СОЗДАНИЕ ШТАММА-ПРОДУЦЕНТА D

Министерство образования и науки Российской Федерации
МОСКОВСКИЙ ФИЗИКО-ТЕХНИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ
(государственный университет)
ФАКУЛЬТЕТ ОБЩЕЙ И ПРИКЛАДНОЙ ФИЗИКИ
КАФЕДРА ФИЗИКИ И ТЕХНОЛОГИИ НАНОСТРУКТУР
СОЗДАНИЕ ШТАММА-ПРОДУЦЕНТА D-ЛАКТАТА НА ОСНОВЕ
Corynebacterium glutamicum
Гапченко Александр Анатольевич
Выпускная квалификационная работа
на соискание степени бакалавра
научный руководитель
с.н.с., д.б.н.
Манухов И.В.
Работа выполнена в ГосНИИгенетика,
г. Москва,
2014
Оглавление
1. Введение...................................................................................................................3
2. Литературный обзор................................................................................................5
2.1. Молочная кислота.............................................................................................5
2.1.1. Области применения молочной кислоты................................................5
2.1.2. Полимеры на основе молочной кислоты..............................................6
2.1.3. Оптическая чистота лактата.................................................................7
2.1.4 Химический синтез молочной кислоты...................................................7
2.2. Биосинтез молочной кислоты..........................................................................8
2.2.1. Метаболизм C. glutamicum в условиях кислородного голодания..........9
2.2.2. Лактатдегидрогеназа...............................................................................10
2.2.3. Биосинтез органических кислот при помощи C. glutamicum..............10
2.2.4 Биосинтез D-лактата.................................................................................11
3. Материалы и методы.............................................................................................13
4. Результаты..............................................................................................................21
4.1 Ферментация нетрансформированного штамма C.glutamicum...............21
4.2 Трансформация C.glutamicum…………………………………….............24
5. Выводы............................................................................................................25
6. Список литературы................................................................................................26
1. Введение
Органические кислоты широко используются в качестве сырья в
пищевой, химической, сельскохозяйственной и фармацевтической
промышленностях (John et al., 2007). В последнее время активно исследуются
сложные эфиры из молочной и янтарной кислот, этиллактат и диэтилсукцинат
как безопасные для окружающей среды растворители (Zwicker et al., 1997).
Кроме того, полимеры из лактата (полимолочная кислота) и сукцината можно
использовать в качестве альтернативы нефтепродуктам в продукции
биоразлагаемого пластика (Flieger et al., 2003). Многие анаэробные и
факультативно анаэробные микроорганизмы способны синтезировать
молочную, янтарную, лимонную, уксусную, масляную или пропионовую
кислоты в процессе анаэробной ферментации (Gottschalk, 1985).
Существуют два оптических изомера молочной кислоты: D-лактат и Lлактат, и свойства полимолочной кислоты сильно зависят от соотношения
числа изомеров (Sawai et al., 2007). В ходе химического синтеза лактата
получается рацемическая DL-молочная кислота, поэтому интерес представляет
биосинтез оптически чистой молочной кислоты в обеих её оптических формах
(Wee et al., 2006). Оптическая чистота молочной кислоты критична для
физических свойств полилактата и, в отличие от рацемата, может быть
полимеризована до высококристаллической полимолочной кислоты, пригодной
для коммерческого использования (Södergärd et al., 2002). Штаммы дикого типа
Corynebacterium glutamicum, успешно используются для получения оптически
чистого L-лактата в анаэробных условиях, однако при этом синтезируются в
больших количествах и такие побочные продукты, как сукцинат и ацетат.
(Okino et al., 2005). Известно, что превращение пирувата, одного из
промежуточных метаболитов гликолиза, в лактат управляется ферментом
лактатдегидрогеназой (Inui et al., 2004). Цель настоящей работы заключается в
создании методами генной инженерии штамма C. glutamicum, способного
синтезировать только D-изомер, путём удаления и добавления генов L- и Dлактатдегидрогеназ соответственно, а так же проведение высокоплотностного
культивирования данного штамма.
2. Литературный обзор
2.1. Молочная кислота
Молочная (2-гидроксипропановая) кислота или лактат высокорастворимая, трёхуглеродная хиральная гидроксикарбоновая кислота,
встречающаяся в природе преимущественно в L-форме (Amar et al., 2005).
Впервые обнаружена в простокваше в 1780 году и была ошибочно принята за
компонент молока. В 1857 году Пастер обнаружил, что это вещество на самом
деле является продуктом жизнедеятельности определённых микроорганизмов
(Benninga, 1990). В связи с весьма широкой областью применения лактата на
данный момент исследовано множество способов химического и
биологического синтеза и обработки молочной кислоты и её производных.
2.1.1. Области применения молочной кислоты
Лактат можно использовать в химическом синтезе ряда соединений:
гидрированием из него можно получить пропиленоксид, декарбоксилированием
– ацетальдегид, дегидрированием – акриловую кислоту, восстановлением –
пропановую кислоту, конденсацией – 2,3-пентандион и путём
самоэстерификации – дилактид (Varadarajan et al., 1999).
Лактат имеет множество применений в промышленности, а именно – в
пищевой (подкислители, ароматизаторы, обогащение минеральными
веществами, регуляторы кислотности), в химической (нейтрализаторы,
хиральные интермедианты, средства против окалины, регуляторы кислотности,
растворители, чистящие средства, комплексообразующие агенты), в
косметической промышленности (увлажнители, средства для омолаживания и
осветления кожи, средства против акне и зубных камней), а также в
фармацевтике (диализные растворы, минеральные препараты, растворы для
парентерального питания, протезирование, хирургические нити, системы
контролируемой доставки лекарственных препаратов) (Wee et al., 2006).
Одной из наиболее важных сфер применения лактата является синтез
полимолочной кислоты.
2.1.2. Полимеризация молочной кислоты
Полимолочная кислота (PLA) представляет из себя жёсткий
термопластический полимер, существующий в полукристаллической и
аморфной формах, в зависимости от оптической чистоты полимерной цепи. В
природе в основном встречается L-форма молочной кислоты, однако возможно
синтезировать и D-изомер, как при помощи микроорганизмов, так и через
химический синтез рацемического DL-лактата. Для получения полимолочных
кислот различных свойств, используются включения D-лактата в полимерную
цепь из L-лактата (Amar et al., 2005).
Из особо полезных свойств полимолочной кислоты следует отметить
способность к термической кристаллизации, к сополимеризации лёгкость
обработки при помощи специально предназначенного для работы с полимерами
оборудования и ударопрочность. Хорошо изучены механизмы образования из
полилактата прозрачных плёнок и волокон, а также он обладает превосходными
органолептическими свойствами, может безвредно контактировать с пищей и
использоваться как упаковочный материал в пищевой промышленности
(Witzke, 1997).
2.1.3. Оптическая чистота лактата
Как было упомянуто выше, L-изомер в природе встречается чаще.
Согласно US FDA (Food and Drug Administration), чистая L-молочная кислота
официально признана безвредной пищевой добавкой (Wee et al., 2006), в то
время, как D-лактат может оказывать вредное воздействие на метаболизм
человека, даже вызывать ацидоз и декальцификацию (Datta et al., 1995).
2.1.4 Химический синтез молочной кислоты
Основными способами химического синтеза молочной кислоты можно
назвать следующие: а) каталитический синтез из ацетальдегида, угарного газа и
воды на силиконовом геле при нагревании и высоком давлении (Bhattacharyya
et al., 1970); б) использование лактонитрила, являющегося побочным продуктом
в акрилонитрильной технологии (Datta et al., 2006) и получаемого при
добавлении синильной кислоты к ацетальдегиду в присутствии катализатора.
Однако в данный момент всё производство основывается на биосинтезе по ряду
причин. Во-первых, в результате химического синтеза получается
рацемизированная DL-молочная кислота, а не оптически чистые изомеры. Вовторых, биосинтез предпочтителен в связи с некоторыми экологическими
аспектами синтетического производства. В-третьих, запасы нефтепродуктов
ограничены, в то время как сбраживаемые углеводы можно получить
гидролизом и/или ферментативным осахариванием из возобновляемых
источников (Wee et al., 2006).
2.2. Биосинтез молочной кислоты
Основными продуцентами, ферментируемыми для получения молочной
кислоты, являются молочнокислые бактерии (Gottschalk, 1985),
Saccharomyces cerevisiae (Adachi et al., 1998), Kluyveromyces lactis (Bianchi et al.,
2001) и Escherichia coli (Chang et al., 1999). Самые высокие скорость продукции
и выход демонстрируют молочнокислые бактерии (Litchfield, 1996),
требующие, однако, целого комплекса питательных веществ, например,
сыворотку, кукурузный или дрожжевой экстракт, что затрудняет производство
и извлечение продукта. Для решения этой проблемы, был создан
генномодифицированный штамм E. coli, способный синтезировать лактат со
значительным выходом целевого продукта и без сложных питательных
комплексов, однако его продуктивность была ниже таковой у молочнокислых
бактерий (Zhou et al., 2003a,b).
Аэробный микроорганизм Corynebacterium glutamicum широко
применяется в промышленном производстве различных аминокислот и
нуклеиновых кислот (Kinoshita, 1985; Terasawa and Yukawa, 1993). Также
известно, что C. glutamicum в минеральной среде и в условиях кислородного
голодания синтезирует из глюкозы различные органические кислоты, причём
преимущественно - молочную (Inui et al., 2004). Это позволяет проводить
биосинтез молочной кислоты в биореакторе, заполненном клеточной культурой
высокой плотности (Okino et al., 2005).
2.2.1. Метаболизм C. glutamicum в условиях кислородного
голодания
Основные пути катаболизма глюкозы в C. glutamicum изображены на
рисунке 1. Известно, что в процессе анаэробного метаболизма глюкоза
переходит в пируват через путь Эмбдена-Мейерхофа-Парнаса,
сопровождающийся генерацией NADH, которая управляется глицеральдегид-3фосфатдегидрогеназой (GAPDH). Поскольку NADH ингибирует GAPDH, то
гликолитический путь управляется
внутриклеточным соотношением
NAD+/NADH. Лактатдегидрогеназа
(LDH) катализирует переработку
NADH и пирувата в NAD+ и лактат,
способствуя гликолитическому пути.
(Danshina et al., 2001; Duggleby and
Dennis, 1974; Velick and Furfine, 1963).
Рис. 1. Метаболические пути C. glutamicum в условиях кислородного голодания.
Катализаторы соответствующих путей отображены в прямоугольниках. LDH - ген
лактатдегидрогеназы (ldhA); PEPC - фосфоенолпируваткарбоксилаза (ppc ген); PC пируват карбоксилаза (pyc ген); PEPCK - фосфоенолпируваткарбоксикиназа (pckA
ген); OD - оксалоацетат декарбоксилаза; FUM - фумараза (fum ген); SDH сукцинатдегидрогеназа; ICL - изоцитратлиаза (aceA ген) (Inui et al., 2004).
2.2.2. Лактатдегидрогеназа
Лактатдегидрогеназа (LDH) представляет из себя фермент, управляющий
одной из ветвей катаболизма пирувата. Располагаются лактатдегидрогеназы на
цитоплазматической стороне внутренней мембраны и состоят из трёх доменов:
флавинадениндинуклеотид (FAD)-связывающийся домен, Cap-домен и домен
связи с мембраной. В условиях клеточного дыхания лактатдегидрогеназа
совместно с NADH катализирует окисление лактата до пирувата, что также
связано с трансмембранным транспортом аминокислот и сахаров (Dym et al.,
2000), а в условиях кислородного голодания способствует восстановлению
пирувата до лактата (Inui et al., 2004). Методы генной инженерии позволяют
извлекать ген лактатдегидрогеназы той или иной (D- или L-) молочной кислоты
из природных продуцентов и осуществлять его экспрессию в других
микроорганизмах в условиях кислородного голодания, тем самым синтезируя
лактат, а также избавляться от синтеза другого изомера путём нокаутирования
гена соответствующей лактатдегидрогеназы, что в итоге даёт необходимый
оптически чистый изомер лактата.
2.2.3. Биосинтез органических кислот при помощи C. glutamicum
C. glutamicum - аэробные или факультативно анаэробные организмы, в
связи с чем для ферментации их сперва наращивают до высоких плотностей в
присутствии кислорода и пищевых комплексов, после чего перекрывают доступ
кислорода, отключая тем самым электронно-транспортную цепь, и
C. glutamicum переходит в режим превращения подаваемых в реактор углеводов
(как правило, глюкозы) в органические кислоты. При определённых условиях
ферментация позволяет получить достаточно высокий выход лактата: при
скорости поглощения глюкозы ~33 мМ/ч C. glutamicum может синтезировать
~62 мМ/ч молочной кислоты, из ~68 мМ/ч всех синтезируемых органических
кислот (Okino et al., 2005).
2.2.4. Биосинтез D-лактата
В настоящее время, исследования биосинтеза D-лактата
преимущественно связаны с такими микроорганизмами, как Lactobacillus,
Escherichia coli и Saccharomyces cerevisiae. Несмотря на то, что первые
промышленные продуценты D-молочной кислоты, L. delbrueckii (Hofvendahl
and Hahn-Hägerdal, 2000), L. coryniformis (Yáñez et al., 2003) и L. lactis (Joshi et
al., 2010) давали высокий выход молочной кислоты и скорость синтеза, до
грамма D-молочной кислоты на грамм глюкозы и со скоростью до 18 г/л/ч у
L. delbrueckii (Tashiro et al., 2010), ферментация их затратна из-за пищевых
комплексов, необходимых для лактобацилл и увеличивающих стоимость
потребляемого субстрата и затраты на отделение конечного продукта. Для
решения этой проблема исследователи методами генной инженерии получили
мутантный штамм E. coli (Zhou et al., 2003a), однако он давал низкий выход Dлактата и обладал низкой устойчивостью к кислоте (Portnoy et al., 2008). Генно-
модифицированный S. cerevisiae позволял сравнительно дешёво разделять
продукты, но тоже давал низкий выход и скорость синтеза (Tokuhiro et al.,
2009).
Эффективными в производстве органических кислот, в том числе Lлактата, являются штаммы C. glutamicum (Okino et al., 2005). В процессе
синтеза молочной кислоты с использованием существующих штаммов
продуцентов получается много побочных продуктов. Также, продуктивность и
выход существующих технологий с использованием как генноинженерных, так
и природных штаммов продуцентов D-молочной кислоты ещё недостаточно
высоки, нет оптимизированной технологии ферментации, в то время как
существуют промышленные микроорганизмы, способные синтезировать до
120г/л/ч L-молочной кислоты (Calabia et al., 2007). Перспективными
направлениями развития биосинтеза D-лактата являются создание на основе
C. glutamicum штамма с D-лактатдегидрогеназой вместо Lлактатдегидрогеназы, ослабление соответствующих побочным продуктам
метаболических путей методами генной инженерии и оптимизация процесса
ферментации.
3. Материалы и методы
В работе использовались следующие олигонуклеотиды:
(Cконструированы и синтезированы на ЗАО «Синтол» (Панов, et.al.
2013))
a. Олигонуклеотиды для ПЦР-амплификации и определения нуклеотидной
последовательности участка гена D-лактатдегидрогеназы были
сконструированы на основе нуклеотидной последовательности штамма
Lactobacillus bulgaricus http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/104773257:
ldhADir 5’ – ACAAGGATCCACTAAAATTTTTGCTTACGCAATTC – 3’
ldhARev 5’ – GTTTTGAGCTCGGGATTTCTAAGCGGCTAGATT – 3’
ldhASeq 5' - AGCTGGAACGTCAGGAACGTGC - 3'
В программе амплификации гена D-лактатдегидрогеназы с помощью
олигонуклеотидов ldhADir и ldhARev и хромосомной ДНК L. bulgaricus в
качестве матрицы температура отжига составляла 57.0ºC (подобрана
экспериментально), время элонгации - 100 с.
b. Олигонуклеотиды для подтверждения вида бактерий по видоспецифичной
последовательности гена 16S рибосомальной РНК на основе нуклеотидной
последовательности:
1. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/48994873 штамма E. coli MG1655 ;
16secoliD 5' - ACCTTCGGGCCTCTTGCCATCG - 3'
16secoliR 5' - CTCATCTCTGAAAACTTCCGTG - 3'
Была выбрана температура отжига 53.0ºC и время элонгации - 70с.
2. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/58036263 C. glutamicum
ATCC13032;
16scorynD 5' - GAAACCGGAGCTTGCTTTGGTG - 3'
16scorynR 5' - GCCGGTGCTTCTTCTCCAGGTA - 3'
Была выбрана температура отжига 56.7ºC и время элонгации - 40с.
3. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/104773257 L. bulgaricus
ATCC11842;
16slactoD 5' - CGGGATGATTTGTTGGACGCTA - 3'
16slactoR 5' - CACCGACTTTGGGCATTGCAGA - 3'
Была выбрана температура отжига 54.8ºC и время элонгации - 140с.
c. Олигонуклеотиды для подтверждения рестрикции pEftu-cat5 по сайтам
BamHI и SacI и лигирования полученного участка ДНК с ldhA, а также для
подтверждения наличия вектора pEftu-cat5 или pEftu-Ldh в клеточной культуре
написаны на основании вышеуказанной нуклеотидной последовательности
pEftu-cat5:
pNS2eftuDir 5' - TACGAGGCACCCAGCG - 3'
pNS2eftuRev 5' - TGTAAAACGACGGCCAGTGAAT - 3'
Была выбрана температура отжига 53.0ºC и время элонгации - 140с.
Этапы клонирования гена D-лактатдегидрогеназы (ldhA) (Панов, et.al.
2013):
1. Амплификация гена ldhA методом ПЦР с использованием в качестве
матрицы геномной ДНК L. bulgaricus; элюция полученного фрагмента из
агарозного геля; лигирование его с T-вектором (pTZ57R/T); трансформация
штамма E. coli TG1 полученной лигазной смесью; отбор клонов с плазмидой,
содержащей ген ldhA (pTZ57R/T-ldhA); рестрикция полученной плазмиды по
сайту BamHI; инактивация рестриктазы и э
люция из агарозного геля
участка длины ~4000 нуклеотидных пар; рестрикция полученного линейного
фрагмента ДНК по сайту SacI; инактивация рестриктазы и элюция из
агарозного геля участка длины ~1000 нуклеотидных пар.
2. Рестрикция плазмиды pEftu-cat5 по сайту BamHI; инактивация
рестриктазы и элюция из агарозного геля участка длины ~10000 нуклеотидных
пар; рестрикция полученного линейного фрагмента ДНК по сайту SacI с
добавлением фосфатазы; инактивация рестриктазы и элюция из агарозного геля
участка той же длины.
3. Лигирование полученных на этапах 1 и 2 линейных фрагментов ДНК;
трансформация лигазной смесью штамма E. coli MC1061; отбор клонов,
содержащих плазмиду с геном ldhA (pEftu-ldhA) .
В работе использовался следующий штамм:
Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, предоставлен ВКПМ
(Всероссийская Коллекция Промышленных Микроорганизмов);
Питательные среды и условия роста
Для культивирования C. glutamicum использовали среду LB (LuriaBertani): триптон, 10г/л; дрожжевой экстракт, 5г/л; NaCl, 10г/л; pH 7,5. Для
получения твёрдой среды к LB добавляли агар до концентрации 1,5%.
Для ферментации C. glutamicum использовали среду A: глюкоза, 40г/л;
мочевина, 2г/л; дрожжевой экстракт, 2г/л; казаминовые кислоты, 7г/л;
(NH4)2SO4, 7г/л; KH2PO4, 0,5г/л; K2HPO4, 0,5г/л; MgSO4·7H20, 0,5г/л;
FeSO4·7H2O, 6мг/л; MnSO4·H2O, 4,2мг/л; биотин, 0,2мг/л; тиамин (pH 7.0),
0,2мг/л (Okino et al., 2005).
Для отбора колоний C. glutamicum по фенотипическому признаку
(характерно жёлтый цвет) использовали BHIS агар (Brain Heart Infusion Sorbitol
Agar): экстракт говяжьего сердца, 10г/л; экстракт мозга телёнка, 7,5г/л;
протеозопептон, 10г/л; глюкоза, 2г/л; NaCl, 5г/л; Na2HPO4, 2,5г/л; сорбитол, 91
г/л; агар, 15г/л.
При трансформации C. glutamicum была использована BHIS среда: BHI,
37 г/л; сорбитол, 91 г/л.
Для инкубации культур была выбрана температура 30°С. В случае жидких
сред бактерии растили при постоянных перемешивании (100-200 об/с) и
вентиляции.
Для отбора колоний в среду в определённых случаях добавлялись
антибиотики в следующих концентрациях: ампициллин – 100мкг/мл,
канамицин – 25 мкг/мл для отбора колоний C.Glutamicum при пересеве, 15
мкг/мл при трансформации.
Используемая плазмида
pEftu-ldhA: ApR, KmR. Карта вектора изображена на рисунке 1.
Использован для экспрессии гена D-лактатдегидрогеназы в C. glutamicum.
Вектор сконструирован (Панов, et.al 2013) из плазмиды pUC19, pBO1репликона из коринебактериальной плазмиды pBL1, ldhA - гена Dлактатдегидрогеназы из L. bulgaricus, сильного конститутивного
коринебактериального промотора eftu гена tuf (Kind et al., 2010) и kan – гена
канамицин-резистентности. pEftu-ldhA способна самореплицироваться в
используемых штаммах E. coli и C. glutamicum, позволяет сильную экспрессию
гена под промотором eftu, а также отбор трансформантов на средах с
добавлением ампициллина и канамицина.
Рис. 1. Карта плазмиды pEftu-ldhA. pUC19 ori – ориджин репликации плазмиды pUC19 для
E. coli, pBO1 ori – ориджин репликации плазмиды pBL1 для C. glutamicum, kan – ген
канамицин-резистентности, ldhA – ген D-лактатдегидрогеназы, bla – ген ампициллинрезистентности, eftu –коринебактериальный промотор.
Трансформация штамма C. glutamicum проводилась по известной
методике (van der Rest et al., 1999) с определёнными изменениями: культивация
клеток проводилась при 30ºC вместо 18ºC, в качестве сред использовали
указанные выше BHI среды с добавлением сорбитола.
Электрофоретическое разделение молекул ДНК производилось в агарозном
(1%) ТАЕ-геле с EtBr согласно известной методике (Maniatis et al., 1989) под
напряжением 100-120В на концах камеры длины ~30см в течение 20-30 минут.
Для нахождения концентраций ДНК определённых длин использовались
эталонные смеси O'GeneRulerTM DNA Ladder Mix (#SM1173, Fermentas) и
λ/HindIII (#SM0103, Fermentas). Визуализация разделения осуществлялась
просвечиванием геля на мягком ультрафиолете на транслюминометре TCP20.MC (VILBER LOURMAT).
Выделение плазмидных ДНК осуществлялось либо щелочным методом
(Maniatis et al., 1989), либо при помощи PureYieldTM Plasmid Miniprep System
(Promega), в отдельных случаях производилась очистка полученных смесей от
солей и переосаждение спиртом (Maniatis et al., 1989).
Трансформация клеток C.glutamicum осуществлялась на электропораторе
Eporator (Eppendorf), время импульса ~5мс.
Центрифугирование малых объемов (эппендорфы с максимально
допустимым объёмом 1,7мл) производилось на Centrifuge5418 (Eppendorf),
центрифугирование больших объемов (стеклянные стаканы объемом до 100мл)
производилось на Sorvall® RC-5B Refrigerated Superspeed Centrifuge (Du Pont
Instruments). Для перемешивания содержимого пробирок или эппендорфов
применялся вортекс Vibrofix VF1 Electronik (Janke&Kunkel IKA-WERK). Для
перемешивания, продувки и поддержания постоянной температуры
инкубируемых в жидких средах клеточных культур применялся инкубатор
Excella E24 Incubator Shaker (New Brunswick Scientific). Для поддержания
постоянной температуры при инкубации клеточных культур на твёрдых средах
применялся термостат ТС-80М-2. При необходимости в течение короткого
времени установить определённую температуру в эппендорфах применялся
термостат Гном (ДНК Технология). При приготовлении растворов
использовались весы ScoutTMPro (OHAUS) и AdventurerTM (OHAUS) и
магнитная мешалка MSH300.
Анализ результатов ферментации на предмет определения концентраций
органических кислот проводился методом высокоэффективной жидкостной
хроматографии (ВЭЖХ). Результативность генетических манипуляций
подтверждался при помощи ПЦР-амлификации, рестрикции, на основе
фенотипических особенностей, или на основании результатов ВЭЖХ.
В ходе работы применялись методы полимеразной цепной реакции (ПЦР)
для амплификации определённых участков генов. На основе заявленных на
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ нуклеотидных последовательностей организмов
при помощи компьютерной программы Oligo, выбирались олигонуклеотиды.
Программа реакции выбиралась на основе алгоритма
http://www.basic.northwestern.edu/biotools/OligoCalc.html. ПЦР-раствор
составлялся из 40мкл PCR-Red #R4-5-5 (Amplisens), до 0,2мМ смеси dNTP
(#00029653, Fermentas) и ~10-20пкмоль обоих олигонуклеотидов на 100мкл
водного раствора. В качестве матрицы использовали либо выделенную
плазмидную ДНК, либо сами клетки. Для ПЦР-амплификации использовались
приборы ТЕРЦИК MC2 (ДНК Технологии) и MasterCycler gradient (Eppendorf).
При необходимости избавиться от испарения раствора при нагреве добавляли
15 мкл минерального масла для ПЦР.
4. Результаты.
4.1 Ферментация нетрансформированного штамма C.glutamicum
Было произведено высокоплотностное культивирование штамма
Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 по методике (Okino, et.al., 2005) и
анализ проб полученных смесей на ВЭЖХ, взятых с интервалом в один час.
Процедура ферментации заняла 15 часов, из которых первые одиннадцать –
аэробное наращивание биомассы до OD = 75, а оставшиеся четыре –
анаэробный режим выработки органических кислот.
pH поддерживался в ферментёре равным 7.5, поддержка осуществлялась
добавлением аммиака и серной кислоты. В анаэробном режиме проводилась
дополнительная добавка глюкозы в среду (8г в час и 15 г дополнительно,
непосредственно перед началом анаэробной ферментации)
В таблицах 1 и 2 приведены результаты ВЭЖХ концентраций сахаров и
органических кислот для аэробной и анаэробной частей ферментации
соответственно. В таблицах приведены только кислоты, присутствовавшие на
ферментации в концентрации ≥ 0,1г/л. На картинках ВЭЖХ красным
прямоугольником отмечен пик, отвечающий молочной кислоте.
Таблица 1. Результаты определения концентрации органических кислот и сахаров методом
ВЭЖХ для проб, взятых во время аэробного наращивания биомассы (концентрация указана
в г/л)
Время, ч
Глицерин
Муравьиная
к-та
Глюкоза
Изоцитрат
Лактат
Уксусная
к-та
Янтарная
к-та
0
2,056
0,605
52,754
2,236
-
-
-
3
1,816
0,574
52,246
1,911
-
-
-
6
0,493
0,633
48,112
1,707
-
-
-
9
-
0,821
27,230
0,327
0,392
0,671
0,619
11
-
0,664
3,417
0,294
0,388
0,692
0,686
Таблица 2. Результаты определения концентрации органических кислот и сахаров методом
ВЭЖХ для проб, взятых во время анаэробной части ферментации (концентрация указана в
г/л)
Время, ч
Глицерин
Муравьиная
к-та
Глюкоза
Изоцитрат
Лактат
Уксусная
к-та
Янтарная
к-та
0
-
0,600
16,649
0,603
4,803
1,210
4,227
1
-
0,668
19,896
0,242
11,744
1,524
5,636
2
-
0,535
16,969
0,221
16,402
1,715
6,549
3
-
0,694
24,669
0,105
20,341
1,817
6,532
4
-
0,629
36,983
-
23,188
1,836
7,198
Рисунок 2. График скорости выработки лактата в период анаэробной
ферментации (скорость указана в
г/л/ч)
Рисунок 3. ВЭЖХ анализ последней пробы ферментации, 4ч.
Как видно из таблицы 1, в период аэробного наращивания биомассы,
существенной выработки лактата не происходит при активном поглощении
глюкозы и питательных веществ среды. При переходе к анаэробному режиму
метаболизма, общее потребление глюкозы возрастает, активируется
анаэробный метаболический путь и начинается выработка лактата.
Наибольшая скорость выработки приходится на первый час ферментации и
уменьшается со временем, несмотря на поддержку достаточного уровня
глюкозы. Это можно объяснить как наличием большого количества побочных
продуктов ферментации в среде, так и существенной концентрацией лактата.
Рисунок 3 демонстрирует отношение количества лактата к побочным
веществам в итоговом продукте ферментации.
4.2 Трансформация C.glutamicum
Была произведена трансформация штамма C.glutamicum ATCC 13032
плазмидой pEftu-ldhA. Подтверждение наличия вектора pEftu-LdhA в
клеточной культуре осуществлялось с помощью полимеразной цепной реакции
по праймерам pNS2eftuDir и pNS2eftuRev с клетками в качестве матрицы
амплификацией участка ДНК с ldhA по сайтам BamHI и SacI (~1000bp) и
форезом ПЦР продукта.
5. Выводы
Главным итогом работы является получение трансформированного pEftuldhA штамма C. glutamicum и освоение методики его ферментации,
подтверждённой ВЭЖХ (скорость выработки лактата соответствует
аналогичной ферментации (Okino, et. al. 2005)). Из результатов ВЭЖХ следует
вывод, что наибольшая скорость выработки лактата и потребления глюкозы
приходятся на первые два часа и затем уменьшается со временем, несмотря на
поддержку достаточного уровня глюкозы. Этим разумно объяснить
дальнейший выбор оптимальной длительности анаэробной ферментации в 5-6
часов.
Подготовлен материал для продолжения работы над созданием продуцента:
положено начало поиску оптимальных условий ферментации, положено начало
сравнению эффективностей D-лактатдегидрогеназ различных
микроорганизмов. Предстоит избавиться от таких побочных продуктов
биосинтеза, как сукцинат и ацетат, что планируется осуществлять нокаутом
генов, управляющих соответствующими метаболическими путями (Inui et al.,
2004).
6. Список литературы
Панов П. Создание штамма продуцента D-лактата (2013)
Adachi E., Torigoe M., Sugiyama M., Nikawa J., Shimizu K. Modification of metabolic
pathways of Saccharomyces cerevisiae by the expression of lactate dehydrogenase and
deletion of pyruvate decarboxylase genes for the lactic acid fermentation at low pH value. J
Ferment Bioeng (1998) 86:284–289.
Amar K.M., Lawrence T.D. Natural Fibers, Biopolymers, and Biocomposites. CRC Press
(2005), pp. 528-569.
Benninga H. A History of Lactic Acid Making. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht,
Netherlands (1990), pp. 1-61.
Bhattacharyya S.K., Palit S.K., Das A.R. Catalytic synthesis of lactic acid from
acetaldehyde, carbon monoxide, and water. Ind. Eng. Chem. Prod. Res. Develop. (1970)
V.9, N.1, pp.92-95.
Bianchi M.M., Brambilla L., Protani F., Liu C.L., Lievense J., Porro D. Efficient homolactic
fermentation by Klyuveromyces lactis strains defective in pyruvate utilization and
transformed with the heterologous LDH gene. Appl Environ Microbiol (2001) 67:56215625.
Calabia B.P., Tokiwa Y. Production of D-lactic acid from sugarcane molasses, sugarcane
juice and sugar beet juice by Lactobacillus delbrueckii. Biotechnol Lett (2007) 29:13291332.
Chang D.E., Jung H.C., Rhee J.S., Pan J.G. Homofermentative production of D- or L-lactate
in metabolically engineered Escherichia coli RR1. Appl Environ Microbiol (1999) 65:13841389.
Datta R., Tsai S.P., Bonsignore P., Moon S.H., Frank J.R. Technological and economic
potential of poly(lactic acid) and lactic acid derivatives. FEMS Microbiol. Rev. (1995)
16:221-231.
Datta R., Henry M. Lactic acid: recent advances in products, processes and technologies - a
review. J Chem Technol Biotechnol (2006)81:1119-1129.
Danshina P.V., Schmalhausen E.V., Avetisyan A.V., Muronetz V.I. Mildly oxidized
glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase as a possible regulator of glycolysis. IUBMB
Life (2001) 51:309-314.
Duggleby R.G., Dennis D.T. Nicotinamide adenine dinucleotide-specific glyceraldehyde 3phosphate dehydrogenase from Pisum sativum. Assay and steady state kinetics. J. Biol.
Chem. (1974) 249:167-174.
Dym O., Pratt E.A., Ho C., Eisenberg D. The crystal structure of D-lactate dehydrogenase, a
peripheral membrane respiratory enzyme. Proc Natl Acad Sci USA (2000) 97(17):94139418.
Flieger M., Kantorova M., Prell A., Rezanka T., Votruba J. Biodegradable plastics from
renewable sources. Folia Microbiol (Praha) (2003) 48:27-44.
Gottschalk G. Bacterial metabolism, 2nd edn. Springer, Berlin Heidelberk New York
(1985).
Hofvendahl K., Hahn-Hägerdal B. Factors affecting the fermentative lactic acid production
from renewable resources. Enzyme Microb Technol (2000) 26:87-107.
Inui M., Murakami S., Okino S., Kawaguchi H., Vertés A.A., Yukawa H. Metabolic
Analysis of Corynebacterium glutamicum during Lactate and Succinate Productions under
Oxygen Deprivation Conditions. J Mol Microbiol Biotechnol (2004) 7:182-196.
John R.P., Nampoothiri K.M., Pandey A. Fermentative production of lactic acid from
biomass: an overview on process developments and future perspectives. Appl Microbiol
Biotechnol (2007) 74:524-534.
Joshi D.S., Singhvi M.S., Khire J.M., Gokhale D.V. Strain improvement of
Lactobacillus lactis for D-lactic acid production. Biotechnol Lett (2010) 32:517-520.
Kind S., Jeong W.K., Schröder H., Wittman C. Systems-wide metabolic pathway
engineering in Corynebacterium glutamicum for bio-based production of diaminopentane.
Metab Eng. (2010) 12(4):341-51.
Kinoshita S. Glutamic acid bacteria. Coummings, London (1989).
de Man J.C., Rogosa M., Sharpe M.E. A Medium for the Cultivation of Lactobacilli. J Appl
Bact (1960) 23:130–135.
Maniatis T., Fritsch E.F., Sambrook J. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Sping
Harbor Laboratory (1989).
Okino S., Inui M., Yukawa H. Production of organic acids by Corynebacterium glutamicum
under oxygen deprivation. Appl Microbiol Biotechnol (2005) 68: 475-480.
Okino S., Suda M., Fujikura K., Inui M., Yukawa H. Production of D-lactic acid by
Corynebacterium glutamicum under oxygen deprivation. Appl Microbiol Biotechnol (2008)
78:449-454.
Portnoy V.A., Herrgard M.J., Palsson B.O. Fermentation of D-Glucose by an evolved
cytochrome oxidase-deficient Escherichia coli strain. Appl Environ Microbiol
(2008)74:7561-7569.
van der Rest M.E., Lange C., Molenaar D. A heat shock following electroporation induces
highly efficient transformation of Corynebacterium glutamicum with xenogeneic plasmid
DNA. Appl Microbiol Biotechnol (1999) 52:541-545.
Södergärd A., Stolt M. Properties of lactic acid based polymers and their correlation with
composition. Prog. Polym. Sci. (2002) 27:1123-1163.
Litchfield J.H. Microbiological production of lactic acid. Adv Appl Microbiol (1996) 42:4595.
Tashiro Y., Kaneko W., Sun Y.Q., Shibata K., Inokuma K., Zendo T., Sonomoto K.
Continuous D-lactic acid production by a novel thermotolerant Lactobacillus delbrueckii
subsp. lactic QU 41. Appl Microbiol Biotechnol (2010). DOI:10.1007/s00253-010-3011-7.
Terasawa M., Yukawa H. Industrial production of biochemicals by native immobilization.
In: Tanaka A., Tosa T., Kobayashi T. (eds) Industrial application of immobilized
biocatalysts. Dekker, New York (1993), pp.37-52.
Tokuhiro K., Ishida N., Nagamori E., Saitoh S., Onishi T., Kondo A., Takahashi H. Double
mutation of the PDC1 and ADH1 genes improves lactate production in the yeast
Saccharomyces cerevisiae expressing the bovine lactate dehydrogenase gene. Appl
Microbiol Biotechnol (2009)82:883-890.
Varadarajan S., Miller D.J. Catality upgrading of fermentation-derived organic acids,
Biotechnol Progr (1999) 15:845-854.
Velick S.F., Furfine C. Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase; in Lardy H., and
Myrbach K. (eds.): The Enzymes. New York, Academic Press (1963), vol. 7, pp. 243-273.
Wee Y.-J., Kim J.-N., Ryu H.-W. Biotechnological Production of Lactic Acid and Its
Recent Applications. Food Technol. Biotechnol. (2006) 44(2):163-172.
Witzke D.R. Introduction to Properties, Engineering, and Prospects of Polylactide Polymer,
Ph.D. thesis, Chemical Engineering, Michigan State University (1997).
Xiaoqiang J., Peng L., Shuang L., Shanshan L., Jianping W. D-lactic acid production by a
genetically engineered strain Corynebacterium glutamicum. World J Microbiol Biotechnol
(2011) 27:2117-2124.
Yáñez R., Moldes A.B., Alonso J.L., Parajó J.C. Production of D(-)-lactic acid from
cellulose by simultaneous saccharification and fermentation using
Lactobacillus coryniformis subsp. torquens. Biotechnol Lett (2003) 25:1161-1164.
Zhou S., Causey T.B., Hasona A., Shanmugam K.T., Ingram L.O. Production of optically
pure D-lactic acid in mineral salts medium by metabolically engineered Escherichia coli
W3110. Appl Environ Microbiol (2003a) 69:399-407.
Zhou S., Shanmugam K.T., Ingram L.O. Functional replacement of the Escherichia coli D(-)-lactate dehydrogenase gene (ldhA) with the L-(+)-lactate dehydrogenase gene (ldhL)
from Pediococcus acidilactici). Appl Environ Microbiol (2003b) 69:2237-2244.
Zwicker N., Theobald U., Zahner H., Fiedler H.P. Optimization of fermentation conditions
for the production of ethylene-diamine-disuccinic acid by Amycolatopsis orientalis. J Ind
Microbiol Biotechnol (1997) 19:280-285.