У А. В. Аншакова , Ю. В. Ермоленко

Успехи в химии и химической технологии. ТОМ XXIX. 2015. № 1
УДК 543.545.2
А. В. Аншакова*, Ю. В. Ермоленко*, М. Я. Каменцев***, В. Ю. Конюхов*, О. О. Максименко**,
С. Э. Гельперина**
* Российский химико-технологический университетим. Д.И. Менделеева, Москва, Россия, 125047 г. Москва,
Миусская пл., д.9
** Общество с ограниченной ответственностью «НПК «Наносистема», Москва, Россия, 115446, Москва,
Коломенский проезд, д. 13А
***Санкт-Петербургский Государственный Университет, Институт химии, Санкт-Петербург, Россия, 198504,
Санкт-Петербург, Университетский пр., д. 26
e-mail: [email protected]
ИССЛЕДОВАНИЕ МЕЖМОЛЕКУЛЯРНОГО ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ В СИСТЕМЕ
РИФАБУТИН – ГИДРОКСИПРОПИЛ-β-ЦИКЛОДЕКСТРИН МЕТОДОМ АФФИННОГО
КАПИЛЛЯРНОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА
Методом аффинного капиллярного электрофореза (КЭФ) изучено влияние кислотности среды на ионное состояние
и эффективную подвижность молекулы рифабутина (РБ). Установлено, что при рН 4,7 ведущего электролита
эффективная электрофоретическая подвижность РБ является функцией от концентрации 2-гидроксипропил-βциклодекстрина (ГП-β-ЦД). Константа устойчивости межмолекулярного взаимодействия РБ – (ГП-β-ЦД) при рН
4,7 (ацетатный буферный раствор с общей молярной концентрацией 0,05 М) составила 60,5 (lgK1:1=1,78).
Ключевые слова: рифабутин; гидроксипропил-β-циклодекстрин; межмолекулярное взаимодействие; аффинный
капиллярный электрофорез.
экспериментальной туберкулезной инфекции [3]. С
помощью методов молекулярной спектроскопии
было установлено, что повышение растворимости РБ
достигалось за счет образования водорастворимых
ассоциатов РБ – (ГП-β-ЦД), а не традиционных для
ЦД «комплексов включения» [4]. Цель данной
работы
исследование
межмолекулярного
взаимодействия в системе РБ – (ГП-β-ЦД) с
помощью метода аффинного КЭФ.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. В работе
использовали субстанцию РБ производства Luohe
Nanjiecun Pharmaceutical Group Pharmacy Co., LTD
(Китай). ГП-β-ЦД был приобретен в Sigma-Aldrich
(Германия).
Влияние кислотности среды и концентрации
ГП-β-ЦД на эффективную электрофоретическую
подвижность РБ устанавливали с помощью системы
КЭФ «Капель 105М» («Люмэкс», Россия),
оборудованной
спектрофотометрическим
детектором, кварцевым капилляром (внутренний
диаметр 75 мм, эффективная длина 50 см, общая
длина 60 см), с программным обеспечением
«Эльфоран».
Термостатирование
капилляра
проводили при +20°С; напряжение на капилляре +20
кВ; длина волны детектирования 214 нм; ввод пробы
гидродинамический (30 мБар), 5 секунд. Перед
вводом пробы капилляр промывали в течение 5
минут
последовательно
водой
и
ведущим
электролитом. Концентрация РБ в пробе - 26,8 мкМ;
концентрация ГП-β-ЦД в растворе ведущего
электролита – 0-70 мкМ. В качестве ведущего
электролита использовали буферные растворы с
общей молярной концентрацией 0,05 М: фосфатный
(рН 2,34; 5,7; 6,2; 6,9; 7,4; 8,0), ацетатный (рН 4 и
4,7), тетраборатный (рН 9,18), карбонатный (рН
10,2).
Раствор
электролита
дегазировали
центрифугированием (132000 об/мин, 15°С, 5 мин).
Метод аффинного КЭФ широко используют для
изучения комплексообразования, а обработка
полученных данных об изменении эффективной
электрофоретической подвижности (μэфф) молекулы
исследуемого вещества в присутствии избытка
лиганда
позволяет
вычислить
константы
устойчивости комплексов [1]. В представляемой
работе метод аффинного КЭФ использовали для
оценки устойчивости межмолекулярного ассоциата
противотуберкулезного антибиотика рифабутина
(РБ) и макроциклического олигосахарида 2гидроксипропил-β-циклодекстрина (ГП-β-ЦД).
Циклодекстрины (ЦД) применяют в технологии
(в частности, в фармацевтике) для повышения
растворимости в воде малорастворимых веществ, а
также для повышения их химической стабильности.
Торообразная форма и строение молекулы
(гидрофобная внутренняя полость и гидрофильная
поверхность) обуславливают способность ЦД к
образованию «комплексов включения». Поскольку
соединения группы ЦД отличаются количеством α(1,4)-связанных глюкопиранозных звеньев, различны
и параметры молекулы – внешний и внутренний
диаметры тора. Таким образом, для каждой
молекулы - «гостя» можно подобрать свою,
подходящую по размеру молекулу ЦД - «хозяина».
Для фармацевтической технологии особый интерес
представляет ГП-β-ЦД, который, благодаря его
высокой растворимости в воде (500 мг/см3) и низкой
токсичности (у крыс LD50 достигает 10 и >2 г/кг при
внутривенном
и
пероральном
приеме,
соответственно) часто применяют в качестве
вспомогательного вещества. Использование ГП-βЦД для солюбилизации РБ привело к 3-кратному
повышению концентрации этого малорастворимого
антибиотика в растворе (cS=0,2 мг/см3 [2]) и
увеличило его эффективность в отношении
22
Успехи в химии и химической технологии. ТОМ XXIX. 2015. № 1
В качестве нейтральной метки электроосмотического
потока (ЭОП) использовали 0,1%-ый водный раствор
ДМСО. По полученным результатам строили
изотерму связывания в координатах: μэфф = f(c(ГП-βЦД)), где: μэфф - эффективная электрофоретическая
подвижность РБ, и рассчитывали условную
константу ассоциации Касс (РБ–(ГП-β-ЦД)):
,
что свидетельствует об отрицательном заряде РБ в
этих условиях. На Рис. 1 (Б) представлена
графическая
рН-зависимость
эффективной
электрофоретической подвижности РБ μэфф(РБ). В
кислой среде μэфф(РБ) остается постоянной и не
изменяется до рН≈4. В данной области рН РБ
существует в виде дикатиона (рКа азота
имидазольной группы - 4,0-5,0 [5]). При дальнейшем
повышении рН (диапазон рН от 4 до 8) происходит
депротонирование азота имидазольной группы. Это
приводит к уменьшению положительного заряда
катиона РБ, что выражается в уменьшении μэфф
катиона. При рН=8 μэфф(РБ) совпадает со скоростью
ЭОП: в этой области происходит отщепление
протона от гидроксильной группы в остатке
нафталина (рКа=6,5-7,5) и образуется цвиттер-ион
РБ. Далее, до рН=11, на частице РБ появляется и
увеличивается отрицательный заряд. В этой области
рН
происходит
депротонирование
азота
пиперидиновой группы молекулы РБ (рКа=9,7-11).
Данные, полученные с помощью метода КЭФ,
согласуются также с данными о зависимости
растворимости
РБ
от
рН,
полученными
спектрофотометрически [4]. Область существования
дикатиона РБ (с относительно высокой μэфф)
соответствует максимуму растворимости РБ. С
увеличением рН растворимость РБ понижается и
становится минимальной в нейтральной среде.
Небольшое увеличение растворимости РБ при рН>8
связано с образованием депротонированной формы
молекулы РБ.
(1)
где, μi – экспериментально полученное значение
электрофоретической подвижности (μi = χсμc + χfμf (с
учетом мольной доли связанного (χс) и свободного
(χf) РБ)); K – константа равновесия, [L] –
концентрация лиганда, μc и μf–электрофоретические
подвижности свободного и связанного РБ.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.
Молекула РБ имеет несколько констант кислотной
диссоциации (рКа), соответствующих ионизации
различных групп, и в зависимости от кислотности
среды в растворе преобладает одна из ионных форм
молекулы РБ [5]. Информация о ионных состояниях
частицы РБ в зависимости от кислотности среды,
полученная методом зонного КЭФ (Рис. 1),
соответствует известным из литературы данным о
константах кислотности РБ. В кислой и нейтральной
областях (до рН 8) время миграции РБ меньше
времени миграции ЭОП, следовательно, при этих
условиях РБ существует в растворе в виде катиона.
При рН 8 пики РБ и нейтральной метки ЭОП
совпадают, что говорит о нейтральном заряде
частицы РБ в среде ведущего электролита. В
щелочной же области метка ЭОП опережает пик РБ,
А
Б
Рис. 1. Влияние рН на эффективную подвижность РБ:А—смещение времени миграции РБ на электрофореграммах (1 –
маркер ЭОП, 2 - РБ); Б—рН-зависимость эффективной подвижности РБ
стехиометрическому соотношению РБ:(ГП-β-ЦД) =
1:1. Дальнейшее увеличение концентрации ГП-β-ЦД
(>35 мкМ) в ведущем электролите (рН 4,7)
практически не оказывало влияния на μэфф(РБ).
Условная константа равновесия, рассчитанная для
процесса взаимодействия между РБ и (ГП-β-ЦД) при
рН 4,7, равна 60,5 (lgK1:1=1,78). В щелочной среде
(рН 9,18) добавление ГП-β-ЦД к раствору ведущего
электролита значительно слабее влияет на μэфф(РБ) и
практически не оказывает не нее влияния
в
нейтральной среде (рН 7,4).
Устойчивость межмолекулярного ассоциата РБ –
(ГП-β-ЦД) изучали методом аффинного КЭФ,
добавляя ГП-β-ЦД в состав ведущего буфера. На
Рис. 2 представлены изотермы связывания,
построенные для системы РБ – (ГП-β-ЦД) в условиях
рН 4,7, 7,4 и 9,18.Наибольшая зависимость μэфф(РБ)
от концентрации ГП-β-ЦД зафиксирована в кислой
области, когда РБ представляет собой катион.
Следовательно, межмолекулярное взаимодействие
между РБ и ГП-β-ЦД максимально в кислой среде.
Следует отметить, что пересечение прямолинейных
участков кривой (1) приблизительно соответствует
23
Успехи в химии и химической технологии. ТОМ XXIX. 2015. № 1
ВЫВОДЫ. Установленная методом аффинного
КЭФ зависимость μэфф(РБ) от кислотности ведущего
электролита согласуется с литературными данными
о распределении ионных форм РБ в зависимости от
рН: молекула РБ нейтральна при рН 8, увеличение и
уменьшение μэфф(РБ) в кислой и щелочной области
связано с образованием катионной и анионной форм
молекулы
РБ,
соответственно
Наибольшее
межмолекулярное взаимодействие между РБ и ГП-βЦД зарегистрировано в кислой области рН. Условная
константа равновесия для реакции взаимодействия
РБ и ГП-β-ЦД составила 60,5 (рН 4,7).
Pǰǧǧ Ǥǟ ƵǤ
8,95
8,90
8,85
8,80
8,75
8,70
8,65
8,60
-2,95
35
-3,00
-3,05
-4,50
-4,55
-4,60
0,00
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
0,07
ǤƶǂEljƷǟƿ
Рис. 2. Влияние концентрации ГП-β-ЦД на
эффективную подвижность РБ (▲ – рН 4,7; ● – рН 7,4; ■ –
рН 9,18)
Аншакова Анастасия Владимировна аспирант кафедры физической химии РХТУ им. Д. И. Менделеева,
м.н.с. ООО «НПК «Наносистема», Россия, Москва
Ермоленко Юлия Валерьевна, к.х.н., доцент кафедры аналитической химии РХТУ им. Д.И. Менделеева
Каменцев Михаил Ярославович к.х.н., доцент кафедры аналитической химии, Институт химии СПбГУ
Россия, Санкт-Петербург
Конюхов Валерий Юрьевич профессор, д.х.н., заведующий кафедры физической химии РХТУ им. Д. И.
Менделеева, Россия, Москва
Максименко Ольга Олеговна к.х.н., гл.н.с. ООО «НПК «Наносистема», Россия, Москва
Гельперина Светлана Эммануиловна д.х.н., директор по науке ООО «НПК «Наносистема», Россия, Москва
Литература
1. Colton I.J. Affinity capillary electrophoresis: A physical-organic tool for studying interaction in
biomolecular recognition / Colton I.J., Carbeck J.D., Rao J. // Electrophoresis. 1998. № 19. P. 367-368.
2. European Pharmacopoeia 6th edition - Nördlingen (Germany), 2007.
3. Гельперина С.Э., Максименко О.О., Ванчугова Л.В., Бабий В.Е., Игнатьев А.В./ Патент ЕАПО (заявка
№201001640/28).
4. Аншакова А.В. Молекулярные взаимодействия в растворах рифабутин – 2-гидроксипропил-βциклодекстрин – вода по данным растворимости (1) / Аншакова А.В., Ермоленко Ю.В., Конюхов
В.Ю., Польшаков В.И., Максименко О.О., Гельпеина С.Э. // Журнал физической химии. − 2015. −
№5. − C. 241–245.
5. Vostrikov V. V. Distribution coefficient of rifabutin in liposome / water system as measured by different
methods / Vostrikov V. V., Selishcheva A. A., Sorokoumova G. M. // European Journal of Pharmaceutics
and Biopharmaceutics. −2008. − Vol. 68. −№ 2. −P. 400-405.
Anshakova Anastasia*,**, Ermolenko Yulia*, Kamentsev Mikhail***, Konjukhov Valeriyi*, Мaksimenko
Olga**, Gelperina Svetlana**
*
D.I. Mendeleev University of Chemical Technology ofRussia, Moscow, Russia
**
Nanosystem LTD, Moscow, Russia
***
Saint Petersburg State University, Saint Petersburg, Russia
e-mail: [email protected]
INVESTIGATION
OF
RIFABUTIN
–
HYDROXYPROPYL-β-CYCLODEXTRIN
INTERMOLECULAR INTERACTIONBY AFFINITY CAPILLARY ELECTROPHORESIS
Abstract
Influence of pH on ionic state of rifabutin (RB), its electrophoretic mobility, and interaction with hydroxypropyl-βcyclodextrin (HP-β-CD) in the aqueous media was evaluated using affinity capillary electrophoresis. It was shown that this
interaction was most effective at the acidic condition. Moreover, in the acidic medium the electrophoretic mobility of RB
was shown to be a function of HP-β-CD concentration. The apparent stability constant of the intermolecular interaction in
the RB - (HP-β-CD) system at pH 4.7 (0.05 M acetate buffer) was K1:1=60,5 (lgK1:1=1,78).
Keywords: rifabutin; hydroxypropyl-β-cyclodextrin; intermolecular interaction; affinity capillary electrophoresis.
24