных производных ИТМ ..........................................................
90
3.3. Токсикологическая характеристика изучаемых соединений ...................
92
3.4. Исследование NOS-ингибирующей активности изучаемых соединений
94
Глава 4. Исследование влияния N,S-замещѐнных ИТМ на сердечнососудистую систему нормотензивных крыс и животных с различными
моделями гипотонических состояний …........................................................
101
4.1. Изучение влияния производных ИТМ на гемодинамику
нормотензивных животных .........................................................................
101
4.2. Изучение влияния производных ИТМ на гемодинамику животных в
состоянии острого тяжѐлого геморрагического шока ............................... 105
4.3. Изучение действия производных ИТМ на гемодинамику крыс на
модели острого эндотоксемического шока …............................................
4.4. Изучение влияния производных ИТМ на гемодинамику крыс при
116
3
гипотонии, вызванной ганглиоблокадой .................................................... 122
4.5. Изучение действия производных ИТМ на гемодинамику крыс с
рефрактерной гипотонией при эндотоксемии ...........................................
125
4.6. Оценка перспективности разработки на основе наиболее активных
производных ИТМ вазопрессорных средств .............................................
129
Глава 5. Исследование радиозащитных свойств изучаемых
N,S-замещѐнных ИТМ ……………………………….………………………..
133
5.1. Радиозащитные свойства и NOS-ингибирующая активность
производных ИТМ ........................................................................................
133
5.2. Показатели противолучевой активности и особенности радиозащитного
действия изучаемых N,S-замещѐнных ИТМ .............................................. 144
5.3. Исследование действия изучаемых производных ИТМ в качестве
средств профилактики осложнений лучевой терапии ..............................
154
5.4. Перспективность применения изучаемых производных ИТМ в
качестве радиозащитных средств и средств профилактики
осложнений лучевой терапии .....................................................................
164
Глава 6. Исследование противоопухолевой и антиметастатической
активности производных ИТМ ……………………………….……………..
168
6.1. Влияние изучаемых соединений на рост и метастазирование
перевиваемой карциномы лѐгких Льюис ...................................................
169
6.2. Исследование механизмов противоопухолевой активности
изучаемых производных ИТМ ....................................................................
174
6.3. Исследование эффективности противоопухолевого действия изучаемых
производных ИТМ при сочетании с радио- и химиотерапией ................. 184
Заключение …………………………………………………..……………………..
189
Выводы …..………………………………………………………...………..............
199
Рекомендации ………………………………………………………………………
201
Перспективы дальнейшей разработки темы …………………………………..
202
Список цитируемой литературы …………………………...……………………
204
4
СПИСОК ТЕРМИНОВ, ОБОЗНАЧЕНИЙ И СОКРАЩЕНИЙ
АД – артериальное давление;
АДс, АДд – систолическое и диастолическое
АД, соответственно;
Апоптоз – I тип гибели клеток, основной
тип генетически запрограммированной
физиологической гибели клеток;
ЭПР – электронный парамагнитный
резонанс.
AGF – ангиопоэтиноподобный фактор
роста;
Akt – протеинкиназа В;
AMP – аденозинмонофосфат;
АФК – активные формы кислорода;
AMPK – cAMP-зависимая киназа;
ГЭБ – гемато-энцефалический баръер;
Ang1 – ангиопоэтин-1;
ИИМ – индекс ингибирования
метастазирования;
AP-1 – активирующий протеин-1
(проапоптотический фактор);
ИР – индекс роста опухоли;
Bcl-2 – антиапоптотический протеин Bcl-2;
ИТМ – изотиомочевина;
bFGF – основной фактор роста
фибробластов;
Каспаза-3 – цистеиновая протеаза-3
(проапоптотический фермент);
КЛЛ – карцинома лѐгких Льюис;
ЛД16 – минимальная летальная доза при
однократном, внутрибрюшинном введении;
ЛД50 – среднелетальная доза при
однократном, внутрибрюшинном введении;
ЛПС – липополисахарид;
М, мМ, мкМ, нМ – моль, ммоль, мкмоль,
нмоль, соответственно;
BH4 - (6R)-5,6,7,8-тетрагидро-L-биоптерин;
Ca+2 – ион кальция;
CaM – кальмодулин;
cAMP – циклический аденозинмонофосфат;
CAT - катион-аминокислотный
транспортный комплекс;
Cav – кавеолин;
cGMP – циклический гуанозинмонофосфат;
МОК – минутный объѐм крови;
cGK-I – cGMP-зависимая протинкиназа;
СИ – сердечный индекс;
cScr – тирозин киназа семейства Scr;
СКО – стволовые клетки опухоли;
EDRF – эндотелиальный фактор
релаксации;
СОД – супероксиддисмутаза;
СПЖ – средняя продолжительность жизни
погибших животных:
EGF – эпидермальный фактор роста;
FAD – флавинадениндинуклеотид;
ТРО – индекс торможения роста опухоли;
Fe-heme – гемовое железо;
УО – ударный объѐм;
FMN – флавинмононуклеотид;
УПСС – удельное периферическое
сопротивление сосудов;
Hb – гемоглобин;
ФИД – фактор изменения дозы;
Hsp70, Hsp90 – белки теплового шока 70,
90;
ЦВД – центральное венозное давление;
ЧДД – частота дыхательных движений;
ЧСС – частота сердечных сокращений;
HO-1 – гемоксигеназа-1;
IC50 – концентрация ингибитора NOS,
подавляющая на 50% активность
ферментов;
IGF1 – инсулиноподобный фактор роста-1;
5
IL-1 - интерлейкин-1;
INF - интерферон гамма;
iRNA – информационная РНК;
L-Arg – L-аргинин;
NADPH – восстановленный
никотинамидадениндинуклеотидфосфат;
NO – оксид азота;
NOS – синтаза оксида азота;
eNOS, iNOS, nNOS – соответственно,
эндотелиальная, индуцибельная и
нейрональная изоформа NOS;
oxLDL – окисленные липопротеиды низкой
плотности;
PCNA – ядерный антиген
пролиферирующих клеток
(иммуногистохимический маркер
пролиферирующих клеток);
PECAM-1 или CD31 –
иммуногистохимический маркер эндотелия;
PI3 – фосфатидилинозитол-трифосфат;
PI3K – фосфатидилинозитол-3 киназа;
PlGF – плацентарный фактор роста;
PKC, PKG – протеинкиназы C, G;
PLC – фосфолипаза С;
pO2 – парциальное давление кислорода;
PP2A – протеинфосфатаза 2А;
S1P – сфингозин 1-фосфат;
sGC – растворимая гуанилатциклаза;
TGasa – тканевая трансглутаминаза
(проапоптотический фермент);
TGF - трансформирующий фактор роста-;
TNF - фактор некроза опухолей альфа;
TSP1, TSP2 – тромбоспондин-1,
тромбоспондин-2;
VEGF – фактор роста эндотелия сосудов;
VEGFR2 – рецептор второго типа фактора
роста эндотелия сосудов;
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность темы и степень еѐ разработанности
Физиологическая активность оксида азота (NO) была описана ещѐ в первой
половине XIX века [Davy H., Davy J., 1839], а предположение о его синтезе в организме
было высказано только в начале XX века [Mitchell O.W., 1916], и потребовалось ещѐ
более 60 лет для его подтверждения. Мощный импульс изучению биологической роли
NO был придан в 1980-х годах, когда было установлено, что эндогенный NO является
фактором релаксации сосудов [Furchgott, R.F., 1980; Palmer R.M.J., 1987], присутствует в
активированных макрофагах [Stuehr D.J., 1989] и тканях мозга [Garthwaite J., 1988]. С
этого времени оксид азота привлѐк большое внимание специалистов в различных
областях биологии и медицины. Начался настоящий бум исследований участия этого
вещества во многих жизненно важных процессах в организме. Объѐм научных данных о
биологической роли оксида азота, накопленных к настоящему времени, столь велик, что
ещѐ не осознана даже общая картина, создаваемая ими. NO участвует в регуляции
тонуса сосудов и адгезии клеток крови, сократимости миокарда и скелетных мышц,
тонуса бронхов и моторики ЖКТ, модулирует процессы ангиогенеза и регенерации,
является медиатором многих видов чувствительности и играет центральную роль в
функциях высшей нервной деятельности, регулирует митохондриальную активность и
редокс-гомеостаз, является эффектором иммунных реакций [Taylor C.T., 2010; Jian Z.,
2014; Moncada S., 2006; Hardingham N., 2013; Forstermann U., 2012; Vincent S.R., 2011;
Niu X., 2012; Tang L., 2014]. Эти знания существенно расширили современные
представления о механизмах многих физиологических и патологических процессов, и
создали основы для развития новых подходов к лечению ряда заболеваний и
патологических
состояний
путѐм
модификации
эндогенного
синтеза
NO
фармакологическими средствами.
Первые лекарственные препараты, повышающие эндогенную продукцию оксида
азота, были найдены эмпирически и вошли в клиническую практику задолго до
открытия биологической роли
NO.
Так, например, нитроглицерин и другие
органические нитраты, являющиеся химическими донорами NO, применяются при
лечении стенокардии уже более 140 лет [Brunton T.L., 1867; Murrell W., 1879]. В
последние
десятилетия
эта
фармакологическая
группа
быстро
пополняется
7
соединениями
различных
классов
–
S-нитрозотиолами,
диазениумдиолатами,
«гибридными» препаратами (например, аспирин-NO). Расширяется и спектр их
фармакологической активности - наряду с сосудорасширяющим и антиангинальным
действием,
современные
бронходилятаторами
и
представители
этой
антиагрегантами,
группы
обладают
являются
эффективными
гепатопротекторным
и
антиульцерогенным действием, оказывают цитостатическое и цитотоксическое действие
в отношении ряда опухолей и патогенных микроорганизмов [Андреев В.Г., 2006; Мазур
Н.А., 2006; Kogias G., 2012; Larsson A.K., 2009; Nossaman V.E., 2010; Ling Y., 2011;
Schairer D.O., 2012; Harmon S., 2012; Nortcliffe A., 2014; Turner D.I., 2012].
Большой
научный
и
практический
интерес
представляют
и
средства,
подавляющие эндогенную продукцию NO – химические ингибиторы синтаз оксида
азота (NOS). Результаты многих исследований свидетельствуют, что ингибиторы NOS
могут иметь практическое значение при лечении ряда патологических состояний,
протекающих с гиперпродукцией NO (сепсис, эндотоксемии, ожоговая болезнь,
мигрень,
ревматоидный
артрит,
хронический
остеоартрит,
неспецифические
энтероколиты и нейродегенеративные заболевания). Они также могут проявлять
широкий спектр важных фармакологических эффектов – обладать вазопрессорным,
противовоспалительным, кардио- и нейропротекторным действием [Hernandez G., 2013;
Szalai Z., 2014; Moncada S., 2006; Calcerrada P., 2011; Ziskoven C., 2010; Nagi G., 2010;
Rochette L., 2013; Tang L., 2014; Omar S.A., 2014; Leiper J., 2011].
Однако, несмотря на большие усилия в этой области, разработка NOSингибирующих фармакологических средств пока не получила реального практического
воплощения. В настоящее время известно несколько сотен веществ различных
химических классов, способных подавлять активность NOS, но на клинические
испытания смогли выйти лишь единицы из них.
Препятствия к созданию пригодных для клинического применения ингибиторов
NOS связаны не только с токсичностью или фармакокинетическими особенностями этих
соединений. Они обусловлены и тем, что оксид азота продуцируется эндогенно с
участием целого семейства NOS. Особенности экспрессии, пост-транскрипционной
модификации, субклеточной локализации и регуляции изоформ NOS определяют их
различную роль в физиологических и патологических процессах [Oess S., 2006;
Dudzinski D., 2007; Villanueva C., 2010; Ramadoss J., 2013; Qian J., 2013; Hardingham N.,
8
2013]. В этой связи интерес представляют, в первую очередь, соединения, оказывающие
избирательное ингибирование изоформ NOS, поскольку в этом случае можно ожидать
снижения до минимума рисков развития нежелательных эффектов [Leiper J., 2011].
Однако в настоящее время практически значимым уровнем селективности к тем или
иным изоформам обладает не более 3-5% известных ингибиторов NOS.
Другими важными факторами, определяющими фармакологические свойства
ингибиторов NOS, являются особенности их молекулярных механизмов ингибирования
данных ферментов. Большинство известных ингибиторов NOS или их метаболиты
необратимо инактивируют эти ферменты, чаще всего вызывая потерю кофакторов или
нарушая необходимую для проявления каталитической активности NOS димерную
структуру [Wolff D.J., 1996, 1997, 1998; Alderton W.K., 2001; Li H., 2005; Zhu Y., 2005;
Lee K.S., 2012]. В связи с тем, что NOS являются долгоживущими ферментами, и
обновление их пула требует длительного времени [Shaul P.W., 2002; Qian J., 2013;
Dudzinski D., 2007], необратимое подавление их активности является далеко не всегда
целесообразным и безопасным. По этой причине многие известные ингибиторы NOS, в
том числе и селективные, такие как 1400W, АМТ, L-VNIO и 7-NIL, остаются удобными
инструментами
исследований,
но
возможности
их
клинического
применения
представляются сомнительными [Alderton W.K., 2001; Zhu Y., 2005; Viteceek J., 2012].
При таких обстоятельствах перспективными могут оказаться селективные
ингибиторы NOS с обратимым, субстратно-конкурентным механизмом действия. Среди
химических соединений, обладающих такими свойствами, в первую очередь привлекает
внимание класс линейных и циклических производных изотиомочевины (ИТМ),
имеющих
в
своей
молекулярной
структуре
тиоамидиновый
фрагмент
R1 NH C SR2 NR3 , подобный (изостеричный) гуанидиновой группе субстрата NOS -
L-аргинина. Поскольку именно эта часть L-аргинина взаимодействует с оксидазным
доменом NOS [Babu B.R., 1999; Giroud C., 2010], такие производные ИТМ могут
конкурировать с субстратом за каталитический центр. Это подтверждается результатами
исследований
S-замещѐнных
и
S,S’-бис-ИТМ,
среди
которых
найден
высокоселективный ингибитор iNOS – PBITU (S,S’-[1,3-фениленбис-(1,2-этанедил)]бисИТМ), практическое применение которого, к сожалению, ограничено высокой
токсичностью и низкой адсорбцией, а также ряд слабо селективных, но чрезвычайно
активных ингибиторов NOS - S-метил/этил/изопропил-ИТМ. Эти соединения, в отличие
9
от ингибиторов других химических классов, в том числе и их аминоалкильных аналогов,
являются в полной мере конкурентными, обратимыми ингибиторами NOS [Garvey E.P.,
1994; Wolff D.J., 1997].
Особый интерес для поиска селективных конкурентных ингибиторов NOS может
представлять мало изученный класс N,S-дизамещѐнных производных ИТМ. По мнению
ряда авторов, именно N-замещающий радикал таких соединений способен нековалентно
взаимодействовать с ферментом вне гуанидинсвязывающей полости его активного
центра. В этом случае строение N-заместителя может существенно влиять на
селективность действия ингибитора на изоформы NOS [Проскуряков С.Я., 2005;
Зефирова О.Н., 2008]. Это подтверждают результаты единичных наблюдений в данной
области химических соединений - так, N-пропиноильный заместитель усиливает
селективность S-этил/изопропил-ИТМ к iNOS [Проскуряков С.Я., 2002], а введение Nфенильного радикала смещает селективность S-этил-ИТМ в сторону nNOS [Shearer
B.G., 1997; Cooper G.R., 2000].
Наряду с проблемами поиска приемлемых для клинического применения
ингибиторов NOS остаются открытыми и многие вопросы, связанные с их
фармакологическими свойствами. Фармакологическим эффектом ингибиторов NOS,
механизм которого на сегодня наиболее подробно изучен, является повышение
сосудистого тонуса. Поскольку это действие ингибиторов NOS развивается, минуя 1адренорецепторы [Dudzinski D., 2007; Ramadoss J., 2013; Qian J., 2013], такие
соединения могут иметь существенные преимущества по сравнению с имеющимися
вазоконстрикторами: большую длительность вазопрессорного действия, отсутствие
побочных эффектов, характерных для адреномиметиков, а также способность повышать
тонус сосудов при гипотонических состояниях, резистентных к действию стандартных
вазопрессоров (1-адреноблокада, рефрактерный шок). Вазоконстрикторы с NOSингибирующим действием могут занять важное место в военной и экстренной медицине
при лечении тяжѐлых травм и ранений на догоспитальном этапе, а также в терапии
критических состояний [Hernandez G., 2013; Cauwels A., 2007; Lange M., 2009; Волков
В.Е., 2009; Andrades M.E., 2011; Wheeler D.S., 2011]. Актуальность поиска и разработки
таких лекарственных средств несомненна, так, например, в США и Канаде только
септический шок ежегодно регистрируется у 700 тысяч человек и приводит к
летальному исходу 30-50% таких больных [Martin G.S., 2003; Ward P.A., 2012]. Однако,
10
гемодинамические эффекты ингибиторов NOS на экспериментальных моделях
различных патологических состояний и в клинических наблюдениях нередко носят
противоречивый характер [Bakker J., 2004; Lopez A., 2004; Watson D., 2004; Cauwels A.,
2007; Gamboa A., 2007; Wecht J.M., 2008; Juffermans N.P., 2010; Shabeeh H., 2013;
Okamoto L.E., 2014]. Это свидетельствует о необходимости детальных исследований
вазоактивных свойств ингибиторов NOS, поскольку неоднозначная трактовка и
недооценка эффектов являются препятствиями для внедрения таких средств в
клиническую практику [Watson D., 2004; Bailev A., 2007; Howes L.G., 2008; Viteceek J.,
2012].
Менее исследованной остаѐтся противолучевая активность ингибиторов NOS,
хотя в последние годы было показано, что многие известные радиопротекторы в той или
иной степени проявляют способность к ингибированию NOS [Garvey E.P., 1994; Southan
G.J., 1996; Wolff D.J., 1997; Проскуряков С.Я., 2003], а тромбоспондин-1, блокирующий
функцию eNOS, а также некоторые ингибиторы NOS и химические перехватчики NO
обладают радиозащитным действием [Liebmann J., 1994; Гильяно Н.А., 2004, 2005;
Gadhi N.M., 2004; Проскуряков С.Я., 2005б; Коноплянников А.Г. 2007; Isenberg J.S.,
2008; Maxhimer J.B., 2009; Sharmaa D., 2010]. Эти данные позволяют рассматривать
ингибиторы
NOS
как
возможную
область
поиска
новых
радиопротекторов,
необходимость в которых вызвана как проблемами радиационной защиты, так и
постоянным ростом числа пациентов, получающих лучевую терапию.
Развитие острых и отдалѐнных лучевых поражений нормальных тканей является
основным негативным эффектом, ограничивающим возможности лучевой терапии
[Vikram B., 2009; Prasanna P.G., 2012; Лушников Е.Ф., 2012; Абизов Р.А., 2014; Аклеев
А.В., 2014]. Имеющиеся эффективные радиопротекторы обеспечивают приемлемый
уровень защиты органов и тканей лишь в субтоксических дозах [Васин М.В., 2010;
Ильин Л.А., 2012; Рождественский Л.М., 2013], поэтому их применение при лучевой
терапии опухолей весьма проблематично. В настоящее время для профилактики
осложнений при радио- и химиотерапии онкологических больных ограниченно
применяется только лекарственный препарат амифостин [Kouvaris J.R., 2007; Hensley
M.L., 2009]. В этой связи изучение механизмов противолучевого действия ингибиторов
NOS может являться основой для поиска и разработки приемлемых для лучевой терапии
11
радиомодифицирующих средств [Citrin D., 2010; Рождественский Л.М., 2013; Аклеев
А.В.; 2014].
Не меньший научный и практический интерес представляет также изучение
антиангиогенного и противоопухолевого действия ингибиторов NOS. Опыт применения
ангиостатиков при лечении ряда форм злокачественных новообразований был
обнадѐживающим - такие препараты замедляли рост опухолей, подавляли процессы
метастазирования, повышали эффективность радио- и химиотерапии [Willett C.G., 2007;
Lein S., 2008; Fang P., 2012; Schmidt B., 2012; Корчагина А.А., 2013; Abdel-Rahman O.,
2014]. Однако опыт клинической практики и данные экспериментальных исследований
показали, что противоопухолевый и антиметастатический эффект ангиостатиков быстро
ослабевает из-за развития резистентности опухоли к их действию. Так, увеличение
продолжительности жизни онкологических больных при применении имеющихся
ангиостатиков не превышает 1 года. В основе этой проблемы - разнообразие
ангиогенных факторов и высокая пластичность новообразований: блокирование одного
ангиогенного фактора усиливает влияние альтернативных факторов, что позволяет
опухоли уклониться от действия ангиостатика и продолжить развитие [Fernando N.T.,
2008; Maity A., 2010; Rahman R., 2010; Plate K.H., 2012; Vasudev N.S., 2014]. В последние
годы началось клиническое изучение эффективности комбинированного применения
различных ингибиторов ангиогенеза, однако в настоящее время эти усилия ограничены
небольшим числом имеющихся препаратов.
Экспериментальные данные о механизмах регуляции ангиогенеза позволяют
рассматривать стойкое повышение синтеза NO в эндотелиальных клетках и
последующие NO-зависимые процессы как общие звенья в биохимических путях
проангиогенного действия основных факторов опухолевого ангиогенеза [Isenberg J.S.,
2009; Miller T.W., 2009; Ziche M., 2009; Филимонова М.В., 2013; Burke A.J., 2013; Cheng
H., 2014]. В этой связи химические ингибиторы NOS могут явиться эффективным
дополнением к существующим ангиостатическим препаратам, необходимым для
долговременного подавления опухолевого роста и расширяющим возможности
современной
противоопухолевой
антиангиогенной
терапии.
При
этом
противоопухолевое действие ингибиторов NOS может не ограничиваться только
ангиостатическим влиянием. По мнению многих авторов, ингибиторы NOS могут
усиливать развитие апоптоза опухолевых клеток, индуцированного цитотоксическими
12
факторами, и таким путѐм повышать чувствительность опухолей к радио- и
химиотерапии [Brune B., 2003; Tarr J.M., 2006; Iyer A.K., 2008; Olson S.Y., 2008; Cardnell
R.J., 2011; Godoy L.C., 2012; Cheng H., 2014].
Сложности разработки лекарственных средств с NOS-ингибирующим действием
и множественность нерешѐнных вопросов их фармакологии определили комплексный
характер данной работы, которая предусматривает сочетание экспериментальных
исследований по поиску конкурентных ингибиторов NOS с изучением зависимости
биохимической активности веществ от их молекулярной структуры, с изучением
особенностей их биохимического действия и фармакологических свойств.
Цели исследования: поиск в ряду линейных и циклических N,S-замещѐнных
производных изотиомочевины эффективных конкурентных ингибиторов NOS, изучение
особенностей их NOS-ингибирующей активности и ряда фармакологических свойств вазопрессорного, радиомодифицирущего и противоопухолевого эффектов.
Для решения указанных целей были поставлены следующие задачи:
1. Провести анализ особенностей химического строения производных ИТМ,
определяющих их NOS-ингибирующие свойства. Осуществить направленный синтез
ряда новых, оригинальных N,S-замещѐнных изотиомочевин, потенциально способных к
конкурентному ингибированию NOS.
2. Изучить in vitro способности полученных соединений к подавлению
каталитической активности изоформ NOS, оценить селективность и обратимость
ингибирования. Оценить показатели острой токсичности, дозовые и временные
параметры NOS-ингибирующего действия in vivo. Выделить наиболее перспективные
соединения для фармакологических исследований.
3. Изучить влияние отобранных соединений на гемодинамику интактных
животных. Оценить их вазопрессорную активность на экспериментальных моделях
различных гипотонических состояний.
4.
Провести
анализ
взаимосвязи
радиозащитной
и
NOS-ингибирующей
активности производных ИТМ. Получить экспериментальные оценки показателей
противолучевой активности изучаемых соединений по выживаемости подопытных
животных и клоногенных гемопоэтических клеток при воздействии -излучения.
Изучить эффективность комбинированного действия производных ИТМ с известными
13
радиопротекторами. Оценить их радиомодифицирующие способности на моделях
лучевой терапии опухолей.
5. Изучить влияние отобранных соединений на рост и метастазирование
карциномы лѐгких Льюис и механизмы их противоопухолевого и антиметастатического
действия.
Оценить
их
противоопухолевую
эффективность
в
комбинации
с
ангиостатическими препаратами, радио- и химиотерапией.
Научная новизна работы
Экспериментальным путѐм выявлены особенности молекулярной структуры N,Sзамещѐнных ИТМ, определяющие их способность к конкурентному ингибированию
NO-синтаз. Установлено влияние N-замещающего радикала на селективность таких
соединений к изоформам NOS. Впервые показано, что N-замещающие изобутаноил,
циклобутанкарбонил и циклогексанкарбонил повышают селективность N,S-замещѐнных
ИТМ к ингибированию eNOS и iNOS, что позволяет рассматривать эти соединения как
перспективную основу для создания NOS-ингибирующих фармакологических средств,
действие которых затрагивает, в первую очередь, сосудистый гомеостаз.
Впервые показано, что изучаемые N,S-замещѐнные ИТМ, обладающие высокой
NOS-ингибирующей активностью, в низких нетоксических дозах вызывают выраженное
повышение сосудистого тонуса, которое сопровождается длительным гипертензивным
эффектом при различных гипотониях, в том числе, резистентных к действию
существующих вазопрессорных лекарственных средств.
Впервые исследована взаимосвязь NOS-ингибирующей и противолучевой
активности S- и N,S-замещѐнных ИТМ. Установлено, что основным механизмом их
противолучевого действия является индукция гипоксии. Экспериментально показано,
что активные ингибиторы NOS из класса N,S-замещѐнных ИТМ способны оказывать
эффективное противолучевое действие в менее токсических дозах, чем аминотиоловые
радиопротекторы.
Впервые
выявлено
выраженное
фармакодинамическое
взаимодействие ингибиторов NOS с существующими противолучевыми средствами
различных классов. Показана способность исследованных N,S-замещѐнных ИТМ
значительно повышать противолучевую эффективность существующих серотонин- и
адренергических радиопротекторов.
14
Впервые
экспериментально
противолучевого
действия
показано,
исследованных
что
гипоксический
N,S-замещѐнных
ИТМ
механизм
способен
обеспечивать селективную защиту немалигнизированных тканей при лучевой терапии
солидных опухолей.
Подтверждены
данные
о
способности
ингибиторов
NOS
проявлять
антиангиогенное и противоопухолевое действие. Впервые установлено, что изученные
ИТМ
N,S-замещѐнные
тормозят
рост
и
подавляют
метастазирование
экспериментальных неоплазий, вызывая нарушение опухолевой васкуляризации,
подавляя пролиферацию опухолевых клеток и усиливая их апоптотическую и
некротическую гибель. Впервые показана способность этих соединений существенно
повышать противоопухолевую эффективность радио- и химиотерапии опухолей.
Методы синтеза исследованных N-ацил-S-алкил-замещѐнных ИТМ и данные об
их биохимических свойствах, вазопрессорной, противолучевой и противоопухолевой
активности являются приоритетным и стали предметом 4 патентов Российской
Федерации и одобренной заявки на изобретение.
Теоретическая и практическая значимость работы
Выявленные
замещѐнных
ИТМ,
особенности
молекулярной
определяющие
их
структуры
способность
к
оригинальных
N,S-
ингибированию
NOS,
установленная зависимость селективности изученных соединений к изоформам NOS от
характера N-замещающего ацильного радикала создают основу для поиска и дизайна
селективных, конкурентных ингибиторов NOS в ряду линейных и гетероциклических
соединений, содержащих тиоамидиновый фрагмент - производных ИТМ, тиазола,
тиазолина, тиазина.
Проведѐнные исследования показали, что ингибиторы NOS из класса N,Sзамещѐнных
ИТМ
в
нетоксических
дозах
способны
оказывать
выраженное
сосудосуживающее действие при различных гипотониях, в том числе, резистентных к
действию существующих вазопрессоров. Полученные результаты свидетельствуют, что
конкурентные тиоамидиновые ингибиторы NOS могут создать новые возможности в
фармакотерапии гипотонических состояний, при оказании экстренной и неотложной
помощи, и в лечении критических состояний, а также позволяют рекомендовать
15
соединение Т-1059 для дальнейшей разработки в качестве вазопрессорного и
противошокового средства.
Результаты исследований показали, что конкурентные ингибиторы NOS из класса
N,S-замещѐнных
ИТМ
обладают
свойствами
гипоксических
радиопротекторов.
Показатели противолучевой эффективности и радиозащитной широты этих соединений,
данные
о
значительном
повышении
противолучевой
эффективности
при
комбинированном взаимодействии с имеющимися серотонин- и адренергическими
радиопротекторами, и способности к селективной защите немалигнизированных тканей
свидетельствуют, что конкурентные тиоамидиновые ингибиторы NOS могут иметь
важное практическое значение при разработке более безопасных противолучевых и
радиомодифицирующих средств. Полученные результаты позволяют рекомендовать
соединение Т-1023 для дальнейшей разработки в качестве радиопротектора экстренного
действия и средства профилактики осложнений лучевой терапии.
Установлено, что изучаемые производные ИТМ при субхроническом применении
подавляют
рост
и
метастазирование
злокачественных
опухолей,
оказывая
антиангиогенное и проапоптотическое действие. Полученные данные о способности
этих соединений повышать эффективность радио- и химиотерапии позволяют
рассматривать их как перспективную основу для разработки новых средств
адъювантной терапии злокачественных новообразований.
Методология и методы диссертационного исследования
Исследование носило комплексный
характер, предполагающий сочетание
экспериментальных исследований по поиску и дизайну эффективных ингибиторов NOS
с изучением зависимости биохимической активности веществ от их молекулярной
структуры, особенностей их биохимического действия и фармакологических свойств.
При решении поставленных задач использован обширный арсенал методов
исследований из различных областей – биохимии, клеточной биологии, морфологии,
экспериментальной физиологии, радиобиологии, онкологии и фармакологии.
Исследование NOS-ингибирующей активности изучаемых соединений проведено
in vitro - радиометрическим методом на изолированных изоформах NOS и методом
проточной цитофлуориметрии на клеточных культурах; in vivo – методом ЭПРспектрометрии и фотометрическим методом. Изучение токсических свойств соединений
16
проведено по методу острой токсичности. Изучение вазоактивных свойств соединений
проведено общепринятыми методами экспериментальной физиологии и фармакологии
на интактных животных и на экспериментальных моделях острого геморрагического
шока, эндотоксического шока, гипотензии при ганглиоблокаде и модели рефрактерной
вазоплегии
при
эндотоксемии.
проведено
общепринятыми
Изучение
методами
противолучевых
свойств
экспериментальной
соединений
радиобиологии
по
выживаемости животных и выживаемости клоногенных гемопоэтических клеток. Для
оценки способности изучаемых соединений к профилактике осложнений радиотерапии
использована экспериментальная модель лучевой терапии саркомы М-1. Исследование
противоопухолевой и антиметастатической активности соединений проведено на
карциноме
лѐгких
Льюис
с
применением
морфологических,
гистологических,
иммуногистохимических и морфометрических методов. При анализе и обобщении
полученных экспериментальных данных использованы адекватные методы статистики и
прикладной математики.
Положения, выносимые на защиту
1. Соединения класса N-ацил-S-алкил-замещѐнных изотиомочевин обладают
способностью к конкурентному, обратимому ингибированию NOS, если их Sзамещающий
радикал
представлен
низшим
алкилом.
Строение
N-ацильных
заместителей в этих соединениях оказывает существенное влияние на селективность их
действия к изоформам NOS.
2. Ряд оригинальных N-ацил-S-алкил-замещѐнных изотиомочевин проявляют
селективность к eNOS и iNOS, и в нетоксических дозах оказывают выраженную NOSингибирующую способность in vivo, что позволяет рассматривать данные соединения
как перспективные для разработки на их основе новых фармакологических средств,
влияющих, в первую очередь, на сосудистый гомеостаз.
3. Вазопрессорное действие исследованных производных ИТМ наблюдается на
различных моделях гипотонических состояний, в том числе, резистентных к действию
существующих вазопрессорных лекарственных средств, и отличается большой
продолжительностью
адреномиметиков.
и
отсутствием
негативных
эффектов,
характерных
для
17
4. Противолучевое действие алкил-замещѐнных изотиомочевин реализуется
путѐм индукции циркуляторной гипоксии. Испытанные соединения обеспечивают
эффективную радиационную защиту в менее токсических дозах, по сравнению с
серосодержащими
радиопротекторами,
эффективность серотонин-
и
способны
адренергических
повышать
противолучевую
радиопротекторов,
и
проявляют
селективную защиту немалигнизированных тканей при лучевой терапии солидных
опухолей.
5. Исследованные ингибиторы NOS оказывают выраженное противоопухолевое и
антиметастатическое действие, подавляя опухолевый ангиогенез и стимулируя
апоптотическую и некротическую гибель опухолевых клеток, и способны повышать
эффективность радио- и химиотерапии новообразований.
6. Полученные данные свидетельствуют о перспективности разработки на основе
наиболее активных соединений принципиально новых лекарственных
способных
расширить
возможности
фармакотерапии
при
средств,
лечении
ряда
распространѐнных заболеваний, критических состояний и оказании экстренной,
неотложной помощи.
Степень достоверности
Достоверность
экспериментальных
данных
обеспечивалась
применением
адекватных, верифицированных методов исследований и экспериментальных моделей,
кондиционностью химических, биологических материалов и лабораторных животных,
величиной экспериментальных выборок и воспроизведением результатов в независимых
экспериментах. Анализ данных и их обобщение проведены с применением методов
математической статистики и прикладной математики, соответствующих характеру
данных и задачам экспериментов. Все выявленные закономерности, эффекты,
обобщения и выводы подтверждались сериями независимых экспериментов и
результатами статистического анализа.
Использование результатов исследований.
Полученные результаты по изучению фармакологической активности соединения
Т-1023
составили
государственной
основу
для
регистрации
разработки
01201461942)
программы
по
НИР
МЗ
проведению
РФ
(номер
расширенного
18
доклинического изучения Т-1023 в качестве средства для лечения злокачественных
новообразований, которая выполняется в настоящее время в МРНЦ им. А.Ф. Цыба.
Полученные результаты по изучению фармакологической активности соединения
Т-1059 составили основу для разработки программы доклинических исследований
вазопрессорного средства на основе ингибиторов NOS из класса N,S-замещѐнных
производных
ИТМ.
Получено
положительное
решение
на
проведение
этих
исследований в рамках ФЦП «Фарма-2020» (протокол № ОП-4119/19 от 09 07-2014 г.).
Способы синтеза исследованных производных ИТМ, их биохимические и
фармакологические свойства явились предметом 4 патентов РФ и одобренной патентной
заявки:
1.
Проскуряков С.Я., Верховский Ю.Г., Филимонова М.В.,
Шевченко Л.И.,
Мандругин А.А., Трофимова Т.П., Федосеев В.М. Антигипотензивное средство.
Патент РФ на изобретение RU2353614. Дата публикации: 27.04.2009.
2.
Филимонова М.В., Шевченко Л.И., Макарчук В.М., Шевчук А.С., Лушникова Г.А.
Вазоконстрикторное средство. Патент РФ на изобретение RU2475479. Дата
публикации: 20.02.2013.
3.
Филимонова М.В., Шевченко Л.И., Макарчук В.М., Шевчук А.С., Южаков В.В.,
Цыб А.Ф. Противоопухолевое средство. Патент РФ на изобретение RU2503450.
Дата публикации: 10.01.2014.
4.
Мандругин А.А., Трофимова Т.П., Борисова Г.С., Филимонова М.В., Шевченко
Л.И., Макарчук В.М., Проскуряков С.Я. Антигипотензивное средство. Патент РФ
на изобретение RU2506082. Дата публикации: 10.02.2014.
5.
Филимонова М.В., Шевченко Л.И., Макарчук В.М., Шевчук А.С., Чеснакова Е.А.,
Цыб А.Ф. Вазопрессорное средство. Заявка на изобретение №082603 от
29.11.2013.
Апробация работы. Результаты работы были доложены и обсуждены на
следующих научных конференциях: Национальная научно-практическая конференция с
международным участием «Свободные радикалы, антиоксиданты и болезни человека»
(Смоленск, 2001); Международная научно-практическая конференция «Активные
формы кислорода, оксида азота, антиоксиданты и здоровье человека» (Смоленск, 2003);
VIII Международная конференция «Биоантиоксидант» (Москва, 2010); Третий съезд
19
военных врачей медико-профилактического профиля Вооружѐнных сил Российской
Федерации
(Санкт-Петербург,
2010);
Российская
научная
конференция
с
международным участием «Актуальные проблемы токсикологии и радиобиологии»
(Санкт-Петербург, 2011); Вторая международная конференция «Новые направления в
химии
гетероциклических
соединений»
(Железноводск,
2011);
Всероссийская
конференция «Радиохимия – наука будущего», посвящѐнной 100-летию со дня
рождения
А.Н.
Несмеянова
(Москва,
2011);
Всероссийская
конференция
с
международным участием «Современные проблемы химической науки и образования»,
посвящѐнная 75-летию со дня рождения В.В.Кормачева (Чебоксары, 2012); International
conference «Radiation safety challengers in the 21th century» (Yerevan, 2012); Российская
научная конференция «Острые проблемы разработки противолучевых средств:
консерватизм или модернизация» (Москва, 2012); Научно-практическая конференция
«Перспективные технологии медицинского обеспечения вооружѐнных сил Российской
Федерации» (Санкт-Петербург, 2013); Third International Conference on Radioecology &
Environmental Radioactivity; ICRER 2014; (Barcelona, 2014); VII съезд по радиационным
исследованиям (радиобиология, радиоэкология, радиационная безопасность) (Москва,
2014).
Диссертация апробирована на научной конференции Экспериментального
радиологического сектора Медицинского радиологического научного центра имени
А.Ф.Цыба – филиала федерального государственного бюджетного учреждения
«Федеральный
медицинский
исследовательский
центр
имени
П.А.
Герцена»
Министерства здравоохранения Российской Федерации 04.12.2014 г. (протокол № 279).
Публикации. По результатам диссертационной работы опубликовано 44 научных
работы: 18 научных статей, из них 12 - в рецензируемых изданиях перечня ВАК
Министерства образования и науки РФ, 21 работа в материалах симпозиумов и научных
конференций. Получено 4 патента РФ и положительное решение по новой патентной
заявке.
Объѐм и структура диссертации. Работа изложена на 239 страницах, состоит из
введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, четырѐх глав
результатов исследований, заключения, выводов, рекомендаций и списка литературы.
Работа содержит 45 таблиц и 33 рисунка. Список литературы содержит 569 источников,
из которых 135 отечественных и 434 зарубежных изданий.
20
Личный вклад автора. Автору принадлежит основная роль в обосновании и
выборе направлений исследований, проведении большинства экспериментов, анализе и
обобщении полученных результатов, и их публикации в научных изданиях, докладах и
обсуждении на отечественных и международных конференциях. В экспериментальных
работах, выполненных в соавторстве, вклад автора является определяющим, состоящим
в участии на всех этапах – от постановки задач и реализации до обсуждения результатов
в публикациях и докладах. Написание диссертации выполнено автором лично.
21
ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Биологические и физиологические функции
оксида азота. NO-синтазы, регулирование их активности в организме в норме и
при патологии
Одно из первых предположений о биогеном синтезе окислов азота было
высказано еще в 1916 году [Mitchell O.W., 1916], но экспериментальное подтверждение
было получено значительно позже. В исследованиях 1986-1989 годов было показано,
что оксид азота (NO) синтезируется в эндотелии сосудов и, распространяясь на
прилегающие гладкие мышцы, вызывает их релаксацию [Furchgott R.F., 1980; Palmer
R.M.J., 1987]. Тогда же окись азота привлекла внимание иммунологов, обнаруживших
синтез NO в культуре активированных макрофагов [Stuehr D.J., 1989], а также
нейробиологов, это вещество было обнаружено в препаратах мозга [Garthwaite J., 1988].
В
результате
этих
исследований
был
выявлен
новый
вид
межклеточного
взаимодействия, где посредником при передаче сигнала служит столь простое
неорганическое соединение, как NO.
В 80-90 годы проблема оксида азота привлекает внимание биологов и врачей
самых разных специальностей, и исследования медико-биологических аспектов NO
охватывают беспрецедентно
широкую
область.
Экспоненциальный
рост
числа
публикаций в этой области позволил Американской ассоциации развития науки и
журналу Science назвать NO молекулой 1992 года [Koshland D.E., 1992]. А в 1998 году
три американских ученых Роберт Фурчготт, Луис Игнарро и Ферид Мурад были
удостоены Нобелевской премии в области физиологии и медицины за «открытие роли
оксида азота как сигнальной молекулы в регуляции сердечно-сосудистой системы».
Объем научных данных о биологической роли NO, накопленных к настоящему
времени, столь велик, что пока еще не осознана даже общая картина, создаваемая ими.
При этом многие авторы проблемных и общетеоретических работ считают, что NO
является одним из древних и универсальных регуляторов систем внутриклеточной и
межклеточной сигнализации, в то время как другие относят оксид азота к "изнанке
метаболизма", связанной с неферментативными химическими процессами [Ванин А.Ф.,
1998; Murad F., 1998; Hare J.M., 2005; Roe N.D., 2012; Tang L., 2014].
1.1 Свойства, эндогенный синтез и пул оксида азота в организме
В нормальных условиях оксид азота находится в газообразном состоянии. Среди
других неорганических молекул с некомпенсированным спином NO отличается
22
стабильностью в газообразном состоянии и практически не димеризуется. Имея низкую
массу (28 Да) и являясь неполярной молекулой, оксид азота растворяется в липидах и
легко диффундирует через клеточные мембраны. Растворимость NO в воде составляет
1,9 мМ/л при 25С. В водной среде NO легко окисляется кислородом
2NO + O2 2NO2
(1.1.1)
и далее трансформируется согласно уравнениям [Al-Sa'Doni H., 2000]:
2NO2 N2O4
(1.1.2)
NO + NO2 N2O3
(1.1.3)
N2O3 + H2O 2NO2- + 2H+
(1.1.4)
N2O4 + H2O NO2- + NO3- + 2H+
(1.1.5)
Реакции (1.1.3-4) протекают существенно быстрее, чем реакция (1.1.5), поэтому в
водных растворах в основном образуется NO2-, но высокий окислительный потенциал
биологической среды смещает равновесие NO2-/NO3- в сторону нитратов – как правило,
соотношение NO2-/NO3- в биологических тканях и жидкостях составляет 1:10.
Имея нечѐтное число электронов, NO активно взаимодействует с различными
соединениями и свободными радикалами (рисунок 1.1). Высокая реакционная
способность приводит к тому, что in vivo NO существует в трѐх взаимно
превращающихся формах: собственно радикала NO, нитрозоний-катиона (NO+) и
нитроксил-аниона (NO-), которые образуются в ходе окисления и восстановления NO.
Рисунок 1.1 - Общая схема основных химических реакций оксида азота в
биологических тканях (по Осипову А.Н. [2007]).
К числу наиболее важных реакций NO in vivo относят его взаимодействие с
кислородом, свободными радикалами, металлами переменной валентности, тиолами и
23
амидами. Скорость реакции NO с супероксидным анион-радикалом (О2-) очень высока
(выше скорости реакции О2- с СОД) и ограничена только скоростью диффузии частиц:
O2- + NO ONOO-
(1.1.6)
Эта реакция продуцирует высокоактивный пероксинитрит-анион (ONOO-), который
проявляет как токсические свойства, нитрозилируя белки и нуклеиновые кислоты, и
пероксидируя липиды, так и сигнальные, нитрозилируя тирозиновые остатки
[Ferdinandy P., 2006; Yamakura F., 2006;Calcerrada P., 2011; Poyton R.O., 2009; Roe N.D.,
2012].
В физиологических концентрациях NO проявляет свойства антиоксиданта,
тормозящего развитие радикальных окислительных процессов, разложение перекисей и
ПОЛ [Keynes R.G., 2005; Hummel S.G., 2006]. Так, NO эффективно реагирует с другими
радикалами, например, с гидроксильным радикалом:
NO + OH HNO2 NO2- + H+
(1.1.7)
пероксильными и алоксильными радикалами липидов:
LOO + NO LOONO
(1.1.8)
С гемсодержащими белками NO может взаимодействовать двумя путями, образуя
стабильный нитрозильный комплекс с гемовым железом:
heme-Fe(II) + NO heme-F(II)-NO heme-Fe(III) + NO-
(1.1.9)
heme-Fe(III) + NO heme-F(III)-NO heme-Fe(II) + NO+
(1.1.10)
Этим путѐм NO может существенно модифицировать свойства ферментов, содержащих
гем в активном центре: например, ингибирует работу липоксигеназы, обратимо
ингибирует клеточное дыхание при взаимодействии с цитохром с оксидазой [Осипов
А.Н., 2007; Brown G.C., 2007; Taylor C.T., 2010; Groschner L.N., 2012], повышает
активность sGC [Bellamy T.C., 2002; Garthwaite J., 2010; Derbyshire E.R., 2012].
Для NO+ характерны реакции присоединения и замещения с аминами,
карбоксилами и тиолами. В физиологических условиях наиболее активны тиолы,
которые реагируют с образованием сравнительно устойчивых S-нитрозотиолов:
RS- + NO+ RSNO
(1.1.11)
Равновесие этой реакции, как правило, смещено в сторону образования RSNO. Но в
присутствии ионов металлов, аскорбиновой кислоты, или при поглощении тепловой или
световой энергии S-нитрозотиолы разлагаются с выделением NO [Граник В.Г., 2004;
Smith B.C., 2012; Parent M., 2013]:
24
2RSNO + hv или 2RS* + 2NO RSSR + 2NO
(1.1.12)
RSNO + Cu+ RS- + Cu2+ + NO
(1.1.13)
Кроме того, NO может образовывать нитрозильные комплексы негемового железа
с тиольными лигандами – динитрозильные железосерные комплексы (DNIC):
(1.1.14)
В их образовании участвуют низкомолекулярные тиолы (например, цистеин и
глутатион), тиоловые группы белков и негемовое железо.
Вследствие высоких скоростей реакций NO с O2, радикалами, ионами металлов
время жизни свободного NO в тканях невысоко. Если в водных аэрированных растворах
Т1/2 жизни NO составляет 5 с, то in vivo Т1/2 снижается до 120 мс, а радиус диффузии NO
при этом составляет не более 200 мкм [Butler A.R., 1998; Thomas D.D., 2001]. Это
определяет важное свойство NO – в биологических тканях его собственное действие
проявляется в непосредственной близости от места синтеза.
Таблица 1.1 - Содержание NO и его метаболитов в организме человека
Содержание, мкМ
Объект
NO
Эндотелиоциты
Венозная кровь
Плазма
Сыворотка
Моча
Слюна
Молоко
Желудочный сок
Бронхиальная
жидкость
Выдыхаемый воздух
Примечания:
NO2
-
NO3
Литература
-
RS-NO
*
0,004-0,159
0,008-0,2*
0,003
0,3
30
15-60
21-45
250-2000
30-210
200-600
20-30
**
0,4-60
50-85**
15
0,0002-0,0004
14
0,25
Du F., 2008
Valance P., 1995
Stamler J.S., 1992
Giovannoni G., 1997
Green L.C., 1982
Green L.C., 1982
Green L.C., 1982
Green L.C., 1982
Gaston B.D., 1993
Moncada S., 1993
* - верхние значения получены при воздействии ацетилхолина;
** - верхние значения получены у больных с заболеваниями желудка.
В этих условиях большое значение приобретают процессы, протекающие с
участием стабильных метаболитов NO, содержание которых в биологических тканях на
2-3 порядка превышает содержание самого оксида азота (таблица 1.1). За исключением
пероксинитрата, все они способны при определѐнных условиях выделять в свободном
25
виде NO или его редокс-формы. Это обстоятельство позволяет рассматривать многие
продукты трансформации NO как формы его депонирования и транспорта in vivo
[Stamler J.S., 1992; Ванин А.Ф., 1998; Suryo Rahmanto Y., 2012; Smith B.C., 2012; Parent
M., 2013; Omar S.A., 2014]. В ходе метаболизма NO депонируется в виде
низкомолекулярных DNIC и S-нитрозотиолов, а также присутствует в значительных
количествах и транспортируется кровью в составе нитрозопротеинов (нитрозоальбумин,
HbNO, HbS-NO). Нитрозопротеины, S-нитрозотиолы и DNIC, имея возможность к
взаимному превращению:
Fe2+ + 2R1SNO+ 2R2S- (R2S)2Fe(NO)2 + R1SSR1
(1.1.15)
формируют обширный пул относительно стабильных продуктов NO в биологических
тканях и способствуют взаимопревращению его редокс-форм.
Наиболее стабильными нитрозотиолами являются S-нитрозопротеины – так,
концентрация нитрозотиолов в плазме на 3-4 порядка превышает концентрацию
свободного NO, и более 95% из них составляет нитрозилированный альбумин. Наряду с
альбуминами плазмы, NO может нитрозилировать и гемоглобин, взаимодействуя с Cys93
с образованием S-нитрозогемоглобина (HbS-NO). HbS-NO содержится в артериальной
крови
в
концентрации
Высвобождение
О2
из
0,3-0,4
мМ
и
практически
оксигенированного
HbS-NO
отсутствует
в
венозной.
сопровождается
разрывом
нитрозильной связи и выделение свободного NO. В результате HbS-NO вызывает
расширение сосудов и усиливает периферический кровоток, в отличие от HbO2, который
имеет вазопрессорное действие вследствие конвертации NO в нитрат [Stamler J.S., 1997].
NO может взаимодействовать не только с SH-группами Hb, но и с гемом, образуя
нитрозильные комплексы (HbNO). Образование HbNO существенно не измененяет
структуру белка и не нарушает его кислородтранспортную функцию [Yonetani T., 1998].
В физиологических условиях 40% NO, связанного с Hb, находится в составе HbNO, а
остальная – в составе HbS-NO [Gow A.J., 1998]. Содержание HbNO может повышаться
при ишемии, гипертермии, активных иммуных и воспалительных реакциях.
Взаимодействие NO с тиолами и гемопротеинами необходимо рассматривать не
только как реакции, ведущие к его депонированию, но и как реакции, реализующие
биохимические и физиологические эффекты NO путем модификации активности
ферментов, если тиолы и гем входят в состав их активного центра или регуляторных
доменов [Bellamy T.C., 2002; Осипов А.Н., 2007: Garthwaite J., 2010; Taylor C.T., 2010;
26
Forstermann U., 2012; Derbyshire E.R., 2012]. Тем не менее, можно утверждать, что в ходе
метаболизма NO депонируется в клетках в виде низкомолекулярных DNIC и Sнитрозотиолов, а также присутствует в значительных количествах и транспортируется в
составе нитрозопротеинов. Эта биотрансформация позволяет постоянно присутствовать
NO и его метаболитам в различных внутриклеточных структурах, межклеточной и
тканевой среде, и непрерывно циркулировать в кровотоке, что придаѐт оксиду азота
черты не только внутри- и межклеточного, но и гуморального фактора [Ванин А.Ф.,
1998; Реутов В.П., 1998; Murad F., 1998; Suryo Rahmanto Y., 2012; Smith B.C., 2012;
Parent M., 2013; Omar S.A., 2014].
Существуют два основных механизма образования NO in vivo: ферментативный и
неферментативный. Под неферментативным путѐм понимают восстановление нитритов
и нитратов до NO. Эта реакция протекает либо как диспропорционирование нитрита или
азотистой кислоты при закислении среды, либо как прямое восстановление нитрита.
Реакция диспропорционирования нитрита:
NO2- + H+ HNO2
(1.2.1)
NO2- + HNO2 N2O3 + OH-
(1.2.2)
N2O3 NO2 + NO
(1.2.3)
становится существенной только при pH<6, поэтому этот механизм синтеза NO in vivo
может наблюдаться только при глубоком ацидозе [Zweier J.L., 2010].
Прямое восстановление нитритов протекает при нейтральных pH. В тканях
основными катализаторами нитритредуктазной реакции являются гемопротеины гемоглобин, миоглобин, цитохром с осидаза, цитохром Р-450, а также семейство
ксантиноксидаз, которые способны трансформировать NO3- в NO2-, а последние – в NO
[Реутов В.П., 1998; Zuckerbraun B.S., 2010; Zweier J.L., 2010].
Схема реакции прямого восстановления на примере гемоглобина имеет вид:
Hb-Fe(II) + NO2- + 2H+ Hb-Fe(III) + NO + H2O
(1.2.4)
Обращает внимание независимость этой реакции от O2, поэтому вклад прямого
восстановления нитритов в эндогенный синтез NO in vivo возрастает при глубокой
гипоксии и аноксии [Webb A.J., 2008; Maia L.B., 2011; Omar S.A., 2014].
Основным же путѐм эндогенного синтеза NO у млекопитающих является
NADPH-O2-зависимое ферментативное окисление гуанидилового азота L-аргинина с
образованием NO и L-цитруллина (рисунок 1.2). Ферменты, катализирующие этот
27
синтез, относятся к семейству цитохром Р-450-подобных гемопротеинов и называются
синтазами оксида азота (NOS). В реакции NOS используют три субстрата: L-аргинин, O2
и NADPH. Синтез NO протекает с образованием промежуточного продукта – L-Nгидроксиаргинина. Первая стадия реакции часто встречается и является обычным
гидроксилированием с участием NADPH и O2, тогда как вторая стадия не имеет
аналогов и требует обязательного участия (6R)-5,6,7,8-тетрагидро-L-биоптерина (BH4),
который ассоциирован с активной NOS и осуществляет транспорт e- и NADPHзависимое восстановление NOS в исходное состояние [Alderton W.K., 2001; Gorren A.C.,
2002, 2006; Daff S., 2010; Santolini J., 2011; Feng C., 2012].
Рисунок 1.2 - Схема NADPH-O2-зависимого ферментативного синтеза оксида азота
На каждой стадии синтеза NO используется по одной молекуле NADPH и O2,
причем промежуточным продуктом процесса служит перекисное соединение гемового
железа heme-Fe(III)-OOR в оксидазном центре NOS. Поэтому, при разобщении реакции
дефицитом субстрата или кофакторов (L-аргинин <10 мкМ и/или BH4 <1 мкМ), NOS
начинает действовать как NADPH-оксидаза - продуцирует не только NO, но и O2[Stuehr D., 2001; Vasquez-Vivar J., 2003; Santolini J., 2011; McNeill E., 2012]. Важность
этого явления состоит в том, что взаимодействие NO и O2- ведет к образованию
пероксинитрита (реакция 1.1.6), обладающего высокими сигнальными свойствами и
токсичностью.
28
В дополнение к общей картине следует отметить, что все NOS, подобно многим
гемопротеинам, способны катализировать и нитритредуктазный синтез NO (реакция
1.2.4), что может иметь значение при глубокой гипоксии и аноксии [Реутов В.П., 1998;
Gautier C., 2006; Webb A.J., 2008; Zuckerbraun B.S., 2010; Omar S.A., 2014].
1.2 Семейство синтаз оксида азота
В настоящее время у млекопитающих различают три изоформы NOS, именуемые
по месту преимущественной клеточной локализации: нейрональную NOS (NOS-1,
nNOS), макрофагальную или индуцибельную NOS (NOS-2, iNOS) и эндотелиальную
NOS
(NOS-3,
eNOS).
Неоднократно
обсуждался
вопрос
о
существовании
митохондриальной изоформы (mtNOS), однако большинство авторов рассматривают еѐ
как результат специфического сплайсинга nNOS [Zaobornyj T., 2012, 2014]. Изоформы
NOS кодируются собственными генами, находящимися в разных хромосомах [Marsden
P.A., 1993; Bloch K.D., 1995; Shinkai T., 2002].
Рисунок 1.3 - Структурно-функциональная организация активной формы
синтаз оксида азота (по U. Forstermann, 2012).
В активной форме все изоформы NOS представляют собой гомодимер (рисунок
1.3), функцию которого обеспечивают несколько кофакторов и простетических групп,
большинство из которых входят в каждую субъединицу - FAD, FMN, CaM, гем с
пентакоординированным Fe2+, Zn2+ и BH4, который может единично присутствовать в
29
димере [Li H., 2005; Daff S., 2010; Feng C., 2012]. Каждый мономер NOS имеет
бидоменную структуру: редуктазный С-терминальный домен, в который входят FAD и
FMN, и оксидазный N-терминальный домен, содержащий гем и участки связывания
BH4, Zn2+ и L-аргинина, CaM интегрирован в оба домена. В процессе димеризации
фермента CaM и Zn-тиолатный комплекс, который образуется цистеиновыми остатками
в оксидазных доменах, координируют положение мономеров в положении «головахвост» и стабилизируют конформационный замок между ними. При синтезе NO
флавины, при участии CaM, переносят электроны от NADPH из редуктазного домена
одного мономера к гему оксидазного домена другого мономера [Santolini J., 2011; Feng
C., 2012].
Рисунок 1.4 - Общая схема регуляции экспрессии и каталитической активности
изоформ NOS (пояснения даны в тексте)
In vitro изоформы NOS практически не различаются по степени сродства к Lаргинину и скорости продукции NO [Wei C.C., 2005]. Между тем, изоформы NOS
только на 50–60% гомологичны по аминокислотному составу и имеют in vivo
30
существенные различия по типу и тканевой специфичности экспрессии, субклеточной
локализации и механизмам регуляции, которые определяют их, во многом различную,
роль в физиологических и патологических процессах (рисунок 1.4).
Экспрессия, регуляция активности и субклеточной локализации NOS
Экспрессия NOS происходит практически во всех тканях [Alderton W.K., 2001;
Villanueva C., 2010; Forstermann U., 2012]. nNOS преимущественно экспрессируется в
нейронах центральной и периферической нервной системы, миоцитах скелетных мышц,
кардиомиоцитах, а также присутствует в эпителии респираторного и пищеварительного
тракта, эндотелии сосудов, нейтрофилах, тромбоцитах, -клетках поджелудочной
железы.
iNOS
преимущественно
экспрессируется
в
макрофагах,
гепатоцитах,
нейтрофилах, астроцитах, эозинофилах, миоцитах гладких мышц, хондроцитах,
фибробластах, остеобластах, а также наравне с другими изоформами, присутствует в
эпителии респираторного тракта и мочевыводящих путей, эндотелии сосудов. eNOS
преимущественно экспрессируется в эндотелии сосудов и эндокарда, кардиомиоцитах,
тромбоцитах, а также присутствует в нейтрофилах, лимфоцитах, эпителии почек,
респираторного и кишечного тракта.
Экспрессия nNOS и eNOS носит конститутивный характер, обеспечивающий
постоянное присутствие определѐнного пула этих ферментов в тканях. Вместе с тем,
наличие в промоторе генов NOS1 и NOS3 значительного числа регуляторных элементов
(Sp1, GATA, AP-1, AP-2, NF-1) придает им черты индуцируемости, позволяя многим
факторам влиять на интенсивность экспрессии [Laumonnier Y., 2000; Gilchrist M., 2004;
Searles C.D., 2006; Miller T.W., 2009; Sampaio A.L., 2013]. Усиление экспрессии nNOS и
eNOS наблюдается в ответ на воздействия, вызывающие стрессорную реакцию клеток
(электро- и фотостимуляция, напряжение сдвига в сосудах, умеренная гипоксия,
воздействие H2O2 и циклоспорина А), а также под влиением эстрогенов, тестостерона,
инсулина и факторов роста [Sanderson N.S.R., 2008; Davis M.E., 2004; Isenberg J.S.,
2009]. Ослабление экспрессии nNOS и eNOS наблюдается в условиях глубокой
гипоксии и под влиянием эритропоэтина, а воздействие ЛПС, TNF и высоких
концентраций oxLDL не только подавляет экспрессию, но и дестабилизирует iRNA
nNOS и eNOS [Wang X.Q., 1999; Govers R., 2001; Sampaio A.L., 2013]. В целом, степень
модификации экспрессии nNOS и eNOS имеет ограниченный масштаб, и при
31
спонтанной активности эти ферменты продуцируют в тканях невысокие, пикомолярные
концентрации NO.
Экспрессия iNOS носит отчѐтливый индуцируемый характер. В нормально
функционирующих тканях эти ферменты практически отсутствуют. Факторами,
вызывающими экспрессию iNOS являются провоспалительные цитокины (INF, TNF,
IL-1) и патоген-ассоциированные молекулярные структуры (например, флагилин
Pseudomonas aeruginosa, ЛПС E.Coli). Регуляция экспрессии iNOS предполагает
присутствие на промоторах генов NOS2 целого ряда транскрипционных факторов (NFkB, STAT-1, IRF-1, AP-1, Oct1, C/EBR), активация которых проходит разными путями,
поэтому сочетанное воздействие индуцирующих факторов, как правило, вызывает
синергичную экспрессию iNOS [Teng X., 2002; Huang H., 2004; Pautz A., 2010; Rahat
M.A., 2011]. Подавление экспрессии, снижение стабильности iRNA и усиленный
протеолиз iNOS наблюдается при воздействии кортикостероидов и TGF, а также при
длительном действии высоких концентраций NO и cGMP [Perez-Sala D.,. 2001; Korhonen
R., 2002; Mitani T., 2005].
После воздействия индуцирующих факторов iRNA iNOS обнаруживается через 35 часов, а протеины iNOS и их активность – через 5-6 часов и наблюдаются до 48 часов
после индукции. Масштаб индуцированной экспресии iNOS, как правило, существенно
превышает уровень экспрессии конститутивных NOS - после индукции iNOS
продуцирует в тканях микромолярные концентрации NO, что на 2-3 порядка превышает
активность nNOS и eNOS.
Для образования активной формы NOS необходимо наличие L-аргинина и всех
кофакторов, которые кооперативно участвуют в процессе димеризации. Важным
регулятором димеризации конститутивных NOS являются ионы Ca2+. CaM связывается с
протеинами nNOS и eNOS только при наличии в его структуре Ca2+, поэтому in vitro при
концентрации Ca2+ меньше 10 нМ конститутивные NOS полностью неактивны, а при
концентрации выше 500 нМ – максимально активны. В отличие от конститутивных
NOS, при димеризации iNOS CaM образует прочную связь с протеином фермента без
участия Ca2+, поэтому активность этой изоформы слабо зависит от его концентрации
[Daff S., 2003; Spratt D.E., 2007; Wu G., 2011]. Другими путями регуляции активности
NOS являются модификация протеинов ферментов и их взаимодействие с NOSассоциированными протеинами.
32
После синтеза eNOS N-концевая область протеина ацилируется - на Gly2
переносится
остаток
миристиновой
кислоты.
Образовавшаяся
N-Myr-eNOS
перемещается в примембранную область цитозоля, где повторно ацилируется - на Cys15
и Cys26 переносятся два остатка пальмитиновой кислоты. Наличие в протеине трѐх
гидрофобных остатков придаѐт eNOS способность встраиваться в липидный слой
мембранных структур, поэтому практически вся активная eNOS связана с клеточной
мембраной и, в меньшей степени, с мембранами комплекса Гольджи. Причѐм,
значительная часть мембранно-связанной eNOS находится в кавеолах – инвагинациях
клеточной мембраны, в которых сосредоточены многие рецепторные и сигнальные
белки, что способствует сопряжению eNOS с рядом трансмембранных процессов [Shaul
P.W., 2002; Oess S., 2006; Dudzinski D., 2006, 2007; Patel H.H., 2008; Villanueva C., 2010;
Qian J., 2013]. При низкой концентрации Ca2+ c eNOS, находящейся в кавеолах, вместо
CaM-Ca2+ связывается мембранно-связанный белок кавеолин (Cav1 и Cav2 – в
эндотелии, Cav3 – в мышцах). В отличие от CaM, Cav не обеспечивает транспорт
электронов, и в таком состоянии eNOS неактивна. Повышение в цитозоле содержания
Ca2+ при действии различных факторов (ацетилхолин, брадикинин, гистамин, аденозин
и др.) увеличивает концентрацию CaM-Ca2+, который вытесняет Cav из eNOS и
активирует фермент. Вытеснению Cav и стабилизации димера eNOS способствует также
белок теплового шока Hsp90.
Многие факторы (VEGF, EGF, TGF, эстрадиол, инсулин, брадикинин) влияют на
активность eNOS путѐм PI3K/Akt-зависимого фосфорилирования. Фосфорилирование в
eNOS человека Ser617, Ser635 и Ser1177 значительно, в 15-20 раз, повышает активность
фермента, усиливая связь с CaM-Ca2+ и ускоряя внутримолекулярный транспорт
электронов [Dudzinski D.M., 2007; Santolini J., 2011; Feng C., 2012; Ramadoss J., 2013;
Qian J., 2013]. Но длительное действие факторов, индуцирующих активность eNOS,
приводит к обратному эффекту - удаляются остатки пальмитата, фосфорилируется Thr495
и нитрозилируются Cys94 и Cys99, что сопровождается инактивацией фермента,
отделением его от мембраны, распадом димера и транслокацией неактивной eNOS в
цитозоль, где фермент подвергается протеолизу или с помощью транспортных белков
возвращается к мембране для нового «цикла жизни» [Dudzinski D.M., 2006, 2007;
Ramadoss J., 2013].
33
nNOS не ацилируется и поэтому не встраивается в липидные структуры, тем не
менее, большая часть активной nNOS ассоциирована с клеточными мембранами и
сарколеммой – в N-концевой области nNOS расположен PDZ-домен, который способен
связываться с мембранными гликопротеидами, что обеспечивает синаптическую
компартментацию фермента в нейронах и его ассоциацию с сарколеммой в скелетных
мышцах и кардиомиоцитах. Взаимодействие PDZ-домена с протеинами PSD-95 и
CAPON обеспечивает ассоциацию nNOS с инотропными глутаматными MNDA
рецепторами постсинаптической мембраны глутаматэргических и холинэргических
синапсов,
взаимодействие
локализацию
nNOS
в
с
синтрофином
области
и
синаптобревином
пресинаптической
мембраны
обеспечивает
ацетилхолиновых
рецепторов, а с синтрофином и дистрофином в миоцитах и кардиоцитах - в области
сарколеммы и постсинаптической мембраны m2-холинорецепторов, и сопряжение
функции nNOS с кальциевыми каналами VDCC и RyR [Paton J.F., 2002; Oess S., 2006;
Zhou L., 2009; Adams M.E., 2010; Niu X., 2012]. Часть nNOS в миоцитах, кардиоцитах и
эпителиальных клетках локализована в кавеолах, где, при низких концентрациях Ca2+,
может инактивироваться при взаимодействии с Cav1 и Cav3. Подобно eNOS, активность
nNOS может регулироваться путѐм PI3K/Akt-зависимого фосфорилирования Ser1412,
повышающего
ферментативную
активность,
или
путѐм
PK1,
PK2-зависимого
фосфорилирования Ser741 и Ser847, подавляющего активность nNOS [Watanabe Y., 2003;
Song T., 2004; Rameau G.A., 2007].
iNOS также в значительной мере ассоциирована с мембранными структурами - в
активированных макрофагах iNOS выявляется в плазматической мембране, мембранах
лизосом и пероксисом, и, в меньшей степени, в цитозоле и митохондриях.
Субклеточную локализацию iNOS определяет еѐ взаимодействие с протеинами CAPON,
Rac1, Rac2, EBR50, но iNOS, по-видимому, не имеет прочного контакта с мембранами,
так как легко экстрагируется из клеток [Alderton W.K., 2001; Zhang W., 2003; Oess S.,
2006; Villanueva C., 2010].
iNOS также подвержена посттрансляционной модификации - индуцируемое
патогенами и цитокинами ERK/MAP-зависимое фосфорилирование Ser745 повышает
активность iNOS [Brovkovych V., 2011; Lowry J.L., 2013]. Кроме того, на активность
iNOS влияют некоторые NOS-ассоциированные пептиды - в глиальных клетках белок
калирин, а в макрофагах – NAP110 подавляют активность этих ферментов, блокируя
34
димеризацию, а Hsp90, наоборот, стабилизирует димер и повышает продуктивность
iNOS [Ratovitski E.A., 1999; Yoshida M., 2003]. Кроме того, как и в случае
конститутивных
NOS,
S-нитрозилирование
цистеина
в
области
Zn-тиолатного
комплекса ведѐт к распаду димера и инактивации iNOS [Mitchell D.A., 2005].
L-аргинин, являясь субстратом для синтеза NO и фактором, необходимым для
димеризации NOS, оказывает влияние на активность всех изоформ NOS. В клетки Lаргинин поступает через катион-аминокислотные транспортные комплексы (CAT),
значительная часть которых находится в области кавеол. Сопряжение поступающего
потока L-аргинина и мембранно-ассоциированных в кавеолах eNOS и nNOS, вероятно,
является необходимым условием функционирования конститутивных NOS [Dudzinski
D.M., 2006, 2007; Ramadoss J., 2013]. Регуляция пула L-аргинина оказывает
значительное влияние и на активность iNOS. Воздействие патогенов и цитокинов,
индуцирующих iNOS, также повышает экспрессию CAT и уменьшает экспрессию
ферментов орнитинового цикла, в частности, аргиназы. В результате, параллельно с
экспрессией iNOS, повышается поступление L-аргинина, и его внутриклеточный
метаболизм смещается в сторону синтеза NO. При воздействии же кортикостероидов и
TGF наблюдаются обратные изменения – подавление экспрессии iNOS и повышение
экспрессии аргиназы, в результате ограничивается синтез NO, а метаболизм L-аргинина
смещается в сторону синтеза мочевины [Korhonen R., 2002; Bansal V., 2003; El-Gayer S.,
2003; Mitani T., 2005; Huynh N.N., 2006].
Недостаток L-аргинина и BH4, потеря гема, S-нитрозилирование стимулируют
диссоциацию и способствуют протеолизу NOS. При наличии субстрата и кофакторов
резистентность димеров к диссоциации и протеолизу наибольшая у конститутивных
NOS (eNOSnNOS>>iNOS). Т1/2 жизни eNOS и nNOS в тканях человека составляет 2022 часа [Shaul P.W., 2002; Qian J., 2013]. Время жизни iNOS существенно ниже (Т1/2 в
эпителии бронхов человека - около 1,6 часа), что связано с быстрым истощением BH4 и
S-нитрозилированием при активной экспрессии iNOS [Kolodziejski P.J., 2004].
1.3 Биологические и физиологические функции оксида азота
Спектр биологического действия NO в значительной мере зависит от его
концентрации (рисунок 1.5). При низком уровне концентрации, который сопровождает
функцию конститутивных изоформ NOS (еNOS и nNOS), оксид азота, взаимодействуя с
35
пространственно ассоциированными регуляторными белками, участвует в реализации
различных функций: вазо- и бронходилятация, регуляция тонуса гладких мышц,
сократимости миокарда и скелетных мышц, активности тромбоцитов, в регуляции
нейротрансмиссии, пролиферации клеток и процессов ангиогенеза, а также проявляет
цитопротективные свойства, оказывая противовоспалительное, антиоксидантное и
антиапоптотическое действие. При высоких концентрациях NO, возникающих при
активной
экспрессии
iNOS
и
фосфорилировании
eNOS,
нитрозолированию
подвергаются не только регуляторные клеточные мишени, но нуклеиновые кислоты и
многие жизненно важные ферменты. При этом NO и его метаболиты проявляют
антимикробное, проапоптотическое, провоспалительное и цитотоксическое действие.
Рисунок 1.5 - Спектр биологических и физиологических функций оксида азота
NO способен изменять активность многих ферментов, взаимодействуя с их
функционально важными группами, в первую очередь, с гемовым железом и тиолами, и
таким путѐм оказывать влияние на многие физиологические и патологические процессы.
Ярким примером heme-Fe-нитрозильной модификации является активация sGC.
Присоединение NO к heme-Fe(II) регуляторной субъединицы sGC вызывает изменение
структуры
активного
центра
и
конформации
белка,
которое
сопровождается
повышением каталитической активности sGC-heme-Fe-NO в десятки раз [Bellamy T.C.,
36
2002; Garthwaite J., 2010; Derbyshire E.R., 2012; Forstermann U., 2012] и, как следствие,
ростом уровня важного внутриклеточного регулятора – cGMP. Эта взаимосвязь
активности синтеза NO и уровня сGMP является основой NOS/cGMP-зависимого пути
регуляции многих биологических процессов и функций – тонуса сосудов, дыхательных
путей и гладких мышц, моторики ЖКТ, адгезии и агрегации тромбоцитов, синтеза и
секреции ряда гормонов, процесов ангиогенеза, функции холинергических синапсов и
др. Heme-Fe-нитрозильной реакции подвержены и другие гемопротеины, и в ряде
случаев эта модификация также изменяет свойства ферментов - в частности, этим путѐм
NO влияет на активность циклооксигеназ и митохондриальных цитохромов [Brown G.C.,
2007; Осипов А.Н., 2007; Taylor C.T., 2010; Groschner L.N., 2012], участвуя в регуляции
воспалительных процессов, клеточного дыхания и редокс-гомеостаза.
Другим распространенным механизмом участия NO в регуляции биохимических
и физиологических процессов является модификация ферментов, ионных каналов и
рецепторов путѐм S-нитрозилирования аминокислотных остатков. Этим путѐм NO
осуществляет саморегуляцию активности NOS, влияет на сократимость скелетной
мускулатуры и миокарда, формирование нейрональных сетей, пластичность и функцию
глутаматэргических синапсов и адренорецепторов, модулирует процессы апоптоза
[Brune B., 2003; Mitchell D.A., 2005; Martinez-Ruiz A., 2005; Iyer A.K., 2008; Olson S.Y.,
2008; Vincent S.R., 2010; Niu X., 2012; Shahani N., 2012; Hardingham N., 2013; Jian Z.,
2014].
1.3.1 Участие в регуляции тонуса сосудов и других гладкомышечных клеток
Влияние NO на сосудистый тонус было впервые продемонстрировано более 30
лет назад [Furchgott R.F., 1980] и с тех пор довольно хорошо изучено. Синтезируемый в
эндотелиоцитах NO диффундирует к гладкомышечным клеткам сосудов и вызывает их
релаксацию. Вазодилятаторы повышают активность eNOS различными путями. Так,
взаимодействие ацетилхолина со своими рецепторами на мембране эндотелиоцитов
приводит к росту концентрации Ca2+ в цитоплазме за счѐт его выхода из
саркоплазматического ретикулума, что потенцирует образование активных димеров
eNOS. Брадикинин, факторы роста VEGF, EGF и TGF, эстрадиол, инсулин повышают
каталитическую активность eNOS, главным образом, путѐм PI3K/Akt-зависимого
фосфорилирования Ser617, Ser635 и Ser1177. Метаболический стресс, умеренная ишемия и
37
деформационное напряжение сдвига активируют eNOS путѐм фосфорилирования Ser1177
сАМР-зивисимой киназой [Cohen R.A., 1999; Ignarro L.G., 2002; Dudzinski D., 2006,
2007; Ramadoss J., 2013; Qian J., 2013]. Усиление синтеза NO в эндотелиальных клетках
сопровождается ростом его концентрации и в близлежащих гладкомышечных клетках,
и, как следствие, повышением активности sGC и ростом уровня cGMP в миоцитах. В
свою
очередь,
повышение
концентрации
cGMP
активирует
cGMP-зависимую
протеинкиназу (PGK) и cGMP-зависимые саркоплазматические кальциевые каналы.
PGK дефосфорилирует лѐгкие цепи миозина, что ведѐт к разрыву актин-миозиновых
сшивок, а высвободившийся из миофибрилл Ca2+ перемещается в саркоплазматический
ретикулум. В результате миофибриллы релаксируются, тонус миоцитов в сосудистой
стенке снижается и развивается вазодилятация.
При повышении концентрации NO фармакологическими средствами (донорами
NO) снижается тонус артериальных и, в большей степени, венозных сосудов,
уменьшается пред- и постнагрузка на сердце, и давление наполнения желудочков. В
коронарных сосудах дилятирующее действие NO направлено в основном на мелкие
артерии венечного бассейна, особенно на изменѐнные атеросклеротическим процессом
участки [Li, N., 2001; Мазур Н.А., 2006; Косарев В.В., 2010; Fonseca V., 2010; Nossaman
V.E., 2010].
Фармакологическое ингибирование синтеза NO приводит к повышению тонуса
сосудов, что, по мнению многих авторов, позволяет предполагать участие недостатка
эндогенного синтеза оксида азота в генезе эссенциальной гипертензии, преэклампсии и
ишемической болезни сердца [Маянская С.Д., 2009; Попова А.А., 2009; Лисицына Н.В.,
2010; Caimi G., 2010; Жабченко И.А., 2012; Qian J., 2013; Tang L., 2014; Bernatova I.,
2014]. Так при дистрофических изменениях в эндотелии сосудов наблюдается
существенное ослабление NO-индуцированной вазодилятации [Медведева Н.А., 2005].
Слабое сосудорасширяющее действие доноров NO наблюдается и в атипичных сосудах
злокачественных новообразований [Morikawa S., 2002; Baluk P. 2005]. Это явление
связывают как с нарушениями морфологии сосудистой стенки, так и с подавлением
активности
eNOS/sGC-пути.
При
эндотелиальной
дисфункции
происходит
S-
глутатионирование eNOS, подавляющее еѐ активность, нарушается обмен кофакторов
NOS и функция клеточных рецепторов, и усиливается синтез ассиметричного
диметилированного аргинина, являющегося эндогенным ингибитором NOS [Bedford
38
M.T., 2009; Al-Zobaidy M.J., 2010; Chen C.A., 2010; Zweier J.L., 2011; Mohan S., 2012;
Klinger J.R., 2013; Bernatova I., 2014; Sheen J.M., 2014].
На сосудистый тонус оказывает влияние активность и других изоформ NOS. Так,
в нормальных, физиологических условиях nNOS нитрергических нейронов, независимо
от эффектов nNOS в ЦНС, также участвует в регуляции тонуса периферических сосудов
(см. раздел 1.3.3). Влияние NO, синтезируемого nNOS, сказывается на базальном тонусе
регионарных сосудов и затрагивает, главным образом, коронарные сосуды и сосуды
мозга, лѐгких, почек и скелетной мускулатуры [Seddon M.D., 2008, 2009; Melikian N.,
2009; Toda N., 2009; Copp S.W., 2013]. По этой причине ряд ингибиторов
фосфодиэстеразы 5 (силденафил и тадалафил), которые, блокируя разложение cGMP,
биохимически усиливают нитрергическое влияние nNOS, показали терапевтическую
эффективность и начали использоваться при лечении лѐгочной артериальной
гипертензии.
Повышенная продукция эндогенного NO вследствие активной экспрессии iNOS и
фосфорилирования eNOS определяет вазодилятацию, повышение проницаемости
сосудов и усиление миграции лимфоидных клеток в очаге воспаления [Tripathi P., 2007;
Mackenzie I.S., 2008; Ziskoven C., 2010; Roe N.D., 2012; Szalai Z., 2014]. Крайне
негативную роль гиперпродукция NO играет при генерализации воспалительного
процесса на фоне сепсиса или эндотоксемии. В этом случае стойкое снижение тонуса
сосудов ведѐт к развитию вазодилятационного шока, лечение которого представляет
чрезвычайно сложную проблему [Голиков П.П., 2004; Cauwels A., 2007; Hollenberg S.M.,
2009; Jang D.H., 2013; Gkisioti S., 2011]. При этом длительное сохранение высоких
концентраций NO сопровождается нитрозилированием важных ферментов и протеинов,
что приводит к развитию таких угрожающих осложнений, как метаболический
дистресс-синдром, полиорганная дисфункция и рефрактерность сосудов, которые
значительно повышают летальность [Волков В.Е., 2009; Westphal M., 2009; Dumbarton
T.C., 2011; Lange M., 2011; Ward P.A., 2012; Nardi G.M., 2014; Fink M., 2014].
Во многих экспериментальных работах показана способность ингибиторов NOS
различных
химических
классов
предотвращать
или
ослаблять
циркуляторные
нарушения у подопытных животных, вызванные сепсисом или эндотоксемией
[Narayanan K., 1995; Kilbourn R.G., 1990, 1997; Wray G.M.., 1998; Tabatabaie T., 2000;
Alderton W.K. 2005; Проскуряков С.Я., Филимонова М.В., 2002, 2004; Bateman R., 2008;
39
Филимонова М.В., 2011, 2012; Lange M., 2011; Nardi G.M., 2014]. Обнадѐживающие
результаты получены и в клинических испытаниях L-NMMA, L-NNA и L-NAME,
длительная инфузия которых больным в состоянии тяжѐлого септического шока
поддерживала среднее АД выше 70 мм.рт.ст. без необходимости использования других
вазопрессоров [Avontuur J.A., 1998; Bakker J., 2004; Lopez, 2004; Watson D., 2004;
Juffermans N.P., 2010; Dumbarton T.C., 2011].
Сходным образом NO воздействует и на другие гладкомышечные клетки. Оксид
азота, выделяемый периферическими нитрергическими нейронами, вызывает снижение
моторики ЖКТ, расслабление сфинктера Одди, нижнего пищеводного сфинктера и
круговых мышц прямой кишки, модулирует перистальтику глотки и пищевода. При
этом показано, что некоторые нарушения тонуса гладких мышц в ЖКТ (например,
гастро-эзофагеальный рефлюкс) могут быть связаны с гиперактивностью nNOS и
избыточной продукцией NO периферическими нитрергическими нейронами [Takeuchi
T., 1998; Lefebvre R.A., 2002; Lecea B., 2011].
Оксид азота, продуцируемый эндотелием, релаксирует трабекулярную сеть и
ресничные мышцы глаза [Stumpff F., 2000]. NO, продуцируемый эпителием бронхов и
нитрергическими нейронами, расслабляет гладкие мышцы крупных бронхов, снижает
воздушное сопротивление дыхательных путей и снижает бронхоспазм. При вдыхании
NO не только ослабляется бронхоспазм, но и повышается барьерная функция
дыхательных путей - увеличивается продукция муцина, возрастает активность
подслизистых желѐз, ускоряются движения ворсинок реснитчатого эпителия [Wang T.,
2003; Xu W., 2006; Krishnan R., 2008]. В настоящее время активно изучается
перспективность применения дыхательных смесей NO и фармакологических доноров
оксида азота для регуляции лѐгочного кровотока, тонуса бронхов и функции
бронхиального эпителия [Gaston B., 1993; Turner D.I., 2012; Porta N.F., 2012].
1.3.2 Участие в регуляции адгезии клеток крови, защите эндотелия,
сократимости и тонуса кардиомиоцитов и скелетных мышц
Оксид азота, продуцируемый эндотелием сосудов и клетками крови, оказывает
существенное влияние на адгезию и агрегацию тромбоцитов. Как и в гладкомышечных
клетках, повышение концентрации NO в тромбоцитах сопровождается ростом уровня
cGMP и перемещением Ca2+ в саркоплазматический ретикулум. Падение уровня Ca2+ в
40
цитоплазме снижает активность PI3-киназы, что подавляет в тромбоцитах экспрессию и
активацию поверхностных рецепторов, необходимых для связывания с фибриногеном и
коллагеном - Р-селектина и IIb/IIIa-гликопротеида. В результате блокируется активация
тромбоцитов и замедляется их адгезия и агрегация к эндотелию [Абакумов М.М., 2005;
Lubos E., 2008; Naseem K.M., 2008; Tymvios C., 2009; Omar S.A., 2014].
Клинически показано, что при приѐме фармакологических доноров NO снижается
вязкость крови и замедляется тромбообразование [Абакумов М.М., 2005; Harmon S.,
2012; Omar S.A., 2014]. Однако антитромботическое влияние NO может приобретать и
патологический характер, способствующий развитию геморрагического синдрома. Так,
показано,
что
у
больных
с
дизагрегационной
тромбоцитопатией
и
тромбоцитопенической пурпурой в крови наблюдается резко повышенный уровень NO
и его метаболитов, включая пероксинитрит [Маткаримова Д.С., 2013]. Повышенный
уровень NO, возможно, также является причиной спонтанных кровотечений при уремии
на фоне почечной недостаточности и геморрагий при язвенной болезни желудка [Star
R.A., 1993; Павлов В.В., 2011].
Ингибирование активности NOS у здоровых добровольцев увеличивает время
свѐртывания и ухудшает ряд показателей коагулограммы. Это, по мнению авторов,
свидетельствует, что ослабление синтеза NO при поражении эндотелия может являться
важным звеном в развитии тромбозов [Freedman J.E., 2003; Голиков П.П., 2004; Omar
S.A., 2014; Bernatova I., 2014]. В то же время, вероятно, в связи с многофакторностью
регуляции свѐртывания крови, модуляция синтеза NO фармакологическими средствами
не вызывает «драматических» изменений гомеостаза. Так, инфузия L-NMMA в дозе 5-20
мг/кг/час в течение 2 недель больным в состоянии септического шока не вызывала
изменений в реологии крови, требующих коррекции [Bakker J. 2004; Lopez A., 2004;
Watson D., 2004], а инфузия L-NMMA в дозе 1 мг/кг/час в течение 5 часов больным с
острым инфарктом миокарда, отягощѐнным кардиогенным шоком, не осложняла
состояние пациентов, а, напротив, повысила на 25% их 30-суточную выживаемость
[Alexander J.H., 2007].
Эндотелиальный NO контролирует также ряд генов, участвующих в атерогенезе подавляет экспрессию хемоатрактанта MCP-1.80, а также экспрессию и связывание
адгезивных рецепторов CD11/CD18 с поверхностью клеток эндотелия, и таким путѐм
ингибирует адгезию лейкоцитов [Kubes P., 1991; Hossain M., 2012], которая является
41
ранним событием в развитии атеросклероза. Существенна также роль оксида азота в
защите целостности эндотелия. NO при низких концентрациях предотвращает апоптоз
эндотелиоцитов (см. раздел 1.3.5), индуцированный воспалительными цитокинами и
АФК [Ni L., 2013]. Оксид азота способен оказывать ингибирующее влияние и на
поздние стадии развития атеросклероза - блокируя активацию тромбоцитов, NO
подавляет выделение тромбоцитарного фактора роста, который стимулирует деление
миоцитов и синтез протеинов матрикса в стенке сосудов, что необходимо для
формирования фиброзных бляшек [Forstermann U, 2008, 2012].
Таким образом, участие в регуляции тонуса сосудов, антитромботическое,
антиатерогенное действие и участие в адаптации сосудистой сети к длительным
патологическим условиям (см. раздел 1.3.4) позволяют, в целом, рассматривать оксид
азота как важный, существенный фактор поддержания сосудистого гомеостаза [Ignarro
L.G., 2002; Голиков П.П., 2004; Forstermann U., 2008, 2012; Qian J., 2013; Tang L., 2014;
Omar S.A., 2014].
В кардиомиоцитах и миоцитах скелетной мускулатуры присутствуют обе
конститутивные изоформы. eNOS локализована в кавеолах и, в значительной степени,
ассоциирована -адренэргическими рецепторами. nNOS в этих клетках находится,
главным образом, в саркоплазматическом ретикулуме [Bredt D.S., 2003].
Воздействие
-агониста
c
рецептором
стимулирует
аденилатциклазу
и
ассоциированные с рецептором кальциевые каналы L-типа (LTCC), в результате чего в
миоцитах возрастает уровень cAMP и Ca2+, и активируется cAMP-зависимая киназа А, и,
в конечном итоге, повышается базальный тонус и сократимость миофибрилл. В то же
время, рост цитоплазматической концентрации Ca2+ стимулирует конститутивные NOS.
Повышение продукции NO при этом по NOS/cGMP-пути и путѐм S-нитрозилирования
ингибирует функцию LTCC, а также кальциевых RyR-каналов саркоплазматического
ретикулума, в результате чего ослабляются потоки Ca2+, и ограничивается инотропное и
хронотропное β-адренэргическое влияние [Martin S.R. et al., 2006; Michel T., 2010b; Jian
Z., 2014].
Участие в этих процессах eNOS и nNOS, судя по всему, существенно различается.
В настощее время получены экспериментальные доказательства, что на базальный
тонус, процессы релаксации и сократимость при адренергической стимуляции в
миокарде и скелетных мышцах оказывает влияние, главным образом, активность nNOS.
42
Показано, что селективное подавление активности nNOS сопровождается повышением
базального тонуса и усилением инотропного и хронотропного эффектов -агонистов, а у
нокаутных животных nNOS-/- данный генетический дефект неизбежно приводит к
развитию гипертрофии левого желудочка [Sears C.E., 2003, 2004; Casadei B., 2006;
Vansburger M.H., 2012; Niu X., 2012; Shibata K., 2013; Tang L., 2014]. Активность же
eNOS в этих процессах определяет возбудимость миокардиоцитов, подавляет
аритмогенные эффекты -адреномиметиков и модулирует реакцию кардиомиоцитов на
механическое растяжение [Petroff M.G., 2001; Wang H., 2008; Tang L., 2014; Jian Z.,
2014].
Примерами патологий, связанных с нарушением данных функций NOS, являются
мышечные дистрофии Дюшенна (МДД) и Бекера, вызваные мутациями в гене,
кодирующем дистрофин, который определяет в миокарде и скелетной мускулатуре
локализацию и функцию nNOS (см. раздел 1.3.3). Нарушение экспрессии дистрофина
при МДД сопровождается также подавлением экспрессии самой nNOSμ и низким
содержанием функциональных комплексов nNOSµ-дистрофин-гликопротеин [Chang
W.J., 1996]. При этом наряду с дистрофией склетных мышц развивается кардиомиопатия
и респираторные осложнения, связанные с поражением дыхательной мускулатуры На
моделях МДД показано, что экспрессия трансгенной iRNA nNOS способствует
длительной защите миоцитов при этой патологии [Tidball J.G., 2004].
1.3.3 Нейромедиаторные функции
В поддержании мозгового кровотока важную роль играет NO эндотелиального
происхождения. Такое же действие может оказывать и NO, образующийся в нервных и
глиальных клетках при участии nNOS [Seddon M.D., 2008, 2009; Melikian N., 2009; Toda
N., 2009], однако функции nNOS в клетках нервной системы существенно шире.
nNOS активно экспрессируется в нейронах мозжечка и астроглии, а также в более
низком количестве присутствует в нейронах гипоталамуса, среднего мозга, стриатума,
коры, гиппокампа и продолговатого мозга. Нейрональный NO в нервной системе
является медиатором болевой чувствительности, термочувствительности, обоняния,
зрительного восприятия, восприятия пищи и воды, участвует в процессах координации
баланса, играет центральную роль в процессах долгосрочной потенциации и,
43
соответственно, памяти и обучения [Han R.Z., 2009; Vincent S.R., 2010; Antonov I., 2010;
Paul V., 2011; Yang Y., 2013; Hardingham N., 2013].
Такая роль оксида азота связана с тем, что NO участвует в регуляции выхода
нейромедиаторов и контролирует нейротрансмиттерные процессы. Значительная часть
nNOS в нейронах ассоциирована с инотропными глутаматными NMDA-рецепторами.
Связывание глутамата с NMDA-рецептором открывает кальциевый канал, что вызывает
активацию nNOS, локализованной в постсинаптической области. Синтезированный NO,
диффундируя по всем направлениям, играет роль медиатора, переносящего сигнал на
все клетки, расположенные в радиусе до 150 мкм от глутаматного нейрона. Ближайшей
мишенью при этом является пресинаптический нейрон, где NO/cGMP-путѐм происходит
активация cGMP-зависимой протеинкиназы PKG. Активированная PKG фосфорилирует
потенциал-зависимый кальциевый канал (ICa,N) в пресинаптической мембране, что
приводит к усилению выброса глутамата и росту синаптической проводимости. Такое
действие NO обеспечивает быструю реакцию рецептора и долгосрочную потенциацию
синапсов, которые лежат в основе формирования сложных рефлексов, памяти и
процессов обучения [Paul V., 2011; Yang Y., 2013; Hardingham N., 2013].
Существуют данные о том, что NO, синтезированный nNOS на уровне
продолговатого и среднего мозга, регулирует активность симпатических нейронов и
таким путѐм участвует в центральном контроле АД и сердечной деятельности –
внутрижелудочковое введение L-NNA повышает симпатический тонус и АД, и это
действие отменяется перерезкой спинного мозга на уровне С1-С2 [Togashi P., 1992;
Sabino J.P., 2011].
Кроме того, NO является медиатором некоторых вегетативных нитрергических
нейронов, содержащих в окончаниях nNOS. Продуцируемый такими нейронами оксид
азота ведѐт себя как атипичный нейромедиатор, стимулируя NO-чувствительную sGC
эффекторных клеток. Таким путѐм NO участвует в регуляции функций органов
пищеварения, тонуса бронхов, эрекции [Krishnan R., 2008; Sanderson N.S.R., 2008;
Vincent S.R., 2010; Lecea B., 2011; Hardingham N., 2013]. Например, показано, что
минимальная стимуляция sGC пещеристых тел NO, выработанным nNOS, и
последующий синтез небольших количеств cGMP является необходимым условием для
развития проэректильного эффекта таких известных ингибиторов фосфодиэстеразы 5,
как силденафил, варденафил и тадалафил [Rosen R.C., 2003].
44
Гиперактивность nNOS также может играть существенную роль в патологических
процессах. Показано, что некоторые нарушения моторики ЖКТ могут быть связаны с
избыточной активностью nNOS в периферических нитрэргических нейронах [Lefebvre
R.A., 2002]. Аномальная регуляция nNOS в ЦНС играет роль в развитии ряда
неврологических заболеваний. Так, поражение нейронов при ишемии мозга, рассеяном
склерозе, болезнях Альцгеймера, Хантингтона и Паркинсона, и воздействии некоторых
нейротоксинов
развивается
вследствие
гиперактивности
глутаматных
NMDA-
рецепторов [Башкатова В.Г., 1998, 2012; Bolanos J.P., 1999; Раевский К.С., 1998, 2000;
Steinert J.R., 2010; Егоров А.Н., 2012]. Избыточное высвобождение глутамата или
воздействие высокой дозы токсического NMDA-агониста вызывает массивный приток
Ca2+ через каналы NMDA-рецепторов, что резко стимулирует ассоциированные с ними
nNOS. При этом активный синтез NO сопровождается также высокой продукцией
супероксида и пероксинитрита. Источником супероксида в этом случае является сама
nNOS (см. раздел 1.2), а также экспрессируемая в микроглии при ишемии мозга
NADPH-оксидаза [Stuehr D.J, 2001; Gorren A.C., 2002; Forstermann U., 2012]. Высокие
концентрации активных форм кислорода и азота вызывают поражение мембран
митохондрий, а высокие уровни NO способствуют энергетическому истощению за счѐт
ингибирования цитохромов дыхательной цепи и гликолитических ферментов, что и
приводит к гибели нейронов.
Об участии nNOS и iNOS в глутаматной нейротоксичности свидетельствует
способность ряда селективных ингибиторов этих изоформ предотвращать развитие,
индуцированной гипоксией и гиперстимуляцией глутаматных рецепторов, гибели
нейронов, ограничивать объѐм поражений мозга на моделях инсульта и черепномозговой травмы, ослаблять нейродегенеративные изменения плода при гипоксии у
подопытных животных, оказывать защитное действие на моделях периферических
нейропатий [Chambrier P.E., 1999; Parmentier S., 1999; Raoul C., 2002; Jafarian-Tehrani M.,
2005; Silverman R.B., 2009; Крушинский А.Л., 2010; Broom L., 2011; Dableh L.J., 2011;
Yuste J.E., 2012; Салыкина М.А., 2013].
1.3.4 Участие в ангиогенезе и регенераторных процессах
Основным путѐм индукции процессов формирования новой сети сосудов из
существующих сосудистых структур является высвобождение ангиогенных факторов,
45
источниками которых являются макрофаги, фибробласты, тучные, эндотелиальные и
эпителиальные клетки [Xiong Y., 2010; Shaw L.C., 2011]: фактора роста эндотелия
сосудов (VEGF), фактора роста фибробластов (FGF), эпидермального фактора роста
(EGF), фактора роста гепатоцитов (HGF), ангиогенина (ANG), ангиопоэтинов (Ang-1,
Ang-2). Неспецифически стимулируют ангиогенез IGF-1, TNF, IL-8 и матриксные
металлопротеазы.
Авторы исследований ангиогенеза среди множества модуляторов отводят особое
место NO и биохимическим процессам, протекающим с его участием [Miller T.W., 2009;
Isenberg J.S., 2009; Ziche M., 2009; Burke A.J., 2013; Cheng H., 2014]. Действие
большинства проангиогенных факторов сопровождается длительным повышением
уровня NO в эндотелии сосудов, которое развивается вследствие возрастания
активности eNOS. Влияние на активность eNOS ангиогенные факторы реализуют
различными путями - изменением экспрессии, посттранскрипционной модификацией,
взаимодействием с регуляторными и ассоциированными протеинами [Dudzinski D.,
2006, 2007; Ramadoss J., 2013; Qian J., 2013]. Многие ангиогенные факторы усиливают
экспрессию eNOS в эндотелиальных клетках. Такое влияние экспериментально показано
для VEGF, bFGF, EGF, oxLDL, IGF-1, инсулина, эстрогенов. Кроме того, большинство
ангиогенных факторов повышают и собственно каталитическую активность eNOS.
Например, VEGF индуцирует три различных процесса, каждый из которых способствует
росту активности eNOS: фосфорилирование Ser1177 по PI3K/Akt пути; повышение
цитоплазматической концентрации Ca+2 и фосфорилирование Ser1177 по AMPK пути;
фосфорилирование Tyr83 Hsp90 по TSAd/Src пути и образование стабильного комплекса
eNOS/Akt/Hsp90 [Fulton D., 1999, 2008; Reihill J.A., 2007; Корчагина А.А., 2013]. Эти
модификации ослабляют зависимость eNOS от Ca+2, облегчают взаимодействие с CaM и
увеличивают скорость синтеза NO. Прямо или косвенно повышают активность eNOS и
многие другие проангиогенные факторы, в том числе, и факторы опухолевого
ангиогенеза: PlGF, Ang1, AGF, bFGF, S1P, эстрогены, инсулин, IGF1, адреномедуллин.
Стойкое повышение продукции NO в эндотелиальных клетках, в свою очередь,
стимулирует экспрессию VEGF и VEGFR2, а также инициирует дальнейший каскад
биохимических процессов (прямая активация c-Scr, sGC/cGMP-зависимая активация
cGK-I и CNG-каналов), ведущих к длительному снижению тонуса и повышению
проницаемости сосудов, миграции и пролиферации эндотелиальных клеток, и, в
46
конечном итоге, к развитию новой сосудистой сети [Ignarro L.G., 2002; Ziche M., 2009;
Kanwar J.R., 2009; Burke A.J., 2013; Cheng H., 2014].
Участвуя в процессах физиологического ангиогенеза, NO играет важную роль в
развитии, нормальном росте тканей, заживлении ран и переломов, в репродуктивных
функциях женщин, а также в адаптации сосудистой системы к патологическим
условиям – например, в реваскуляризации после инфаркта миокарда или при
хронической ишемии конечностей [Талицкий К.А., 2011; Bir S.G., 2012; Титов, В.Ю.,
2014]. Так, показано, что морфология лѐгких eNOS-дефицитных мышей характеризуется
дефектами развития сосудов и дыхательных путей, сходными с картиной альвеолярной
дисплазии у человека, наблюдаемой при злокачественной форме лѐгочной гипертензии
новорожденных [Han R.N., 2006]. Изменение активности синтеза NO существенно
влияет и на процессы регенерации - обработка эндоскопическим путѐм слизистой ЖКТ
при язвенной болезни газовой смесью NO ускоряет васкуляризацию в 3 раза, а
эпителизацию дефектов - в 8 раз [Андреев В.Г., 2006; Поваляев А.В., 2009]. NO в
газовом потоке также существенно ускоряет регенерацию при травмах глаз [Чеснокова
Н.Б., 2003; Гундорова Р.А., 2010] и способствует заживлению гнойных ран и венозных
трофических язв [Москаленко В.И., 2012; Чернеховская Н.Е., 2013, 2014]. В то же время,
хроническое ингибирование синтеза NO у подопытных животных с мышечной травмой
снижает в острый период уровень воспалительных цитокинов, но впоследствии
нарушает регенерацию и способствует развитию фиброза [Filippin L.I., 2011].
Участие NO в процессах ангиогенеза может играть и патологическую роль. Так,
ещѐ более 40 лет назад была доказана критическая роль ангиогенеза в процессах роста
злокачественных опухолей [Folkman J., 1971]. В настоящее время также показано, что
повышенная проницаемость сосудов и активация металлопротеиназ, вследствие
усиленного синтеза NO, во многом определяют и активность метастазирования
новообразований [Marangoni K., 2008; Lahdenranta J., 2009; Ziche M., 2009; Ortega A.L.,
2010; Корчагина А.А., 2013; Cheng H., 2014]. Значительная роль оксида азота в
процессах
ангиогенеза
позволяет
ожидать
развития
неспецифического
антиваскулогенного влияния на опухоль при ингибировании эндогенного синтеза NO.
Противоопухолевая
активность
ряда
ингибиторов
NOS
была
подтверждена
результатами экспериментальных исследований [Thomsen L.L., 1997; Gratton J.P., 2003;
Kashiwagi S., 2005; Mohamad N.A., 2009; Филимонова М.В., 2013, 2014б]. Введение
47
ингибиторов NOS животным-опухоленосителям сопровождалось торможением роста и
подавлением метастазирования опухолей, что авторы исследований связывали, главным
образом, с нарушением опухолевого ангиогенеза.
1.3.5 Участие в регуляции процессов апоптоза
Оксид азота, воздействуя различными путями, играет двоякую роль в процессах
апоптоза [Брюне Б., 1998; Tarr J.M., 2006; Olson S.Y., 2008; Рязанцева Н.В., 2012;
Choudhari S.K., 2013]. При низких, физиологических концентрациях NO, создаваемых
конститутивными
изоформами
NOS,
оксид
азота
оказывает
преимущественно
антиапоптогенное действие. При таких концентрациях NO инактивирует путѐм Sнитрозилирования
каспазу-3,
AP-1
и
TGase,
и
повышает
экспрессию
антиапоптотических протеинов и ферментов Bcl-2, HO-1 и Hsp70 [Razavi H.M., 2005;
Черешнев В.А., 2011; Shahani N., 2012]. В связи с этим, высокая активность eNOS и
nNOS может способствовать повышению устойчивости клеток к воздействию
различных апоптогенных факторов. В частности, ряд авторов связывает высокую
резистентность к радио- и химиотерапии стволовых клеток опухолей именно с высокой
активностью NOS [Lim K.H., 2008; Iyer A.K., 2008; Eyler C.E., 2011; Проскуряков С.Я.,
2011; Godoy L.C., 2012; Матчук О.Н., 2012, 2013].
Такое влияние оксида азота позволяет ожидать снижения апоптотической
резистентности при подавлении эндогенного синтеза NO. В настоящее время изучается
перспективность этого подхода в лечении онкологических заболеваний. В ряде
экспериментальных исследований показана способность ингибиторов NOS повышать
спонтанный уровень апоптоза и усиливать развитие апоптоза опухолевых клеток,
индуцированного другими факторами [Cook T., 2004; Chardnell R.J., 2011; Oronsky B.T.,
2012; Орлова М.В., Филимонова М.В., 2013, 2014; Филимонова М.В., 2013, 2015].
При высоких концентрациях NO, создаваемых гиперэкспрессией iNOS или
донорами NO, влияние приобретает проапоптотический характер. Судя по всему, в этом
случае активируются различные пути апоптоза: усиление экспресии лигандов APO-1/Fas
и TRAIL/APO-2, и инактивация XIAP активируют путь через каспазы 8 и 3;
нитрозилирующая активность ONOO- и повышенная экспрессия Bax активируют
митохондриальный путь, а S-нитрозилирование GAPDH активирует GAPDH-Siah1-путь
48
развития апоптоза [Chao J.I., 2004; Hara M.R., 2006; Li C.Q., 2009; Calcerrada P., 2011;
Таширева Л.А., 2012; Рязанцева Н.В., 2012; Roe N.D., 2012].
В этой связи в последнее время началось активное изучение перспективности
применения доноров NO в лечении онкологических заболеваний. В экспериментальных
исследованиях было показано, что некоторые соединения этого класса оказывают
апоптогенное влияние в отношении ряда новообразований человека, а также способны
усиливать
развитие
апоптоза,
индуцированного
химиопрепаратами,
лучевой
и
фотодинамической терапией [Mijatovic S., 2008; Kogias G., 2012; Yasuda H., 2008; Li
C.Q., 2009; Zhou H., 2009; Oronsky B.T., 2012; Cheng H., 2014; Nortcliffe A., 2014].
1.3.6 Участие в иммунных и воспалительных реакциях
Оксид азота принимает участие в воспалительных и иммунных реакциях, и в
настоящее
время
рассматривается
как
неотъемлемая
часть
неспецифической
резистентности организма. При этом многие авторы особое внимание уделяют, в первую
очередь, роли NO в антимикробной и противоопухолевой эффекторной системе
мононуклеарных макрофагов. Активация макрофагов микробиальными патогенами и
воспалительными цитокинами индуцирует в этих клетках экспрессию iNOS, что
сопровождается продукцией NO в высоких концентрациях (см. раздел 1.2).
Цитотоксическое действие активированных макрофагов на инфекционные агенты
связано
с
синергизмом
каталитической
активности
iNOS,
HADPH-оксидаз
и
миелопероксидаз, приводящим к образованию различных активных форм кислорода и
азота, что обеспечивает чрезвычайно широкий спектр микробоцидной активности
макрофагов. Эффекторная система макрофагов активна против грибов, бактерий,
вирусов, паразитов и опухолевых клеток, и является эффективной как в отношении
внеклеточных, так и внутриклеточных объектов [Cifone M.G., 1995; Проскуряков С.Я.,
2000; Rivero A., 2006; Shaughnessy L.M., 2007; Gutierrez F.R., 2009; Mehta D.R., 2012].
Так, экспериментально доказана незаменимость индукции iNOS в макрофагах для
контроля таких внутриклеточных инфекций, как Mycobacterium tuberculosis и
Leishmania [Stenger S., 1994; Nicholson S., 1996]. Причѐм, именно нитрозилирование
бактериальной Fe-SOD позволяет макрофагам преодолевать антиоксидантную систему
микроорганизмов.
49
Антимикробное действие NO реализуется, главным образом, путѐм подавления
митохондриального
дыхания
и
окислительного
фосфорилирования.
Наиболее
чувствительными к NO в этом случае являются железосерные ферменты цикла Кребса и
цепи переноса электронов: цитоплазматическая аконитаза, сукцинатдегидрогеназа,
NADH-дегидрогеназа, цитохромоксидаза и железосерные белки комплексов цитохромов
b и c1 [Drapier J.C., 1996; Sosroseno W., 2004; Schairer D.O., 2012; Pacheco-Yepez J.,
2014]. Нитрозилирование этих ферментов, как правило, ведѐт к развитию некротической
гибели.
Кроме
того,
высокие
концентрации
NO
способствуют
развитию
и
апоптотической формы гибели (см. раздел 1.3.5).
Противовирусный эффект NO, по-видимому, развивается за счѐт подавления
репликации
вирусов.
Это
действие
реализуется
путѐм
S-нитрозилирования
и
ингибирования вирусных протеиназ и факторов транскрипции, вовлечѐнных в процесс
репликации вирусов, а также за счѐт повышения эффекта INF [Mannick J.B., 2006;
Щегловитова О.Н., 2009; Fujikura Y., 2009; Mehta D.R., 2012].
Многие неиммунные клетки, индуцированные цитокинами, также в состоянии
продуцировать NO в цитотоксических концентрациях. Показано, что активированные
цитокинами эндотелиальные клетки могут вызывать лизис клеток опухоли, а
индуцированные гепатоциты способны вызывать гибель малярийных спорозоитов [Li
L.M., 1991; Wanasen N., 2008]. Индукция iNOS в эпителиальных клетках респираторного
и
пищеварительного
тракта
является
важной
частью
в
реализации
противоинфекционного потенциала слизистых оболочек, а их угнетение на фоне
атрофии или фиброза является причиной повышенной частоты бактериальных и
вирусных инфекций [Gookin J.L., 2002; Wang T., 2003; Xu W., 2006; Krishnan R., 2008].
Вместе с тем, высокие концентрации NO могут быть токсичны не только для
опухолевых клеток и инфекционных агентов, но и для нормальных тканей.
Воспалительные и аутоиммунные процессы протекают, как правило, с обилием
активированных макрофагов и нейтрофилов. В этой связи, гиперпродукция NO может
являться патогенетическим звеном в их развитии. Многие авторы отводят особое место
избыточной продукции NO в патогенезе бронхиальной астмы, ревматоидного артрита и
остеоартрозов, воспалительных глазных болезней, неспецифических воспалительных
заболеваний кишечника, кардиомиопатий, кардио-пульмонального дистресс синдрома
[Голиков П.П., 2004; Kanwar J.R., 2009; Сайфутдинов Р.Г., 2009; Westphal M., 2009; Nagi
50
G., 2010; Ziskoven C., 2010; Lange M., 2011; Prado C.M., 2011, 2011b; Эседов Э.М., 2012;
Roe N.D., 2012; Rochette L., 2013; Szalai Z., 2014]. Показана также роль гиперпродукции
NO и в развитии нейродегенеративных заболеваний - стойкое повышение активности
NADPH-оксидазы микроглии и экспрессии iNOS в глии, приводящее к высокой
продукции пероксинитрита способствует развитию глутаматной нейротоксичности (см.
раздел 1.3.3) при рассеяном склерозе, болезнях Альцгеймера, Хантингтона и
Паркинсона, и развитию нарушений ГЭБ при ишемии [Раевский К.С., 1998, 2000;
Moncada S., 2006; Steinert J.R., 2010; Brown G.C., 2010; Brown G.C., Neher J.J., 2010;
Miclescu A. 2010; Calcerrada P., 2011; Башкатова В.Г., 1998, 2012; Forstermann U., 2012;
Салыкина М.В., 2013]. Наконец,
чрезмерная
продукция
оксида
азота
iNOS,
индуцированными в стенке сосудов, играет решающую роль в развитии септического
шока [Hollenberg S.M., 2008; Lange M., 2009; Gkisioti S. 2011].
В настоящее время активно изучается вопрос перспективности применения
ингибиторов NOS в лечении острых и хронических воспалительных заболеваний. В
экспериментах показано, что некоторые ингибиторы NOS, обладающие селективностью
к iNOS, ослабляют клинические проявления артрита и воспаления синовиальных
оболочек, индуцированных у лабораторных животных [Connor J.R., 1995; Pelletier J.P.,
1998; Cuzzocrea S., 2002], снижают тяжесть индуцированного колита [Di Paola R., 2005],
ослабляют
болевую
гиперчувствительность
на
модели
хронической
травмы
седалищного нерва [De Alba J., 2006], оказывают выраженную нейропротекцию при
инсульте [Parmentier S., 1999; Крушинский А.Л., 2010], черепно-мозговой травме
[Jafarian-Tehrani M., 2005] и на модели болезни Паркинсона [Broom L., 2011; Башкатова
В.Г., 2012], снижают индуцированную бронхиальную гиперреактивность [Eynott P.R.,
2002] и аллергическую гиперчувствительность [Koarai A., 2000], предотвращают
развитие отѐка лѐгких и обструктивных нарушений при остром инфекционном
поражении лѐгких [Westphal M., 2009; Lange M, 2011] и нарушений ГЭБ при ишемии
[Miclescu A., 2010], ослабляют развитие гипотонии и гипоперфузии периферических
тканей на фоне сепсиса и эндотоксемии [Wray G.M., 1998; Alderton W.K., 2005; Bateman
R., 2008].
51
1.4 Химические субстрат-подобные ингибиторы эндогенного синтеза оксида азота
Экспрессия
и
активность
NOS
контролируется
значительным
числом
регуляторов, которые потенциально могут являться мишенями для фармакологического
воздействия [Граник В.Г., 2004;
Li H., 2005; Dudzinski D., 2007; Michel T., 2010;
Косенкова Ю.С., 2010; Qian J., 2013; Ramadoss J., 2013]. Существующие ингибиторы
NOS можно классифицировать с различных точек зрения. Наиболее широко
используется классификация, основанная на месте связывания ингибиторов с NOS,
которая
различает
четыре
группы
ингибиторов:
первый
класс
представлен
ингибиторами, взаимодействующими с аргинин-связывающим сайтом; второй –
соединениями, имитирующими BH4 и конкурирующими с этим кофактором; третий –
соединениями, которые взаимодействуют с гемом мономерных NOS и блокирующих
образование активных димерных форм ферментов; четвѐртый – соединениями,
взаимодействующими с CaM и флавиновыми кофакторами и блокирующими их
интеграцию в NOS [Ji H., 2009; Косенкова Ю.С., 2010; Viteceek J., 2012]. Далее
представлено описание NOS-ингибирующей активности соединений, конкурирующих с
L-аргинином за связывание с каталитическим центром оксидазного домена NOS
(субстрат-подобные ингибиторы NOS).
Рисунок 1.6 - Схема взаимодействия L-аргинина с каталитическим центром NOS.
Здесь R = HOOC-CH(NH2)-(CH2)2
В этом домене локализованы важнейшие структуры фермента: окислительный
центр, содержащий гем с пентакоординированным Fe, сайт связывания L-аргинина,
акцептирующая BH4 полость и Zn-тиолатный комплекс [Alderton W.K., 2001; Stuehr D.J.,
52
2001; Gorren A.C., 2006; Daff S., 2010;]. Все изоформы NOS в оксидазном домене
содержат высоко консервативные последовательности – 16 из 18 аминокислотных
остатков в пределах 6 А от активного центра совпадают в NOS млекопитающих с
известной структурой [Ji H., 2009]. По данным рентгеноструктурного анализа ведущую
роль в связывании L-аргинина играют две аминокислоты: Glu и Trp (рисунок 1.6). В
ближней (проксимальной) к гему полости протон аминогруппы гуанидиновой части Lаргинина акцептируется карбонильной группой триптофана. В дистальной полости
второй протон той же аминогруппы и протон при N5 акцептируются карбонильными
группами глутаминовой кислоты. Протонированный N+, связанный с Trp, в ходе
NADPH-O2-зависимого окисления L-аргинина используется для синтеза NO.
Консервативное подобие изоформ NOS в оксидазном домене препятствует поиску
селективных ингибиторов. В то же время, спектральный и ингибиторный анализ выявил
определѐнные особенности топологии аргинин-связывающего сайта изоформ NOS.
Наблюдается различие размеров субстратной полости (nNOS > iNOS > eNOS),
затрагивающее топологию проксимальной и дистальной полостей, акцептирующих
протоны гуанидиновой группы, что создаѐт потенциальный базис для селективности
ингибиторов [Babu B.R., 1999; Poulos T.L., 2013; Oliveira B.L., 2013; Rouseau D.L., 2005].
Большинство известных субстрат-подобных ингибиторов NOS содержат в своей
структуре группу атомов, изостеричную гуанидиновой группе L-аргинина [Граник В.Г.,
1997, 2004; Проскуряков С.Я., 2005; Верховский Ю.Г., Филимонова М.В., 2008, 2009;
Косенкова Ю.С., 2010; Viteceek J., 2012]:
L-аргинин
Значение этого структурного соответствия вызвано тем, что именно гуанидиновая
группа L-аргинина обеспечивает связывание этой аминокислоты с каталитическим
центром фермента [Babu B.R., 1999; Giroud C., 2010]. Основные типы субстратподобных
ингибиторов
NOS
представленны
соединениями,
содержащими
гуанидиновую, амидиновую и тиоамидиновую группу (таблица 1.2):
Гуанидиновая
Амидиновая
Тиоамидиновая
53
Таблица 1.2 - Основные типы субстрат-подобных ингибиторов NOS.
Примеры соединений и показатели их ингибирующей активности.
Гуанидиновая структурная группа
NG-амино-L-аргинин (L-NAA);
IC50nNOS iNOS eNOS: 3; 7,4; 2,5 [Lambert L.E., 1991]
Аминогуанидин;
IC50nNOS iNOS eNOS: 30,3; 6,4; 22,1 [Faraci W.S., 1996];
41; 5; 255 [Wolff D.J., 1997]
NG-монометил-L-аргинин (L-NMMA);
IC50nNOS iNOS eNOS: 7,1; 3,3; 5,3 [Faraci W.S., 1996];
0,3; 2,6; 0,3 [Boer R., 2000]
N--пропил-L-аргинин;
IC50nNOS iNOS eNOS: 4; 100; 8,7 [Boer R., 2000];
0,09; 209; 2 [Cooper G.R., 2000]
NG-нитро-L-аргинина метиловый эфир (L-NAME);
IC50nNOS iNOS eNOS: 0,8; 31,6; 1,5 [Boer R., 2000];
0,5; 20; 0,9 [Mitchell J.A., 1993]
NG-Нитро-L-аргинина (L-NNA);
IC50nNOS iNOS eNOS: 0,5; 3,2; 0,9 [Boer R., 2000];
0,2; 13; 0,3 [Cooper G.R., 2000]
Амидиновая структурная группа
N-(3-(аминоэтил)бензил) ацетамидин (1400W);
IC50nNOS iNOS eNOS: 3,2; 0,8; 49 [Boer R., 2000];
7,3; 0,2; 1000 [Alderton W.K., 2001]
N(5)-(1-иминоэтил)-L-орнитин (L-NIO);
IC50nNOS iNOS eNOS: 1; 1,6; 1 [Boer R. 2000];
0,3; 0,3; 0,08 [Wolff D.J., 1998]
7-нитроиндазол (7-NI);
IC50nNOS iNOS eNOS: 0,7; 5,8; 0,8 [Bland-Ward P.A.,
1995]; 2,5; 20; 0,8 [Wolff D.J., 1994]
3-Бромо-7-нитроиндазол;
IC50nNOS iNOS eNOS: 0,17; 0,29; 0,86 [Bland-Ward P.A.,
1995]
N5-(1-имино-3-бутенил)-L-орнитин (L-VNIO);
IC50nNOS iNOS eNOS: 0,4; 0,8; 1,4 [Boer R., 2000]
N(6)-(1-иминоэтил)-L-лизин (L-NIL);
IC50nNOS iNOS eNOS: 4; 2; 7,8 [Boer R., 2000];
4,1; 0,9; 7,4 [Faraci W.S., 1996]
54
Продолжение таблицы 1.2
Тиоамидиновая структурная группа
S-Этил-ИТМ;
IC50nNOS iNOS eNOS: 0,12; 0,06; 0,17 [Boer R.., 2000];
0,02; 0,02; 0,29 [Wolff D.J., 1997]
S-Изопропил-ИТМ;
IC50nNOS iNOS eNOS: 0,01; 0,01; 0,08 [Wolff D.J., 1997]
S-(3-аминопропил)-ИТМ;
IC50nNOS iNOS eNOS: 14,5; 7,9; 28,8 [Boer R., 2000]
S-Метил-ИТМ;
IC50nNOS iNOS eNOS: 0,5; 0,5; 0,6 [Boer R., 2000]
L-тиоцитруллин;
IC50nNOS iNOS eNOS: 4,6; 1,7; 1,9 [Ulharq S., 1999]
2-Амино-5,6-дигидро-6-метил-4H-1,3-тиазин
(AMT);
IC50nNOS iNOS eNOS: 0,01; 0,01; 0,03 [Boer R., 2000];
0,03; 0,01; 0,15 [Nakane M., 1995]
S-Метил-L-тиоцитруллин;
IC50nNOS iNOS eNOS: 0,04; 0,20; 0,12 [Boer R., 2000]
S-Этил-N-[4-(трифлуорометил) фенил]-ИТМ
(ETPI);
IC50nNOS iNOS eNOS: 0,1; 8,6; 5,2 [Cooper G.R., 2000];
3,6; >100; 50 [Boer R., 2000]
S,S'-(1,4-фенилене-бис(1,2-этандиил))бис-ИТМ
(PBITU)
IC50nNOS iNOS eNOS: 2,3; 0,5; 31,6 [Boer R., 2000]
Гуанидиновые ингибиторы NOS
В качестве соединений, способных конкурировать с L-аргинином за активный
центр NOS, были исследованы, в первую очередь, простые производные L-аргинина.
Ожидания в целом подтвердились – в этой области в 1980-90 годы был выявлен
обширный ряд ингибиторов NOS.
55
Первым, интуитивно найденным, ингибитором NOS явился NG-монометил-Lаргинин (L-NMMA), также известный как L-N-метиларгинин (L-NMA). Это природное
соединение,
которое
является
продуктом
деградации
аргинин-метилированных
протеинов [Bedford M.T. 2009]. Поскольку структура L-NMMA очень близка к
структуре L-аргинина, это соединение является конкурентным ингибитором всех
изоформ NOS. В то же время, показано, что часть L-NMMA медленно метаболизируется
iNOS и nNOS (с участием BH4 и NADPH) с образованием N-гидрокси-производного,
вызывающего необратимую инактивацию этих NOS [Reif D.W., 1995].
Со времени открытия L-NMMA это соединение широко использовалось в
экспериментальных исследованиях в качестве инструмента изучения роли NO в
иммунной,
нервной
и
сердечно-сосудистой
системах.
В
частности,
показана
способность L-NMMA предотвращать гипотонию у септических собак и повышать
выживаемость подопытных животных [Kilbourn R.G., 1990]. В этих исследованиях LNMMA оказывал гипертензивное действие за счѐт повышения системного сосудистого
сопротивления. В то же время, в некоторых случаях наблюдалось снижение сердечного
индекса, индекса доставки О2 и даже повышение летальности, что авторы связали с
особенностями течения сепсиса в различных экспериментальных моделях и отличиями
дозировки и схем применения L-NMMA [Kilbourn R.G., 1997]. Также показана
способность L-NMMA нормализовать функцию почек и почечный кровоток у
экспериментальных животных при гипердинамическом сепсисе [Ishikawa K., 2012].
На I и II фазе клинических испытаний инфузия в течение 8-72 часов L-NMMA в
дозе 5-20 мг/кг/час пациентам с тяжѐлым септическим шоком позволяла поддерживать
АД выше 70 мм. рт. ст. без неблагоприятных эффектов и необходимости применения
других вазопрессоров [Grover R., 1999; Bakker J., 2004]. На III фазе клинических
испытаний инфузия L-NMMA в этих же дозах в течение 7 и 14 суток пациентам с
тяжѐлым септическим шоком снижала смертность по
причине полиорганной
дисфункции. Однако в целом смертность возросла на 10% в сравнении с плацебо за счѐт
высокой доли сердечно-сосудистых смертей. Это было расценено как свидетельство
токсического влияния L-NMMA на сердечно-сосудистую систему при его длительном
применении, и исследование было прекращено [Lopez A., 2004; Watson D., 2004]. В то
же время, на II фазе клинических испытаний у больных с острым инфарктом миокарда,
осложнѐнным рефрактерным кардиогенным шоком, L-NMMA был высокоэффективен.
56
658 пациентов получили L-NMMA однократно, внутривенно в дозе 1 мг/кг, а затем
инфузионно в дозе 1 мг/кг/час в течение 5 часов. Такое лечение повысило 30-суточную
выживаемость больных на 25% [Alexander J.H., 2007]. В двух других клинических
испытаниях L-NMMA (6 мг/кг, внутривенно) оказывал достоверный терапевтический
эффект при мигрени и цефалгии напряжения [Lassen L.H., 2003]. В настоящее время
проводится более 15 различных клинических исследований L-NMMA, посвящѐнных
изучению его способности влиять на системную и регионарную гемодинамику,
результаты которых пока неопубликованы.
Другим естественным ингибитором NOS является L-N,N-диметиларгинин,
известный также как ассиметричный диметилированный аргинин (ADMA). Это
соединение также является продуктом деградации аргинин-метилированных протеинов
[Bedford M.T., 2009]. ADMA является умеренным, неселективным, конкурентным
ингибитором NOS [Valance P., 1992]. Использование ADMA в качестве инструмента
модуляции активности NOS весьма ограниченно. Практически все связанные с этим
соединением исследования направлены на изучение роли ADMA в патогенезе сердечнососудистых заболеваний [Al-Zobaidy M.J., 2010; Mohan S., 2012; Sheen J.M., 2014].
L-N-нитроаргинин (L-NNA), также называемый как NG-нитро-L-аргинин, явился
одним из первых синтетических ингибиторов NOS. L-NNA является конкурентным
ингибитором всех NOS с незначительной селективностью к nNOS и eNOS [Furfine E.S.,
1993]. Селективность L-NNA коррелирует с особенностями его взаимодействия с
различными изоформами - эффект воздействия L-NNA на iNOS быстро обращается Lаргинином, в то время как восстановление активности nNOS и eNOS после воздействия
L-NNA развивается относительно медленно, хотя со всеми изоформами L-NNA
взаимодействует нековалентно. Фактором, сдерживающим применение L-NNA в
биологических системах, является его низкая растворимость (около 4 мМ/л) при
нейтральных pH. Этот недостаток послужил причиной синтеза близкого, высоко
растворимого соединения – метилового эфира L-N-нитроаргинина (L-NAME), которое
в биологических тканях быстро гидролизуется эстеразами с образованием L-NNA и
проявляет аналогичные NOS-ингибирующие свойства [Pfeiffer S., 1996].
Оба соединения широко использованы в экспериментальных исследованиях, в
частности, при изучении роли NO в адгезии лейкоцитов, в нейротоксичности
индуцированной
ЛПС
микроглии,
в
процессах
ангиогенеза
и
в
физиологии
57
миокардиоцитов. L-NAME и, в меньшей степени, L-NNA были использованы для
модуляции гемодинамики in vivo. Показано, что в дозах 0,1 мМ/л эти соединения
ослабляют или инвертируют эффект многих вазодилятаторов (брадикинина, 5гидрокситриптамина и др.) [Vials A., 1992]. Кроме того, L-NAME в дозах до 100 мг/кг,
подобно L-NMMA, ослаблял или предотвращал сепсис-ассоциированную гипотонию на
различных моделях. Вместе с тем, в сравнении с L-NMMA, при применении L-NAME в
этих исследованиях существенно чаще наблюдались негативные эффекты, связанные со
снижением сердечного индекса и нарушениями регионарного кровотока [Kilbourn R.G.,
1997]. Также была экспериментально показана противоопухолевая активность L-NAME
в отношении меланомы B16, которую авторы исследований связывали, главным
образом, с нарушением опухолевого ангиогенеза [Kashiwagi S., 2005].
В ранних клинических исследованиях L-NAME продемострировал дозовозависимую способность повышать сосудистое сопротивление и АД у пациентов с
септическим шоком - однократное внутривенное введение L-NNA в дозе 20 мг/кг
вызывало повышение системного сопротивления сосудов и АД, но также снижало
сердечный индекс, что было устранено инфузией L-аргинина (200 мг/кг) [Lorente J.A.,
1993]. Аналогичные результаты получены и в исследовании, включавшем инфузию LNNA (1 мг/кг/ч) в течение 12 часов [Avontuur J.A., 1998]. На I фазе клинических
исследований L-NNA у пациентов с онкологическими заболеваниями показана
способность этого соединения значительно снижать активность кровотока в солидных
опухолях [Nq Q.S., 2007]. В настоящее время проводится 6 различных клинических
исследований L-NNA и L-NAME, посвящѐнных изучению их влияния на метаболизм
миокарда, сердечную деятельность и системную гемодинамику, результаты которых
пока не опубликованы.
Cинтетическим ингибитором NOS, вывяленным в конце 1980-х годов, является LN-аминоаргинин, также называемый как NG-амино-L-аргинин. Это соединение
является неселективным конкурентным ингибитором NOS, обладающим также
способностью инактивировать эти ферменты [Moore W.M., 1996; Wolff D.J., 1996]. LN-аминоаргинин широко использовался в экспериментальных исследованиях in vitro
при изучении роли NO в регуляции сосудистого тонуса. Однако токсические свойства
этого соединения исключают его применение in vivo и в клинической практике.
58
Ряд ингибиторов NOS был выявлен в 1990-е годы среди близких к L-NMMA
высших L-N-алкилированных аргининов, у которых N-алкильный радикал является
насыщенным или циклическим: L-N-пропиларгинин (L-NPLA), N-аллил-L-аргинин,
N-циклопропил-L-аргинин,
N-пропаргил-L-аргинин.
Эти
соединения
показали,
насколько существенно может изменяться как селективность, так и механизм
ингибирования даже при минорных изменениях молекулярной структуры. L-NPLA
является конкурентным ингибитором NOS с существенной селективностью к nNOS,
которая, судя по всему, является результатом инактивации этой изоформы [Zhang H.Q.,
1997]. N-циклопропил-L-аргинин проявляет себя исключительно как неселективный
конкурентный ингибитор NOS, а его стереохимический изомер N-аллил-L-аргинин в
дополнение к неселективному конкурентному ингибированию вызывает необратимую
инактивацию iNOS и nNOS [Zhang H.Q., 1997a]. N-пропаргил-L-аргинин является
достаточно сильным неселективным конкурентным ингибитором всех NOS.
Из этой группы внимание экспериментаторов привлѐк только L-NPLA в качестве
инструмента подавления активности nNOS. Это соединение использовалось в изучении
роли активации nNOS в развитии апоптоза двигательных нейронов, участия NO в
регуляции мускариновых холинорецепторов, взаимодействия кальциевых каналов и
nNOS в регуляции сократимости и возбудимости миокардиоцитов [Raoul C., 2002;
Oceandy D., 2007]. Местные аппликации добровольцам на кожу L-NPLA (5 мМ/л)
применялись при изучении различных изоформ NOS в местной микроциркуляции у
здоровых и больных гипертонией [Kellogg D.L., 2009; Smith C.J., 2011]. И хотя L-NPLA
демонстрирует определѐнный потенциал для клинического применения, он пока не был
использован в клинических испытаниях.
Способность к ингибированию NOS проявляют и некоторые неаминокислотные
соединения, содержащие гуанидиновую группу. В первую очередь это касается
аминогуанидина, меркаптоэтилгуанидина и ряда замещѐнных ариламиногуанидинов и
арилгуанидинов.
В
большинстве
исследований
эти
соединения
близки
по
эффективности к L-NMMA при ингибировании iNOS, но на порядок менее эффективны
в отношении ингибирования конститутивных изоформ. Механизм ингибирования
конкурентный, но, также как и в случае L-NMMA, под влиянием аминогуанидина и его
производных
постепенно
сопровождающаяся
потерей
развивается
необратимая
гема
D.J.,
[Wolff
1996;
инактивация
Alderton
W.K.,
NOS,
2001].
59
Аминогуанидин и его производные широко используются в экспериментальных
исследованиях, посвящѐнных изучению роли NO в воспалительных и септических
процессах, в частности, показана их способность повышать выживаемость подопытных
животных при эндотоксемии и сепсисе [Hobbs A.J., 1999; Tabatabaie T., 2000], повышать
выживаемость животных на модели геморрагического инсульты [Крушинский А.Л.,
2010], нормализовать функцию почек и почечный кровоток при гипердинамическом
сепсисе [Ishikawa K., 2012]. Однако терапевтический эффект достигался только в случае
применения высоких доз этих ингибиторов, и нередко наблюдались побочные эффекты,
связанные со способностью этих соединений влиять на метаболизм полиаминов,
ингибированием диаминоксидаз, каталаз и ряда других Cu- и Fe-содержащих
ферментов, сопровождающиеся накоплением АФК [Ou P., 1993; Alderton W.K., 2001].
С того момента, как было показано, что NOS могут использовать в качестве
субстрата некоторые аргинин-содержащие дипептиды [Hecker M., 1991], были
предприняты усилия по разработке дипептидов на основе аргининоподобных
ингибиторов. В результате этих исследований была выявлена группа производных Lнитроаргинина, являющихся конкурентными ингибиторами NOS и проявляющих
значительную селективность к ингибированию nNOS: D-фенилаланина-N-нитро-Lаргинина метиловый эфир; N-нитро-L-аргинил-транс-3-амино-L-пролинамид; (4S)-NN-(4S)-{4-амино-5-[2-(2-
(4-амино-5-[аминоэтил]аминопентил)-N'-нитрогуанидин;
аминоэтил )фениламино]-пентил}-N'-нитрогуанидин [Hah J.M., 2001; Ji H., 2006]. В
экспериментальных
исследованиях
эти
соединения
предотвращали
развитие
индуцированного гипоксией апоптоза в культуре нейронов и ослабляли развитие
нейродегенеративных изменений плода при гипоксии у подопытных животных
[Silverman R.B., 2009]. Также синтезирован обширный ряд дипептидов на основе
тиоцитруллина. Среди этих соединений выделялся S-метил-L-тиоцитруллинил-Lфенилаланин, имеющий существенную селективность к iNOS [Kobayashi N., 1999]. В
клинических исследованиях дипептидные ингибиторы NOS пока не использовались.
Амидиновые ингибиторы NOS
Эти соединения содержат амидиновую группу, аналог гуанидинового фрагмента
L-аргинина,
в
котором
терминальная
аминогруппа
заменена
углеводородным
фрагментом. Первым соединением в этой химической области, признанным в качестве
60
ингибитора NOS, явился N(5)-(1-иминоэтил)-L-орнитин (L-NIO). Это соединение
является мощным неселективным конкурентным ингибитором NOS, способным также
вызывать инактивацию nNOS [McCall T.B., 1991]. Аналогичными характеристиками
обладает и его производное - N(5)-(1-имино-3-бутенил)-L-орнитин (L-VNIO). При
действии обоих соединений инактивация nNOS сопровождается потерей гема.
Детальный механизм такого действия неизвестен, однако можно полагать, что
инактивирующее влияние в данном случае определяется наличием ненасыщенного
винилового фрагмента, посокольку насыщенное производное N(5)-(1-имино-3-бутил)-Lорнитин не вызывает инактивации nNOS, хотя проявляет аналогичную аффинность
[Babu B.R., 1998]. Высокую активность и селективность к nNOS проявляет также N(5)[2-(метилтио)-1- иминоэтил]-L-орнитин [Litzinger E.A., 2006].
Следующим перспективным соединением в этой области явился синтетический
гомолог L-NIO – N(6)-(1-иминоэтил)-L-лизин (L-NIL). Это конкурентный, умеренно
селективный ингибитор iNOS, не вызывающий инактивации ферментов [Moore W.M.,
1994]. Позже был синтезирован более стабильный и менее гигроскопичный аналог LNIL – N(6)-(1-иминоэтил)-L-лизин 5-тетразол-амид (L-NIL-TA, также упоминаемый как
SC-51). Это соединение самостоятельно не влияет на активность NOS, но, быстро
метаболизируясь в организме, высвобождает L-NIL [Hallinan E.A., 2002].
Являясь селективными ингибиторами, L-NIO, L-VNIO и L-NIL достаточно
широко используются в различных экспериментальных исследованиях in vitro. В
исследованиях
in
vivo,
в
связи
с
селективностью
к
iNOS,
используются
преимущественно L-NIL и L-NIL-TA. На модели индуцированного адъювантом артрита
L-NIL (0,1 мг/мл в питьевой воде или 100 мг интрагастрально) снижал у крыс уровень
нитратов в плазме и ослаблял воспаление, не оказывая влияния на АД [Connor J.R.,
1995]. В исследовании на модели остеоартрита у собак L-NIL (10 мг/кг интрагастрально,
дважды в день) снижал клинические проявления остеоартрита и воспаления
синовиальных оболочек [Pelletier J.P., 1998]. L-NIL-TA (10 мг/кг интрагастрально)
уменьшал
концентрацию
выдыхаемого
NO
и
подавлял
бронхиальную
гиперреактивность у крыс, вызванную овальбумином [Eynott P.R., 2002], а лечение LNIL-TA (10 мг/кг/ч в питьевой воде) в течение 14 дней после ишемии практически
полностью предотвращало потерю ганглиозных клеток сетчатки у крыс [Neufeld A.H.,
2002]. На модели сепсиса L-NIL в дозе 3 мг/кг/час ослаблял гипотонию и усиливал
61
кровоток и оксигенацию в скелетных мышцах [Bateman R., 2008]. В клинических
испытаниях из этой группы соединений пока был использован только L-NIL-TA.
Оральный приѐм L-NIL-TA в дозе 200 мг снижал более чем на 90% количество
выдыхаемого NO у здоровых волонтѐров и астматиков в течение 72 часов, и при этом не
оказывал влияния на АД, ЧСС и ЧДД [Hansel T.T., 2003].
Значительным шагом вперѐд было открытие в средине 1990-х годов N-(3(аминоэтил)бензил) ацетамидина (1400W), обладающего большей селективностью к
iNOS, чем L-NIL [Garvey E.P., 1997]. В отношении конститутивных изоформ 1400W
ведѐт себя как конкурентный, обратимый ингибитор, но ингибирование iNOS
сопровождается постепенным развитием NADPH-зависимой инактивации ферментов –
через 2 часа воздействия 1400W на iNOS ингибирование становится полностью
аргинин-необратимым
экспериментальных
[Zhu
Y.,
2005].
исследованиях.
В
широко
1400W
частности,
показана
используется
способность
в
этого
соединения тормозить опухолевый рост [Thomsen L.L., 1997], предотвращать
циркуляторные нарушения, индуцированные эндотоксинами [Wray G.M., 1998],
оказывать нейропротекторное действие при ишемии мозга [Parmentier S., 1999] и
черепно-мозговой
травме
[Jafarian-Tehrani
M.,
2005],
снижать
аллергическую
гиперчувствительность [Koarai A., 2000]. В то же время, малая терапевтическая широта
1400W исключает его примение для человека, и это соединение остаѐтся только
фармакологическим инструментом в экспериментальных исследованиях.
Более перспективными для клинического применения являются два недавно
полученных
представителя
ацетамидиновых
аминокислот
-
(R)-2-амино-3-{[2-
(этанимидоиламино)этил]сульфонил} пропановая кислота (GW273629) и (S)-2-амино-4{[2-(этанимидоиламино)этил]тио}
бутановая
кислота
(GW274150),
обладающие
чрезвычайно высокой селективностью к ингибированию iNOS [Alderton W.K., 2005].
Подобно 1400W, оба эти соединения конкурентно ингибируют NOS, а в отношении
iNOS вызывают постепенно развивающуюся NADPH-завимую инактивацию. GW273629
и GW274150 растворимы и устойчивы в растворе, имеют низкую токсичность и хорошо
переносятся при пероральном введении (биодоступность свыше 90%). В экспериментах
показана способность GW274150 подавлять более чем на 24 часа ЛПС-индуцированный
синтез NO у мышей [Alderton W.K., 2005], ослаблять тяжесть индуцированного
коллагеном артрита у мышей [Cuzzocrea S., 2002] и тяжесть индуцированного у крыс
62
колита [Di Paola R., 2005], ослаблять болевую гиперчувствительность на модели
хронической травмы седалищного нерва [De Alba J., 2006], оказывать выраженную
нейропротекцию на модели болезни Паркинсона [Broom L., 2011]. Однако для широкого
применения GW273629 и GW274150 недоступны в связи с патентными ограничениями.
В клинических испытаниях GW274150 показал хороший потенциал для
ослабления воспалительных патологических процессов. В последние годы были
опубликованы результаты клинических испытаний GW274150, проведѐнные компанией
Glaxo Smith Kline. В первом исследовании пациенты с астмой в течение 14 суток
ежедневно перорально получали GW274150 в дозе 90 мг. Такое лечение уменьшило на
70% количество выдыхаемого NO, но не оказало влияния на характер и выраженность
реакции дыхательных путей на аллергены [Singh D., 2007]. В двух других
исследованиях GW274150 применялся для лечения мигрени. Показано, что ни раннее
применение GW274150 (5-180 мг/кг) при острой мигрени, ни профилактическое
применение (60-120 мг/кг ежедневно в течение 12 недель) не сглаживало картину
мигрени. Это, по мнению авторов, исключает участие iNOS в индукции атаки мигрени
[Palmer J.E., 2009; Hoivik H.O., 2010]. Предварительные результаты II фазы клинических
испытаний GW274150 при лечении ревматоидного артрита показали, что 4-недельный
курс этого ингибитора (60 мг per os, ежедневно) достоверно снижает УЗИ признаки
воспаления суставов [Seymour M., 2012].
Значительное число слабо селективных ингибиторов iNOS и nNOS выявлено
среди циклических амидинов – соединений, в которых амидиновый фрагмент включѐн в
гетероцикл. В этом ряду практический интерес представляет 7-нитроиндазол (7-NI) и
его
производное
3-бромо-7-нитроиндазол,
которые
проявляют
существенную
селективность к nNOS [Bland-Ward P.A., 1995]. Результаты кристаллографических
исследований показали, что взаимодействие этих ингибиторов с NOS сопровождается
значительными конформационными изменениями оксидазного домена, которые не
только блокируют взаимодействие L-аргинина с активным центром nNOS, но и
нарушают связывание BH4 [Rosenfeld R.J., 2002]. В настоящее время эти соединения
активно используются в экспериментальных исследованиях, в частности, при изучении
механизмов регуляции церебральной гемодинамики [Brozickova C., 2013], участия NO в
функциях ЦНС [Shen F., 2012; Orzelska J., 2013], патогенеза острого респираторного
дистресс синдрома [Westphal M., 2009], рефрактерной вазоплегии [Nardi G.M., 2014;
63
Fink M., 2014], ишемических поражений мозга, нейродегенеративных заболеваний и
периферических нейропатий [Крушинский А.Л., 2010; Dableh L.J., 2011; Yuste J.E., 2012;
Салыкина М.А., 2013]. В клинических исследованиях нитроиндазол и его производные
пока не использовались.
Тиоамидиновые ингибиторы NOS
Сильные ингибиторы NOS cреди соединений, содержащих тиоамидиновый
фрагмент, были выявлены ещѐ в начале 1990-х годов. Результаты рентгеноструктурных
исследований оксидазного домена NOS, включающего ингибитор с тиоамидиновой
группой, свидетельствуют, что, в отличие от нитроиндазолов, простые S-алкилзамещѐнные производные ИТМ не вносят конформационных изменений в структуру
активного центра [Li H., 2000]. Тиоамидиновая группа таких соединений занимает в
каталитической
полости
всех
изоформ
положение,
аналогичное
положению
гуанидиновой группы L-аргинина, при этом аминогруппы ИТМ, как и гуанидиновые
аминогруппы L-аргинина, взаимодействуют с карбонильными группами Trp и Glu.
Вместе с тем, имеется и существенное отличие – если аминокислотная часть L-аргинина
ориентирована к выходному отверстию канала доступа субстрата, то алкильный радикал
S-алкил-ИТМ располагается возле гема и боковой цепи Phe (для iNOS человека – Phe369)
в узком углублении (H-pocket).
Детали взаимодействия S-алкил-ИТМ с активным центром NOS до конца неясны,
однако очевидно, что близость атома серы ИТМ к Fe-heme играет важную роль в
аффинности этих соединений – как например, NOS-ингибирующая активность S-метилИТМ более чем на 2 порядка выше, чем у метилгуанидина [Wolff D.J., 1997].
Существенным является также гидрофобное взаимодействие алкильного радикала Sалкил-ИТМ с аминокислотными остатками каталитической полости. Об этом
свидетельствует полное отсутствие NOS-ингибирующей активности у тиомочевины и
N-метилтиомочевины. Согласно кристаллографическим данным, H-pocket не превышает
размерами этильную группу [Li H., 2000], и, вероятно, по этой причине максимальной
NOS-ингибирующей активностью в ряду S-алкил-ИТМ обладают S-этил- и Sизопропил-ИТМ, способные образовать прочные гидрофобные контакты в этом
«кармане» (таблица 1.3). Структурные данные показывают, что метильные группы этих
соединений участвуют в Ван-дер-Вальсовом взаимодействии с азотом и пропионатом
64
пиррольного кольца D гема. Дальнейшее увеличение числа метиленовых групп в Sалкильном радикале сопровождается снижением аффинности соединений.
Таблица 1.3 - NOS-ингибирующая активность S-алкил-замещѐнных ИТМ
(по данным [Garvey E.P., 1994]).
R
KiiNOS, мкМ
R
KiiNOS, мкМ
H
CH3
CH2CH3
CH(CH3)2
>2500
0,12
0,02
0,01
CH2CH2CH3
CH2(CH2)2CH3
CH2Ph
0,24
11
5,6
Примечание:
Ki – константа ингибирования, рассчитанная в предположении
конкурентности и стационарности реакции: Ki = IC50 / (1 + [S]/Km), где IC50 – концентрация
ингибитора, при которой активность NOS подавляется на 50% при постоянной концентрации Lаргинина; [S] - концентрация L-аргинина; Km – константа Михаэлиса.
Наличие у S-алкил-ИТМ «дополнительного» взаимодействия в оксидазном
домене делает эти соединения чрезвычайно эффективными ингибиторами NOS,
значительно превосходящими ингибирующую способность производных L-аргинина.
Так, например, S-метил-ИТМ как ингибитор iNOS в 500 раз активнее, чем L-NMMA
[Boer R., 2000]. При этом по отношению ко всем изоформам S-алкил-ИТМ ведут себя
как конкурентные, обратимые ингибиторы, не вызывая инактивации ферментов.
Существенным недостатком этих соединений является низкая избирательность
ингибирования различных изоформ – только S-этил- и S-изопропил-ИТМ проявляют
умеренную селективность к iNOS [Garvey E.P., 1994; Wolff D.J., 1997].
В исследованиях in vivo S-алкил-замещѐнные производные ИТМ в полной мере
сохраняют
свою
активность.
Зависимость
подавления
продукции
нитрита
в
активированных макрофагах от структуры соединения полностью коррелировала с
показателями активности на изолированных ферементах in vitro [Southan G.J., 1996]. А
S-метил-ИТМ снижала степень биохимических нарушений и повышала выживаемость
животных при эндотоксемии [Szabo C., 1994].
Сильными ингибиторами NOS являются также ди-ИТМ. С увеличением
алкильного мостика до 6 метиленовых групп способность таких производных
ингибировать NOS снижается (таблица 1.4), однако следующие два соединения – S,S’-
65
[1,3-фенилен-бис-(1,2-этандиол)]-бис-ИТМ и S,S’-[1,4- фенилен-бис(1,2-этандиил)]-бисИТМ (PBITU) обладают высокой NOS-ингибирующей активностью и при этом
проявляют значительную селективность к iNOS [Garvey E.P., 1994; Boer R., 2000].
Кристаллографические исследования показали, что причиной высокой аффинности этих
бис-ИТМ
является
пиррольного
кольца
взаимодействие
D
гема.
второй
уреидной
группы
с
пропионатом
Бис-ИТМ,
подобно
S-алкил-ИТМ,
являются
конкурентными, обратимыми ингибиторами NOS. К сожалению, высокая токсичность
бис-изотиурониевых производных и низкая абсорбируемость в биологических тканях
ограничивает их практическое применение [Alderton W.K., 2001; Viteceek J., 2012].
Введение аминогруппы в S-алкильный радикал изменяет NOS-ингибирующие
свойства S-алкил-ИТМ. Практически во всех случаях S-аминоалкил-ИТМ существенно
менее активны как ингибиторы NOS, чем соответствующие S-алкил-ИТМ [Garvey E.P.,
1994; Southan G.J., 1996]. И при этом качественно изменяется механизм ингибирующего
действия – все исследованные S-аминоалкил-ИТМ, подобно L-N-аминоаргинину и
аминогуадинину, вызывают необратимую инактивацию NOS [Wolff D.J., 1996, 1997].
Таблица 1.4 - Ингибирующая активность S-замещѐнных диизотиомочевин
(по данным [Garvey E.P., 1994]).
R
KiiNOS, мкМ
R
KiiNOS, мкМ
(CH2)2
(CH2)3
(CH2)4
(CH2)7
1,4
16
40
0,8
(CH2)8
(CH2)2-(1,3-Ph)-(CH2)2
(CH2)2-(1,4-Ph)-(CH2)2
9,2
0,05
0,007
Наиболее изученным представителем этой группы является S-аминоэтил-ИТМ.
Хотя это соединение является достаточно слабым ингибитором NOS, показано, что оно
in vivo подавляет индуцированную ЛПС продукцию NO [Проскуряков С.Я.,
Филимонова М.В., 2003]. Кроме того, получены данные, что S-аминоэтил-ИТМ
подавляет экспрессию iNOS и ускоряет еѐ деградацию [Wei L.H., 1998].
N-замещающий радикал самостоятельно не придаѐт тиомочевинам NOSингибирующей активности - детальное изучение не выявило сильных ингибиторов NOS
66
в ряду N-алкил, N-аминоалкил и N-арилтиомочевин [Goodyer C.L., 2003]. Более того,
сопоставление
ингибирующей
активности
S-замещѐнных
и
S,N-замещѐнных
производных ИТМ свидетельствует, что N-замещение, как правило, ослабляет
ингибирующую активность ИТМ - так, например, если для S-этил-ИТМ KiiNOS
составляет 0,02 мкМ, то для S-этил-N-метил-ИТМ эта величина возрастает до 9,3 мкМ
[Moore W.M., 1996]. Однако, это негативное влияние N-замещающего радикала, судя по
всему, неравномерно сказывается на аффинности S,N-замещѐнных производных ИТМ к
различным изоформам NOS. В результате этого такие соединения, хотя и уступают в
ингибирующей
активности
S-замещѐнным
аналогам,
но
могут
приобретать
селективность к тем или иным изоформам.
Примером этому является S-этил-N-[4-(трифлуорометил)фенил]-ИТМ (ETPI),
выявленная в ряду N-арил-S-алкил-ИТМ, которая in vitro проявляет высокую
селективность к ингибированию nNOS [Shearer B.G., 1997; Cooper G.R., 2000].
Рентгеноструктурные данные показали, что объѐмный N-фенильный заместитель не
позволяет расположиться S-этильной группе ETPI возле гема в H-pocket оксидазного
домена NOS, как это наблюдается в случае S-этил-ИТМ [Raman C.S., 2001]. Повидимому, ослабление гидрофобного взаимодействия S-алкильной группы в этом случае
и является причиной меньшей ингибирующей активности ETPI в сравнении с S-этилИТМ.
Вместе
с
тем,
атом
фтора
N-заместителя
ETPI
образует
в
nNOS
«дополнительную» водородную связь с Gln, которая отсутствует в iNOS и eNOS,
обеспечивая тем самым селективность к нейрональной изоформе [Tafi A., 2006]. ETPI in
vivo проявляет достаточно слабую NOS-ингибирующую активность, тем не менее,
показана способность этого соединения к защите миокарда на модели транзиторной
ишемии [Wang Y., 2004].
В последние годы проводились активные экспериментальные исследования
фармакологических свойств S- и N,S-замещѐнных производных ИТМ. Показано, что
активные ингибиторы NOS данного химического класса в нетоксических дозах (5-15
мг/кг) in vivo оказывают выраженное вазопрессорное действие, сопровождающееся у
подопытных животных в состоянии геморрагического или эндотоксемического шока
длительным подъѐмом АД [Проскуряков С.Я., Филимонова М.В., 2002, 2010;
Верховский Ю.Г., Филимонова М.В., 2009; Макарчук В.М., Филимонова М.В., 2010,
2010б; Филимонова М.В., 2011], а также способны достоверно повышать выживаемость
67
животных
при
радиационном
и
комбинированном
радиационно-термическом
поражении [Проскуряков С.Я., 2003, 2005б; Коноплянников А.Г., 2007; Филимонова
М.В., 2012б, 2014], и усиливать апоптоз опухолевых клеток [Орлова М.А., Филимонова
М.В., 2013, 2014; Филимонова М.В., 2013, 2015]. Причѐм, вазопрессорные и
радиозащитные свойства некоторых S-алкил-ИТМ, обладающих NOS-ингибирующей
активностью, были показаны задолго до открытия роли NO в регуляции сосудистого
тонуса [Голощапова Ж.А., 1981], а диэтилфосфат S-этил-ИТМ (дифетур) был принят
ещѐ в 1980-х годах к применению в качестве гипертензивного средства. Данный
препарат отличался высокой длительностью вазопрессорного действия и отсутствием
недостатков, характерных для адреномиметиков, однако, в связи с патентными
ограничениями, возникшими после распада СССР, производство дифетура было
прекращено.
Перспективными тиоамидиновыми ингибиторами NOS являются также Lтиоцитруллин (L-TC) и его S-алкильные производные, которые можно рассматривать
как S,N-замещѐнные производные ИТМ с аминокислотным N-радикалом. L-цитруллин
не влияет на каталитическую активность NOS, однако замещение в его структуре
кислорода карбоксамидной группы на серу значительно повышает аффинность - L-TC
ведѐт себя как неселективный ингибитор всех изоформ NOS [Narayanan K., 1994; Furfine
E.S., 1994]. Спектральный анализ показал, что основой высокой аффинности L-TC
является прямое взаимодействие атома серы с Fe-heme в активном центре NOS [Frey C.,
1994]. Как и в случае S-алкил-ИТМ, внесение в структуру L-TC S-алкильных
заместителей
небольшого
объѐма
повышали
NOS-ингибирующую
активность
соединений – S-метил-L-тиоцитруллин (L-SMTC) и S-этил-L-тиоцитруллин (L-SETC)
являются сильными ингибиторами NOS и обладают значительной селективностью к
nNOS [Furfine E.S., 1994]. S-алкилирование нарушало прямое взаимодействие атома
серы этих соединений с Fe-heme, однако это компенсировалось гидрофобным
взаимодействием S-алкильных радикалов [Ijuin R., 2005]. Несмотря на различие
взаимодействия
с
активным
центром,
L-TC,
L-SMTC
и
L-SETC
являются
конкурентными, обратимыми ингибиторами NOS. Эти соединения хорошо растворимы
и стабильны (кроме щелочных растворов), и поэтому широко используются в
экспериментальных исследованиях. Показано, что L-TC (20 мг/кг, внутривенно)
повышает АД нормотонических и септических крыс [Frey C., 1994]. L-SMTC (20 мг/кг,
68
внутривенно) стремительно повышал АД у септических крыс и собак, и при этом
умеренно улучшал сердечный индекс подопытных животных [Narayanan K., 1995]. LSMTC также активно используется как инструмент изучения функций nNOS, в
частности, при изучении роли nNOS в модуляции симпатической активности ЦНС
[Zanzinger J., 1997], в формировании долгосрочной памяти [Kelley J.B., 2011], в
регуляции почечной микроциркуляции и гемодинамики [Komers R., 2000] и в патогенезе
рефрактерной вазоплегии [Nardi G.M., 2014]. В последние годы L-SMTC начал
использоваться и в клинических исследованиях, в частности, при изучении роли nNOS в
регуляции микроциркуляции, коронарного кровотока и центральной гемодинамики
[Seddon M., 2008, 2009; Melikian N., 2009; Shabeeh H., 2013, 2013b].
Наряду с линейными N,S-замещѐнными производными ИТМ, ингибирующую
активность могут проявлять также и соединения, содержащие тиоамидиновый фрагмент
в составе гетероцикла. Одними из первых соединений в данной области, испытанными в
качестве ингибиторов NOS, явились 5-членные гетероциклы – производные 2аминотиазола. Было показано, что в этом ряду для ингибирующей активности особое
значение имеет характер заместителей в 4 и 5 положении. Метильные заместители
значительно (в 5-50 раз) усиливали NOS-ингибирующую активность по сравнению с
исходным аминотиазолом [Garvey E.P., 1994]. Однако введение в 5-ое положение таких
объѐмных заместителей, как изопропил и третбутил, уменьшало аффинность к nNOS, и
такие соединения приобретали избирательность к ингибированию iNOS [Ueda S., 2004].
2-амино-2-тиазолин
и
2-амино-5,6-дигидро-4Н-1,3-тиазин,
образующиеся
в
организме млекопитающих при циклизации, соответственно, S-аминоэтил- и Sаминопропил-ИТМ, также обладают ингибирующей активностью без значимой
селективности к изоформам NOS [Boer R., 2000; Мандругин А.А., 2007; Мандругин
А.А., Филимонова М.В., 2014]. В то же время, для этих соединений также отмечено
существенное влияние заместителей на характер ингибирующей активности. Так,
введение метильной группы в 6-ое положение 2-амино-5,6-дигидро-4Н-1,3-тиазина в
100-150 раз повышает активность ингибирования NOS и придаѐт соединению значимую
селективность к iNOS [Nakane M., 1995; Трофимова Т.П., 2008; Lopez-Cara L.C., 2012].
В экспериментах in vivo производные 2-аминотиазола, 2-амино-2-тиазолина и 2амино-5,6-дигидро-4Н-1,3-тиазина,
обладающие
NOS-ингибирующей
активностью,
повышали сосудистый тонус и оказывали гипертензивное действие у подопытных
69
животных в состоянии геморрагического и эндотоксемического шока [Проскуряков
С.Я., Филимонова М.В., 2002, 2004; Филимонова М.В., 2012; Плотникова Е.Д.,
Филимонова М.В., 2013; Мандругин А.А., Филимонова М.В., 2014]. Была также
показана способность ингибиторов NOS дигидротиазин-тиазолинового ряда ускорять
пострадиационное восстановление кроветворной системы [Коноплянников А.Г., 2007] и
наличие у некоторых из них специфического цитотоксического действия в отношении
лейкемических клеток [Орлова М.А., Филимонова М.В., 2013, 2014].
70
ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Лабораторные животные
Исследования проведены на 850 белых аутбредных мышах обоего пола
(исходный генотип – SHK) в возрасте 4-5 месяцев с массой тела 27-33 г; на 2230 мышахгибридах F1 (CBA×C57BL6j), самцах и самках в возрасте 2-2,5 месяца с массой тела 19-22
г; на 35 самках мышей C57BL6j в возрасте 2-2,5 месяца с массой тела 23-26 г; и на 230
самцах крыс Wistar (KYO) в возрасте 3-4 месяца с массой тела 230-320 г. Животные
получены из питомника лабораторных животных ФГБУН НЦБМТ ФМБА России
(филиал «Андреевка»). Они были здоровы, имели ветеринарный сертификат качества и
состояния здоровья, и прошли 20-суточный карантин в виварии МРНЦ им. А.Ф. Цыба.
Содержались животные в клетках Т-3 и Т-4 в соответствии с нормами группового
размещения в условиях естественного освещения с принудительной 16-кратной в час
вентиляцией, при температуре 18-20˚C и относительной влажности воздуха 40-70% на
подстилке из древесных стружек, простерилизованных в сухожаровом шкафу.
Животные имели свободный доступ к питьевой воде и корму.
Таблица 2.1 - Комбикорм ПК-120-1 для лабораторных крыс и мышей
(сертификат соответствия № РОСС RU.ПО81.В00113; ГОСТ Р50258-92)
Состав
Ячмень или овѐс
Пшеница
Шрот подсолничниковый
Рыбная мука
Дрожжи кормовые
Соль поваренная
Премикс минерало-витаминный
Отруби пшеничные
Сухое молоко
Эндокс
Шрот соевый
Известняковая мука
Минеральная смесь
%
31,78
24,09
9,00
2,00
5,00
0,10
0,02
13,00
1,00
0,01
11,90
2,00
0,10
Показатели качества
Сырой протеин
Обменная энергия
Сырая клетчатка
Сырой жир
Кормовые единицы /100 кг
Фосфор
Натрий хлористый
Лизин
Метионин + Цистеин
Кальций
21,9%
280,2 ккал
4,7%
3,2%
123,2
0,69%
0,26%
1,09%
0,82%
0,93%
Содержание микронутриентов в 1 кг: А–10 тыс.МЕ; В1–1 мг; В12–0,02 мг; В2–6 мг; В3–10 мг; В5–20 мг;
В6–4 мг; D3–2 тыс.МЕ; Е–20 мг; Н–0,1 мг; К3–2 мг; эндокс–100 мг; Co-0,3 мг; Cu–10 мг; Fe–80 мг; I–0,6
мг; Mn–40 мг; Se–0,2 мг; Zn–60 мг
Для питья использовали поилки – 500 мл стеклянные сосуды с конической
пробкой из нержавеющей стали с отверстием в центре. Животные получали
71
стандартный брикетированный корм ПК-120-1 (ООО «Лабораторснаб», Россия), состав,
пищевая ценность и содержание нутриентов которого указаны в таблице 2.1.
Все экспериментальные работы с лабораторными животными выполнены в
соответствии с общепринятыми нормами обращения с животными, на основе
стандартных операционных процедур, принятых в МРНЦ им. А.Ф. Цыба, которые
соответствуют правилам Европейской Конвенции по защите позвоночных животных,
используемых для научных целей (European Convention for the Protection of Vertebrate
Animals Used for Experimental and other Scientific Purposes (ETS 123). Strasbourg, 1986).
Использованные соединения и фармакологические препараты
Методы синтеза использованных в исследованиях оригинальных линейных и
циклических
производных
N-ацил-S-алкил-замещѐнных
ИТМ
разработаны
в
лаборатории радиационной фармакологии Медицинского радиологического научного
центра им. А.Ф.Цыба – филиала федерального государственного бюджетного
учреждения «Федеральный медицинский исследовательский центр им. П.А.Герцена»
Министерства Здравоохранения Российской и защищены патентами РФ на изобретения
RU2338538 от 20.11.2008; RU2353614 от 27.04.2009, RU2475479 от 20.02.2013 и заявкой
на изобретение №082603 от 29.11.2013. Наработка этих соединений в количествах,
необходимых для экспериментальных исследований, также была проведена в
лаборатории радиационной фармакологии МРНЦ.
Методы
синтеза
использованных
в
работе
S-[2-алкил(арил)сульфонил]-
монозамещѐнных производных S-этил(винил)-ИТМ разработаны в ФГБУ науки
«Институт органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН» (а.с. №83085 от 1.11.1974,
№90803 от 6.10.1975 и №97821 от 2.8.1976). Наработка соединений этого класса для
исследований была проведена в лаборатории радиационной фармакологии МРНЦ им.
А.Ф. Цыба.
Структуру всех исследуемых соединений идентифицировали и подтверждали
методами физико-химического и химического анализа. Контроль чистоты соединений
осуществляли с помощью тонкослойной хроматографии на пластинах Silufol UV-254
(Чешская Республика) в системах аммиак-хлороформ-изопропанол и бутанол-ацетонмуравьиная кислота. Спектры ЯМР 1H получены в DMSO-d6 и D2O на спектрометре
DRX-500 (Bruker, Германия) при частоте 500 МГц с использованием тетраметилсилана в
качестве внутреннего стандарта. Масс-спектры регистрировали на квадрупольном масс-
72
спектрометре LCMS-2010A (Shimadzu, Япония) с ионизацией в электроспрее.
Температуры плавления определяли с помощью дифференциально-сканирующего
колориметра DSC-822E (Mettler Toledo, Швейцария) в интервале температур 50-300°C
при скорости нагрева 10°C/мин навесок массой 3-5 мг.
При проведении экспериментальных исследований все изучаемые соединения
применялись в виде асептических водных растворов, приготовленных ex tempore.
Исключение составляли соединение Т-1049, для приготовления раствора которого
использовали Tween-80 (Sigma-Aldrich, кат.№ P8074) в соотношении 1:10, и индралин,
который растворяли в 1% растворе винной кислоты.
Препараты сравнения – радиопротекторы аmifostine S-[2-[(3-аминопропил)
амино]этил]дигидрофосфотиоат (амифостин, MedImmun Pharma BV, Нидерланды),
дифетур (НПЦ «Фармзащита» ФГУП ФМБА, Россия), цистамина дигидрохлорид
«Сигма-Алдрич» (Москва), серотонина адипинат «Сигма-Алдрич» (Москва), мексамин
«Сигма-Алдрич» (Москва), индралин (Б-190) (НПЦ «Фармзащита» ФГУП ФМБА,
Россия), α1-адреномиметик фенилэфрин (мезатон, ICN Полифарм, Россия), цитостатик
циклофосфамид (циклофосфан, ООО «Компания Деко», Россия) и ингибитор VEGF
бевацизумаб
(авастин,
Roche
Diagnostics GmbH, Германия)
использовались
в
исследованиях в готовых лекарственных формах.
Исследование токсичности соединений
На первом этапе исследования изучаемых соединений для выбора доз и
концентраций при тестировании биологической активности проводили оценку их
острой токсичности при однократном внутрибрюшинном введении на 416 самцах белых
аутбредных мышей SHK в возрасте 4-5 месяцев с массой тела 27-30 г [Хабриев Р.У.,
2005; Курляндский Б.А., 2002]. Условия получения и содержания животных описаны в
разделе 2.1. Объѐм вводимых растворов соединений составлял 0,1-0,5 мл. Наблюдение
за подопытными животными осуществляли в течение 15 суток после введения
соединений. Регулярно фиксировали общее состояние, особенности поведения и
двигательной активности, регистрировали сроки развития интоксикации и гибели
животных. Показатели острой токсичности ЛД10, ЛД16, ЛД50±m и ЛД84 определяли с
использованием метода пробит-анализа по Литчфилду-Уилкоксону [Litchfield J.T.,
Wilcoxon F., 1949; Беленький М.Л., 1963].
73
Исследование влияния соединений на активность NOS и уровень NO
Изучение
NOS-ингибирующей
активности
in
vitro
радиометрическим
методом использовали в качестве скринингового теста для количественной оценки
NOS-ингибирующей активности исследуемых соединений и селективности их действия
к изоформам NO-синтаз. Исследования проведены на изолированных рекомбинантных
изоформах NOS человека (Enzo Life Sciences Inc., США) с применением набора
реагентов и протокола измерений NOS Activity Assay Kit (Cayman Chemical, США). При
этом изучалось влияние различных концентраций исследуемых соединений на
каталитическую активность изоформ NOS. Активность ферментов оценивали по
скорости накопления [3H]-L-цитруллина, образующегося в реакции окисления [3H]-Lаргинина, катализируемой NOS [van Eijk H.M., 2007].
Для этого в центрифужные пробирки помещали по 43 мкл реакционной среды,
содержащей 5 мМ Tris-HCl (pH 7,4); 10 мкМ BH4; 5 мкМ FAD; 5 мкМ FMN; 1 мМ
NADPH; 1 мМ 3H-L-Арг (0,1 мКи/мл); 50 нМ CaM; 0,5 мМ CaCl2. В подопытные
пробирки добавляли 5 мкл фосфатно-солевого буфера (pH 7,4), содержащего
исследуемый ингибитор в конечных концентрациях от 10-1 до 103 мкМ (по пять
повторностей на каждую концентрацию), в контрольные - 5 мкл фосфатного буфера.
Далее во все пробирки вносили по 2 мкл «стандартных» растворов рекомбинантных
изоформ NOS. Инкубировали реакционную смесь в течение 60 минут при 37˚C. Реакцию
останавливали, добавляя по 400 мкл охлаждѐнного буфера, содержащего 50 мМ HEPES
(pH 5,5) и 5 мМ EDTA. Далее в каждый образец вносили по 100 мкл суспензии
ионнообменной смолы Dowex AG50WX8 и центрифугировали 3 минуты при 20000 g.
После чего по 100 мкл супернатанта переносили во флаконы, содержащие 5 мл
сцинтиляционной
жидкости
и
проводили
радиометрические
измерения
на
сцинтиляционном счѐтчике Beckman LS 6000 (Beckman Coulter, США). В каждом опыте,
наряду с подопытными пробами, ставились пробы негативного контроля, в которые не
вносили изоформы NOS, и в которых образование [3H]-L-цитруллина не происходило.
Результаты измерений каждого опыта корректировали по показателям радиоактивности
негативного контроля.
Для количественной оценки ингибирующей активности изучаемых соединений по
отношению к изоформам NOS использовали показатели IC50 – концентрации
соединений, подавляющие активность ферментов на 50% (при постоянной для всех
74
измерений концентрации L-аргинина). Рассчѐт IC50 проводили на основе результатов
радиометрических измерений. О степени и характере селективности ингибирующего
действия исследуемых соединений судили по отношениям значений IC50 для различных
изоформ NOS.
Оценка
активности
синтеза
NO
в
клеточных
культурах
методом
цитофлуориметрии использована в работе для исследования обратимости NOSингибирующего действия изучаемых соединений. В опытах применяли зонд DAF-2DA
(4,5-диаминофлуоресцеин-2-диацетат)
(Sigma-Aldrich,
США),
образующий
при
взаимодействии с NO флуоресцирующий продукт DAF-2T (4,5-диаминофлуоресцеин-2триазол), интенсивность флуоресценции которого коррелирует с внутриклеточным
содержанием NO в широком диапазоне концентраций.
В опытах использовали культуры клеток меланомы B16 и клеток HeLa,
различающиеся по спектру экспрессируемых изоформ NOS. Клетки снимали с
подложки, подсчитывали их концентрацию в камере Горяева и вносили в цетрифужные
пробирки по 105 клеток. Клетки центрифугировали 5 мин при 200 g, к осадку добавляли
0,5 мл среды DMEM (Пан-Эко, Россия) без сыворотки. Далее в подопытные пробирки в
5 повторах вносили исследуемые соединения в конечных концентрациях от 0,02 до 0,4
мг/мл, а в контрольные пробирки - равный объѐм DMEM. В качестве препарата
сравнения использовали известный гуанидиновый ингибитор NOS L-NMMA (Cayman
Chemical, США), который вносили в таких же концентрациях. Все препараты
инкубировали 2 часа при 37˚С и периодическом перемешивании. Затем клетки осаждали
центрифугированием, отмывали в PBS (Sigma-Aldrich, США), добавляли раствор DAF2DA в PBS и инкубировали ещѐ 1 час. После чего клетки ресуспендировали,
фильтровали с помощью нейлонового фильтра с порами 40 мкм. Анализ образцов
проводили на проточном цитофлуориметре FACS Calibur (BDIS, США) совместно с
сотрудниками отдела радиационной биохимии МРНЦ им. А.Ф. Цыба. Содержание NO
оценивали по флуоресценции DAF-2T на длине волны 525±30 нм (возбуждали при 488
нм). В каждой пробе анализировали не менее 200 тысяч клеток. На основе полученных
данных при помощи программы CellQuestPro (BDIS, США) расчитывали средние
показатели флуоресценции DAF-2T, по которым судили о внутриклеточном содержании
NO в клетках исследованных образцов.
75
Измерение содержания NO в тканях подопытных животных методом ЭПРспектрометрии с применением диэтилдитиокарбаматной (ДЭТК) спиновой ловушки
использовали при изучении NOS-ингибирующей активности изучаемых соединений in
vivo. Комплекс Fe+2-(ДЭТК)2, образующийся в тканях подопытных животных при
введении ДЭТК и Fe/цитратного комплекса, реагирует с NO с образованием
стабильного парамагнитного мононитрозильного комплекса NO-Fe+2-(ДЭТК)2, который
отличается характерным при низких температурах спектром ЭПР со сверхтонкой
структурой в виде триплета с аксиальной симметрией (g1=2,037 и g2=2,015). Анализ
спектра ЭПР образцов тканей позволяет оценить содержание в них NO-Fe+2-(ДЭТК)2, по
которому можно судить о концентрации NO в этих тканях [Vanin A.F., 2009; Hogg N.,
2010].
Экспериментальные исследования проведены на самцах мышей-гибридов F1
(CBA×C57BL6j) в возрасте 2-2,5 месяца с массой тела 19-22 г. В каждом опыте, наряду с
опытными группами, использовалось две контрольных группы животных – негативного
и позитивного контроля (по 5-6 особей в каждой экспериментальной группе). Особям
позитивного контроля и опытных групп за 24 часа до взятия проб внутрибрюшинно
вводили ЛПС E.coli (0111:В4; Sigma-Aldrich, США) в дозе 2 мг/кг в 0,5 мл раствора.
Особям негативного контроля ЛПС не вводили. За 1 час до взятия проб опытным
животным внутрибрюшинно вводили исследуемые соединения в 0,2-0,4 мл раствора, а
животным негативного и позитивного контроля – равный объѐм растворителя (при
изучении длительности ингибирующего действия in vivo, исследуемые соединения
вводили за 1 и 4 часа до взятия проб). За 30 минут до взятия проб всем животным
вводили компоненты спиновой ловушки (Sigma-Aldrich, США) – ДЭТК (300 мг/кг),
внутрибрюшинно в 0,5 мл, и Fe2SO4 (32 мг/кг) + натрия цитрат (136 мг/кг),
внутримышечно в 0,2 мл. Перед взятием проб животных выводили из опыта путѐм
цервикальной дислокации под эфирным наркозом. Выделяли головной мозг и печень.
Из каждого органа брали по три образца тканей в виде циллиндров диаметром 4 и
высотой 10 мм и замораживали в жидком азоте. Образцы от каждой экспериментальной
группы (по 15-18 шт.) помещали в герметичные стеклянные сосуды, которые погружали
в сосуды Дьюара с жидким азотом до проведения спектрометрии.
Спектры регистрировали при 77˚К на частоте 9,61 ГГц (мощность СВЧ 5 мВт,
частота модуляции 100 кГц и амплитуда модуляции магнитного поля 0,5 мТ) на
76
спектрометрах EMX-8 и ESP-300E (оба: Bruker, Германия) в лаборатории ядерной
медицины МРНЦ им. А.Ф. Цыба и в лаборатории нейрохимии ФГБУ науки ИБХФ им.
Н.М. Эмануэля РАН. Интенсивность сигналов измеряли по спектру эталона MgO:Mn2+
(ФГУП ВНИИФТРИ, Менделеево, Россия), который записывали в том же канале,
одновременно со спектром образца. Содержание NO в тканях оценивали при помощи
программы Simphonia (Bruker, Германия) по амплитуде первой компоненты триплетной
структуры спектра (рисунок 2.1), которая находится в минимальной суперпозиции с
сигналами других парамагнитных центров.
Рисунок 2.1 - Типичный спектр ЭПР тканей печени самцов мышей гибридов F1
(CBA×C57BL6j): В – интактный орган; А - орган, индуцированный ЛПС в дозе 2 мг/кг.
Стрелкой отмечен первый компонент триплетной структуры спектра NO-Fe+2-(ДЭТК)2.
Фотометрический метод определения содержания NO2-/NO3- с использованием
реактива Грисса также применяли при изучении NOS-ингибирующей активности
изучаемых соединений in vivo. Метод основан на свойстве диазотированной в
присутствии NO2- сульфаниловой кислоты образовывать с α-нафтиламином в кислой
среде азосоединение, имеющее розовое окрашивание, интенсивность которого
пропорциональна концентрации нитритов [Tsikas D., 2009].
Исследования выполнены на самцах крыс Wistar (KYO) в возрасте 3-4 месяца с
массой тела 270-350 г. Как и в случае ЭПР-спектрометрии, в каждом опыте, наряду с
опытными группами, использовали две контрольных группы животных – негативного и
позитивного контроля (по 4 особи в каждой экспериментальной группе). Особям
позитивного
контроля
и
опытных
групп
за
1
сутки
до
взятия
материала
внутрибрюшинно вводили ЛПС E.coli (0111:В4; Sigma-Aldrich, США) в дозе 10 мг/кг в
77
0,5 мл раствора, а через 1 час опытным животным внутрибрюшинно вводили
исследуемые соединения в 0,5 мл раствора. Растворы компонентов реагента Грисса
(Promega, США) готовили в день проведения исследований.
Перед взятием проб животных наркотизировали (тиопентал натрия, 60 мг/кг,
внутрибрюшинно), проводили забор крови из сонной артерии с добавлением гепарина
(1:4) и выполняли эвтаназию путѐм передозировки тиопентала натрия. Сразу выделяли
печень и мозжечок, из которых в кратчайшие сроки на льду готовили гомогенаты в
фосфатно-солевом буфере (pH 7,4). Депротеинизацию образцов проводили сульфатом
цинка. Для этого к 1 мл плазмы крови или гомогената тканей добавляли 1 мл 6%
раствора сульфата цинка и инкубировали 1 час при 10˚C. Далее образцы
центрифугировали 15 минут при 3000 g, добавляли к 1 мл супернатанта 300 мкл 1 N
раствора NaOH и повторно центрифугировали. Восстановление нитратов проводили
металлическим цинком. Для этого в пробирку, содержащую 110 мг цинковой пыли, 0,5
мл аммиачного буфера (pH 9,6) и 20 мкл аммиачного комплекса сульфата меди,
помещали 1 мл супернатанта,
укупоривали и инкубировали 30 минут
при
периодическом встряхивании. Цинковую пыль осаждали центрифугированием при 1500
g в течение 10 минут. Далее к 1 мл супернатанта добавляли 1 мл 1% раствора
сульфаниловой кислоты в 30% уксусной кислоте и инкубировали 10 минут при 4˚C для
завершения диазотирования. После чего добавляли 1 мл 15% раствора ацетата натрия и
1 мл 0,05% раствора α-нафтиламина солянокислого. Для полного развития окраски
пробы инкубировали при 20˚C в течение 30 минут. Оптическую плотность измеряли на
520 нм при помощи фотометра КФК-3-01 (ЗОМЗ, РФ). Концентрацию NO2-/NO3- в
образцах рассчитывали с учѐтом разведений при депротеинизации по калибровочным
кривым, полученным по растворам Na2NO2 в концентрациях до 150 мМ.
Исследования влияния соединений на сердечно-сосудистую систему
Исследования
влияния
производных
ИТМ
на
гемодинамику,
сердечную
деятельность и дыхание проведены на нормотонических животных и на моделях
различных
гипотоний:
острого
тяжѐлого
геморрагического
шока;
острого
эндотоксемического шока; гипотонии, вызванной ганглиоблокадой; рефрактерной
стадии шока при эндотоксемии.
Исследования проведены на группах самцов крыс Wistar (по 8-12 особей в
каждой) в возрасте 3-4 месяцев с массой 240-320 г, наркотизированных тиопенталом
78
натрия (Sandoz, Австрия или ОАО «Синтез», Россия) в дозе 60 мг/кг, внутрибрюшинно.
Животному устанавливали трахеостому, катетеризировали яремную вену и сонные
артерии, подключали инвазивные датчики кровяного давления, электроды ЭКГ и
внутривенно вводили гепарин (100 ЕД). После стабилизации состояния животного
регистрировали с помощью полиграфа RM-6000 (Nikhon Kohden, Япония) или с
помощью комплекса PowerLab 8/30 (ADInstruments, Австралия) исходные значения ЧСС
(уд/мин), ЧДД (дв/мин), АДс и АДд (мм.рт.ст.) в левой сонной артерии и ЦВД (мм.рт.ст.)
в яремной вене.
Далее производили манипуляции, необходимые для воспроизведения различных
гипотонических состояний [Саркисов Д.С., 1960; Новицкий В.В., 2011]. При
моделировании острого тяжѐлого геморрагического (гиповолемического) шока из
правой сонной артерии подопытных животных проводили забор крови в течение 8-12
мин в объѐме 3,0 мл на 100 г массы тела. Для создания острого эндотоксемического
(вазодилятационного) шока внутривенно вводили ЛПС E.coli (0111:В4; Sigma-Aldrich,
Москва) в дозе 18 мг/кг в 0,5 мл раствора. Для создания гипотонии, вызванной
ганглиоблокадой, внутрибрюшинно вводили азаметония бромид (пентамин, ОАО
Дальхимфарм, Россия) в дозе 12 мг/кг в 0,3 мл раствора. Для воспроизведения
рефрактерного состояния при эндотоксемии проводили двухкратное внутрибрюшинное
введение ЛПС в дозе 5 мг/кг в 0,5 мл раствора: первую инъекцию делали за 18 часов до
начала исследований, вторую – после подключения датчиков и регистрации исходных
показателей у наркотизированного животного.
После развития стабильной гипотонии (при геморрагическом шоке – с момента
окончания кровопотери; при эндотоксемическом шоке – через 10 минут после введения
ЛПС) повторяли регистрацию физиологических показателей. Затем животным опытных
групп внутрибрюшинно вводили исследуемые соединения в дозах 10 – 60 мг/кг в виде
растворов, приготовленных из расчѐта 0,1 мл на 100 г массы тела. Дальнейшее
наблюдение за динамикой показателей продолжали в течение последующих 90-120
минут. Выживших к концу срока наблюдения животных выводили из опыта путѐм
воздушной эмболии.
В качестве препарата сравнения в данных исследованиях использовали
фенилэфрин (мезатон, ICN-Полифарм, Россия), который является одним из наиболее
длительно действующих α1-адреномиметиков. Подопытным животным фенилэфрин
79
вводили однократно, внутрибрюшинно в дозе 0,5 мг/кг, которая эквивалентна
максимальной рекомендуемой дозе для человека при подкожном и внутримышечном
введении [Машковский М.Д., 2005].
При исследовании влияния изучаемых соединений на гемодинамику, сердечную
деятельность и дыхание нормотонических животных, наряду с указанными выше
физиологическими показателями, каждые 30 минут наблюдения измеряли МОК (л/мин)
методом термодилюции в ранее разработанной модификации с внутрипищеводным
расположением термодатчика [Филимонова М.В., 1999]. Выводили животных из опыта
также через 90-120 минут наблюдения путѐм воздушной эмболии. В дальнейшем при
анализе гемодинамики на основе измерений проводили расчѐт ряда стандартных
показателей [Антонов А.А., 2004]: ударный объѐм (мл) - УО МОК ЧСС 1000;
сердечный индекс (л/мин/м2) - СИ МОК ППТ , где ППТ - площадь поверхности тела
животного,
которую
рассчитывали
по
Улановой
И.П.
[1968];
и
удельное
периферическое сопротивление сосудов (дин/сек/см5/м2) - УПСС 80 * АД ср ЦВД СИ ,
где АД ср АД д АД с АД д 3 - среднее АД.
Исследования радиозащитных свойств соединений
Первичную оценку радиозащитных свойств изучаемых соединений проводили по
тесту 30-суточной выживаемости животных при «костномозговой» форме острого
лучевого поражения, вызванного воздействием γ-излучения в дозе 10 Гр (ЛД98/30).
При изучении радиозащитных свойств S-монозамещѐнных производных ИТМ
опыты проведены на белых аутбредных мышах (самцах и самках) в возрасте 4-5 месяцев
с массой тела 27-33 г. Воздействие γ-излучением (60Co) в этих опытах проводили на
установке «Гаммацелл-220» (Канада) при мощности дозы 320 мГр/с. При изучении
радиозащитных свойств N,S-дизамещѐнных производных ИТМ опыты проведены на
самцах и самках мышей-гибридов F1 (CBA×C57BL6j) в возрасте 2-2,5 месяцев с массой
тела 20-23 г. Воздействие γ-излучением (60Co) в этих опытах проводили на установке
«Луч-2» (Россия) с мощностью дозы 84 мГр/с. Во всех случаях одновременно облучали
до 15 животных.
В каждом эксперименте, наряду с опытными группами, использовались три
контрольных группы - негативного, позитивного и биологического контроля. Все
группы состояли из 12-15 мышей. Особям опытных групп за 15-20 мин до
80
радиационного воздействия внутрибрюшинно вводили исследуемые соединения. Дозы
S-монозамещѐнных производных ИТМ составляли 1/3-1/2 ЛД50, а дозы N,Sдизамещѐнных производных ИТМ – 1/5-1/4 ЛД50. Особям групп позитивного контроля в
эти сроки внутрибрюшинно вводили препараты-сравнения – амифостин (270 мг/кг), Sэтилизотиурония диэтилфосфат (дифетур, 150 мг/кг) или цистамина дигидрохлорид (225
мг/кг), а животным негативного контроля – 0,5 мл физиологического раствора. Группа
биологического контроля не подвергалась никаким воздействиям и служила для
контроля полноценности животных и качества условий их содержания. Гибель
животных регистрировали ежедневно на протяжении 30 суток.
Радиозащитный
эффект
оценивали
по
кривым
выживаемости
животных
(диаграммы Каплана-Мейера), показателю выживаемости на 30-е сутки после облучения
и средней ПЖ погибших животных. При данных условиях радиационного воздействия
во всех сериях экспериментов в группах негативного контроля к 12-18 суткам после
облучения наблюдалась 100%-ная летальность.
Изучение влияния производных ИТМ на выживаемость гемопоэтических
клоногенных клеток при воздействии γ-излучения проведено на самцах мышейгибридов F1 (CBA×C57BL6j) в возрасте 2-2,5 месяцев и массой тела 20-23 г. При
использовании метода селезѐночных эндоколоний животных экспериментальных групп
(по 12-15 особей в каждой) подвергали воздействию γ-излучения (60Co) в дозе 6 Гр на
установке «Луч-2» при мощности дозы 80 мГр/с. Животным опытных групп за 15-20
мин до облучения внутрибрюшинно вводили исследуемые соединения в дозах 1/5-1/4
ЛД50, а животным групп позитивного контроля вводили препараты сравнения - дифетур
(150 мг/кг) или цистамина дигидрохлорид (225 мг/кг). На 9-е сутки после облучения
животных выводили из опыта путѐм цервикальной дислокации под эфирным наркозом,
выделяли селезѐнки и фиксировали их 24 часа в жидкости Буэна. Далее проводили
подсчѐт числа колоний на поверхности селезѐнок линейным размером более 0,2 мм,
образованных выжившими эндогенными гемопоэтическими клетками (КОЕ-С-9)
[Коноплянников А.Г., 2009]. Защитный эффект оценивали по среднему числу
эндоколоний в экспериментальных группах при 2-3 повторах экспериментов.
Метод селезѐночных эндоколоний также был использован при изучении
радиозащитного действия производных ИТМ в комбинации с некоторыми известными
радиопротекторами. В этом случае при раздельном применении изучаемые соединения
81
вводили внутрибрюшинно за 15-20 минут до облучения. При сочетанном применении
производное ИТМ вводили через 20 минут после внутрибрюшинного введения
радиопротектора и через 10-15 минут проводили облучение.
Метод селезѐночных экзоколоний применяли для определения оптимальной
радиозащитной
дозы
исследуемых
соединений.
В
этих
опытах
каждая
экспериментальная группа состояла из 5 мышей-доноров и 10-12 мышей реципиентов.
Доноров группы негативного контроля не подвергали радиационному воздействию.
Доноров позитивного контроля и подопытных групп подвергали воздействию γизлучения (60Co) в дозе 5 Гр на установке «Луч-2» при мощности дозы 80 мГр/с. За 1520 минут до облучения донорам подопытных групп внутрибрюшинно вводили
исследуемые соединения в дозах 1/8-2/3 ЛД16, а донорам положительного контроля – 0,5
мл физиологического раствора. Через 2 суток доноров всех групп выводили из опыта
путѐм цервикальной дислокации под эфирным наркозом, выделяли бедренные кости
конечностей, извлекали костный мозг и готовили клеточные суспензии для пересадки
мышам-реципиентам, которых в предшествующие сутки облучали в дозе 8 Гр. Перед
пересадкой проводили подсчѐт в камере Горяева под микроскопом CX21 (Olympus
Corp., Япония) клеточность суспезии и внутривенно трансплантировали реципиентам по
105 клеток костного мозга от соответствующих доноров. Через 8 суток реципиентов
выводили из опыта, извлекали селезѐнки, фиксировали их 24 часа в жидкости Буэна и
проводили подсчѐт на их поверхности числа колоний размером более 0,2 мм,
образованных
экзогенными
гемопоэтическими
клетками.
Далее
определяли
выживаемость клоногенных клеток в подопытных группах, по которой оценивали
радиозащитный эффект.
Изучение радиомодифицирующего действия соединений на моделях
лучевой терапии опухолей
Исследования выполнены совместно с сотрудниками отдела радиационной
биофизики МРНЦ им. А.Ф. Цыба (зав. - доктор биол. наук С.Е. Ульяненко) [Filimonova
M.V., Ulyanenko S.E., 2012] на самцах крыс Wistar (KYO) в возрасте 3-4 месяцев и
массой тела 270-350 г. В качестве модели использовали перевиваемую саркому М-1,
которая является быстрорастущей, неметастазирующей опухолью крыс и отличается
высокой радиорезистентностью [Гаркуша Н.Ф., 1990]. Для перевивки опухолевую ткань,
взятую на 12-14 сутки роста, измельчали до гомогенной консистенции, гомогенат
82
фильтровали с помощью нейлонового фильтра с порами 40 мкм, определяли
клеточность в камере Горяева под микроскопом CX21 (Olympus Corp., Япония) и
доводили средой 199 (Пан-Эко, Россия) до концентрации 6·106 клеток/мл. Перевивали
саркому животным путѐм подкожного введения 0,2 мл суспензии (1,2·106 клеток) в
область бедра.
Животных-опухоленосителей брали в опыт на 11 сутки после перевивки саркомы,
когда опухолевый узел уже развился у всех особей и достигал объѐма 0,8-1,2 см3.
Животных распределяли в 6 экспериментальных групп по 8-10 особей в каждой.
Животные группы негативного контроля не получали никаких воздействий. Животным
позитивного контроля однократно, внутрибрюшинно вводили изучаемое соединение в
дозе 1/4 ЛД16. Животные первой и второй опытных групп получали локальное
воздействие γ-излучением (60Co) на конечность c опухолью в дозах 32 и 36 Гр. Перед
облучением животных наркотизировали тиопенталом натрия. Каждую особь помещали
в специальный контейнер, из которого выводили облучаемую конечность, а тело
животного покрывали свинцовым экраном. Облучение проводилось на установке «Луч2» с мощностью дозы 48,6 сГр/мин. Животным третьей и четвѐртой опытных групп за
15-20 мин до облучения внутрибрюшинно вводили изучаемое соединение в дозе 1/4
ЛД16, и далее проводили локальное радиационное воздействие в дозах 32 и 36 Гр на
конечность с опухолью таким же путѐм, как в первой и второй опытной группе.
В дальнейшем, через каждые 2-3 суток, проводили измерение линейных размеров
опухолевых узлов у всех животных, а у животных, получавших радиационное
воздействие, также оценивали клиническую картину острых лучевых поражений кожи и
еѐ придатков на облучѐнной конечности. Выводили животных из опыта на 28-29 сутки
опухолевого роста путѐм воздушной эмболии под эфирным наркозом. Для анализа
динамики
роста
саркомы
проводили
рассчѐт
объѐмов
опухолевых
узлов
в
эллиптическом приближении. Строили кривые опухолевого роста, рассчитывали
индексы роста опухоли (ИР) и длительность задержки роста новообразований (см.
раздел 2.8), по которым судили о противоопухолевом эффекте [Хабриев Р.У., 2005].
Тяжесть и течение острых лучевых поражений кожи оценивали по клиникоморфологической классификации Радиотерапевтической онкологической группы и
Европейской организации по исследованию и лечению рака RTOG/EORTC-95 [Wells M.,
2003; Cox J.D., 1995; Аклеев А.В., 2014].
83
Исследования противоопухолевой активности соединений
Исследования проведены на самцах мышей-гибридов F1 [CBA×C57BL6j] в возрасте
2-2,5 месяца с массой тела 19-22 г. В качестве опухолевой модели использована
эпидермоидная карцинома лѐгких Льюис (КЛЛ). Штамм КЛЛ получен из банка
опухолевых материалов ФГБУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина и поддерживался на самцах
мышей С57BL6j. Для перевивки опухолевую ткань, взятую на 12-14 сутки роста,
измельчали до гомогенной консистенции, гомогенат фильтровали с помощью
нейлонового фильтра с порами 40 мкм, оценивали клеточность суспензии в камере
Горяева под микроскопом CX21 (Olympus Corp., Япония) и доводили средой 199 (ПанЭко, Россия) до концентрации 5·106 кл/мл. Перевивку КЛЛ проводили путѐм
подкожного введения 0,2 мл суспензии (106 клеток) в область бедра.
Изучение противоопухолевой и антиметастатической активности проводили
морфологическими методами при субхроническом введении соединений. Во всех
опытах в экспериментальных группах использовали по 13-15 животных. N,Sзамещѐнные производные ИТМ вводили особям подопытных групп ежедневно,
внутрибрюшинно в дозе 1/5 ЛД16 в 0,2 мл раствора. В зависимости от целей
исследования использовали различные схемы введения изучаемых соединений: со 2 по
21 сутки; со 2 по 7 сутки; с 7 по 21 сутки после перевивки КЛЛ. В качестве препарата
сравнения использовали бевацизумаб (авастин, Roche Diagnostics GmbH, Германия),
который вводили подопытным животным внутрибрюшинно в дозе 15 мг/кг в 0,2 мл
раствора на 2, 5 и 12 сутки после перевивки опухоли.
При изучении противоопухолевой активности исследуемых соединений в
сочетании с радио- и химиотерапией производные ИТМ вводились животнымопухоленосителям ежедневно со 2 по 21 сутки после перевивки КЛЛ. Локальное
воздействие γ-излучением в дозе 5 Гр на конечность c опухолью проводили на 7-е сутки
опухолевого роста. Перед облучением животных наркотизировали тиопенталом натрия.
Каждую особь помещали в специальный контейнер, из которого выводили облучаемую
конечность, а тело животного покрывали свинцовым экраном. Облучение проводили на
установке «Луч-2» с мощностью дозы 51 сГр/мин. Циклофосфамид (циклофосфан, Дако,
Россия) вводили подопытным животным дважды внутримышечно в дозе 100 мг/кг на 7
84
и 11 сутки опухолевого роста. Животным, получавшим сочетанное воздействие,
производное ИТМ вводили через 3-4 часа после облучения и цитостатика.
Начиная с 7-8 суток экспериментов, когда опухолевые узлы достигали
измеряемого размера, каждые 2-3 дня у всех животных измеряли линейные размеры
опухолей и рассчитывали их объѐмы в эллиптическом приближении:
4
x y z
V 0,524 x y z ,
3 2 2 2
где V - объѐм опухоли (мм3); x, y, z - ортогональные линейные размеры (мм).
В дальнейшем строили кривые опухолевого роста, рассчитывали индексы
торможения роста опухоли (ТРО) или индексы их роста (ИР) на различных сроках
наблюдения:
TPO
VK VO
100% ;
VK
ИР
VO
100% ,
VK
где VK и VO - средние объѐмы опухоли в контрольной и подопытной группе на
определѐнном сроке наблюдения, а также по экспоненциальным кривым роста
оценивали длительность задержки роста новообразований, по которым судили о
противоопухолевом действии [Хабриев Р.У., 2005].
Выводили животных из опыта на 21-е сутки после перевивки опухоли путѐм
цервикальной дислокации под эфирным наркозом. Выделяли лѐгкие, фиксировали их 24
часа в жидкости Буэна, проводили подсчѐт числа малых и крупных лѐгочных метастазов
КЛЛ и рассчитывали индексы ингибирования метастазирования (ИИМ):
ИИМ
fO M K M O
100% ,
fK
MK
где f O , f K - доля животных с метастазами в подопытной и контрольной группе, M O ,
M K - среднее число метастазов в подопытной и контрольной группе [Хабриев Р.У.,
2005], по которым судили об антиметастатическом действии изучаемых соединений.
Все эксперименты проводились в 2-3 повторностях.
Изучение
морфологию
влияния
опухолей
исследуемых
выполнены
соединений
совместно
с
на
функциональную
лабораторией
радиационной
патоморфологии МРНЦ им. А.Ф. Цыба (зав. - канд. мед. наук В.В. Южаков)
[Филимонова М.В., Южаков В.В., 2015]. В исследовании, наряду с контрольной
группой, использовали две подопытных группы животных-опухоленосителей (по 5
85
особей в каждой). Животным первой подопытной группы ежедневно внутрибрюшинно
вводили изучаемые производные ИТМ в дозе 1/5 ЛД16 со 2 по 14 сутки после перевивки
КЛЛ. Особям второй подопытной группы внутрибрюшинно вводили бевацизумаб
(авастин, Roche Diagnostics GmbH, Германия) в дозе 15 мг/кг на 2, 5 и 12 сутки роста
карциномы. Животных выводили из опыта на 15 сутки после перевивки КЛЛ путѐм
цервикальной дислокации под тиопенталовым наркозом. Выделяли опухоль, тимус и
селезѐнку. Материал фиксировали 24 ч в кислой жидкости Буэна, обезвоживали и
заливали в Paraplast Plus (Kendall, США).
Общую гистологию изучали на срезах толщиной 5 мкм, окрашенных
гематоксилином-эозином. Иммуногистохимические исследования проводили методом
биотин-стрептавидин-пероксидазного комплекса с использованием моноклональных
мышиных
антител
к
PCNA
(1:400;
PC10,
Dako
Corp.,
Дания)
–
маркѐру
пролиферирующих клеток и поликлональных кроличьих антител к PECAM-1 (1:100; M20-R, Santa Cruz Biotechnology Inc., США) – маркѐру эндотелиальных клеток. Растворы
для иммуногистохимии готовили на фосфатно-солевом буфере (рН 7,4). Перед
нанесением антител к PCNA срезы обрабатывали 18 часов в 0,5 М растворе HCl при
37˚C. Иммуноокрашивание CD31 выполняли по стандартному протоколу. Эндогенную
пероксидазу блокировали в 3% растворе H2O2 с добавлением 2% нормальной сыворотки
животных-доноров вторых антител, 1% бычьего сывороточного альбумина и 0,1%
Тритона Х-100. В растворе первых антител препараты инкубировали 12 часов во
влажной камере при 4˚C. После отмывки в фосфатно-солевом буфере материал
обрабатывали вторичными антителами. Для этого применяли биотинилированные
лошадиные антитела к мышиным IgG (1:250; ВА-2000, Vector Laboratories Inc., США) и
биотинилированные козьи антитела к кроличьим IgG (1:250; ВА-1000, Vector
Laboratories Inc., США), а также стрептавидин-пероксидазный комплекс (1:250; SA5004, Vector Laboratories Inc., США). Для снижения уровня неспецифических реакций
при выявлении PCNA в раствор антител к мышиным Ig добавляли 2% нормальной
крысиной сыворотки. Субстратную пероксидазу проявляли диаминобензидином (Liquid
DAB+, Dako Corp., Дания).
От каждого животного изучали по три среза опухоли и органов в микроскопе
Olympus CX41 (Olympus Corp., Япония) с фиксацией изображений с помощью цифровой
камеры Nicon CoolPix 4500 (Nikon Corp., Япония). Морфометрию проводили с помощью
86
системы анализа микроскопических изображений AnalySIS 5.0 (Soft Imaging System
GmbH, Германия). Плотность клеток карциномы, их митотическую активность и
апоптотическую гибель определяли при изучении площадей, охватывающих не менее
2000 клеточных ядер. Апоптотические клетки выявляли по морфологическим критериям
[Абраменков И.В., 2003; Южаков В.В., 2013]. Подсчѐт морфометрических показателей
для каждого животного проводили в 60 полях по трѐм срезам опухоли и органов.
Также были проведены сравнительные исследования раздельного и сочетанного
влияния изучаемых производных ИТМ и цитостатика циклофосфамида. В этих опытах
использовано 4 группы самцов мышей-гибиридов F1 [CBA×C57BL6j] (по 7 особей в
каждой) в возрасте 2-2,5 месяца с массой тела 20-22 г. Контрольные животныеопухоленосители не подвергались воздействиям. Особям первой подопытной группы
ежедневно внутрибрюшинно вводили производное ИТМ в дозе 1/5 ЛД16 с 7 по 11 сутки
роста КЛЛ. Особям второй подопытной группы внутрибрюшинно вводили циклофосфан
в дозе 100 мг/кг на 7 сутки роста КЛЛ. Особям третьей подопытной группы
внутрибрюшинно вводили циклофосфан в дозе 100 мг/кг на 7 сутки роста КЛЛ и далее с
7 по 11 сутки ежедневно внутрибрюшинно вводили производное ИТМ в дозе 1/5 ЛД16.
Животных выводили из опыта на 11 сутки опухолевого роста. Далее исследование
проводили аналогично описанному выше.
Статистическая обработка экспериментальных данных
При
первичной
обработке
результатов
проводили
проверку
наличия
сомнительных значений, возникновение которых возможно в связи с погрешностями
постановки эксперимента или влиянием неконтролируемых факторов [Хабриев Р.У.,
2005]. С этой целью полученные в каждой экспериментальной группе значения
показателей ранжировали по возрастанию. При наличии в крайних положениях
ранжированного ряда вариант, резко отличающихся от остальных членов ряда,
проверяли
гипотезу
о
принадлежности
сомнительных
вариант
к
изучаемой
совокупности с помощью критериев Диксона и Ирвина [Айвазян С.А., 1983; Лакин Г.Ф.,
1990]. Сомнительную варианту классифицировали как грубую погрешность при p<0,05
и исключали из дальнейшего рассмотрения.
Статистическую проверку межгрупповых различий проводили с применением
непараметрических
критериев.
При
парном
сравнении
применяли
U-критерий
Уилкоксона-Манна-Уитни и двухвыборочный критерий Колмогорова-Смирнова, а при
87
множественном сравнении – ранговый дисперсионный анализ Краскела-Уоллиса и
критерии множественного сравнения Ньюмена-Кейлса, Даннета и Данна [Гланц С.,
1998]. Достоверность различий 30-суточной выживаемости животных оценивали по
точному критерию Фишера и 2-критерию. Различие кривых выживаемости облучѐнных
животных (диаграммы Каплана-Мейера) оценивали при множественном сравнении – по
2-критерию, при парном сравнении – по F-критерию Кокса [Реброва О.Ю., 2002]. Во
всех
случаях
межгрупповые
различия
считали
достоверными
при
p<0,05.
Корреляционный анализ проводили с использованием рангового коэффициента
Спирмена. Статистические рассчѐты проведены с использованием программных пакетов
Exel 2003 (Microsoft, США), Origin 7.5 (OriginLab, США) и Statistica 7.0 (StatSoft Inc.,
США).
88
ГЛАВА 3 ХИМИЧЕСКОЕ СТРОЕНИЕ, ТОКСИЧНОСТЬ И NOSИНГИБИРУЮЩАЯ АКТИВНОСТЬ ИЗУЧАЕМЫХ ПРОИЗВОДНЫХ ИТМ
3.1 Обоснование химической области фармакологического скрининга
Важным этапом работы являлся обоснованный выбор направления поиска
эффективных конкурентных ингибиторов NOS в ряду линейных и циклических N,Sзамещѐнных производных ИТМ (формула 3.1):
(3.1)
Ещѐ в 1990-х годах было показано (см. раздел 1.5.4), что для взаимодействия Sалкил-ИТМ с активным центром NOS важную роль играет гидрофобное взаимодействие
S-алкильного радикала с аминокислотными остатками каталитической полости [Li H.,
2000]. Об этом свидетельствует, например, отсутствие NOS-ингибирующей активности
у тиомочевины и N-метилтиомочевины. В то же время, в ряду S-алкил-ИТМ
максимальную NOS-ингибирующую активность проявляют S-этил- и S-изопропилИТМ, а дальнейшее увеличение числа метиленовых групп в S-алкильном радикале
сопровождается снижением аффинности соединений [Garvey E.P., 1994].
Таблица 3.1 - Влияние некоторых N,S-замещѐнных производных ИТМ формулы (3.1) на
продукцию NO в печени опытных животных, индуцированную ЛПС
Соединение
Доза, мкМ/кг
Продукция NO, % *
N-ацетил-S-метил-ИТМ
N-ацетил-S-этил-ИТМ
N-ацетил-S-изопропил-ИТМ
N-ацетил-S-аллил-ИТМ
N-ацетил-S-(4-фторбутил)-ИТМ
N-ацетил-S-фенил-ИТМ
10
10
10
10
30
30
14
22
5
66
107
73
Примечание: * - относительно животных, получавших только ЛПС.
На начальном этапе работ аналогичная закономерность была установлена нами и
для N,S-замещѐнных производных ИТМ [Верховский Ю.Г., Филимонова М.В., 2008,
2009]. Так, по данным ЭПР-спектрометрии в ряду N-ацетил-S-алкил/аллил/арил-ИТМ
наибольшую NOS-ингибирующую активность in vivo проявлял N-ацетил-S-изопропилИТМ, а дальнейшее увеличение объѐма S-замещающего радикала резко ослабляло
89
ингибирующую способность соединений (таблица 3.1). Эти данные свидетельствуют о
том, что тиоамидиновый фрагмент и S-алкильный радикал N,S-алкил-замещѐнных-ИТМ
и их S-алкил-ИТМ аналогов располагаются в активном центре NOS сходным образом.
Следовательно, был сделан вывод, что в ряду соединений формулы (3.1) существенную
NOS-ингибирующую активность можно ожидать, в первую очередь, у производных, в
структуре которых R2 представляет собой низший алкил C1-3.
Анализ структуры известных эффективных ингибиторов NOS показал, что
высокая
аффинность
этих
соединений
определяется
не
только
наличием
гуанидиноподобной группы, выполняющей роль псевдосубстрата. Принципиальное
значение для обеспечения высокой активности таких соединений имеет наличие в их
структуре функциональных заместителей, способных образовать дополнительные связи
с пептидами в канале доступа и далее от каталитического центра, что может повысить
конкурентное преимущество ингибитора и определить его селективность [Граник В.Г.,
1997; Boer R., 2000; Проскуряков С.Я., 2005, 2005в; Верховский Ю.Г., Филимонова
М.В., 2008, 2009; Tafi A., 2006; Lopez-Cara L.C., 2012].
В соединениях формулы (3.1) роль функционального остатка выполняет Nзамещающий радикал (R1). В настоящее время есть основания полагать, что
гуанидиноподобная группа и функциональный остаток ингибитора NOS должны быть
связаны подвижным химическим мостиком, обеспечивающим оптимальное связывание
ингибитора с каталитическим центром и вне его. Это было подтверждено нашими
исследованиями, показавшими, что N-(дифенилфосфат)-S-метил/этил-ИТМ, у которых
два объѐмных заместителя образуют жѐсткую связь с тиоамидиновой группой,
практически лишены NOS-ингибирующей активности [Верховский Ю.Г., Филимонова
М.В., 2009], в то время как их S-алкил-ИТМ-аналоги являются эффективными
ингибиторами
[Garvey
E.P.,
1994].
О
важности
подвижной
связи
между
гуанидиноподобной и функциональной группой в проявлении аффинности к NOS
свидетельствуют и результаты компьютерного докинга: рассчѐты показали, что
соединения тиоамидинового ряда, содержащие N-заместитель, способны проявлять
значимую аффинность только в случае, если с атомом азота тиоамидиновой группы
контактирует атом углерода с минимальными заместителями - группы –CH2- или –CO[Воронков А.Э., 2005; Левцова А.А., 2007; Прошин А.Н., 2007]. Причѐм, в случае
ацилпроизводных
прогнозировалась
возможность
образования
дополнительной
90
нековалентной связи карбонильного кислорода с гемовой группой в активном центре
NOS и аминокислотными остатками за пределами классического сайта связывания.
Такая возможность косвенно подтверждается существенным NOS-ингибирующим
преимуществом
N-ацилпроизводных
над
N-алкильными
аналогами
в
ряду
гетероциклических тиоамидинов - производных тиазина с алкил/ацил-заместителями в
аминогруппе [Проскуряков С.Я., 2005в; Верховский Ю.Г., Филимонова М.В., 2009].
Изложенные данные позволили ограничить химическую область нашего
скрининга при поиске эффективных конкурентных ингибиторов NOS соединениями
ряда N-ацил-S-алкил-замещѐнных производных ИТМ общей формулы (3.2):
(3.2)
где R1 – алкильная или арильная группа C1-14; R2 – алкильная группа C1-3; HX –
неорганическая или органическая кислота.
3.2 Химическое строение и физико-химические свойства изучаемых
N,S-замещѐнных производных ИТМ
В лаборатории радиационной фармакологии МРНЦ им. А.Ф. Цыба были
разработаны оригинальные схемы алкилирования и ацилирования тиомочевин,
необходимые для синтеза соединений формулы (3.2). В рамках данных исследований
были синтезированы, идентифицированы и полностью охарактеризованы 16 новых, не
описанных ранее в патентной и научной литературе N-ацил-S-алкил-замещѐнных
производных ИТМ (таблица 3.2).
Таблица 3.2 - Структура и физико-химические свойства изучаемых
производных ИТМ
Код
Соединение
Структура
Свойства
Т-974
N-ацил-S-метил-ИТМ
гидроиодид
МВ – 260,1
Тпл – 160-162˚C
Растворимо в воде
Т-982
N-ацил-S-этил-ИТМ
гидробромид
МВ – 227,1
Тпл – 120-121˚C
Растворимо в воде
91
Продолжение таблицы 3.2
Т-975
N-ацил-S-изопропил-ИТМ
гидробромид
МВ – 241,1
Тпл – 138-140˚C
Растворимо в воде
Т-1004
N-пропионил-S-изопропил-ИТМ
гидробромид
МВ – 255,2
Тпл – 126-128˚C
Растворимо в воде
Т-1005
N-пропионил-S-метил-ИТМ
гидроиодид
МВ – 274,2
Тпл – 119-120˚C
Растворимо в воде
Т-1006
N-пропионил-S-этил-ИТМ
гидробромид
МВ – 241,1
Тпл – 106-107˚C
Растворимо в воде
Т-1023
N-изобутаноил-S-изопропил-ИТМ
гидробромид
МВ – 269,2
Тпл – 129-131˚C
Растворимо в воде
Т-1032
N-изобутаноил-S-этил-ИТМ
гидробромид
МВ – 255,2
Тпл – 68-70˚C
Растворимо в воде
Т-1058
N-бензоил-S-этил-ИТМ
гидробромид
МВ – 289,2
Тпл – 195-197˚C
Растворимо в воде
Т-1031
N-бензоил-S-этил-ИТМ
оксиэтилидендифосфонат
МВ – 414,4
Тпл – 178-182˚C
Растворимо в воде
Т-1019
N-3'-фторбензоил -S-этил-ИТМ
гидробромид
МВ – 307,2
Тпл – 190-191˚C
Растворимо в воде
Т-1020
N-циклобутаноил -S-этил-ИТМ
гидробромид
МВ – 267,2
Тпл – 120-123˚C
Растворимо в воде
Т-1049
N-циклобутаноил -S-изопропилИТМ гидробромид
МВ – 281,2
Тпл – 118-120˚C
Растворимо в воде
Т-1059
N-циклогексаноил -S-этил-ИТМ
гидробромид
МВ – 295,2
Тпл – 123-125˚C
Растворимо в воде
92
Продолжение таблицы 3.2
Т-1064
Т-1046
N-циклогексаноил -S- изопропил ИТМ гидробромид
МВ – 309,3
Тпл – 163-165˚C
Растворимо в воде
N-пальмитинатоил -S- этил -ИТМ
гидробромид
МВ – 423,5
Тпл – 103-105˚C
Слабоастворимо;
Растворимо в
присутствии
Tween 80 (1:10)
Практически все полученные производные ИТМ хорошо растворимы в воде.
Исключением является производное Т-1046, имеющее длинный гидрофобный Nпальмитинатоильный
заместитель,
которое
слабо
растворялось
в
воде.
В
экспериментальных исследованиях для приготовления растворов Т-1046 использовали
полисорбат Tween-80 (Sigma-Aldrich, Москва) в соотношении 1:10.
3.3 Токсикологическая характеристика изучаемых соединений
Исследования
острой
токсичности
N,S-замещѐнных
производных
ИТМ
выполнены на 415 самцах белых аутбредных мышей SHK. Условия получения и
содержания животных описаны в разделе 2.1. Растворы изучаемых соединений готовили
ex tempore в виде асептических водных растворов, либо, в случае соединения Т-1046, с
использованием Tween-80 (Sigma-Aldrich) в соотношении 1:10, и вводили подопытным
животным однократно внутрибрюшинно в дозах 100-2000 мг/кг в объѐме 0,1-0,5 мл.
Контрольные животные получали соответствующий объѐм растворителя.
Наблюдение за подопытными животными осуществляли в течение 15 суток после
введения соединений. Регулярно фиксировали общее состояние, особенности поведения
и двигательной активности, регистрировали сроки развития интоксикации и гибели
животных. Показатели острой токсичности ЛД10, ЛД16, ЛД50±m, ЛД84 и ЛД90 определяли
с использованием метода пробит-анализа по Литчфилду-Уилкоксону [Litchfield J.T.,
Wilcoxon F., 1949; Беленький М.Л., 1963].
Результаты этих исследований показали (таблица 3.3), что все изучаемые
производные ИТМ являются умеренно токсичными соединениями [Курляндский, Б.А.,
2002; Березовская И.В., 2003] – их параметры ЛД50 находились в диапазоне 380-945
93
мг/кг. Гибель животных, получивших летальные дозы соединений, наступала на 1 – 4
сутки после введения, на фоне вялости, периодического тремора, заторможенности и
адинамии.
Таблица 3.3 - Показатели острой токсичности изучаемых N,S-замещѐнных производных
ИТМ для мышей при внутрибрюшинном введении
Соединение
Показатели токсичности, мг/кг
ЛД10
ЛД16
ЛД50 ± m
ЛД84
ЛД90
T-974
297
337
485 ± 16
660
770
Т-975
405
520
713 ± 20
925
1035
Т-982
203
338
515 ± 13
668
810
Т-1004
190
342
564 ± 23
814
1008
Т-1005
210
389
564 ± 17
743
920
Т-1006
545
590
761 ± 65
975
1035
Т-1019
475
501
615 ± 40
742
797
Т-1020
622
674
812 ± 32
965
1008
Т-1023
224
268
410 ± 11
552
623
Т-1031
415
523
732 ± 50
928
1035
Т-1032
325
356
411 ± 40
456
490
Т-1046
680
762
945 ± 57
1173
1277
Т-1049
618
713
760 ± 61
857
931
Т-1058
281
325
414 ± 17
488
561
Т-1059
232
274
380 ± 32
523
594
Т-1064
287
324
655 ± 16
887
953
При этом в ряду исследованных соединений – производных ИТМ существенной
зависимости между химическим строением и показателями острой токсичности не
установлено.
94
3.4 Исследование NOS-ингибирующей активности изучаемых соединений
Первичная оценка NOS-ингибирующей активности изучаемых N,S-замещѐнных
производных ИТМ in vitro радиометрическим методом на изолированных изоформах
NOS человека показала, что все исследованные соединения в той или иной мере
проявляли свойства ингибиторов NOS (таблица 3.4).
Таблица 3.4 - Показатели ингибирующей активности исследованных N,S-замещѐнных
производных ИТМ in vitro по отношению к изоформам NOS
Соединение
IC50, мкМ/л / мг/кг
Селективность *
nNOS
iNOS
eNOS
n/i
e/i
T-974
250 / 65,0
160 / 41,6
190 / 49,4
1,6
1,2
T-975
150 / 36,1
90 / 21,7
110 / 26,5
1,7
1,2
T-982
160 / 36,3
90 / 20,4
120 / 27,3
1,8
1,3
T-1004
15 / 3,8
7,5 / 1,9
9,5 / 2,4
2,0
1,3
T-1005
35 / 9,6
24 / 6,6
28 / 7,7
1,5
1,2
T-1006
20 / 4,8
13 / 3,1
17 / 4,1
1,5
1,3
T-1019
130 / 39,9
75 / 23,0
90 / 27,6
1,7
1,2
T-1020
35 / 9,4
8 / 2,1
10 / 2,7
4,4
1,3
T-1023
48 / 12,9
3,2 / 0,9
5,0 / 1,3
15,0
1,6
T-1031
120 / 49,7
85 / 35,2
95 / 39,4
1,4
1,1
T-1032
20 / 5,1
6 / 1,5
9 / 2,3
3,3
1,5
T-1046
23 / 9,7
18 / 7,6
21 / 8,9
1,3
1,2
T-1049
28 / 7,9
5,5 / 1,5
8,5 / 2,4
5,1
1,5
T-1058
40 / 11,6
22 / 6,4
27 / 7,8
1,8
1,2
T-1059
60 / 17,7
1,8 / 0,5
3,3 / 1,0
33,3
1,8
T-1064
35 / 10,8
14 / 4,3
18 / 5,6
2,5
1,3
Примечание: * - в качестве показателя селективности использовано отношение между
соответствующими значениями IC50.
Как и ожидалось (см. раздел 1.4), наличие N-замещающего радикала в структуре
этих соединений, в целом, ослабляло их аффинность к NOS в сравнении с Sэтил/изопропил-ИТМ, у которых IC50 находится в наномолярной области [Wolff D.J.,
1997; Boer R., 2000]. Тем не менее, ряд исследованных соединений – Т-1004, Т-1020, Т-
95
1023, Т-1032, Т-1049 и Т-1059 вполне эффективно подавляли активность eNOS и iNOS
(IC50 – 1,8-10 мкМ/л), на уровне, сопоставимом с активностью таких известных
ингибиторов NOS, как L-NAA, L-NNA, L-NAME [Lambert L.E., 1991; Faraci W.S., 1996;
Boer R., 2000] (см. таблицу 1.2).
Большая часть исследованных соединений, подобно S-алкил-ИТМ, являлись
неселективными ингибиторами – практически в равной степени подавляющими
активность различных изоформ NOS. В то же время, такие N-замещающие радикалы,
как изобутаноил, циклобутанкарбонил и циклогексанкарбонил в большей степени
ослабляли взаимодействие N,S-замещѐнных-ИТМ с нейрональной NOS, в результате
чего такие соединения в той или иной степени приобретали селективность к
ингибированию eNOS и iNOS. Так, вещества Т-1020, Т-1032 и Т-1049 проявляли
умеренную селективность (в 3-5 раз) к eNOS и iNOS, а соединения Т-1023 и Т-1059 в
данных
исследованиях
демонстрировали
уже
практически
значимый
уровень
селективности [Alderton W.K., 2001] – в 15-30 раз активнее подавляя eNOS и iNOS, чем
nNOS (рисунок 3.1).
Рисунок 3.1 - Зависимость активности изоформ NOS от концентрации исследуемых
соединений. А – производное Т-1023; Б – производное Т-1059.
Эти данные свидетельствуют о способности N-замещающего радикала влиять на
селективность действия N,S-замещѐнных производных ИТМ в отношении различных
изоформ NO-синтаз и подтверждают мнение ряда авторов о перспективности поиска в
данной химической области селективных ингибиторов NOS [Shearer B.G., 1997; Cooper
96
G.R., 2000; Проскуряков С.Я., Филимонова М.В., 2002; Проскуряков С.Я., 2005в]. Что
же касается самих соединений Т-1023 и Т-1059, то наблюдаемые особенности их NOSингибирующих свойств позволяют ожидать у них действия, прежде всего, на
сосудистый гомеостаз, в регуляции которого ведущую роль играют eNOS и iNOS (см.
раздел 1.3).
Сопоставление
среднеэффективных
концентраций
(IC50;
таблица
3.4)
и
среднелетальных доз (ЛД50; таблица 3.3) изучаемых производных ИТМ показывает, что
наиболее активные соединения (Т-1004, Т-1020, Т-1023, Т-1032, Т-1049 и Т-1059)
оказывают значительное (более 50%) ингибирующее влияние уже при концентрациях,
на 2-3 порядка ниже токсических. Что позволяет ожидать у этих соединений
способности к высокой физиологической активности в нетоксических дозах.
В опытах in vitro на изолированных изоформах NOS характер ингибирующего
действия
всех
исследованных
N,S-замещѐнных
производных
ИТМ,
как
и
у
низкомолекулярных S-алкил-ИТМ, был в полной мере конкурентным и обратимым –
влияние этих соединений на каталитическую активность всех изоформ NOS полностью
нивелировалось при 8–10-кратном избытке L-аргинина.
Таблица 3.5 - Относительная продукция NO в культурах клеток B16 и HeLa после
удаления изучаемых соединений из культуральной среды (%, M±)
Т-1023
Т-1059
L-NMMA
Концентрация
ингибитора
B16
HeLa
B16
HeLa
B16
HeLa
Контроль
100 ± 9
100 ± 4
100 ± 9
100 ± 4
100 ± 9
100 ± 4
0,02 мг/мл
88 ± 20
97 ± 12
105 ± 17
98 ± 14
93 ± 17
97 ± 15
0,1 мг/мл
87 ± 18
96 ± 6
96 ± 20
99 ± 6
78 ± 11 1
89 ± 6 1
0,2 мг/мл
91 ± 7
90 ± 10
92 ± 28
98 ± 12
82 ± 7 1
88 ± 14
Примечание:
1
- статистически значимое различие с контролем (p<0,05)
по критерию Даннета (во всех группах n=5).
Наличие чисто конкурентного, обратимого механизма ингибирования NOS у
изучаемых соединений подтвердили и результаты исследований на культурах клеток
меланомы В16, в которых присутствуют конститутивные изоформы NOS, главным
образом – nNOS, и клеток HeLa, в которых доминирует iNOS. В этих опытах методом
проточной флуориметрии было показано, что после 2-х часов инкубации клеток с
97
различными концентрациями изучаемых производных ИТМ удаление этих веществ из
культуральной среды сопровождалось быстрым и полным восстановлением продукции
NO до уровня интактных клеток, не имевших контакта с данными ингибиторами NOS
(таблица 3.5).
В отличие от изучаемых N,S-замещѐнных производных ИТМ, иная картина в этих
опытах наблюдалась при воздействии известного гуанидинового ингибитора L-NMMA.
В этом случае в обеих клеточных культурах после 2 часов инкубации с высокими
дозами L-NMMA сохранялось достоверное снижение на 10-20% продукции NO после
удаления ингибитора из среды. Эти результаты вполне согласуются с данными ряда
авторов о наличии у L-NMMA смешанного механизма влияния на активность NOS –
быстрого конкурентного ингибирования и медленно развивающегося необратимого
инактивирующего действия [Reif D.W., 1995; Wolff D.J., 1996; Alderton W.K., 2001; Lee
K.S., 2012].
Таблица 3.6 - Влияние исследуемых соединений в дозе 10 мг/кг на продукцию NO
в печени подопытных животных, индуцированную ЛПС1 (M±)
Группа; число проб
Содержание
NO, отн. ед.
Группа; число проб
Содержание
NO, отн. ед.
Контроль;
n=18
5,3 ± 1,0
ЛПС + Т-1020; n=18
2,9 ± 0,9 2 3
ЛПС;
n=18
14,6 ± 3,2
ЛПС + Т-1023; n=18
1,4 ± 1,0 2 3
ЛПС + Т-974;
n=15
9,3 ± 2,1 2
ЛПС + Т-1031; n=15
8,6 ± 2,7 2
ЛПС + Т-975;
n=18
8,7 ± 2,0 2
ЛПС + Т-1032; n=18
4,3 ± 1,1 2
ЛПС + Т-982;
n=16
8,9 ± 2,3 2
ЛПС + Т-1046; n=15
7,4 ± 1,7 2
ЛПС + Т-1004; n=15
3,4 ± 0,6 2 3
ЛПС + Т-1049; n=18
2,1 ± 0,7 2 3
ЛПС + Т-1005; n=15
7,1 ± 1,6 2
ЛПС + Т-1058; n=15
7,6 ± 1,5 2
ЛПС + Т-1006; n=15
6,2 ± 1,2 2
ЛПС + Т-1059; n=18
2,4 ± 0,8 2 3
ЛПС + Т-1019; n=18
9,1 ± 1,6 2
ЛПС + Т-1064; n=18
6,0 ± 0,9 2
1
Примечания:
– ЛПС в дозе 2 мг/кг ввели в/б за 24 часа до взятия проб;
2
– статистически значимое различие (p<0,05) по критерию Данна, с группой,
получавшей только ЛПС;
3
– статистически значимое различие с контролем (p<0,05) по критерию Данна.
Результаты исследований влияния изучаемых производных ИТМ на эндогенную
продукцию NO в тканях подопытных животных свидетельствуют, что большая часть
98
этих соединений проявляют in vivo высокую NOS-ингибирующую активность. Методом
ЭПР-спектрометрии с диэтилдитиокарбаматной спиновой ловушкой было показано, что
однократное внутрибрюшинное введение этих соединений в дозе 10 мг/кг (1/50-1/40
ЛД50) уже в течение первого часа достоверно подавляло продукцию NO в печени самцов
мышей-гибридов F1 (CBA×C57BL6j), индуцированную ЛПС E.coli (2 мг/кг) за 24 часа до
исследований (таблица 3.6).
NOS-ингибирующая активность исследованных соединений in vivo, в целом,
коррелировала с данными, полученными in vitro на изолированных изоформах NOS (см.
таблицу 3.4). In vivo также наиболее высокую ингибирующую активность проявляли
производные Т-1004, Т-1020, Т-1023, Т-1032, Т-1049 и Т-1059. В данных опытах эти
вещества в дозе 10 мг/кг, несмотря на длительное влияние ЛПС, снижали продукцию
NO достоверно ниже уровня, характерного для интактных животных, не получавших
эндотоксин. Наблюдаемое сходство NOS-ингибирующей активности in vitro и in vivo в
ряду исследованных N,S-замещѐнных производных ИТМ свидетельствует в пользу того,
что их влияние in vivo на эндогенную продукцию NO определяется, собственно, их
ингибирующим действием на NOS.
Рисунок 3.2 - Влияние in vivo соединений Т-1023 и Т-1059 в дозе 10 мг/кг на продукцию
NO (а) и содержание его стабильных метаболитов (б) в биологических тканях и
жидкостях. Обозначения: 1 и 2 – статистически значимое различие (p<0,05) по критерию
Данна, соответственно, с контролем и группой, получавшей только ЛПС.
99
В дальнейших исследованиях было показано, что эти вещества быстро
абсорбируются и распределяются в биологических тканях, проникая, в том числе, через
ГЭБ. Так, на рисунке 3.2,а показано, что производные Т-1023 и Т-1059 уже в течение
первого часа после внутрибрюшинной инъекции в дозе 10 мг/кг достоверно снижают
продукцию NO как в печени, так и в мозге мышей-гибридов F1 (CBA×C57BL6j). В тканях
мозга, куда ЛПС не проникал в данные сроки и при данном пути введения, изучаемые
соединения достоверно подавляли спонтанную продукцию NO, а в печени ингибиторы
блокировали как спонтанный, так и индуцированный синтез оксида азота. Как было
показано выше, изучаемые N,S-замещѐнные производные ИТМ обратимо ингибируют
NOS. В то же время, их NOS-ингибирующая активность in vivo, судя по всему,
сохраняется длительное время. Так, однократное введение Т-1023 и Т-1059 в дозе 10
мг/кг отчѐтливо отражалось и на уровне стабильных метаболитов, кумулирующих NO через сутки после инъекции наблюдалось достоверное и выраженное снижение
содержания NO2-/NO3- в различных тканях (рисунок 3.2,б), которое, в целом,
коррелировало с изменениями активности синтеза самого оксида азота.
Рисунок 3.3 - Дозовая и временная зависимость влияния соединения Т-1023 на
эндогенную продукцию оксида азота в печени подопытных животных.
Результаты прямых экспериментальных оценок продолжительности
NOS-
ингибирующей активности изучаемых соединений in vivo свидетельствуют, что
100
однократное введение их в дозах 10-20 мг/кг сопровождается достоверным подавлением
продукции NO в висцеральных органах в течение 3-4 часов (рисунок 3.3).
Таким образом, анализ экспериментальных и теоретических работ, посвящѐнных
тиоамидиновым ингибиторам NOS, и результаты собственных исследований позволили
на начальном этапе работ обосновать целесообразность поиска эффективных
селективных ингибиторов NOS в ряду N-ацил-S-алкил-замещѐнных производных ИТМ
формулы (3.2).
В данном классе химических веществ были синтезированы и полностью
охарактеризованы 16 новых, не описанных ранее в научной и патентной литературе,
производных
ИТМ.
Практически
все
полученные
соединения
являются
водорастворимыми и умеренно токсичными (ЛД50 – 380-945 мг/кг).
Показано, что все исследованные соединения в той или иной мере ингибируют
каталитическую активность NOS. Ряд из них – производные Т-1004, Т-1020, Т-1023, Т1032, Т-1049 и Т-1059 высокоэффективно подавляют активность eNOS и iNOS (IC50 –
1,8-10 мкМ/л), причѐм, соединения Т-1023 и Т-1059 проявляют значительную
селективность (в 15-30 раз) к этим изоформам NOS. В отличие от многих известных
ингибиторов NOS других химических классов, в той или иной мере инактивирующих
NO-синтазы,
изучаемые
соединения
являются
субстратно-конкурентными
ингибиторами NOS и не вызывают их необратимой инактивации даже при
субтоксических концентрациях.
Выявленные в исследованиях in vitro эффективные ингибиторы NOS (соединения
Т-1004, Т-1020, Т-1023, Т-1032, Т-1049 и Т-1059) при парентеральном введении быстро
абсорбируются и распределяются в биологических тканях, в том числе, проникая через
ГЭБ. Однократное введение этих соединений в дозе 10 мг/кг (1/50-1/40 ЛД50) вызывает
быстрое и выраженное подавление спонтанной и ЛПС-индуцированной продукции
оксида азота в различных тканях и жидкостях подопытных животных, сохраняющееся
на значимом уровне в течение 3-4 часов.
Полученные на этом этапе данные позволили рассматривать производные ИТМ
Т-1004, Т-1020, Т-1023, Т-1032, Т-1049 и Т-1059, как фармакологически приемлемые
ингибиторы NOS, детальное изучение физиологических и фармакологических свойств
которых представляет большой научный и практический интерес.
101
ГЛАВА 4 ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ N,S-ЗАМЕЩЁННЫХ ИТМ НА
СЕРДЕЧНО-СОСУДИСТУЮ СИСТЕМУ НОРМОТЕНЗИВНЫХ КРЫС И
ЖИВОТНЫХ С РАЗЛИЧНЫМИ МОДЕЛЯМИ ГИПОТОНИЧЕСКИХ
СОСТОЯНИЙ
Исследования проведены на самцах крыс Wistar (по 7-12 особей в каждой
экспериментальной группе) в возрасте 3-4 месяцев с массой тела 230-320 г,
наркотизированных тиопенталом натрия (60 мг/кг, внутрибрюшинно). В качестве
препарата сравнения был использован фенилэфрин (мезатон), являющийся одним из
наиболее длительно действующих селективных α1-адреномиметиков, который вводили
однократно, внутрибрюшинно в дозе 0,5 мг/кг - эквивалентной с учѐтом межвидового
пересчѐта максимально рекомендуемой дозе для человека при внутримышечном и
подкожном введении [Машковский М.Д., 2005].
4.1 Изучение влияния производных ИТМ на гемодинамику
нормотензивных животных
Во многих экспериментальных работах показана способность ингибиторов NOS
различных химических классов повышать тонус кровеносных сосудов [Narayanan K.,
1995; Kilbourn R.G., 1990, 1997; Wray G.M., 1998; Tabatabaie T., 2000; Alderton W.K.,
2005; Проскуряков С.Я., Филимонова М.В., 2002, 2004; Филимонова М.В., 2011, 2012].
Подобные свойства проявляли и изучаемые N,S-замещѐнные производные ИТМ.
Как показано в таблице 4.1, после однократного внутрибрюшинного введения
соединения Т-1059 в дозе 10 мг/кг (~1/25 ЛД16) у подопытных нормотензивных крыс
развивалась
длительная
и
выраженная
вазоконстрикция
–
УПСС
достоверно
повышалось на 30-45% относительно исходного уровня в течение 90 минут. При этом в
первые минуты наблюдался умеренный, но достоверный гипертензивный эффект: АДД
и АДС повышались на 15-20% в течение первых 10 минут. Быстрый рост АД вызвал у
этих животных рефлекторное замедление сердечного ритма – к 5-й минуте ЧСС
достоверно снизилось на 12-15%. На фоне развившейся брадикардии, начиная с 10
минуты прогрессивно снижалось АДС, в результате чего с 70 по 110 минуту
наблюдалась умеренная гипотония: АДС на 8-10% ниже исходного уровня.
102
Таблица 4.1 – Влияние соединения Т-1059 (однократно, в/б, 10 мг/кг) на гемодинамику и частоту дыхательных движений
наркотизированных нормотензивных крыс Wistar (%; M±) *
Время после
введения, минуты;
число животных
АДС
АДД
ЧСС
УПСС
УО
СИ
ЧДД
Исходно
100,0
100,0
100,0
100,0
100,0
100,0
100,0
n=8
Т-1059 10 мг/кг в/б
1
111,6 ± 2,8
1
2;
n=8
114,8 ± 3,1
5;
n=8
119,8 ± 4,9 1
117,6 ± 4,7 1
87,2 ± 2,6 1
105,4 ± 11,6
10;
n=8
118,7 ± 4,1 1
116,7 ± 3,1 1
86,7 ± 2,5 1
104,8 ± 12,3
20;
n=8
105,1 ± 2,7
114,2 ± 3,2 1
85,9 ± 2,9 1
1
1
30;
n=8
103,2 ± 2,1
113,0 ± 3,0
40;
n=8
100,3 ± 2,7
110,1 ± 3,1 1
86,4 ± 2,6 1
98,5 ± 7,4
50;
n=8
96,6 ± 2,7
111,7 ± 2,9 1
87,4 ± 2,5 1
99,0 ± 9,9
60;
n=8
96,1 ± 2,8
110,9 ± 2,8 1
88,6 ± 2,3 1
1
1
101,7 ± 8,0
101,9 ± 7,3
1
145,3 ± 13,0 1
107,3 ± 5,4
98,3 ± 5,2
95,3 ± 8,4
91,1 ± 10,4
100,5 ± 10,1
99,3 ± 10,1
n=8
93,2 ± 2,1
80;
n=8
90,5 ± 2,6 1
107,9 ± 2,9 1
89,2 ± 2,2 1
90;
n=8
91,2 ± 2,5 1
105,0 ± 2,8
90,4 ± 2,4 1
100;
n=8
92,1 ± 2,2 1
100,0 ± 4,1
92,6 ± 2,2 1
100,2 ± 8,6
110;
n=8
94,1 ± 2,6
1
100,2 ± 3,3
94,0 ± 2,2
1
100,5 ± 8,6
120;
n=8
96,2 ± 2,9
101,2 ± 3,4
96,6 ± 2,6
*
1
89,4 ± 2,5
134,4 ± 8,0
70;
Примечания:
109,3 ± 2,7
85,4 ± 2.7
100,7 ± 9,8
1
128,1 ± 9,9 1
114,3 ± 8,9
99,1 ± 4,5
101,6 ± 3,6
91,6 ± 11,3
97,2 ± 10,3
103,0 ± 8,1
101,1 ± 7,3
- данные нормированы на исходные значения показателей;
– статистически значимое различие (p<0,05) с исходным значением показателя по критерию Даннета.
103
Таблица 4.2 – Влияние соединения Т-1023 (однократно, в/б, 10 мг/кг) на гемодинамику и частоту дыхательных движений
наркотизированных нормотензивных крыс Wistar (%; M±) *
Время после
введения, минуты;
число животных
АДС
АДД
ЧСС
УПСС
УО
СИ
ЧДД
Исходно
100,0
100,0
100,0
100,0
100,0
100,0
100,0
n=7
Т-1023 10 мг/кг в/б
2;
n=7
114,4 ± 3,0 1
110,1 ± 4,5 1
5;
n=7
118,1 ± 2,7 1
116,3 ± 3,0 1
89,1 ± 2,9 1
103,2 ± 7,4
10;
n=7
110,3 ± 2,2 1
114,4 ± 4,0 1
89,3 ± 2,8 1
102,9 ± 8,8
1
1
102,4 ± 9,6
20;
n=7
105,0 ± 2,6
111,5 ± 3,3
30;
n=7
99,1 ± 2,2
109,5 ± 3,8 1
90,6 ± 2,7 1
40;
n=7
91,7 ± 3,3 1
107,5 ± 4,0
89,3 ± 2,5 1
100,7 ± 6,9
50;
n=7
92,3 ± 2,8 1
102,1 ± 3,5
91,4 ± 3,6 1
100,3 ± 6,3
60;
n=7
95,6 ± 2,7
99,7 ± 3,8
94,3 ± 3,2
Примечания:
*
1
90,1 ± 2,2
135,2 ± 12,1 1
112,2 ± 14,3
104,5 ± 7,0
98,3 ± 6,2
91,2 ± 9,3
94,2 ± 8,4
99,0 ± 6,2
100,9 ± 5,9
- данные нормированы на исходные значения показателей;
– статистически значимое различие (p<0,05) с исходным значением показателя по критерию Даннета.
Через 90 минут после введения Т-1059 периферическое сопротивление сосудов
снижалось и к 120 минуте показатель УПСС возвращалось к исходному уровню.
Снижение тонуса сосудов сопровождалось и нормализацией показателей АД и ЧСС.
Соединение Т-1059 в изученной дозе не влияло на насосную функцию сердца и
системный кровоток, поскольку показатели УО и СИ оставались на исходном уровне в
течение всего периода наблюдения. Также не отмечено изменений со стороны ЧДД.
Сходное, но менее длительное (около 40 минут) влияние на гемодинамику
нормотензивных крыс наблюдалось при однократном внутрибрюшинном введении
соединения Т-1023 в дозе 10 мг/кг (~1/27 ЛД16). Как показано в таблице 4.2, в этом
случае периферическое сопротивление сосудов статистически значимо повысилось на
40%. Изменения АД при этом также имели двухфазный характер: начальный
гипертензивный эффект – АДД и АДС статистически значимо повышены на 15-20% в
течение первых 10 минут; а далее на фоне брадикардии наблюдалось прогрессивное
снижение АДС с развитием к 40-й минуте умеренной гипотонии: АДС статистически
значимо на 8-10% ниже исходного уровня. Периферическое сопротивление сосудов
начинало восстанавливаться через 30 минут после введения Т-1023, а к 60-й минуте его
величина соответствовала исходному уровню. К этому моменту наблюдалась
нормализация показателей АД и ЧСС. Изменений со стороны УО, СИ и ЧДД при
воздействии Т-1023 не было зарегистрировано в течение всего периода наблюдения.
Таким образом, результаты этих исследований показывают, что изучаемые N,Sзамещѐнные производные ИТМ, подобно известным ингибиторам NOS, эффективно
подавляющим eNOS, оказывают выраженное вазопрессорное действие, приводящее к
значительному и длительному повышению периферического сопротивления сосудов
[Narayanan K., 1995; Kilbourn R.G., 1990, 1997; Wray G.M., 1998; Tabatabaie T., 2000;
Alderton W.K., 2005; Проскуряков С.Я., Филимонова М.В., 2002, 2004; Филимонова
М.В., 2011, 2012].
У нормотензивных животных прессорное влияние изучаемых ингибиторов NOS в
дозах 1/20-1/30 ЛД16 сопровождалось быстрым повышением АД и развитием
компенсаторной барорефлекторной реакции [Гусева Е.И., 2008]. В результате этого
наблюдался лишь кратковременный и довольно слабый гипертензивный эффект –
повышение АДС и АДД на 15-20% в течение первых 10-15 минут. При использованных
дозах изучаемых производных ИТМ рефлекторная реакция носила умеренный характер,
105
который не требовал фармакологической коррекции, так как снижение ЧСС и АДС не
превышало 10-15%. При этом не наблюдалось ослабления сократительной функции
сердца и системного кровотока (УО и СИ сохранялись на исходном уровне), и все
измененѐнные показатели
самостоятельно нормализовались по мере
снижения
периферического сопротивления сосудов.
Полученные результаты свидетельствуют также и об относительной безопасности
изучаемых соединений при нормотензивных состояниях. Поскольку эти вещества
являются конкурентными, обратимыми ингибиторами NOS (см. раздел 3.1.4), их
краткосрочные эффекты, в данном случае - вазопрессорное действие и гипертензивный
эффект, можно ослабить или отменить введением L-аргинина или фармакологических
доноров NO, таких как нитроглицерин или нитропруссид натрия [Alderton W.K., 2001;
Viteceek J., 2012]. А выраженность изменений, вызванных рефлекторной ваготонией, в
данном случае - брадикардию и гипотонию, можно корректировать холинолитическими
средствами, например, подкожным введением атропина [Машковский М.Д., 2005].
4.2 Изучение влияния производных ИТМ на гемодинамику животных в состоянии
острого тяжѐлого геморрагического шока
Для
исследования
вазопрессорных
свойств
изучаемых
соединений
при
гиповолемических состояниях использовали модель геморрагического шока у крыс,
вызванного острой, массивной кровопотерей (47-50% объѐма циркулирующей крови в
течение 8-12 минут), сходную по своему течению с тяжѐлыми клиническими формами
гипотоний [Саркисов Д.С., 1960]. В данной модели острая кровопотеря приводила к
развитию тяжѐлого гиповолемического шока и при отсутствии лечения сопровождалась
гибелью 40-50% подопытных животных в течение уже первых 2 часов от момента
окончания кровопотери.
Как показано в таблице 4.3, к окончанию кровопотери у подопытных животных
наблюдалась умеренная брадикардия (ЧСС понижена на 15% от исходной) и глубокая
гипотония (АДС составляло 30%, АДД – 21% от исходного). В течение первого часа
после кровопотери гипотония частично компенсировалась за счѐт повышения тонуса
сосудов и ЧСС – к 60-й минуте среднее АДС составляло 55%, среднее АДД – 44% от
исходного. Однако полной компенсации дефицита кровотока не происходило, и на фоне
сохраняющейся гипотонии и гипоперфузии через 40-60 минут после кровопотери у
106
значительной части контрольных животных, не получавших лечения, развивались
нарушения насосной функции сердца (рисунок 4.1), что, по-видимому, становилось
основной причиной их гибели. Из 11 контрольных животных 5 особей (45%) погибло к
120 минуте опыта.
Таблица 4.3 – Динамика показателей АД, ЧСС и ЧДД при остром геморрагическом шоке
у наркотизированных крыс Wistar, не получавших лечения (%; M±) *
Время (t) после
кровопотери, мин.;
число животных
АДС
АДД
ЧСС
ЧДД
Исходно;
100,0
100,0
100,0
100,0
84,3 ± 7,0 1
107,0 ± 14,2
n = 11
Кровопотеря
0;
2;
n = 11
30,4 ± 4,3 1
21,1 ± 4,5 1
n = 11
32,0 ± 7,5
1
21,0 ± 7,9
1
1
20,3 ± 7,7 1
86,0 ± 7,8 1
106,5 ± 14,7
5;
n = 11
33,9 ± 7,3
10;
n = 11
35,1 ± 7,7 1
21,9 ± 7,5 1
87,0 ± 9,4
105,9 ± 15,4
20;
n = 11
39,9 ± 9,2 1
30,8 ± 8,7 1
86,8 ± 9,7
101,8 ± 12,9
30;
n = 11
45,3 ± 10,8 1
37,2 ± 9,5 1
90,1 ± 12,7
101,6 ± 13,2
40;
n = 11
49,8 ± 11,0
1
93,8 ± 10,5
97,4 ± 10,5
50;
n = 11
52,2 ± 11,5 1
41,0 ± 9,1 1
94,9 ± 8,6
100,1 ± 12,9
60;
n = 11
55,4 ± 9,8 1
44,3 ± 10,7 1
98,5 ± 8,2
100,4 ± 13,2
70;
n = 10
57,4 ± 7,7 1
44,8 ± 9,9 1 2
102,8 ± 7,4
12
40,4 ± 10,0
12
102,8 ± 11,1
n = 10
59,4 ± 6,9
90;
n=9
59,6 ± 7,8 1 2
46,1 ± 8,8 1 2
108,1 ± 7,8 2
104,1 ± 10,0
100;
n=7
60,1 ± 6,2 1 2
46,3 ± 9,1 1 2
111,4 ± 7,2 2
101,3 ± 10,5
110;
n=7
60,6 ± 7,1 1 2
47,0 ± 9,5 1 2
113,6 ± 6,6 1 2
101,6 ± 9,5
n=6
12
12
102,2 ± 8,2
Примечания:
*
61,1 ± 7,0
47,3 ± 10,9
12
105,9 ± 7,8
2
80;
120;
46,3 ± 9,7
1
115,3 ± 6,0
103,0 ± 8,2
- показатели нормированы на исходное значение;
– статистически значимое различие (p<0,05) с исходным значением
показателя по критерию Данна;
2
– статистически значимое различие (p<0,05) со значением показателя
на момент окончания кровопотери (t=0) по критерию Данна.
1
107
Рисунок 4.1 – Динамика ЭКГ крысы Wistar при остром тяжѐлом геморрагическом шоке. А. Перед кровопотерей; АД – 153/116, ЧСС
– 461 уд/мин. Синусовый ритм, изменений ЭКГ не наблюдается. ЧДД - 62 дв/мин. Б. 40-я минута после кровопотери; АД – 59/38,
ЧСС – 417 уд/мин. Синусовый ритм, ЭКГ-признаки ишемии миокарда. ЧДД - 38 дв/мин. В. 50-я минута после кровопотери; АД –
58/26, ЧСС – 146 - 206 уд/мин. Синусовая аритмия. ЭКГ-признаки ишемии миокарда. Дыхательные движения редкие, единичные. Г.
70-я минута после кровопотери; АД – 27/16, ЧСС – 57 уд/мин. Дыхательные движения не регистрируются. На 73 минуте
зафиксирована остановка сердечных сокращений.
Фенилэфрин (однократно, в/б, 0,5 мг/кг) вызывал у животных в состоянии
тяжѐлого геморрагического шока быстрый подъѐм АД (таблица 4.4). Так, уже на 5
минуте после инъекции препарата показатели АД подопытных животных были
статистически значимо выше, чем у контрольных животных, не получавших лечения.
Таблица 4.4 – Динамика показателей АД, ЧСС и ЧДД при остром геморрагическом шоке
у наркотизированных крыс Wistar при воздействии фенилэфрина,
однократно, 0,5 мг/кг, в/б (%; M±) *
Время после
кровопотери
и введения
препарата, мин.;
число животных
Исходно;
n = 10
АДС
АДД
ЧСС
ЧДД
100,0
100,0
100,0
100,0
85,6 ± 7,1
106,0 ± 12,8
Кровопотеря
0;
n = 10
30,7 ± 4,0
20,6 ± 4,6
Фенилэфрин 0,5 мг/кг в/б
2;
n = 10
38,8 ± 6,3
29,3 ± 8,8
5;
n = 10
47,3 ± 7,1 1
34,1 ± 7,6 1
85,1 ± 7,3
108,9 ± 12,2
10;
n = 10
53,7 ± 8,8 1
44,2 ± 8,7 1
86,8 ± 8,0
106,3 ± 13,4
20;
n = 10
58,2 ± 8,5 1
50,9 ± 9,3 1
87,1 ± 7,7
105,0 ± 11,9
30;
n = 10
59,4 ± 9,6
51,2 ± 11,9
88,6 ± 8,6
104,5 ± 10,3
40;
n = 10
60,5 ± 12,1
51,3 ± 12,2
90,1 ± 8,4
99,7 ± 9,5
50;
n = 10
61,2 ± 11,5
51,0 ± 10,4
92,3 ± 7,2
104,4 ± 11,5
60;
n=9
61,2 ± 9,8
49,8 ± 11,5
95,5 ± 7,8
105,1 ± 10,6
70;
n=9
63,9 ± 8,7
50,8 ± 10,1
99,8 ± 6,9
103,8 ± 11,9
80;
n=8
66,1 ± 8,3
51,1 ± 10,3
104,0 ± 6,6
102,4 ± 10,9
90;
n=8
64,4 ± 7,7
50,4 ± 10,8
106,6 ± 6,9
103,0 ± 10,1
100;
n=7
63,8 ± 8,4
50,8 ± 10,2
108,3 ± 6,3
104,4 ± 11,0
110;
n=6
65,3 ± 8,2
52,2 ± 9,9
109,9 ± 6,6
103,3 ± 10,4
120;
n=5
65,5 ± 8,1
52,8 ± 10,7
111,9 ± 6,5
103,6 ± 10,0
Примечания:
*
- показатели нормированы на исходное значение;
– статистически значимое различие (p<0,05) с показателями
контрольных животных (таблица 4.3) по критерию Данна.
1
109
Максимальный гипертензивный эффект фенилэфрина развивался к 10 минуте. В этот
момент показатели АДС было выше на 25-40%, а АДД – на 65-75%, чем у не получавших
лечения животных, и составляли 45-55% от исходного уровня до кровопотери.
Вазопрессорное действие фенилэфрина в этих опытах было непродолжительным –
достоверный гипертензивный эффект наблюдался около 15-20 минут - с 5 по 20 минуту
после инъекции, что вполне согласуется с литературными данными для этого способа
введения данного препарата [Харкевич Д.А., 2010; Brunton L., 2010]. Начиная с 30-й
минуты и до конца наблюдения все показатели гемодинамики у животных, получавших
фенилэфрин, и контрольных нелеченных животных статистически не различались.
Кратковременное и незначительное ослабление гипотонии под влиянием
фенилэфрина, по существу, не повлияло на течение шока у подопытных животных –
летальность в этой группе составила 50% в течение 120 минут наблюдения.
Качественно иная картина течения шока наблюдалась у животных, получавших
соединение Т-1023, однократно, 10 мг/кг, в/б (~1/25 ЛД16; 1/40 ЛД50). Как показано в
таблице 4.5, начальная динамика АД под влиянием Т-1023 была сходна с таковой,
зарегистрированной в группе животных, получавших фенилэфрин – достоверное
повышение АД наблюдалось с 5-ой минуты после введения препарата. Однако в случае
применения соединения Т-1023 рост АД был более продолжительным - максимальный
гипертензивный эффект развивался на 40-50 минутах после введения Т-1023. При этом
степень подъѐма АД была в 1,5-2 раза выше, чем при действии фенилэфрина: подъѐм
АДС достигал 70-80%, АДД – 100-120% относительно показателей контрольных
нелеченных животных, и в этот период уровень АД составлял 80-90% относительно его
уровня до кровопотери. Вазопрессорное действие соединения Т-1023 начинало
ослабевать с 90 минуты. Статистически значимый гипертензивный эффект (достоверно
повышенные АДС и АДД) наблюдался около 95-100 минут – с 5 до 100 минуты с
момента введения препарата. При этом у животных, получавших Т-1023, отсутствовала
компенсаторная тахикардия, которая развивалась на поздних сроках наблюдения у
животных, не получавших лечения и животных, получавших фенилэфрин.
110
Таблица 4.5 – Динамика показателей АД, ЧСС и ЧДД при остром геморрагическом шоке
у наркотизированных крыс Wistar при воздействии Т-1023, однократно, 10 мг/кг, в/б
(%; M±) *
Время после
кровопотери
и введения
препарата, мин.;
число животных
Исходно;
n=9
АДС
АДД
ЧСС
ЧДД
100,0
100,0
100,0
100,0
79,5 ± 6,4
99,5 ± 8,3
Кровопотеря
0;
n=9
28,8 ± 3,8
19,8 ± 3,6
Т-1023 10 мг/кг в/б
2;
n=9
42,3 ± 10,3
36,9 ± 12,6
5;
n=9
53,2 ± 10,1 1
52,8 ± 12,5 1
83,9 ± 9,3
100,6 ± 9,3
10;
n=9
56,5 ± 10,5 1
60,3 ± 13,2 1
80,4 ± 7,1
103,6 ± 8,4
20;
n=9
65,4 ± 11,1
1
1
84,7 ± 13,3
106,7 ± 11,9
30;
n=9
69,4 ± 16,8 1
75,9 ± 18,6 1
85,2 ± 12,9
96,5 ± 7,7
40;
n=9
76,0 ± 7,9 1
81,1 ± 11,1 1
85,4 ± 10,3
98,6 ± 7,8
50;
n=9
83,6 ± 10,3 1
90,5 ± 11,2 1
89,3 ± 10,9
93,0 ± 8,0
60;
n=9
91,4 ± 19,6
1
1
93,9 ± 11,0
103,5 ± 7,2
70;
n=9
91,1 ± 10,9 1
102,0 ± 8,4 1
96,3 ± 8,5
98,5 ± 7,4
80;
n=9
88,1 ± 12,7 1
99,1 ± 9,9 1
95,4 ± 6,6
97,5 ± 7,7
90;
n=9
85,0 ± 11,3 1
98,8 ± 9,5 1
99,3 ± 5,1
99,5 ± 7,5
n=9
1
98,3 ± 4,1
104,6 ± 9,7
100;
81,4 ± 10,0
72,0 ± 13,1
98,5 ± 13,0
93,8 ± 11,3
1
1
110;
n=9
76,3 ± 18,7
86,3 ± 18,3
120;
n=9
71,5 ± 9,8
77,2 ± 12,5 1
Примечания:
95,2 ± 7,4
1
97,9 ± 7,1 1
106,6 ± 12,5
98,5 ± 10,1
*
- показатели нормированы на исходное значение;
– статистически значимое различие (p<0,05) с показателями
контрольных животных (таблица 4.3) по критерию Данна.
1
Таким образом, гипертензивный эффект соединения Т-1023, однократно, в\б 10
мг/кг; 1/25 ЛД16
существенно превосходил таковой, зарегистрированный для
фенилэфрина (однократно 0,5 мг/кг в/б) - в 1,5-2 раза по степени подъѐма АД, и в 5-6 раз
– по продолжительности прессорного действия. При этом выраженное и длительное
111
ослабление тяжести гипотонии под влиянием Т-1023 в данном исследовании
качественно изменило течение ранней стадии геморрагического шока – из 9 крыс
подопытной группы, получавших Т-1023, несмотря на массивную кровопотерю (50%
объѐма циркулирующей крови), в течение 120 минут наблюдения не погибло ни одно
животное.
Сходное с Т-1023 влияние на гемодинамику животных, находящихся в состоянии
тяжѐлого геморрагического шока оказывали и соединения Т-1020 и Т-1049 (таблицы 4.6,
4.7). При однократном внутрибрюшинном введении этих соединений в дозе 10 мг/кг
(1/30 и 1/40 ЛД16, соответственно) также развивался выраженный, длительный
гипертензивный эффект. Начальный подъѐм АД под влиянием Т-1020 и Т-1049
развивался несколько быстрее, чем при воздействии Т-1023 – достоверное повышение
АД отмечено уже на 2-й минуте, а максимальное развитие гипертензивного эффекта
наблюдалось к 10-20 минуте после введения этих соединений. В этот период АДД
достигало 90-100%, а АДС – 80-90% от уровня показателей до кровопотери.
Вазопрессорное действие этих соединений начинало ослабевать с 100-й минуты от
момента окончания их введения. Статистически значимый гипертензивный эффект
сохранялся около 100-110 минут – со 2 по 110 минуту, а достоверно повышенное АДД
сохранялось до конца эксперимента. У подопытных животных, получавших Т-1020 и Т1049, также отсутствовала компенсаторная тахикардия на поздних сроках наблюдения.
Как и в случае Т-1023, длительное и существенное ослабление гипотонии под
влиянием соединений Т-1020 и Т-1049 однократно, в/б в дозе 10 мг/кг в течение всего
периода наблюдения статистически значимо ограничивало краткосрочную летальность,
вызванную острым геморрагическим шоком – из 8 особей каждой подопытной группы,
несмотря на клиническую тяжесть использованной модели, в течение 2 часов не
погибло ни одного животного.
112
Таблица 4.6 – Динамика показателей АД, ЧСС и ЧДД при остром
геморрагическом шоке у наркотизированных крыс Wistar при воздействии Т-1020
однократно, 10 мг/кг, в/б (%; M±) *
Время после
кровопотери
и введения
препарата, мин.;
число животных
Исходно;
n=8
АДС
АДД
ЧСС
ЧДД
100,0
100,0
100,0
100,0
81,0 ± 6,5
105,0 ± 7,4
Кровопотеря
0;
n=8
28,3 ± 2,9
19,6 ± 4,7
Т-1020 10 мг/кг в/б
2;
n=8
42,1 ± 6,3 1
38,1 ± 10,6 1
5;
n=8
47,4 ± 11,9 1
48,5 ± 12,5 1
86,5 ± 6,6
104,9 ± 6,7
10;
n=8
61,1 ± 10,9 1
67,4 ± 13,2 1
92,5 ± 7,0
104,3 ± 6,5
20;
n=8
90,0 ± 15,2
1
1
94,1 ± 8,4
104,0 ± 7,9
30;
n=8
91,5 ± 10,6 1
99,6 ± 16,6 1
94,9 ± 7,0
103,5 ± 8,7
40;
n=8
93,3 ± 11,1 1
102,1 ± 11,1 1
95,6 ± 8,5
100,1 ± 5,3
50;
n=8
86,7 ± 11,0 1
95,9 ± 11,2 1
96,5 ± 8,1
101,8 ± 6,0
1
97,2 ± 9,7
101,4 ± 5,4
1
95,4 ± 13,1
60;
n=8
85,6 ± 8,6
70;
n=8
88,4 ± 10,8 1
96,4 ± 8,4 1
100,9 ± 9,8
102,0 ± 5,0
80;
n=8
80,0 ± 8,0 1
89,3 ± 9,9 1
98,3 ± 9,9
103,4 ± 5,5
90;
n=8
83,5 ± 9,6 1
93,5 ± 9,5 1
101,2 ± 10,8
104,4 ± 6,1
n=8
1
98,6 ± 9,7
104,6 ± 7,7
100;
81,1 ± 9,8
95,4 ± 13,0
88,6 ± 11,3
1
1
110;
n=8
75,2 ± 10,5
81,7 ± 15,3
120;
n=8
66,9 ± 15,3
72,1 ± 11,5 1
Примечания:
*
1
103,3 ± 5,2
99,8 ± 8,4 1
103,6 ± 5,3
99,2 ± 9,8
- показатели нормированы на исходное значение;
– статистически значимое различие (p<0,05) с показателями
контрольных животных (таблица 4.3) по критерию Данна.
1
113
Таблица 4.7 – Динамика показателей АД, ЧСС и ЧДД при остром геморрагическом шоке
у наркотизированных крыс Wistar при воздействии Т-1049 однократно, 10 мг/кг, в/б (%;
M±) *
Время после
кровопотери
и введения
препарата, мин.;
число животных
Исходно;
n=8
АДС
АДД
ЧСС
ЧДД
100,0
100,0
100,0
100,0
88,3 ± 7,8
97,6 ± 6,2
Кровопотеря
0;
n=8
27,8 ± 3,3
23,8 ± 4,1
Т-1049 10 мг/кг в/б
2;
n=8
40,6 ± 5,4 1
40,7 ± 8,7 1
5;
n=8
53,3 ± 9,4 1
60,0 ± 15,9 1
92,1 ± 10,3
98,1 ± 7,5
10;
n=8
70,3 ± 14,0 1
82,6 ± 20,8 1
94,5 ± 10,4
96,8 ± 6,6
20;
n=8
70,1 ± 13,3
1
1
92,9 ± 9,3
97,1 ± 8,8
30;
n=8
78,9 ± 10,4 1
93,3 ± 13,4 1
94,9 ± 7,3
102,0 ± 7,7
40;
n=8
85,7 ± 8,6 1
100,9 ± 4,8 1
94,4 ± 6,3
100,0 ± 8,9
50;
n=8
84,0 ± 8,8 1
98,2 ± 5,8 1
92,1 ± 5,8
97,6 ± 6,0
60;
n=8
86,0 ± 9,3
1
97,3 ± 9,8
98,9 ± 5,4
70;
n=8
82,8 ± 9,1 1
96,7 ± 8,1 1
96,9 ± 10,6
103,8 ± 9,7
80;
n=8
83,1 ± 7,9 1
96,6 ± 7,8 1
94,5 ± 7,6
99,6 ± 8,9
90;
n=8
76,8 ± 9,7 1
92,0 ± 14,2 1
95,4 ± 5,4
102,7 ± 8,4
n=8
77,3 ± 6,3
1
1
100;
110;
n=8
79,5 ± 6,4
120;
n=8
73,9 ± 9,9
Примечания:
*
82,9 ± 19,7
101,1 ± 5,4
1
90,9 ± 3,1
1
92,8 ± 3,1
1
84,5 ± 7,4 1
95,6 ± 5,2
1
100,7 ± 8,5
94,7 ± 4,5
1
98,3 ± 7,6
95,1 ± 4,4 1
98,6 ± 8,3
- показатели нормированы на исходное значение;
– статистически значимое различие (p<0,05) с показателями
контрольных животных (таблица 4.3) по критерию Данна.
1
114
Таблица 4.8 – Динамика показателей АД, ЧСС и ЧДД при остром геморрагическом шоке
у наркотизированных крыс Wistar при воздействии Т-1059 однократно, 10 мг/кг, в/б
(%; M±) *
Время после
кровопотери
и введения
препарата, мин.;
число животных
Исходно;
n=9
АДС
АДД
ЧСС
ЧДД
100,0
100,0
100,0
100,0
85,2 ± 8,2
100,0 ± 8,7
Кровопотеря
0;
n=9
28,3 ± 1,8
18,4 ± 2,1
Т-1059 10 мг/кг в/б
2;
n=9
38,2 ± 5,8
32,0 ± 5,1
5;
n=9
45,3 ± 6,6 1
43,1 ± 9,5 1
89,8 ± 6,3
103,7 ± 8,8
10;
n=9
73,8 ± 10,0 1
78,8 ± 10,3 1
95,2 ± 5,8
98,4 ± 8,1
101,8 ± 7,7
101,1 ± 7,0
1
20;
n=9
96,0 ± 7,3
30;
n=9
90,3 ± 9,2 1
98,6 ± 8,2 1
98,8 ± 6,1
97,9 ± 9,3
40;
n=9
89,6 ± 16,4 1
92,3 ± 17,4 1
94,0 ± 5,5
96,3 ± 8,4
50;
n=9
90,0 ± 15,4 1
94,1 ± 13,6 1
92,3 ± 6,3
95,2 ± 8,2
60;
n=9
93,4 ± 13,6
1
1
95,1 ± 7,0
100,6 ± 9,2
70;
n=9
99,1 ± 5,2 1
105,1 ± 5,3 1
100,2 ± 6,0
96,3 ± 9,1
80;
n=9
100,3 ± 9,6 1
102,0 ± 8,3 1
97,5 ± 5,2
96,8 ± 9,0
90;
n=9
99,5 ± 9,3 1
102,9 ± 5,8 1
98,1 ± 5,5
100,6 ± 8,7
100;
n=9
91,9 ± 14,8
1
1
110;
n=9
95,3 ± 7,9
120;
n=9
91,9 ± 6,9 1
Примечания:
101,4 ± 6,4
1
97,1 ± 10,9
95,6 ± 17,5
98,1 ± 9,8
1
1
96,6 ± 6,7 1
97,5 ± 5,1
1
103,8 ± 6,3
98,1 ± 5,9
1
99,1 ± 6,1
97,5 ± 6,5 1
99,5 ± 7,4
*
- показатели нормированы на исходное значение;
– статистически значимое различие (p<0,05) с показателями
контрольных животных (таблица 4.3) по критерию Данна.
1
В ряду исследованных соединений наиболее выраженное и продолжительное
вазопрессорное действие оказывало соединение Т-1059 (таблица 4.8). При однократном
внутрибрюшинном введении этого соединения в дозе 10 мг/кг (1/25 ЛД16; 1/38 ЛД50)
115
животным, находящимся в состоянии острого тяжѐлого геморрагического шока
развивался сильный и стойкий гипертензивный эффект. С 20 минуты после инъекции Т1059 и до конца срока наблюдения показатели АД подопытных животных, потерявших
половину объѐма циркулирующей крови, стабильно сохранялись на уровне 90-100% от
уровня АД до кровопотери. Прессорное действие Т-1059 начинало ослабевать с 130-140
минуты после введения (данные не отражены в таблице). Как и в случае других
исследованных производных ИТМ, длительная стабилизация гемодинамики под
влиянием Т-1059 ограничивала краткосрочную летальность состояния – из 9 особей
подопытной группы в течение эксперимента не погибло ни одного животного.
Как показано в разделе 4.1, изучаемые N,S-замещѐнные производные ИТМ
обладают выраженными вазопрессорными свойствами. Результаты исследований на
модели тяжѐлого геморрагического шока показали: эти соединения при острой
гиповолемической гипотонии вызывают значительное и длительное повышение АД.
При этом гипертензивный эффект, при однократном внутрибрюшинном введении этих
веществ в нетоксической дозе 10 мг/кг (1/25-1/40 ЛД16), качественно превосходит
гипертензивный эффект при таком способе введения эталонного препарата селективного α1-адреномиметика фенилэфрина (0,5 мг/кг) - в 1,5-2 раза по степени
подъѐма АД, и в 5-7 раз – по длительности эффекта.
Таблица 4.9 - Влияние исследованных производных ИТМ на двухчасовую летальность
подопытных животных при остром тяжѐлом геморрагическом шоке
Группа
Летальность, %
Контроль
45 (5/11)
Фенилэфрин, 0,5 мг/кг
50 (5/10)
Т-1023, 10 мг/кг
0 (0/9) *
Т-1020, 10 мг/кг
0 (0/8) *
Т-1049, 10 мг/кг
0 (0/8) *
Т-1059, 10 мг/кг
0 (0/9) *
Примечание:
*
- статистически значимое различие (p<0,05) с контролем по
точному критерию Фишера.
Конечно, целесообразность применения вазопрессоров при геморрагическом
шоке, протекающем, по крайней мере, на начальных стадиях, при повышенном тонусе
116
периферических сосудов [Шутеу Ю., 1981; Волков В.Е., 2009], не очевидна. Избыточная
централизация кровотока в этом случае способна отягощать течение критического
состояния [Ремизова М.И., 2014]. Тем не менее, в данных исследованиях при
однократной инъекции нетоксических доз изучаемых N,S-замещѐнных производных
ИТМ наблюдалось достоверное снижение краткосрочной летальности тяжѐлого
геморрагического шока (таблица 4.9). По нашему мнению, это свидетельствует о
перспективности разработки на основе этих соединений лекарственных средств для
оказания помощи при гипотонических расстройствах на догоспитальном этапе лечения
[Макарчук В.М., Филимонова М.В., 2010б; Проскуряков С.Я., Филимонова М.В., 2010;
Филимонова М.В., 2014б].
4.3 Изучение действия производных ИТМ на гемодинамику крыс на модели
острого эндотоксемического шока
Для исследования влияния изучаемых N,S-замещѐнных производных ИТМ на
гемодинамику
при
вазодилятационных
гипотонических
расстройствах
была
использована модель острого эндотоксемического шока, индуцированного высокими
дозами липополисахарида E.Coli. Как показано в разделах 1.2 и 1.3.6, инфекционноассоциированные патогены неспецифически стимулируют фосфорилирование eNOS и
индуцируют экспрессию iNOS. В результате этого при системном воздействии
патогенов, например при эндотоксемии или септическом процессе, происходит
значительное
и
стойкое
повышение
продукции
NO
в
различных
тканях.
Гиперпродукция NO в эндотелии при этом приводит к падению сосудистого тонуса и
развитию вазодилятационных гипотоний, вплоть до тяжѐлых шоковых состояний
[Dudzinski D., 2007; Cauwels A., 2007; Gkisioti S., 2011].
Как показано в таблице 4.10, внутривенное введение ЛПС E.Coli в дозе 18 мг/кг
сопровождалось быстрым падением АД и через 10 минут у подопытных животных
развивался острый вазодилятационный шок – показатели АД снижались до 45% от
исходных значений. В отличие от геморрагического шока (см. раздел 4.2), на фоне
вазодилятационного влияния эндотоксинов компенсаторного повышения тонуса
сосудов у этих животных практически не наблюдалось – в течение последующих 90
минут АДД было стабильно низким и находилось в пределах 45-55% от исходного
117
уровня. Тяжесть гипотонии у контрольных, не получавших лечения животных в
дальнейшем частично компенсировалась за счѐт повышения ЧСС – к концу наблюдения
АДС повысилось до 60-65% от исходного уровня на фоне умеренной тахикардии.
Таблица 4.10 – Динамика показателей АД, ЧСС и ЧДД при остром эндотоксемическом
шоке у контрольных наркотизированных крыс Wistar (%; M±) *
Время наблюдения,
минуты;
число животных
Исходно;
n=8
АДС
АДД
ЧСС
ЧДД
100,0
100,0
100,0
100,0
96,8 ± 6,3
105,2 ± 6,5
ЛПС 18 мг/кг в/в
0;
2;
n=8
46,5 ± 7,7 1
44,1 ± 7,7 1
n=8
47,3 ± 7,8
1
43,8 ± 7,8
1
1
45,8 ± 6,6 1
98,1 ± 5,1
101,3 ± 8,2
5;
n=8
48,2 ± 8,0
10;
n=8
51,4 ± 7,4 1
48,6 ± 6,5 1
100,4 ± 4,0
100,3 ± 7,0
20;
n=8
54,0 ± 7,5 1
53,7 ± 6,7 1
100,9 ± 4,6
100,4 ± 6,3
30;
n=8
56,3 ± 6,8 1
54,2 ± 7,8 1
105,1 ± 4,9
103,6 ± 8,8
40;
n=8
59,8 ± 6,0
1
1
107,8 ± 5,3
101,2 ± 8,4
50;
n=8
58,0 ± 5,9 1
47,2 ± 6,1 1
108,2 ± 5,6
99,7 ± 8,5
60;
n=8
58,3 ± 5,3 1
49,9 ± 5,4 1
110,3 ± 4,7
104,0 ± 8,6
70;
n=8
60,3 ± 5,7 1
55,7 ± 7,5 1
111,6 ± 4,2 2
103,3 ± 8,2
80;
n=8
62,0 ± 5,8
1
1
2
101,5 ± 9,0
90;
n=8
63,4 ± 6,1 1 2
113,1 ± 5,7 2
102,3 ± 7,7
Примечания:
52,4 ± 5,9
55,4 ± 6,7
56,6 ± 6,1 1
112,4 ± 4,1
*
- начало мониторинга - через 10 минут от начала введения ЛПС;
показатели нормированы на исходное значение;
1
– статистически значимое различие (p<0,05) с исходным значением
показателя по критерию Даннета;
2
– статистически значимое различие (p<0,05) со значением показателя
на момент начала мониторинга по критерию Даннета.
Фенилэфрин (0,5 мг/кг, однократно, в/б) вызывал у подопытных животных в
состоянии
острого
эндотоксемического
шока
слабый
и
кратковременный
гипертензивный эффект – достоверное повышение АД наблюдалось только на 10-й
118
минуте после инъекции. При этом повышение АД не превышало 20% от уровня АД
контрольных животных. Начиная с 20-й минуты и до конца наблюдения показатели АД
и ЧСС подопытных животных, получавших фенилэфрин, и контрольных животных
были статистически неразличимы. В то же время, в этой группе животных, получавших
фенилэфрин, через 30-40 минут после введения препарата отмечался прогрессивный
рост ЧДД в сравнении с контрольными животными – на поздних сроках наблюдалось
достоверное тахипноэ, достигавшее 30%.
Таблица 4.11 – Динамика показателей АД, ЧСС и ЧДД при остром эндотоксемическом
шоке у наркотизированных крыс Wistar при воздействии фенилэфрина, однократно,
0,5 мг/кг, в/б (%; M±) *
Время после
введения
препарата, мин.;
число животных
Исходно;
n=7
АДС
АДД
ЧСС
ЧДД
100,0
100,0
100,0
100,0
99,1 ± 6,2
110,6 ± 8,7
ЛПС 18 мг/кг в/в
0;
n=7
48,3 ± 9,2
38,6 ± 8,8
Фенилэфрин 0,5 мг/кг в/б
2;
n=7
57,8 ± 9,4
51,3 ± 9,9
5;
n=7
60,3 ± 10,7
55,5 ± 10,6
100,2 ± 7,3
102,4 ± 7,5
10;
n=7
66,9 ± 7,8 1
65,1 ± 9,1 1
97,0 ± 9,8
107,3 ± 7,9
20;
n=7
65,2 ± 9,1
63,3 ± 10,8
102,2 ± 7,2
98,3 ± 8,6
30;
n=7
64,4 ± 10,5
60,9 ± 11,3
105,5 ± 6,9
103,6 ± 10,6
40;
n=7
62,1 ± 9,6
55,3 ± 9,4
107,4 ± 8,7
110,4 ± 12,7
50;
n=7
60,1 ± 8,6
53,4 ± 9,6
110,1 ± 7,8
119,3 ± 13,0
60;
n=7
60,3 ± 7,8
55,3 ± 8,4
112,8 ± 8,4
122,3 ± 13,3
70;
n=7
62,8 ± 7,3
58,0 ± 12,2
113,6 ± 9,1
128,3 ± 11,3 1
80;
n=7
64,5 ± 6,7
57,7 ± 11,0
112,5 ± 9,0
129,7 ± 10,2 1
90;
n=7
65,0 ± 6,6
58,5 ± 9,8
114,6 ± 7,3
130,7 ± 11,1 1
Примечания:
*
- препарат введѐн через 10 минут после инъекции ЛПС;
показатели нормированы на исходное значение;
1
– статистически значимое различие (p<0,05) с показателями
контрольных животных (таблица 4.10) по критерию Данна.
119
Имеющиеся данные не позволяют однозначно интерпретировать это явление.
Динамика снижения АД и глубина гипотонии свидетельствуют о развитии в этом
исследовании у животных тяжѐлого эндотоксемического шока, и в этом случае развитие
метаболического ацидоза и тахипноэ являются закономерными [Шутеу Ю., 1981;
Волков В.Е., 2009]. Возможно, в использованной модели высокая доза адреномиметика
усиливала развитие ацидоза.
Изучаемые N,S-замещѐнные производные ИТМ оказывали существенно более
выраженное влияние на уровень АД подопытных животных в состоянии острого
эндотоксемического шока [Макарчук В.М., Филимонова М.В., 2010; Филимонова М.В.,
2011; Филимонова М.В., 2014б]. В этом случае ингибиторы NOS, подавляя
индуцированную эндотоксинами гиперпродукцию NO (как показано в разделе 3.4),
блокировали вазодилятационное влияние ЛПС и вызывали быстрое и длительное
повышение тонуса сосудов и подъѐм АД. Так, уже ко 2-ой минуте после однократного
внутрибрюшинного введения соединения Т-1004 в дозе 10 мг/кг АДД подопытных
животных повысилось на 75% и с 10 по 30 минуту показатели АДД, несмотря на влияние
эндотоксинов, полностью находились на уровне исходных показателей перед введением
ЛПС (таблица 4.12). При этом в первые 5 минут после введения Т-1004 у подопытных
животных развилась умеренная брадикардия (снижение ЧСС на 15%), которая в данном
случае, вероятно, обусловлена рефлекторным повышением тонуса блуждающего нерва
на фоне быстрого роста АД. Тем не менее, с 10 по 30 минуту у подопытных животных
АДС составляло 90% от уровня показателей до введения ЛПС. В целом же, в этих
опытах вазопрессорное действие Т-1004 при данном состоянии было нестабильным –
статистически значимый гипертензивный эффект сохранялся только в первые 40 минут
после введения препарата. Изменений со стороны ЧДД не наблюдалось.
120
Таблица 4.12 – Динамика показателей АД, ЧСС и ЧДД при остром
эндотоксемическом шоке у наркотизированных крыс Wistar при воздействии Т-1004,
однократно, 10 мг/кг, в/б (%; M±) *
Время после
введения
препарата, мин.;
число животных
Исходно;
n=7
АДС
АДД
ЧСС
ЧДД
100,0
100,0
100,0
100,0
97,7 ± 5,1
100,1 ± 8,2
ЛПС 18 мг/кг в/в
0;
n=7
46,0 ± 5,5
43,5 ± 7,3
Т-1004 10 мг/кг в/б
1
76,0 ± 10,8 1
2;
n=7
70,4 ± 7,7
5;
n=7
80,0 ± 6,7 1
87,2 ± 9,1 1
84,0 ± 5,2 1
108,8 ± 7,5
10;
n=7
86,2 ± 6,8 1
100,6 ± 8,3 1
84,5 ± 4,8 1
106,2 ± 6,9
20;
n=7
88,2 ± 7,4 1
101,4 ± 7,4 1
84,9 ± 5,3 1
105,3 ± 8,1
n=7
84,7 ± 7,5
1
88,9 ± 6,3
1
101,7 ± 8,5
1
92,7 ± 6,2
1
98,6 ± 6,7
30;
99,1 ± 7,7
1
88,3 ± 6,1
1
40;
n=7
74,1 ± 6,4
50;
n=7
67,3 ± 6,2
78,5 ± 9,5 1
94,3 ± 4,9 1
97,6 ± 6,3
60;
n=7
67,5 ± 6,3
79,2 ± 8,3 1
96,4 ± 5,5 1
98,3 ± 6,8
70;
n=7
69,6 ± 7,2
83,1 ± 10,6 1
98,3 ± 5,0 1
96,8 ± 6,6
1
1
97,9 ± 6,6
99,0 ± 5,0 1
99,0 ± 7,1
80;
n=7
72,1 ± 6,4
86,8 ± 12,6
90;
n=7
74,0 ± 5,6
90,2 ± 10,5 1
Примечания:
98,8 ± 5,1
*
- препарат введѐн через 10 минут после инъекции ЛПС;
показатели нормированы на исходное значение;
1
– статистически значимое различие (p<0,05) с показателями
контрольных животных (таблица 4.10) по критерию Данна.
В ряду исследованных на данной модели производных ИТМ наиболее стабильное
и длительное вазопрессорное действие, как и при гиповолемическом шоке (см. раздел
4.2), проявляло соединение Т-1059. Как показано в таблице 4.13, соединение Т-1059
(однократно, в/б, 10 мг/кг) вызывало выраженный подъѐм АД, сопровождавшийся
умеренной брадикардией (снижение ЧСС менее 15%), развившейся в первые 10 минут.
Сосудистый тонус под влиянием Т-1059 в течение всего опыта стабильно сохранялся на
уровне, предшествующем введению эндотоксинов – достоверный гипертензивный
эффект наблюдался со 2-ой минуты и до конца срока наблюдения, и при этом АДД
121
составляло 90-100%, АДС – 80-90% от уровня исходных показателей перед введением
ЛПС. Изменений со стороны ЧДД не отмечено.
Таблица 4.13 – Динамика показателей АД, ЧСС и ЧДД при остром эндотоксемическом
шоке у наркотизированных крыс Wistar при воздействии Т-1059
однократно, 10 мг/кг, в/б (%; M±) *
Время после
введения
препарата, мин.;
число животных
Исходно;
n=8
АДС
АДД
ЧСС
ЧДД
100,0
100,0
100,0
100,0
98,9 ± 5,3
103,2 ± 8,2
86,6 ± 5,4
103,4 ± 11,0
ЛПС 18 мг/кг в/в
0;
n=8
49,8 ± 6,9
47,8 ± 9,8
Т-1059 10 мг/кг в/б
2;
n=8
80,7 ± 7,9 1
86,6 ± 10,7 1
5;
n=8
88,8 ± 6,4 1
98,3 ± 7,9 1
10;
n=8
91,7 ± 7,1
1
20;
n=8
88,1 ± 5,8 1
30;
n=8
40;
1
104,2 ± 7,1
99,1 ± 6,1 1
88,7 ± 4,6 1
105,6 ± 9,6
85,1 ± 5,9 1
95,4 ± 8,6 1
92,2 ± 5,9 1
103,8 ± 8,2
n=8
83,0 ± 6,0 1
91,4 ± 7,7 1
94,6 ± 5,2 1
98,0 ± 12,4
50;
n=8
82,4 ± 5,8
1
1
96,1 ± 5,7
99,3 ± 8,3
60;
n=8
81,8 ± 6,5 1
89,7 ± 9,3 1
97,3 ± 5,2 1
100,3 ± 9,6
70;
n=8
80,6 ± 5,9 1
89,3 ± 8,8 1
96,9 ± 6,0 1
104,2 ± 10,4
80;
n=8
83,2 ± 6,9 1
90,0 ± 8,7 1
99,5 ± 5,8 1
105,2 ± 9,4
n=8
1
1
1
104,0 ± 9,3
90;
Примечания:
82,9 ± 7,0
100,3 ± 6,9
90,4 ± 7,9
90,4 ± 8,3
1
86,2 ± 4,6
98,9 ± 5,1
*
- препарат введѐн через 10 минут после инъекции ЛПС;
показатели нормированы на исходное значение;
1
– статистически значимое различие (p<0,05) с показателями
контрольных животных (таблица 4.10) по критерию Данна.
Таким образом, результаты этих исследований показали, что изучаемые N,Sзамещѐнные производные ИТМ, подавляя индуцированную эндотоксинами избыточную
продукцию NO (см. раздел 3.4), оказывают эффективное терапевтическое действие в
условиях
экспериментальной
эндотоксемии,
вызванной
высокими
дозами
липополисахарида E.Coli. Способность изучаемых соединений при их однократном
122
введении
в
нетоксических
дозах
длительно
ослаблять
тяжесть
острой
вазодилятационной гипотонии, сопутствующей эндотоксемии, по нашему мнению,
свидетельствует, что вазопрессоры с NOS-ингибирующим механизмом действия могут
открыть новые возможности для создания новых оригинальных лекарственных средств
профилактики и лечения гипотонических расстройств при сепсисе и патологиях,
сопровождающихся высокой токсической нагрузкой.
4.4 Изучение влияния производных ИТМ на гемодинамику крыс при гипотонии,
вызванной ганглиоблокадой
Ганглиолитики,
блокируя
периферические
н-холинорецепторы,
блокируют
передачу возбуждения в вегетативных ганглиях. При этом снижение тонуса
сосудодвигательного центра, угнетение прессорных рефлексов и адренэргического
вазопрессорного влияния, и снижение продукции адреналина в надпочечниках
вызывают расширение артериол, венул и мелких вен, что сопровождается снижением
АД.
Ганглиоблокаторы
применяются
при
лечении
тяжѐлых
и
осложнѐнных
гипертонических кризов, спазмов периферических сосудов, отѐка мозга и лѐгких, а
также для создания управляемой гипотонии и подавления вегетативных рефлексов при
оперативных вмешательствах. Вместе с тем, при патологии внутренних органов,
повышенной
чувствительности
применении
возможно
к
развитие
ганглиоблокаторам
глубоких
или
их
нерациональном
вазодилятационных
гипотонических
расстройств, лечение которых может представлять существенные сложности, в
частности, в связи с повышенной реактивностью при таких состояниях адрено- и мхолинорецепторов [Машковский М.Д., 2005; Brunton L., 2010]. В этой связи было
проведено исследование вазопрессорных свойств изучаемых производных ИТМ на
модели гипотонии при ганглиоблокаде.
На фоне применения ганглиоблокатора азаметония (однократно, в/б, 12 мг/кг) у
подопытных крыс развивалось снижение АД. Гипотония достигала максимального
развития через 20 минут после введения препарата. Как показано в таблице 4.14, в этот
момент у животных наблюдалась умеренная брадикардия (ЧСС понижена на 15%), а
показатели АДС и АДД составляли 65-67% относительно исходного уровня до введения
пентамина.
Поскольку
ганглиолитик
блокировал
вегетативные
рефлексы,
компенсаторные прессорные механизмы, способные ослабить гипотонию, практически
123
не реализовались, и у контрольных животных в течение последующих 100 минут
наблюдения сохранялась стабильная гипотония – статистически значимой динамики
изучаемых показателей не наблюдалось.
Таблица 4.14 – Динамика показателей АД, ЧСС и ЧДД у наркотизированных крыс
Wistar при гипотонии, вызванной азаметонием однократно, в/б, 12 мг/кг (%; M±) *
Время наблюдения,
минуты;
число животных
Исходно
n=7
АДС
АДД
ЧСС
ЧДД
100,0
100,0
100,0
100,0
Азаметоний 12 мг/кг в/б
0;
n=7
65,2 ± 7,1 1
67,1 ± 7,6 1
86,2 ± 5,4 1
103,1 ± 7,5
10;
n=7
67,6 ± 6,7 1
70,2 ± 6,3 1
86,6 ± 6,0 1
102,2 ± 7,2
20;
n=7
71,0 ± 7,0 1
73,9 ± 6,7 1
87,2 ± 5,9 1
95,1 ± 7,9
30;
n=7
71,9 ± 7,1 1
74,0 ± 6,0 1
89,1 ± 4,8 1
100,3 ± 6,4
40;
n=7
72,0 ± 6,0
1
1
89,9 ± 5,8
104,9 ± 7,1
50;
n=7
69,9 ± 6,1 1
72,2 ± 6,6 1
90,1 ± 5,3
98,3 ± 6,6
60;
n=7
72,7 ± 5,4 1
74,9 ± 5,4 1
91,1 ± 5,4
103,6 ± 6,5
70;
n=7
71,6 ± 5,2 1
73,0 ± 5,3 1
89,9 ± 6,0
103,4 ± 5,4
80;
n=7
73,9 ± 4,7
1
1
90,4 ± 5,1
102,7 ± 5,3
90;
n=7
74,9 ± 4,9 1
75,3 ± 6,8 1
91,4 ± 5,4
97,7 ± 6,1
100;
n=7
72,7 ± 5,8 1
74,3 ± 6,4 1
91,8 ± 4,9
103,0 ± 6,3
Примечания:
74,4 ± 5,6
75,7 ± 5,5
*
- начало мониторинга - через 20 минут после введения азаметония;
показатели нормированы на исходное значение;
1
– статистически значимое различие (p<0,05) с исходным значением
показателя по критерию Даннета.
При введении соединения Т-1059 (однократно, в/б, 10 мг/кг) через 20 минут после
премедикации азаметонием наблюдалось значительное повышение АД подопытных
животных (таблица 4.15). При этом гипертензивное действие ингибитора NOS не
сопровождалось
брадикардией,
что,
вероятно,
обусловлено
медикаментозной
вегетативной денервацией, вызванной азаметонием. Вазопрессорное действие Т-1059 в
этом случае развивалось заметно медленнее, чем на моделях геморрагического и
эндотоксического шока (см. разделы 4.2, 4.3). Вероятно, это связано с тем, что
124
ганглиолитик
препятствовал
реализации
центрального
прессорного
действия
ингибитора NOS (см. раздел 1.3.3), которое развивается при подавлении продукции NO
в среднем мозге и реализуется, главным образом, путѐм повышения симпатического
тонуса [Togashi P., 1992; Sabino J.P., 2011]. Гипертензивный эффект Т-1059 в этих
опытах достигал максимального развития к 20-ой минуте после инъекции препарата и
практически полностью нивелировал гипотензивное влияние ганглиолитика – до конца
срока наблюдения показатели АДД составляли 90-95%, а АДС – 85-90% от исходного
уровня до введения ганглиолитика. При этом влияния на ЧСС и ЧДД соединение Т-1059
не оказывало.
Таблица 4.15 – Динамика показателей АД, ЧСС и ЧДД у наркотизированных крыс
Wistar на фоне ганглиоблокады при воздействии Т-1059 однократно, в/б, 10 мг/кг
(%; M±) *
Время наблюдения,
минуты;
число животных
Исходно;
n=7
АДС
АДД
ЧСС
ЧДД
100,0
100,0
100,0
100,0
88,0 ± 5,8
101,1 ± 7,1
85,2 ± 5,7 1
86,6 ± 6,0
102,2 ± 7,2
92,1 ± 5,5
1
87,2 ± 5,9
96,8 ± 8,5
94,3 ± 6,4
1
87,0 ± 6,2
98,3 ± 7,6
Азаметоний 12 мг/кг в/б
20;
n=7
65,8 ± 5,2
68,9 ± 7,0
Т-1059 10 мг/кг в/б
30;
40;
n=7
n=7
80,2 ± 5,3
87,6 ± 5,5
1
1
50;
n=7
89,7 ± 5,5
60;
n=7
90,9 ± 4,9 1
95,3 ± 6,1 1
86,1 ± 6,1
100,7 ± 8,9
70;
n=7
90,7 ± 5,4 1
95,2 ± 5,9 1
88,8 ± 5,9
106,3 ± 7,8
80;
n=7
87,7 ± 4,3 1
94,0 ± 5,7 1
87,4 ± 5,3
99,2 ± 8,2
90;
n=7
88,2 ± 4,7
1
1
89,3 ± 5,4
101,5 ± 7,3
100;
n=7
90,2 ± 5,6 1
95,7 ± 5,0 1
88,5 ± 5,1
101,2 ± 5,3
110;
n=7
88,1 ± 5,7 1
95,1 ± 5,6 1
89,8 ± 5,1
98,3 ± 5,9
120;
n=7
87,8 ± 5,0 1
94,5 ± 5,9 1
92,3 ± 6,4
99,6 ± 8,2
Примечания:
*
94,2 ± 5,3
- Т-1059 введѐн через 20 минут после инъекции азаметония;
показатели нормированы на исходное значение;
1
– статистически значимое различие (p<0,05) с показателями
контрольных животных (таблица 4.14) по критерию Манна-Уитни.
125
Длительный и стабильный гипертензивный эффект, который развивается при
однократной инъекции нетоксической дозы соединения Т-1059, свидетельствует, что
вазопрессоры с NOS-ингибирующим механизмом действия, в частности, изучаемые N,Sзамещѐнные
производные
ИТМ,
могут
быть
потенциальными
эффективными
средствами коррекции гипотонических расстройств, развившихся при применении
ганглиоблокаторов, миорелаксантов, анестетиков, тем более, что они лишены побочных
эффектов, присущих применяемым в клинике лекарственным средствам используемым
для лечения передозировки выше указанных групп препаратов [Машковский М.Д., 2005;
Brunton L., 2010].
4.5 Изучение действия производных ИТМ на гемодинамику крыс с рефрактерной
гипотонией при эндотоксемии
Лечение
рефрактерных
гипотонических
состояний,
характеризующихся
резистентностью сосудов к действию эндогенных и экзогенных вазопрессоров, является
крайне сложной клинической проблемой, поскольку развитие резистентной вазоплегии
на поздних стадиях шока любой этиологии значительно повышает летальность такого
состояния [Tiemermann C., 1993; Hernandez G., 2013; Волков В.Е., 2009; Andrades M.E.,
2011].
Повышение тонуса сосудов при действии ингибиторов NOS развивается без
участия клеточных рецепторных структур [Dudzinski D., 2007; Ramadoss J., 2013; Tang
L., 2014], нарушение функции которых во многом и определяет патогенез вазоплегии. В
этой связи такие соединения потенциально могут оказывать вазопрессорное действие
при гипотониях, резистентных к действию существующих вазопрессоров, реализующих
свои эффекты на уровне рецепторного аппарата сосудистой стенки.
Для оценки способности изучаемых производных ИТМ оказывать гипертензивное
действие в условиях рефрактерной гипотонии были проведены исследования на модели
резистентной вазоплегии, которая развивалась на фоне длительной эндотоксемии,
вызванной двукратным внутрибрюшинным введением ЛПС E.Coli в дозе 2 мг/кг.
Первую инъекцию проводили за 18 часов до исследований, вторую – за 10 минут до
введения изучаемых соединений.
126
Таблица 4.16 – Влияние фенилэфрина (однократно, в/б, 0,5 мг/кг) на показатели
АД, ЧСС и ЧДД у наркотизированных крыс Wistar при гипотонии на фоне длительной
эндотоксемии (%; M±) *
Время наблюдения,
минуты;
число животных
Исходно;
n=7
АДС
АДД
ЧСС
ЧДД
100,0
100,0
100,0
100,0
99,2 ± 7,0
115,2 ± 6,2 1
ЛПС 2 мг/кг в/бр, первая инъекция
18 часов;
n=7
89,1 ± 7,2
85,8 ± 7,5
ЛПС 2 мг/кг в/бр, вторая инъекция
10;
n=7
73,6 ± 6,5 1
67,6 ± 7,1 1
98,4 ± 6,1
111,0 ± 11,2
Фенилэфрин 0,5 мг/кг в/б
2;
n=7
75,1 ± 6,4 1
69,3 ± 6,3 1
5;
n=7
76,7 ± 6,4 1
69,9 ± 7,2 1
98,7 ± 5,4
116,6 ± 9,5
10;
n=7
77,0 ± 6,1 1
67,2 ± 7,9 1
97,3 ± 6,3
115,6 ± 9,6
20;
n=7
75,2 ± 6,9 1
67,5 ± 7,2 1
99,2 ± 6,3
113,9 ± 9,5
30;
n=7
76,1 ± 6,5 1
65,2 ± 8,3 1
100,4 ± 5,2
116,9 ± 9,2
40;
n=7
77,5 ± 6,0 1
67,7 ± 8,1 1
98,9 ± 6,4
122,4 ± 10,5 1
50;
n=7
78,0 ± 6,4 1
71,4 ± 7,2 1
98,7 ± 6,1
127,0 ± 9,9 1
60;
n=7
78,1 ± 6,3 1
75,2 ± 7,0 1
99,3 ± 6,3
132,1 ± 9,3 1
70;
n=7
77,0 ± 6,2 1
75,1 ± 7,1 1
101,5 ± 6,0
137,5 ± 9,8 1
80;
n=7
76,4 ± 4,7 1
74,4 ± 7,2 1
101,3 ± 6,2
139,9 ± 9,0 1 2
90;
n=7
75,7 ± 5,9 1
75,3 ± 7,8 1
100,1 ± 5,9
141,9 ± 9,7 1 2
Примечания:
*
- введение препарата через 10 минут после 2-й инъекции ЛПС;
показатели нормированы на исходное значение;
1
– статистически значимое различие (p<0,05) с исходным значением
показателя по критерию Даннета;
2
– статистически значимое различие (p<0,05) со значением показателя
перед введением препарата по критерию Даннета.
При использованных дозах и схеме введения ЛПС у подопытных животных к
началу мониторинга развивалась выраженная гипотония: АДД составляло 68%, а АДС –
74% от исходного уровня показателей перед первой инъекцией ЛПС (таблица 4.16).
Причѐм,
длительная
эндотоксемия
значительно
подавляла
у
этих
животных
реактивность сосудов к действию вазопрессоров. Как показано в таблице 4.16, при
127
внутрибрюшинном введении фенилэфрина (0,5 мг/кг, в/б) животным с рефрактерной
гипотонией не наблюдалось сколько-нибудь значимых изменений АД – в течение всех
последующих 100 минут наблюдения АДД подопытных животных стабильно
находилось в пределах 65-75%, а АДС – в пределах 70-80% от уровня исходных
значений. Причѐм, в этих опытах, как и в опытах на модели острого эндотоксического
шока (см. раздел 4.3), у животных, получавших фенилэфрин, отмечена статистически
зачимая кардиореспираторная реакция на препарат.
Эти наблюдения позволяют заключить, что длительная эндотоксемия значительно
подавляет реактивность сосудов к действию вазопрессоров. Полное отсутствие не
только достоверного гипертензивного эффекта, но и даже тенденции к повышению АД
при применении высокой дозы селективного α1-адреномиметика свидетельствует, по
нашему мнению, о выраженной резистентности сосудов к прессорному влиянию и
подтверждает,
что
используемая
модель
в
значительной
мере
воспроизводит
резистентную вазоплегию.
Однако дальнейшие исследования показали, что данное патофизиологическое
состояние не является препятствием для развития вазопрессорного действия изучаемых
ингибиторов NOS. Как показано в таблице 4.17, соединение Т-1059 в дозе 10 мг/кг,
введѐнное животным в данном состоянии однократно внутрибрюшинно, оказывало
выраженное вазопрессорное действие сразу после инъекции препарата. Уже на 2-й
минуте после введения Т-1059 гипертензивное действие этого соединения полностью
нивелировало гипотензивный эффект эндотоксемии – в этот момент АДД составляло
98%, АДС – 105% от уровня исходных показателей. В то же время, вазопрессорное
действие Т-1059 при таком способе введения на этой модели было непродолжительным
- с 5-ой минуты тонус сосудов начинал снижаться и статистически значимым
гипертензивный эффект оставался только в течение 20 минут.
Относительно низкая продолжительность прессорного действия изучаемых
ингибиторов NOS при данном способе введения, вероятно, обусловлена высокой
экспрессией iNOS, перманентно пополняющей пул этих ферментов на поздних стадиях
эндотоксемии [Teng X., 2002; Huang H., 2004; Cauwels A., 2007; Lange M., 2009; Pautz A.,
2010]. В этом случае длительный гипертензивный эффект, вероятно, можно достичь при
внутримышечном или подкожном введении, либо при продолжительной инфузии таких
соединений.
128
Таблица 4.17 – Влияние Т-1059 (однократно, в/б, 10 мг/кг) на показатели АД, ЧСС и
ЧДД у наркотизированных крыс Wistar при гипотонии на фоне длительной
эндотоксемии (%; M±) *
Время наблюдения,
минуты;
число животных
Исходно;
n=7
АДС
АДД
ЧСС
ЧДД
100,0
100,0
100,0
100,0
99,2 ± 7,1
113,9 ± 8,9
ЛПС 2 мг/кг в/бр, первая инъекция
18 часов;
n=7
86,3 ± 7,5
85,8 ± 7,5
ЛПС 2 мг/кг в/бр, вторая инъекция
10;
n=7
71,5 ± 6,0 1
68,9 ± 6,9 2
98,2 ± 5,9
112,0 ± 9,5
Т-1059 10 мг/кг в/б
2;
n=7
104,5 ± 5,8 2
97,7 ± 7,8 2
5;
n=7
99,2 ± 6,9 2
97,5 ± 7,6 2
92,3 ± 6,7
114,7 ± 10,3
10;
n=7
94,1 ± 6,3 2
94,7 ± 8,0 2
92,5 ± 6,1
112,8 ± 10,6
20;
n=7
87,0 ± 6,1 2
88,8 ± 8,2 2
93,7 ± 6,7
111,1 ± 9,0
30;
n=7
82,9 ± 6,4 1
85,4 ± 8,6
40;
n=7
79,3 ± 6,8
1
50;
n=7
60;
70;
98,2 ± 6,6
110,0 ± 9,9
1
100,1 ± 6,4
112,3 ± 10,6
77,7 ± 6,3 1
80,2 ± 8,6 1
101,2 ± 6,2
110,6 ± 8,3
n=7
77,4 ± 6,3 1
79,3 ± 8,2 1
102,0 ± 7,1
113,5 ± 9,1
n=7
77,9 ± 6,7 1
79,9 ± 7,9 1
102,7 ± 6,8
112,5 ± 8,8
80;
n=7
77,4 ± 6,2
1
1
102,4 ± 6,3
113,8 ± 9,5
90;
n=7
76,4 ± 5,7 1
80,9 ± 7,5 1
102,3 ± 6,6
114,2 ± 8,1
Примечания:
81,6 ± 8,7
79,1 ± 7,6
*
- введение препарата через 10 минут после 2-й инъекции ЛПС;
показатели нормированы на исходное значение;
1
– статистически значимое различие (p<0,05) с исходным значением
показателя по критерию Даннета;
2
– статистически значимое различие (p<0,05) со значением показателя
перед введением препарата по критерию Даннета.
В целом же, результаты данных исследований, полученные на модели
рефрактерной гипотонии, убедительно показывают, что молекулярный механизм
прессорного действия ингибиторов NOS позволяет изучаемым N-ацил-S-алкил-
129
замещѐнным производным ИТМ повышать сосудистый тонус при патологических
состояниях, резистентных к действию существующих вазопрессоров. Учитывая
появившиеся
в
последние
годы
данные
о
способности
ингибиторов
NOS
восстанавливать при рефрактерных состояниях реактивность сосудов к прессорному
действию α1-адреномиметиков и ангиотензина II [Tiemermann C., 1993; Alexander J.H.,
2007; Salem R., 2007; Dumbarton T.C., 2011; Jang D.H., 2013; Shabana A., 2013; Nardi
G.M., 2014; Fink M., 2014], можно ожидать, что вазопрессоры с NOS-ингибирующим
механизмом действия позволят расширить возможности при лечении тяжѐлых
эндотоксемий и критических состояний.
4.6 Оценка перспективности разработки на основе наиболее активных
производных ИТМ вазопрессорных средств
В зависимости от этиологии, тяжести и течения гипотонических состояний объѐм
и интенсивность проводимых терапевтических мероприятий изменяются в чрезвычайно
широких пределах – от ограниченного амбулаторного применения аналептических и
кардиотонических
средств
до
интенсивного
использования
всего
арсенала
фармацевтических средств и медицинского оборудования реанимационных отделений.
Среди медикаментозных средств в лечении острых и хронических гипотоний важное
место
занимают
вазопрессоры
–
фармакологические
средства,
оказывающие
гипертензивное действие путѐм повышения тонуса кровеносных сосудов.
В качестве таких средств в настоящее время используются α 1-адреномиметики
(норэпинефрин, эпинефрин, допамин, фенилэфрин, мидодрин, добутамин и др.) и
пептидные вазоконстрикторы, в большинстве представленные аналогами вазопрессина,
ангиотензина
и
соматостатина
(вазопрессин,
терлипрессин,
ангиотензинамид,
октапрессин и др.) [Машковский М.Д., 2005; Харкевич Д.А., 2010; Brunton L., 2010].
Общим недостатком адреномиметиков является кратковременность действия и
наличие существенных побочных эффектов. При их применении возможно развитие
возбуждения ЦНС, нарушений сердечного ритма, метаболического ацидоза, а
продолжительный, устойчивый гипертензивный эффект возможен лишь при длительной
инфузионной терапии, что значительно ограничивает использование указанных средств.
Пептидные вазоконстрикторы имеют сравнительно большую продолжительность
действия. Однако повышение сосудистого тонуса при их воздействии развивается,
130
главным образом, в коронарных, чревных и почечных сосудах. В связи с чем,
применение таких препаратов также далеко не всегда допустимо: аналоги ангиотензина
противопоказаны при гиповолемии, а аналоги вазопрессина – при ишемии миокарда. В
этой связи, во многих случаях, особенно при острых гипотонических состояниях,
эффективное применение существующих вазопрессоров возможно лишь в клинических
условиях и, нередко, требует тщательного врачебного контроля [Delmas A., 2005;
Волков В.Е., 2009; Boerma E.C., 2010; Ferquson-Myrthil N., 2012].
Эти
особенности
действия
и
недостатки
существующих
вазопрессоров
значительно ограничивают их возможности, в частности, крайне затрудняют их
эффективное
применение
при
оказании
экстренной,
неотложной
помощи
на
догоспитальном этапе лечения при травмах, ранениях, ожогах, отравлениях и различных
патологиях, сопровождающихся развитием острой гипотонии. Между тем, в этих
случаях, нередко, именно своевременная эффективная догоспитальная медицинская
помощь способна предотвратить развитие тяжѐлых состояний и угрожающих
осложнений, которые в дальнейшем определяют неблагоприятное течение заболевания.
Эта ситуация резко обостряется в случаях массового поражения при стихийных
бедствиях, техногенных катастрофах, терактах или вооружѐнных конфликтах. Так,
например, по данным Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова до 35% боевых
потерь личного состава в Афганистане были обусловлены низкой эффективностью
догоспитальной помощи при ранениях и развитием тяжѐлого геморрагического шока
[Хубулаева Г.Г., 2013].
Кроме того, важную клиническую проблему представляют патологические
состояния, при которых имеющиеся вазопрессоры неэффективны или противопоказаны
– гипотонии, развившиеся на фоне перидуральной анестезии, при передозировке
ганглиоблокаторов, α1-адреноблокаторов, нейролептиков, анестетиков, а также поздние,
рефрактерные стадии шока различной
этиологии, характеризующиеся потерей
чувствительности сосудов к действию эндо- и экзогенных вазопрессоров. Развитие
такой резистентной вазоплегии резко повышает летальность при критических
состояниях [Шутеу Ю., 1981; Волков В.Е., 2009]. Масштаб этой проблемы также
огромен - так, в США и Канаде ежегодно регистрируется около 700 тысяч случаев
только септического шока, и для 250-300 тысяч таких больных причиной смерти
становится тяжѐлый рефрактерный шок [Martin G.S., 2003; Ward P.A., 2012].
131
В этой связи, актуальность разработки новых эффективных вазопрессоров
является несомненной. Приведѐнные в данной главе результаты экспериментальных
исследований свидетельствуют, что новые подходы в лечении гипотонических
состояний могут открыть ингибиторы NOS, в частности, изучаемые N,S-замещѐнные
производные ИТМ [Проскуряков С.Я., Филимонова М.В., 2010; Макарчук В.М.,
Филимонова М.В., 2010, 2010б; Филимонова М.В., 2011, 2014б].
Так, выраженное и длительное вазопрессорное действие при однократном
введении изучаемых ингибиторов NOS в нетоксических дозах (~1/25 ЛД16) вызывало у
животных на модели тяжѐлого геморрагического шока гипертензивный эффект,
качественно превосходящий прессорное действие высоких доз адреномиметиков - в 1,52 раза по степени подъѐма АД, и в 5-7 раз – по длительности. При этом значительное и
продолжительное ослабление тяжести гипотонии достоверно снижало краткосрочную
летальность подопытных животных. Полученные данные свидетельствуют, что
лекарственные средства на основе изучаемых ингибиторов NOS и, в первую очередь, соединения Т-1059, могут быть эффективными на догоспитальном этапе лечения при
травмах и ранениях, сопровождающихся развитием острых гипотонических состояний.
Как показано в разделе 3.4, есть все основания полагать, что изучаемые
производные ИТМ быстро абсорбируются и распределяются в биологических тканях, и
в этой связи, длительность гипертензивного эффекта этих соединений может быть
существенно повышена в случае их внутримышечного или подкожного введения.
Способность изучаемых соединений оказывать длительный гипертензивный
эффект при
гипотонических расстройствах на
фоне
острой эндотоксемии
и
ганглиоблокады, в целом, демонстрирует широкую возможность использования
вазопрессоров с NOS-ингибирующим механизмом действия. В то же время, очевидно,
что эффективность клинического применения таких вазопрессоров будет определяться
не только этими препаратами, но и адекватностью выбора способа лечения основного
заболевания, ставшего причиной развития гипотонии [Watson D., 2004; Bakker J., 2004].
Принципиально
важной
является
установленная
эффективность
действия
изучаемых производных ИТМ при вазоплегии, резистентной к действию существующих
вазопрессоров. Учитывая появившиеся в последние годы данные о способности
ингибиторов NOS восстанавливать реактивность сосудов к прессорному действию α1адреномиметиков и ангиотензина II [Tiemermann C., 1993; Alexander J.H., 2007; Salem
132
R., 2007; Dumbarton T.C., 2011; Jang D.H., 2013; Shabana A., 2013; Nardi G.M., 2014; Fink
M., 2014], можно ожидать, что такие вазопрессоры могут повысить эффективность
лечения тяжѐлых эндотоксемий и критических состояний.
Подводя итоги проведѐнных исследований, можно отметить, что изучаемые
производные ИТМ являются перспективными соединениями для разработки на их
основе новых эффективных вазопрессорных и противошоковых средств, способных
создать новые возможности фармакотерапии гипотонических расстройств, особенно при
оказании экстренной, неотложной помощи и при лечении критических состояний.
Проведение
детальных
доклинических
исследований
наиболее
эффективных
соединений, в первую очередь, соединения Т-1059, является вполне обоснованным и
целесообразным.
133
ГЛАВА 5 ИССЛЕДОВАНИЕ РАДИОЗАЩИТНЫХ СВОЙСТВ ИЗУЧАЕМЫХ
N,S-ЗАМЕЩЁННЫХ ИТМ
Способность солей некоторых S-монозамещѐнных производных ИТМ (в первую
очередь - S-метил/этил/аминоэтил-ИТМ) к противолучевому действию была изучена
ещѐ в 1960-80 годах [Жеребченко П.Г., 1968; Ильюченок Т.Ю., 1972; Голощапова Ж.А.,
1981]. После открытия биологической роли оксида азота было показано, что эти
производные ИТМ проявляют высокую NOS-ингибирующую активность [Garvey E.P.,
1994; Southan G.J., 1996; Wolff D.J., 1997]. В последующих исследованиях было
установлено, что многие известные радиопротекторы в той или иной степени подавляют
эндогенный синтез оксида [Garvey E.P., 1994; Southan G.J., 1996; Проскуряков С.Я.,
Филимонова М.В., 2003], а тромбоспондин-1, блокирующий функцию eNOS, некоторые
ингибиторы NOS и химические перехватчики NO обладают радиозащитным действием
[Liebmann J., 1994; Гильяно Н.А., 2004, 2005; Gadhi N.M., 2004; Проскуряков С.Я.,
2005б; Коноплянников А.Г., 2007; Isenberg J.S., 2008; Maxhimer J.B., 2009; Sharmaa D.,
2010]. В целом, полученные данные свидетельствуют в пользу того, что ингибиторы
NOS могут являться перспективной областью для поиска и разработки новых
эффективных радиозащитных и радиомодифицирующих фармакологических средств.
Вместе с тем, эти данные позволяют лишь предполагать возможные механизмы
повышения радиорезистентности при воздействии на обмен оксида азота, поскольку NO
отличается крайне широким и многоплановым участием в различных физиологических
и патологических процессах (см. раздел 1.3), и роль NOS-ингибирующей активности в
развитии противолучевого действия остаѐтся не совсем ясной.
5.1 Радиозащитные свойства и NOS-ингибирующая активность
производных ИТМ
Для оценки роли ингибирования NOS при реализации радиозащитного действия
производных ИТМ было проведено сравнительное исследование NOS-ингибирующей и
противолучевой
активности
в ряду S-[2-алкил(арил)сульфонил]-производных
S-
этил(винил)-ИТМ [Филимонова М.В., 2012], методы синтеза которых были ранее
разработаны в ФГБУН «Институт органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН».
С этой целью в лаборатории радиационной фармакологии МРНЦ им. А.Ф. Цыба
были исследованы 17 химических соединений общих формул (5.1-5.2):
134
(5.1)
где
R1 = CH3-SO2; C2H5-SO2; Ph-SO2; CH3-Ph-SO2; C2H5-SO; C2H5-S;
R2 = Br; Cl; CH3-Ph-SO3.
(5.2)
где
R1 = CH3-SO2; н-C3H7-SO2; и-C3H7-SO2; н-C4H9-SO2; н-C8H17-SO2;
R2 = Br; CH3-Ph-SO3.
Исходной «точкой» этого химического ряда является S-этил-ИТМ, которая
проявляет
высокую
NOS-ингибирующую,
вазопрессорную
и
противолучевую
активность [Garvey E.P., 1994; Голощапова Ж.А., 1981], в которую дополнительно
включалась в S-замещающий радикал S-этил(винил)-ИТМ алкил(арил)сульфонильная
группа.
Результаты исследований обобщены в таблице 5.1, где приведены данные
химического строения исследованных соединений, показатели их острой токсичности,
30-суточной выживаемости белых аутбредных мышей самцов массой тела 20-22 г (10-15
особей в группе), которым перед -облучением в дозе 10 Гр вводили испытуемые
вещества. Методом ЭПР-спектрометрии оценивали содержание NO в печени
необлучѐнных самцов мышей-гибридов F1 (CBA×C57BL6j) массой тела 20-22 г после
введения ЛПС E.Coli в дозе 2 мг/кг и получавших изучаемые соединения в
«радиозащитных» дозах (5-7 особей в группе). Выбор дозы соединений определялся
токсичностью и в большинстве случаев составлял 1/3-1/2 ЛД50. В качестве препаратов
сравнения использовали дифетур (диэтилфосфат S-этил-ИТМ) и аминотиольные
радиопротекторы – цистамина дигидрохлорид и амифостин.
Установлено,
что
большая
часть
исследованных
соединений
оказывала
достоверное радиозащитное действие. Однако, хотя противолучевой эффект некоторых
из них (производные ЭИТМ-8 и ВИТМ-1) был вполне сопоставим с действием
цистамина, амифостина и дифетура, в целом, введение в структуру S-этил(винил)-ИТМ
дополнительной серосодержащей группы не повышало радиозащитных свойств
соединений. Противолучевая активность снижалась, как при замене -SO2- группы на
-SO- и -S- группы, так и с ростом величины алкильного радикала.
135
Таблица 5.1 - Химическая структура исследованных S-замещѐнных ИТМ формул
(5.1-5.2), показатели токсичности, противолучевой и NOS-ингибирующей активности
Группа,
соединение
R1
R2
ЛД50,
мг/кг
Контроль
Дифетур
Амифостин
Цистамин
Доза,
мг/кг
30-суточная
выжив., %
Продукция
NO, % 1
150
270
225
2,2
45 *
55 *
53 *
2,2
39,3
62,5
S-[2-алкил(арил)сульфонил]-производные этилизотиурония формулы (3.3)
ЭИТМ-1
ЭИТМ-2
ЭИТМ-3
CH3-SO2
C2H5-SO2
C2H5-SO2
Br
Br
Cl
277
220
213
ЭИТМ-4
Ph-SO2
Br
145
ЭИТМ-5
Ph-SO2
Cl
129
ЭИТМ-6
Ph-SO2
CH3-Ph-SO3
246
ЭИТМ-7
CH3-Ph-SO2
Br
193
ЭИТМ-8
ЭИТМ-9
CH3-Ph-SO2
C2H5-SO
Cl
Br
167
270
ЭИТМ-10
C2H5-SO
Cl
232
ЭИТМ-11
C2H5-S
Cl
103
152
130
120
175
60
106
64
100
170
190
135
190
115
155
160
115
140
60
75
35 *
40 *
30 *
45 *
30 *
40 *
20
40 *
30 *
40 *
30 *
40 *
55 *
0
10
10
10
0
0
27,0
19,6
39,1
8,4
24,2
18,6
27,3
21,7
25,2
18,9
28,4
16,8
3,3
84,0
72,5
75,7
63,3
78,5
71,2
S-[2-алкил(арил)сульфонил]-производные винилизотиурония формулы (3.4)
ВИТМ-1
C2H5-SO2
Br
63
ВИТМ-2
ВИТМ-3
ВИТМ-4
ВИТМ-5
ВИТМ-6
C2H5-SO2
н-C3H7-SO2
и-C3H7-SO2
н-C4H9-SO2
н-C8H17-SO2
CH3-Ph-SO3
CH3-Ph-SO3
CH3-Ph-SO3
CH3-Ph-SO3
CH3-Ph-SO3
57
65
59
72
75
Примечания:
39
45
34
38
35
43
45
40 *
50 *
40 *
30 *
10
15
20
14,4
4,9
7,6
12,2
28,1
56,1
54,1
1
– относительно содержания NO в печени животных, получавших только
ЛПС;
*
– статистически значимое различие (p<0,05) с контролем по точному
критерию Фишера.
Все исследованные соединения формул (5.1-5.2) также в той или иной степени
подавляли эндогенный синтез оксида азота и во всех случаях повышение их дозы
136
усиливало подавление продукции NO. Однако, как и ожидалось (см. разделы 1.4 и 3.1),
увеличение S-алкильного радикала дополнительной серосодержащей группой ослабляло
NOS-ингибирующую активность производных ИТМ – большая часть исследованных
соединений снижала содержание NO в печени подопытных животных существенно
слабее, чем исходная S-этил-ИТМ (в данном случае – дифетур).
Сопоставление использованных в этих опытах показателей, отражающих NOSингибирующую и противолучевую активность, показало, что в ряду исследованных Sзамещѐнных производных ИТМ наблюдается статистически значимая корреляция
между
ними
–
производные
ИТМ,
обладающие
высокой
способностью
к
ингибированию NOS, проявляли и большую противолучевую активность (рисунок 5.1).
Рисунок 5.1 – Взаимосвязь между показателями NOS-ингибирующей и противолучевой
активности в ряду исследованных соединений (пояснения даны в тексте).
R – коэффициент корреляции Спирмена по данным для S-монозамещѐнных ИТМ.
Однако данная взаимосвязь имела отчѐтливый характер только для производных
ИТМ. Так, дифетур, являющийся диэтилфосфорной солью S-этил-ИТМ, полностью
«укладывался» в эту закономерность, но для аминоалкилтиолов наблюдалась иная
картина – цистамин и амифостин в дозах, обеспечивавших в этих опытых 50-55%-ную
выживаемость
активность.
подопытных
животных,
проявляли
слабую
NOS-ингибирующую
137
Полученные результаты свидетельствуют в пользу того, что, в отличие от
аминотиолов, в развитии противолучевого действия
S-алкилзамещѐнных ИТМ
принципиальную роль играет ингибирование этими соединениями биогенного синтеза
оксида азота. Причѐм радиозащитные свойства, судя по всему, способны проявлять не
только эффективные ингибиторы NOS из класса производных ИТМ, но и ингибиторы
NOS других химических классов, что подтверждается данными о противолучевой
активности ряда гуанидиновых ингибиторов NOS – L-NNA, L-NAME, аминогуанидина
[Libmann J., 1994; Jordan B.F., 2004; Гильяно Н.А., 2004, 2005; Sharmaa D., 2010].
Таблица 5.2 - Влияние изучаемых N,S-замещѐнных производных ИТМ на 30-суточную
выживаемость самцов мышей-гибридов F1 (CBA×C57BL6j) при воздействии -излучения
в дозе 10 Гр
№ опыта
I
Группа, соединение
число животных
Контроль
Цистамин
Т-1004
Т-1006
Т-1023
Т-1032
II
Примечание:
Контроль
Цистамин
Т-1020
Т-1049
n = 15
n = 15
n = 14
n = 15
n = 14
n = 15
n = 11
n = 14
n = 15
n = 14
n = 14
n = 15
n = 15
n = 14
n = 14
n = 15
n = 14
Доза, мг/кг
Выживаемость, %
225
21
41
120
20
40
120
40
82
120
40
150
0
53 *
0
47 *
36 *
27
18
64 *
20
100 *
100 *
20
80 *
225
135
220
0
93 *
53 *
71 *
*
- статистически значимое различие (p<0,05) с контролем по точному
критерию Фишера.
В этой связи можно было ожидать наличие радиозащитных свойств и у
изучаемых N-ацил-S-алкил-замещѐнных производных ИТМ, проявляющих высокую
NOS-ингибирующую активность, что в полной мере подтвердили результаты
138
скрининговых исследований – практически все исследованные соединения оказывали
противолучевое действие.
Как показано в таблицах 5.2 и 5.3, однократное внутрибрюшинное введение
изучаемых N,S-замещѐнных производных ИТМ в дозах 1/6-1/3 ЛД50 за 15-20 минут до
лучевого воздействия статистически значимо повышало выживаемость подопытных
животных и выживаемость клоногенных гемопоэтических клеток при воздействии излучения.
Таблица 5.3 - Влияние изучаемых N,S-замещѐнных производных ИТМ на число
селезѐночных эндоколоний у самцов мышей-гибридов F1 (CBA×C57BL6j) на 9 сутки
после воздействия -излучения в дозе 6 Гр
№ опыта
I
II
III
Группа, соединение,
число животных
Контроль
Цистамин
Дифетур
Т-1004
Т-1006
Т-1023
Т-1032
n = 14
n = 14
n = 13
n = 14
n = 14
n = 14
n = 14
Контроль
Цистамин
Дифетур
Т-1019
Т-1020
Т-1049
Т-1058
n = 14
n = 13
n = 13
n = 14
n = 14
n = 14
n = 14
Контроль
Цистамин
Т-1023
Т-1059
Т-1064
n = 15
n = 14
n = 15
n = 15
n = 14
Доза, мг/кг
КОЕ-С-9
(M±)
225
200
120
120
120
150
4,8 ± 1,1
14,6 ± 4,1 *
11,6 ± 4,9 *
19,1 ± 7,1 *
12,6 ± 4,7 *
15,9 ± 3,7 *
11,1 ± 4,0 *
225
200
140
135
220
100
5,6 ± 1,7
15,4 ± 4,7 *
11,3 ± 3,8 *
9,4 ± 1,8 *
12,4 ± 4,2 *
12,3 ± 4,3 *
6,7 ± 3,1
225
130
120
220
5,1 ± 2,3
19,8 ± 6,7 *
28,5 ± 7,8 *
16,3 ± 4,2 *
10,4 ± 1,6 *
Примечание: * - статистически значимое различие (p<0,05) с контролем
по критерию Данна.
Наиболее стабильное и выраженное радиозащитное действие
в
этих
исследованиях проявляло соединение Т-1023, которое уже в дозе 1/5 ЛД50 обладало
высокой противолучевой эффективностью. В целом же, в ряду исследованных N-ацилS-алкил-замещѐнных производных ИТМ также прослеживалась связь между NOS-
139
ингибирующей и противолучевой активностью, аналогичная взаимосвязи, выявленной
для S-замещѐнных ИТМ. Слабые ингибиторы NOS (соединения Т-1019, Т-1058, Т-1064)
проявляли умеренное, порой недостоверное радиозащитное действие. И, наоборот,
активные ингибиторы NOS (соединения Т-1004, Т-1006, Т-1020, Т-1023, Т-1032, Т-1049
и Т-1059) обеспечивали противолучевую защиту, не уступая, а иногда и превосходя в
эффективности действие цистамина и S-этилизотиурония диэтилфосфата (дифетура),
которые применялись в максимально переносимых дозах (1/2 ЛД50).
Наблюдаемая
взаимосвязь
между
и
NOS-ингибирующей
противолучевой
активностью производных ИТМ, а также наличие у них выраженных вазопрессорных
свойств, которые для N-ацил-S-алкил-замещѐнных ИТМ показаны в разделе 4,
позволяют предполагать, что основным механизмом противолучевого действия
соединений этого химического класса является индукция циркуляторной и тканевой
гипоксии. В настоящее время известно достаточно большое число вазоактивных
радиопротекторов,
преимущественно,
индолилалкиламинов,
обладающих
таким
механизмом действия [Саксонов П.П., 1976; Владимиров В.Г., 1989; Васин М.В., 2010;
Ильин Л.А., 2012]. Такие соединения взаимодействуют с серотониновыми рецепторами
(серотонин,
мексамин
и
другие
производные
окситриптамина)
или
α 1-
адренорецепторами (индралин). Введение эти средств в высоких, радиозащитных дозах
вызывает резкое повышение тонуса сосудов, что прямо или рефлекторно ослабляет
периферический кровоток и способствует развитию гипоксии [Жеребченко П.Г., 1963.
Машковский М.Д., 1963, 1967; Yildiz O., 1998; Васин М.В., 2001, 2013; Earley S., 2013].
С
целью
уточнения
производных ИТМ
были
механизма
проведены
противолучевого
исследования
действия
влияния
на
изучаемых
гемодинамику
нормотензивных животных «радиозащитных» доз этих соединений [Филимонова М.В.,
2014]. Результаты показали, что эти соединения в дозах 1/5-1/6 ЛД16, введѐнные
однократно, оказывали на гемодинамику влияние сходное с тем, которое они оказывали
в дозах 1/25 ЛД16 (см. раздел 4.1), но наблюдались и существенные отличия.
140
Таблица 5.4 – Влияние соединения Т-1059 в дозе 40 мг/кг (~1/6 ЛД16) на гемодинамику наркотизированных нормотензивных
крыс Wistar (%; M±) *
Время после
введения, минуты;
число животных
АДС
АДД
Исходно
n=8
100,0
100,0
2;
5;
10;
20;
30;
40;
50;
60;
70;
80;
90;
100;
110;
120;
n=8
n=8
n=8
n=8
n=8
n=8
n=8
n=8
n=8
n=8
n=8
n=8
n=8
n=8
119,4 ± 3,2 1
123,7 ± 3,9 1
115,5 ± 2,1 1
105,7 ± 2,4
104,8 ± 2,3
102,6 ± 2,3
97,4 ± 2,8
92,5 ± 2,7 1
90,7 ± 3,1 1
89,4 ± 3,2 1
88,7 ± 3,2 1
89,3 ± 2,9 1
91,3 ± 2,8 1
92,3 ± 3,1 1
118,9 ± 4,8 1
121,4 ± 5,2 1
120,7 ± 3,1 1
119,2 ± 2,8 1
118,1 ± 2,4 1
112,3 ± 3,0 1
113,9 ± 2,5 1
111,2 ± 2,6 1
110,8 ± 2,8 1
111,6 ± 3,21
109,3 ± 3,4 1
110,3 ± 2,6 1
109,1 ± 2,4 1
109,5 ± 2,9 1
Примечания:
*
ЧСС
УПСС
100,0
100,0
Т-1059 40 мг/кг в/б
82,4 ± 2,7 1
82,9 ± 3,0 1
81,2 ± 3,5 1
81,6 ± 3,2 1
82,8 ± 2,6 1
83,5 ± 2,8 1
82,6 ± 2,9 1
81,7 ± 3,2 1 2
81,6 ± 3,0 1 2
80,2 ± 3,0 1 2
80,6 ± 2,8 1 2
82,0 ± 2,1 1 2
82,6 ± 2,4 1 2
УО
СИ
ЧДД
100,0
100,0
100,0
187,4 ± 16,3 1 2
87,3 ± 5,2 1 2
71,8 ± 11,3 1 2
185,4 ± 16,7 1 2
85,2 ± 6,6 1 2
72,1 ± 12,3 1 2
174,0 ± 17,1 1 2
81,3 ± 6,3 1 2
65,2 ± 9,2 1 2
180,1 ± 18,1 1 2
84,6 ± 7,1 1 2
67,4 ± 10,6 1 2
106,8 ± 9,1
105,2 ± 10,3
103,9 ± 18,8
103,4 ± 7,3
99,7 ± 6,4
103,3 ± 8,4
104,0 ± 7,5
102,7 ± 8,8
101,3 ± 8,9
101,9 ± 7,0
103,3 ± 7,9
102,2 ± 7,3
102,5 ± 6,9
- данные нормированы на исходные значения показателей;
– статистически значимое различие (p<0,05) с исходным значением показателя по критерию Даннета;
2
– статистически значимое различие (p<0,05) с соответствующим значением при дозе 10 мг/кг (таблица 4.1) по
критерию Манна-Уитни.
1
141
Таблица 5.5 – Влияние соединения Т-1023 в дозе 60 мг/кг (~1/5 ЛД16) на гемодинамику наркотизированных нормотензивных
крыс Wistar (%; M±) *
Время после
введения, минуты;
АДС
АДД
ЧСС
УПСС
УО
СИ
ЧДД
число животных
Исходно
n=8
100,0
100,0
2;
5;
10;
20;
30;
40;
50;
60;
70;
80;
90;
100;
110;
120;
n=8
n=8
n=8
n=8
n=8
n=8
n=8
n=8
n=8
n=8
n=8
n=8
n=8
n=8
129,1 ± 6,1 1
123,7 ± 4,2 1
108,9 ± 5,3
102,4 ± 3,5
94,7 ± 3,1
90,6 ± 2,1 1
87,4 ± 2,9 1
87,7 ± 2,8 1
86,7 ± 3,2 1
87,1 ± 3,2 1
86,8 ± 2,9 1
86,1 ± 3,1 1
87,8 ± 2,7 1
90,8 ± 3,1 1
124,7 ± 4,1 1
121,0 ± 4,2 1
117,5 ± 3,8 1
115,8 ± 2,8 1
114,8 ± 2,6 1
111,1 ± 3,1 1
109,0 ± 2,9 1
111,6 ± 2,5 1
109,4 ± 2,7 1
110,6 ± 2,8 1
109,4 ± 3,1 1
106,6 ± 2,8
103,1 ± 2,3
99,5 ± 2,6
Примечания:
*
100,0
100,0
Т-1023 60 мг/кг в/б
81,6 ± 3,7 1 2
72,1 ± 5,0 1 2
74,3 ± 5,3 1 2
75,1 ± 5,2 1 2
74,9 ± 6,6 1 2
73,6 ± 6,8 1 2
74,7 ± 7,9 1 2
75,8 ± 6,2 1
77,6 ± 5,6 1
81,6 ± 8,3 1
83,2 ± 7,2 1
87,9 ± 6,5 1
90,6 ± 6,6
100,0
100,0
181,6 ± 12,5 1 2
78,8 ± 7,3 1 2
63,0 ± 10,5 1 2
172,6 ± 12,7 1 2
75,7 ± 7,5 1 2
59,5 ± 11,3 1 2
174,8 ± 13,0 1
79,9 ± 7,2 1
56,2 ± 10,3 1
114,3 ± 12,7
97,7 ± 6,2
88,5 ± 9,6
100,0
102,6 ± 7,7
99,5 ± 7,0
101,1 ± 7,3
99,0 ± 8,2
97,4 ± 7,3
96,3 ± 7,1
101,8 ± 8,1
97,4 ± 8,0
97,9 ± 7,9
101,7 ± 7,6
102,7 ± 5,2
100,2 ± 6,3
100,6 ± 7,2
- данные нормированы на исходные значения показателей;
– статистически значимое различие (p<0,05) с исходным значением показателя по критерию Даннета;
2
– статистически значимое различие (p<0,05) с соответствующим значением при дозе 10 мг/кг (таблица 4.2) по
критерию Манна-Уитни.
1
Как показано в таблице 5.4, после внутрибрюшинного введения соединения
Т-1059 в дозе 40 мг/кг (~1/6 ЛД16) у подопытных нормотензивных крыс наблюдалось
значительное и длительное повышение периферического сопротивления сосудов.
Прессорное действие Т-1059 в этой дозе было достоверно выше, чем в дозе 10 мг/кг:
если при дозе 10 мг/кг УПСС было повышено на 30-45% в течение 90 минут, то при дозе
40 мг/кг этот показатель был повышен на 75-85% в течение всего срока наблюдения. В
первые минуты наблюдался умеренный, достоверный гипертензивный эффект: АДД и
АДС повышены на 12-25% в течение первых 10 минут. В дальнейшем на фоне
брадикардии АДС прогрессивно снижалось и с 60 минуты наблюдалась умеренная
гипотония – АДС на 10-12% ниже исходного, при повышенном АДД и УПСС.
Принципиальным же являлось то, что гипертензивный эффект Т-1059 в дозе 40
мг/кг не только вызывал брадикардию, как в дозе 10 мг/кг, но сопровождался
снижением УО – в течение всего эксперимента у подопытных животных наблюдалось
достоверное снижение этого показателя на 15-20%. И, если при дозе Т-1059 10 мг/кг
значимого изменения СИ не наблюдалось, то в дозе 40 мг/кг это соединение уже
значительно ослабляло системный кровоток – показатель СИ у подопытных животных
был достоверно понижен на 30-35% от исходного уровня в течение всего наблюдения.
Сходное влияние на гемодинамику нормотензивных животных оказывало и
соединение Т-1023 (таблица 5.5). Однократное введение этого соединения в высокой
дозе (60 мг/кг; 1/5 ЛД16) также сопровождалось более выраженным вазопрессорным
действием: если при дозе 10 мг/кг УПСС подопытных животных было повышено на
35% в первые 30 минут, то при дозе 60 мг/кг этот показатель был повышен на 70-80% в
течение 90 минут после введения препарата. Гипертензивный эффект в высокой дозе Т1023 также сопровождался не только замедлением сердечного ритма, но и ослаблением
насосной функции сердца – у подопытных животных был статистически значимо
понижен УО на 20-25% в течение первых 90 минут после введения препарата. В эти же
сроки наблюдалось и значительное ослабление системного кровотока – сердечный
индекс (СИ) был статистически значимо снижен на 40-45% относительно исходного
уровня. Через 90 минут после введения Т-1023 в дозе 60 мг/кг все изменѐнные
показатели самостоятельно нормализовались по мере ослабления прессорного влияния.
В этих условиях значительное и продолжительное снижение СИ, развивающееся
при введении высоких доз изучаемых соединений пропорционально снижает и доставку
143
кислорода (DO2) в периферические ткани [Антонов А.А., 2004]. Между тем, реальная
степень снижения pO2 в тканях под влиянием ингибиторов NOS может существенно
превышать уровень ослабления транспорта кислорода. Известно, что NO, нитрозилируя
гемовое железо митохондриальных цитохромов, снижает их активность [Осипов А.Н.,
2007; Brown G.C., 2007; Taylor C.T., 2010; Groschner L.N., 2012]. В этой связи
подавление
синтеза
оксида
азота
при
воздействии
ингибитора
NOS
может
неспецифически стимулировать клеточное дыхание, что в условиях дефицита доставки
O2 будет углублять тканевую гипоксию.
Косвенным
подтверждением
гипоксического
механизма
противолучевого
действия изучаемых производных ИТМ является сходство влияния на гемодинамику
нормотензивных животных этих соединений и серотонина
- «классического»
гипоксического радиопротектора. Серотонин в радиозащитных дозах вызывает
аналогичную двухфазную реакцию – кратковременный гипертензивный эффект, а в
дальнейшем – развитие гипотонии на фоне брадикардии и повышенного сосудистого
тонуса [Саксонов П.П., 1976; Васин М.В., 2010].
Предположение о гипоксическом механизме радиозащитного действия изучаемых
N,S-замещѐнных
ИТМ
объясняет
существенное
различие
противолучевой
эффективности соединений Т-1023 и Т-1059, которое наблюдалось в скриниговых
исследованиях (см. таблицу 5.3). Хотя соединение Т-1059 почти в 2 раза превосходит Т1023 в NOS-ингибирующей активности (см. раздел 3.4), соединение Т-1023 в высокой
дозе, вероятно, в силу фармакокинетических особенностей, в большей степени
ослабляет системный кровоток нормотензивных животных, чем Т-1059 в подобной дозе.
В этом связи, большая противолучевая эффективность Т-1023 в сравнении с Т-1059
является вполне закономерной.
Таким образом, рассмотренные результаты исследований свидетельствуют, что
алкильные производные ИТМ, в том числе, изучаемые N-ацил-S-алкил-замещѐнные
производные
вазоактивными
ИТМ,
обладающие
радиопротекторами,
NOS-ингибирующей
временно
активностью,
повышающими
являются
резистентность
биологических объектов к лучевому воздействию путѐм индукции тканевой гипоксии.
Противолучевое действие по гипоксическому механизму способны проявлять не
только производные ИТМ, но и эффективные ингибиторы NOS других химических
классов. Так, экспериментально показано, что гуанидиновый неселективный ингибитор
144
L-NAME оказывает противолучевое действие путѐм индукции гипоксии костного мозга
[Liebmann J., 1994], а позднее было уточнено, что снижение pO2 в тканях при
воздействии
L-NAME
развивается
вследствие
ингибирования
эндотелиальной
изоформы NOS [Jordan B.F., 2004].
Наряду с ограничением индуцированного радиацией образования активных форм
кислорода вследствие снижения pO2 в биологических тканях, в радиозащитное действие
ингибиторов NOS определѐнный вклад может вносить и снижение выхода активных
форм азота, в частности, пероксинитрит-аниона [Гильяно Н.Я., 2004, 2005; Замулаева
И.А., 2007; Трофимова Т.П., 2009; Calcerrada P., 2011; Oronsky B.T., 2012]. Однако такое
влияние, скорее всего, будет значимо затрагивать ткани, активно экспрессирующие
iNOS, поскольку при концентрациях оксида азота, которые создаются конститутивными
изоформами NOS, выход ONOO- даже на фоне радиационного воздействия чрезвычайно
низок [Leach J.K., 2002], а сам NO в таких концентрациях ведѐт себя в большей степени
как антиоксидант и ингибитор свободно-радикальных процессов [Keynes R.G., 2005;
Hummel S.G., 2006]. Видимо, по этой причине в опытах in vitro аминогуанидин и LNAME проявляют радиозащитное действие только в отношении далеко не всех
клеточных культур [Гильяно Н.Я., 2004, 2005].
5.2 Показатели противолучевой активности и особенности радиозащитного
действия изучаемых N,S-замещѐнных ИТМ
Как показано в разделе 5.1, в скрининговых исследованиях радиозащитных
свойств
изучаемых
производных
ИТМ
наиболее
выраженную
и
стабильную
противолучевую активность проявляло соединение Т-1023. В этой связи, с целью
оценки перспективности практического применения изучаемых N-ацил-S-алкилзамещѐнных производных ИТМ в качестве радиозащитных и радиомодифицирующих
средств, было проведено детальное исследование особенностей противолучевой
активности этого вещества.
Определение оптимальных радиозащитных доз и терапевтической широты Т-1023
Исследование зависимости 30-суточной выживаемости мышей F1 (CBA×C57BL6j),
облучѐнных летальными дозами -излучения, от дозы соединения Т-1023 (в диапазоне
1/8-2/3
ЛД16),
вводимого
перед
облучением,
показало
существенное
отличие
145
противолучевой активности этого производного ИТМ от действия существующих
аминоалкилтиоловых радиопротекторов.
Рисунок 5.2 - Зависимость 30-суточной выживаемости самцов мышей-гибридов F1
(CBA×C57BL6j) от дозы соединения Т1023 при воздействии -излучении в дозе 10 Гр
(объединѐнные данные 5 экспериментов). Символом * отмечены показатели,
статистически значимо отличные (p<0,05) от контроля по точному критерию Фишера
(в группах по 15-45 мышей).
Известно, что аминотиоловые радиозащитные средства, такие как цистамин,
цистеамин, амифостин, проявляют стабильное эффективное противолучевое действие
только при их применении в дозах, близких к максимально переносимым [Саксонов
П.П., 1976; Владимиров В.Г., 1989; Васин М.В., 2010; Ильин Л.А., 2012; Hosseinimehr
S.J., 2007; Copp R.R., 2013; Рождественский Л.М., 2013]. Однако соединение Т-1023
проявляло высокое противолучевое действие уже при дозах 65-85 мг/кг (~1/4 ЛД16), а
дальнейшее повышение дозы Т-1023 в этих опытах не только не повышало, но и
сопровождалось тенденцией к ослаблению радиозащитного эффекта (рисунок 5.2).
Способность соединения Т-1023 в низких дозах оказывать эффективное
радиозащитное действие подтвердили и результаты исследований зависимости
выживаемости гемопоэтических клоногенных клеток костного мозга мышей F1 от дозы
Т-1023 при воздействии -излучения в дозе 5 Гр по тесту селезѐночных экзоколоний.
146
Как показано на рисунке 5.3, в этом случае противолучевое действие соединения Т-1023
достигало максимума в дозе 75 мг/кг (1/4 ЛД16) и при дальнейшем увеличении дозы
оставалось неизменным.
Рисунок 5.3 - Зависимость выживаемости гемопоэтических клоногенных клеток самцов
мышей-гибридов F1 (CBA×C57BL6j) от дозы соединения Т1023 при воздействии
-излучения в дозе 5 Гр (метод экзоколоний). Символом * отмечены показатели,
статистически значимо отличные (p<0,05) от контроля (значение при D=0) по критерию
Даннета (в каждой группе по 5 мышей-доноров и 12 мышей-реципиентов).
Таким образом, результаты этих исследований показали, что соединение Т-1023
проявляет высокую противолучевую эффективность уже в дозе 1/4 ЛД16. При
дальнейшем повышении дозы Т-1023 эффективное радиозащитное действие в
отношении костного мозга сохраняется, однако в дозах 1/2 ЛД16 и выше это вещество,
возможно, способно осложнять течение костномозговой формы острой лучевой болезни.
Следовательно, доза Т-1023 75 мг/кг (1/4 ЛД16) является для мышей оптимальной
радиозащитной дозой.
Минимальная доза соединения Т-1023, при которой наблюдался достоверный
радиозащитный эффект у мышей, в обоих опытах составила 40 мг/кг. Сопоставление
этой дозы с максимально переносимой дозой (ЛД10), которая, как показано в разделе 3.3,
для Т-1023 составляет 224 мг/кг, свидетельствует, что, как радиопротектор это вещество
147
имеет высокую терапевтическую широту, которая для данного вида животных
составила 5,5.
Показатели противолучевой эффективности Т-1023
В качестве показателя противолучевой эффективности использован фактор
изменения дозы (ФИД). Этот показатель оценивали для оптимальной радиозащитной
дозы Т-1023 (75 мг/кг) по 30-суточной выживаемости самцов мышей-гибиридов F1
(CBA×C57BL6j) и выживаемости гемопоэтических клоногенных клеток (по методу
экзоколоний) при воздействии -излучения.
В таблице 5.6 приведены данные 30-суточной выживаемости контрольных
животных и животных, получавших перед облучением Т-1023 в дозе 75 мг/кг, при
воздействии среднелетальных доз -излучения. Рассчѐт ЛД50 -излучения по этим
данным, проведѐнный методом пробит-анализа по Литчфилду-Уилкоксону, дал
следующие оценки: для контрольных животных – 7,13 (6,62÷7,64) Гр; для подопытных
животных – 10,22 (9,61÷10,93) Гр. Рассчитанный по ЛД50 показатель ФИД для
оптимальной радиозащитной дозы Т-1023 составил – 1,44 (1,26÷1,65).
Таблица 5.6 - Радиозащитное действие соединения Т-1023 по показателям 30-суточной
выживаемости самцов мышей-гибиридов F1 (CBA×C57BL6j)
при воздействии -излучения
Доза -излучения, Гр
6
7
8
9
10
11
Выживаемость, %
Контроль
100,0 (15/15)
53,3 (8/15)
20,0 (3/15)
0 (0/15)
Т1023, 75 мг/кг
100,0 (15/15)
93,3 (14/15)
93,3 (14/15)
66,7 (10/15)
20,0 (3/15)
Несколько большие, но менее точные оценки ФИД -излучения для вещества Т1023 в дозе 75 мг/кг были получены при регрессионном анализе данных двух
независимых опытов по выживаемости гемопоэтических клоногенных клеток у самцов
мышей-гибиридов F1 (CBA×C57BL6j) (таблица 5.7). По данным первого опыта оценки
148
ЛД50 -излучения для этих клеток составила: у контрольных животных - 0,63 (0,55÷0,72)
Гр; у подопытных животных – 1,14 (0,93÷1,31) Гр, и показатель ФИД по ЛД50 составил
1,81 (1,29÷2,38). По данным воторого опыта оценки ЛД50 -излучения для этих клеток
составила: у контрольных животных - 1,07 (0,88÷1,34) Гр; у подопытных животных –
1,67 (1,62÷1,71) Гр, и показатель ФИД по ЛД50 составил 1,56 (1,21÷1,94).
Таблица 5.7 - Выживаемость клоногенных клеток костного мозга контрольных и
подопытных самцов мышей-гибиридов F1 (CBA×C57BL6j) при воздействии -излучения
и Т1023 (метод экзоколоний*)
Выживаемость, % (M±)
№ опыта
Доза -облучения, Гр
I
0,25
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
73,1 ± 4,9
59,3 ± 6,9
29,9 ± 6,5
20,9 ± 4,8
13,3 ± 3,7
0,25
0,75
1,25
1,5
1,75
2,0
2,25
2,5
98,3 ± 7,6
61,2 ± 5,3
43,8 ± 5,1
II
Контроль
33,5 ± 6,4
24,7 ± 4,9
Т1023, 75 мг/кг
91,0 ± 8,1
52,2 ± 6,3
40,5 ± 7,2
25,4 ± 6,9
14,2 ± 4,5
67,5 ± 5,5
53,0 ± 5,0
44,6 ± 5,1
39,9 ± 4,6
35,4 ± 4,9
30,3 ± 4,7
Примечание: * - в каждой группе 5 мышей-доноров и 12 мышей-реципиентов.
Полученные данные свидетельствуют о способности соединения Т-1023
обеспечивать эффективное радиозащитное действие. При этом уровень количественных
показателей противолучевой эффективности Т-1023 позволяет рассматривать это
соединение как перспективную основу для создания нового радиопротектора
экстренного действия [Хабриев Р.У., 2005; Владимиров В.Г., 1989].
149
Особенности совместного применения Т-1023 с радиопротекторами других классов
Сложность и многоплановость процессов развития лучевого поражения, и
отличие механизмов действия различных радиопротекторов создают потенциальную
возможность для их фармакодинамического взаимодействия. В этой связи, для
детальной оценки радиозащитных свойств ингибиторов NOS было проведено
исследование противолучевой эффективности сочетанного применения соединения
Т-1023 с некоторыми известными радиопротекторами.
В этих опытах проводилось сравнительное изучение влияния соединения Т-1023 в
сочетании с цистамином, серотонином, мексамином и индралином на выживаемость
эндогенных клоногенных клеток костного мозга мышей-гибиридов F1 (CBA×C57BL6j)
при воздействии -излучения в дозе 6 Гр. Изучаемые соединения вводили
внутрибрюшинно за 15-20 минут до облучения. При сочетанном применении
соединения вводили с интервалом в 15-20 минут, а облучение проводили через 10-15
минут после последней инъекции. Каждая экспериментальная группа состояла из 12-15
мышей.
Цистамин. Большинство известных радиопротекторов экстренного действия
обладают вазоактивным действием. Цистамин и цистеамин, относящиеся к классу
аминотиолов, в этом ряду не являются исключением. Известно, что их введение в
эффективных радиозащитных дозах сопровождается резким снижением тонуса сосудов,
приводящим к развитию глубокой, близкой к шоку, вазодилятационной гипотонии. Этот
эффект большинство авторов связывает, главным образом, со снижением тонуса
сосудодвигательного центра и адренолитическим действием высоких доз аминотиолов,
а также с мобилизацией эндогенных факторов, обладающих сосудорасширяющим
действием, в частности, ацетилхолина и гистамина [Mundy R.L, 1960; Heiffer M.H., 1962;
Ильинский Д.А., 1962; Саксонов П.П., 1976; Владимиров В.Г., 1989].
Исследование противолучевой активности цистамина и соединения Т-1023 при их
раздельном и сочетанном применении показало наличие фармакодинамического
взаимодействия между ними, которое носило отчѐтливый антагонистичный характер.
Как показано в таблице 5.8, последовательное введение этих средств достоверно
снижало радиозащитный эффект в сравнении с противолучевым эффектом при их
раздельном применении. Особенно выраженный антагонизм наблюдался при введении
150
цистамина после инъекции Т-1023 – при этом радиозащитное действие полностью
отсутствовало.
Таблица 5.8 - Влияние соединения Т-1023 и цистамина при их раздельном и сочетанном
применении на число селезѐночных эндоколоний у самцов мышей-гибиридов F1
(CBA×C57BL6j) на 9 сутки после -излучения в дозе 6 Гр.
Опыт № 1
Группа, число животных
Контроль; (n=15)
Опыт № 2
КОЕ-С-9
(M±)
КОЕ-С-9
(M±)
Группа, число животных
4,1 ± 2,3
Контроль; (n=15)
1
3,6 ± 2,0
Цистамин, 150 мг/кг (n=15)
23,5 ± 4,6 1
Т-1023, 90 мг/кг (n=14)
21,4 ± 3,0 1
14,7 ± 2,1 1 2 Цистамин, 150 мг/кг +
Т-1023, 90 мг/кг (n=14)
13,6 ± 2,5 1 2
Цистамин, 150 мг/кг (n=14)
22,5 ± 3,8
Т-1023, 90 мг/кг (n=15)
20,5 ± 3,2 1
Цистамин, 150 мг/кг +
Т-1023, 90 мг/кг (n=15)
Т-1023, 90 мг/кг +
цистамин, 150 мг/кг (n=15)
Примечания:
6,8 ± 2,7 2
1
– статистически значимое различие (p<0,05) с контролем по
критериюДанна;
2
– статистически значимое различие (p<0,05) с группами,
получавшими Т-1023 и цистамин раздельно, по критерию Данна.
Серотонин, мексамин. Прямое влияние серотонина на тонус сосудов отличается
гетерогенностью, что, вероятно, вызвано отличиями спектра серотониновых рецепторов
в различных сосудистых бассейнах. При введении серотонина в эффективных
радиозащитных дозах развивается фазная реакция гемодинамики, подобная той, которая
наблюдается при воздействии изучаемых производных ИТМ (см. раздел 5.1) –
значительное повышение тонуса сосудов, кратковременный гипертензивный эффект и
далее – развитие брадикардии и гипотонии при сохранении высокого сосудистого
тонуса [Саксонов П.П., 1976; Yildiz O., 1998; Васин М.В., 2010; Earley S., 2013].
Исследование противолучевой активности серотонина и соединения Т-1023 при
их
раздельном
и
сочетанном
применении
показало
наличие
выраженного
фармакодинамического взаимодействия между ними (таблица 5.9). В двух опытах
последовательное
введение
этих
средств
статистически
значимо
повышало
радиозащитный эффект в сравнении с противолучевым эффектом при их раздельном
151
применении. Причѐм, во втором опыте было показано, что значительное увеличение
противолучевого эффекта серотонина и Т-1023 достигается и в случае сочетанного
применения меньших доз этих соединений. Особенно эффективным было сочетание
высокой дозы серотонина (150 мг/кг) с минимальной радиозащитной дозой Т-1023 (40
мг/кг).
Таблица 5.9 - Влияние соединения Т-1023 и серотонина при их раздельном и
сочетанном применении на число селезѐночных эндоколоний у самцов мышейгибиридов F1 (CBA×C57BL6j) на 9 сутки после -излучения в дозе 6 Гр.
Опыт № 1
Группа, число животных
Опыт № 2
КОЕ-С-9
(M±)
Группа, число животных
КОЕ-С-9
(M±)
Контроль; (n=15)
2,1 ± 1,1
Контроль; (n=15)
2,3 ± 1,2
Серотонин, 150 мг/кг (n=15)
3,8 ± 1,8
Серотонин, 150 мг/кг (n=15)
9,8 ± 2,3 1
Т-1023, 75 мг/кг (n=15)
7,8 ± 2,5 1
Т-1023, 75 мг/кг (n=14)
7,4 ± 2,1 1
13,6 ± 2,1 1 2 Серотонин, 75 мг/кг +
Т-1023, 75 мг/кг (n=14)
14,0 ± 2,8 1
Серотонин, 150 мг/кг +
Т-1023, 40 мг/кг (n=15)
20,3 ± 3,0 1 2
Серотонин, 150 мг/кг +
Т-1023, 75 мг/кг (n=15)
Примечания:
1
– статистически значимое различие (p<0,05) с контролем по критерию
Данна;
2
– статистически значимое различие (p<0,05) с группами,
получавшими Т-1023 и серотонин раздельно, по критерию Данна.
Аналогичное взаимодействие наблюдалось также между Т-1023 и ближайшим
синтетическим аналогом серотонина – мексамином. Как показано в таблице 5.10,
последовательное введение этих соединений также статистически значимо повышало
радиозащитный эффект в сравнении с противолучевым эффектом при их раздельном
применении. В этом случае также высокая противолучевая эффективность сочетанного
действия мексамина и Т-1023 достигалась и при применении Т-1023 в минимальной
радиозащитной дозе.
152
Таблица 5.10 - Влияние соединения Т-1023 и мексамина при их раздельном и
сочетанном применении на число селезѐночных эндоколоний у самцов мышейгибиридов F1 (CBA×C57BL6j) на 9 сутки после -излучения в дозе 6 Гр.
Группа, число животных
КОЕ-С-9 (M±)
Контроль; (n=14)
1,7 ± 0,9
Мексамин, 20 мг/кг; (n=15)
10,3 ± 1,9 1
Т-1023, 40 мг/кг; (n=14)
7,5 ± 1,4 1
Т-1023, 75 мг/кг; (n=15)
9,8 ± 1,8 1
Мексамин, 20 мг/кг + Т-1023, 75 мг/кг; (n=15)
19,9 ± 3,0 1 2
Мексамин, 20 мг/кг + Т-1023, 40 мг/кг; (n=15)
20,9 ± 2,1 1 2
Примечания:
1
– статистически значимое различие (p<0,05) с контролем по критерию
Данна;
2
– статистически значимое различие (p<0,05) с группами,
получавшими Т-1023 и мексамин раздельно, по критерию Данна.
Индралин. Этот радиопротектор является прямым α1-адреномиметиком и, судя
по данным литературы, в радиозащитных дозах оказывает сильное вазопрессорное
действие, которое приводит к изменениям в гемодинамике, подобным тем, которые
вызывают в таких дозах серотонин и изучаемые производные ИТМ [Васин М.В., 2001,
2010; 2013]. Исследование противолучевой активности индралина и соединения Т-1023
при их раздельном и сочетанном применении также показало наличие выраженного
фармакодинамического взаимодействия между ними (таблица 5.11).
В двух опытах последовательное введение этих соединений достоверно повышало
радиозащитный эффект в сравнении с противолучевым эффектом при их раздельном
применении. Защитный эффект при этом превышал сумму эффектов при раздельном
действии Т-1023 и индралина. Причѐм, значительное увеличение противолучевой
эффективности наблюдалось даже в случае применения с индралином соединения Т1023 в дозе 25 мг/кг, которая самостоятельно не оказывает влияния на выживаемость
облучѐнных животных (см. рисунок 5.2).
В то же время, фармакодинамическое взаимодействие индралина и Т-1023
сопровождалось и повышением токсичности этих соединений. В обоих опытах, в
контрольных группах и группах, получавших раздельно индралин или Т-1023, до конца
экспериментов сохранялась 100%-ная выживаемость животных. Однако, в группах,
153
получавших сочетание этих радиопротекторов, при всех использованных дозах
соединений наблюдалась 20-33%-ная летальность. Гибель животных развивалась на 2-4
сутки после введения этих веществ и лучевого воздействия.
Таблица 5.11 - Влияние соединения Т-1023 и индралина при их раздельном и
сочетанном применении на число селезѐночных эндоколоний у самцов мышейгибиридов F1 (CBA×C57BL6j) на 9 сутки после -излучения в дозе 6 Гр.
Опыт № 1
Группа, число животных
Опыт № 2
КОЕ-С-9
(M±)
Группа, число животных
КОЕ-С-9
(M±)
Контроль; (n=15)
2,0 ± 1,2
Контроль; (n=14)
1,7 ± 0,7
Индралин, 75 мг/кг (n=14)
5,3 ± 1,1 1
Индралин, 40 мг/кг (n=15)
7,4 ± 2,2 1
Т-1023, 75 мг/кг (n=14)
6,8 ± 2,6 1
Т-1023, 40 мг/кг (n=15)
7,5 ± 3,6 1
Индралин, 75 мг/кг +
Т-1023, 75 мг/кг (n=15)
Примечания:
12,8 ± 2,3 1 2 Индралин, 40 мг/кг +
Т-1023, 40 мг/кг (n=15)
20,8 ± 4,0 1 2
Индралин, 40 мг/кг +
Т-1023, 25 мг/кг (n=15)
22,7 ± 3,2 1 2
1
– статистически значимое различие (p<0,05) с контролем по критерию
Данна;
2
– статистически значимое различие (p<0,05) с группами,
получавшими Т-1023 и индралин раздельно, по критерию Данна.
Таким образом, результаты исследований противолучевого действия при
комбинированном применении соединения Т-1023 в сочетании с радиопротекторами
других классов свидетельствуют о наличии существенного фармакодинамического
взаимодействия ингибитора NOS с другими радиозащитными средствами. Характер
этого взаимодействия, по-видимому, определяется сходством или отличиями в
вазотропной активности. Сочетание Т-1023 с аминотиолами, для которых характерно
вазодилятационное действие, сопровождается отчѐтливым антагонизмом, вплоть до
полного подавления противолучевой активности. И, наоборот, значительное увеличение
радиозащитного эффекта наблюдается при сочетании ингибитора NOS с серотонин- и
адренергическими
радиопротекторами,
для
которых
характерно
вазопрессорное
действие. Важно, что значительное повышение противолучевой эффективности таких
радиопротекторов соединение Т-1023 вызывало не только в радиозащитных, но и в 2-3
раза меньших дозах. Эти данные свидетельствуют в пользу того, что ингибиторы NOS
154
могут не только самостоятельно являться эффективными противолучевыми средствами,
но и являться дополнительными компонентами, повышающими эффективность
существующих радиопротекторов экстренного действия.
5.3 Исследование действия производных ИТМ в качестве средств профилактики
осложнений лучевой терапии
Известно, что гипоксия является неспецифическим фактором, снижающим
радиочувствительность биологических тканей [Бутомо Н.В., 2004; Ярмоненко С.П.,
2004]. Вместе с тем, во многих исследованиях показано, что, в связи с несовершенством
сосудистой сети новообразований, в тканях солидных опухолей имеются глубоко
гипоксичные и аноксичные области, в которых pO2 значительно ниже, чем в
немалигнизированных окружающих тканях [Осинский С.П., 2009]. Это различие в
оксигенации
может
во
многом
определять
как
резистентность
опухолей
к
радиационному воздействию, так и высокие риски лучевых поражений нормальных
тканей, способных приводить к развитию тяжѐлых осложнений.
В таких условиях индукция гипоксии может способствовать селективной защите
нормальных тканей при лучевом воздействии, поскольку противолучевой эффект в этом
случае будет развиваться преимущественно в исходно оксигенированных, нормальных
тканях [Prasanna P.G., 2012; Fahl W.E., 2014; Nieder C., 2014]. В этой связи, выявленная
способность изучаемых производных ИТМ создавать условия для развития гипоксии и
оказывать эффективное противолучевое действие явилась основанием для изучения
возможности селективной защиты нормальных тканей и профилактики осложнений
лучевой терапии с помощью этих соединений.
Исследования были проведены совместно с отделом радиационной биофизики
МРНЦ им. А.Ф. Цыба (зав. – доктор биол. наук С.Е. Ульяненко) на самцах крыс Wistar
на моделях лучевой терапии саркомы М-1 [Filimonova M.V., Ulyanenko S.E., 2012],
которая является быстрорастущей, неметастазирующей опухолью крыс и отличается
высокой радиорезистентностью [Гаркуша Н.Ф., 1990]. Животных-опухоленосителей
брали в опыт на 11 сутки после перевивки саркомы, когда опухолевые узлы уже
развились у всех животных и достигали объѐма 0,9-1,2 см3. В опыте использовано шесть
экспериментальных групп по 7-8 особей в каждой. Животные группы негативного
контроля не получали никаких воздействий. Животным позитивного контроля
155
однократно, внутрибрюшинно вводили соединение Т-1023 в дозе 75 мг/кг. Животные
первой и второй опытных групп получали локальное воздействие γ-излучением (60Co) на
конечность c опухолью в дозах 32 и 36 Гр. Животным третьей и четвѐртой опытных
групп за 15-20 мин до облучения внутрибрюшинно вводили Т-1023 в дозе 75 мг/кг и
далее проводили локальное радиационное воздействие в дозах 32 и 36 Гр на конечность
с опухолью как в первой и второй опытной группе. В дальнейшем в различные сроки
проводили оценку роста опухолевых узлов и картины острых лучевых поражений кожи
и еѐ придатков. Клинико-морфологическую тяжесть лучевых повреждений кожи
оценивали
по
классификации
Радиотерапевтической
онкологической
группы
RTOG/EORTC-95 [Wells M., 2003; Cox J.D., 1995; Аклеев А.В., 2014].
Результаты исследований показали, что соединение Т-1023 в дозе 75 мг/кг при
однократном введении животным-опухоленосителям не оказывало влияния на развитие
необлучѐнной саркомы – на всех сроках наблюдения значимого различия объѐмов
опухолевых узлов в контрольной группе и группе позитивного контроля не
наблюдалось (таблица 5.12). Независимо от применения Т-1023, в этих группах рост
саркомы имел отчѐтливый экспоненциальный характер, и на поздних сроках
эксперимента у многих животных этих групп в опухолевых узлах наблюдались
обширные некротические изменения (рисунок 5.4).
Несмотря на то, что соединение Т-1023 было введено подопытным животным в
оптимальной радиозащитной дозе, в этих исследованиях ингибитор NOS также не
оказал влияния и на радиочувствительность саркомы. Как показано в таблице 5.12, во
все сроки не наблюдалось достоверных различий объѐмов опухолевых узлов между
группами, получавшими лучевое воздействие в равных дозах. Независимо от
применения Т-1023, -излучение в дозах 32 и 36 Гр оказывало эффективное
противоопухолевое действие, сопровождавшееся значительным (в 3-5 раз) регрессом и
длительной задержкой роста саркомы – по меньшей мере, на 17 суток. В этих группах к
10-13 суткам после облучения у части животных развивался полный регресс
опухолевого узла – у 40-50% при дозе 32 Гр, и у 60-70% при дозе 36 Гр. Но на поздних
этапах эксперимента во всех этих группах наблюдалась тенденция к рецидивному росту
сохранившихся опухолей.
156
Таблица 5.12 – Динамика роста саркомы М-1 в экспериментальных группах
Срок
наблюдения,
сутки
Средний объѐм опухолевого узла, отн. ед.* (M±)
Контроль
Т-1023
32 Гр
Т-1023 + 32 Гр
36 Гр
Т-1023 + 36 Гр
0
1,00
1,00
1,00
1,00
1,00
1,00
3
1,38 ± 0,32
1,31 ± 0,22
1,32 ± 0,25
1,25 ± 0,54
1,12 ± 0,50
1,19 ± 0,34
5
1,98 ± 0,38
2,18 ± 0,34
1,30 ± 0,31
1,12 ± 0,56
0,97 ± 0,65
1,04 ± 0,43
7
2,38 ± 0,58
2,32 ± 0,61
1,08 ± 0,28 1
0,90 ± 0,51 1
0,64 ± 0,44 1
0,85 ± 0,33 1
10
3,07 ± 0,92
3,21 ± 0,81
0,72 ± 0,24 1
0,73 ± 0,37 1
0,34 ± 0,32 1
0,60 ± 0,40 1
13
4,40 ± 1,46
4,17 ± 1,30
0,43 ± 0,20 1 2
0,58 ± 0,35 1
0,19 ± 0,28 1 2
0,34 ± 0,29 1 2
17
5,58 ± 2,21
5,77 ± 2,06
0,25 ± 0,14 1 2
0,36 ± 0,32 1 2
0,17 ± 0,22 1 2
0,30 ± 0,25 1 2
25
10,59 ± 3,92
10,02 ± 3,12
0,39 ± 0,23 1 2
0,48 ± 0,53 1
0,28 ± 0,31 1 2
0,43 ± 0,49 1
Примечания:
*
- данные нормированы на начальный (на 11 сутки роста) объѐм саркомы;
1
– статистически значимое различие (p<0,05) с контрольной группой по критерию Данна;
2
– в группах, получавших лучевое воздействие - статистически значимое различие (p<0,05)
с начальным значением перед облучением (при t=0) по критерию Даннета.
Рисунок 5.4 – Необлучѐнный опухолевый узел саркомы М-1: А – контрольное животное,
11 сутки роста; Б – животное, получившее Т-1023, 11 сутки роста; В – контрольное
животное, 36 сутки роста; Г – животное, получившее Т-1023, 36 сутки роста.
Если лучевые эффекты в отношении саркомы соединение Т-1023 в этих опытах не
модифицировало, то его влияние на тяжесть лучевых реакций кожи было отчѐтливым и
достоверным. В группах, получавших облучение в дозе 32 Гр начальная динамика
развития
кожных
лучевых
реакций
не
различались:
клинические
проявления
манифестировали на 3-5 сутки и до 7-х суток практически полностью оставались в
пределах 1-ой степени реакции – наблюдалась умеренная эритема и сухой, иногда,
распространѐнный эпидермит (таблица 5.13). Но в дальнейшем, к 10-13 суткам после
облучения у большинства крыс группы, не получавшей Т-1023, тяжесть лучевых
реакций быстро нарастала - развивался влажный, чаще сливной эпидермит, нередко
сопровождавшийся изъязвлениями и мелкими кровотечениями (рисунок 5.5, а, б), что
158
свидетельствовало о полном поражении и отторжении эпидермиса и частичном
поражении дермы.
Таблица 5.13 - Влияние соединения Т-1023 на лучевые реакции кожи крыс Wistar
при воздействии -излучения в дозе 32 Гр
Степень лучевой реакции кожи по
классификации RTOG/EORTC-95
[Cox J.D., 1995]
0 – нет проявлений;
1 – слабые или невыраженные:
эритема, эпиляция, сухой
эпидермит;
2 - яркая эритема, островковый
влажный эпидермит,
умеренный отѐк;
3 – сливной влажный эпидермит
вне кожных складок, отѐк с
вдавлением;
4 – язва, кровотечение, некроз;
Различие * :
Примечание:
Доля животных, %
7 сутки
10 сутки
13 сутки
32 Гр
Т-1023
+ 32 Гр
32 Гр
Т-1023
+ 32 Гр
32
Гр
Т-1023
+ 32 Гр
0
87,5
0
87,5
0
12,5
0
62,5
0
0
0
62,5
12,5
12,5
50
37,5
12,5
25
0
0
37,5
0
75
12,5
0
0
0
0
12,5
0
недостоверное
p < 0,05
p < 0,01
* - оценка значимости различий по критерию Манна-Уитни (в каждой
группе по 8 крыс).
Воспалительные процессы в этой группе протекали длительно, и у значительной
части животных, имевших высокую степень лучевой реакции, до конца наблюдения
регенерация повреждений оставалась незавершѐнной (рисунок 5.5, в, г).
159
Рисунок 5.5 - Картина лучевых реакций кожи при облучении в дозе 32 Гр у крыс Wistar,
не получавших Т-1023. (А, Б) - 11-е сутки после облучения. Внешняя поверхность – отѐк
кожи, сливной влажный эпидермит; внутренняя поверхность – частичная эпиляция,
островковый эпидермит. (В, Г) – 25-е сутки после облучения. Стадия регенерации
эксудативного эпидермита, полная эпиляция шѐрстного покрова.
У животных, которым перед облучением в дозе 32 Гр вводили соединение Т-1023,
к 10-13 суткам отягощение лучевой реакции наблюдалось лишь у небольшой части
особей, и, как правило, было ограничено усилением эритемы и развитием умеренного
островкового
влажного
эпидермита
(таблица
5.13,
рисунок
5.6,
а,
б),
что
свидетельствовало о значительной сохранности эпидермиса. В этот период отличие
клинико-морфологической тяжести острых лучевых повреждений между, облучѐнными
в дозе 32 Гр, принимало выраженный характер, и по степени лучевой реакции в
классификации RTOG-95 [Cox J.D., 1995] наблюдалось достоверное различие. В
160
дальнейшем у животных, получавших Т-1023, проявления лучевой реакции быстро
регрессировали и к 25-м суткам эксперимента у 75% особей этой группы полностью
отсутствовали какие-либо изменения кожи и еѐ придатков на облучѐнной конечности
(рисунок 5.6, в, г).
Рисунок 5.6 - Картина лучевых реакций кожи при облучении в дозе 32 Гр у крыс Wistar,
получавших Т-1023. (А, Б) - 11-е сутки после облучения. Внешняя поверхность –
эритема, островковый влажный эпидермит; внутренняя поверхность – умеренная
эритема. (В, Г) – 25-е сутки после облучения. Проявления лучевой реакции отсутствуют.
При воздействии -излучения в дозе 36 Гр соединение Т-1023 также достоверно
влияло на развитие острой лучевой реакции кожи (таблица 5.14). У животных, не
получавших Т-1023, к 10-13 суткам в большинстве случаев на фоне выраженного отѐка
кожи развивался распространѐнный экссудативный дерматит, нередко приобретавший
язвенно-некротический характер - сопровождавшийся изъязвлениями, кровоизлияниями
161
и формированием глубоких дефектов (рисунок 5.7, а, б), что свидетельствовало о
значительном поражении глубоких слоѐв дермы и подлежащих тканей.
Таблица 5.14 - Влияние соединения Т-1023 на лучевую реакцию кожи крыс Wistar
при воздействии -излучения в дозе 36 Гр
Доля животных, %
Степень лучевой реакции кожи
[Cox J.D., 1995]
0 – нет проявлений;
1 – слабые или невыраженные:
эритема, эпиляция, сухой
эпидермит;
2 - яркая эритема, островковый
влажный эпидермит,
умеренный отѐк;
3 – сливной влажный эпидермит
вне кожных складок, отѐк с
вдавлением;
4 – язва, кровотечение, некроз;
Различие * :
Примечание:
7 сутки
10 сутки
13 сутки
36 Гр
Т-1023
+ 36 Гр
36
Гр
Т-1023
+ 36 Гр
36
Гр
Т-1023
+ 36 Гр
0
62,5
0
75
0
12,5
0
62,5
0
0
0
0
37,5
25
50
12,5
25
75
0
0
37,5
25
50
25
0
0
0
0
25
0
недостоверное
p < 0,05
p < 0,05
* - оценка значимости различий по критерию Манна-Уитни (в каждой
группе по 8 крыс).
В дальнейшем, по мере ослабления воспалительных процессов, такие дефекты
восстанавливались за счѐт краевой эпителизации, а в некоторых случаях - за счѐт
кожных дериватов с формированием рубцовой ткани. К 25-м суткам эксперимента у
большинства животных этой группы регенерация лучевых повреждений кожи
оставалась незавершѐнной (рисунок 5.7, в, г).
162
Рисунок 5.7 - Картина лучевых реакций кожи при облучении в дозе 36 Гр у крыс Wistar,
не получавших Т-1023. (А, Б) - 11-е сутки после облучения. Внешняя поверхность – отѐк
кожи, сливной влажный эпидермит, формирование глубоких дефектов; внутренняя
поверхность – эпиляция, влажный эпидермит. (В, Г) – 25-е сутки после облучения.
Внешняя поверхность – незавершѐнная регенерация глубокого дефекта за счѐт
рубцевания; внутренняя поверхность – стадия регенерации влажного эпидермита,
полная эпиляция шѐрстного покрова.
У большинства животных, получавших Т-1023 перед облучением в дозе 36 Гр, к
10-13 суткам выраженый сухой эпидермит приобретал характер островкового
экссудативного (рисунок 5.8, а, б). Однако сливная форма развилась только у четверти
этих животных, и язвенно-некротических явлений при этом не наблюдалось (таблица
5.14). В дальнейшем, по мере ослабления воспаления, у этих животных развивалась
активная регенерация - к 25-м суткам у подавляющего большинства особей этой группы
163
сохранялись минимальные проявления лучевой реакции – сухое шелушение кожи и, в
разной степени, эпиляция шѐрстного покрова на внутренней поверхности облучѐнной
конечности (рисунок 5.8, в, г). Только у одной особи регенерация после сливного
экссудативного дерматита оставалась незавершѐнной.
Рисунок 5.8 - Картина лучевых реакций кожи при облучении в дозе 36 Гр у крыс Wistar,
получавших Т-1023. (А, Б) - 11-е сутки после облучения. Внешняя поверхность –
островковый влажный эпидермит; внутренняя поверхность – частичная эпиляция, сухой
эпидермит. (В, Г) – 25-е сутки после облучения. Внешняя поверхность – без изменений;
внутренняя поверхность – полная эпиляция шѐрстного покрова.
Таким образом, при обеих дозах -излучения соединение Т-1023 существенно и
достоверно ограничивало степень острой лучевой реакции кожи подопытных животных.
При этом заметного влияния Т-1023 на развитие воспалительных и регенераторных
процессов в этих опытах не наблюдалось – при использованных дозах облучения
164
течение близких по объѐму и клинической тяжести лучевых повреждений у опытных и
контрольных животных было сходным, и каких-либо особенностей не наблюдалось. Это
свидетельствует, что соединение Т-1023 ослабляло, именно, лучевую альтерацию
глубоких слоѐв кожи, еѐ дериватов и подлежащих тканей - вызывало снижение
радиочувствительности нормальных тканей в поле облучения [Аклеев А.В., 2014]. В то
же время, в этих опытах ингибитор NOS не модифицировал чувствительность саркомы
к лучевому воздействию и не снижал противоопухолевую эффективность радиотерапии,
что убедительно свидетельствует о способности соединения Т-1023 к селективной
защите немалигнизированных тканей при лучевой терапии солидных злокачественных
новообразований.
5.4 Перспективность применения изучаемых производных ИТМ в качестве
радиозащитных средств и средств профилактики осложнений лучевой терапии
Проблема разработки новых эффективных радиозащитных фармакологических
средств актуальна не только в связи с развитием атомной энергетики и возрастающими
рисками ядерных конфликтов и техногенных катастроф [Цыб А.Ф., 2011]. Рост
клинической потребности в таких средствах в настоящее время в значительной мере
обусловлен неуклонным расширением применения методов радиационной медицины в
лечении онкологических заболеваний [Иванов В.К., 2011].
По данным ФГБУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина в Российской Федерации на учѐте с
различными онкологическими заболеваниями состоит более 2,5 миллионов жителей.
При этом за последнее десятилетие прирост онкозаболеваемости превысил 13%. В
настоящее время практически каждый второй онкологический больной получает курс
радикальной или комбинированной лучевой терапии.
Несмотря на совершенствование медицинской радиологической техники и
методов радиотерапии, в России и развитых странах мира частота развития осложнений
лучевой терапии остаѐтся на уровне 10-15% (а некоторых видов – до 40%) [Бардычев
М.С., 1998; Цыб А.Ф., 2005; Лушников Е.Ф., 2012; Аклеев А.В., 2014]. Такие патологии,
особенно поздние лучевые повреждения, отличаются торпидностью течения и с трудом
поддаются лечению. При этом развитие таких тяжѐлых осложнений, как лучевой
перикардит, пневмосклероз или панкреафиброз, способно даже при излечении
165
основного заболевания определять негативный прогноз таких больных [Бардычев М.С.,
1985, 1998; Пасов В.В., 2002; Абизов Р.А., 2014].
На сегодняшний день известно значительное число соединений различных
химических классов, обладающих противолучевым действием [Саксонов П.П., 1976;
Владимиров В.Г., 1989; Васин М.В., 2010; Ильин Л.А., 2012; Hosseinimehr S.J., 2007].
Некоторые из них в настоящее время входят в обеспечение медицинских служб МО и
служб спасения в качестве радиопротекторов экстренного действия: цистамин и Б-190
(индралин) - в Российской Федерации; амифостин – в странах НАТО. Однако низкая
переносимость и токсичность эффективных радиозащитных доз таких радиопротекторов
затрудняют их применение в онкологической практике для профилактики осложнений
радиотерапии.
По существу, единственным допущенным к клиническому применению в
качестве средства профилактики осложнений радио- и химиотерапии опухолей является
разработанный в США аминотиоловый радиопротектор амифостин [Kouvaris J.R., 2007;
Hensley M.L., 2009; Рождественский Л.М., 2013], который начал ограниченно
применяться при лечении некоторых видов новообразований. В настоящее время
ведутся работы по поиску более приемлемых аналогов амифостина [Peebles D.D., 2012;
Copp R.R., 2013], а также изучается целесообразность применения с этой целью
адреномиметиков,
системных
протекторов,
инактивирующих
активные
формы
кислорода, и ингибиторов апоптоза [Bourgier C., 2012; Prasanna P.G., 2012; Fahl W.E.,
2014; Maier P., 2014; Аклеев, А.В., 2014]
Вместе с тем данные, изложенные в разделах 5.1-5.3, показывают, что
перспективным подходом, как для обеспечения эффективной противолучевой защиты в
целом, так и для селективной защиты нормальных тканей при радиотерапии, может
явиться применение ингибиторов эндогенного синтеза оксида азота. Обладая
выраженным вазопрессорным действием, изучаемые N,S-замещѐнные производные
ИТМ при применении их в высоких дозах индуцировали изменения гемодинамики,
способствующие
развитию
тканевой
гипоксии.
Причѐм,
имея
собственные
молекулярные механизмы вазопрессорного действия, эти соединения в радиозащитных
дозах, по существу, вызывали изменения гемодинамики, подобные тем, которые
развиваются под влиянием эффективных доз серотонинергических и адренергических
радиопротекторов [Саксонов П.П., 1976; Владимиров В.Г., 1989; Васин М.В., 2010]. Это
166
свидетельствует, что эффективные ингибиторы NOS и, в частности, изучаемые
производные
ИТМ,
можно
рассматривать
как
один
из
видов
вазоактивных
радиопротекторов с гипоксическим механизмом противолучевого действия.
Результаты
детальных
исследований
противолучевой
активности
Т-1023,
проявлявшего наиболее выраженные радиозащитные свойства среди изучаемых
производных
ИТМ,
радиопротекторов
показали,
что
терапевтической
это
соединение
широтой
(около
обладает
5,5)
и
высокой
в
для
оптимальной
радиозащитной дозе 75 мг/кг, составляющей 1/4 ЛД16, обеспечивает противолучевое
действие, не уступающее в эффективности действию существующих радиопротекторов
– по разным тестам оценки ФИД -излучения составили 1,44 (1,26÷1,65), 1,56
(1,21÷1,94) и 1,81 (1,29÷2,38). Показано также значительное усиление радиозащитного
эффекта при взаимодействии Т-1023 с радиопротекторами, обладающими сходным
вазотропным действием. Причѐм, выраженное, статистически значимое повышение
эффективности серотонинергических и адренергических радиопротекторов соединение
Т-1023 вызывало даже в дозах, самостоятельно не имеющих радиозащитного действия.
Гипоксический механизм действия вазоактивных радиопротекторов потенциально
позволяет им оказывать селективную защиту нормальных тканей при лучевой терапии
[Prasanna P.G., 2012]. В частности, такая способность недавно была показана для ряда
адреномиметиков [Fahl W.E., 2014]. Соединение Т-1023 также в полной мере проявило
эту способность на модели лучевой терапии радиорезистентной саркомы М-1. Введение
этого производного ИТМ в оптимальной радиозащитной дозе перед локальным
облучением в дозах 32 и 36 Гр не модифицировало радиочувствительность саркомы М-1
и не снижало противоопухолевую эффективность радиационного воздействия. Но при
этом Т-1023 статистически значимо понижало степень острых лучевых реакций кожи,
ограничивая альтерацию глубоких слоѐв кожи и подлежащих тканей.
В целом, полученные данные убедительно свидетельствуют, что эффективные
ингибиторы NOS могут стать основой нового класса вазоактивных радиопротекторов и
средств профилактики осложнений лучевой терапии, а также явиться ценными
фармакологическими препаратами, способными повышать эффективность многих
существующих
противолучевых
средств.
Само
же
производное
Т-1023,
по
действующим критериям фармакологического отбора соединений с противолучевым
действием [Владимиров В.Г., 1989; Хабриев Р.У., 2005], является перспективным для
167
дальнейшей разработки, и целесообразность проведения полных доклинических
исследований соединения Т-1023 в качестве радиопротетора экстренного действия и
средства профилактики осложнений радио- и химиотерапии не вызывает сомнений.
168
ГЛАВА 6 ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ И
АНТИМЕТАСТАТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ПРОИЗВОДНЫХ ИТМ
В современных представлениях о биологии злокачественных опухолей и их
таргетной терапии особое место отводится ангиогенезу и перспективам применения
антиангиогенных средств [Ziche M., 2009; Plate K.H., 2012; Корчагина А.А., 2013].
Результаты использования ангиостатических препаратов в онкологической практике, в
целом, подтвердили ожидания – ингибиторы ангиогенеза подавляют рост и
метастазирование опухолей, повышают эффективность радио- и химиотерапии [Fang P.,
2012; Willett C.G., 2007; Lein S., 2008; Schmidt B., 2012; Abdel-Rahman O., 2014]. В то же
время, долговременное подавление опухолевого роста имеющимися ангиостатическими
средствами достигается редко. В клинической практике и в экспериментальных
исследованиях влияние VEGF-специфических и мультикиназных ингибиторов, как
правило, прогрессивно ослабевает вследствие развития резистентности опухоли к
таргетным препаратам через активацию альтернативных ангиогенных путей и усиление
промиграционного фенотипа некоторых неоплазий [Fernando N.T., 2008; Bergers G.,
2008; Maity A., 2010; Rahman R., 2010; Plate K.H., 2012; Vasudev N.S., 2014].
В связи с тем, что в основе этой проблемы лежит разнообразие ангиогенных
факторов и высокая пластичность опухолей, перспективным подходом может явиться
применение ингибиторов ангиогенеза, действие которых направлено на общие участки
проангиогенных путей различных факторов. Авторы исследований опухолевого
ангиогенеза среди множества модуляторов особую роль отводят оксиду азота [Isenberg
J.S., 2009; Miller T.W., 2009; Ziche M., 2009]. Воздействие большинства проангиогенных
факторов вызывает повышение экспрессии и каталитической активности eNOS в
клетках эндотелия, что, в свою очередь, инициирует каскад процессов (активация c-Scr,
cGK-I и CNG-каналов), ведущих к длительному снижению тонуса и повышению
проницаемости сосудов, миграции и пролиферации эндотелиальных клеток, и, в
конечном итоге, к развитию новой сосудистой сети [Ignarro L.G., 2002; Ziche M., 2009;
Kanwar J.R., 2009; Burke A.J., 2013; Cheng H., 2014]. Более того, показано, что
повышенная проницаемость сосудов и активация металлопротеиназ, вследствие
усиленного синтеза NO, во многом определяют и интенсивность метастазирования
новообразований [Marangoni K., 2008; Lahdenranta J., 2009; Ziche M., 2009; Ortega A.L.,
2010].
169
В целом, эти данные позволяют ожидать неспецифическое антиваскулогенное
влияние на опухоль при подавлении синтеза NO химическими ингибиторами NOS. В
настоящее время противоопухолевая активность ряда гуанидиновых ингибиторов NOS
(аминогуанидин, L-NNA, L-NAME) показана в исследованиях на экспериментальных
опухолевых системах [Thomsen L.L., 1997; Gratton J.P., 2003; Kashiwagi S., 2005;
Mohamad N.A., 2009]. Субхроническое введение этих ингибиторов NOS животнымопухоленосителям
сопровождалось
торможением
роста
и
подавлением
метастазирования опухолей, что авторы исследований объясняли, главным образом,
нарушением опухолевого ангиогенеза.
Значительная роль оксида азота в процессах роста и метастазирования опухолей,
и данные о способности изучаемых N,S-замещѐнных производных ИТМ эффективно
подавлять эндогенный синтез NO (см. раздел 3) явились основанием для изучения их
противоопухолевой и антиметастатической активности.
6.1 Влияние изучаемых соединений на рост и метастазирование перевиваемой
карциномы лѐгких Льюис
Ежедневное введение самцам мышей-гибиридов F1 (CBA×C57BL6j) соединений
Т-1004, Т1023 и Т-1032 в дозе 60 мг/кг в/б (1/6-1/5 ЛД16) с 1 по 21 сутки после перевивки
карциномы лѐгких Льюис (КЛЛ) не вызывало в ходе всех опытов каких-либо
токсических эффектов и гибели опытных животных. В то же время, все эти соединения
оказывали сходное влияние на развитие карциномы, сопровождавшееся достоверным
антиметастатическим и противоопухолевым эффектом.
Как показано на рисунке 6.1, при такой схеме введения противоопухолевый
эффект ингибиторов NOS реализовался преимущественно на раннем этапе развития
карциномы и проявлялся начальной задержкой роста опухолевого узла: на 1,5 суток –
при воздействии Т-1004; на 2 суток – при воздействии Т-1032; на 3 суток – при
воздействии Т-1023. В результате этой задержки роста объѐм опухоли у животных
подопытных групп оставался достоверно ниже, чем в контроле практически в течение
всего срока наблюдения (таблица 6.1), и индекс торможения роста опухоли (ТРО)
стабильно сохранялся на высоком уровне: 30-50% - для соединений Т-1004 и Т-1032; 4570% - для соединения Т-1023.
170
Рисунок 6.1 - Влияние соединений Т-1004, Т-1023 и Т-1032 на развитие КЛЛ при
ежедневном введении в дозе 60 мг/кг с 1 по 21-22 сутки после перевивки опухоли.
А. - Кривые роста опухолевого узла. Б. - Оценки длительности задержки роста.
При этом ингибиторы NOS также подавляли и метастазирование карциномы – на
21-22 сутки роста опухоли количество лѐгочных метастазов у опытных животных было
на 35-50% меньше при действии соединений Т-1004 и Т-1032, и на 70% меньше при
действии Т-1023 (рисунок 6.2).
171
Таблица 6.1 - Динамика среднего объѐма узла КЛЛ при ежедневном введении
соединений Т-1004, Т-1023 и Т-1032 в дозе 60 мг/кг с 1 по 21-22 сутки (см3, M±m)
Опыт № 1
Опыт № 2
Время,
сутки
Контроль
Т-1023
Т-1032
Время,
сутки
Контроль
Т-1004
7
0,76±0,09
0,45±0,06 1
0,50±0,05 1
8
0,15±0,02
0,09±0,02
9
1,21±0,23
0,85±0,19
0,78±0,07 1
11
0,41±0,05
0,23±0,05 2
12
2,22±0,21
1,32±0,11 1
1,51±0,11 1
14
0,85±0,10
0,59±0,13
15
3,44±0,28
2,21±0,20 1
2,56±0,18 1
17
1,87±0,19
1,24±0,23 2
19
6,63±0,37
4,31±0,35 1
4,60±0,25 1
20
3,45±0,35
2,04±0,38 2
21
7,13±0,23
4,96±0,38 1
5,67±0,31 1
22
4,38±0,46
2,56±0,46 2
12
Примечания:
- статистически значимое различие (p<0,05) с контролем по
критериям Даннета и Манна-Уитни, соответственно (в каждой группе n = 15).
Рисунок 6.2 - Влияние на метастазирование КЛЛ соединений Т-1004, Т-1023 и Т-1032
при ежедневном введении в дозе 60 мг/кг с 1 по 21-22 сутки после перевивки опухоли.
Символом * отмечено статистически значимое различие (p<0,05) с контролем
по критерию Манна-Уитни (в каждой группе n = 14-15).
Параллельный ход экспоненциальных кривых роста КЛЛ в контрольных и
опытных группах свидетельствует о том, что при данной схеме введения уже с 7-8 суток
172
ингибиторы NOS не оказывают значимого влияния на рост карциномы. Однако
наблюдаемое ослабление противоопухолевого действия изучаемых соединений в этот
период не означает снижения их активности. Об этом свидетельствуют результаты
опыта, в котором соединение Т-1023 вводили животным-опухоленосителям ежедневно в
дозе 60 мг/кг с 1 по 10 сутки после перевивки КЛЛ (рисунок 6.3). При такой схеме
введения Т-1023, также как и в первом опыте, вызвало начальную задержку роста
опухоли на 2,5-3 суток (ТРО - 62%). Однако после «отмены» Т-1023 рост карциномы у
подопытных животных ускорялся и через 4 суток объѐмы опухолевого узла в
экспериментальных группах становились равными.
С позиции предположения об антиангиогенной природе противоопухолевого
действия ингибиторов NOS такая динамика вполне закономерна. Поскольку весь
молекулярный аппарат, участвующий в ангиогенезе, остаѐтся сохранным при действии
субстратно-конкурентного ингибитора NOS, «отмена» Т-1023 должна сопровождаться
активацией опухолевого ангиогенеза и быстрой реваскуляризацией опухоли [Fernando
N.T., 2008; Vasudev N.S., 2014].
Рисунок 6.3 - Влияние соединения Т-1023 на рост и метастазирование КЛЛ при
ежедневном введении в дозе 60 мг/кг с 1 по 10 сутки после перевивки. А. - Кривые роста
и оценка длительности задержки роста опухоли. Б. - Число лѐгочных метастазов на 21
сутки. Символом * отмечены статистически значимые различия (p<0,05) с контролем по
критерию Манна-Уитни (в каждой группе n = 14-15).
В этой связи, стабильное торможение роста КЛЛ, наблюдавшееся в первом опыте,
следует рассматривать не только как следствие начальной задержки роста опухоли, но, в
целом, - как результат хронического ангиостатического влияния ингибиторов NOS на
173
опухолевый ангиогенез. Кроме того, в данном опыте также обращал на себя внимание
тот факт, что даже при «кратковременном» воздействии на ранней стадии опухолевого
процесса соединение Т-1023 обеспечивало выраженное, достоверное подавление
процессов метастазирования – на 21 сутки число лѐгочных метастазов у опытных
животных было в 2 раза меньше, чем в контроле.
Рисунок 6.4 - Влияние соединения Т-1023 на рост и метастазирование КЛЛ при
ежедневном введении в дозе 60 мг/кг с 7 по 21 сутки после перевивки. А. - Кривые
роста, нормированные на средний объѐм на 7 сутки, оценка задержки роста. Б. –
Показатели метастазирования на 21 сутки. Символом * отмечены статистически
значимые различия (p<0,05) с контролем по критерию Манна-Уитни
(в каждой группе n = 15).
Прямым подтверждением того, что действие ингибиторов NOS способно
реализоваться не только на ранних стадиях опухолевого роста, явились результаты
опыта, в котором соединение Т-1023 вводили с 7 суток, когда опухолевые узлы КЛЛ
уже сформировались у всех животных. Как показано на рисунке 6.4, в этом случае к 4-6
суткам от начала применения Т-1023 также развивалась задержка роста карциномы
примерно на 2 суток, и через 10 дней объѐм опухолей у животных опытной группы был
достоверно ниже, чем в контроле (ИР снижался до 47-50%). Кроме того, обращало на
себя внимание то, что воздействие Т-1023 на уже развившуюся карциному в данном
опыте сопровождалось выраженным антиметастатическим эффектом – на 21 сутки
опухолевого роста число лѐгочных метастазов у опытных животных было в 5 раз ниже,
чем в контроле. Причѐм, в этом случае Т-1023 не только эффективно ингибировало
процессы метастазирования (ИИМ вырос до 79%), но статистически значимо подавляло
174
рост метастазов – число крупных лѐгочных метастазов снизилось у опытных животных
почти в 3 раза.
6.2 Исследование механизмов противоопухолевой активности изучаемых
производных ИТМ
Для
оценки
механизмов
противоопухолевого
действия
изучаемых
N,S-
замещѐнных производных ИТМ было проведено сравнительное исследование влияния
соединения Т-1023 и известного VEGF-ингибирующего антиангиогенного препарата
бевацизумаб (авастин) на развитие КЛЛ при их раздельном и сочетанном применении.
Авастин вводили животным-опухоленосителям внутрибрюшинно в дозе 15 мг/кг на 1, 5
и 12 сутки после перевивки опухоли. Т-1023 вводили ежедневно в дозе 60 мг/кг с 1 по 21
сутки опухолевого роста.
Рисунок 6.5 - Влияние соединения Т-1023 и авастина на рост и метастазирование КЛЛ
при раздельном и сочетанном применении. А. - Кривые роста. Б. – Показатели
метастазирования на 21 сутки.
Результаты исследований показали, что субхроническое воздействие Т-1023 и
авастина оказывают сходное влияние на развитие карциномы, проявлявшееся
практически равным противоопухолевым и антиметастатически действием (рисунок
6.5). В обоих случаях развивалась начальная задержка роста опухолевого узла на 3-4
суток, в результате чего индекс торможения роста КЛЛ в опытных группах в течение
всего времени наблюдения стабильно сохранялся на уровне 50-65%. Сходным был и
175
антиметастатический эффект – число лѐгочных метастазов снижалось в 2-2,5 раза в
сравнении с контрольными животными. Кроме того, обращал на себя внимание тот
факт, что сочетанное применение Т-1023 и авастина не изменяло противоопухолевого
эффекта – сочетанное и раздельное воздействие этих соединений было практически
равноэффективным.
Многочисленные данные о молекулярных механизмах дейстия различных
проангиогенных факторов свидетельствуют, что важным и, во многом, общим звеном в
этих процессах является перманентное повышение каталитической активности eNOS в
эндотелии сосудов [Ignarro L.G., 2002; Miller T.W., 2009; Isenberg J.S., 2009; Ziche M.,
2009; Burke A.J., 2013; Cheng H., 2014]. Большая часть биохимических путей,
реализующих ангиогенное влияние VEGF, также предполагает активное участие оксида
азота [Fulton D., 1999; Reihill J.A., 2007; Dudzinski D., 2007; Fulton D., 2008; Ramadoss J.,
2013]. В этой связи наблюдаемое в этих опытах сходство и «самодостаточность»
противоопухолевой активности VEGF-ингибитора бевацизумаба (авастин) и NOSингибитора Т-1023, на наш взгляд, свидетельствует в пользу того, что эти ингибиторы
блокируют на различных участках один и тот же процесс – опухолевый ангиогенез.
Предположение об антиангиогенной природе противоопухолевого действия
изучаемых
производных
ИТМ
в
значительной
мере
подтвердили
результаты
морфологических и гистологических исследований влияния авастина и соединения
Т-1023 на функциональную морфологию КЛЛ, которые были проведены совместно с
лабораторией радиационной патоморфологии МРНЦ им. А.Ф. Цыба (зав. – канд. мед.
наук В.В. Южаков) [Филимонова М.В., Южаков В.В., 2015].
В этих исследованиях использовалось три группы мышей-опухоленосителей F1
(CBA×C57BL6j) – контрольная и две опытных. Особям первой опытной группы вводили
внутрибрюшинно авастин в дозе 15 мг/кг на 1, 5 и 12 сутки, второй – вводили
внутрибрюшинно соединение Т-1023 в дозе 60 мг/кг ежедневно с 1 по 14 сутки. На 15
сутки от перевивки КЛЛ животных выводили из опыта и выделяли биологический
материал для исследований.
Через две недели после перевивки карцинома лѐгких Льюис у контрольных
животных
имела
солидно-инфильтрующий
тип
строения
с
выраженным
полиморфизмом гистологического рисунка. В проксимальной части опухолевых узлов
отмечался
инвазивный
рост
карциномы,
при
этом
тяжи
опухолевых
клеток
176
распространялись
между волокнами
мышц,
вызывая
их
дистрофию,
отѐк
и
микрогеморрагии. Центральные участки опухолевых узлов были представлены
оксифильными полями спонтанного некроза. На препаратах определялась зональная
неоднородность распределения кровеносных сосудов в паренхиме. Относительно
васкуляризированными были зоны инвазии опухолевых клеток в здоровые ткани
(рисунок 6.6). Здесь опухолевые клетки диссоциированы друг от друга и образуют
скопления в виде небольших агрегатов и трабекулярных тяжей. Зоны солидного
строения опухолевой ткани располагались, как правило, в виде тяжей в области
подкожной клетчатки и на границе с подлежащими поперечно-полосатыми мышцами.
Здесь полиморфные клетки карциномы плотно упакованы. При микроскопическом
исследовании в этих зонах видны многочисленные фигуры митозов и единичные
опухолевые клетки, погибающие путѐм апоптоза (рисунок 6.7). Отдельные клетки
подвергались цитолизу.
На препаратах, окрашенных антителами к PCNA, интенсивно пролиферирующие
клетки располагались в периферических зонах опухолей, концентрируясь вокруг
сосудов (рисунок 6.8). В зонах инвазивного роста карциномы отмечались расширенные
сосуды, выстланные уплощѐнными эндотелиальными клетками, ядра которых также
давали PCNA-положительную окраску (рисунок 6.9), что свидетельствовало об
активных процессах опухолевого ангиогенеза. На препаратах, окрашенных антителами к
CD31, определялась неоднородность распределения кровеносных сосудов. Наиболее
плотная сосудистая сеть выявлялась в перитуморальных областях, прилегающих к
подкожной клетчатке (рисунок 6.10). От расширенных венул, располагающихся в
соединительной ткани, ответвлялись короткие капиллярные петли, врастающие в
паренхиму опухоли и в здоровую ткань.
177
Рисунок 6.6 – Гистологическая картина опухолевых узлов КЛЛ на 15 сутки роста (х 200). Перитуморальная зона. Окраска
гематоксилином и эозином. А – опухоль контрольного животного; Б - опухоль животного, получавшего авастин; В – опухоль,
животного, получавшего соединение Т-1023. На препаратах отмечены: 1 – апоптотическая гибель; 2 – деструкция сосудов.
178
Рисунок 6.7 – Гистологическая картина опухолевых узлов КЛЛ на 15 сутки роста (х 200). Паренхима узлов. Окраска
гематоксилином и эозином. А – опухоль контрольного животного; Б - опухоль животного, получавшего авастин; В – опухоль,
животного, получавшего соединение Т-1023. На препаратах отмечены: 1 – апоптотическая гибель; 2 – фигуры митозов.
179
Рисунок 6.8 – Пролиферативная активность в опухолевых узлах КЛЛ на 15 сутки роста. Зоны роста (х 20). Иммуноокрашивание
антителами к PCNA. А – опухоль контрольного животного; Б - опухоль животного, получавшего авастин; В – опухоль, животного,
получавшего соединение Т-1023.
180
Рисунок 6.9 – Пролиферативная активность в опухолевых узлах КЛЛ на 15 сутки роста. Перитуморальные зоны (х 100).
Иммуноокрашивание антителами к PCNA. А – опухоль контрольного животного; Б - опухоль животного, получавшего авастин;
В – опухоль, животного, получавшего соединение Т-1023.
181
Рисунок 6.10 – Сосудистая сеть в опухолевых узлах КЛЛ на 15 сутки роста. Перитуморальные зоны (х 250). Иммуноокрашивание
антителами к CD31, метод биотин-стрептавидин-пероксидазного комплекса, диаминобензидин. А – опухоль контрольного
животного; Б - опухоль животного, получавшего соединение Т-1023.
182
Рисунок 6.11 – Тимус мышей-опухоленосителей. Септальные сосуды (х 200). Окрашивание гематоксилином и эозином.
А – контрольное животное; Б - животное, получавшее авастин; В – животное, получавшее соединение Т-1023.
183
На обзорных препаратах узлов КЛЛ подопытных животных, получавших авастин
и соединение Т-1023, существенных отличий от контроля в гистологическом рисунке не
выявлялось. Обращало лишь внимание истончение тяжей солидного строения
карциномы, прилегающих к подкожной клетчатке.
При гистологическом исследовании на препаратах КЛЛ животных, получавших
авастин и Т1023, выявлялось снижение выраженности васкулогенеза на границе
опухолевой и здоровой ткани, и обширные очаги отѐка и дистрофических изменений в
паренхиме
наблюдалось
узлов.
Визуализировалось
слущивание
эндотелия
снижение
крупных
содержания
сосудов
мелких
синусоидного
сосудов,
типа
с
плазматическим пропитыванием их стенок (рисунок 6.6). При этом усиливалось
плазматическое
пропитывание
отдельных
участков
паренхимы,
определялась
гидропическая дистрофия и лизис опухолевых клеток (рисунок 6.7). Появлялись
кластеры клеток карциномы, гибнущих путем апоптоза, и реже встречались фигуры
митозов.
На препаратах подопытных животных, окрашенных антителами к PCNA,
определялась неравномерность распределения пролиферирующих клеток и заметно
снижалась интенсивность окрашивания на PCNA ядер опухолевых клеток вокруг
сосудов не только в зонах солидного строения, но и в зонах инвазии карциномы в
здоровые ткани (рисунки 6.8, 6.9). При этом в сосудах перитуморальной зоны
существенно реже выявлялись эндотелиальные клетки с PCNA-положительной
окраской, что свидетельствовало о подавленности опухолевого васкулогенеза. На фоне
воздействия Т-1023 в периферических участках узлов, окрашенных на CD31, отчѐтливо
визуализировалось снижение содержания кровеносных сосудов (рисунок 6.10).
Влияние авастина и Т-1023 сходным образом затрагивало не только опухоль. Оба
препарата усиливали полнокровие крупных сосудов вилочковой железы, а также
вызывали деструкцию и слущивание эндотелия с плазматическим пропитыванием
стенок сосудов в капиллярном русле тимуса (рисунок 6.11).
Сходство влияния на КЛЛ ингибитора VEGF и ингибитора NOS подтверждали и
результаты морфометрии (таблица 6.2). Количественный анализ показал, что
субхроническое воздействие авастина и Т-1023 достоверно снижало объѐмное
содержание пролиферирующих (PCNA-положительных) клеток карциномы и плотность
опухолевых клеток, и более чем в 3 раза повышало апоптотический индекс.
184
Таблица 6.2 - Влияние авастина и Т-1023 на морфофункциональные показатели
ткани карциномы лѐгких Льюис (M±)
Показатель
Контроль
Авастин
Т-1023
Объѐмное содержание PCNAположительных клеток, %
47,8±1,6
39,6±2,4 1
38,6±3,9 1
Объѐмное содержание зон некроза, %
44,8±2,1
46,0±3,1
40,0±2,5
Плотность опухолевых клеток в зоне
роста (на 1 мм2)
5408±295
4616±337 1
4088±206 1
Митотический индекс, %
1,94±0,10
1,78±0,12
1,48±0,10 1 2
Апоптотический индекс, %
0,23±0,04
0,78±0,05 1
0,72±0,07 1
Примечания:
1
- статистически значимое различие (p<0,05) с контролем по критерию
Данна;
2
– статистически значимое различие (p<0,05) с группой, получавшей
авастин, по критерию Данна.
Таким образом, характер изменений морфологии КЛЛ, развивающихся при
воздействии Т-1023 и их сходство с изменениями, которые вызывает ангиостатический
препарат авастин, позволяют сделать вывод, что основой противоопухолевой
активности изучаемого производного ИТМ является антиангиогенное действие
[Филимонова М.В., Южаков В.В., 2015]. Нарушение перитуморальной васкуляризации
под влиянием ингибитора VEGF и ингибитора NOS вызывает нарастание гипоксии в
паренхиме опухоли, которая стимулирует апоптотическую гибель опухолевых клеток
[Frost P., 2013]. В то же время, нельзя исключить участия в противоопухолевом
действии ингибиторов NOS и других механизмов. Так, в данных исследованиях
действие
Т-1023
сопровождалось
достоверным
цитостатическим
эффектом
–
митотический индекс клеток карциномы снижался на 25%, в то время как при
воздействии авастина подобный эффект практически отсутствовал.
6.3 Исследование эффективности противоопухолевого действия изучаемых
производных ИТМ при сочетании с радио- и химиотерапией
Известно,
что
применяемые
в
онкологической
практике
в
качестве
антиангиогенных средств ингибиторы VEGF и мультикиназные ингибиторы повышают
эффективность радио- и химиотерапии [Fang P., 2012; Willett C.G., 2007; Lein S., 2008;
185
Schmidt B., 2012; Abdel-Rahman O., 2014]. Показанная в разделе 6.2 способность
изучаемых N,S-замещѐнных производных ИТМ к ангиостатическому влиянию
позволяет ожидать аналогичных свойств и у этих соединений. В этой связи было
проведено сравнительное изучение противоопухолевой эффективности соединения Т1023 в сочетании с радиационным воздействием и циклофосфамидом (циклофосфан).
При
изучении
противоопухолевой
эффективности
Т-1023
в
комбинации
с -излучением, наряду с контролем, использовано три опытных группы мышейопухоленосителей F1 (CBA×C57BL6j) – по 15 особей в каждой. Первая группа получала
локальное облучение в дозе 5 Гр на конечность с опухолью на 7 сутки опухолевого
роста. Особям второй опытной группы вводили Т-1023 в дозе 60 мг/кг ежедневно с 7 по
21 сутки. Особи третьей группы на 7 сутки также получали локальное облучение в дозе
5 Гр, и через 1 час им вводили первую инъекцию Т-1023 в дозе 60 мг/кг, в дальнейшем
эти животные получали Т-1023 в той же дозе ежедневно по 21 сутки опухолевого роста.
Рисунок 6.12 - Влияние -излучения и Т-1023 на рост и метастазирование КЛЛ при их
раздельном и сочетанном применении. Кривые роста нормированы на средний объѐм
опухоли в группе на 7 сутки.
Как показано на рисунке 6.12, через неделю после лучевого воздействия и начала
введения Т-1023 у подопытных животных развивалась задержка роста карциномы: на
1,5-2 суток после облучения и на 1,5-2,5 суток при действии Т-1023. В обоих опытах
дополнительный
курс
Т-1023
усиливал
противоопухолевый
эффект
лучевого
воздействия. Особенно выраженное взаимодействие наблюдалось во втором опыте. В
этом случае задержка роста карциномы составила более 3 суток и эффект сочетанного
186
воздействия Т-1023 и -излучения был достоверно выше, чем при их раздельном
применении (таблица 6.3), и практически соответствовал уровню независимого,
аддитивного противоопухолевого действия радиации и ингибитора NOS.
Таблица 6.3 – Динамика роста КЛЛ при раздельном и сочетанном воздействии
-излучения и соединения Т-1023
Средний объѐм опухолевого узла, отн. ед. *
Время,
сутки
Контроль
5 Гр
Т-1023
5 Гр + Т-1023
7
1,0
1,0
1,0
1,0
10
3,2 ± 0,3
3,3 ± 0,3
3,0 ± 0,5
2,5 ± 0,2
14
10,6 ± 0,8
8,2 ± 0,5 1
7,8 ± 1,1 1
5,9 ± 0,6 1
17
17,9 ± 1,3
13,1 ± 1,2 1
13,7 ± 1,3 1
10,5 ± 0,9 1 2
21
35,1 ± 2,3
24,9 ± 1,0 1
24,9 ± 2,3 1
18,4 ± 1,2 1 2
Примечания:
*
– данные нормированы на начальный объѐм (на 7 сутки);
– статистически значимое различие (p<0,05) с контролем
по критерию Данна;
2
– статистически значимое различие (p<0,05) с группами,
получавшими отдельно Т-1023 и радиационное воздействие
по критерию Данна.
1
Изучение противоопухолевого действия соединения Т-1023 и циклофосфана при
раздельном и сочетанном применении было проведено с применением гистологических
и иммуногистохимических методов. В этих опытах использовано 4 группы мышейопухоленосителей F1 (CBA×C57BL6j) по 7 особей в каждой – контрольная и три
опытных. Контрольные мыши не получали воздействий. Особям первой опытной
группы ежедневно внутрибрюшинно вводили Т-1023 в дозе 60 мг/кг с 7 по 11 сутки
опухолевого роста. Особям второй опытной группы однократно внутрибрюшинно ввели
циклофосфан в дозе 100 мг/кг на 7 сутки роста КЛЛ. Особям третьей группы также на 7
сутки ввели циклофосфан в дозе 100 мг/кг и через 4 часа сделали первую инъекцию
Т-1023 в дозе 60 мг/кг. Далее этим животным вводили Т-1023 в той же дозе по 11 сутки
роста
опухоли.
На
11
сутки
животных
выводили
морфофункциональные исследования тканей опухолей.
из
опыта
и
проводили
187
Рисунок 6.13 – Влияние соединения Т-1023 и циклофосфана при их раздельном и
сочетанном применении на морфофункциональные показатели ткани карциномы
лѐгких Льюис.
Результаты исследований показали, что Т-1023 и циклофосфан обладают
однонаправленной противоопухолевой активностью, но разными механизмами действия
на карциному лѐгких Льюис (рисунок 6.13). Соединение Т-1023, нарушая ангиогенез,
снижало
пролиферативную
активность
клеток
карциномы,
способствовало
их
апоптотической гибели и выраженно стимулировало формирование зон некроза в
экспериментальной неоплазии. Циклофосфан вызывал альтеративно-деструктивные
изменения паренхимы и стромы опухоли, сопровождавшиеся снижением пролиферации
клеток карциномы и выраженым усилением их апоптотической гибели. При сочетанном
применении Т-1023 и циклофосфана наблюдалось отчѐтливое усиление выраженности
патоморфоза КЛЛ, степени индукции апоптоза и некроза, и резкое снижение
репопуляционной способности неопластических клеток (рисунок 6.14).
188
Рисунок 6.14 – Пролиферативная активность в опухолевых узлах КЛЛ на 11 сутки роста.
Обзорные препараты. Иммуноокрашивание антителами к PCNA.
Таким образом, результаты этих исследований свидетельствуют, что, подобно
существующим антиангиогенным средствам, изучаемые N,S-замещѐнные производные
ИТМ могут не только самостоятельно оказывать значительное противоопухолевое и
антиметастатическое действие, но также способны повышать эффективность радио- и
химиотерапии.
189
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Анализ результатов экспериментальных исследований, посвящѐнных поиску
эффективных ингибиторов NOS, показал, что тиоамидиновые ингибиторы NOS имеют
ряд особенностей, выделяющих их среди соединений других химических классов с
подобной фармакологической активностью:
1.
Многие S-алкилзамещѐнные производные ИТМ и S,S’-алкилзамещѐнные бис-ИТМ
проявляют существенно большую аффинность к NOS, чем их ближайшие аналоги
других химических классов, что, по-видимому, обусловленно способностью атома
серы и S-замещающего алкила к дополнительному взаимодействию с гемом и
аминокислотными остатками в каталитическом центре NOS [Garvey E.P., 1994;
Wolff D.J., 1997; Boer R., 2000; Li H., 2000].
2.
Алкилзамещѐнные производные ИТМ (по крайней мере, низкомолекулярные),
обладающие NOS-ингибирующей способностью, в отличие от большинства
ингибиторов NOS, содержащих свободную аминогруппу, в том числе и
аминоалкилзамещѐнных
ИТМ,
являются
в
полной
мере
конкурентными,
обратимыми ингибиторами [Garvey E.P., 1994; Southan G.J., 1996; Wolff D.J., 1996,
1997; Alderton W.K., 2001; Прокуряков С.Я., Филимонова М.В., 2009].
3.
Низкомолекулярные S-алкилзамещѐнные производные ИТМ, проявляющие NOSингибирующую активность, не обладают значимой селективностью к изоформам
этих ферментов [Garvey E.P., 1994; Wolff D.J., 1997;. Cooper G.R., 2000].
Эти данные послужили основой для выбора N,S-замещѐнных производных ИТМ в
качестве основных объектов наших исследований.
Результаты единичных экспериментальных [Boer R., 2000; Raman C.S., 2001;
Goodyer C.L., 2003] и теоретических [Воронков А.Э., 2005; Левцова А.А., 2007; Прошин
А.Н., 2007] исследований в этой химической области,
а также результаты
экспериментальных работ лаборатории радиационной фармакологии МРНЦ им. А.Ф.
Цыба [Проскуряков С.Я., Филимонова М.В., 2002, 2003; Проскуряков С.Я., 2005, 2005в;
Верховский Ю.Г., Филимонова М.В., 2008, 2009; Филимонова М.В., 2011, 2012]
позволили ограничить область скрининга и обосновать целесообразность поиска
эффективных конкурентных ингибиторов NOS в ряду N-ацил-S-алкил-замещѐнных
производных ИТМ с общей формулой:
190
(1)
где R1 – алкильная или арильная группа C1-14; R2 – алкильная группа C1-3; HX –
неорганическая или органическая кислота.
Разработка в лаборатории радиационной фармакологии МРНЦ им. А.Ф. Цыба
методов алкилирования
и
ацилирования
тиомочевин
повысила синтетическую
доступность этой химической области и позволила получить оригинальные соединения,
фармакологическое изучение которых выявило их влияние на активность NOS и обмен
NO в организме.
В целом, в рамках этих исследований были синтезированы, идентифицированы и
полностью охарактеризованы 16 новых, не описанных в научной и патентной
литературе N,S-замещѐнных производных ИТМ формулы (1). Все полученные
производные ИТМ являлись водорастворимыми, малотоксичными соединениями –
показатели ЛД50 острой токсичности для мышей при внутрибрюшинном введении
находились в диапазоне 380-945 мг/кг.
Результаты скрининговых исследований ингибирующей активности in vitro на
изолированных изоформах NOS, в целом, подтвердили исходные ожидания –
практически
все
изучаемые
производные
ИТМ
обладали
NOS-ингибирующей
способностью. В то же время, подтвердилась и другая закономерность, ранее
отмеченная [Moore W.M., 1996; Boer R., 2000; Проскуряков С.Я., Филимонова М.В.,
2002] о том, что наличие у соединений формулы (1) N-замещающего радикала
значительно снижало их аффинность к NOS в сравнении с S-алкилзамещѐнными
аналогами.
Тем не менее, ряд исследованных соединений – Т-1004, Т-1020, Т-1023, Т-1032, Т1049 и Т-1059 в экспериментах in vitro эффективно подавляли активность eNOS и iNOS
(IC50 – 1,8-10 мкМ/л), на уровне, сопоставимом с активностью таких известных
ингибиторов NOS, как L-NAA, L-NNA, L-NAME [Lambert L.E., 1991; Faraci W.S., 1996;
Boer R., 2000]. Кроме того, в ряду исследованных N,S-замещѐнных производных ИТМ
проявилась и «положительная» сторона влияния N-замещающего радикала. Большая
часть исследованных соединений, подобно S-алкил-ИТМ, являлись неселективными
ингибиторами NOS. В то же время, такие N-замещающие радикалы, как изобутаноил,
191
циклобутанкарбонил и циклогексанкарбонил в большей степени ослабляли способность
N,S-замещѐнных-ИТМ к взаимодействию с нейрональной NOS, в результате чего такие
соединения в той или иной степени приобретали селективность к ингибированию eNOS
и iNOS. Так, производные Т-1020, Т-1032 и Т-1049 проявляли умеренную селективность
(в 3-5 раз) к eNOS и iNOS, а соединения Т-1023 и Т-1059 демонстрировали уровень
селективности, представляющий практический интерес [Alderton W.K., 2001] – в 15-30
раз активнее подавляя eNOS и iNOS, чем nNOS.
Предположения о способности N-замещающего радикала влиять на селективность
N,S-замещѐнных производных ИТМ ранее высказывались рядом авторов [Shearer B.G.,
1997; Cooper G.R., 2000; Проскуряков С.Я., Филимонова М.В., 2002; Проскуряков С.Я.,
2005; Левцова А.А., 2007]. Полученное в настоящей работе подтверждение роли этого
факта свидетельствует о целесообразности его детального изучения в дальнейших
исследованиях. Что же касается соединений Т-1023 и Т-1059, то выявленные
особенности их NOS-ингибирующих свойств позволили ожидать у них способности
влиять, прежде всего, на сосудистый гомеостаз, в регуляции которого ведущую роль
играют eNOS и iNOS.
Сопоставление эффективных ингибирующих и токсических доз изучаемых
производных ИТМ показало, что наиболее активные соединения (Т-1004, Т-1020, Т1023, Т-1032, Т-1049 и Т-1059) оказывают значительное (более 50%) ингибирующее
влияние уже при дозах, на 2-3 порядка ниже токсических, что свидетельствовало об их
физиологической активности в нетоксических дозах.
В опытах на изолированных изоформах NOS характер ингибирующего действия
всех исследованных N,S-замещѐнных производных ИТМ, как и у низкомолекулярных Sалкил-ИТМ, был в полной мере конкурентным и обратимым – влияние этих соединений
на каталитическую активность всех изоформ NOS полностью нивелировалось при 8-10кратном избытке L-аргинина. Конкурентный механизм NOS-ингибирующей активности
изучаемых соединений подтвердили и результаты исследований на клеточных
культурах. В проведѐнных опытах после 2-х часов инкубации клеток с различными
концентрациями изучаемых соединений, вплоть до токсических, удаление их из
культуральной среды сопровождалось быстрым и полным восстановлением продукции
NO до уровня интактных клеток, не контактировавших с этими веществами.
192
Результаты изучения влияния производных ИТМ на эндогенную продукцию NO в
тканях подопытных животных показали, что большая часть этих соединений в
нетоксических дозах (1/25-1/40 ЛД16) проявляет in vivo высокую NOS-ингибирующую
активность,
количественные
показатели
которой,
в
целом,
коррелировали
с
показателями этой активности in vitro. В этих же исследованиях было показано, что
изучаемые соединения легко абсорбируются и быстро распределяются в биологических
жидкостях и тканях, в том числе, проникая через ГЭБ. Были также получены некоторые
фармакокинетические данные о продолжительности NOS-ингибирующего действия.
Показано, что при однократном введении в дозах 5-20 мг/кг эффективные соединения
значимо подавляли синтез NO в биологических тканях в течение 3-4 часов.
На основании анализа полученных данных о токсичности и NOS-ингибирующей
активности исследованных производных ИТМ in vivo была выделена группа
перспективных соединений: производные ИТМ Т-1004, Т-1020, Т-1023, Т-1032, Т-1049 и
Т-1059, детальное изучение свойств которых является целесообразным и может
представлять научный и практический интерес.
Исследование влияния перспективных производных ИТМ на гемодинамику крыс
в состоянии острого тяжѐлого геморрагического шока показало наличие у них
выраженной вазопрессорной способности. Однократное внутрибрюшинное введение
нетоксических доз изучаемых ингибиторов NOS (10 мг/кг; ~1/25 ЛД16) вызывало у этих
животных гипертензивный эффект, качественно превосходящий прессорное действие
высоких доз адреномиметиков - в 1,5-2 раза по степени подъѐма АД, и в 5-7 раз – по
длительности. Так, однократное введение в указанной дозе соединения Т-1059
поддерживало в течение более 2 часов АД животных, потерявших 50% объѐма
циркулирующей крови, на уровне АД здоровых животных.
При этом выраженное и длительное ослабление тяжести гипотонии под влиянием
изучаемых ингибиторов NOS качественно изменяло течение тяжѐлого геморрагического
шока. На модели геморрагического шока у контрольных животных и в группе,
получавшей адреномиметик фенилэфрин, двухчасовая летальность составляла 45-50%,
тогда как в группах, получавших изучаемые производные ИТМ, в течение 2 часов
наблюдения не погибло ни одно животное.
Известно, что наиболее эффективным способом лечения острых тяжѐлых
гиповолемических состояний является экстренное возмещение потерянного объѐма
193
донорской кровью или кровезаменителями [Шутеу Ю., 1981; Волков В.Е., 2009]. Однако
эти мероприятия не всегда доступны, особенно вне клинических условий. В то же
время,
достоверное
экспериментах
при
снижение
краткосрочной
однократной
инъекции
летальности
изучаемых
животных
производных
в
этих
ИТМ
свидетельствует, что такие вазопрессоры способны оказывать эффективную помощь на
догоспитальном этапе лечения при травмах и ранениях, что не позволяют сделать
существующие вазопрессорные средства [Delmas A., 2005; Волков В.Е., 2009; Boerma
E.C., 2010; Ferquson-Myrthil N., 2012].
Аналогично выраженный и длительный гипертензивный эффект изучаемые
соединения вызывали и на моделях вазодилятационных гипотоний – при остром
эндотоксемическом шоке и при гипотонии, индуцированной ганглиоблокадой, что
свидетельствует о возможности широкого применения вазопрессоров с таким
механизмом действия.
Принципиально важной является
установленная в наших исследованиях
способность изучаемых производных ИТМ к вазопрессорному действию при
рефрактерном состоянии на фоне длительной эндотоксемии - вазоплегии, резистентной
к действию эндо- и экзогенных вазопрессоров. Учитывая появившиеся в последние годы
данные о способности ингибиторов NOS восстанавливать реактивность сосудов к
прессорному действию α1-адреномиметиков и ангиотензина II [Tiemermann C., 1993;
Alexander J.H., 2007; Salem R., 2007; Dumbarton T.C., 2011; Jang D.H., 2013; Shabana A.,
2013; Nardi G.M., 2014; Fink M., 2014], можно ожидать, что такие вазопрессоры могут
повысить эффективность лечения тяжѐлых критических состояний.
Важно отметить, что во всех исследованиях на моделях гипотонических
состояний применение ингибиторов NOS не сопровождалось какими-либо побочными
эффектами.
Безопасным являлось и действие изучаемых ингибиторов NOS на гемодинамику
интактных животных. Введение изучаемых N-ацил-S-алкил-замещѐнных производных
ИТМ нормотензивным животным не вызывало значимого подъѐма АД. Развитие
гипертензивного эффекта в этом случае быстро подавлялось барорефлекторной
реакцией. При назначении этих соединений в эффективных «гипертензивных» дозах (515 мг/кг; 1/25-1/40 ЛД16) рефлекторная реакция носила умеренный характер - снижение
ЧСС и АДС не превышало 10-15% и ослабления системного кровотока при этом не
194
наблюдалось. Все гемодинамические изменения самостоятельно нормализовались по
мере элиминации прессорного действия ингибитора NOS и фармакологической
коррекции при этом не требовалось. В то же время, поскольку изменения в
гемодинамике в этом случае носят чисто рефлекторный характер, в случае
необходимости их можно корректировать холинолитиками, например, подкожным
введением атропина.
Таким
производные
образом,
ИТМ
полученные
являются
данные
перспективной
свидетельствуют,
основой
для
что
изучаемые
разработки
новых
эффективных вазопрессорных и противошоковых средств, способных создать новые
возможности в терапии гипотонических расстройств, особенно при оказании эктренной,
неотложной помощи и в лечении критических состояний. Проведение детальных
доклинических исследований наиболее эффективных соединений, в первую очередь,
соединения Т-1059 является вполне обоснованным и целесообразным.
Способность некоторых S-монозамещѐнных производных ИТМ (в первую
очередь - S-метил/этил/аминоэтил-ИТМ) к противолучевому действию была показана
ещѐ в 1960-80 годах [Жеребченко П.Г., 1968; Ильюченок Т.Ю., 1972; Голощапова Ж.А.,
1981]. В то же время, после открытия биологической роли оксида азота было показано,
что эти производные ИТМ проявляют высокую NOS-ингибирующую активность
[Garvey E.P., 1994; Southan G.J., 1996; Wolff D.J., 1997]. Вместе с тем, эти данные
позволяют лишь предполагать возможные механизмы повышения радиорезистентности,
и роль NOS-ингибирующей активности в развитии противолучевого действия остаѐтся
не совсем ясной. Также в полной мере не исследован вопрос, собственно, практической
целесообразности применения ингибиторов NOS в качестве радиозащитных и
радиомодифицирующих средств.
Результаты детального исследования механизмов противолучевой активности
алкилзамещѐнных производных ИТМ, в том числе и изучаемых соединений, показали,
что в этом случае основным механизмом радиозащитного эффекта является индукция
гипоксии. Обладая мощным вазопрессорным действием, изучаемые N,S-замещѐнные
производные ИТМ при назначении их в высоких дозах индуцировали рефлекторные
изменения гемодинамики, способствующие развитию тканевой гипоксии. Причѐм, имея
собственные молекулярные механизмы вазопрессорного действия, эти соединения в
радиозащитных дозах, по существу, вызывали изменения гемодинамики, подобные тем,
195
которые развиваются под влиянием эффективных доз серотонинергических и
адренергических радиопротекторов [Саксонов П.П., 1976; Владимиров В.Г., 1989; Васин
М.В., 2010]. Эти данные свидетельствуют о том, что эффективные ингибиторы NOS и, в
частности, изучаемые производные ИТМ можно рассматривать как один из видов
вазоактивных радиопротекторов с гипоксическим механизмом противолучевого
действия.
Результаты исследования противолучевой активности соединения Т-1023,
проявившего наиболее выраженные радиозащитные свойства среди изучаемых
производных
ИТМ,
радиопротекторов
показали,
что
терапевтической
это
соединение
широтой
(около
обладает
5,5)
и
высокой
в
для
оптимальной
радиозащитной дозе 75 мг/кг, составляющей 1/4 ЛД16, оказывает противолучевое
действие, не уступающее в эффективности действию существующих радиопротекторов
– по разным тестам оценки ФИД -излучения составили 1,44 (1,26÷1,65) и 1,81
(1,29÷2,38). Показано также существенное увеличение радиозащитного эффекта в
результате фармакодинамического взаимодействия Т-1023 с радиопротекторами,
обладающими сходным вазотропным действием. Причѐм, выраженное, статистически
значимое
повышение
эффективности
серотонинергических
и
адренергических
радиопротекторов соединение Т-1023 вызывало даже в малых дозах, самостоятельно не
проявляющих радиозащитного действия.
Гипоксический механизм действия вазоактивных радиопротекторов потенциально
позволяет им оказывать селективную защиту нормальных тканей при лучевой терапии
опухолей [Prasanna P.G., 2012]. Соединение Т-1023 также в полной мере проявило эту
активность на модели лучевой терапии радиорезистентной саркомы М-1. Введение
этого производного ИТМ в оптимальной радиозащитной дозе перед локальным
облучением в дозах 32 и 36 Гр не модифицировало радиочувствительность саркомы и не
снижало противоопухолевую эффективность радиационного воздействия. Но при этом
Т-1023 достоверно снижало степень острых лучевых реакций кожи, ограничивая
альтерацию глубоких слоѐв кожи и подлежащих тканей.
В целом, полученные данные убедительно свидетельствуют, что эффективные
ингибиторы NOS могут стать основой нового класса вазоактивных радиопротекторов и
средств профилактики осложнений лучевой терапии, а также явиться ценными
фармакологическими
средствами,
способными
повышать
эффективность
ряда
196
существующих радиопротекторов. Само же соединение Т-1023, по действующим
критериям отбора соединений с противолучевым действием [Владимиров В.Г., 1989;
Хабриев Р.У., 2005], является перспективным для дальнейшей разработки, и
целесообразность проведения его полных доклинических исследований в качестве
радиопротетора экстренного действия и средства профилактики осложнений радио- и
химиотерапии не вызывает сомнений.
В современных представлениях о биологии злокачественных опухолей и их
таргетной терапии особое место отводится ангиогенезу и перспективам применения
антиангиогенных средств [Ziche M., 2009; Plate K.H., 2012; Корчагина А.А., 2013].
Результаты использования ангиостатических препаратов в лечении онкологических
заболеваний, в целом, подтвердают ожидания – ингибиторы ангиогенеза подавляют рост
и метастазирование опухолей, повышают эффективность радио- и химиотерапии [Fang
P., 2012; Willett C.G., 2007; Lein S., 2008; Schmidt B., 2012; Abdel-Rahman O., 2014]. В то
же время, в клинической практике влияние VEGF-специфических и мультикиназных
ингибиторов,
как
правило,
прогрессивно
ослабевает
вследствие
развития
резистентности опухоли к этим препаратам через активацию альтернативных
ангиогенных путей и усиление промиграционного фенотипа некоторых видов опухолей
[Fernando N.T., 2008; Bergers G., 2008; Maity A., 2010; Rahman R., 2010; Plate K.H., 2012;
Vasudev N.S., 2014].
Поскольку в основе этой проблемы лежит разнообразие ангиогенных факторов и
высокая пластичность опухолей, перспективным подходом может являться применение
ингибиторов
ангиогенеза,
проангиогенных
путей
действие
различных
которых
факторов.
направлено
При
этом
на
общие
авторы
участки
исследований
опухолевого ангиогенеза среди множества модуляторов особую роль отводят оксиду
азота [Isenberg J.S., 2009; Miller T.W., 2009; Ziche M., 2009; Burke A.J., 2013; Cheng H.,
2014]. Воздействие большинства проангиогенных факторов вызывает повышение
экспрессии и каталитической активности eNOS в клетках эндотелия, что, в свою
очередь, инициирует каскад процессов, ведущих к длительному снижению тонуса и
повышению проницаемости сосудов, миграции и пролиферации эндотелиальных клеток,
и, в конечном итоге, к развитию новой сосудистой сети [Ignarro L.G., 2002; Ziche M.,
2009; Kanwar J.R., 2009].
197
В этой связи можно ожидать развития неспецифического антиваскулогенного
влияния на опухоль при подавлении синтеза NO химическими ингибиторами NOS. В
настоящее время противоопухолевая активность ряда гуанидиновых ингибиторов NOS
(аминогуанидин, L-NNA, L-NAME) показана в исследованиях на экспериментальных
опухолевых системах [Thomsen L.L., 1997; Gratton J.P., 2003; Kashiwagi S., 2005;
Mohamad N.A., 2009]. Значительная роль оксида азота в процессах роста и
метастатического прогресса опухолей, и данные о способности изучаемых N,Sзамещѐнных производных ИТМ эффективно подавлять эндогенный синтез NO явились
основанием для изучения их противоопухолевой и антиметастатической активности.
Результаты исследований показали, что субхроническое введение изучаемых
производных ИТМ в дозе 60 мг/кг (1/5 ЛД16) животным-опухоленосителям не
сопровождалось какими-либо токсическими эффектами и гибелью животных, но при
этом наблюдалось выраженное противоопухолевое действие на карциному лѐгких
Льюис, проявляющееся значительным торможением роста опухоли (от 30-40% до 5075%)
и
подавлением
процессов
метастазирования
(от
50%
до
75-80%).
Противоопухолевое и антиметастатическое действие изучаемых ингибиторов NOS
наблюдалось как на растущей, так и на уже развившейся опухоли.
Результаты
гистологических
и
иммуногистохимических
сравнительных
исследований влияния соединения Т-1023 и VEGF-ингибирующего препарата авастин
(бевацизумаб) на морфологию карциномы лѐгких Льюис показали значительное
сходство морфофункциональных изменений, развивающихся при субхроническом
воздействии этих средств. В обоих случаях наблюдалось нарушение перитуморальной
васкуляризации, подавление пролиферации клеток карциномы и повышение их
апоптотической гибели. Эти данные свидетельствуют, что противоопухолевое действие
изучаемых производных ИТМ реализуется, в первую очередь, путѐм подавления
опухолевого ангиогенеза.
В экспериментах также было показано, что изучаемые N,S-замещѐнные
производные
ИТМ
могут
не
только
самостоятельно
оказывать
значительное
противоопухолевое и антиметастатическое действие, но также способны повышать
эффективность радио- и химиотерапии опухолей.
198
Полученные данные свидетельствуют, что ингибиторы NOS, в том числе, и
изучаемые производные ИТМ, могут являться перспективной основой для разработки
лекарственных средств комплексной терапии онкологических заболеваний.
199
ВЫВОДЫ
1.
Выявлены
особенности
химического
строения
N,S-алкил/ацил-замещѐнны
изотиомочевин, определяющие их NOS-ингибирующие свойства. Наиболее
активными конкурентными, обратимыми ингибиторами NO-синтаз являются
соединения, в которых S-замещающий радикал представлен низшим алкилом.
Селективность таких производных к
изоформам
NOS
определяется
N-
замещающим радикалом.
2.
Полученные в результате направленного синтеза N-ацил-S-алкил-замещѐнные
изотиомочевины под шифрами Т-1004, Т-1020, Т-1023, Т-1032, Т-1049 и Т-1059
проявляют селективность к ингибированию eNOS и iNOS, и в нетоксических
дозах in vivo вызывают выраженное подавление эндогенного синтеза NO в
биологических
жидкостях
и
тканях
организма,
что
свидетельствует
о
целесообразности детального изучения их фармакологических свойств.
3.
Сосудосуживающее действие N,S-замещѐнных ИТМ: Т-1020, Т-1023, Т-1049 и Т1059 (однократно, в/б) в нетоксических дозах (~1/25 ЛД16) реализуется на
различных моделях гипотонических состояний, в том числе, резистентных к
действию существующих вазопрессорных лекарственных средств, и отличается
большой длительностью и отсутствием нежелательных эффектов, характерных
для адреномиметиков.
4.
При
нормотензивном
состоянии
вазопрессорное
действие
исследованных
производных ИТМ сопровождается незначительным гипертензивным эффектом
вследствие развития барорефлекторной реакции, ограничивающей подъѐм АД.
Назначение таких соединений в эффективных «гипертензивных» дозах (~1/25
ЛД16) сопровождается умеренной рефлекторной реакцией, не требующей
фармакологической коррекции.
5.
Противолучевое действие алкил-замещѐнных изотиомочевин реализуется путѐм
индукции гипоксии. Испытанные соединения: Т-1004, Т-1023, Т-1032, Т-1049
обеспечивают эффективную радиационную защиту в меньших дозах, по
сравнению с известными серосодержащими радиопротекторами, действующими в
200
субтоксических дозах, и повышают противолучевую эффективность серотонин- и
адренергических радиопротекторов.
6.
Противолучевое действие исследованных производных ИТМ (Т-1004, Т-1023)
способно обеспечивать селективную защиту немалигнизированных тканей при
лучевой терапии солидных опухолей, без ослабления противоопухолевой
эффективности радиационного воздействия.
7.
Исследованные производные ИТМ при субхроническом введении оказывают
выраженное противоопухолевое и антиметастатическое действие, подавляя
опухолевый ангиогенез и стимулируя апоптотическую и некротическую гибель
опухолевых клеток, и повышают эффективность радио- и химиотерапии
новообразований.
8.
Полученные данные свидетельствуют о перспективности разработки на основе
наиболее активных соединений (Т-1004, Т-1023, Т-1059) лекарственных средств
принципиально нового механизма действия, способных расширить возможности
фармакотерапии при лечении ряда распространѐнных заболеваний, при оказании
экстренной, неотложной помощи и терапии критических состояний.
201
РЕКОМЕНДАЦИИ
Выявленные в данном исследовании особенности молекулярной структуры N,Sзамещѐнных ИТМ, определяющие их способность к ингибированию NOS, и
установленная зависимость селективности изученных соединений к изоформам NOS от
характера N-замещающего ацильного радикала создают основу для рационального
поиска и дизайна селективных, конкурентных тиоамидиновых ингибиторов NOS в ряду
производных ИТМ, тиазола, тиазолина, тиазина.
Полученные в результате проведѐнных исследований данные, подтверждѐнные
патентами РФ RU2353614 [Проскуряков С.Я., Филимонова М.В., 2009], RU2475479
[Филимонова
М.В.,
2013],
RU2503450
[Филимонова
М.В.,
2014],
RU2506082
[Мандругин А.А., Филимонова М.В., 2014] и одобренной заявкой на изобретение
№082603 [Филимонова М.В., 2013], дают основание планировать разработку новых
лекарственных
средств:
противошокового
на
средства,
основе
на
соединения
основе
Т-1059
соединения
–
Т-1023
вазопрессорного
–
и
радиопротектора
экстренного действия и средства профилактики осложнений лучевой терапии, а также
свидетельствуют о целесообразности детального изучения перспективности применения
конкурентных
ингибиторов
NOS
злокачественных новообразований.
в
качестве
средств
адъювантной
терапии
202
ПЕРСПЕКТИВЫ ДАЛЬНЕЙШЕЙ РАЗРАБОТКИ ТЕМЫ
Дальнейшая разработка темы предполагает:
1.
Повышение эффективности поиска селективных, конкурентных ингибиторов NOS
в данной химической области, в том числе, путѐм компьютерного моделирования
молекулярного взаимодействия лигандов с активными центрами изоформ NOсинтаз, а также дизайн соединений, сочетающих NOS-ингибирующую активность
с другими биохимическими свойствами, например – ингибирование COX,
антиоксидантная активность.
2.
Дальнейшее изучение фармакологических свойств конкурентных ингибиторов
NOS, включая противовоспалительное, кардио- и нейрозащитное действие.
.
203
БЛАГОДАРНОСТИ
Автор считает своим долгом выразить искреннюю благодарность коллегам,
которые долгие годы оказывали моральную и интеллектуальную поддержку, и
способствовали теоретическому и экспериментальному развитию данных исследований:
Проскурякову С.Я. (зав. лабораторией радиационной фармакологии в 2010 г.),
заложившему основу исследований химии и экспериментальной фармакологии
ингибиторов NOS в МРНЦ им. А.Ф. Цыба; профессору Саенко А.С. (зам. директора по
науке МРНЦ им. А.Ф. Цыба по 2013 г.), за поддержку на этапе планирования; всем
сотрудникам лаборатории радиационной фармакологии МРНЦ им. А.Ф. Цыба за
помощь при проведении экспериментальных исследований; Скворцову В.Г. (зав.
лабораторией ядерной медицины МРНЦ им. А.Ф. Цыба) и сотрудникам лаборатории:
Федосову И. М., Орленко С. П., профессору Каламкарову Г. Р. (зав. лабораторией
нейрохимии ФГБУ науки ИБХФ им. Н.М. Эмануэля РАН) и сотрудникам лаборатории
Шевченко Т. Ф., Бугровой А. за помощь в проведении ЭПР-спектрометрических
измерений; профессору Замулаевой И.А. (зав. отделом радиационной биохимии МРНЦ
им. А.Ф. Цыба) и сотрудникам отдела за помощь в проведении исследований методом
проточной цитометрии; Ульяненко С. Е. (зав. отделом радиационной биофизики МРНЦ
им. А.Ф. Цыба) и сотрудникам отдела Кузнецовой М. Н., Хозяшевой Т. С. за помощь
при проведении исследований на модели лучевой терапии саркомы М-1; Южакову В. В.
(зав. лабораторией радиационной патоморфологии МРНЦ им. А.Ф. Цыба) и
сотрудникам
лаборатории
за
помощь
при
проведении
гистологических,
иммуногистохимических и морфометрических исследований; а также научным
консультантам: профессору Арзамасцеву Евгению Вениаминовичу (руководителю
лаборатории лекарственной токсикологии ФГБУ "Российский кардиологический
научно-производственный комплекс" Минздрава России) за неоценимую помощь на
этапах планирования, выполнения и написания работы и доктору медицинских наук
Жаворонкову Леониду Петровичу (заместителю директора МРНЦ им. А.Ф. Цыба –
филиала
ФГБУ
«НМИРЦ»
Минздрава
России,
заведующему
лабораторией
радиопатологии) за консультативную помощь в проведении радиобиологических
исследований.
204
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
1.
Абакумов, М.М. Оксид азота и свѐртывающая система крови в клинике / М.М.
Абакумов, П.П. Голиков // Вестник РАМН. – 2005. - № 10. – С.53-57.
2.
Абизов, Р.А. Органосберегающее лечение рака гортани, ротоглотки, их рецидивов и
осложнений (руководство) / Р.А. Абизов, В.Г. Андреев, А.А. Белоусова и др.; под ред.
Д.И. Заболотного и др. – Киев: ТОВ «Бiблiотека «Здоров’я Украiны», 2014. – 316 с.
3.
Абраменков, И.В. Оценка параметров апоптоза в диагностике онкологических
заболеваний, их прогнозе и оптимизации схем терапии / И.В. Абраменков, А.А.
Фильченков // Вопр. онокол. – 2003. – Т.49, № 1. – С.21-30.
4.
Айвазян, С.А. Прикладная статистика: Основы моделирования и первичная обработка
данных. Справочное изд. / С.А. Айвазян, И.С. Енюков, Л.Д. Мешалкин. - М.: Финансы и
статистика, 1983. – 471 с.
5.
Аклеев, А.В. Радиобиологические закономерности реакции нормальных тканей при
лучевой терапии опухолей / А.В. Аклеев // Радиац. биол. Радиоэкол. – 2014. – Т.54, №.3.
– С.241-255.
6.
Андреев, В.Г. Диагностическая и лечебная гастродуоденоскопия при желудочнокишечных кровотечениях язвенной этиологии / В.Г. Андреев, Н.Е. Чернеховская, М.В.
Вараксин и др. // Мед. помощь. – 2006. – № 4. – С.13-16.
7.
Антонов, А.А. Гемодинамика для клинициста (физиологические аспекты) / А.А.
Антонов. - М.: Аркомис-Профи ТТ, 2004. - 99 с.
8.
Бардычев, М.С. Местные лучевые повреждения / М.С. Бардычев, А.Ф. Цыб. - М.:
Медицина, 1985. - 240 с.
9.
Бардычев, М.С. Лечение вторичных лучевых повреждений после комбинированного
лечения рака молочной железы / М.С. Бардычев, В.В. Пасов // Русский онкол. журнал. –
1998. - №.1. - С.18-21.
10.
Башкатова, В.Г. Оксид азота в механизмах повреждения мозга, обусловленных
нейротоксическим действием глутамата / В.Г. Башкатова, К.С. Раевский // Биохимия. –
1998. - Т.63, Вып.7. - С.1020-1028.
11.
Башкатова, В.Г. Роль метаботропных глутаматных рецепторов в механизмах развития
экспериментального паркинсонизма / В.Г. Башкатова, С.К. Судаков // Бюлл. эксп. биол.
мед. – 2012. – Т.153, Т.5. – С.608-610.
12.
Беленький, М.Л. Элементы количественной оценки фармакологического эффекта / М.Л.
Беленький. - Л.: Гос. изд-во мед. литературы, 1963. – 146 с.
13.
Березовская, И.В. Классификация химических веществ по параметрам острой
токсичности при парентеральных способах введения / И.В. Березовская // Хим. фарм.
журнал. – 2003. – Т.37, №.3. – С.32-34.
14.
Брюне, Б. Апоптотическая гибель клеток и оксид азота: механизмы активации и
антагонистические сигнальные пути / Б. Брюне, К. Сандау, А. фон Кнетен // Биохимия.1998.- T.63, Вып.7.- C.966-975.
15.
Бутомо, Н.В. Основы медицинской радиологии (под ред. Ушакова И.Б.) / Н.В. Бутомо,
А.Н. Гребенюк, В.И. Легеза. - СПб.: ООО «Изд-во Фолиант», 2004. – 384 с.
205
16.
Ванин, А.Ф. Динитрозильные комплексы железа и S-нитрозотиолы две возможные
формы стабилизации и транспорта оксида азота в биосистемах / А.Ф. Ванин // Биохимия.
– 1998.- Т.63, №.7. - С.924-938.
17.
Васин М.В. Противолучевые лекарственные средства (учебная монография) / М.В.
Васин // М.: Изд-во Российской медицинской академии последипломного образования,
2010. – 180 с.
18.
Васин, М.В. К фармакологическому анализу противолучевого действия индралина / М.В.
Васин, И.Б. Ушаков, Л.А. Семѐнова, В.Ю. Ковтун // Радиац. биол. Радиоэкол. – 2001. –
Т.41, №.3. – С.307-309.
19.
Васин, М.В. Модификация потребления кислорода клетками костного мозга in vitro под
влиянием α1-адреномиметика индралина / М.В. Васин, И.Б. Ушаков, Э.П. Коровкина,
В.Ю. Ковтун // Бюлл. эксп. биол. мед. – 2013. – Т.155, Т.3. - С.337-339.
20.
Верховский, Ю.Г. Синтез и отбор новых ингибиторов продукции биогенного оксида
азота / Ю.Г. Верховский, Н.Б. Борышева, М.В. Филимонова и др. // Труды
Регионального конкурса научных проектов в области естественных наук.– Калуга,
2008.– Вып. 13.– С.254–265.
21.
Верховский, Ю.Г. Исследование связи между структурой и NOS-ингибирующей
активностью N,S-замещѐнных производных изотиомочевины и обоснование нового
направления в создании на их основе антигипотензивных средств широкого спектра
действия / Ю.Г. Верховский, М.В. Филимонова, О.Н. Боровая и др. // Труды
Регионального конкурса научных проектов в области естественных наук.– Калуга,
2009.– Вып. 14.– С.361–372.
22.
Владимиров, В.Г. Радиопротекторы: Структура и функция / В.Г Владимиров, И.И.
Красильников, О.В. Арапов. - Киев: Наукова думка, 1989. – 258 с.
23.
Волков, В.Е. Шок. Сепсис. Полиорганная дисфункция / В.Е. Волков, С.В. Волков. Чебоксары: ПБОЮЛ Наумов Л.А., 2009. – 348 с.
24.
Воронков, А.Э. Молекулярный дизайн ингибиторов NO-синтазы на основе циклических
изотиомочевин // А.Э. Воронков, О.Н. Зефирова, В.А. Палюлин и др. // Сб. тезисов межд.
конф. по химии гетероциклических соединений, посвящ. 90-летию А.Н. Коста. Россия,
М., 17-21 октября 2005 г. – М., 2005. - С.143.
25.
Гаркуша, Н.Ф. Характеристика саркомы Ml крыс / Н.Ф. Гаркуша, Н.Ю. Гончарова //
Биол. науки. - 1990. - № 6. - С.154-159.
26.
Гильяно, Н.Я. NO-зависимый путь модификации клеточной чувствительности к
действию γ- и нейтронного излучений / Н.Я. Гильяно, Г.Н. Бондарев, Л.А. Носкин и др.//
Радиац. биол. Радиоэкол. - 2004. - Т. 44, № 1. - С. 62-67.
27.
Гильяно, Н.Я. Модификация клеточной радиочувствительности ингибиторами NOсинтаз / Н.Я. Гильяно, Г.Н. Бондарев, Л.В. Коневега и др. // Радиац. биол. Радиоэкол. 2005. - Т.45, № 1. - С.63-67.
28.
Гланц, С. Медико-биологическая статистика. Пер. с англ. / С. Гланц. - М.: Практика,
1998. - С.323-365.
29.
Голиков, П.П. Оксид азота в клинике неотложных заболеваний / П.П. Голиков. - М.: ИД
Медпрактика-М, 2004. – 180 с.
30.
Голощапова, Ж.А. Экспериментальное обоснование использования некоторых
производных изотиурония в качестве радиозащитных соединений // Ж.А. Голощапова,
Т.Н. Тужилкова, Л.И. Мизрах // Радиобиология. – 1981. - Т.21, №.5. - С.521-525.
206
31.
Граник, В.Г. Оксид азота (NO). Новый путь к поиску лекарств / В.Г. Граник, Н.Б.
Григорьев - М.: Вузовская книга, 2004. – 360 с.
32.
Граник, В.Г. Экзогенные доноры оксида азота и ингибиторы его образования
(химический аспект) / В.Г. Граник, С.Ю. Рябова, Н.Б. Григорьев // Успехи химии. - 1997.
- Т.66, № 8. - С.792-807.
33.
Гундорова, Р.А. NO-терапия при лечении ран век / Р.А. Гундорова, А.Б. Шехтер, О.И.
Кваша и др. // Офтальмохирургия. – 2010. - №.3. – С.28-32.
34.
Гусева, Е.И. Неврология. Национальное руководство / Под ред. Е.И. Гусева, А.Н.
Коновалова, В.И. Скворцовой, А.Б. Гехт. - М.: ГЕОТАР-Медиа, 2008. – 1040 с.
35.
Егоров, А.Н. Роль нитрозилирующего стресса в механизмах нейродеструкции в условиях
пренатальной алкогольной интоксикации и пути фармакокоррекции возникающих
нарушений / А.Н. Егоров, И.Ф. Беленичев, Е.П. Соколик и др. // Запорожский мед.
журнал. – 2012. - №.5. – С.25-28.
36.
Жабченко, И.А. Роль донаторов оксида азота в комплексе лечебных мероприятий при
преэклампсии / И.А. Жабченко / Репродуктивное здоровье Восточная Европа. – 2012. №.4. – С.150-158.
37.
Жеребченко, П.Г. О связи между радиозащитным и сосудосуживающим действием
индолилалкиламинов / П.Г. Жеребченко, Н.Н. Суворов // Радиобиология. – 1963. – Т.3,
№.4. – С.595-599.
38.
Жеребченко, П.Г. Радиозащитный эффект солей S-алкилзамещѐнных производных
изотиомочевины при их раздельном и комбинироваанном изучении / П.Г. Жеребченко,
Ю.Д. Зильбер, Г.П. Поспехова и др. // Радиобиология. – 1968. – Т.8, №.4. – С.582-587.
39.
Замулаева, И.А. Корреляция между внутриклеточным содержанием оксида азота и
частотой мутантных лимфоцитов после радиационного воздействия в малых дозах / И.А.
Замулаева, С.Г. Смирнова, Н.В. Орлова и др. // Радиац. биол. Радиоэкол. – 2007. – Т.47,
Вып. 1. – С.86–92.
40.
Зефирова, О.Н. О некоторых примерах «рационального» создания физиологически
активных соединений / О.Н. Зефирова, Е.В. Нуриева, Т.Ю. Баранова и др. // Альманах
современной науки и образования. – Тамбов: «Грамота», 2008. - № 5. – С. 61-63.
41.
Иванов, В.К. Радиационные риски медицинского облучения / В.К. Иванов, А.Ф. Цыб,
Ф.А. Метлер // Радиация и риск. - 2011. - Т.20, №.2. - С.17-29.
42.
Ильин Л.А. Противолучевые средства в системе радиационной защиты персонала и
населения при радиационных авариях / Л.А. Ильин, И.Б. Ушаков, М.В. Васин // Мед.
радиол. радиац. безоп. – 2012. – Т.57, №.3. – С.26-31.
43.
Ильинский, Д.А. Некоторые стороны биологического действия радиозащитных средств
из группы аминодисульфидов / Д.А. Ильинский // Труды ВМОЛА им. С.М. Кирова. –
1962. – Т.141. – С.169-173.
44.
Ильюченок, Т.Ю. Радиозащитные свойства некоторых фосфорсодержащих производных
изотиурония / Т.Ю. Ильюченок, Л.М. Фригидова, Ю.В. Завьялов и др. // Фармакол. и
токсикол. – 1972. - Т.39, Т.3. – С.191-198.
45.
Косарев, В.В. Клиническая фармакология лекарственных средств, применяемых при
сердечно-сосудистых заболеваниях / В.В. Косарев, С.А. Бабанов // Самара: Офорт, 2010.
– 140 с.
46.
Коноплянников А.Г. Радиобиология стволовых клеток / А.Г. Коноплянников - М.:
Биоинформсервис, 2009. – 171 с.
207
47.
Коноплянников, А.Г. Влияние некоторых ингибиторов NOS дигидротиазинтиазолинового ряда на пострадиационное восстановление эндогенных КОЕ-С-8 у мышей
/ А.Г. Коноплянников, С.Я. Проскуряков, О.А. Коноплянникова и др. // Радиац. биол.
Радиоэкол. - 2007. – Т.47, № 1. – С.5-9.
48.
Корчагина, А.А. Роль рецепторов VEGFR в неопластическом ангиогенезе и перспективы
терапии опухолей мозга / А.А. Корчагина, О.И. Шеин, В.П. Гурина, В.П. Чехонин //
Вестник РАМН. – 2013. - № 11. – С.104-114.
49.
Косенкова, Ю.С. Ингибиторы NO-синтаз: химический аспект проблемы / Ю.С.
Косенкова, М.П. Половинка, Н.Ф. Салахутдинов // Химия в интересах устойчивого
развития. – 2010. – Т.18, №.6. – С.669-690.
50.
Крушинский, А.Л. Влияние ингибиторов индуцибельной и нейрональной NO-синтаз на
развитие аудиогенных стрессорных повреждений у крыс линии КрушинскогоМолодкиной / А.Л. Крушинский, В.С. Кузенков, В.Е. Дьяконова и др. // Бюлл. экспер.
биол. мед. – 2010. – Т.150, №.7. – С.38-41.
51.
Курляндский, Б.А. Общая токсикология / Под ред. Б.А. Курляндского и В.А. Филатова –
М.: Медицина, 2002. – 608 с.
52.
Лакин, Г.Ф. Биометрия / Г.Ф. Лакин – М.: Высшая школа, 1990. – 350 с.
53.
Левцова, А.А. Создание потенциальных ингибиторов синтазы оксида азота на основе
производных 2-амино-5,6-дигидро-4Н-1,3-тиазина / А.А Левцова, В.В. Чупахин, А.Н.
Прошин и др. // Вестн. Моск. Ун-та. Серия 2. Химия. – 2007. – Т.48, № 5. – С.299-301.
54.
Лисицына, Н.В. Медикаментозные средства, влияющие на синтез оксида азота и их
место в патогенетической терапии преэклампсии / Н.В. Лисицына / Науч. ведомости
Белгородсткого гос. ун-та. Серия: Медицина. Фармация. – 2010. – Т.10, №.10. – С.46-54.
55.
Лушников, Е.Ф. Современная лучевая патология человека: проблемы методологии
исследований, этиологии, патогенеза и классификации / Е.Ф. Лушников, А.Ю.
Абросимов – Обнинск: ФГБУ МРНЦ Минздравсоцразвития России, 2012. – 236 с.
56.
Мазур, Н.А. Клиническая фармакология нитратов и их эффективность / Н.А. Мазур //
Кардиология. - 2006. - №8. - С. 55-62.
57.
Макарчук,
В.М.
Антигиповолемическое
действие
N-пропионил-S-изопропилизотиомочевины гидробромида при септическом шоке у крыс-самцов Wistar / В.М.
Макарчук, М.В. Филимонова, С.Я. Проскуряков, В.И. Суринова и др. // Сборник
научных работ лауреатов конкурса им. Е.Р.Дашковой. - Калуга: КГУ им.
К.Э.Циолковского - 2010. – Вып. 4. - С.34-42.
58.
Макарчук, В.М. Влияние ряда производных изотиомочевины на показатели
артериального давления крыс в состоянии тяжѐлого геморрагического шока / В.М.
Макарчук, М.В. Филимонова, Г.С. Борисова // Мед. академич. журнал. – 2010б. - Т.10,
№ 5. - C.167.
59.
Мандругин, А.А. Исследования свойств серосодержащих органических соединений
методами радионуклидной диагностики // А.А. Мандругин, Т.П. Трофимова, В.М.
Федосеев, С.Я. Проскуряков // Рос. хим. журнал. – 2005. – Т.XLIX, N 6. – С.35–46.
60.
Мандругин, А.А. NO-ингибирующая активность производных 2-амино-2-тиазолина /
А.А. Мандругин, Т.П. Трофимова, В.М. Федосеев и др. // Хим.-фарм. журнал. – 2007. –
Т.41, № 12. – С.61-63.
61.
Мандругин, А.А. Антигипотензивное средство. / А.А. Мандругин, Т.П. Трофимова, Г.С.
Борисова, М.В. Филимонова, Л.И. Шевченко, В.М. Макарчук, С.Я. Проскуряков //
Патент РФ на изобретение RU2506082. Дата публикации: 10.02.2014.
208
62.
Маткаримова, Д.С. Особенности системы гомеостаза и оксида азота у допризывников с
дизагрегационной тромбоцитопатией и тромбоцитопенической пурпурой // Д.С.
Маткаримова, Ш.Г. Сабирова, У.Н. Нуриддинова, У.У. Рахманова // Вестник Укр.
стомат. акад. - 2013. – Т.13, Вып. 2(42). – С.132-134.
63.
Матчук, О.Н. Чувствительность клеток SP линии меланомы В16 к действию редко- и
плотноионизирующего излучений / О.Н. Матчук, И.А. Замулаева, Е.И. Селиванова и др.
// Радиац. биол. Радиоэкол. – 2012. – Т.52, № 3. – С.261-267.
64.
Матчук, О.Н. Механизмы радиорезистентности клеток SP культуры мышиной меланомы
B16 / О.Н. Матчук, И.А. Замулаева, О.А. Ковалѐв, А.С. Саенко // Цитология. – 2013. –
Т.55, № 8. – С.553-559.
65.
Машковский, М.Д. К фармакологии хлоргидрата 5-метокситриптамина (мексамина) //
М.Д. Машковский, Г.С. Арутюнян // Фармакол. токсикол. – 1963. – Т.26, №.1. – С.10-14.
66.
Машковский, М.Д. Влияние серотонина на объѐмную скорость кровотока и pO2 в
некоторых областях мозга / М.Д. Машковский, В.П. Ланский // Бюлл. эксп. биол. мед. –
1967. – Т.64, №.11. – С.95-97.
67.
Машковский, М.Д. Лекарственные средства. Пособие для врачей. Справочник. 15-е изд. /
под ред. М.Д. Машковского. - М.: Новая Волна, 2005. – 1164 с.
68.
Маянская, С.Д. Артериальная гипертензия и дисфункция эндотелия. Часть II / С.Д.
Маянская, А.А. Попова, Н.Н. Маянская и др. // Вестник соврем. клинич. мед. – 2009. –
Т.2, №.3. – С.43-48.
69.
Медведева, Н.А. Снижение оксид азота (NO)-цГМФ-зависимой расширительной реакции
сосудов малого круга кровообращения при дисфункции эндотелия / Н.А. Медведева,
А.П. Бонарцев, А.Б. Постников и др. // Рос. физиол. журн. им. И.М. Сеченова. – 2005. –
Т.91, № 2. – С.132-140.
70.
Москаленко, В.И. Оксид азота и ангиогенез / В.И. Москаленко, А.А. Чомаева, В.В.
Москаленко и др. // Моск. хирургический журнал. – 2012. - №.2. – С.27-32.
71.
Новицкий, В.В. Патофизиология: рук. к практ. занятиям / В.В. Новицкий, О.И. Уразова,
В.И. Агафонов; под ред. В.В. Новицкого, О.И. Уразовой. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2011. –
333 с.
72.
Орлова, М.В. Влияние производных тиазина и тиомочевины – эффекторов NO-синтаз –
на выживаемость лейкемических клеток / М.В. Орлова М.В., Т.П. Трофимова, М.В.
Филимонова // Изв. АН СССР, Сер. хим. – 2013. - № 4. – С.1111-1114.
73.
Орлова М.А. О перспективах некоторых новых подходов воздействия на лейкемические
клетки / М.А. Орлова, С.А. Румянцев, М.В. Филимонова, А.П. Орлов и др. // Изв. АН.
Сер. Химическая. – 2014. - № 5. – С.1205-1210
74.
Осинский, С.П. Микрофизиология опухолей / С.П. Осинский, П. Ваумпель. - Киев:
Наукова думка, 2009 – 256 с.
75.
Осипов, А.Н. Биологическая роль нитрозильных комплексов гемопротеинов // А.Н.
Осипов, Г.Г. Борисенко, Ю.А. Владимиров // Усп. биол. химии. – 2007. – Т.47. – С.259292.
76.
Павлов, А.Н. Исследования микроциркуляции желудка при язвенных геморрагиях у
крыс с применением блокатора NO-синтазы и вейвлет-анализа / А.Н. Павлов, М.А.
Родионов, О.В. Семячкина-Глушковская и др. // Фундаментальные исследования. – 2011.
- №.9(3). – С.467-468.
209
77.
Пасов, В.В. Хирургическая коррекция местных лучевых повреждений у больных раком
молочной железы: пособие для врачей / В.В. Пасов, М.С. Бардычев // Обнинск: ФГБУ
МРНЦ Минздравсоцразвития России, 2002.
78.
Плотникова, Е.Д. Молекулярное моделирование, рентгеноструктурный анализ и
изучение
iNOS-ингибирующей
активности
гидрохлорида
3-имино-2,4диазабицикло[3.3.1]нонан-1-ола / Е.Д. Плотникова, М.В. Филимонова, Е.В. Нуриева,
Д.И. Перегуд и др. // Журнал орг. химии. – 2013. – Т.49, Вып.8. – С.1128-1131.
79.
Поваляев, А.В. Оксид азота в комплексном эндоскопическом лечении больных с
эрозивно-язвенными гастродуоденальными кровотечениями / А.В. Поваляев // Автореф.
дисс. канд. мед. наук. - М., 2009. – 22 с.
80.
Попова, А.А. Артериальная гипертензия и дисфункция эндотелия. Часть I // А.А. Попова,
С.Д. Маянская, Н.Н. Маянская и др. // Вестник соврем. клинич. мед. – 2009. – Т.2, № 2. –
С.41-46.
81.
Проскуряков, С.Я. Оксид азота в механизмах патогенеза внутриклеточных инфекций /
С.Я. Проскуряков, А.И. Иванников, В.Г. Скворцов, С.Ф. Бикетов // Иммунология. – 2000.
- № 4. – С.9-20.
82.
Проскуряков, С.Я. NO-ингибирующая и вазотропная активность некоторых соединений,
содержащих тиоамидиновую группу / С.Я. Проскуряков, Н.Г. Кучеренко, М.В.
Филимонова и др. // Бюлл. экспер. биол. мед. – 2002. - Т.134, №.10. - С.393-396.
83.
Проскуряков, С.Я. NO-ингибирующая активность радиопротекторов / С.Я. Проскуряков,
Н.Г. Кучеренко, М.В. Филимонова и др. // Радиац. биол. Радиоэкол. – 2003. – Т.43, №.1.
– С. 57-61.
84.
Проскуряков, С.Я. Влияние ингибитора NO-синтазы 2-АДТ на эндотоксининдуцированные изменения гемодинамики и дыхания крыс / С.Я. Проскуряков, М.В.
Филимонова, Ю.Г. Верховский и др. // Бюлл. экспер. биол. мед. – 2004. – Т.138, №.10. –
С.446-449.
85.
Проскуряков, С.Я. Структура, активность и биологические эффекты субстрат-подобных
ингибиторов NO-синтаз // С.Я. Проскуряков, А.Г. Коноплянников, В.Г. Скворцов и др. //
Биохимия. – 2005. – Т.70, №.1. – С. 14-32.
86.
Проскуряков, С.Я. Оценка роли оксида азота в отягощении исходов комбинированных
радиационно-термических поражений / С.Я. Проскуряков, Л.П. Ульянова, В.Г.
Скворцов, Р.С. Будагов // Радиац. биол. Радиоэкол. – 2005б. – Т. 45, № 3. – С. 316-319.
87.
Проскуряков, С.Я. Ингибиторы NO-синтаз, содержащие карбоксамидиновую группу и ее
изостеры / С.Я. Проскуряков, А.Г. Коноплянников, В.Г. Скворцов и др. // Успехи химии.
– 2005в. – Т.74, № 9. – С.939–950.
88.
Проскуряков, С.Я. Влияние ингибиторов NO-синтазы, содержащих тиоамидиновый
фрагмент, на люминол-зависимую хемилюминесценцию нейтрофилов человека / С.Я.
Проскуряков, В.Н. Петров, Е.В. Саяпина, В.Г. Скворцов // Вопр. биол. мед. фармакол.
химии. – 2006. – № 2.– С. 31–33.
89.
Проскуряков, С.Я. NO-ингибирующая активность соединений, содержащих в своей
структуре тиоамидиновую группу / С.Я. Проскуряков, Л.И. Шевченко, Н.Г. Цышкова и
др. // Вопр. биол. мед. хим. фарм. – 2009. - № 3. – С.15-18.
90.
Проскуряков, С.Я. Антигипотензивное средство. / С.Я. Проскуряков, Ю.Г. Верховский,
М.В. Филимонова, Л.И. Шевченко, А.А. Мандругин, Т.П. Трофимова, В.М. Федосеев //
Патент РФ на изобретение RU2353614. Дата публикации: 27.04.2009.
210
91.
Проскуряков, С.Я. Влияние NO-ингибиторов на гипотензию, вызванную
гиповолемическим шоком / С.Я. Проскуряков, М.В. Филимонова, О.Н. Боровая и др. //
Бюлл. эксп. биол. мед.– 2010. – Т.150, N 7.– С.23-27.
92.
Проскуряков, С.Я. Современное состояние и перспективы разработки новых подходов к
лечению меланомы / С.Я. Проскуряков, О.Н. Матчук, И.А. Замулаева // Вестник РОНЦ
им. Н.Н. Блохина РАМН. – 2011. - Т.22, № 2. - С.31-40.
93.
Прошин, А.Н. Создание химических соединений с заданной физиологической
активностью. Ингибиторы NO-синтазы / А.Н. Прошин, А.Н. Пушин, Т.П. Трофимова,
О.Н. Зефирова // Тезисы докладов XVIII Менделеевского съезда по общей и прикладной
химии. 2007. – М.: Граница, 2007. – Т.1. – С.395.
94.
Раевский,
К.С.
Судороги,
вызываемые
введением
N-метил-DL-аспартата,
сопровождаются усилением генерации оксида азота и процессов перекисного окисления
липидов в мозге крыс / К.С. Раевский, В.Г. Башкатова, Г.Ю. Вицкова и др. // Экспер.
клин. фармакол. – 1998. – Т.61, №.1. – С.13-16.
95.
Раевский, К.С. Роль оксида азота в глутаматергической патологии мозга / К.С. Раевский,
В.Г. Башкатова, А.Ф. Ванин // Вестник РАМН. – 2000. - № 4. – С.11-15.
96.
Реброва, О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета
прикладных программ STATISTICA / О.Ю. Реброва - М.: МедиаСфера, 2002. – 312 с.
97.
Ремизова, М.И. Роль оксида азота в развитии централизации кровообращения при
геморрагическом шоке в эксперименте / М.И. Ремизова, К.А. Гербут // Бюлл. эксп. биол.
мед. – 2014. - Т.157, №.1. – С.27-29.
98.
Реутов, В.П. NO-синтазная и нитритредуплеказная компоненты цикла оксида азота /
В.П. Реутов, Е.Г. Сорокина // Биохимия. – 1998. – Т.63, № 7. – С.874-884.
99.
Рождественский, Л.М. Актуальные вопросы поиска и исследования противолучевых
средств / Л.М. Рождественский // Радиац. биол. Радиоэкол. – 2013. – Т.53, №.5. – С.513520.
100.
Рязанцева, Н.В. Внутриклеточные газовые посредники оксид азота, монооксид углерода
и сульфид водорода участвуют в регуляции апоптоза / Н.В. Рязанцева, Е.Г. Старикова,
Л.П. Таширева и др. // Цитология. – 2012. – Т.54, №.2. – С.105-111.
101.
Сайфутдинов, Р.Г. Роль оксида азота при заболеваниях внутренних органов (Обзор
литературы) / Р.Г. Сайфутдинов // Вестник соврем. клин. мед. – 2009. – Т.2, № 3. – С.4853.
102.
Саксонов, П.П. Радиационная фармакология. / П.П. Саксонов, В.С. Шашков, П.В.
Сергеев. - М.: Медицина, 1976. – 256 с.
103.
Салыкина М.А. Влияние селективных ингибиторов нейрональной и индуцибельной NOсинтах на содержание АТФ и выживаемость культивируемых нейронов мозжечка крысы
при гиперстимуляции глутаматных рецепторов / М.А. Салыкина, Е.Г. Сорокина, И.А.
Красильникова и др. // Бюлл. экспер. биол. мед. – 2013. – Т.155, №.1. – С.47-50.
104.
Саркисов, Д.С. Воспроизведение болезней человека в эксперименте / Д.С. Саркисов,
П.И. Ремезов, под ред. А.А. Вишневского - М. – 1960. – 780 с.
105.
Талицкий, К.А. Эффективность терапевтического ангиогенеза у больных с хронической
ишемией нижних конечностей / К.А. Талицкий, О.С. Булкина, Т.И. Арефьева и др. //
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. – 2011. – Т.6, № 3. – С.89-98.
211
106.
Таширева, Л.А. Внутриклеточные мишени проапоптотического влияния газовых
трансмиттеров / Л.А. Таширева, Е.Г. Старикова, В.В. Новицкий, Н.В. Рязанцева //
Вестник РАМН. – 2012. - № 10. – С.77-81.
107.
Титов, В.Ю. Специфическая роль оксида азота (NO) в эмбриональном миогенезе птиц /
В.Ю. Титов, Г.В. Кондратов, А.В. Иванова // Бюлл. эксп. биол. мед. – 2014. – Т.158,
№.10. – С.512-516.
108.
Трофимова, Т.П. Синтез и изучение NOS-ингибирующей активности N-ацильных
производных 2-амино-5,6-дигидро-4Н-1,3-тиазина / Т.П. Трофимова, О.Н. Зефирова,
А.А. Мандругин и др. // Вест. Моск. Ун-та. Серия 2. Химия. – 2008. – Т.49, № 5. – С.328331.
109.
Трофимова,Т.П. Синтез потенциальных радиопротекторов на основе производных
циклических изотиомочевин / Т.П. Трофимова, О.Н. Зефирова, А.А. Мандругин А.А. и
др. / Вест. Моск. Ун-та. Сер. 2. Химия. – 2009. – Т.50, №.6. – С.50-56.
110.
Уланова, И.П. К вопросу об учѐте поверхности тела экспериментальных животных при
токсикологическом исследовании / И.П. Уланова, К.К. Сидоров, А.И. Халепо. Под ред.
А.А. Летавета и И.В. Саноцкого. – Л.: Медицина, 1968. – Вып.10. – С.18-25.
111.
Филимонова, М.В. Модифицированный способ определения сердечного выброса
методом термодилюции у мелких лабораторных животных / М.В. Филимонова, А.А.
Скворцов // Бюлл. эксп. биол. мед. - 1999. - Т.127, № 5. - С.593-596.
112.
Филимонова, М.В. Влияние N-пропионил-S-изопропил-изотиомочевины на продукцию
биогенного оксида азота (NO) и гемодинамические параметры животных при
эндотоксическом шоке / М.В. Филимонова, Л.И. Шевченко, В.И. Суринова и др. / Вопр.
биол. мед. и фарм. химии. - 2011. - № 9. - С.35-39.
113.
Филимонова, М.В. Антигипотензивная активность N-2-ацетиламино-5,6-дигидро-4Н1,3-тиазина / М.В. Филимонова, Т.П. Трофимова, Г.С. Борисова, А.А. Мандругин //
Хим.-фарм. журнал. - 2012. - Т.46, №.3. - С.39-41.
114.
Филимонова, М.В. Радиозащитные свойства производных изотиомочевины с NOингибирующим механизмом действия / М.В. Филимонова, С.Я. Проскуряков, Л.И.
Шевченко и др. // Радиац. биол. Радиоэкол. – 2012б. – Т.52, № 6. - С.593-601.
115.
Филимонова, М.В. Ангиостатическое влияние ингибиторов NO-синтаз из класса S,Nзамещѐнных производных изотиомочевины на опухолевый ангиогенез / М.В.
Филимонова, Л.И. Шевченко, В.В. Южаков и др. // Труды Регионального конкурса
проектов в области естественных наук. – Калуга, 2013. - Вып.18. - С.147-151.
116.
Филимонова, М.В. Вазоконстрикторное средство. / М.В. Филимонова, Л.И. Шевченко,
В.М. Макарчук, А.С. Шевчук, Г.А. Лушникова // Патент РФ на изобретение RU2475479.
Дата публикации: 20.02.2013.
117.
Филимонова, М.В. Вазопрессорное средство. / М.В.Филимонова, Л.И. Шевченко, В.М.
Макарчук, А.С. Шевчук, Е.А. Чеснакова, А.Ф. Цыб // Заявка на изобретение №082603 от
29.11.2013.
118.
Филимонова, М.В. К вопросу о механизме радиозащитного действия ингибиторов NOсинтаз / М.В. Филимонова, Л.И. Шевченко, Т.П. Трофимова и др. / Радиац. биол.
Радиоэкол. – 2014. – Т.54, №.5. – С.500-506.
119.
Филимонова, М.В. Экспериментальная и теоретическая разработка противошоковых и
противоопухолевых средств нового поколения на основе ингибиторов NO-синтаз / М.В.
Филимонова, Л.И. Шевченко, В.В. Южаков, В.М. Макарчук и др. // Труды
212
регионального конкурса проектов фундаментальных научных исследований. Калужский
региональный научный центр им. А.В Дерягина. - Калуга. – 2014б. - Вып.19. - С 151-155.
120.
Филимонова, М.В. Противоопухолевое средство. / М.В. Филимонова, Л.И. Шевченко,
В.М. Макарчук, А.С. Шевчук, В.В. Южаков, А.Ф. Цыб // Патент РФ на изобретение
RU2503450. Дата публикации: 10.01.2014.
121.
Филимонова, М.В. Экспериментальное исследование противоопухолевой активности
нового ингибитора синтаз оксида азота Т1023 / М.В. Филимонова, В.В. Южаков, Л.П.
Шевченко и др. / Молек. мед. – 2015. - № 1. – С.61-64.
122.
Хабриев Р.У. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых
фармакологических веществ / Под общей ред. члена-корр. РАМН, проф. Р.У.Хабриева.
2-изд., перераб. и доп. – М.: ОАО «Издательство «Медицина», 2005. – 832 с.
123.
Харкевич, Д.А. Фармакология. Учебник для вузов / Д.А. Харкевич. 10-е изд. – М.:
ГЭОТАР-Медиа, 2010. – 908 с.
124.
Хубулаева, Г.Г. Перспективы развития сердечно-сосудистой хирургии в Вооружѐнных
Силах РФ / Г.Г. Хубулаева, А.А. Ерофеев, О.В. Маслянюк // Материалы научнопрактической конференции «Перспективные технологии медицинского обеспечения
Вооружѐнных Сил Российской Федерации» - СПб.: ВМедА, 2013. – С.142-145.
125.
Цыб, А.Ф. Радиация и патология: учебное пособие / А.Ф. Цыб, Р.С. Будагов, И.А.
Замулаева и др.; под общ. ред. А.Ф. Цыба. - М.: Высшая школа, 2005. – 341 с.
126.
Цыб, А.Ф. Медицинские последствия аварии / А.Ф. Цыб, В.К. Иванов, М.А. Максютов
М.А. / 25 лет чернобыльской аварии. Итоги и перспективы преодоления ее последствий
в России, 1986-2011. Российский национальный доклад; под общ. ред. С.К. Шойгу, Л.А.
Большова - М.: МЧС России, 2011. - С.75-104/
127.
Чеснокова, Н.Б. Экспериментальное обоснование применения оксида азота в газовом
потоке для лечения травм глаза / Н.Б. Чеснокова, Р.А. Гундорова, О.И. Кваша и др. //
Вестник РАМН. – 2003. - № 5. – С.40-44.
128.
Черешнев, В.А. Фармакологическое регулирование программированной гибели клеток /
В.А. Черешнев, В.Н. Цыган, М.М. Одинак. - СПб.: Наука, 2011. - 255 с.
129.
Чернеховская, Н.Е. Влияние оксида азота и лазеротерапии на репаративные процессы в
условиях гнойной раны / Н.Е. Чернеховская, А.А. Чомаева, В.К. Шишло // Лазерная
медицина. – 2013. – Т.17, №.1. – С.26-28.
130.
Чернеховская, Н.Е. Немедикаментозные методы лечения венозных трофических язв
нижних конечностей / Н.Е. Чернеховская, В.К. Шишло, А.А. Чомаева // Паллиативная
медицина и реабилитация. – 2014. - №.2. – С.9-12.
131.
Шутеу, Ю. Шок / Ю. Шутеу, Т. Бэндилэ, А. Кафрицэ, А.И. Букур, В. Кындя. - Бухарест:
Военное издательство, 1981. – 515 с.
132.
Щегловитова, О.Н. Влияние интерферона на продукцию оксида азота клетками
эндотелия сосудов человека, инфицированными вирусом простого герпеса I-го типа /
О.Н. Щегловитова, З.В. Куроптева, Л.Г. Наглер и др. // Иммунология. – 2009. – Т.30,
№.5. – С.279-282.
133.
Южаков, В.В. Эффективность фракционированного воздействия γ-излучения и быстрых
нейтронов на саркому М1 /В.В. Южаков, Л.Е. Севанькаева, С.Е. Ульяненко и др. /
Радиац. биол. Радиоэкол. – 2013. – Т.53, № 3. – С.267-279.
134.
Эседов, Э.М. Динамика содержания оксида азота в желудочном соке у больных с
хеликобактер-ассоциированными заболеваниями желудка и двенадцатиперстной кишки
213
до и после лечения / Э.М. Эседов, А.С. Абасова // Экспер. клинич. гастроэнтнрол. – 2012.
- №.5. – С.22-28.
135.
Ярмоненко, С.П. Радиобиология человека и животных. Учебное пособие / С.П.
Ярмоненко, А.А. Вайсон. - М.: Высшая школа, 2004. – 549 с.
136.
Abdel-Rahman, O. Sorafenib-based combination as a first line treatment for advanced
hepatocellular carcinoma: a systemic review of the literature / O. Abdel-Rahman, M. Fouad //
Crit. Rev. Oncol. Hematol. – 2014. – Vol.91, N.1. – P.1-8.
137.
Adams, M.E. The alpha-syntrophin PH and PDZ domains scaffold acetylcholine receptors,
utrophin, and neuronal nitric oxide synthase at the neuromuscular junction / M.E. Adams, K.N.
Anderson, S.C. Froehner // J. Neurosci. – 2010. – Vol.30, N.33. – P.11004-11010.
138.
Alderton, W.K. Nitric oxide synthases: structure, function and inhibition / W.K. Alderton, C.E.
Cooper, R.G. Knowles // Biochem. J. – 2001. – Vol.357, Pt.3. – P.593-615.
139.
Alderton, W.K. GW274150 and GW273629 are potent and highly selective inhibitors of
inducible nitric oxide synthase in vitro and in vivo / W.K. Alderton, A.D. Angell, C. Craig et al.
/ Br. J. Pharmacol. – 2005. – Vol.145, N.3. – P.301-312.
140.
Alexander, J.H. Effect of tilarginine acetate in patients with acute myocardial infarction and
cardiogenic shock: the TRIUMPH randomized controlled trial /J.H. Alexander, H.R. Reynolds,
A.L. Stebbins et al. // JAMA. – 2007. – Vol.297, N.15. – P.1657-1666.
141.
Al-Sa'Doni, H. S-Nitrosothiols: a class of nitric oxide-donor drugs / H. Al-Sa'Doni, A. Ferro //
Clin. Sci. - 2000. - Vol.98, N.5. - P.507-520.
142.
Al-Zobaidy, M.J. Differential sensitivity of basal and acetylcholine-induced activity of nitric
oxide to blockade by asymmetricdimethylarginine in the rat aorta / M.J. Al-Zobaidy, J. Craig,
W. Martin // Br. J. Pharmacol. – 2010. – Vol.160, N.6. – P.1476-1483.
143.
Andrades, M.E.. Bench-to-bedside review: sepsis - from the redox point of view / M.E.
Andrades, A. Morina, S. Spasic et al. // Crit. Care. – 2011. – Vol.15, N.5. – P.230-241.
144.
Antonov, I. Presynaptic and postsynaptic mechanisms of synaptic plasticity and metaplasticity
during intermediate-term memory formation in Aplysia / I. Antonov, E.R. Kandel, R.D.
Hawkins // J. Neurosci. – 2010. – Vol.30, N.16. – P.5781-5791.
145.
Avontuur, J.A. Prolonged inhibition of nitric oxide synthases in severe septic shock: a clinical
study / J.A. Avontuur, R.P. Tutein-Nolthenius, J.W. Van Bodegon et al. // Crit. Care Med. –
1998. – Vol.26, N.4. – P.660-667.
146.
Babu, B.R. N5-(1-imino-3-butenyl)-L-ornitine. A neuronal isoform selective mechanism-based
inactivator of nitric oxide synthase / B.R. Babu, O.W. Griffith // J. Biol. Chem. – 1998. –
Vol.273, N.15. – P.8882-8889.
147.
Babu, B.R. L-arginine binding to nitric-oxide synthase. The role of H-bonds to the nonreactive
guanidinium nitrogens / B.R. Babu, C. Frey, O.W. Griffith // J. Biol. Chem. – 1999. – Vol.274,
N.36. – P.25218-25226.
148.
Bailev, A. The tragedy of TRIUMPH for nitric oxide synthesis inhibition in cardiogenic shock:
where do we go from here? / A. Bailev, T.W. Pope, S.A. Moore et al. // Am. J. Cardiovasc.
Drugs. – 2007. – Vol.7, N.5. – P.337-345.
149.
Bakker, J. Glaxo Wellcome International Septic Shock Study Group. Administration of the
nitric oxide synthase inhibitor NG-methyl-L-arginine hydrochloride (546C88) by intravenous
infusion for up to 72 hours can promote the resolution of shock in patients with severe sepsis:
results of a randomized, double-blind, placebo-controlled multicenter study (study no. 144-
214
002) / J. Bakker, R. Grover, A. McLuckie et al. // Crit. Care Med. – 2004. – Vol.32, N.1. – P.112.
150.
Baluk, P. Cellular abnormalities of blood vessels as targets in cancer / P. Baluk, H. Hashizume,
D.M. McDonald // Curr. Opin. Genet. Dev. – 2005. – Vol.15, N.1. – P.102-111.
151.
Bansal, V. Arginine availability, arginase, and the immune response / V. Bansal, J.B. Ochoa //
Curr. Opin. Clin. Nutr. Metab. Care. – 2003. – Vol.6, N.2. – P.223-228.
152.
Bateman, R.M. Inhibiting nitric oxide overproduction during hypotensive sepsis increases local
oxygen consumption in rat skeletal muscle / R.M. Bateman, M.D. Sharpe, D. Goldman et al. //
Crit. Care Med. – 2008. – Vol.36, N.1. – P.225-231.
153.
Bedford, M.T. Protein arginine methylation in mammals: who, what and why / M.T. Bedford,
S.G. Clarke // Molecular Cell. – 2009. – Vol.33, N.1. – P.1-13.
154.
Bellamy, T.C. On the activation of soluble guanylyl cyclase by nitric oxide / T.C. Bellamy, J.
Wood, J. Garthwaite // PNAS. – 2002. – Vol.99, N.1. – P.507-510.
155.
Bergers, G. Modes of resistance to anti-angiogenic therapy / G. Bergers, D. Hanahan // Nat.
Rev. Cancer. – 2008. – Vol.8, N.8. – P.592-603.
156.
Bernatova, I. Endothelial dysfunction in experimental models of arterial hypertension: cause or
consequence? / I. Bernatova // Biomed. Res. Int. – 2014. – Vol.2014. - doi:
10.1155/2014/598271.
157.
Bir, S.C. Emerging role of PKA/eNOS pathway in therapeutic angiogenesis for ischaemic
tissue diseases / S.C. Bir, Y. Xiong, C.G. Kevil et al. // Cardiovasc. Res. – 2012. – Vol.95, N.1.
– P.7-18.
158.
Bland-Ward, P.A. 7-nitro indazole derivatives are potent inhibitors of brain, endothelium and
inducible isoforms of nitric oxide synthase / P.A. Bland-Ward, P.K. Moore // Life Sci. – 1995.
– Vol.57, N.11. – P.131-135.
159.
Bloch, K.D. Three members of the nitric oxide synthase II gene family (NOS2A, NOS2B and
NOS2C) colocalize to human chromosome 17 / K.D. Bloch, J.R. Wolfram, D.M. Brown et al. //
Genomics. – 1995. – Vol.27, N.3. – P.526-530.
160.
Boer, R. The inhibitory potency and selectivity of arginine substrate site nitric-oxide synthase
inhibitors is solely determined by their affinity toward the different isoenzymes / R. Boer, W.R.
Ulrich, T. Klein et al. // Mol. Pharmacol. – 2000. – Vol.58, N.5. – P.1026-1034.
161.
Boerma E.C., Ince C. The role of vasoactive agents in the resuscitation of microvascular
perfusion and tissue oxygenation in critically ill patients / E.C. Boerma, C. Ince/ Intens. Care
Med. - 2010. - Vol.36, N.12. – P.2004-2018.
162.
Bolanos, J.P. Roles of nitric oxide in brain hypoxia-ischemia / J.P. Bolanos, A. Almeida //
Biochim. Biophys. Acta. – 1999. – Vol.1411, N.1-2. – P.415-436.
163.
Bourgier, C. Pharmacological strategies to spare normal tissues from radiation damage: useless
or overlooked therapeutics? / C. Bourgier, A. Levy, M.C. Vozenin et al. // Cancer Metastasis
Rev. – 2012. – Vol.31, N.3-4. – P.699-712.
164.
Bredt, D.S. Nitric oxide signaling specificity – the heart of the problem / D.S. Bredt // J. Cell
Sci. – 2003. – Vol.116, Pt.1. – P.9-15.
165.
Broom, L. Neuroprotection by the selective iNOS inhibitor GW274150 in a model of
Parkinson disease / L. Broom, L. Marinova-Mutafchieva, M. Sadeghian et al. // Free Rad. Biol.
Med. – 2011. – Vol.50, N.5. – P.633–640.
215
166.
Brovkovych, V. A novel pathway for receptor-mediated post-translation activation of inducible
nitric oxide synthase / V. Brovkovych, Y. Zhang, S. Brovkovych et al. // J. Cell Mol. Med. –
2011. – Vol.15, N.2. – P.258-269.
167.
Brown, G.C. Nitric oxide and mitochondrial respiration in the heart / G.C. Brown, V. Borutaite
// Cardiovasc. Res. – 2007. – Vol.75, N.2. – P.283-290.
168.
Brown, G.C. Nitric oxide and neuronal death / G.C. Brown // Nitric Oxide. – 2010. – Vol.23,
N.3. – P.153-165.
169.
Brown, G.C. Inflammatory neurodegeneration and mechanisms of microglial killing of neurons
/ G.C. Brown, J.J. Neher // Mol. Neurobiol. – 2010. – Vol.41, N.2-3. – P.242-247.
170.
Brozickova, C. Effect of an inhibitor of neuronal nitric oxide synthase 7-nitroindazole on
cerebral hemodynamic response and brain excitability in urethane-anesthetized rats / C.
Brozickova, J. Otahal // Physiol. Res. – 2013. – Vol.62, Suppl.1. – P.57-66.
171.
Brune, B. Nitric oxide: NO apoptosis or turning it ON? / B. Brune // Cell Death Differ. – 2003.
– Vol.10, N.8. – P.864-869.
172.
Brunton, T.L. On the use of nitrite of amyl in angina pectoris / T.L. Brunton // Lancet. – 1867.
– N.2. – P.97–98.
173.
Brunton, L. Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics; 12th ed. / L.
Brunton, B. Chabner, B. Knollman. - NY: McGraw Hill Professional, 2010. - 1808 p.
174.
Burke, A.J. The yin and yang of the nitric oxide in cancer progression / A.J. Burke, F.J.
Sullivan, F.J. Giles et al. // Carcinogenesis. – 2013. – Vol.34, N.3. – P.503-512.
175.
Butler, A.R. Diffusion of nitric oxide and scavenging by blood in the vasculature / A.R. Butler,
I.L. Megson, P.G. Wright // Biochim. Biophys. Acta. – 1998. – Vol.1425, N.1. – P.168-176.
176.
Caimi, G. Nitric oxide methabolites and oxidative stress in mild essential hypertension / G.
Caimi, G. Mule, E. Hopps et al. // Clin. Hemorheol. Microcirc. – 2010. – Vol.46, N.4. – P.321325.
177.
Calcerrada, P. Nitric oxide-derived oxidants with a focus on peroxynitrite: molecular targets,
cellular responses and therapeutic implications / P. Calcerrada, G. Peluffo, R. Radi // Curr.
Pharm. Des. – 2011. – Vol.17, N.35. – P.3905-3932.
178.
Cardnell, R.J. Nitric oxide synthase inhibition enhances the antitumor effect of radiation in the
treatment of squamous carcinoma xenografts / R.J. Cardnell, R.B. Mikkelsen // PLoS One. –
2011. – Vol.6, N.5. - doi: 10.1371/journal.pone.0020147.
179.
Casadei, B. The emerging role of neuronal nitric oxide synthase in the regulation of myocardial
function / B. Casadei // Exp. Physiol. – 2006. – Vol.91, N.6. – P.943-955.
180.
Cauwels, A. Nitric oxide in shock / A. Cauwels // Kidney Int. – 2007. – Vol.72, N.5. – P.557565.
181.
Chambrier, P.E. BN80933, a dual inhibitor of neuronal nitric oxide synthase and lipid
peroxidation: a promising neuroprotective strategy / P.E. Chambrier, M. Auguet, B. Spinnewyn
et al. // PNAS. – 1999. – Vol.96, N.19. – P.10824-10829.
182.
Chang, W.J. Neuronal nitric oxide synthase and dystrophin-deficient muscular dystrophy / W.J.
Chang, S.T. Iannaccone, K.S. Lau et al. // PNAS. – 1996. – Vol.93, N.17. – P.9142-9147.
183.
Chao, J.I. Down-regulation of surviving in nitric oxide-induced cell growth inhibition and
apoptosis of the human lung carcinoma cells / J.I. Chao, P.C. Kuo, T.S. Hsu // J. Biol. Chem. –
2004. – Vol.279, N.19. – P.20267-20276.
216
184.
Chardnell, R.J. Nitric oxide synthase inhibition enhances the antitumor effect of radiation in the
treatment of squamous carcinoma xenografts / R.J. Chardnell, R.B. Mikkelsen // PLoS One. –
2011. – Vol.6, N.5. - e20147. doi: 10.1371.
185.
Chen, C.A. S-glutathionylation uncouples eNOS and regulates its cellular and vascular function
/ C.A. Chen, T.Y. Wang, S. Varadharaj et al. // Nature. – 2010. – Vol.468, N.7327. – P.11151118.
186.
Cheng, H. Nitric oxide in cancer metastasis / H. Cheng, L. Wang, M. Mollica // Cancer Lett. –
2014. – Vol.352, N.1. – P.1-7.
187.
Cheshire, D.R. The discovery of novel, potent and highly selective inhibitors of inducible nitric
oxide synthase (iNOS) / D.R. Cheshire, A. Aberg, G.M. Andersson et al. // Bioorg. Med.
Chem. Lett. – 2011. – Vol.21, N.8. – P.2468-2471.
188.
Choudhari, S.K. Nitric oxide and cancer: a review / S.K. Choudhari, M. Chaudhary, S. Bagde
et al. // World J. Surg. Oncol. – 2013. – Vol.11. - doi: 10.1186/1477-7819-11-118.
189.
Cifone, M.G. Role of nitric oxide in cell-mediated tumor cytotoxicity / M.G. Cifone, L. Cironi,
M.A. Meccia et al. // Adv. Neuroimmunol. – 1995. – Vol.5, N.4. – P.443-461.
190.
Citrin, D. Radioprotectors and mitigators of radiation-induced normal tissue injury / D. Citrin,
A.P. Cotrim, F. Hyodo et al. // Oncologist. – 2010. – Vol.15, N.4. – P.360-371.
191.
Cohen, R.A. Mechanism of nitric oxide-induced vasodilatation- refilling of intracellular stores
by sarcoplasmic reticulum Ca2+ ATPase and inhibition of store-operated Ca2+ influx / R.A.
Cohen, R.M. Weisbrod, M. Gericke et al. // Circ. Res. – 1999. – Vol.84, N.2. – P.210-219.
192.
Connor, J.R. Suppression of adjuvant-induced arthritis by selective inhibition of inducible
nitric oxide synthase / J.R. Connor, P.T. Manning, S.L. Settle et al. // Eur. J. Pharmacol. –
1995. – Vol.273, N.1-2. – P.15-24.
193.
Cook, T. Nitric oxide and ionizing radiation synergistically promote apoptosis and growth
inhibition of cancer by activating p53 / T. Cook, Z. Wang, S. Alber et al. // Cancer Res. – 2004.
– Vol.64, N.21. – P.8015-8021.
194.
Cooper, G.R. Cellular and enzymatic studies of N(omega)-propyl-l-arginine and S-ethyl-N-[4(trifluoromethyl)phenyl]isothiourea as reversible, slowly dissociating inhibitors selective for
the neuronal nitric oxide synthase isoform / G.R. Cooper, K. Mialkowski, D.J. Wolff // Arch.
Biochem. Biophys. – 2000. – Vol.375, N.1. – P.183-194.
195.
Copp, R.R. Radioprotective efficacy and toxicity of a new family of aminothiol analogs / R.R.
Copp, D.D. Peebles, C.W. Soref et al. // Int. J. Radiat. Biol. – 2013. – Vol.89, N.7. – P.485492.
196.
Copp, S.W. Muscle fibre-type dependence of neuronal nitric oxide synthase-mediated vascular
control in the rat during high speed treadmill running / S.W. Copp, C.T. Holdsworth, S.K.
Ferguson et al. // J. Physiol. – 2013. – Vol.591, Pt.11. – P.2885-2896.
197.
Cox, J.D. Toxicity criteria of the Radiation Therapy Oncology Group (RTOG) and the
European Organization of Research and Treatment of Cancer (EORTC) / J.D. Cox, J. Stetz,
T.F. Pajak // Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. – 1995. – Vol.31, N.5. – P.1341-1346.
198.
Cuzzocrea, S. Beneficial effects of GW274150, a novel, potent and selective inhibitor of iNOS
activity, in a rodent model of collagen-induced arthritis / S. Cuzzocrea, P.K. Chatterjee, E.
Mazzon et al. // Eur. J. Pharmacol. – 2002. – Vol.453, N.1. – P.119-129.
199.
Dableh, L.J. The selective neuronal nitric oxide synthase inhibitor 7-nitroindazole has acute
analgesic but not cumulative effects in a rat model of peripheral neuropathy / L.J. Dableh, J.L.
Henry // J. Pain Res. – 2011. – Vol.4. – P.85-90.
217
200.
Daff, S. Calmodulin-dependent regulation of mammalian nitric oxide synthase / S. Daff //
Biochem. Soc. Trans. – 2003. – Vol.31, Pt.3. – P.502–505.
201.
Daff, S. NO synthase: structures and mechanism / S. Daff // Nitric Oxide. – 2010. – Vol.23,
N.1. – P.1-11.
202.
Davis, M.E. Shear stress regulates endothelial nitric-oxide synthase promoter activity through
nuclear factor kappaB binding / M.E. Davis, I.M. Grumbach, T. Fukai et al. // J. Biol. Chem. –
2004. – Vol.279, N.1. – P.163-168.
203.
Davy, H. The collected works of Sir Humphry Davy / H. Davy, J. Davy. - Smith, Elder and Co,
London, 1839.
204.
De Alba, J. GW274150, a novel and highly selective inhibitor of the inducible isoform of nitric
oxide synthase (iNOS), shows analgesic effects in rat models of inflammatory and neuropathic
pain / J. De Alba, N.M. Clayton, S.D. Collins et al. // Pain. – 2006. – Vol.120, N.1-2. – P.170–
181.
205.
Delmas, A. Clinical review: Vasopressin and terlipressin in septic shock patients / A. Delmas,
M. Leone, S. Rousseau et al. / Crit. Care. - 2005. – Vol.9, N.2. - P.212-222.
206.
Derbyshire, E.R. Structure and regulation of soluble guanylate cyclase / E.R. Derbyshire, M.A.
Marletta // Annu. Rev. Biochem. – 2012. – Vol.81. – P.533-559.
207.
Di Paola, R. Beneficial effects of GW274150 treatment on the development of experimental
colitis induced by dinitrobenzene sulfonic acid / R. Di Paola, E. Mazzon, N.S. Patel et al. //
Eur. J. Pharmacol. – 2005. – Vol.507, N.1-3. – P.281-289.
208.
Drapier, J.C. Modulation by nitric oxide of metalloprotein regulatory activities / J.C. Drapier,
C. Bouton // Bioessays. – 1996. – Vol.18, N.7. – P.549-556.
209.
Du, F. Real-time monitoring of NO release from single cells using carbon fiber microdisk
electrodes modified with single-walled carbon nanotubes / F. Du, W. Huang, Y. Shi et al. //
Biosens. Bioelectron. – 2008. – Vol.24, N.3. – P.415-421.
210.
Dudzinski, D.M. The regulation and pharmacology of endothelial nitric oxide synthase / D.M.
Dudzinski, J. Igarashi, D.M. Greif et al. // Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. – 2006. – Vol.46. –
P.235–276.
211.
Dudzinski, D.M. Life history of eNOS: Partners and pathway / D.M. Dudzinski, T. Michel //
Cardiovasc. Res. – 2007. – Vol.75, N.2. – P.247-260.
212.
Dumbarton, T.C. Prolonged methylene blue infusion in refractory septic shock: a case report /
T.C. Dumbarton, S. Minor, C.K. Yeung // Can. J. Anaesth. – 2011. – Vol.58, N.4. – P.401-405.
213.
Earley, S. Serotonin receptors take the TRiPV4 highway in chronic hypoxic pulmonary
hypertension. Focus on "TRPV4 channel contributes to serotonin-induced pulmonary
vasoconstriction and the enhanced vascular reactivity in chronic hypoxic pulmonary
hypertension” / S. Earley, N. Leblanc // Am. J. Physiol. Cell. Physiol. – 2013. – Vol.305, N.7. –
P.690-692.
214.
El-Gayer, S. Translation control of inducible nitric oxide synthase by IL-13 and arginine
availability in inflammatory macrophages / S. El-Gayer, H. Thuring- Nahler, J. Pfeilschifter et
al. // J. Immunol. – 2003. – Vol.171, N.9. – P.4561-4568.
215.
Eyler, C.E. Glioma stem cell proliferation and tumor growth are promoted by nitric oxide
synthase-2 / C.E. Eyler, Q. Wu, K. Yan et al. // Cell. - 2011. - Vol.146, N.1. - P.53-66.
216.
Eynott, P.R. Role of nitric oxide in allergic inflammation and bronchial hyperresponsiveness /
P.R. Eynott, D.A. Groneberg, G. Caramori et al. // Eur. J. Pharmacol. – 2002. – Vol.452, N.1. –
P.123-133.
218
217.
Fahl, W.E. Effect of topical vasoconstrictor exposure upon tumorocidal radiotherapy / W.E.
Fahl // Int. J. Cencer. – 2014. – Vol.135, N.4. – P.981-989.
218.
Fang, P. Efficacy and safety of bevacizumab for the treatment of advanced hepatocellular
carcinoma: a systematic review of phase II trials / P. Fang, J.H. Hu, Z.G. Cheng et al. // PLoS
One. – 2012. – Vol.7, N.12. - doi: 10.1371/journal.pone.0049717.
219.
Faraci, W.S. 2-amino-4-methylpyridine as a potent inhibitor of inducible NO synthase activity
in vitro and in vivo / W.S. Faraci, A.A. Nagel, K.A. Verdries et al. // Br. J. Pharmacol. – 1996.
– Vol.119, N.6. – P.1101-1108.
220.
Feng, C. Mechanism of nitric oxide synthase regulation: electron transfer and interdomain
interactions / C. Feng // Coord. Chem. Rev. – 2012. – Vol.256, N.3-4. – P.393-411.
221.
Ferdinandy, P. Peroxynitrite: just an oxidative/nitrosative stressor or a physiological regulator
as well? / P. Ferdinandy // Br. J. Pharmacol. – 2006. – Vol.148, N.1. – P.1-3.
222.
Ferquson-Myrthil, N. Vasopressor use in adult patients / N. Ferquson-Myrthil / Cardiol. Rev. 2012. - Vol.20, N.3. - P.153-158.
223.
Fernando, N.T. Tumor escape from endogenous, extracellular matrix-associated angiogenesis
inhibitor by up-regulation of multiple proangiogenic factors / N.T. Fernando, M. Koch, C.
Rothrock et al. // Clin. Cancer Res. - 2008. - Vol.14, N.5. - P.1529-1539.
224.
Filimonova, M.V. Vasopressive and radioprotective effects of NOS inhibitors - isothiourea
derivatives / M.V. Filimonova, S.E. Ulyanenko, T.P. Trofimova, L.I. Shevchenko et al. // Proc.
Int. Conf. “Radiation safety challengers in the 21th century”. – Yerevan, 2012. – P.33-35.
225.
Filippin, L.I. The role of nitric oxide during healing of trauma to the skeletal muscle / L.I.
Filippin, M.J. Cuevas, E. Lima et al. // Inflamm. Res. – 2011. – Vol.60, N.4. – P.347-356.
226.
Fink, M.P. Nitric oxide synthase and vascular dysfunction in sepsis: should we target niric
oxide synthase 1, nitric oxide synthase 2, both, or neither? / M.P. Fink // Crit. Care Med. –
2014. – Vol.42, N.6. – P.1572-1575.
227.
Folkman, J. Tumor angiogenesis: therapeutic implication / J. Folkman // N. Engl. J. Med. 1971. - Vol.285, N.21. - P.1182-1186.
228.
Fonseca, V. Differential sensitities of pulmonary and coronary arteries to hemoglobin-based
oxygen carries and nitrovasodilators: study in a bovine ex vivo model of vascular strips / V.
Fonseca, J. Avizinis, P. Moon-Massat et al. // Vascul. Pharmacol. – 2010. – Vol.52, N.5-6. –
P.215-223.
229.
Forstermann U. Oxidative stress in vascular disease: causes, defense mechanisms and potential
therapies // Nat. Clin. Pract. Cardiovasc. Med. – 2008. – Vol.5, N.6. – P.338-349.
230.
Forstermann, U. Nitric oxide synthases: regulation and function / U. Forstermann, W.C. Sessa
// Eur. Heart J. – 2012. – Vol.33, N.7. – P.829-837.
231.
Freedman, J.E. Nitric oxide and its relationship to thrombotic disorders / J.E. Freedman, J.
Loscalzo // J. Thromb. Haemost. – 2003. – Vol.1, N.6. – P.1183-1188.
232.
Frey, C. L-thiocitrulline: a stereospecific, heme-binding inhibitor of nitric-oxide synthases / C.
Frey, K. Narayanan, K. McMillan et al. // J. Biol. Chem. – 1994. – Vol.269, N.42. – P.2608326091.
233.
Frost, P. Mammalian target of rapamycin inhibitors induce tumor cell apoptosis in vivo
primarily by inhibiting VEGF expression and angiogenesis / P. Frost, E. Berlanger, V. Mysore
et al. // J. Oncol. - 2013. – Vol.2013, Article ID 897025.
219
234.
Fujikura, Y. The effect of nitric oxide on vaccinia virus-encoded ribonucleotide reductase / Y.
Fujikura, P. Kudlackova, M. Vokurka et al. // Nitric Oxide. – 2009. – Vol.20, N.2. – P.114-121.
235.
Fulton, D. Regulation of endothelium-derived nitric oxide production by the protein kinase Akt
/ D. Fulton, J.P. Gratton, T.J. McCabe et al. // Nature. - 1999. - Vol.399, N.8736. - P.597-601.
236.
Fulton, D. Agonist-stimulated andothelian nitric oxide synthase activation and vascular
relaxation. Role of eNOS phosphorylation at Tyr83 / D. Fulton, L. Ruan, S.G. Sood et al. //
Circ. Res. - 2008. - Vol.102, N.4. - P.497-504.
237.
Furchgott, R.F. The obligatory role of endothelial cells in the relaxation of arterial smooth
muscle by acetylcholine / R.F. Furchgott, J.V. Zawadzki // Nature. – 1980. – Vol.288, N.5789.
– P.373–376.
238.
Furfine, E.S. Selective inhibition of constitutive nitric oxide synthase by L-NG-nitroarginine /
E.S. Furfine // Biochemistry. – 1993. – Vol.32, N.33. – P.8512-8517.
239.
Furfine, E.S. Potent and selective inhibition of human nitric oxide synthases. Selective
inhibition of neuronal nitric oxide synthase by S-methyl-L-thiocitrulline and S-ethyl-Lthiocitrulline / E.S. Furfine, M.F. Harmon, J.E. Paith et al. // J. Biol. Chem. – 1994. - Vol.269,
N.43. – P.26677–26683.
240.
Gadhi, N.M. Radiation protection by diethyldithiocarbamate: protection of membrane and
DNA in vitro and in vivo against gamma-radiation / N.M. Gadhi, C.K. Nair // J. Radiat. Res. –
2004. Vol.45, N.2. – P.175-180.
241.
Gamboa, A. Contribution of endothelial nitric oxide to blood pressure in humans / A. Gamboa,
C. Shibao, A. Diedrich et al. // Hypertension. – 2007. – Vol.49, N.1. – P.170-177.
242.
Garcin, E.D. Anchored plasticity opens doors for selective inhibitor design in nitric oxide
synthase / E.D. Garcin, A.S. Arvai, R.J. Rosenfeld et al. // Nat. Chem. Biol. – 2008. – Vol.4,
N.11. – P.700-707.
243.
Garthwaite, J. Endothelium-derived relaxing factor release on activation of NMDA receptors
suggests role as intercellular messenger in the brain / J. Garthwaite, S.L. Charles, R. ChessWilliams // Nature. - 1988. - Vol.336, N.6197. - P.385-388.
244.
Garthwaite, J. New insight into the functioning of nitric oxide-receptive guanylyl cyclase:
physiological and pharmacological implications / J. Garthwaite // Mol. Cell Biochem. – 2010. –
Vol.334, N.1-2. – P.221-232.
245.
Garvey, E.P. Potent and selective inhibition of human nitric oxide synthases. Inhibition by nonamino acid isothioureas / E.P. Garvey, J.A. Oplinger, G.J. Tanoury et al. // J. Biol. Chem. –
1994. – Vol.269, N.43. – P.26669-26676.
246.
Garvey, E.P. 1400W is a slow, tight binding, and highly selective inhibitor of inducible nitricoxide synthase in vitro and in vivo / E.P. Garvey, J.A. Oplinger, E.S. Furfine et al. // J. Biol.
Chem. – 1997. – Vol.272, N.8. P.4959-4963.
247.
Gaston, B. Endogenous nitrogen oxides and bronchodilator S-nitrosothiols in human airways /
B. Gaston, J. Reilly, J.M. Drazen et al. // PNAS. – 1993. – Vol.90, N.23. – P.10957-10961.
248.
Gautier, C. Endothelial nitric oxide synthase reduces nitrite anions to NO under anoxia / C.
Gautier, E.E. van Faassen, I. Mikula et al. // Biochem. Biophys. Res. Commun. – 2006. –
Vol.341, N.3. – P.816-821.
249.
Gilchrist, M. Expression, localization, and regulation of NOS in human mast cell lines: effects
on leukotriene productions / M. Gilchrist, S.D. McCauley, A.D. Befus // Blood. – 2004. –
Vol.104, N.2. – P.462-469.
220
250.
Giovannoni, G. Adaptation of the nitrate reductase and Griess reaction methods for the
measurement of serum nitrate plus nitrite levels / G. Giovannoni, J.M. Land, G. Keir et al. //
Ann. Clin. Biochem. – 1997. – Vol.34, Pt.2. – P.193-198.
251.
Giroud, C. Role of arginine guanidinium moiety in nitric-oxide synthase mechanism of oxygen
activation / C. Giroud, M. Moreau, T.A. Mattioli et al. // J. Biol. Chem. – 2010. – Vol.285,
N.10. – P.7233-7245.
252.
Gkisioti. S. Vasogenic shock physiology / S. Gkisioti, S.D. Mentzelopoulos // Open Acc.
Emerg. Med. – 2011. – Vol.3. – doi: 10.2147/OAEM.S10388.
253.
Godoy, L.C. Endogenously produced nitric oxide mitigates sensitivity of melanoma cells to
cisplatin / L.C. Godoy, C.T. Anderson, R. Chowdhury et al. // PNAS. – 2012. – Vol.109, N.50.
– P.20373-20378.
254.
Goodyer, C.L. Synthesis of N-benzyl- and N-phenyl-2-amino-4,5-dihydrothiazoles and
thioureas and evaluation as modulators of the isoforms of nitric oxide synthase / C.L. Goodyer,
E.C. Chinje, M. Jaffar et al. // Bioorg. Med. Chem. – 2003. – Vol.11, N.19. – P.4189-4206.
255.
Gookin, J.L. Inducible nitric oxide synthase mediates early epithelial repair of porcine ileum /
J.L. Gookin, J.M. Rhoads, R.A. Argenzio // Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. - 2002.
- Vol.283, N.1. - P.157-168.
256.
Gorren, A.C. Tetrahydrobiopterin in nitric oxide synthesis: a novel biological role for
pteridines / A.C. Gorren, B. Mayer // Curr. Drug Metab. – 2002. – Vol.3, N.2. – P.133-157.
257.
Gorren, A.C. High-pressure studies of the reaction mechanism of nitric oxide synthase / A.C.
Gorren, S. Marchal, M. Sorlie et al. // Biochim. Biophys. Acta. – 2006. – Vol.1764, N.3. –
P.578-585.
258.
Govers, R. Cellular regulation of endothelian nitric oxide synthase / R. Govers, T.J. Rabelink //
Am. J. Physiol. Renal. Physiol. – 2001. – Vol.280, N.2. – P.103-106.
259.
Gow, A.J. Reactions between nitric oxide and haemoglobin under physiological conditions /
A.J. Gow, J.S. Stamler // Nature. - 1998. - Vol.391, N.6663. - P.169-173.
260.
Gratton, J.P. Selective inhibition of tumor microvascular permeability by cavtratin blocks
tumor progression in mice / J.P. Gratton, M.I. Lin, J. Yu et al. // Cancer Cell. – 2003. – Vol.4,
N.1. – P.31-39.
261.
Green, L.C. Analysis of nitrate, nitrite and [15N]nitrate in biological fluids / L.C. Green, D.A.
Wagner, J. Glogowski et al. // Anal. Biochem. – 1982. – Vol.126, N.1. – P.131-138.
262.
Groschner, L.N. Endothelial mitochondria – less respiration, more integration / L.N.
Groschner, M.W. Weiermair, R. Malli et al. // Pflugers Arch. – 2012. – Vol.464, N.1. – P.6376.
263.
Grover, R. An open-label dose escalation study of nitric oxide synthase inhibitor, N(G)-methylL-arginine hydrochloride (546C88), in patients with septic shock / R. Grover, D. Zaccardelli,
G. Colice et al. // Crit. Care Med. – 1999. – Vol.27, N.5. – P.913-922.
264.
Gutierrez, F.R. The effects of nitric oxide on the immune system during Trypanosoma cruzi
infection / F.R. Gutierrez, T.W. Mineo, W.R. Pavanelli et al. // Mem. Inst. Oswaldo Cruz. –
2009. – Vol.104, Suppl.1. – P.236-245.
265.
Hah,
J.M.
Reduced
amide
bond
peptidomimetics
(4S)-N-(4-amino-5[aminoalkyl]aminopentyl)-N-nitroguanidines, potent and highly selective inhibitor of neuronal
nitric oxide synthase / J.M. Hah, L.J. Roman, P. Martasek, et al. // J. Med. Chem. – 2001. –
Vol.44, N.16. – P.2667-2670.
221
266.
Hall, C.N. What is the real physiological NO concentration in vivo? / C.N. Hall, J. Garthwait //
Nitric Oxide. – 2009. – Vol.21, N.2. – P.92-103.
267.
Hallinan, E.A. Synthesis and biological characterization of L-N(6)-(1-iminoethyl)lysine 5tetrazole-amide, a prodrug of a selective iNOS inhibitor / E.A. Hallinan, S. Tsymbalov, C.R.
Dorn et al. // J. Med. Chem. – 2002. – Vol.45, N.8. – P.1686-1689.
268.
Han, R.N. Defective lung vascular development in endothelial nitric oxide synthase-deficient
mice / R.N. Han, D.J. Stewart // Trends Cardiovasc. Med. – 2006. – Vol.16, N.1. – P.29-34.
269.
Han, R.Z. NMDA receptor antagonist MK-801 reduces neuronal damage and preserves
learning and memory in a rat model of traumatic brain injury / R.Z. Han, J.J. Hu, Y.C. Weng et
al. // Neurosci. Bull. – 2009. – Vol.25, N.6. – P.367-375.
270.
Hansel, T.T. A selective inhibitor of inducible nitric oxide synthase inhibits exhaled breath
nitric oxide in healthy volunteers and asthmatics / T.T. Hansel, S.A. Kharitonov, L.E. Donnelly
et al. // FASEB J. – 2003. – Vol.17, N.10. – P.1298-1300.
271.
Hara, M.R. Nitric-oxide-GAPDH-Siah: a novel cell death cascade / M.R. Hara, S.H. Snyder //
Cell Mol. Neurobiol. – 2006. – Vol.26, N.4-6. – P.527-538.
272.
Hardingham, N. The role of nitric oxide in pre-synaptic plasticity and homeostasis / N.
Hardigham, J. Dachtler, K. Fox // Front Cell Neurosci. – 2013. – Vol. 7. - doi:
10.3389/fncel.2013.00190.
273.
Hare, J.M. NO/redox disequilibrium in the failing heart and cardiovascular system / J.M. Hare,
J.S. Stamler // J. Clin. Invest. – 2005. – Vol.115, N.3. – P.509-517.
274.
Harmon, S. Mechanisms of aggregation inhibition by aspirin and nitrate-aspirin prodrags in
human plateles / S. Harmon, I. Inkielewicz-Stepniak, M. Jones et al. // J. Pharm. Pharmacol. –
2012. – Vol.64, N.1. – P.77-89.
275.
Hecker, M. On the substrate specifity of nitric oxide synthase / M. Hecker, D.T. Walsh, J.R.
Vane // FEBS Lett. – 1991. – Vol.294, N.3. – P.221-224.
276.
Heiffer, M.H. The pharmacology of radioprotective chemicals. On some of the effects of betamercaptoethylamine (MEA) and cystamine in the rat / M.H. Heiffer, R.L. Mundy, B. Mehlman
// Radiat. Res. – 1962. – Vol.16. – P.165-172.
277.
Hensley, M.L.American Society of Clinical Oncology 2008 clinical practice guideline update:
use of chemotherapy and radiation therapy protectants / M.L. Hensley, K.L. Hagerty, T.
Kewalramani et al. // J. Clin. Oncol. – 2009. – Vol.27, N.1. – P.127-145.
278.
Hernandez, G. Microcirculation in sepsis: new persprctives / G. Hernandez, A. Bruhn, C. Ince
// Curr. Vasc. Pharmacol. – 2013. – Vol.11, N.2. – P.161-169.
279.
Hobbs, A.J. Inhibition of nitric oxide synthase as a potential therapeutic target / A.J. Hobbs, A.
Higgs, S. Moncada // Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. – 1999. – Vol.39. – P.191-220.
280.
Hogg, N. Detection of nitric oxide by electron paramagnetic resonance spectroscopy / N. Hogg
// Free Radic. Biol. Med. – 2010. – Vol.49, N.2. – P.122-129.
281.
Hoivik, H.O. Lack of efficacy of the selective iNOS inhibitor GW274150 in prophylaxis of
migraine headache / H.O. Hoivik, B.E. Laurijssens, L.O. Harnisch et al. // Cephalalgia. – 2010.
– Vol.30, N.12. – P.1458-1467.
282.
Hollenberg, S.M. Bench-to-bedside review: nitric oxide in critical illness-update 2008 / S.M.
Hollenberg, I. Cinel // Crit. Care. – 2009. – Vol.13, N.4. – P.218-226.
222
283.
Hossain, M. Inhibition of nitric oxide synthesis enhances leukocyte rolling and adhesion in
human microvasculature / M. Hossain, S.M. Qadri, L. Liu // J. Inflamm. (Lond.). – 2012. –
Vol.9, N.1. - doi: 10.1186/1476-9255-9-28.
284.
Hosseinimehr, S.J. Foundation review: Trends in the development of radioprotective agents /
S.J. Hosseinimehr // Drugs Discov. Today. – 2007. – Vol.12, N.19/20. – P.794-805.
285.
Howes, L.G. Expert opinion on tilarginine in the treatment of shock / L.G. Howes, D.G.
Brillante // Expert Opin. Investig. Drugs. – 2008. – Vol.17, N.10. – P.1573-1580.
286.
Huang, H. p38 Mitogen-activated protein kinase mediated synergistic induction of inducible
nitric oxide synthase by lipopolysaccharide and interferon-gamma through signal transducer
and activator of transcription 1 Ser 727 phosphorylation in murine aortic endothelial cells / H.
Huang, J.L. Rose, D.G. Hoyt // Mol. Pharmacol. – 2004. – Vol.66, N.2. – P.302-311.
287.
Hummel, S.G. Nitric oxide as a cellular antioxidant: a little goes a long way / S.G. Hummel,
A.J. Fischer, S.M. Martin et al. // Free Radic. Biol. Med. – 2006. – Vol.40, N.3. – P.501-506.
288.
Huynh, N.N. Amino acids, arginase and nitric oxide in vascular health / N.N. Huynh, J. ChinDasting // Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. – 2006. – Vol.22, N.1-2. – P.1-8.
289.
Ignarro, L.G. Nitric oxide as a unique signaling molecule in the vascular system: a historical
overview / L.G. Ignarro // J. Physiol. Pharmacol. – 2002. – Vol.53, N.4, Pt.1. – P.503-514.
290.
Ijuin, R. Evaluaion of 3-substituted arginine analogs as selective inhibitors of human nitric
oxide synthase isozymes / R. Ijuin, N. Umezawa, S.I. Nagai et al. // Bioorg. Med. Chem. Lett. –
2005. - Vol.15, N.11. – P.2881–2885.
291.
Isenberg, J.S. Thrombospondin-1 and CD47 limit cell and tissue survival of radiation injury /
J.S. Isenberg, J.B. Maxhimer, F. Hyodo et al. // Am. J. Pathol. – 2008. – Vol.173, N.4. –
P.1100-1112.
292.
Isenberg, J.S. Regulation of nitric oxide signaling by thrombospondin-1: implications for antiangiogenic therapies / J.S. Isenberg, G. Martin-Manso, J.B. Maxhimer et al. // Nat. Rev.
Cancer. - 2009. - Vol.9, N.3. - P.182-194.
293.
Ishikawa, K. Effect of selective inhibition of renal inducible nitric oxide synthase on renal
blood flow and function in experimental hyperdynamics sepsis / K. Ishikawa, P. Calzavacca, R.
Bellomo et al. // Crit. Care Med. – 2012. – Vol.40, N.8. – P.2368-2375.
294.
Iyer, A.K. Role of S-nitrosylation in apoptosis resistance and carcinogenesis / A.K. Iyer, N.
Azad, L. Wang et al. // Nitric Oxide. – 2008. – Vol.19, N.2. – P.146–151.
295.
Jafarian-Tehrani, M. 1400W, a potenet selective inducible NOS inhibitor, improves
histopathological outcome following traumatic brain injury in rats // M. Jafarian-Tehrani, G.
Louin, N.C. Royo et al. // Nitric Oxide. – 2005. – Vol.12, N.2. – P.61-69.
296.
Jang, D.H. Methylene blue for distributive shock: a potential new of an old antidote / D.H.
Jang, L.S. Nelson, R.S. Hoffman // J. Med. Toxicol. – 2013. – Vol.9, N.3. – P.242-249.
297.
Ji, H. Conformationally restricted dipeptide amides as potent and selective neuronal nitric
oxide synthase inhibitors / H. Ji, J.A. Gomez-Vidal, P. Martazek et al. / J. Med. Chem. – 2006.
– Vol.49, N.21. – P.6254-6263.
298.
Ji, H. Selective neuronal nitric oxide synthase inhibitors and the prevention of cerebral palsy /
H. Ji, S. Tan, J. Igarashi et al. // Ann. Neurol. – 2009. – Vol.65, N.2. – P.209-217.
299.
Jian Z. Mechanochemotransduction during cardiomyocyte contraction is mediated by localized
nitric oxide signaling / Z. Jian, H. Han, T. Zhang // Sci. Signal. – 2014. – Vol.7, N.317. - doi:
10.1126/scisignal.2005046.
223
300.
Jordan, B.F. Nitric oxide as a radiosensitizer: evidence for an intrinsic role in addition to its
effect on oxygen delivery and consumption / B.F. Jordan, P. Sonveaux, O. Feron et al. // Int. J.
Cancer. – 2004. – Vol.109, N.5. – P.768-773.
301.
Juffermans, N.P. A dose-finding study of methylene blue to inhibit nitric oxide actions in the
hemodynamics of human septic shock / N.P. Juffermans, M.G. Vervloet, C.R. DaemenGubbels // Nitric Oxide. – 2010. – Vol.22, N.4. – P.275-280.
302.
Kanwar, J.R. Recent advances on the roles of NO in cancer and chronic inflammatory disorders
/ J.R. Kanwar, R.K. Kanwar, H. Burrow et al. // Curr. Med. Chem. - 2009. – Vol.16, N.19. P.2373-2394.
303.
Kashiwagi, S. NO mediates mural cell recruitment and vessel morphogenesis in murine
melanomas and tissue-engineered blood vessels / S. Kashiwagi, Y. Izumi, T. Gohongi et al. // J.
Clin. Invest. – 2005. – Vol.115, N.7. – P.1816-1827.
304.
Kelley, J.B. Long-termmemory of visually cued fear conditioning: roles of the neuronal nitric
oxide synthase gene and cyclic AMP response element-binding protein /J.B. Kelley, K.L.
Anderson, S.L. Altmann et al. // Neurosci. – 2011. - Vol.174. – P.91–103.
305.
Kellogg, D.L. Role of nitric oxide synthase isoforms in cutaneous vasodilation induced by local
warming of skin and whole body heat stress in humans / D.L. Kellogg, J.L. Zhao, Y. Wu // J.
Appl. Physiol. – 2009. – Vol.107, N.5. – P.1438-1444.
306.
Keynes, R.G. Nitric oxide consumption through lipid peroxidation in brain cell suspensions
and homogenates / R.G. Keynes, C.H. Griffiths, C. Hall et al. // Biochem. J. – 2005. – Vol.387,
Pt.3. – P.685-694.
307.
Kilbourn, R.G. Reversal of endotoxin-mediated shock by NG-methyl-L-arginine, an inhibitor
of nitric oxide synthesis / R.G. Kilbourn, A. Jubran, S.S. Gross et al. // Biochem. Biophys. Res.
Commun. – 1990. – Vol.172, N.3. – P.1132-1138.
308.
Kilbourn, R.G. Benificial versus determental effects of nitric oxide synthase inhibitors in
circulatory shock: lessons learned from experimental and clinical studies / R.G. Kilbourn, C.
Szab, D.L. Trauber // Shock. – 1997. – Vol.7, N.4. – P.235-246.
309.
Kim, W.S. Measuring nitric oxide in single neurons by capillary electrophoresis with laserinduced fluorescence: use of ascorbate oxidase in diaminofluorescein measurements / W.S.
Kim, X. Ye, S.S. Rubakhin et al. // Anal. Chem. – 2006. – Vol.78, N.6. – P.1859-1865.
310.
Klinger, J.R. Nitric oxide deficiency and endothelial dysfunction in pulmonary arterial
hypertension / J.R. Klinger, S.H. Abman, M.T. Gladwin // Am. Respir. Circ. Care Med. – 2013.
– Vol.188, N.6. – P.639-646.
311.
Koarai, A. Allergic airway hyperresponsiveness and eosinophil infiltration is reduced by a
selective iNOS inhibitor, 1400W, in mice / A. Koarai, M. Ichinose, H. Sugiura et al. // Pulmon.
Pharmacol. Ther. – 2000. – Vol.13, N.6. – P.267-275.
312.
Kobayashi, N. Dipeptides containing L-arginine analog: new isozyme-selective inhibitors of
nitric oxide synthase / N. Kobayashi, T. Higuchi, Y. Urano et al. // Biol. Pharm. Bull. – 1999. –
Vol.22, N.9. – P.936-940.
313.
Kogias, E. Growth-inhibitory and chemosensitizing effects of the glutathione-S-transferase-activated nitric oxide donor PABA/NO in malignant gliomas / E. Kogias, N. Osterberg, B.
Baumer et al. // Int. J. Cancer. – 2012. – Vol.130, N.5. – P.1184-1194.
314.
Kolodziejski, P.J. Regulation of inducible nitric oxid synthase by rapid cellular turnover and
cotranslation down-regulation by dimerization inhibitor / P.J. Kolodziejski, J.S. Koo, N.T.
Eissa // PNAS. – 2004. – Vol.101, N.52. – P.18141-18146.
224
315.
Komers, R. Effects of systemic inhibition of neuronal nitric oxide synthase in diabetic rats / R.
Komers, T.T. Oyama, J.G. Chapman et al. // Hypertension. – 2000. - Vol.35, N.2. – P.655–661.
316.
Korhonen, R. Dexamethasone inhibits inducible nitric-oxide synthase expression and nitric
oxide production by destabilizing mRNA in lipopolysaccharide-treated macrophages / R.
Korhonen, A. Lahti, M. Hamalainen et al. // Mol. Pharmacol. – 2002. – Vol.62, N.3. – P.698704.
317.
Koshland, D.E.Jr. The molecule of the year / D.E.Jr. Koshland // Science. – 1992. – Vol.258,
N.5090. – P.1861.
318.
Kouvaris, J.R. Amifostine: the first selective-target and broad-spectrum radioprotector / J.R.
Kouvaris, V.E. Kouloulias, L.J. Vlahos // Oncologist. – 2007. - Vol.12, N.6. – P.738-747.
319.
Krishnan, R. Airway smooth muscle and bronchospasm: fluctuating, fluidizing, freezing / R.
Krishnan, X. Trepat, T.T. Nguyen et al. // Respir. Physiol. Neurobiol. – 2008. – Vol.163, N.13. – P.17-24.
320.
Kubes, P. Nitric oxide: an endogenous modulator of leukocyte adhesion / P. Kubes, M. Suzuki,
D.N. Granger // PNAS. – 1991. – Vol.88, N.1. – P.4651-4655.
321.
Lahdenranta, J. Endothelial nitric oxide synthase mediates lymphangiogenesis and lymphatic
metastasis / J. Lahdenranta, J. Hagendoorn, T.P. Padera et al. // Cancer Res. – 2009. – Vol.69,
N.7. – P.2801-2808.
322.
Lambert, L.E. Nitric oxide synthsis in the CNS endothelium and macrophages differs in its
sensitivity to inhibition by arginine analogues / L.E. Lambert, J.P. Whitten, B.M. Baron et al. //
Life Sci. – 1991. – Vol.48, N.1. – P.69-75.
323.
Landmesser, U. Oxidation of tetrahydrobiopterin leads to uncoupling of endothelial cell nitric
oxide synthase in hypertension / U. Landmesser, S. Dikalov, S.R. Price et al. // J. Clin. Ivest. –
2003. – Vol.111, N.8. – P.1201-1209.
324.
Lange, M. Role of nitric oxide in shock: the large animal perspective / M. Lange, P.
Enkhbaatar, Y. Nakano et al. // Front Biosci. (Landmark Ed.). – 2009. – Vol.14. – P.19791989.
325.
Lange, M. Beneficial effects of concominant neuronal and inducible nitric oxide synthase
inhibition in ovine burn and inhalation injury / M. Lange, A. Hamahata, P. Enkhbaatar et al. //
Shock. – 2011. – Vol.35, N.6. – P.626-631.
326.
Larsson, A.K. Specific mediator inhibition by the NO donors SNP and NCX 2057 in the
peripheral lung: implications for allergen-induced bronchoconstriction / A.K. Larsson, M.
Back, J.O. Lundberg et al. // Respir. Res. – 2009. – Vol.10, N.1. – P.46-55.
327.
Lassen, L.H. A dose-response study of nitric oxide synthase inhibition in different vascular
beds in man / L.H. Lassen, H.K. Iversen, J. Olesen // Eur. J. Clin. Pharmacol. – 2003. – Vol.59,
N.7. – P.499-505.
328.
Laumonnier, Y. Caracterization of an upstream enhancer region in the promoter of the human
endothelial nitric oxide synthase gene / Y. Laumonnier, S. Nadaud, M. Agrapart et al. // J. Biol.
Chem. – 2000. – Vol.275, N.52. – P.40732-40741.
329.
Leach, J.K. Activation of constitutive nitric oxide synthase activity is an early signaling event
induced by ionizing radiation / J.K. Leach, S.M. Black, R.K. Schmidt-Ullrich et al. // J. Biol.
Chem. – 2002. – Vol.277, N.18. – P.15400-15406.
330.
Lecea, B. Regional functional specialization and inhibitory nitrergic and nonnitrergic
coneurotransmission in the human esophagus / B. Lecea, D. Gallego, R. Farre et al. // Am. J.
Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. – 2011. – Vol.300, N.5. – P.782-794.
225
331.
Lee, K.S. Differential effects of substrate-analogue inhibitors on nitric oxide synthase
dimerization / K.S. Lee, D.K. Lee, D. Jeoung et al. // Biochem. Biophys. Res. Commun. –
2012. – Vol.418, N.1. – P.49-55.
332.
Lefebvre, R.A. Pharmacological characterization of the nitrergic innervation of the stomach /
R.A. Lefebvre // Verh. K. Acad. Geneeskd. Belg. – 2002. – Vol.64, N.3. – P.151-166.
333.
Lein, S. Therapeutic anti-VEFG antibodies / S. Lein, H.B. Lowman // Handb. Exp. Pharmacol.
- 2008. - N.181. - P.131-150.
334.
Leiper, J. The therapeutic potential of targeting endogenous inhibitors of nitric oxide synthesis
/ J. Leiper, M. Nandi // Nat. Rev. Drug Discov. – 2011. – Vol.10, N.4. – P.277-291.
335.
Li, C.Q. Nitric oxide activation of Keep1/Nrf2 signaling in human colon carcinoma cells / C.Q.
Li, M.Y. Kim, L.C. Godoy et al. // PNAS. – 2009. – Vol.106, N.34. – P.14547-14551.
336.
Li, H. Mapping the active site polarity in structures of endothelial nitric oxide synthase heme
domain complexed with isothioureas / H. Li, C.S. Raman, P. Martasek et al. // J. Inorg.
Biochem. – 2000. – Vol.81, N.3. – P.133-139.
337.
Li, H. Structure-function studies on nitric oxide synthases / H. Li, T.L. Poulos // J. Inorg.
Biochem. – 2005. – Vol.99, N.1. – P.293-305.
338.
Li, L.M. Role of nitric oxide in lysis of tumor cells by cytokine-activated endothelial cells /
L.M. Li, R.G. Kilbourn, J. Adams et al. // Cancer Res. – 1991. – Vol.51, N.10. – P.2531-2535.
339.
Li, N. Effect of nitric oxide on calcium-induced calcium release in coronary arterial smooth
muscle / N. Li, A.P. Zou, Z.D. Ge et al. // Gen. Pharmacol. – 2001. – Vol.35, N.1. – P.37-45.
340.
Liebmann, J. In vivo radiation protection by nitric oxide modulation / J. Libmann, A.M.
DeLica, D. Ciffin et al. // Cancer Res. – 1994. – Vol.54, N.13. – P.3365-3368.
341.
Lim, K.H. Tumor maintenance is mediated by eNOS / K.H. Lim, B.B. Ancrile, D.F. Kashatus
et al. // Nature. - 2008. - Vol.452, N.7187. - P.646-649.
342.
Ling, Y. Novel nitric oxide-releasing derivatives of farnesylthiosalicylic acid: synthesis and
evaluation of antihepatocellular carcinoma activity / Y. Ling, X. Ye, Z. Zhang et al. // J. Med.
Chem. – 2011. – Vol.54, N.9. – P.3251-3259.
343.
Litchfield, J.T. A simplified method of evaluating dose-effect experiments / J.T. Litchfield, F.
Wilcoxon // J. Pharm. Exp. Ther. - 1947. - Vol.96, N.2. - P.99-113.
344.
Litzinger, E.A. Design, synthesis and biological testing of potential hemecoordinating nitric
oxide synthase inhibitors / E.A. Litzinger, P. Martasek, L.J. Roman et al. // Bioorg. Med.
Chem. – 2006. – Vol.14, N.9. – P.3185-3198.
345.
Lopez, A. Multiple-center, randomized, placebo-controlled, double-blind study of the nitric
oxide synthase inhibitor 546C88: effect on survival in patients with septic shock / A. Lopez,
J.A. Lorente, J. Steingrub ey al. // Crit. Care Med. – 2004. – Vol.32, N.1. – P.21-30.
346.
Lopez-Cara, L.C. Thiazole derivatives as selective inhibitors of iNOS versus nNOS: Synthesis
and structure-activity dependence / L.C. Lopez-Cara, M.D. Carrion, A. Entrena et al. // Eur. J.
Med. Chem. – 2012. – Vol.50. – P.129-139.
347.
Lorente, J.A. L-arginin pathway in the sepsis syndrome / J.A. Lorente, L. Landin, R. De Pablo
et al. // Crit. Care Med. – 1993. – Vol.21, N.9. – P.1287-1295.
348.
Lowry, J.L. Endothelial nitric-oxide synthase activation generates an inducible nitric-oxide
synthase-like output of nitric oxide in inflamed endothelium / J.L. Lowry, V. Brovkovych, Y.
Zhang et al. // J. Biol. Chem. – 2013. – Vol.288, N.6. – P.4174-4193.
226
349.
Lubos, E. Role of oxidative stress and nitric oxide in atherothrombosis / E. Lubos, G.H. Handy,
J. Loscalzo // Front. Biosci. – 2008. – Vol.13. – P.5323-5344.
350.
Mackenzie, I.S. Nitric oxide and cardiovascular effects: new insights in the role of nitric oxide
for the management ofosteoarthritis / I.S. Mackenzie, D. Rutherford, T.M. MacDonald //
Arthritis Res. Ther. – 2008. – Vol.10, Suppl.2. - doi: 10.1186/ar2464.
351.
Maia, L.B. Nitrite reduction by xantine oxidase family enzymes: a new class of nitrite
reductases / L.B. Maia, J.J. Moura // J. Biol. Inorg. Chem. – 2011. – Vol.16, N.3. – P.443-460.
352.
Maier, P. Radioprotection of normal tissue cells / P. Maier, F. Wenz, C. Herskind //
Strahlenther. Oncol. – 2014. - Vol.190, N.8. – P.745-752.
353.
Maity, A. Modulating tumor vasculature through signaling inhibition to improve cytotoxic
therapy / A. Maity, E.J. Bernhard // Cancer Res. – 2010. – Vol.70, N 6. - P.2141-2145
354.
Mannick, J.B. Immunoregulatory and antimicrobial effects of nitrogen oxides / J.B. Mannick //
Proc. Am. Thorac. Soc. – 2006. – Vol.3, N.2. – P.161-165.
355.
Marangoni, K. The -786T>C promoter polymorphism of the NOS3 gene is associated with
prostate cancer progression / K. Marangoni, T.G. Araujo, A.F. Neves et al. // MC Cancer. 2008. - Vol.8. - doi: 10.1186/1471-2407-8-273.
356.
Marsden, P.A. Structure and chromosomal localization of the human constitutive endothelial
nitric oxide synthase gene / P.A. Marsden, H.Q. Heng, S.W. Scherer et al. // J. Biol. Chem. –
1993. – Vol. 268, N.23. - P.17478-17488.
357.
Martin, G.S. The epidemiology of sepsis in the United States from 1979 through 2000 / G.S.
Martin, D.M. Mannino, S. Eaton et al. // N. Engl. J. Med. – 2003. – Vol.348, N.16. – P.15461554.
358.
Martin, S.R. Are myocardial eNOS and nNOS involved in the beta-adrenergic and muscarinic
regulation of inotropy? A systematic investigation / S.R. Martin, K. Emanuel, C.E. Sears et al.
// Cardiovasc. Res. – 2006. – Vol.70, N.1. – P.97-106.
359.
Martinez-Ruiz, A. S-nitrosylation of Hsp90 promotes the inhibition of its ATPase and
endothelial nitric oxide synthase regulatory activities / A. Martinez-Ruiz, L. Villanueva, C.
Gonzalez de Orduna et al. // PNAS. – 2005. – Vol.102, N.24. – P.8525-8530.
360.
Maxhimer, J.B. radioprotection in normal tissue and delayed tumor growth by blockade of
CD47 signaling / J.B. Maxhimer, D.R. Soto-Pantoja, L.A. Ridnour et al. // Sci. Transl. Med. –
2009. – Vol.1, N.3. – doi: 10.1126/scitranslmed.3000139.
361.
McCall, T.B. Identification of N-iminoethyl-L-ornitine as an irrevrsible inhibitor of nitroc
oxide synthase in phagocytic cells /T.B. McCall, M. Feelisch, M.J. Palmer et al. // Br. J.
Pharmacol. – 1991. – Vol.102, N.1. – P.234-238.
362.
McNeill, E. The role of tetrahydrobiopterin in inflammation and cardiovascular disease / E.
McNeill, K.M. Channon // Thromb. Haemost. – 2012. – Vol.108, N.5. – P.832-839.
363.
Mehta, D.R. The nitric oxide pathway provides innate antiviral protection in conjunction with
the type I interferon pathway in fibroblasts / D.R. Mehta, A.A. Ashkar, K.L. // PLoS One. –
2012. – Vol.7, N.2. - e31688.
364.
Melikian, N. Neuronal nitric oxide synthase and human vascular regulation / N. Melikian,
M.D. Seddon, B. Casadei et al. // Trends Cardiovasc. Med. – 2009. – Vol.19, N.8. – P.256-262.
365.
Michel, T. Cellular signaling and NO production / T. Michel, P.M. Vanhaoutte / Pflugers Arch.
– 2010. – Vol.459, N.6. – P.807-816.
227
366.
Michel, T. NO way to relax: the complexities of coupling nitric oxide synthase pathways in the
heart / T. Michel // Circulation. – 2010b. – Vol.121, N.4. – P.484-486.
367.
Miclescu, A. Methylene blue protects the cortical blood-brain barrier against ischemia/
reperfusion-induced disraptions / A. Miclescu, H.S. Sharma, C. Martijn et al. // Crit. Care Med.
– 2010. – Vol.38, N.11. – P.2199-2206.
368.
Mijatovic, S. Novel nitric oxide-donating compound (S,R)-3-phenyl-4,5-dihydro-5-isoxazole
acetic acid–nitric oxide (GIT-27NO) induces p53 mediated apoptosis in human A375
melanoma cells / S. Mijatovic, D. Maksimovic-Ivanic, M. Mojic et al. // Nitric Oxide. – 2008. –
Vol.19, N.2. – P.177-183.
369.
Miller, T.W. Molecular regulation of tumor angiogenesis and perfusion via redox signaling /
T.W. Miller, J.S. Isenberg, D.D. Roberts // Chem. Rev. – 2009. – Vol.109, N.7. – P.3099-3124.
370.
Mitani, T. TGF-beta1 enhances degradation of IFN-gamma-induced iNOS protein wia
proteosomes in RAW 264.7 cells / T. Mitani, M. Terashima, H. Yoshimura et al. // Nitric
Oxide. – 2005. – Vol.13, N.1. – P.78-87.
371.
Mitchell, J.A. Induction by endotoxin of nitric oxide synthase in the rat mesentery: lack of
effect on action of vasoconstrictors / J.A. Mitchell, K.L. Kohlhaas, R. Sorrentino et al. // Br. J.
Pharmacol. – 1993. – Vol.109, N.1. – P.265-270.
372.
Mitchell, D.A. S-nitrozilation and regulation of inducible nitric oxide synthase / D.A. Mitchell,
P.A. Erwin, T. Michel et al. // Biochemistry. – 2005. – Vol.44, N.12. – P.4636-4647.
373.
Mitchell, O.W. Endameba Buccalis in the mouths of institutional children / O.W. Mitchell,
W.L. Culpepper, W.D. Aver // J. Med. Res. – 1916. – Vol.35, N.1. – P.51-53.
374.
Mohamad, N.A. Amonoguanidine impedes human pancreatic tumor growth and metastasis
development in nude mice / N.A. Mohamad, G.P. Cricco, L.A. Sambuco et al. // World J.
Gastroenterol. – 2009. – Vol.15, N.9. – P.1065-1071.
375.
Mohan, S. Mechanism of cellular oxidation stress induced by asymmetric dimethylarginine / S.
Mohan, H.L. Fung // Int. J. Mol. Sci. – 2012. – Vol.13, N.6. – P.7521-7531.
376.
Moncada, S. The L-arginine-nitric oxide pathway / S. Moncada, A. Higgs // New Engl. J. Med.
– 1993. – Vol.329, N.27. – P.2002-2012.
377.
Moncada, S. Nitric oxide, cell bioenergetics and neurodegeneration / S. Moncada, J.P. Bolanos
// J. Neurochem. – 2006. – Vol.97, N.6. – P.1676-1689.
378.
Morikawa, S. Abnormalities in pericytes on blood vessels and endothelial sprouts in tumors / S.
Morikawa, P. Baluk, T. Kaidoh et al. // Am. J. Pathol. – 2002. – Vol.160, N.3. – P.985-1000.
379.
Moore, W.M. L-N6-(1-iminoethyl)lysine: a selective inhibitor of inducible nitric oxide
synthase / W.M. Moore, R.K. Webber, G.M. Jerome et al. // J. Med. Chem. – 1994. – Vol.37,
N.23. – P.3886-3888.
380.
Moore, W.M. Inhibitors of human nitric oxide synthase isoforms with the carbamidine moiety
as a common structural element / W.M. Moore, R.K. Webber, K.F. Fok et al. // Bioorg. Med.
Chem. – 1996. – Vol.4, N.9. – P.1559-1564.
381.
Mundy, R.L. The pharmacology of radioprotectant chemicals. General pharmacology of βmercaptoethylamine / R.L. Mundy, M.H. Heiffer // Radiat. Res. – 1960. – Vol.13. – P.381-394.
382.
Murad, F. Nitric oxide signaling: would you believe that a simple free radical could be a
second messenger, autacoid, paracrine substance, neurotransmitter and hormone? / F. Murad /
Recent Prog. Horm. Res. – 1998. – Vol.53. – P.43-59; discussion P.59-60.
383.
Murrell, W. Nitro-Glycerine in angina pectoris / W. Murrell / Lancet. – 1879. – N.1. – P.80-81.
228
384.
Nagi, G. Central role of nitric oxide in the pathogenesis of rheumatoid arthritis and systemic
lupus erythematosus / G. Nagi, A. Koncz, T. Telarico et al. // Arthritis Res. Ther. – 2010. –
Vol.12, N.3. - doi: 10.1186/ar3045.
385.
Nakane, M. Novel potent and selective inhibitors of inducible nitric oxide synthase / M.
Nakane, V. Kinghofer, J.E. Kuk et al. // Mol. Pharmacol. – 1995. – Vol.47, N.4. – P.831-834.
386.
Narayanan, K. Synthesis of L-thiocitrulline, L-homothiocitrulline and S-methyl-Lthiocitrulline: a new class of potent nitric oxide synthase inhibitors / K. Narayanan, O.W.
Griffith // J. Med. Chem. – 1994. - Vol.37, N.7. – P.885–887.
387.
Narayanan, K. S-alkyl-L-thiocitrullines. Potent stereoselective inhibitors of nitric oxide
synthase with strong pressor activity in vivo / K. Narayanan, L. Spack, K. McMillan et al. // J.
Biol. Chem. – 1995. – Vol.270, N.19. - P.11103–11110.
388.
Nardi, G.M. Neuronal nitric oxide synthase and its interaction with soluble guanylate cyclase is
a key factor for the vascular dysfunction of experimental sepsis / G.M. Nardi, K.
Scheschowitsch, D. Ammar et al. // Crit. Care. Med. – 2014. – Vol.42, N.6. – P.391-400.
389.
Naseem, K.M. Unresolved roles of platelet nitric oxide synthase / K.M. Naseem, R. Riba // J.
Thromb. Haemost. – 2008. – Vol.6, N.1. – P.10-19.
390.
Neufeld, A.H. Loss of retinal ganglion cells following retinal ischemia: the role of inducible
nitric oxide synthase /A.H. Neufeld, S. Kawai, S. Das et al. // Exp. Eye Res. – 2002. – Vol.75,
N.5. – P.521-528.
391.
Nq, Q.S. Effect of nitric-oxide synthesis on tumour blood volume and vascular activity: a phase
I study / Q.S. Nq, V. Goh, J. Milner et al. // Lancet Oncol. – 2007. – Vol.8, N.2. – P.111-118.
392.
Ni, L. The protective effect of Bcl-xl overexpression against oxidative stress-induced vascular
endothelial cell injury and the role of the Akt/eNOS pathway / L. Ni, T. Li, B. Liu et al. // Int.
J. Mol. Sci. – 2013. – Vol.14, N.11. – P.22149-22162.
393.
Nicholson, S. Inducible nitric oxide synthase in pulmonary alveolar macrophages from patients
with tuberculosis / S. Nicholson, M.G. Bonecini-Almeida, J.R. Lapa e Silva et al. // J. Exp.
Med. – 1996. – Vol.183, N.5. – P.2293-2302.
394.
Nieder, C. Normal tissue studies in radiation oncology: A systematic review of highly cited
articles and citation patterns / C. Nieder, N.H. Andratschke, A.L. Grosu // Oncol. Lett. – 2014.
– Vol.8, N.3. – P.972-976.
395.
Niu, X. Cardioprotective effect of beta-3 adrenergic receptor agonism: role of neuronal nitric
oxide synthase / X. Niu, V.L. Watts, O.H. Cingolani et al. // J. Am. Coll. Cardiol. – 2012. –
Vol.59, N.22. – P.1979-1987.
396.
Nortcliffe, A. Synthesis and biological evaluation of nitric oxide-donating analogues of
sulindac for prostate cancer treatment / A. Nortcliffe, A.G. Ekstrom, J.R. Black et al. // Bioorg.
Med. Chem. – 2014. – Vol.22, N.2. – P.756-761.
397.
Nossaman, V.E. Nitrates and nitrites in the treatment of ischemic cardiac disease / V.E.
Nossaman, B.D. Nossaman, P.J. Kadowitz // Cardiol. Rev. – 2010. – Vol.18, N.4. – P.190-197.
398.
Oceandy, D. Neuronal nitric oxide synthase signaling in the heart is regulated by the
sarcolemmal calcium pump 4b / D. Oceandy, E.J. Cartwright, M. Emerson et al. // Circulation.
– 2007. – Vol.115, N.4. – P.483-492.
399.
Oess, S. Subcellular targeting and trafficking of nitric oxide synthases / S. Oess, A. Icking, D.
Fulton et al. // Biochem. J. – 2006. – Vol.396, N.3. – P.401-409.
229
400.
Okamoto, L.E. Nebivolol, but not metoprolol, lowers blood pressure in nitric oxide-sensitive
human hypertension / L.E. Okamoto, A. Gamboa, C.A. Shibao et al. // Hypertension. – 2014. –
Vol. 64, N.6. – P.1241-1247/
401.
Oliveira, B.L. Insights into the structural determinants for selective inhibition of nitric oxide
synthase isoforms / B.L. Oliveira, I.S. Moreira, P.A. Fernandes // J. Mol. Model. – 2013. –
Vol.19, N.4. – P.1537-1551.
402.
Olson, S.Y. Regulation of apoptosis-related genes by nitric oxide in cancer / S.Y. Olson, H.J.
Garban // Nitric Oxide. – 2008. – Vol.19, N.2. – P.170–176.
403.
Omar, S.A. Nitrite reduction and cardiovascular protection / S.A. Omar, A.J. Webb // J. Mol.
Cell Cardiol. – 2014. – Vol.73. – P.57-69.
404.
Oronsky, B.T. Is nitric oxide (NO) the last word in radiosensitization? A review / B.T.
Oronsky, S.J. Knox, J.J. Scicinski // Transl. Oncol. – 2012. – Vol.5, N.2. – P.66-71.
405.
Ortega, A.L. Oxidative and nitrosative stress in the metastatic microenvironment / A.L. Ortega,
S. Mena, J.M. Estrela // Cancers (Basel). – 2010. – Vol.2, N.2. – P.274-304.
406.
Orzelska, J. Effects of NOS inhibitors on the benzodiazepines-induced memory impairment of
mice in the modified elevated plus-maze task / J. Orzelska, S. Talarek, J. Listos et al. // Behav.
Brain Res. – 2013. – Vol.244. – P.100-106.
407.
Ou, P. Aminoguanidine: a drug proposed for prophylaxis in diabetes inhibits catalase and
generates hydrogen peroxide in vitro / P. Ou, S.P. Wolff // Biochem. Pharmacol. – 1993. –
Vol.46, N.7. – P.1139-1144.
408.
Pacheco-Yepez, J. Peroxynitrite and peroxiredoxin in the pathogenesis of experimental amebic
liver abscess / J. Pacheco-Yepez, R.A. Jarillo-Luna, M. Gutierrez-Meza et al. // Biomed. Res.
Int. – 2014. – Vol.2014. - doi: 10.1155/2014/324230.
409.
Palmer R.M., Ferrige A.G., Moncada S. Nitric oxide release accounts for the biological activity
of endothelium-derived relaxing factor / Palmer R.M., Ferrige A.G., Moncada S. // Nature. 1987. - Vol.327, N.6122. - P.524-526.
410.
Parent, M. Are in situ formulations the keys for the therapeutic future of S-nitrosothiols? / M.
Parent, A. Boudier, F. Dupuis et al. // Eur. J. Pharm. Biopharm. – 2013. – Vol.85, N.3, Pt.A. –
P.640-649.
411.
Parmentier, S. Selective inhibition of inducible nitric oxide synthase prevents ischaemic brain
injury / S. Parmentier, G.A. Bohme, D. Lerouet et al. // Br. J. Pharmacol. – 1999. – Vol.127,
N.2. – P.546-552.
412.
Patel, H.H. Caveolae as organizers of pharmacologically relevant signal transduction molecules
/ H.H. Patel, F. Murray, P.A. Insel // Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. – 2008. – Vol.48. –
P.359-391.
413.
Paton, J.F. Nitric oxide and autonomic control of heart rate: A question of specificity / J.F.
Paton, S. Kasparov, D.J. Paterson // Trends Neurosci. – 2002. - Vol.25, N.12. – P.626– 631.
414.
Paul, V. Involvement of nitric oxide in learning&memory processes / V. Paul, P. Ekambaram //
Indian J. Med. Res. – 2011. – Vol.133, N.5. – P.471-478.
415.
Pautz, A. Regulation of the expression of inducible nitric oxide synthase / A. Pautz, J. Art, S.
Hahn et al. // Nitric Oxide. – 2010. – Vol.23, N.2. – P.75-93.
416.
Peebles, D.D. ROS-scavenger and radioprotective efficacy of the new PrC-210 aminothiol /
D.D. Peebles, C.M. Soref, R.R. Copp et al. // Radiat. Res. – 2012. – Vol.178, N.1. – P.57-68.
230
417.
Pelletier, J.P. Reduced progression of experimental osteoarthritis in vivo by selective inhibition
of inducible nitric oxide synthase / J.P. Pelletier, D. Jovanovic, J.C. Fernandes et al. // Arthritis
Rheum. – 1998. – Vol.41, N.7. – P.1275-1286.
418.
Perez-Sala, D. Posttranscriptional regulation of human iNOS by NO/cGMP pathway / D.
Perez-Sala, E. Gernuda-Morollon, M. Diaz-Cazorla et al. // Am. J. Physiol. Renal. Physiol. –
2001. – Vol.280, N.3. – P.466-473.
419.
Petroff, M.G. Endogenous nitric oxide mechanisms mediate the stretch dependence of Ca2+
release in cardiomyocytes / M.G. Petroff, S.H. Kim, S. Pepe et al. // Nat. Cell Biol. – 2001. –
Vol.3, N.10. – P.867-873.
420.
Pfeiffer, S. Inhibition of nitric oxide synthases by N(G)-nitro-L-arginine methyl ester (LNAME): requirement for bioactivation to the free acid, N(G)-nitro-L-arginine / S. Pfeiffer, E.
Leopold, K. Schmidt K. et al. // Br. J. Pharmacol. – 1996. – Vol.118, N.6. – P.1433-1440.
421.
Plate, K.H. Tumor angiogenesis and anti-angiogenic therapy in malignant gliomas revisited /
K.H. Plate, A. Scholz, D.J. Dumont // Acta Neuropathol. – 2012. – Vol.124, N.6. – P.763-775.
422.
Porta, N.F. Pulmonary vasodilator therapy in the NICU: inhaled nitric oxide, sildenafil, and
other pulmonary vasodilating agents / N.F. Porta, R.H. Steinhorn // Clin. Perinatol. – 2012. –
Vol.39, N.1. – P.149-164.
423.
Poulos, T.L. Structural basis for isoform-selective inhibition in nitric oxide synthase / T.L.
Poulos, H. Li // Acc. Chem. Res. – 2013. – Vol.46, N.2. – P.390-398.
424.
Poyton, R.O. Mitochondria and hypoxic signaling: a new view / R.O. Poyton, P.R. Castello,
K.A. Ball et al. // Ann. N. Y. Acad. Sci. – 2009. – Vol.1177. – P.48-56.
425.
Prado, C.M. Effects of inducible nitric oxide synthase inhibition in bronchial vascular
remodeling-induced by chronic allergic pulmonary inflammation / C.M. Prado, L. Yano, G.
Rocha et al. // Exp. Lung Res. – 2011. – Vol.37, N.5. – P.259-268.
426.
Prado, C.M. Nitric oxide in asthma physiopathology / C.M. Prado, M.A. Martins, I.F. Tiberio //
ISRN Allergy. – 2011b. - Vol.2011. - Article ID 832560, 13 pages doi:10.5402/2011/832560.
427.
Prasanna, P.G. Normal tissue protection for improving radiotherapy: Where are the Gaps? /
P.G. Prasanna, H.B. Stone, R.S. Wong et al. // Transl. Cancer Res. – 2012. – Vol.1, N.1. –
P.35-48.
428.
Qian, J. Post-translation regulation of endothelial nitric oxide synthase in vascular endothelium
/ J. Qian // Front Physiol. – 2013. – Vol.4. - doi: 10.3389/fphys.2013.00347.
429.
Rahat, M.A. Molecular mechanisms regulation macrophage response to hypoxia / M.A. Rahat,
H. Bitterman, N. Lahat // Front Immunol. – 2011. – Vol.2. - doi: 10.3389/fimmu.2011.00045.
430.
Rahman, R. Antiangiogenic therapy and mechanisms of tumor resistance in malignant glioma /
R. Rahman, S. Smith, C. Rahman et al. // J. Oncology. – 2010. – Vol.2010. – Art.ID 251231,
doi:10.1155/2010/251231.
431.
Ramadoss, J. Endothelial caveolar subcellular domain regulation of endothelial nitric oxide
synthase / J. Ramadoss, M.B. Pastore, R.R. Magness // Clim. Exp. Pharmacol. Physiol. – 2013.
– V.40, N.11. – P.753-764.
432.
Raman, C.S. Implications for isoform-selective inhibitor design derived from the binding mode
of bulky isothioureas to the heme domain of endothelial nitric oxide synthase / C.S. Raman, H.
Li, P. Martasek et al. // J. Biol. Chem. – 2001. – Vol.276, N.7. – P.26486-26491.
433.
Rameau, G.A. Biphasic coupling of neuronal nitric oxide synthase phosphorylation to the
NMDA receptor regulates AMPA receptor trafficking and neuronal cell death / G.A. Rameau,
D.S. Tukey, E.D. Garcin-Hosfield et al. // J. Neurosci. – 2007. – Vol.27, N.13. – P.3445-3455.
231
434.
Raoul, C. Motoneuron death triggered by a specific pathway downstream of fas: potentiation
by ALS-linked SOD1 mutations / C. Raoul, A.G. Estevez, H. Nishimune et al. // Neuron. –
2002. – Vol.35, N.6. - P.1067-1083.
435.
Ratovitski, E.A. An inducible nitric oxide synthase (NOS)-associated protein inhibits NOS
dimerization and activity / E.A. Ratovitski, C. Bao, R.A. Quick et al. // J. Biol. Chem. – 1999. –
Vol.274, N.42. – P.30250-30257.
436.
Razavi, H.M. Modulation of apoptosis by nitric oxide: implications in myocardial ischemia and
heart failure / H.M. Razavi, J.A. Hamilton, Q. Fenq // Pharmacol. Ther. - 2005. - Vol.106, N.2.
- P.147-162.
437.
Reif, D.W. N-nitro-L-arginine and N-monomethyl-L-arginine exhibit a different pattern of
inactivation toward the three nitric oxide synthases / D.W. Reif, S.A. McCreedy // Arch.
Biochem. Biophys. – 1995. – Vol.320, N.1. – P.170-176.
438.
Reihill, J.A. AMPK-activated protein kinase mediates VEGF-stimulated endothelian NO
production / J.A. Reihill, M.A. Ewart, D.G. Hardie et al. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2007. - Vol.354, N.4. - P.1084-1088.
439.
Rivero, A. Nitric oxide: an antiparasitic molecule of invertebrates / A. Rivero // Trends
Parasitol. – 2006. – Vol.22, N.5. – P.219-225.
440.
Rochette, L. Nitric oxide synthase inhibition and oxidative stress in cardiovascular diseases:
possible therapeutic targets? / L. Rochette, J. Lorin, M. Zeller et al. // Pharmacol. Ther. – 2013.
– Vol.140, N.3. – P.239-257.
441.
Roe, N.D. Nitric oxide synthase uncoupling: a therapeutic target in cardiovascular diseases /
N.D. Roe, J. Ren // Vascul. Pharmacol. – 2012. – Vol.57, N.5-6. – P.168-172.
442.
Rosen, R.C. Overview of phosphodiesterase 5 inhibition in erectile dysfunction / R.C. Rosen,
J.B. Kostis // Am. J. Cardiol. – 2003. – Vol.92, N.9A. – P.9M-18M.
443.
Rosenfeld, R.J. Conformational changes in nitric oxide synthases induced by chlorzoxazone
and nitroindazoles: crystallographic and computational analyses of inhibitor potency / R.J.
Rosenfeld, Garcin E.D., Panda K. et al. // Biochemistry. – 2002. – Vol.41, N.47. – P.1391513925.
444.
Rouseau, D.L. Ligand-protein interactions in nitric oxide synthase / D.L. Rouseau, D. Li, M.
Couture et al. // J. Inorg. Biochem. – 2005. – Vol.99, N.1. – P.306-323.
445.
Sabino, J.P. Role of the spinal cord NO/cGMP pathway in the control of arterial pressure and
heart rate / J.P. Sabino, G. Bombarda, C.A. da Silva et al. // Pflugers. Arch. – 2011. – Vol.461,
N.1. – P.23-28.
446.
Salem, R. Nitric oxide rapidly increases blood pressure with no change in outcome in
cardiogenic shock: the TRIUMPH trial / R. Salem, A. Mebazaa // Crit. Care. – 2007. – Vol.11,
N.3. – P.136.
447.
Sampaio, A.L. Biphasic modulation of NOS expression, protein and nitrite products by
hydroxocobalamine underlies its protective effect in endotoxemic shock: downstreame
regulation of COX-2, IL-1β, TNF-α, IL-6 and HMGB1 expression / A.L. Sampaio, J. Dalli, V.
Brancaleone et al. // Mediators Inflamm. – 2013. – Vol.2013. - doi: 10.1155/2013/741804.
448.
Sanderson, N.S.R. Preoptic neuronal nitric oxide synthase induction by testosterone is
consistent with a role in gating male copulatory behavior / N.S.R. Sanderson, B. Le, Z. Zhou et
al. // Eur. J. Neurosci. – 2008. – Vol.27, N.1. – P.183–190.
449.
Santolini, J. The molecular mechanism of mammalian NO-synthases: a story of electrons and
protons / J. Santalini // J. Inorg. Biochem. – 2011. – Vol.105, N.2. – P.127-141.
232
450.
Schairer, D.O. The potential of nitric oxide releasing therapies as antimicrobial agents / D.O.
Schairer, J.S. J.S. Chouake, J.D. Nosanchuk et al. // Virulence. – 2012. – Vol.3, N.3. – P.271279.
451.
Schmidt, B. Combining Bevacizumab with radiation or chemoradiation for solid tumors: A
review of the scientific rationale, and clinical trials / B. Schmidt, H.J. Lee, S. Ryeom // Curr.
Angiogenes. 2012. – Vol.1, N.3. – P.169-179.
452.
Searles, C.D. Transcriptional and posttranscriptional regulation of endothelial nitric oxide
synthase expression / C.D. Searles // Am. J. Physiol. Cell Physiol. – 2006. – Vol.291, N.5. –
P.C803-C816.
453.
Sears, C.E. Cardiac neuronal nitric oxide synthase isoform regulates myocardial contraction
and calcium handling / C.E. Sears, S.M. Bryant, E.A. Ashley et al. // Circ. Res. – 2003. –
Vol.92, N.5. – P.52-59.
454.
Sears, C.E. Nitric oxide control of cardiac function: is neuronal nitric oxide synthase a key
component? / C.E. Sears, E.A. Ashley, B. Casadei / Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. –
2004. – Vol.359, N.1446. – P.1021-1044.
455.
Seddon, M.D. Neuronal nitric oxide synthase regulates basal microvascular tone in humans in
vivo / M.D. Seddon, P.J. Chowienczyk, S.E. Brett, / Circulation. – 2008. – Vol.117, N.15. –
P.1991–1996.
456.
Seddon, M.D. Effects of neuronal nitric oxide synthase on human coronary artery diameter and
blood flow in vivo / M.D. Seddon, N. Melikian, R. Dworakowski et al. // Circulation. – 2009. –
Vol.119, N.20. – P.2656-2662.
457.
Seymour, M. Ultrasonographic measures of synovitis in an early phase clinical trial: a doubleblind, randomized, placebo and comparator controlled phase IIa trial of GW274150 (a selective
inducible nitric oxide synthase inhibitor) in rheumatoid arthritis / M. Seymour, F. Petavy, F.
Chiesa et al. // Clin. Exp. Rheumatol. – 2012. – Vol.30, N.2. – P.254-261.
458.
Shabana, A. Cardiogenic shock complicating myocardial infarction: an updated review / A.
Shabana, M. Moustafa, A. El-Menyar et al. // Br. J Med. & Med. Research. – 2013. – Vol.3,
N.3. – P.622-653.
459.
Shabeeh, H. Differential role of endothelial versus neuronal nitric oxide synthase in the
regulation of coronary blood flow during pacing-induced increases in cardiac workload / H.
Shabeeh, N. Melikian, R. Dworakowski et al. // Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. – 2013. –
Vol.304, N.9. – P.H1277-H1282.
460.
Shabeeh, H. Sympathetic activation increases NO release from eNOS but neither eNOS nor
nNOS play an essential role in exercise hyperemia in the human forearm / H. Shabeeh, M.
Seddon, S. Brett et al. // Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. – 2013b. – Vol.304, N.9. –
P.H1225-H1230.
461.
Shahani, N. Protein S-nitrosylation: role for nitric oxide signaling in neuronal death / N.
Shahani, A. Sawa // Biochem. Biophys. Acta. – 2012. – Vol.1820, N.6. – P.736-742.
462.
Sharmaa, D.Differential activation of NF-κB and nitric oxide in lymphocytes regulates in vitro
and in vivo radiosensitivity / D. Sharmaa, S.K. Sandura, R. Rashmia et al. // Mutat. Res. - 2010.
- Vol.703, N.2. - P.149-157.
463.
Sharpe, M.A. Nitric oxide and Fenton/Haber-Weiss chemistry: nitric oxide is a potent
antioxidant at physiological concentrations / M.A. Sharpe, S.J. Robb, J.B. Clark // J.
Neurochem. – 2003. – Vol.87, N.2. – P.386-394.
464.
Shaughnessy, L.M. The role of the activated macrophage in clearing Listeria monocytogenes
infection / L.M. Shaughnessy, J.A. Swanson // Front Biosci. – 2007. – Vol.12. – P.2683-2692.
233
465.
Shaul, P.W. Regulation of endothelial nitric oxide synthase: location, location, location / P.W.
Shaul // Annu. Rev. Physiol. – 2002. – Vol.64. – P.749–774.
466.
Shaw, L.C. Cell-based therapies for diabetic retinopathy / L.C. Shaw, M.B. Neu, M.B. Grant //
Curr. Diab. Rep. – 2011. – Vol.11, N.4. – P.265-274.
467.
Shearer, B.G. Substituted N-phenylisothioureas: potent inhibitors of human nitric oxide
synthase with neuronal isoform selectivity / B.G. Shearer, S. Lee, J.A. Oplinger et al. // J. Med.
Chem. – 1997. – Vol.40, N.12. – P.1901-1905.
468.
Sheen, J.M. Increased circulatory asymmetric dimethylarginine and multiple organ failure: bile
duct ligation in rat as a model / J.M. Sheen, Y.C. Chen, Y.L. Tain et al. // Int. J. Mol. Sci. –
2014. – Vol.15, N.3. – P.3989-4006.
469.
Shen, F. Role of the NO/sGC/PKG signaling pathway of hippocampal CA1 in morphineinduced reward memory / F. Shen, Y.J. Li, X.J. Shou et al. // Neurobiol. Learn Mem. – 2012. –
Vol.98, N.2. – P.130-138.
470.
Shibata, K. Nitric oxide synthases and heart failure – lessons from genetically manipulated
mice / K. Shibata, H. Shimokawa, N. Yanagihara et al. // J. UOEH. – 2013. – Vol.35, N.2. –
P.147-158.
471.
Shinkai, T. Allelic association of the neuronal nitric oxide synthase (NOS1) gene with
schizophrenia / T. Shinkai, O. Ohmori, H. Hori et al. // Mol. Psychiatry. – 2002. – Vol.7, N.6. –
P.560–563.
472.
Silverman, R.B. Design of selective neuronal nitric oxide synthase inhibitors for the prevention
and treatment of neurodegenerative diseases / R.B. Silverman // Acc. Chem. Res. – 2009. –
Vol.42, N.3. – P.439-451.
473.
Sikora, A.G. Targeted inhibition of inducible nitric oxide synthase inhibits growth of human
melanoma in vivo and synergizes with chemotherapy / A.G. Sikora, A. Gelbarda, M.A. Daviesa
et al. // Clin. Cancer Res. – 2010. – Vol.16, N.6. – P.1834-1844.
474.
Singh, D. Selective inducible nitric oxide synthase inhibition has no effect on allergen
challenge in asthma / D. Singh, D. Richards, R.G. Knowles et al. // Am. J. Respir. Crit. Care
Med. – 2007. – Vol.176, N.10. – P.988-993.
475.
Smith, B.C. Mechanisms of S-nitrosothiol formation and selectivity in nitric oxide signaling /
B.C. Smith, M.A. Marletta // Curr. Opin. Chem. Biol. – 2012. – Vol.16, N.5-6. – P.498-506.
476.
Smith, C.J. Upregulation of inducible nitric oxide synthase contributes to attenuated cutaneous
vasodilation in essential hypertensive humans / C.J. Smith, L. Santhanam, R.S. Bruning et al. //
Hypertension. – 2011. – Vol.58, N.5. – P.935-942.
477.
Song, T. Calcium/ calmodulin-dependent protein kinase I inhibits neuronal nitric-oxide
synthase activity through serine 741 phosphorylation / T. Song, N. Hatano, M. Horii et al. /
FEBS Letts. – 2004. – Vol.570, N.1–3. – P.133–137.
478.
Sosroseno. W. L-arginine-dependent nitric oxide production of a murine macrophage-like
RAW 264.7 cell line stimulated with Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide / W.
Sosroseno, E. Herminajeng, P.S. Bird et al. // Oral Microbiol. Immunol. – 2004. – Vol.19, N.2.
– P.65-70.
479.
Southan,
G.J.
Spontaneous
rearrangement
of
aminoalkylisothioureas
into
mercaptoalkylguanidines, a novel class of nitric oxide synthase inhibitors with selectivity
towards the inducible isoform / G.J. Southan, B. Zingarelli, M. O’Connor et al. // Br. J.
Pharmacol. – 1996. – Vol.117, N.4. – P.619-632.
234
480.
Spratt, D.E. Differential binding of calmodulin domains to constitutive and inducible nitric
oxide synthase enzymes / D.E. Spratt, V. Taiakina, M. Palmer et al. // Biochemistry. – 2007. –
Vol.46, N.28. – P.8288-8300.
481.
Stamler, J.S. Nitric oxide circulates in mammalian plasma primarily as an S-nitroso adduct /
J.S. Stamler, O. Jaraki, J. Osborne et al. // PNAS. – 1992. - Vol.89, N.16. – P.7674–7677.
482.
Stamler, J.S.Blood flow regulation by S-nitrosohemoglobin in the physiological oxygen
gradient / J.S. Stamler, L. Jia, J.P. Eu et al. // Science. – 1997. – Vol.276, N.5321. - P.20342037
483.
Star, R.A. Southwestern internal medicine conference: Nitric Oxide / R.A. Star // Am. J. Med.
Sci. – 1993. – Vol.306, N.5. – P.348-358.
484.
Steinert, J.R. Nitric oxide signaling in brain function, dysfunction, and dementia / J.R. Steinert,
T. Chernova, I.D. Forsythe // Neuroscientist. – 2010. – Vol.16, N.4. – P.435-452.
485.
Stenger, S. Tissue expression of inducible nitric oxide synthase is closely associated with
resistance to Leishmania major / S. Stenger, H. Thuring, M. Rollinghoff et al. // J. Exp. Med. –
1994. – Vol.180, N.3. – P.783-793.
486.
Stuehr, D.J. Synthesis of nitrogen oxides from L-arginine by macrophage cytosol: requirement
for inducible and constitutive components / D.J. Stuehr, N.S. Kwon, S.S. Gross et al. //
Biochem. Biophys. Res. Common. - 1989. - Vol.161, N.2. - P.420-426.
487.
Stuehr, D.J. Oxygen reduction by nitric oxide synthase / D.J. Stuehr, S. Pou, G.M. Rosen // J.
Biol. Chem. – 2001. – Vol.276, N.18. – P.14533-14536.
488.
Stumpff, F. Regulation of trabecular meshwork contractility / F. Stumpff, M. Wiederholt //
Ophthalmologica. – 2000. – Vol.214, N.1. – P.33-53.
489.
Suryo Rahmanto, Y. Nitrogen monoxide (NO) storage and transport by dinitrosyl-dithiol-iron
complexes: long-lived NO that is trafficked by interacting proteins / Y. Suryo Rahmanto, D.S.
Kalinowski, D.J. Lane // J. Biol. Chem. – 2012. – Vol.287, N.10. – P.6960-6968.
490.
Szabo, C. Beneficial effects and improved survival in rodent models of septic shock with Smethylisothiourea sulfate, a potent and selective inhibitor of inducible nitric oxide synthase / C.
Szabo, G.J. Southan, C. Thiemermann // PNAS. – 1994. – Vol.91, N.26. – P.12472-12476.
491.
Szalai, Z. Anti-inflammatory effect of recreational exercise in TNBS-induced colitis in rats:
role of NOS/HO/MPO system / Z. Szalai, A. Szasz, I. Nagy et al. // Oxid. Med. Cell Longev. –
2014. – Vol.2014. - doi: 10.1155/2014/925981.
492.
Tabatabaie, T. Inhibition of the cytokine-mediated inducible nitric oxide synthase expression in
rat insulinoma cells by phenil-N-tert-butylnitrone / T. Tabatabaie, K.L. Graham, A.M. Vasquez
et al. // Nitric Oxide. – 2000. – Vol.4, N.2. – P.157-167.
493.
Tafi, A. Computational studies of competitive inhibitors of nitric oxide synthase (NOS)
enzymes: towards the development of powerful and isoform-selective inhibitors / A. Tafi, L.
Angeli, G. Venturini et al. // Curr. Med. Chem. – 2006. – Vol.13, N.16. – P.1929-1946.
494.
Takeuchi, T. Nonadrenergic, noncholinergic relaxation mediated by nitric oxide with
concomitant change in Ca2+ level in rectal circular muscle of rats / T. Takeuchi, S. Niioka, M.
Kishi et al. // Eur. J. Pharmacol. – 1998. – Vol.353, N.1. – P.67-74.
495.
Tang, L. Targeting NOS as a therapeutic approach for heart failure / L. Tang, H. Wang, M.T.
Ziolo // Pharmacol. Ther. – 2014. – Vol.142, N.3. – P.306-315.
496.
Tarr, J.M. Nitric oxide and the regulation of apoptosis in tumour cells / J.M. Tarr, P. Eggleton,
P.G. Winvard // Curr. Pharm. Des. – 2006. – Vol.12, N.34. – P.4445-4468.
235
497.
Taylor, C.T. Nitric oxide, cytochrome C oxidase, and the cellular response to hypoxia / C.T.
Taylor, S. Moncada // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. – 2010. – Vol.30, N.4. – P.643-647.
498.
Teng, X. Molecular mechanisms of iNOS induction by IL-1 beta and INF-gamma in rat aortic
smooth cells / T. Teerlink, Z. Luo, F. Palm et al. // Am. J. Physiol. Cell Physiol. – 2002. –
Vol.282, N.1. – P.144-152.
499.
Thomas, D.D. The biological lifetime of nitric oxide: implications for the perivascular
dynamics of NO and O2 / D.D. Thomas, X. Liu, S.T. Kantrow et al. // PNAS. – 2001. – Vol.98,
N.1. – P.355-360.
500.
Thomsen, L.L. Selective inhibition of inducible nitric oxide synthase inhibits tumor growth in
vivo: studies with 1400W, a novel inhibitor / L.L. Thomsen, J.M. Scott, P. Topley et al. //
Cancer Res. – 1997. – Vol.57, N.15. – P.3300-3304.
501.
Tidball, J.G. Expression of a NOS transgene in dystrophin-deficient muscle reduces muscle
membrane damage without increasing the expression of membrane-associated cytoskeletal
proteins / J.G. Tidball, M. Wehling-Henricks // Mol. Genet. Metab. – 2004. – Vol.82, N.4. –
P.312-320.
502.
Tiemermann, C. Vascular hyporeactivity to vasoconstrictor agents and hemodynamic
decompensation in hemorrhagic shock is mediated by nitric oxide / C. Tiemermann, C. Szab,
J.A. Mitchell et al. // PNAS. – 1993. – Vol.90, N.1. – P.267-271.
503.
Toda, N. Cerebral blood flow regulation by nitric oxide in neurological disorders / N. Toda, K.
Ayajiki, T. Okamura // Can. J. Physiol. Pharmacol. - 2009. - Vol.87, N.8. – P.581-594.
504.
Togashi, P. A central nervous system action of nitric oxide in blood pressure regulation / P.
Togashi, I. Sakuma, M. Yoshioka et al. // J. Pharmacol. Exp. Ther. – 1992. – Vol.262, N.1. –
P.343-347.
505.
Tripathi, P. The role of nitric oxide in inflammatory reactions / P. Tripathi, L. Kashyap, V.
Singh // FEMS Immunol. Med. Microbial. – 2007. – Vol.51, N.3. – P.443-452.
506.
Tsikas, D. Analysis of nitrite and nitrate in biological fluids by based on the Griess reaction:
appraisal of the Griess reaction in the L-arginine/nitric oxide area of research / D. Tsikas // J.
Chromatogr. B. Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. - 2007. - Vol.851, N.1-2. - P.51-70.
507.
Turner, D.I. Bronchoprotection in conscious guinea pigs by budesonide and the NO-donating
analogue, TPI 1020, alone and combined with tiotropium or formoterol / D.I. Turner, N.
Ferrari, W.R. Ford et al. // Br. J. Pharmacol. – 2012. – Vol.167, N.3. – P.515-526.
508.
Tymvios, C. Platelet aggregation responses are critically regulated in vivo by endogenous nitric
oxide but not by endothelialnitric oxide synthase / C. Tymvios, C. Moore, S. Jones et al. // Br.
J. Pharmacol. – 2009. – Vol.158, N.7. – P.1735-1742.
509.
Ueda, S. Structure-activity relationships of 2-aminothiazole derivatives as inducible nitric
oxide synthase inhibitor / S. Ueda, H. Terauchi, M. Kawasaki et al. // Chem. Pharm. Bull.
(Tokyo). – 2004. – Vol.52, N.5. – P.634-637.
510.
Ulharq, S. Heterocyclic analogues of L-citrulline as inhibitors of the isoforms of nitric oxide
synthase (NOS) and identification of N(delta)-(4,5-dihydrothiazol-2-yl)ornitine as a potent
inhibitor / S. Ulharq, E.C. Chinje, M.A. Naylor et al. // Bioorg. Med. Chem. – 1999. – Vol.7,
N.9. – P.1787-1796.
511.
Valance, P. Direct measurement of nitric oxide in human beings / P. Valance, S. Patton, K.
Bhagat et al. // Lancet. – 1995. – V.346, N.8968. – P.153-154.
512.
Valance, P. Endogenous dimethylarginine as an inhibitor of nitric oxide synthases / P. Valance,
A. Leone, A. Calver et al. // J. Cardiovasc. Pharmacol. – 1992. – Vol.20, N.12. – P.S60-S62.
236
513.
van Eijk, H.M. Method using stable isotopes to measure nitric oxide synthesis in the Larginine/NO pathway in health and disease / H.M. van Eijk, Y.C. Luiking, N.E. Deutz // J.
Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. - 2007. - Vol.851, N.1-2. - P.172-185.
514.
Vanin, A.F. NO spin trapping in biological systems / A.F. Vanin, A.P. Poltorakov // Front
Biosci. (Landmark Ed.) - 2009. - Vol.14. - P.4427-4435.
515.
Vansburger, M.H. Displacement-encoded and manganese-enhanced cardiac MRI reveal that
nNOS, not eNOS, plays a dominant rolein modulating contraction and calcium influx in the
mammalian heart / M.H. Vansburger, B.A. French, C.M. Kramer et al. // Am. J. Physiol. Heart
Circ. Physiol. – 2012. – Vol.302, N.2. – P.H412-H419.
516.
Vasquez-Vivar, J. The role of tetrahydrobiopterin in superoxide generation from eNOS:
ensymology and physiological implications / J. Vasquez-Vivar, B. Kalyanaraman, P. Mastasek
// Free Radic. Res. – 2003. – Vol.37, N.2. – P.121-127.
517.
Vasudev, N.S. Anti-angiogenic therapy for cancer: current progress, unresolved questions and
future directions / N.S. Vasudev, A.R. Reynolds // Angiogenesis. – 2014. – Vol.17, N.3. –
P.471-494.
518.
Vials, A. Effects of nitric oxide synthase inhibitors, L-N(G)-nitroarginine and L-N(G)nitroarginine methyl ester, on responses to vasodilatators of the guinea pig coronary
vasculature / A. Vials, G. Burnstock // Br. J. Pharmacol. – 1992. – Vol.107, N.2. – P.604-609.
519.
Vikram, B. Current status and future potential of advanced technologies in radiation oncology.
Part 1. Challenges and resources / B. Vikram, C.N. Coleman, J.A. Deve // Oncology (Williston
Park). – 2009. – Vol.23, N.3. – P.279-283.
520.
Villanueva, C. Subcellular and cellular locations of nitric-oxide synthase isoforms as
determinants of health and disease / C. Villanueva, C. Giulivi // Free Radic. Biol. Med. – 2010.
– Vol.49, N.3. – P.307-316.
521.
Vincent, S.R. Nitric oxide neurons and neurotransmission / S.R. Vincent / Prog. Neurobiol. –
2010. – Vol.90, N.2. – P.246-255.
522.
Viteceek, J. Arginin-based inhibitors of nitric oxide synthase: therapeutic potential and
challenges / J. Viteceek, A. Lojek, G. Valacchi et al. // Mediators Inflamm. – 2012. – Vol.2012.
– Art.ID: 318087.
523.
Wanasen, N. L-arginine metabolism and its impact on host immunity against Leishmania
infection / N. Wanasen, L. Soong // Immunol. Res. – 2008. – Vol.41, N.1. – P.15-25.
524.
Wang, X.Q. Erythropoietin depresses nitric oxide synthase expression by human endothelial
cells / X.Q. Wang, N.D. Vaziri // Hypertension. – 1999. – Vol.33, N.3. – P.894–899.
525.
Wang, H. Endothelial nitric oxide synthase decreases beta-adrenergic responsiveness via
inhibition of the L-type Ca2+ current / H. Wang, M.J. Kohr, D.G. Wheeler et al. // Am. J.
Physiol. Heart Circ. Physiol. – 2008. – Vol.294, N.3. – P.H1473-H1480.
526.
Wang, T. Inhaled nitric oxide in 2003: a review of its mechanisms of action / T. Wang, D. El
Kebir, G. Blaise // Can. J. Anaesth. – 2003. – Vol.50, N.8. – P.839-846.
527.
Wang, Y. Cardioprotection during the final stage of the late phase of ischemic preconditioning
is mediated by neuronal NO synthase in concert with cyclooxygenase-2 / Y. Wang, E. Kodani,
J. Wang et al. // Circ. Res. – 2004. – Vol.95, N.1. – P.84-91.
528.
Ward, P.A. A historical perspective on sepsis / P.A. Ward, M. Bosmann // Am. J. Pathol. –
2012. – Vol.181, N.1. – P.2-7.
237
529.
Watanabe, Y. Post-synaptic density-95 promotes calcium/calmodulindependent protein kinase
II-mediated Ser847 phosphorylation of neuronal nitric oxide synthase / Y. Watanabe, T. Song,
K. Sugimoto et al. // Biochem. J. – 2003. – Vol.372, Pt 2. – P.465– 471.
530.
Watson, D. Cardiovascular effects of the nitric oxide synthase inhibitor NG-methyl-L-arginine
hydrochloride (546C88) in patients with septic shock: results of a randomized, double-blind,
placebo-controlled multicenter study (study no. 144-002) / D. Watson, R. Grover, A. Anzueto
et al. // Crit. Care Med. – 2004. – Vol.32, N.1. – P.13-23.
531.
Webb, A.J. Mechanisms underlying erythrocyte and endothelial nitrite reduction to nitric oxide
in hypoxia. Role for xanthine oxidoreductase and endothelial nitric oxide synthase / A.J. Webb,
A.B. Milsom, K.S. Rathod et al. // Circ. Res. – 2008. – Vol.103, N.9. – P.957-964.
532.
Wecht, J.M. Direct and reflexive effects of nitric oxide synthase inhibition on blood pressure /
J.M. Wecht, J.P. Weir, D.S. Goldstein, et al. // Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. – 2008. –
Vol.294, N.1. – P.H190-H197.
533.
Wei, C.C. The three nitric-oxide synthases differ in their kinetics of tetrahydrobiopterin radical
formation, heme-dioxy reduction, and arginine hydroxylation / C.C. Wei, Z.Q. Wang, D. Durra
et al. // J. Biol. Chem. – 2005. – Vol.280, N.10. – P.8929-8935.
534.
Wei, L.H. Certain S-substituted isothioureas not only inhibit NO synthase catalytic activity but
also decrease translation and stability of inducible NO synthase protein / L.H. Wei, N.
Arabolos, L.J. Ignarro // Nitric Oxide. – 1998. – Vol.2, N.3. – P.155-164.
535.
Wells, M. Radiation skin reactions / M. Wells, S. MacBride // In: Supportive care in
radiotherapy. M. Wells, S. Faithfull. - Churchill Livingstone, 2003. – P.135-159.
536.
Westphal, M. Who is the bad guy in acute respiratory distress syndrome? Neuronal nitric oxide
synthase, inducible nitric oxide synthase, or both? / M. Westphal, D.M. Maybauer, M.O.
Maybauer // Crit. Care Med. – 2009. – Vol.37, N.1. – P.363-364.
537.
Wheeler, D.S. Oxidative stress in critically III children with sepsis / D.S. Wheeler // Open
Inflam. J. – 2011. – Vol.4(s1). – P.74-81.
538.
Willett, C.G.Complete pathological response to bevacizumab and chemoradiation in advanced
rectal cancer/ C.G. Willett, D.G. Duda, E. di Tomaso et al. // Nat. Clin. Pract. Oncol. - 2007. Vol.4, N.5. - P.316-321.
539.
Wolff, D.J. The inhibition of th constitutive bovine endothelial nitric oxide synthase by
imidazole and indazole agents / D.J. Wolff, A. Lubeskie, S. Umansky // Arch. Biochem.
Biophys. – 1994. – Vol.314, N.2. – P.360-366.
540.
Wolff, D.J. Inactivation of nitric oxide synthase by substituted aminoguanidines and
aminoisothioureas / D.J. Wolff, D.S. Gauld, M.J. Neulander et al. // J. Pharmacol. Exp. Ther. –
1997. – V.283, N.1. – P.265-273.
541.
Wolff, D.J. Inactivation of nitric oxide synthase isofoms by diaminoguanidine and NG-aminoL-arginine / D.J. Wolff, A. Lubeskie // Arch. Biochem. Biophys. – 1996. – Vol.325, N.2. –
P.227-234.
542.
Wolff, D.J. Inactivation of nitric oxide synthases and cellular nitric oxide formation by N6iminoethyl-L-lysine and N5-iminoethyl-L-ornitine / D.J. Wolff, A. Lubeskie, D.S. Gauld et al.
// Eur. J. Pharmacol. – 1998. – Vol.360, N 2.3. – P.325-334.
543.
Wray, G.M. Selective inhibition of the activity of inducible nitric oxide synthase prevents the
circulatory failure, but not the organ injury/dysfunction, caused by endotoxin / G.M. Wray,
C.G. Millar, C.J. Hinds et al. // Shock. – 1998. – Vol.9, N.5. – P.329-335.
238
544.
Wu, G. Binding kinetics of calmodulin with target peptides of three nitric oxide synthase
isozymes / G. Wu, V. Berka, A.L. Tsai et al. // J. Inorg. Biochem. – 2011. – Vol 105, N 9. – P.
1226-1237.
545.
Xiong, Y. Angiogenesis, neurogenesis and brain recovery of function following injury / Y.
Xiong, A. Mahmood, M. Chopp // Curr. Opin. Investig. Drugs. – 2010. – Vol.11, N.3. – P.298308.
546.
Xu, W. The role of epithelial NO in airway viral infection / W. Xu, S. Zheng, R.A. Dweik et al.
// Free Radic. Biol. Med. - 2006. - Vol.41, № 1. - P.19-28.
547.
Yamakura, F. Modification of tryptophan and tryptophan residues in proteins by reactive
nitrogen species / F. Yamakura, K. Ikeda // Nitric Oxide. – 2006. – Vol.14, N.2. – P.152-161.
548.
Yang, Q. Single cell determination of nitric oxide release using capillary electrophoresis with
laser-induced fluorescence detection / Q. Yang, X. Zhang, X. Bao et al. // J. Chromatogr.
Analyt. – 2008. – Vol.1201, N.1. – P.120-127.
549.
Yang, Y. Presynaptic long-term plasticity / Y. Yang, N. Calacos // Front Synaptic Neurosci. –
2012. Vol.5, Art.8. – P.1-22.
550.
Ye, S. Detection of nitric oxide in single cells / S. Ye, S.S. Rubakhin, J.V. Sweedler // Analist.
– 2008. – Vol.133, N.4. – P.423-433.
551.
Yildiz, O. Serotonin and vasoconstrictor synergism / O. Yildiz, J.R. Smith, R.E. Purdy // Life
Sci. – 1998. – Vol.62, N.19. – P.1723-1732.
552.
Yonetani, T. Electron paramagnetic resonance and oxygen binding studies of a nitrosyl
hemoglobin: a novel oxygen carrier having NO-assisted allosteric functions / T. Yonetani, A.
Tsuneshige, Y. Zhou et al. // J. Biol. Chem. – 1998. – Vol.273, N.32. - P.20323-20333.
553.
Yoshida, M. Heat shock protein 90 as an endogenous protein enhancer of inducible nitric oxide
synthase / M. Yoshida, Y. Xia // J. Biol. Chem. – 2003. – Vol.278, N.38. – P.36953-36958.
554.
Yasuda, H. Solid tumor physiology and hypoxia-induced chemo/radio-resistance: novel
strategy for cancer therapy: nitric oxide donor as a therapeutic enhancer / H. Yasuda // Nitric
Oxide. – 2008. – Vol.19, N.2. – P.205-216.
555.
Yuste, J.E. 7-Nitroindazole down-regulates dopamine/DARPP-32 signaling in neostriatal
neurons in a rat model of Parkinson's disease / J.E. Yuste, M.B. Echeverry, F. Ros-Bernal et al.
// Neuropharmacology. – 2012. – Vol.63, N.7. – P.1258-1267.
556.
Zanzinger, J. Neuronal nitric oxide reduces sympathetic excitability by modulation of central
glutamate effects in pigs / J. Zanzinger, J. Czachurski, H. Seller // Circ. Res. – 1997. - Vol.80,
N.4. – P.565–571.
557.
Zaobornyj, T. Strategic location of heart mitochondrial NOS: a review of the evidence / T.
Zaobornyj, P. Ghafourifar // Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. – 2012. – Vol.303, N.11. –
P.H1283-H1293.
558.
Zaobornyj, T. Heart mitochondrial nitric oxide synthase: a strategic enzyme in the regulation of
cellular bioenergetics / T. Zaobornyj, L.B. Valdez // Vitam. Horm. – 2014. – Vol.96. – P.29-58.
559.
Zhang, H.Q. Potent and selective inhibition of neuronal nitric oxide synthase by N()-propylL-arginine / H.Q. Zhang, W. Fast, M.A. Marletta et al. // J. Med. Chem. – 1997. – Vol.40,
N.24. – P.3869-3870.
560.
Zhang, H.Q. Mechanism of inactivation of neuronal nitric oxide synthase by N()-allyl-Larginine / H.Q. Zhang, R.P. Dixon, M.A. Marletta et al. // J. Am. Chem. Soc. – 1997a. –
Vol.119, N.45. – P.10888-10902.
239
561.
Zhang, W. Protein-protein interactions involving inducible nitric oxide synthase / W. Zhang, T.
Kuncewicz, Z.Y. Yu et al. // Acta Physiol. Scand. – 2003. – Vol.179, N.2. – P.137-142.
562.
Zhou, H. Nitric oxide-donating aspirin inhibits the growth of pancreatic cancer cells through
redox-dependent signaling / H. Zhou, L. Huang, Y. Sun et al. // Cancer Lett. – 2009. – Vol.273,
N.2. – P.292–299.
563.
Zhou, L. Neuronal nitric oxide synthase: structure, subcellular localization, regulation, and
clinical implications / L. Zhou, D.Y. Zhu // Nitric Oxide. – 2009. – Vol.20, N.4. – P.223-230.
564.
Zhu Y. Mechanism of inactivation of inducible nitric oxide synthase by amidines. Irreversible
enzyme inactivation without inactivator modification / Y. Zhu, D. Nikolic, R.B. Van Breemen
et al. // J. Am. Chem. Soc. – 2005. – Vol.127, N.3. – P.858-868.
565.
Ziche, M.L. Molecular regulation of tumour angiogenesis by nitric oxide / M. Ziche, L.
Morbidelli // Eur. Cytokine Netw. - 2009. – Vol.20, N.4. - P.164-170.
566.
Ziskoven, C. Oxidative stress in secondary osteoarthritis: from cartilage destruction to clinical
presentation? / C. Ziskoven, M. Jager, C. Zilkens et al. // Orthop. Rev. (Pavia). – 2010. – Vol.2,
N.2. - doi: 10.4081/or.2010.e23.
567.
Zuckerbraun, B.S. Ntrite potently inhibits hypoxic and inflammatory pulmonary arterial
hypertension and smooth muscle proliferation via xanthine oxidoreductase-dependent nitric
oxide generation / B.S. Zuckerbraun, S. Shiva, E. Ifedigbo et al. // Circulation. – 2010. –
V.121, N.1. – P.98-109.
568.
Zweier, J.L. Mechanisms of nitrite reduction to nitric oxide in the heart and vessel wall / J.L.
Zweier, H. Li, A. Samouilov et al. // Nitric Oxide. – 2010. – Vol.22, N.2. – P.83-90.
569.
Zweier, J.L. S-glutathionylation reshapes our understanding of endothelial nitric oxide synthase
uncoupling and nitric oxide/reactive oxygen species-mediated signaling / J.L. Zweier, C.A.
Chen, L.J. Druhan // Antioxid. Redox Signal. – 2011. – Vol.14, N.10. – P.1769-1775.
