Продукты компании Тианген для выделения ДНК

Продукты компании Тианген для выделения ДНК
Обзор продуктов Тианген для
выделения ДНК
Компания
Тианген
представляет
технологию выделения геномной ДНК из
широкого спектра образцов, включая
кровь,
бактерии,
дрожжи,
ткани
животных, растения, клеточные линии,
продукты питания. Размер фрагментов
выделенной геномной ДНК составляет
20 – 30 kb.
TIANGEN®
www.tiangen.com
С целью обеспечения вами хороших
результатов,
Тианген
предлагает
большой выбор наборов для выделения
ДНК из определенных типов образцов.
Ниже представленные вспомогательные
схемы помогут вам лучше разобраться в
продукции.
AVA-miR Genomics, Москва, Россия
www.avagen.ru
Тел.: +7 (985) 616 32 64
TIANGEN®
www.tiangen.com
AVA-miR Genomics, Москва, Россия
www.avagen.ru
Тел.: +7 (985) 616 32 64
Особенности наборов
Наборы для выделения ДНК простой и
безопасный способ выделения без
использования
токсичных
реагентов
таких как фенол или хлороформ.
Типы образцов
Растения / кровь / ткани / клеточные
культуры / крысиный хвост / сыворотка
/ плазма/ тампоны / слюна / продукты
питания / дрожжи / вирусы / бактерии /
парафиновые блоки и др.
Области использования
выделенной ДНК
 Приготовление библиотек
 картирование генома
 Саузерн блоттинг
 ПЦР
TIANGEN®
www.tiangen.com
AVA-miR Genomics, Москва, Россия
www.avagen.ru
Тел.: +7 (985) 616 32 64
Технология выделения ДНК с использованием наборов компании Тианген
Требования к образцам
Принципы
 Обеспечение целостности нуклеиновых
кислот
с
целью
последующей
функционального исследования
 Удаление
примесей
(белков,
полисахаридов, липидов и органических
растворителей)
Стадии метода
Свежеотобранные
образцы
или
0
замороженные при -20/-80
C. Не
рекомендуется повторная разморозка,
поскольку это
может
привести к
разрушению и потерям при выделении.
В отношении бактерий и дрожжей
рекомендуется сбор в логарифмической
фазе.
Методы пробоподготовки
Выделение ДНК из клеток можно
разделить на четыре этапа:
1. Гомогенизация
2. Лизис
3. Освобождение от белков и примесей
4. Высвобождение ДНК
Подготовка образца
Методы подготовки зависят от типов
(бактерии,
дрожжи,
растения
и
клеточные линии) и формы образцов
(например:
свежая,
замороженная
кровь, сгустки крови, пятна крови).
Пробоподготовка
Связывание ДНК с
силиконовой мембраной
Отмывка
 Растения – растирание в жидком
азоте
 Животные ткани – гомогенизация и
растирание в жидком азоте
 Бактерии – обработка лизоцимом
 Дрожжи – растирание стеклянными
шариками и обработка литиказой
Клеточный лизис
Методы, в наборах для выделения ДНК
Тиангена основаны на использовании
SDS или CTAB для лизиса клеток для
высокомолекулярных фрагментов ДНК.
Пользователь
может
выбрать
Клеточный лизис.
высвобождение ДНК
Адсорбционное выделение:
удаление белков, липидов
и полисахаридов
Удаление солей и
органических примесей
Элюция
Получение чистой ДНК
Сбор
TIANGEN®
www.tiangen.com
AVA-miR Genomics, Москва, Россия
www.avagen.ru
Тел.: +7 (985) 616 32 64
соответствующий
образцов.
метод
для
разных
CTAB – метод
 Подходит для грибов и растений
 CTAB
(цетилтриметиламмоний
бромид)
ялвляется
катионным
детергентом,
который
растворяет
клеточную мембрану и образует
комплекс с нуклеиновыми кислотами
и
полисахарами.
Этот
комплекс
стабилен в солевом растворе (>0,7M
NaCl.
SDS –метод
 Подходит
для
крови,
клеточных
линий, животных тканей, бактерий и
дрожжей
 SDS – анионный детергент, который
лизирует клетки, денатурирует белки
и преципитирует хромосомы
Другие методы лизиса
 Физические
–
механическое
растирание,
ультразвук,
гомогенизация
 Химические – щелочной лизис и
лизис гуанидинизотиоцианатом
 Ферментативные
– расщепление
протеиназой К.
Выделение и очистка ДНК
Требования к выделенному образцу
 Отсутствие
органических
веществ
или высоконцентрированных солей,
которые ингибируют ДНК-полимеразу
или ферменты)
 Низкое
содержание
примесей
(например белков, полисахаридов и
липидов)
 Отсутствие контаминаций РНК в ДНК
и наоборот
Выделение ДНК
TIANGEN®
www.tiangen.com
Обычно выделение ДНК начинается с
лизиса образца, разрушения тканей или
клеток. Этот процесс необходим для
нарушения белковой структуры клеток
и
способствует
высвобождению
нуклеиновых кислот из ядра. Для
удаленияпримесей и выделения ДНК в
наборе используется адсорбирующий
материал,
представляющий
собой
ионно-обменную смолу и шарики на
основе
кремния.
Силиконовые
адсорбирующие
субстраты
широко
распространены в методиках выделения
нуклеиновых
кислот
вследствие
ощутимых преимуществ по скрости,
простоте и безопасности (отсутствие
токсической органики, такой как фенол
и
хлороформ).
Для
поддержания
целостности ДНК в наборах Тиангена
используется мембранная технология.
Правильность выбора метода позволяет
оптимизировать
выход
и
качество
изолированной ДНК.
Примечания
Для обеспечения чистоты и целостности
выделенной
ДНК,
учитывайте
следующие факторы:
 Убедитесь, что метод достаточно
прост и лишен опасных факторов,
повреждающих ДНК
 С
целью
снижения
возможности
деградации ДНК, поддерживайте pH
сред,
используемых
в
процессе
выделения в диапазоне pH 4 – 10.
 Избегайте деградации ДНК. Опасность
представляют ДНКазы, которые могут
разрушить
первичную
структуру
нуклеиновых
кислот.
Для
своей
активности
ДНКазам
необходимы
растворы, богатые ионами Mg2+
и
2+
Ca . Соответственно растворы на
основе цитрата или ЭДТА иогут
существенно
снижать
активность
AVA-miR Genomics, Москва, Россия
www.avagen.ru
Тел.: +7 (985) 616 32 64
ДНКаз. Буферы в наборах Тиангена
содержат ингибиторы ДНКаз.
 Избегайте
деградации
ДНК
в
следствие
физических
факторов,
таких
как
нагрев
до
высоких
температур и повторная разморозка
Элюция ДНК
Элюция ДНК
факторов:
зависит
от
следующих
Состав элюента
При
использовании
адсорбционных
материалов оптимальным выделения
ДНК является pH 7-8,5. В наборах
Тиангена используются буферы с pH 8
для сохранения и элюции ДНК из
силиконовой мембраны.
Концентраия
ЭДТА в TE буфере очень низкая и
практически не влияет на активность
ДНК-полимеразы
и
эндонуклеаз.
Эффективность элюции можно усилить
путем инкубации TE-буфера при 60-70
0
C в течении 10 минут.
Взаимосвязь между выходом ДНК и объемом элюции
Из вышеприведенных картинок следует,
что при объеме элюента ниже 30мкл,
эффективность
элюции
низкая
и
нестабильная. Эффективность элюции
при
максимальном
выходе
можно
довести до 80 – 90% при диапазоне 50
– 200мкл элюционного объема. Перед
элюцией
необходимо
полностью
освободиться от буфера PW. Для
удаления
этанольного
раствора
необходимо цетнрифугировать колонки
в течение двух минут при комнатной
температуре.
Время и частота элюции.
После внесения TE буфера на мембрану,
инубируйте колонку в течение 2-5
минут
для
полного
наполнения
мембраны и лучшего растворения ДНК в
TE. Повторение элюции дважды и
трижды усиливает растворение ДНК в
TE-буфере
и
значительно
может
увеличить эффективность элюции и
выход ДНК.
Хранение ДНК
Хранение буфера
ДНК стабильна в щелочной среде
буфера и как правило хранится в TEбуфере. Состав TE-буфера: 10мМ TRISHCl (трис формирует прочные связи с
соляной
кислотой);
1мМ
ЭДТА
(хелатирует
бивалентные
ионы
металлов, что ингибирует ДНКазы);
pH
8
(щелочная
среда
снижает
деградацию ДНК). TE-буфер в составе
наборов Тиангена может эффективно
сохранять и элюировать ДНК.
Часто задаваемые вопросы:
Выход ДНК и эффективность элюции значительно
усиливаются при повторных элюциях
Объем элюции
TIANGEN®
www.tiangen.com
В: Возможно ли использование
воды для хранения ДНК?
О: нормальный pH воды – 7 и пригоден
для хранения ДНК. Однако иногда
ddH2O, приготовленная в лабораторных
условиях обладает кислым pH, что
негативно влияет на эффективность
элюции
ДНК
с
мембраны.
Также
AVA-miR Genomics, Москва, Россия
www.avagen.ru
Тел.: +7 (985) 616 32 64
хранение в
ускоренной
длительного
TE-буфер.
такой воде приводит к
деградации
ДНК.
Для
хранения рекомендован
В: Требуется ли преципитация и
сушка высокомолекулярной ДНК?
О: Молекулярный вес геномной ДНК
слишком
велик,
поэтому
тяжело
растворяется. Кроме того размешивание
при растворении сухой ДНК может
приводить к нарушениям еѐ структуры.
Соответственно
нет
необходимости
высушивания ДНК.
TIANGEN®
www.tiangen.com
Хранение
С целью ограничения деградации ДНК,
следует еѐ аликвотировать и хранить
аликвоты при -20 или -80 0C. На -80 0C
ДНК может храниться до 5 лет.
Избегайте повторных разморозок.
AVA-miR Genomics, Москва, Россия
www.avagen.ru
Тел.: +7 (985) 616 32 64
Информация для заказа
TIANGEN®
www.tiangen.com
AVA-miR Genomics, Москва, Россия
www.avagen.ru
Тел.: +7 (985) 616 32 64
Технология выделения РНК с использованием наборов компании Тианген
Принципы и методы
Тотальная РНК представляет собой три
основных
типа:
матричная,
транспортная и рибосомальная РНК.
Процесс
выделения
РНК
включает
стадии лизиса, высвобождения РНК,
удаления
примесей
и
получения
высоко-чистой РНК.
Процесс выделения
Пробоподготовка
Выделять
РНК
можно
из
разных
источников, включая бактерии, дрожжи,
кровь,
животные
ткани,
растения,
клеточные культуры и разных типов
образцов (свежая, замороженная кровь,
сгустки крови, пятна крови).
Свежеотобранные
образцы
или
замороженные при -20/-80 0C. Не
рекомендуется повторная разморозка,
поскольку это
может
привести к
разрушению и потерям при выделении.
В отношении бактерий и дрожжей
рекомендуется сбор в логарифмической
фазе.
Методы пробоподготовки
 Растения – растирание в жидком
азоте
 Животные ткани – гомогенизация и
растирание в жидком азоте
 Бактерии – обработка лизоцимом
 Дрожжи – растирание стеклянными
шариками и обработка литиказой
Клеточный лизис, методы
 Гуанидинизотиоцианата
и фенола
Экстракция
с
использованием
фенол/хлороформа – это жидкофазный
биохимический мето, которым часто
пользуются в молекулярной биологии
TIANGEN®
www.tiangen.com
AVA-miR Genomics, Москва, Россия
www.avagen.ru
Тел.: +7 (985) 616 32 64
для выделения РНК. Этот метод основан
на
фазовом
разделении
водной
суспензии
образца
и
раствора,
содержащего разведенного в воде
фенола,
хлороформа
и
денатурирующего
раствора
гуанидинизотиоцианата.
Центрифугирование
жидкой
смеси
приводит
к
разделению
верхнюю
водную фазу и нижнюю органическую
(главным образом, хлороформ). РНК
находится в водной фазе, в то время,
как белки – в органической. На
следующем этапе РНК преципитируется
из водной фазы с использованием
изопропанола или этанола. Наборы
«TRNzol» (DP405), «TRNzol-a+» (DP421)
и «RNAsimple» (DP419) основаны на
методе выделения с использованием
гуанидинизотиоцианата/фенольного
метода.
Реагент
TRNzol
широко
используется для выделения РНК из
животных тканей, микробных образцов,
культивируемых клеток и растений,
ткани
которых
не
изобилуют
вторичными метаболитами.
 Гуанидиновой соли и
β-Меркаптоэтанола
Метод подходит для выделения из
животных тканей и растений, без
вторичных метаболитов.
β-Меркаптоэтанолт
используют,
как
реагент который защищает РНК от
деградации. Наборы Тиангена серии
«RNAprep pure» основаны на этом
методе.

Другие методы
Некоторые растения (такие как фрукты
и
листья
томатов)
богаты
полисахаридами
и
полифенолами;
некоторые имеют высокую степень
одревеснения
(например,
корни).
Реагент компании Тианген «RNA plant
plus Reagent» (DP437) специально
предназначен для таких образцов. С его
TIANGEN®
www.tiangen.com
помощью
можно
выделять
высоко
очищенную
РНК
из
растений
обогащенных
вторичными
метаболитами.
Выделение РНК
Требования по чистоте образца
 Отсутствие
органических
веществ
или высоконцентрированных солей,
которые ингибируют ДНК-полимеразу
или ферменты)
 Низкое
содержание
примесей
(например белков, полисахаридов и
липидов)
 Отсутствие контаминаций ДНК
Выделение
Метод 1: экстракция органическими
смесями
Экстракция фенол/лороформом – это
классический
способ
отделения
нуклеиновых кислот от белков. Во
время экстракции РНК мигрирует в
водную фазу, в то время как ДНК и
белки остаются либо в интерфазе, либо
в органической фракции. На этом
методе основаны продукты Тианген
серии «TRNzol» и «RNAplant plus».
Метод 2: Адсорбция на силиконовой
мембране
По
мере
совершенствования
технологии, для упрощения процесса
были
внедрены
адсорбирующие
материалы. Силиконовые материалы
широко
распространены
благодаря
высокой
производимости
и
безопасности метода выделения, при
котором не используются вредные
органические
соединения,
включая
фенол и хлороформ. На этом методе
основаны продукты Тианген серии «RNA
simple Total RNA kit» и «RNA prep pure».
В результате получается высоко чистая
РНК.
AVA-miR Genomics, Москва, Россия
www.avagen.ru
Тел.: +7 (985) 616 32 64
Выделение РНК из разных тканей
Волокнистые ткани
Эффективный лизис клеток является
важным для очистки РНК из волокон
сердечных и скелетных
мышц. Эти
образцы обладают низкой плотностью
клеток. Для увеличения стартового
количества клеток, рекомендуется брать
больше ткани и лучше растирать
образец в жидком азоте.
Ткани обогащенные белками или
жирами
Содержание жира велико в растениях и
мозге. Рекомендуется проводить
повторные экстрации
фенол/хлороформом с целью выхода
более чистой РНК.
Нуклеиновые кислоты / Ткани
богатые РНКазами
РНКаз много в селезенке и тимусе.
Незамедлительное помещение тканей
после
забора
в
жидкий
азот
с
растиранием способствует эффективной
инактивации
РНКаз.
Повторные
экстракции фенолом /хлороформом могут
дополнительно удалять белки и ДНК.
Если сразу после добавления этанола
формируется белый преципитат, это
может
быть
индикатором
ДНК
контаминации. Ёе можно устранить либо
ДНКазой
I,
либо
экстракцией
фенолом/хлороформом.
Растения и грибы
Выделять РНКиз растений и грибов
намного сложнее, чем из тканей
животных. РНК в растертом в жидком
азоте образцы необходимо защитить от
деградации. Если не удается избежать
деградации РНК текущим методом,
данный процесс, скорее всего, вызван
наличием примесей в образце. Многие
грибы
и
растения
обогащены
полисахаридами
и
полифенолами,
которые сложно удалить и которые
TIANGEN®
www.tiangen.com
могут связывать РНК. Для их удаления
рекомендуются дополнительные этапы и
реагенты, такие как реагент Тиангена
«RNA plant plus» (DP437).
Идентификация и оценка РНК
С
целью
использования
РНК
в
дальнейших процедурах, необходимо
четко определить еѐ качество. Разным
экспериментам требуются собственные
стандарты качества РНК. Для создания
ДНК-библиотек требуется чистая РНК
без примесей. Для Нозерна чистота РНК
также
необходимо,
но
какие-то
концентрации
ингибиторов
не
так
критичны. В тоже время для ОТ-ПЦР не
так важна интактность РНК, сколь
необходимо отсутствие ингибиторов.
Соответственно многим приложениям
требуются разные способы выделения
РНК.
Определение выхода РНК с
использованием УФ –
спектрометрии
Концентрация РНК отличается в разных
тканях.
Оценить
еѐ
можно
с
использованием
УФспектрометрии,
которая
определяет
линейные
изменения
поглощения.
Максимум
поглощения РНК при 260нм в диапазоне
260 -280нм РНК. Значение оптической
плотности (OD) при 260нм используется
для определения концентрации РНК в
растворе.
Значение
OD260
- 1.0
эквивалентно
40 мкг/мкл РНК. Соотношение
OD260/280 чистой РНК без примесей
белков должно быть в диапазоне 1.8-2.
Концентрация РНК (мкг/мкл) =
= OD260 X 40 мкг/мл X величину
разведения.
AVA-miR Genomics, Москва, Россия
www.avagen.ru
Тел.: +7 (985) 616 32 64
Стартовые значения РНК для выделения
Показатели чистоты РНК с
использованием УФ –
спектрометрии
1.9 - 2.1 при OD260/OD280: высокая
чистота РНК;
Ниже 1.8 при OD260/OD280: наличие
примеси белка в РНК;
Выше 2.2 при OD260/OD280:
деградация РНК;
Примечание: OD260/OD280 может
повышаться при использовании TE –
буфера для разведения РНК.
Анализ целостности РНК с
использованием агарозного и
денатурирующего гелевого
электрофорезов.
Определить целостность РНК можно с
использованием
денатурирующего
гелевого электрофореза, но обычно для
этого
используется
агарозный
электрофорез.
В
тотальной
РНК
содержится 80%-85% рРНК. В агарозе
можно легко различить 28S (23S) и
18S (16S) рРНК. 28S рРНК составляет
обычно половинную часть от 18S рРНК,
что говорит о целостности РНК. В
таблице справа указаны показатели
рРНК из разных источников.
Обычный электрофорез
Поскольку выполнение
денатурирующего электрофореза
намного сложнее агарозного, то обычно
тестируют РНК с помощью агарозного,
тем более, что положение полос РНК
при обоих методах одно и то же.
Защита РНК
Процесс
выделения
РНК
намного
сложнее ДНК, главным образом в
следствие
более
высокой
подверженности РНК деградации по
сравнению с ДНК. Это зависит от
внешних
и
внутренних
факторов.
Внутренний
фактор:
остатки
нуклеотидов молекулы РНК обладают
двумя 2′ и 3′ - гидроксильными
группами. Это усиливает химическую
реактивность РНК по сравнению с ДНК.
Внешний фактор: во внешней среде
больше
РНКаз,
которые
сложнее
инактивируются нагреванием.
Защита РНК до начала выделения
Хранение и сбор образца
Лучше всего работать со свежим
образцом.
Для
сохранения
РНК
TIANGEN®
www.tiangen.com
AVA-miR Genomics, Москва, Россия
www.avagen.ru
Тел.: +7 (985) 616 32 64
необходимо
в
кратчайшие
сроки
поместить образец в жидки азот,
растереть и гомогенизировать. Если
сразу приступить к выделению не
возможно,
необходимо
сохранить
образец. Чаще всего образцы хранят в
жидком азоте, повторная разморозка не
рекомендуется.
Отсутствие РНКаз в эксперименте
Природное
окружение
обогащено
РНКазами. Соответственно выделение
РНК следует проводить в свободных от
РНКаз условиях и не соприкасаться с
другими экспериментальными зонами.
Реагенты и расходные материалы
без РНКаз
Требуется использовать стерильный,
одноразовый
пластик
без
РНКаз.
Используемую
стеклянную
посуду
требуется предварительно прожаривать
при температуре 1500C >4 часов.
В
некоторых случаях стелянную посуду
предварительно обрабытывают 0,1%
раствором диэтилпирокарбоната (DEPC),
ингибитора РНКаз. Основной источник
РНКаз
–
это
руки;
используйте
перчатки. Выделите в лаборатории
отдельное место для посуды свободной
от РНКаз. Также можно использовать
воду, обработанную DEPC (добавить 1
мл DEPC на 1 литр воды; инкубировать
12 часов и автоклавировать 15-20
минут). Эту воду можно использовать
для приготовления всех растворов.
Защита РНК в процессе выделения
Гомогенизация образца
Лизис клеток
Для лизиса клеток необходим удобный и
подходящий буфер. Все лизирующие
буферы от Тиангена «TRNzol», «RNA
simple» и наборы серии «RNA prep kits»
обладают
ингибирующим
эффектом
против
РНКаз.
Образец
следует
добавлять в нужной пропорции к
лизирующему буферу. Избыток образца
приводит к недостаточному лизису
клеток, слабому ингибированию РНКаз,
что сказывается на количестве выхода и
целостности РНК.
Условия хранения
Важным моментом является сохранение
РНК после выделения и предотвращение
еѐ деградации. Для простого решения
этой проблемы предлагается продукт
«TIANGEN RNA safe» (DP409). Это
уникальный
химический
реагент,
который ингибирует РНКазы, удаляет
загрязнение РНКазами раствора РНК. Он
совместим со многими буферами, и
дальнейшая стерилизации не требуется.
Последующие приложения
Готовую РНК можно использовать в
таких последующих методах, как ОТПЦР, Нозерн, трансляция translation in
vitro. Для этих процедур требуется
последующее сохранение РНК. Для этих
целей
рекомендуется
использовать
продукт «RNasin» (DP418), который
блокирует
РНКазы
в
дальнейших
экспериментах.
Одним из наиболее частым методом
гомогенизации является растирание в
жидком
азоте.
Не
давайте
азоту
полностью испаряться и постоянно
подливайте азот. Если образец начнет
размораживаться
до
РНК
будет
разрушена РНКазами.
TIANGEN®
www.tiangen.com
AVA-miR Genomics, Москва, Россия
www.avagen.ru
Тел.: +7 (985) 616 32 64
Обзор продукции для выделения РНК
TIANGEN®
www.tiangen.com
AVA-miR Genomics, Москва, Россия
www.avagen.ru
Тел.: +7 (985) 616 32 64
Схема по выбору соответствующего набора
TIANGEN®
www.tiangen.com
AVA-miR Genomics, Москва, Россия
www.avagen.ru
Тел.: +7 (985) 616 32 64
Сравнение наборов для выделения РНК
TIANGEN®
www.tiangen.com
AVA-miR Genomics, Москва, Россия
www.avagen.ru
Тел.: +7 (985) 616 32 64
Информация для заказа
TIANGEN®
www.tiangen.com
AVA-miR Genomics, Москва, Россия
www.avagen.ru
Тел.: +7 (985) 616 32 64
Обзор продукции для выделения плазмидной ДНК
TIANGEN®
www.tiangen.com
AVA-miR Genomics, Москва, Россия
www.avagen.ru
Тел.: +7 (985) 616 32 64
Информация для заказа
TIANGEN®
www.tiangen.com
AVA-miR Genomics, Москва, Россия
www.avagen.ru
Тел.: +7 (985) 616 32 64
Обзор продукции для очистки продуктов ПЦР и
выделения ДНК из геля
TIANGEN®
www.tiangen.com
AVA-miR Genomics, Москва, Россия
www.avagen.ru
Тел.: +7 (985) 616 32 64
Информация для заказа
TIANGEN®
www.tiangen.com
AVA-miR Genomics, Москва, Россия
www.avagen.ru
Тел.: +7 (985) 616 32 64
Молекулярные маркеры длин для ДНК-анализа
TIANGEN®
www.tiangen.com
AVA-miR Genomics, Москва, Россия
www.avagen.ru
Тел.: +7 (985) 616 32 64
Информация для заказа
TIANGEN®
www.tiangen.com
AVA-miR Genomics, Москва, Россия
www.avagen.ru
Тел.: +7 (985) 616 32 64