1 Фосфорилирование миозина как основной путь регуляции
реклама
Фосфорилирование миозина как основной путь регуляции сокращения гладких мышц А.В. Воротников1,2, О.В. Щербакова2, Т.В. Кудряшова1, О.С. Тарасова3, В.П. Ширинский2, Г. Пфитцер4, В.А. Ткачук1,5 1 Кафедра биологической и медицинской химии Факультета фундаментальной медицины МГУ имени М.В. Ломоносова; 2 Лаборатория клеточной подвижности Института экспериментальной кардиологии Российского Кардиологического научно-производственного комплекса Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи РФ; 3 Кафедра физиологии человека и животных Биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова. 4 Институт вегетативной физиологии, Университет г. Кёльн, ул. Роберта Коха, 39, Кёльн, D50931, Германия. 5 Лаборатория молекулярной эндокринологии Института экспериментальной кардиологии Российского Кардиологического научно-производственного комплекса Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи РФ; Адрес для переписки: А.В. Воротников, Кафедра биологической и медицинской химии, Факультет фундаментальной медицины МГУ имени М.В. Ломоносова, Москва 119192, Ломоносовский проспект, д. 31, корп 5. [email protected], тел. 8-916-552-1560, факс/тел 8-495-932-8814. 1 Резюме Миозин II типа является молекулярным мотором, обеспечивающим сокращение всех типов мышц. Для развития сокращения гладких мышц миозин должен быть активирован путем фосфорилирования. Уровень фосфорилирования миозина и сокращение гладких мышц поддерживаются за счет баланса активностей фосфорилирующих его киназ и дефосфорилирующей фосфатазы. Этот баланс регулируется путем изменения активности киназ миозина, изменением активности фосфатазы миозина и изменением доступности миозина для этих ферментов. Во всех случаях важную роль играют рецептор-зависимые сигнальные каскады, которые реализуют нейрогуморальный контроль этих механизмов. Их дисбаланс ведет к немедленным нарушениям сократимости и последующему развитию патологических состояний. Ключевым ферментом этих каскадов является Rho-киназа, которая рассматривается в настоящее время как наиболее перспективная мишень для фармакологической терапии нарушений сократимости гладких мышц. Ключевые слова: Са-чувствительность, регуляция сокращения, гладкие мышцы; фосфорилирование, Rho-киназа. Используемые сокращения: КЛЦМ, Киназа Легких Цепей Миозина; РЛЦ, Регуляторная Легкая Цепь; CPI-17, активируемый С-киназой ингибитор фосфатазы (C-kinase-Рotentiated Inhibitor); ILK, интегрин-зависимая киназа (Integrin-Linked Kinase); KRP, белок, родственный киназе легких цепей миозина (Kinase Related Protein); МАР-киназа, Митоген-Активируемая Протеин(киназа) (Mitogen-Activated Protein Kinase); MYPT, миозин-связывающая субъединица фосфатазы (Myosin Phosphatase Targeting Subunit); PP1c, каталитическая субъединица фосфатазы 1 типа; Rho-киназа, киназа, активируемая малым ГТФ-связывающим белком Rho; ZIP-киназа, Zipper-Interating Protein kinase. 2 Введение Сократительная активность гладких мышц вносит ключевой вклад в функционирование сердечно-сосудистой, дыхательной, пищеварительной, зрительной, выделительной и репродуктивной систем организма. Результаты многочисленных исследований показывают, что нарушения сократимости гладкомышечных клеток преимущественно связаны не с изменением внутриклеточной концентрации Са2+ ([Ca2+]i), а с дисбалансом сигнальных механизмов, которые активируются мембранными рецепторами и изменяют активность белков сократительного аппарата. Сократительные реакции гладкомышечных клеток в ответ на действие агонистов мембранных рецепторов имеют, как правило, две фазы и складываются из быстрого сокращения и последующей фазы поддержания сокращенного состояния, известной также как тоническое сокращение [1,2,28,48,56]. Первая фаза кратковременна и связана с повышением [Са2+]i, в то время как длительность второй фазы и сила тонического сокращения крайне вариабельны в разных тканях и значительно меньше зависят от изменений [Са2+]i. Большинство хронических нарушений (спазм сосудов головного мозга, легочная и системная артериальная гипертензия, венозные дистонии и бронхиальная астма, аномалии половой и родовой деятельности, а также работы пищеварительного тракта) имеют сложный патогенез, но во многом связаны с нарушением тонической фазы сократительных реакций и последующей перестройки гладкомышечных элементов [7,8,47]. Молекулярный механизм генерации силы сокращения во всех типах мышц, в том числе гладких, принципиально одинаков и обобщен в ряде работ [11,22]. Он обеспечивается миозином II типа, представляющим собой молекулярный мотор, и актином, который выполняет роль кофактора миозина. Миозин II преобразует энергию гидролиза АТФ в механическую работу путем циклического взаимодействия с актином, при котором актин более чем в 1000 раз ускоряет эту реакцию. Тем не менее, именно молекулярные свойства миозина II определяют основные отличия в регуляции сокращения поперечнополосатых и гладких мышц. Миозин II сердца и скелетных мышц постоянно активен и регуляция сокращения происходит на уровне его взаимодействия с актином. Классический механизм, реализуемый в этих мышцах, основан на быстром и массированном входе Са2+ в цитоплазму, его связывании с тропонином и координированным снятием тропомиозинового блока на актине. Это разрешает взаимодействие постоянно активного миозина с актином. При таком типе регуляции зависимость силы сокращения от [Са2+]i является строго пропорциональной. Напротив, миозин II гладких мышц должен быть предварительно активирован путем фосфорилирования единственного остатка Ser19 регуляторных легких цепей (РЛЦ) миозина. 3 Поэтому сила сокращения гладких мышц во многом зависит от уровня фосфорилирования миозина в клетке. Именно на его изменение направлено большинство механизмов регуляции сократительных реакций и тонуса гладких мышц, а дисбаланс этих механизмов ведет к немедленным нарушениям сократимости и последующему развитию патологических состояний. Нейрогуморальный контроль гладких мышц характеризуется градуальной активацией, медленной динамикой и продолжительностью их сокращения. Действие агонистов вызывает повышение [Са2+]i по нескольким механизмам и распространение Ca2+-сигнала имеет свои пространственно-временные особенности в клетках разных органов [9]. События, приводящие к развитию первой фазы сокращения, достаточно универсальны и напоминают те, которые происходят при активации сокращения поперечнополосатых мышц [48,56]. Запуск сокращения происходит за счет увеличения [Са2+]i и включает связывание Са2+ с кальмодулином и активацию киназы легких цепей миозина (КЛЦМ). КЛЦМ фосфорилирует Ser19 регуляторных легких цепей (РЛЦ) миозина, что активирует моторную функцию миозина [31]. Параллельно, Са2+кальмодулин связывает актин-ассоциированный белок кальдесмон – функциональный аналог тропонина в гладкой мускулатуре. Однако в гладких мышцах снятие кальдесмонового блока не является критическим и лишь способствует развитию сокращения и замедляет расслабление [5,18]. Первая фаза сокращения кратковременна, так как быстро включаются механизмы вывода Са2+ из цитоплазмы, что приводит к снижению [Са2+]i, инактивации КЛЦМ и восстановлению ингибиторного действия кальдесмона. При завершении первой фазы уровень [Са2+]i снижается, но сохраняется выше уровня покоя за счет работы осцилляторных механизмов, природа которых пока до конца не ясна [9]. Он поддерживает активность КЛЦМ на фоновом уровне. На этой стадии начинает проявляться действие активированных рецепторами сигнальных каскадов и их мишеней – Са2+-независимых протеинкиназ, отличных от КЛЦМ. Они медленно повышают активность миозина и эффективность его взаимодействия с актином, что приводит к развитию второй, тонической фазы сокращения. Вклад этих протеинкиназ в фосфорилирование РЛЦ миозина обеспечивает увеличение Са2+-чувствительности сократительного аппарата, т.е. его способности развивать значительную силу сокращения при невысокой [Са2+]i [28,65]. Внутриклеточные механизмы, приводящие к повышению Са2+-чувствительности (то есть, Са2+-сенситизации) или к ее уменьшению (Са2+-десенситизации), основаны на действии ряда протеинкиназ и других сигнальных молекул, которые в настоящее время рассматриваются как наиболее перспективные мишени лекарственных препаратов нового поколения для снижения избыточного тонуса гладкомышечных клеток. Сигнальные механизмы регуляции сокращения гладких мышц направлены на изменение моторной активности миозина или эффективности его взаимодействия с актином. С учетом 4 этого они могут быть объединены в три основных группы: (1) механизмы, регулирующие уровень фосфорилирования РЛЦ миозина по остатку Ser19, (2) механизмы, изменяющие доступность актина для взаимодействия с миозином, и (3) менее исследованные механизмы, регулирующие перестройку филаментов актина и миозина и облегчающие поддержание и распределение силы в гладкомышечном волокне. Накопленные к настоящему времени данные лабораторных и клинических исследований указывают на то, что первая группа механизмов наиболее значима, поэтому именно она подробнее анализируется ниже. Общая схема участников этих каскадов и их взаимодействия приведена на рис. 1. Механизмы регуляции фосфорилирования миозина Как для многих сигнальных молекул, общий уровень фосфорилирования миозина II в клетке поддерживается за счет баланса активностей ферментов, осуществляющих его фосфорилирование (киназы) и дефосфорилирование (единственная фосфатаза). Этот баланс регулируется тремя основными способами: (1) путем изменения активности киназ миозина и фосфорилирования РЛЦ миозина, (2) изменением активности фосфатазы и дефосфорилирования РЛЦ миозина, и (3) изменением доступности РЛЦ миозина для этих ферментов. Во всех случаях важную роль играют рецептор-зависимые сигнальные каскады, которые реализуют нейрогуморальный контроль этих механизмов. Основные рецептор-зависимые каскады, регулирующие уровень фосфорилирования миозина Каноническая КЛЦМ – наиболее активный и специфичный для миозина фермент, который обеспечивает быстрое сокращение при повышении [Са2+]i, независимо от того, чем вызвано это повышение: деполяризацией мембраны или открытием рецептор-управляемых ионных каналов (рис. 1). Активность КЛЦМ может изменяться при действии ряда протеинкиназ, но диапазон этих изменений достаточно узок и вряд ли значительно отражается на общей активности этого фермента в клетке (для более детальной информации по этому вопросу см. [1,2,4]). Кроме того, эти изменения имеют разнонаправленный характер и могут приводить как к повышению, так и снижению активности КЛЦМ. Это предполагает возможность подстроечной регуляции активности и/или субклеточной локализации КЛЦМ, но вряд ли глобальные изменения ее активности и первичного сократительного ответа. На второй, тонической стадии сокращения [Са2+]i снижается и активность КЛЦМ падает. Фосфорилирование миозина в этих условиях осуществляют, по-видимому, неканонические киназы РЛЦ миозина, активность которых не зависит от Са2+ и контролируется внешними сигналами через мембранные рецепторы. Хотя набор рецепторов существенно отличается в разных гладкомышечных клетках, большинство механизмов проведения сигнала включают 5 активацию тримерных G-белков, стимулирующих образование вторичных посредников, а также активацию рецепторных тирозиновых киназ и малых G-белков Ras, Rho и Rac [50,65,69]. Не останавливаясь подробно на анализе рецепторов и первичных этапов проведения сигналов, важно отметить, что все они приводят к активации ограниченного числа ключевых интермедиатов – протеинкиназ, непосредственно передающих сигнал на сократительный аппарат клетки (рис. 1). Основными из них являются Rho-киназа, протеинкиназа С и митоген-активируемые протеинкинкиназы (МАР-киназы), действие которых направлено на повышение уровня фосфорилирования миозина. Относительный вклад этих сигнальных путей в регуляцию рецептор-зависимого сокращения можно оценить с использованием специфических ингибиторов (рис. 2). В артериальных сосудах сокращение, вызываемое селективным агонистом a1адренорецепторов, сопряженных с Gq белками, наиболее чувствительно к действию ингибитора Rho-киназы. Аналогичная картина наблюдается и в случае сокращения, вызываемого агонистом тромбоксановых рецепторов (Тарасова О.С., неопубликованные данные), хотя эти рецепторы сопряжены с Gq и Gi-3/G12/13 белками. В совокупности, эти данные указывают на ключевую роль рецептор-зависимых сигнальных каскадов в обеспечении второй, тонической фазы сокращения гладких мышц. Физиологический механизм расслабления гладких мышц основан на действии оксида азота (NO), образуемого эндотелием, или активации рецепторов, сопряженных с Gs-белками (b2адренорецепторов, рецепторов аденозина, простациклина и др.). Эти воздействия ускоряют синтез циклических нуклеотидов цГМФ и цАМФ (рис. 1), в результате происходит активация циклонуклеотид-зависимых протеинкиназы А (под действием цАМФ) и протеинкиназы G (под действием цГМФ). Действие этих киназ приводит к расслаблению гладкой мышцы несколькими способами. Активация калиевых и инактивация кальциевых каналов приводит к снижению [Са2+]i. Снижение фосфорилирования миозина достигается за счет повышения активности фосфатазы РЛЦ миозина, или же разобщения взаимодействие миозина с актином, независимо от уровня фосфорилирования миозина [46]. Активация рецепторов, сопряженных с Gi-белками (a2адренорецепторов или Y1-рецепторов нейропептида Y), вызывает ингибирование аденилатциклазы, тормозит расслабление и пролонгирует действие просократительных агонистов. Неканонические киназы, обеспечивающие Са2+-независимое фосфорилирование миозина Фосфорилирование миозина играет важную роль и в развитии второй, тонической фазы сокращения. Кроме КЛЦМ, фосфорилирование миозина во время тонического сокращения осуществляют Са2+-независимые киназы. 6 Промежуточные сигнальные протеинкиназы прямо не влияют на активность миозинового мотора. Ни протеинкиназа С, ни МАР-киназы не фосфорилируют Ser19 РЛЦ миозина. Хотя в некоторых условиях протеинкиназа С может слабо фосфорилировать РЛЦ миозина по Ser9, это фосфорилирование не активирует, а скорее ингибирует моторную функцию миозина гладких мышц [64]. В отличие от них, Rho-киназа способна фосфорилировать Ser19 РЛЦ очищенного миозина, в связи с чем ранее предполагалось, что именно она активирует миозин в тонической фазе сокращения гладких мышц [41]. Однако позже было показано, что этого не происходит, по крайней мере, в сосудах [54] и кишечнике [68], и участие Rho-киназы в прямом фосфорилировании РЛЦ миозина гладких мышц в настоящее время считается маловероятным. Таким образом, Rho-киназа, протеинкиназа С и МАР-киназы лишь опосредуют активирующее действие агонистов на фосфорилирование миозина, передавая сигнал к другим белкам, непосредственно выполняющим эту задачу. К настоящему времени идентифицированы как минимум две протеинкиназы, которые могут осуществлять фосфорилирование миозина в фазе тонического сокращения гладких мышц (рис. 3). Это ZIP-киназа, название которой отражает наличие в ней «лейциновой молнии» – характерной белковой последовательности, опосредующей белок-белковые взаимодействия, и интегрин-зависимая киназа (ILK) [15,52]. Есть также данные о том, что в гладкой мышце кишечника таким действием обладает протеинкиназа РАК3, активируемая малым G-белком Rac [72], однако они пока не подтверждены и не продемонстрированы в других тканях. Во многом это обусловлено отсутствием специфических ингибиторов этих протеинкиназ и сложностью применения антисмысловых олигонуклеотидов и метода РНК-интерференции для выключения экспрессии конкретных белков в интактной гладкомышечной ткани. Однако эксперименты с использованием более простых моделей свидетельствуют о роли этих киназ в развитии Са2+независимого сокращения. Так, обработка скинированных (частично лишенных наружной мембраны) гладкомышечных волокон ингибитором фосфатазы РЛЦ миозина в условиях контролируемо низкой [Са2+]i вызывает медленное сокращение, которое не блокируется ингибиторами КЛЦМ и Rho-киназы, но полностью подавляется неселективным ингибитором протеинкиназ стауроспорином [42,61]. Хотя процедура скинирования может приводить к потере клеткой растворимых белков, в том числе и некоторых протеинкиназ, ZIP-киназа и ILK остаются прочно связанными с сократительным аппаратом гладкомышечных клеток [61]. Механизмы сопряжения Са2+-независимых киназ миозина с участниками рецепторзависимых сигнальных каскадов остаются пока неясными, но можно сделать два предположения. Во-первых, Rho-киназа может прямо фосфорилировать и активировать ZIP-киназу как в гомогенате ткани, так и в изолированных клетках [24]. Фосфорилирование протекает по двум остаткам, один из которых обеспечивает активацию ZIP-киназы, а второй определяет ее 7 внутриклеточную локализацию. Если этот механизм будет подтвержден в интактных гладких мышцах, он может разрешить вопрос о пространственной организации сигнальной цепи от связанной с мембраной активной Rho-киназы к сократительному аппарату клетки. Во-вторых, при длительном тоническом сокращении происходит реорганизация структур, обеспечивающих связь сократительного аппарата с мембраной клетки и межклеточные взаимодействия [23], что сопровождается активацией тирозиновых киназ и фосфорилированием белков клеточных контактов, талина и паксиллина, которые связаны с интегриновыми комплексами наружной мембраны. Эти события приводят к активации интегрин-зависимой киназы ILK, которая фосфорилирует РЛЦ миозина и поддерживает миозин в активном состоянии. Есть также данные в пользу последовательной активации МАР-киназ и ILK в гладкомышечных клетках. Так, усиление адгезивных контактов стимулирует МАР-киназы и сокращение миометрия матки [43], и этот процесс связан с активацией интегринов и локальным фосфорилированием РЛЦ миозина [21]. С помощью ингибиторного анализа, измерения активности ILK и сокращения одиночных клеток было продемонстрировано участие МАР-киназ в активации ILK [35]. Таким образом, ZIP-киназа и ILK представляются наиболее вероятными мишенями Rhoкиназы и МАР-киназ при поддержании Са2+-независимого фосфорилирования миозина в ходе тонического сокращения гладких мышц. Однако эти киназы не столь активны как КЛЦМ. При высокой активности Са2+-независимой фосфатазы РЛЦ миозина они не способны полностью обеспечить уровень фосфорилирования миозина, достаточный для поддержания сокращения. Обязательным дополнительным механизмом регуляции общего уровня фосфорилирования миозина на тонической стадии сокращения является ингибирование активности фосфатазы РЛЦ миозина. Регуляция активности фосфатазы РЛЦ миозина Фосфатаза РЛЦ миозина имеет сложный состав и состоит из трех субъединиц: каталитической, общей для фосфатаз 1 типа (РР1с, d-изоформа с массой 38 кДа), регуляторной миозинсвязывающей (MYPT, масса 110 кДа) и малой субъединицы, функция которой менее ясна (М20, 20 кДа) [25]. По-существу, MYPT выполняет каркасную функцию, непосредственно взаимодействуя с РЛЦ миозина и связывая РР1с своим N-концевым, а М20 – С-концевым доменом. Кроме этого, MYPT имеет важное регуляторное значение. Она направляет РР1с к миозину и увеличивает ее активность, а также дополнительно усиливает ее взаимодействие с миозином за счет малой субъединицы М20, которая сама по себе не влияет на фосфатазную активность [26]. Функции MYPT полностью отвечают основному принципу функционирования фосфатаз 1 типа, согласно которому различные регуляторные субъединицы определяют субстратную специфичность общей для них каталитической субъединицы РР1с, а также служат 8 точкой приложения большинства регуляторных воздействий [12,29]. Аналогичным образом действует гликоген-связывающая субъединица фосфатазы гликогенсинтазы, гликогенфосфорилазы и киназы фосфорилазы – трех основных ферментов, регулирующих метаболизм гликогена в печени. Другие регуляторные субъединицы направляют РР1с к эндоплазматическому ретикулуму, плазматической мембране, микротрубочкам или цитоскелету, а р53ВР2 служит для связывания РР1с с опухолевым супрессором р53 и регулирует уровень его фосфорилирования [14]. В гладкомышечных клетках MYPT служит конечной мишенью сигнальных каскадов, направленных на изменение активности фосфатазы миозина [27,30,36]. Важно, что для регуляции активности фосфатазы РЛЦ миозина используются те же сигнальные каскады и эффекторные протеинкиназы, которые фосфорилируют миозин в тонической фазе гладкомышечного сокращения. Такая организация позволяет с помощью незначительных изменений активности этих каскадов эффективно регулировать уровень фосфорилирования РЛЦ миозина в клетке. Rho-киназа, ZIP-киназа и ILK прямо фосфорилируют MYPT и являются основными регуляторами миозиновой фосфатазы [32,49]. Модифицикации подвергаются два треониновых остатка MYPT, Thr696 и Thr853, фосфорилирование которых ингибирует фосфатазу РЛЦ миозина. Этот механизм функционирует практически во всех типах гладких мышц. Предполагается, что фосфорилирование Thr696 связано с прямым ингибированием каталитической активности РР1с, а фосфорилирование Thr853 нарушает взаимодействие компонентов фосфатазного комплекса [27,30]. Кристаллографическое исследование комплекса РР1с и N-концевого домена MYPT проясняет структурную основу высокой субстратной специфичности и принципы регуляции фосфатазы РЛЦ миозина [71]. Активный центр каталитической субъединицы РР1с имеет Yобразную форму, три ветви которой являются углублениями белковой глобулы, сходящимися в точке связывания дефосфорилируемого Ser19. Нижняя борозда содержит гидрофобные остатки и связывает гидрофобный N-конец MYPT и гидрофобную область РЛЦ, расположенную к Сконцу от Ser19, фиксируя эти взаимодействия. Однозначная координация РЛЦ в активном центре достигается взаимодействием отрицательных остатков правого углубления с положительно заряженными остатками РЛЦ, лежащими к N-концу от Ser19. Связывание с MYPT вызывает дополнительную структуризацию и удлинение этой борозды так, что ее форма полностью совпадает с конфигурацией РЛЦ, обеспечивая специфичность связывания комплекса РР1сMYPT с миозином. Белковая последовательность вокруг остатков Thr696 и Thr853, фосфорилируемых Rho-киназой, ZIP-киназой и ILK, имеет сходное с РЛЦ распределение заряженных и гидрофобных остатков [71]. Вероятно, после фосфорилирования эти последовательности MYPT связываются в активном центре и выключают активность 9 фосфатазы путем аутоингибирования. Разрешение полной пространственной структуры фосфатазного комплекса поможет в дальнейшем прояснить вопрос о различии регуляторных механизмов, связанных с фосфорилированием Thr696 или Thr853. Таким образом, прямое фосфорилирование РЛЦ миозина и фосфорилирование MYPT являются финальными этапами двух из трех ключевых сигнальных каскадов, опосредуемых Rho-киназой и МАР-киназами/ILK (см. рис. 1 и 2). Известный к настоящему времени механизм действия протеинкиназы С совершенно иной, но он также основан на ингибировании активности фосфатазы РЛЦ миозина. Он включает фосфорилирование белка CPI-17 по остатку Thr38. В результате этой модификации CPI-17 приобретает способность в 1000 раз сильнее ингибировать РР1с миозиновой фосфатазы [20,37]. По-видимому, при этом используется тот же молекулярный механизм аутоингибирования, как и в случае фосфорилирования остатка Thr696 MYPT. При этом наличие ароматического остатка тирозина в 41-м положении CPI-17 препятствует дефосфорилированию его Thr38 под действием РР1с. Это означает, что длительность ингибирующего действия CPI-17 контролируется в клетках отдельным сигнальным каскадом, приводящим к дефосфорилированию CPI-17 другими фосфатазами, скорее всего типа 2А и 2С [70]. Механизм ингибирования фосфатазы РЛЦ миозина с участием CPI-17 используется не только в каскаде, контролируемом протеинкиназой С. Как Rho-киназа, так и ILK способны фосфорилировать остаток Thr38 в CPI-17 [16,39], обеспечивая переадресацию рецепторзависимых сигнальных каскадов. Таким образом, Rho-киназа и ILK подавляют активность фосфатазы РЛЦ миозина сразу двумя путями – фосфорилируя остатки Thr696 и Thr853 самой фосфатазы и активируя ее фосфо-зависимый ингибитор CPI-17. Есть данные о том, что эти два механизма включаются последовательно и первичная кратковременная активация CPI-17 протеинкиназой С сменяется действием Rho-киназы [17]. В тех гладких мышцах, которые содержат большое количество CPI-17, например, в гладкой мышце крупных артерий [75], фосфорилирование этого белка может быть более значимым для регуляции активности фосфатазы, чем фосфорилирование MYPT [53]. Регуляция активности фосфатаз 1 типа фосфобелками является универсальным механизмом, используемым разными клетками [12,14]. Фосфорилирование ингибитора-1 и белка DARPP-32 цАМФ-зависимой протеинкиназой превращает их в мощные блокаторы РР1с, которые играют важную роль в работе дофаминергических синапсов головного мозга и формировании долговременной памяти [6]. Ингибитор-2 обнаружен во многих тканях и фосфорилируется под действием так называемых ацидотропных киназ (казеинкиназы 1 и 2, киназа гликогенсинтазы-3), однако его функции более сложны и не до конца выяснены. CPI-17 и еще один белок, РН-1, являются представителями регуляторных фосфобелков в гладкой 10 мускулатуре, тогда как в сердечной мышце присутствует РН-2 [19]. Экспрессия CPI-17 высока в тех гладких мышцах, которые проявляют ярко выраженную тоническую фазу и высокую Са2+чувствительность агонист-зависимого сокращения [37,75]. Напротив, уровень экспрессии РН-1 более ровный и этот белок, по-видимому, функционально заменяет CPI-17 в фазных мышцах, где последнего мало [75]. Основной механизм активации фосфатазы миозина связан с повышением уровня цАМФ или цГМФ и активацией соответствующих протеинкиназ А и G [13,60]. Прямое фосфорилирование фосфатазы РЛЦ миозина этими протеинкиназами не изменяет ее активности [51]. Однако они фосфорилируют фосфолипазу С, снижая образование инозитолтрисфосфата (IP3), а также рецептор IP3 на эндоплазматическом ретикулуме, ингибируя выход Са2+ в цитоплазму [13]. Кроме того, протеинкиназы А и G фосфорилируют ионные каналы наружной мембраны, что также приводит к снижению [Са2+]i. Однако основной механизм расслабления тонически сокращенных гладких мышц под действием протеинкиназ А и G заключается в ингибировании компонентов Са2+-независимых каскадов. К настоящему времени определены четыре участка действия циклонуклеотид-зависимых протеинкиназ на сигнальные каскады, регулирующие активность фосфатазы миозина (рис. 1). На начальном этапе протеинкиназа А фосфорилирует Ga12/13 субъединицу G-белка, ингибирует его диссоциацию и активацию белка Rho [45]. На конечном этапе протеинкиназа G физически взаимодействует с MYPT, препятствуя ее фосфорилированию и ингибированию фосфатазы под действием Rho-киназы и других эффекторных протеинкиназ [66]. Однако эти механизмы не универсальны и ограничены участием рецепторов определенного типа или наличием в структуре MYPT особой белковой последовательности (лейциновой молнии), которая отвечает за взаимодействие с протеинкиназой G и отсутствует у ряда изоформ MYPT [33]. Например, в гладкой мышце артерий экспрессируются MYPT с лейциновой последовательностью, а в венах – без нее [55]. Два других механизма более общие и включают регуляцию протеинкиназами А и/или G промежуточных звеньев сигнальных каскадов. Это фосфорилирование остатка Ser188 Rho белка, приводящее к его инактивации [58,59], или остатка Ser695 MYPT, которое запрещает модификацию соседнего Thr696 Rho-киназой [51,76]. В обоих случаях прерывается передача сигнала от мембранных рецепторов к фосфатазе и уровень фосфорилирования РЛЦ миозина снижается. Это приводит к уменьшению силы тонического сокращения гладких мышц. Единственный предполагаемый механизм прямой активации фосфатазы РЛЦ миозина связывают с фосфорилированием белка KRP/телокина. Ген этого белка входит в состав гена киназы легких цепей миозина КЛЦМ и имеет ту же рамку считывания [10], что и отражено в двух его названиях – KRP (Kinase Related Protein) и телокин (telos of the kinase, т.е. «хвост» 11 киназы). KRP экспрессируется независимо благодаря наличию собственного промотора в одном из интронов гена КЛЦМ [73]. Он вызывает расслабление скинированных гладкомышечных волокон, которое становится более выраженным в присутствии протеинкиназы G [74,77]. Показано, что протеинкиназы А и G фосфорилируют остаток Ser13 KRP/телокина при расслаблении интактных гладких мышц [3,40], а искусственная замена Ser13 на аланин отменяет фосфорилирование KRP/телокина и усиливающий эффект протеинкиназы G на расслабление скинированных гладких мышц [74]. Однако, несмотря на кажущуюся изящность, прямые доказательства функционирования этого механизма in vivo пока отсутствуют. Эксперименты, в которых сравнивали способность KRP/телокина и его фосфорилированного по Ser13 варианта расслаблять скинированные гладкомышечные волокна, не выявили различий [44,61]. Более того, пока не показано ни влияния KRP/телокина на активность фосфатазы РЛЦ миозина, ни прямого взаимодействия этих белков [F. Brozovich, личное сообщение]. В отсутствие положительных ответов на эти вопросы, роль KRP/телокина в активации фосфатазы миозина под действием циклонуклеотид-зависимых протеинкиназ остается пока спорной. Таким образом, представляется наиболее вероятным, что роль циклических нуклеотидов и активируемых ими протеинкиназ в подавлении тонического сокращения реализуется путем нейтрализации передачи сигнала от рецепторов к сократительному аппарату клетки на уровне фосфорилирования MYPT и/или Rho белка. Регуляция доступности РЛЦ миозина для киназ и фосфатазы Результаты последних исследований указывают на наличие еще одного механизма регуляции фосфорилирования миозина, связанного с изменением доступности Ser19 РЛЦ миозина для модифицирующих его ферментов. Основными известными пока регуляторами являются KRP/телокин, который препятствует фосфорилированию РЛЦ миозина, и белок M-RIP (Myosin phosphatase-Rho Interacting Protein), который связывает фосфатазу РЛЦ миозина с сократительным аппаратом и способствует дефосфорилированию миозина. Первые же функциональные эксперименты показали, что KRP представляет собой миозин-связывающий домен КЛЦМ и конкурирует с ней за связывание с миозином, замедляя фосфорилирование РЛЦ миозина in vitro [62,63]. Была выдвинута гипотеза о том, что в гладких мышцах KRP действует как специфический антагонист КЛЦМ и снижает общий уровень фосфорилирования РЛЦ миозина, тормозит развитие сокращения и способствует расслаблению [73]. Однако выяснилось, что KRP/телокин лишь незначительно ингибирует развитие первой стадии Са2+-зависимого сокращения под действием высокоактивной КЛЦМ [77], но подавляет Са2+-независимое фосфорилирование миозина и тоническое сокращение скинированных волокон (рис. 3). Вместе с тем, связывание с миозином действительно необходимо для проявления 12 эффектов KRP, поскольку KRP, лишенный С-концевой миозин-связывающей последовательности не способен ингибировать сокращение (рис. 3). По-видимому, молекулярный механизм действия KRP/телокина связан с экранированием фосфорилируемого Ser19 на РЛЦ миозина не только под действием КЛЦМ, но и других киназ [61]. Чтобы считать этот механизм физиологически значимым, необходимо еще подтвердить его с использованием животных, нокаутированных по KRP/телокину. Такие животные были недавно получены, они имеют повышенный уровень фосфорилирования РЛЦ миозина, нарушения расслабления гладких мышц и общий сократительный фенотип, согласующийся с предполагаемой функцией KRP/телокина [34]. Дальнейшие эксперименты прояснят молекулярные детали этого механизма. M-RIP функционирует как каркасный белок и важный регулятор миозиновой фосфатазы. Он одновременно взаимодействует с MYPT, белком Rho, Rho-киназой, миозином и, возможно, актином, обеспечивая совместную локализацию этих белков в сократительном аппарате клетки [38, 67]. Молекулярный механизм действия M-RIP пока недостаточно понятен, но ясно, что он не влияет на каталитическую активность PP1c, а улучшает дефосфорилирование миозина, повышая доступность РЛЦ для фосфатазного комплекса. Подавление экспрессии M-RIP в культивируемых гладкомышечных клетках ведет к нарушению Rho-зависимой передачи сигнала к фосфатазе миозина, снижению ее активности и повышению уровня фосфорилирования миозина [38,57]. Весьма возможно, что KRP/телокин и M-RIP являются не единственными регуляторами, контролирующими доступность РЛЦ миозина для модифицирующих ферментов. Несмотря на скудность информации о малой субъединице фосфатазного комплекса М20, ее также можно рассматривать как потенциального представителя этой группы белков. Считается, что М20 играет роль в закреплении MYPT на миозине, что должно повышать доступность РЛЦ для каталитической субъединицы фосфатазы PP1c [30]. Интересно, что N-концевые последовательности М20, KRP/телокина и белка CPI-17 имеют определенную гомологию и сходное расположение фосфорилируемых регуляторных остатков. Более того, высказано предположение о том, что гены М20 и MYPT имеют тот же принцип организации, что и в случае KRP/телокина и КЛЦМ, т.е. ген М20 расположен внутри гена MYPT, но эти белки экспрессируются назависимо [30]. Дальнейшие исследования должны выявить функциональную значимость такого структурного сходства. Вопрос о регуляции взаимодействия KRP и M-RIP с миозином в настоящее время остается открытым. Фосфорилирование N-концевых остатков KRP/телокина не влияет на его связывание с миозином, которое опосредует С-концевой домен KRP [65]. Ничего пока не известно и о том, как регулируется связывание M-RIP или М20. Вполне возможно, что регуляторный вклад каждого из этих белков определяется уровнем его экспрессии. Так, 13 содержание KRP/телокина максимально в фазных гладких мышцах и очень низкое в тонических, способных поддерживать сокращенное состояние при низких значениях [Са2+]i и общего уровня фосфорилирования РЛЦ миозина [40]. Есть основания считать, что это совпадение не случайно и физиологические отличия этих мышц, по крайней мере отчасти, связаны с разным содержанием KRP/телокина. Уровень экспрессии М20 также существенно различается в разных тканях [30], но для M-RIP такие данные пока отсутствуют. Заключение Ближайшие перспективы лекарственной терапии при патологиях, связанных с нарушениями сократимости гладких мышц, связаны с разработкой фармакологических препаратов нового поколения, действие которых направлено на внутриклеточные мишени. Считается, что преимущество такого подхода по сравнению с ранее и сейчас используемыми блокаторам ионных каналов и антагонистами мембранных рецепторов состоит в избирательности воздействия и минимизации побочных влияний на гомеостаз клетки и сопряженные рецепторактивируемые процессы. Многочисленные данные, полученные на клеточных моделях и в экспериментах на животных, а также результаты первых клинических испытаний показывают, что Rho/Rho-киназный каскад играет критическую роль в нарушениях тонического сокращения гладких мышц. Rho-киназа рассматривается в настоящее время как наиболее перспективная мишень для фармакологической терапии гиперсократимости гладких мышц. Этому способствует тот факт, что существуют по крайней мере два высокоселективных ингибитора Rho-киназы, Y-27632 и фасудил, причем последний уже применяется в клинической практике. В некоторых тканях не менее важную роль могут играть каскады с участием ZIP-киназы и ILK, однако их организация в клетке и индивидуальный вклад в регуляцию сократимости пока не совсем ясны. Отсутствие селективных ингибиторов этих киназ существенно тормозит такие исследования. Возможно использование ингибиторов тех компонентов рецептор-зависмых каскадов, которые функционируют в начале сигнальной цепочки, но оно может быть связано с риском побочных эффектов. Так, специфические ингибиторы МАР-киназ существуют давно, но до сих пор не используются в качестве лекарственных препаратов. Аналогичная ситуация складывается с ингибиторами протеинкиназы С и белка Rho. Их применение может быть связано с нарушением широкого спектра внутриклеточных регуляторных процессов. 14 Благодарности Авторы благодарны коллегам и сотрудникам, предоставившим свои результаты и принявшим участие в обсуждении: С.В. Мочалову, В.У. Каленчуку, Д.К. Гайнуллиной, Н.В. Тарасовой, В.А. Пуздровой, Д.В. Серебряной и А.Ю. Хапчаеву. Работы выполнены при финансовой поддержке РФФИ (гранты 07-04-01527 и 08-04-01721). 15 Список литературы [1] Воротников А.В., Крымский М.А., Ширинский В.П. Внутриклеточная сигнализация и фосфорилирование белков при сокращении гладких мышц. Биохимия 67: 1587-1610. 2002. [2] Воротников A.В., Крымский М.А., Хапчаев А.Ю., Серебряная Д.В. Сигнальные механизмы регуляции сократительной активности гладких мышц. Рос. физиол. журнал им. И.М. Сеченова 90: 705-518. 2004. [3] Хапчаев A.Ю., Крымский M.A., Сидорова M.В., Беспалова Ж.Д., Ванг Ч.-Л.A., Ширинский В.П., Воротников A.В. Новые фосфоспецифические антитела для анализа фосфорилирования белковых продуктов генетического локуса киназы легких цепей миозина. Биохимия 69: 968-980. 2004 [4] Хапчаев A.Ю., Ширинский В.П., Воротников A.В. Структура, функции и регуляция белковых продуктов генетического локуса киназы легких цепей миозина. Успехи Биол. Химии 43: 365-420. 2003. [5] Albrecht K., Schneider A., Liebetrau C., Ruegg J.C. , Pfitzer G. Exogenous caldesmon promotes relaxation of guinea-pig skinned taenia coli smooth muscles: inhibition of cooperative reattachment of latch bridges? Pflugers Arch 434: 534-42. 1997. [6] Allen P.B., Hvalby O., Jensen V., Errington M.L., Ramsay M., Chaudhry F.A., Bliss T.V., Storm-Mathisen J., Morris R.G., Andersen P. , Greengard P. Protein phosphatase-1 regulation in the induction of long-term potentiation: heterogeneous molecular mechanisms. J Neurosci 20: 3537-43. 2000. [7] Andersson K.E. , Arner A. Urinary bladder contraction and relaxation: physiology and pathophysiology. Physiol Rev 84: 935-86. 2004. [8] Bentley J.K. , Hershenson M.B. Airway smooth muscle growth in asthma: proliferation, hypertrophy, and migration. Proc Am Thorac Soc 5: 89-96. 2008. [9] Berridge M.J. Smooth muscle cell calcium activation mechanisms. J Physiol 586: 5047-61. 2008. [10] Birukov K.G., Schavocky J.P., Shirinsky V.P., Chibalina M.V., Van Eldik L.J. , Watterson D.M. Organization of the genetic locus for chicken myosin light chain kinase is complex: multiple proteins are encoded and exhibit differential expression and localization. J Cell Biochem 70: 402-13. 1998. [11] Block S.M. Fifty ways to love your lever: myosin motors. Cell 87: 151-7. 1996. [12] Bollen M. , Stalmans W. The structure, role, and regulation of type 1 protein phosphatases. Crit Rev Biochem Mol Biol 27: 227-81. 1992. 16 [13] Carvajal J.A., Germain A.M., Huidobro-Toro J.P. , Weiner C.P. Molecular mechanism of cGMPmediated smooth muscle relaxation. J Cell Physiol 184: 409-20. 2000. [14] Cohen P.T. Protein phosphatase 1--targeted in many directions. J Cell Sci 115: 241-56. 2002. [15] Deng J.T., Van Lierop J.E., Sutherland C. , Walsh M.P. Ca2+-independent smooth muscle contraction. a novel function for integrin-linked kinase. J Biol Chem 276: 16365-73. 2001. [16] Deng J.T., Sutherland C., Brautigan D.L., Eto M. , Walsh M.P. Phosphorylation of the myosin phosphatase inhibitors, CPI-17 and PHI-1, by integrin-linked kinase. Biochem J 367: 517-24. 2002. [17] Dimopoulos G.J., Semba S., Kitazawa K., Eto M. , Kitazawa T. Ca2+-dependent rapid Ca2+ sensitization of contraction in arterial smooth muscle. Circ Res 100: 121-9. 2007. [18] Earley J.J., Su X. , Moreland R.S. Caldesmon inhibits active crossbridges in unstimulated vascular smooth muscle: an antisense oligodeoxynucleotide approach. Circ Res 83: 661-7. 1998. [19] Eto M., Karginov A., Brautigan D.L. A novel phosphoprotein inhibitor of protein type-1 phosphatase holoenzymes. Biochemistry 38: 16952-7. 1999. [20] Eto M., Kitazawa T. , Brautigan D.L. Phosphoprotein inhibitor CPI-17 specificity depends on allosteric regulation of protein phosphatase-1 by regulatory subunits. Proc Natl Acad Sci U S A 2004. [21] Fincham V.J., James M., Frame M.C. , Winder S.J. Active ERK/MAP kinase is targeted to newly forming cell-matrix adhesions by integrin engagement and v-Src. Embo J 19: 2911-23. 2000. [22] Geeves M.A. , Holmes K.C. The molecular mechanism of muscle contraction. Adv Protein Chem 71: 161-93. 2005. [23] Gunst S.J. , Zhang W. Actin cytoskeletal dynamics in smooth muscle: a new paradigm for the regulation of smooth muscle contraction. Am J Physiol Cell Physiol 295: C576-87. 2008. [24] Hagerty L., Weitzel D.H., Chambers J., Fortner C.N., Brush M.H., Loiselle D., Hosoya H. , Haystead T.A. ROCK1 phosphorylates and activates zipper-interacting protein kinase. J Biol Chem 282: 4884-93. 2007. [25] Hartshorne D.J., Ito M. , Erdodi F. Role of protein phosphatase type 1 in contractile functions: myosin phosphatase. J Biol Chem 279: 37211-4. 2004. [26] Hirano K., Phan B.C. , Hartshorne D.J. Interactions of the subunits of smooth muscle myosin phosphatase. J Biol Chem 272: 3683-8. 1997. [27] Hirano K. Current topics in the regulatory mechanism underlying the Ca2+ sensitization of the contractile apparatus in vascular smooth muscle. J Pharmacol Sci 104: 109-15. 2007. [28] Horowitz A., Menice C.B., Laporte R. , Morgan K.G. Mechanisms of smooth muscle 17 contraction. Physiol Rev 76: 967-1003. 1996. [29] Hubbard M.J. , Cohen P. On target with a new mechanism for the regulation of protein phosphorylation. Trends Biochem Sci 18: 172-7. 1993. [30] Ito M., Nakano T., Erdodi F. , Hartshorne D.J. Myosin phosphatase: structure, regulation and function. Mol Cell Biochem 259: 197-209. 2004. [31] Kamm K.E. , Stull J.T. Dedicated myosin light chain kinases with diverse cellular functions. J Biol Chem 276: 4527-30. 2001. [32] Kawano Y., Fukata Y., Oshiro N., Amano M., Nakamura T., Ito M., Matsumura F., Inagaki M. , Kaibuchi K. Phosphorylation of myosin-binding subunit (MBS) of myosin phosphatase by Rhokinase in vivo. J Cell Biol 147: 1023-38. 1999. [33] Khatri J.J., Joyce K.M., Brozovich F.V. , Fisher S.A. Role of myosin phosphatase isoforms in cGMP-mediated smooth muscle relaxation. J Biol Chem 276: 37250-7. 2001. [34] Khromov A.S., Wang H., Choudhury N., McDuffie M., Herring B.P., Nakamoto R., Owens G.K., Somlyo A.P. , Somlyo A.V. Smooth muscle of telokin-deficient mice exhibits increased sensitivity to Ca2+ and decreased cGMP-induced relaxation. Proc Natl Acad Sci U S A 103: 2440-5. 2006. [35] Kim N., Cao W., Song I.S., Kim C.Y., Harnett K.M., Cheng L., Walsh M.P. , Biancani P. Distinct kinases are involved in contraction of cat esophageal and lower esophageal sphincter smooth muscles. Am J Physiol Cell Physiol 287: C384-94. 2004. [36] Kim H.R., Appel S., Vetterkind S., Gangopadhyay S.S. , Morgan K.G. Smooth muscle signalling pathways in health and disease. J Cell Mol Med 12: 2165-80. 2008. [37] Kitazawa T., Eto M., Woodsome T.P. , Khalequzzaman M. Phosphorylation of the myosin phosphatase targeting subunit and CPI-17 during Ca2+ sensitization in rabbit smooth muscle. J Physiol 546: 879-89. 2003. [38] Koga Y. , Ikebe M. p116Rip decreases myosin II phosphorylation by activating myosin light chain phosphatase and by inactivating RhoA. J Biol Chem 280: 4983-91. 2005. [39] Koyama M., Ito M., Feng J., Seko T., Shiraki K., Takase K., Hartshorne D.J. , Nakano T. Phosphorylation of CPI-17, an inhibitory phosphoprotein of smooth muscle myosin phosphatase, by Rho-kinase. FEBS Lett 475: 197-200. 2000. [40] Krymsky M.A., Kudryashov D.S., Shirinsky V.P., Lukas T.J., Watterson D.M. , Vorotnikov A.V. Phosphorylation of kinase-related protein (telokin) in tonic and phasic smooth muscles. J Muscle Res Cell Motil 22: 425-37. 2001. [41] Kureishi Y., Kobayashi S., Amano M., Kimura K., Kanaide H., Nakano T., Kaibuchi K. , Ito M. 18 Rho-associated kinase directly induces smooth muscle contraction through myosin light chain phosphorylation. J Biol Chem 272: 12257-60. 1997. [42] Kureishi Y., Ito M., Feng J., Okinaka T., Isaka N. , Nakano T. Regulation of Ca2+-independent smooth muscle contraction by alternative staurosporine-sensitive kinase. Eur J Pharmacol 376: 315-20. 1999. [43] Li Y., Gallant C., Malek S. , Morgan K.G. Focal adhesion signaling is required for myometrial ERK activation and contractile phenotype switch before labor. J Cell Biochem 100: 129-40. 2007. [44] MacDonald J.A., Walker L.A., Nakamoto R.K., Gorenne I., Somlyo A.V., Somlyo A.P. , Haystead T.A. Phosphorylation of telokin by cyclic nucleotide kinases and the identification of in vivo phosphorylation sites in smooth muscle. FEBS Lett 479: 83-8. 2000. [45] Manganello J.M., Huang J.S., Kozasa T., Voyno-Yasenetskaya T.A. , Le Breton G.C. Protein kinase A-mediated phosphorylation of the Galpha13 switch I region alters the Galphabetagamma13-G protein-coupled receptor complex and inhibits Rho activation. J Biol Chem 278: 124-30. 2003. [46] McDaniel N.L., Chen X.L., Singer H.A., Murphy R.A. , Rembold C.M. Nitrovasodilators relax arterial smooth muscle by decreasing [Ca2+]i and uncoupling stress from myosin phosphorylation. Am J Physiol 263: C461-7. 1992. [47] McVary K. Lower urinary tract symptoms and sexual dysfunction: epidemiology and pathophysiology. BJU Int 97 Suppl 2: 23-8; discussion 44-5. 2006. [48] Morano I. Tuning smooth muscle contraction by molecular motors. J Mol Med 81: 481-7. 2003. [49] Muranyi A., MacDonald J.A., Deng J.T., Wilson D.P., Haystead T.A., Walsh M.P., Erdodi F., Kiss E., Wu Y. , Hartshorne D.J. Phosphorylation of the myosin phosphatase target subunit by integrin-linked kinase. Biochem J 366: 211-6. 2002. [50] Murthy K.S. Signaling for contraction and relaxation in smooth muscle of the gut. Annu Rev Physiol 68: 345-74. 2006. [51] Nakamura K., Koga Y., Sakai H., Homma K. , Ikebe M. cGMP-dependent relaxation of smooth muscle is coupled with the change in the phosphorylation of myosin phosphatase. Circ Res 101: 712-22. 2007. [52] Niiro N. , Ikebe M. Zipper-interacting protein kinase induces Ca(2+)-free smooth muscle contraction via myosin light chain phosphorylation. J Biol Chem 276: 29567-74. 2001. [53] Niiro N., Koga Y. , Ikebe M. Agonist-induced changes in the phosphorylation of the myosinbinding subunit of myosin light chain phosphatase and CPI17, two regulatory factors of myosin 19 light chain phosphatase, in smooth muscle. Biochem J 369: 117-28. 2003. [54] Noda M., Yasuda-Fukazawa C., Moriishi K., Kato T., Okuda T., Kurokawa K. , Takuwa Y. Involvement of rho in GTP gamma S-induced enhancement of phosphorylation of 20 kDa myosin light chain in vascular smooth muscle cells: inhibition of phosphatase activity. FEBS Lett 367: 246-50. 1995. [55] Payne M.C., Zhang H.Y., Prosdocimo T., Joyce K.M., Koga Y., Ikebe M. , Fisher S.A. Myosin phosphatase isoform switching in vascular smooth muscle development. J Mol Cell Cardiol 40: 274-82. 2006. [56] Rasmussen H., Takuwa Y. , Park S. Protein kinase C in the regulation of smooth muscle contraction. Faseb J 1: 177-85. 1987. [57] Riddick N., Ohtani K. , Surks H.K. Targeting by myosin phosphatase-RhoA interacting protein mediates RhoA/ROCK regulation of myosin phosphatase. J Cell Biochem 103: 1158-70. 2008. [58] Sauzeau V., Le Jeune H., Cario-Toumaniantz C., Smolenski A., Lohmann S.M., Bertoglio J., Chardin P., Pacaud P. , Loirand G. Cyclic GMP-dependent protein kinase signaling pathway inhibits RhoA-induced Ca2+ sensitization of contraction in vascular smooth muscle. J Biol Chem 275: 21722-9. 2000. [59] Sawada N., Itoh H., Yamashita J., Doi K., Inoue M., Masatsugu K., Fukunaga Y., Sakaguchi S., Sone M., Yamahara K., Yurugi T. , Nakao K. cGMP-dependent protein kinase phosphorylates and inactivates RhoA. Biochem Biophys Res Commun 280: 798-805. 2001. [60] Schlossmann J., Feil R. , Hofmann F. Insights into cGMP signalling derived from cGMP kinase knockout mice. Front Biosci 10: 1279-89. 2005. [61] Shcherbakova O., Serebryanaya D., Postnikov F., Zittrich S., Shirinsky V., Vorotnikov A. , Pfitzer G. Kinase Related Protein / telokin inhibits microcystin-induced Ca2+-independent contraction in triton skinned guinea pig taenia coli. Biochem J in press: 2009. [62] Shirinsky V.P., Vorotnikov A.V., Birukov K.G., Nanaev A.K., Collinge M., Lukas T.J., Sellers J.R. , Watterson D.M. A kinase-related protein stabilizes unphosphorylated smooth muscle myosin minifilaments in the presence of ATP. J Biol Chem 268: 16578-83. 1993. [63] Silver D.L., Vorotnikov A.V., Watterson D.M., Shirinsky V.P. , Sellers J.R. Sites of interaction between kinase-related protein and smooth muscle myosin. J Biol Chem 272: 25353-9. 1997. [64] Singer H.A. Protein kinase C activation and myosin light chain phosphorylation in 32P-labeled arterial smooth muscle. Am J Physiol 259: C631-9. 1990. [65] Somlyo A.P. , Somlyo A.V. Signal transduction and regulation in smooth muscle. Nature 372: 231-6. 1994. 20 [66] Surks H.K., Mochizuki N., Kasai Y., Georgescu S.P., Tang K.M., Ito M., Lincoln T.M. , Mendelsohn M.E. Regulation of myosin phosphatase by a specific interaction with cGMPdependent protein kinase Ialpha. Science 286: 1583-7. 1999. [67] Surks H.K., Riddick N. , Ohtani K.I. M-RIP targets myosin phosphatase to stress fibers to regulate myosin light chain phosphorylation in vascular smooth muscle cells. J Biol Chem 28: 28. 2005. [68] Sward K., Dreja K., Susnjar M., Hellstrand P., Hartshorne D.J. , Walsh M.P. Inhibition of Rhoassociated kinase blocks agonist-induced Ca2+ sensitization of myosin phosphorylation and force in guinea-pig ileum. J Physiol 522 Pt 1: 33-49. 2000. [69] Tabrizchi R. , Bedi S. Pharmacology of adenosine receptors in the vasculature. Pharmacol Ther 91: 133-47. 2001. [70] Takizawa N., Niiro N. , Ikebe M. Dephosphorylation of the two regulatory components of myosin phosphatase, MBS and CPI17. FEBS Lett 515: 127-32. 2002. [71] Terrak M., Kerff F., Langsetmo K., Tao T. , Dominguez R. Structural basis of protein phosphatase 1 regulation. Nature 429: 780-4. 2004. [72] Van Eyk J.E., Arrell D.K., Foster D.B., Strauss J.D., Heinonen T.Y., Furmaniak-Kazmierczak E., Cote G.P. , Mak A.S. Different molecular mechanisms for Rho family GTPase-dependent, Ca2+independent contraction of smooth muscle. J Biol Chem 273: 23433-9. 1998. [73] Vorotnikov A.V. Kinase-related protein: a smooth muscle myosin-binding protein. Int J Biochem Cell Biol 29: 727-30. 1997. [74] Walker L.A., MacDonald J.A., Liu X., Nakamoto R.K., Haystead T.A., Somlyo A.V. , Somlyo A.P. Site-specific phosphorylation and point mutations of telokin modulate its Ca2+desensitizing effect in smooth muscle. J Biol Chem 276: 24519-24. 2001. [75] Woodsome T.P., Eto M., Everett A., Brautigan D.L. , Kitazawa T. Expression of CPI-17 and myosin phosphatase correlates with Ca2+-sensitivity of protein kinase C-induced contraction in rabbit smooth muscle. J Physiol 535: 553-64. 2001. [76] Wooldridge A.A., MacDonald J.A., Erdodi F., Ma C., Borman M.A., Hartshorne D.J. , Haystead T.A. Smooth muscle phosphatase is regulated in vivo by exclusion of phosphorylation of threonine 696 of MYPT1 by phosphorylation of Serine 695 in response to cyclic nucleotides. J Biol Chem 279: 34496-504. 2004. [77] Wu X., Haystead T.A., Nakamoto R.K., Somlyo A.V. , Somlyo A.P. Acceleration of myosin light chain dephosphorylation and relaxation of smooth muscle by telokin. Synergism with cyclic nucleotide-activated kinase. J Biol Chem 273: 11362-9. 1998. 21 Рис. 1. Основные сигнальные каскады, участвующие в регуляции сокращения гладких мышц. Первая фаза рецептор-зависимого сокращения инициируется за счет быстрой активации Са2+-каналов и повышения [Ca2+]i (слева). Связывание Са2+ с кальмодулином (СаМ) ведет к активации киназы легких цепей миозина (КЛЦМ), которая фосфорилирует регуляторные легкие цепи (РЛЦ) миозина. На второй, тонической фазе сокращения [Ca2+]i уменьшается и активность КЛЦМ падает, но сокращение поддерживается за счет активации Rho-киназы (RhoK), протеинкиназы С (РКС) и МАР-киназ (МАРК) под действием рецепторов (R1), сопряженных с G-белками. Фосфорилирование миозина на этой стадии также осуществляют Са2+-независимые ZIP-киназа (ZIPK) и интегрин-связанная киназа (ILK). Доступность фосфорилируемого в РЛЦ миозина остатка регулируется белком KRP/телокином. Механизмы ингибирования фосфатазы РЛЦ миозина основаны на фосфорилировании ее регуляторной субъединицы MYPT и белка CPI-17. В правой части схемы представлены механизмы, приводящие к расслаблению. Протеинкиназы А/G фосфорилируют G-белок и Rho, подавляя Rhо-киназный каскад, а также регуляторную субъединицу MYPT фосфатазы РЛЦ миозина, препятствуя ее инактивации под действием Rho-киназы, ZIP-киназы и ILK. Сплошными и пунктирными линиями показаны стимулирующие и ингибирующие воздействия, соответственно. 22 Рис. 2. Сравнительный вклад протеинкиназы С, МАР-киназ и Rho-киназы в рецепторзависимое сокращение гладких мышц. Представлены зависимости силы сокращения препаратов подкожной артерии крысы от концентрации специфического агониста a1адренорецепторов, метоксамина, в отсутствие (сплошные линии) и присутствии (пунктирные линии) специфических ингибиторов ключевых протеинкиназ: А – протеинкиназы С (GF109203X, 1 мкМ), Б – р38 МАР-киназы (SB202190, 10 мкМ), В – Rho-киназы (Y27632, 10 мкМ). 23 Рис. 3. KRP/телокин ингибирует Ca2+-независимое фосфорилирование миозина и сокращение гладких мышц. Представлены типичные кривые развития силы сокращения скинированных тритоном Х-100 препаратов гладкомышечных волокон taenia coli морской свинки. Концентрации Ca2+ указаны внизу. Са2+-зависимое сокращение при максимальном значении Ca2+ (10-4,5 М) происходит за счет Са2+/кальмодулин-зависимой КЛЦМ. При очень низкой концентрации Са2+ (10-8 М) КЛЦМ неактивна и сокращение развивается только в ответ на добавление 10 мкМ микроцистина как отмечено стрелкой. Микроцистин ингибирует фосфатазу РЛЦ миозина и позволяет проявиться медленному действию Са2+-независимых ZIPкиназы и ILK, остающихся в скинированных волокнах [61]. KRP/телокин отсутствует в контрольных волокнах, поскольку вымывается при скинировании, и сокращение контрольных волокон начинает развиваться через 2-3 минуты и достигает максимума через 20 минут. Обратное введение KRP (20 мкМ) замедляет развитие сокращения и увеличивает время, необходимое для развития полумаксимального ответа, с 8,4 ± 0,9 мин (n=7) до 35,1 ± 2,5 мин (n=7), а также снижает максимальную силу сокращения с 91,1 % до 56,4 % (n=7) от максимальной к 40-й минуте. Такого ингибирования не происходит при введении мутантного DCKRP, у которого удалены 19 С-концевых аминокислотных остатков, отвечающих за связывание KRP с миозином. На 25 минуте сокращения уровень фосфорилирования РЛЦ миозина был достоверно ниже в волокнах, инкубированных с KRP, по сравнению с контрольными (33 ± 4.4 % по сравнению с 47 ± 3.0 % в контроле, n=7, р<0,05) [61]. Таким образом, KRP ингибирует фосфорилирование РЛЦ миозина и развитие сокращения за счет прямого связывания с миозином. 24
