ХИМИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ЖИЗНИ
реклама
Федеральное агентство по образованию Московская государственная академия тонкой химической технологии им. М.В.Ломоносова Кафедра органической химии Борисова Е.Я., Колобова Т.П., Борисова Н.Ю. ХИМИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ЖИЗНИ (часть 1) Учебное пособие 2007 1 ББК 28.072. УДК 577.1 Борисова Е.Я., Колобова Т.П., Борисова Н.Ю. Химические основы жизни Учебное пособие М. МИТХТ им. М.В.Ломоносова, 2007 Утверждено библиотечно-издательской комиссией МИТХТ им. М.В.Ломоносова в качестве учебного пособия. Поз. № 129 /2007 Данное учебное пособие является дополнением к существующим учебникам по химическим основам жизни и биохимии. Оно отражает читаемый курс лекций для студентов 4 курса по дисциплинам «Основы биохимии» и «Химические основы жизни». В нем отражено современное состояние развития биохимии и учитываются задачи преподавания ее для подготовки бакалавра. Основы биохимии являются обязательной дисциплиной по направлениям бакалавриата «Химическая технология и биотехнология» № 550800 и бакалавриата «Химия» № 510500 и важным звеном в системе базовых дисциплин химического профиля, обеспечивающих профессиональную подготовку будущего специалиста. Основной целью пособия является формирование системных знаний по строению, химическим свойствам и метаболизму белков, нуклеиновых кислот, углеводов, липидов и биологически активных соединений. Рецензент: доц., к.х.н. Харитонова О.В. © МИТХТ им. М. В. Ломоносова, 2007 2 СОДЕРЖАНИЕ стр. 1. Введение. Молекулярная логика живой материи ……………………..4 1.1. Отличительные особенности живой материи ………………………..4 1.2. Обмен веществ. Метаболизм. Катаболические и анаболические пути метаболизма ……………………………………………..10 1.3. Классификация живых организмов……… ..……….14 1.4. Источники энергии и ее превращение в живой клетке …….… .16 2. Клетка ……………………………………………………….…………...18 2.1. Типы клеток …………………………………………………….……..18 2.2. Главные элементы клетки и их роль в жизнедеятельности организмов …………………………………………………………….19 2.3. Рост и деление клеток ………………………………………………...27 3. Белки ……………………………………………………………………..28 3.1. -Аминокислоты ……………………………………………………...29 3.1.1. Классификация -аминокислот…………………………………….29 3.1.2. Физические свойства -аминокислот……………………………...32 3.1.3 Синтез -аминокислот……………………………………………….34 3.1.4. Разделение рацемических -аминокислот………………………....37 3.1.5. Химические свойства -аминокислот……………………………...38 3.2. Пептиды, белки………………………………………………………...55 3.2.1. Синтез пептидов……………………………………………………..56 3.2.2. Пространственное строение полипептидов и белков…………..…58 3.2.2.1. Строение пептидной группы……………………………………...58 3.2.3. Первичная структура………………………………………………...61 3.2.3.1. Состав и аминокислотная последовательность……………….…61 3.2.4. Вторичная структура белка…………………………………………65 3.2.5. Третичная структура белка………………………………………….69 3.2.6. Четвертичная структура белка……………………………………...71 3.2.7. Классификация белков………………………………………………73 3.2.8. Физико-химические свойства белков………………………………77 3 1. МОЛЕКУЛЯРНАЯ ЛОГИКА ЖИВОЙ МАТЕРИИ 1.1. Отличительные особенности живой материи Под понятием «жизнь» большинство ученых подразумевает процесс существования сложных систем, состоящих из больших органических молекул, способных самовоспроизводиться и поддерживать свое существование в результате обмена энергией и веществом с окружающей средой. Все живые организмы построены из молекул. Если эти молекулы выделить и изучать в изолированном состоянии, то оказывается, что они подчиняются всем физическим и химическим законам, определяющим поведение неживого вещества. Тем не менее, живые организмы обладают необычными свойствами, отсутствующими в скоплениях неживой материи: 1. Неживая среда (почва, вода, горные породы) обычно представляет собой неупорядоченные смеси относительно простых химических соединений, характеризующиеся весьма слабо выраженной структурной организацией. Для живых организмов сложность строения и высокий уровень организации. 2. Каждая составная часть живого организма имеет специальное назначение и выполняет строго определенную функцию. Это справедливо не только для внутриклеточных структур (например, ядро или клеточная мембрана), но и для индивидуальных химических компонентов клетки – липидов, белков и нуклеиновых кислот. Поэтому, в случае живых организмов вполне уместен вопрос о функции каждой молекулы. В то же время такой вопрос применительно к молекулам, образующим неживые вещества, был бы неуместен и попросту бессмыслен. 3. Важной особенностью живых организмов является их способность извлекать из окружающей среды и преобразовывать энергию, которая расходуется на построение и поддержание характерной для живого сложной структурной организации, причем в качестве сырья используются простые исходные материалы. Неживая материя не обладает подобной способностью использовать внешнюю энергию для поддержания собственной структуры. Напротив, когда неживая система поглощает внешнюю энергию, например свет или тепло, она, как правило, переходит в состояние, характеризующееся меньшей степенью упорядоченности. 4. Самое поразительное свойство живых организмов – это их способность к точному самовоспроизведению, т.е. к производству на протяжении 4 многих поколений форм, сходных по массе, размеру и внутренней структуре. По своему химическому составу живые организмы сильно отличаются от окружающей среды, в которой они живут. В живых организмах, составляющих биомассу Земли, обнаружено свыше 60 химических элементов. Среди них условно выделяют группу элементов, встречающихся в составе любого организма, независимо от видовой принадлежности и уровня организации последнего. К их числу относят C, N, H, O, S, P, Na, K, Ca, Mg, Zn, Fe, Mn, Cu, Co, Mo, B, V, I и Cl. Первые шесть элементов, получивших название органогенов, играют исключительную роль в биосистемах, так как из них построены важнейшие соединения, составляющие основу живой материи – белки, нуклеиновые кислоты, углеводы, липиды и др. Общая массовая доля этих элементов в организме человека составляет 97,3 %. Из них: С – 21,0; Н – 9,7; О – 62,4; N – 3,1; Р – 0,95 и S – 0,16 %. В неживой материи эти элементы распространены гораздо меньше. В атмосфере и в земной коре они встречаются только в виде простых, стабильных и бедных энергией неорганических соединений, таких, например, как диоксид углерода, молекулярный азот, карбонаты и нитраты. Последующие десять элементов называют «металлами жизни» – они очень важны для поддержания структуры и функциональной активности биополимеров. На их долю в организме приходится 2,4 %. Все «металлы жизни» в живых организмах находятся в виде свободных катионов или являются ионами-комплексообразователями, связанными с биолигандами. В виде свободных катионов находятся только натрий и калий, катионы кальция и магния встречаются как в свободном, так и в связанном состояниях (в виде комплексов или водонерастворимых соединений). Катионы остальных «металлов жизни» в основном входят в состав биокомплексов организма, устойчивость которых варьируется в широких пределах. Остальные элементы, обнаруженные в биомассе, встречаются в живой природе не столь систематически, а биологическое значение их во многих случаях еще не выяснено. Органогены играют важную роль в явлениях жизни благодаря комплексу особых качеств. Для органогенов характерно исключительное разнообразие образуемых ими химических связей, что определяет многообразие биомолекул в живых организмах. Вследствие этого, углерод, например, превосходит кремний в отношении числа и разнообразия возможных соединений, обладающих уникальными свойствами. Второе качество заключается в том, что атомы упомянутых элементов, отличаясь малыми размерами, образуют относительно плотные молекулы с минимальными межатомными расстояниями. Такие молекулы более устойчивы к действию тех или иных химических 5 агентов. И, наконец, третье качество присуще в основном P и S, и лишь в небольшой мере N и сводится к возникновению на базе указанных элементов специфических соединений, при расщеплении которых выделяется повышенное количество энергии, используемое для процессов жизнедеятельности. И наконец, органогены образуют, в основном, водорастворимые соединения, что способствует их концентрированию в живых организмах, содержащих более 60 % воды. По количественному содержанию в живом веществе элементы делят на три категории: макроэлементы, концентрация которых превышает 0,001 % (O, C, H, Ca, N, P, S, Mg, Na, Cl, Fe), микроэлементы, доля которых составляет от 0,001 до 0,000001 % (Mn, Zn, Cu, B, Mo, Co и многие другие) и ультрамикроэлементы, содержание котрых не превышает 0,000001 % (Hg, Au, U, Ra и др.). Из макроэлементов в наибольшем количестве в биомассе содержатся О, С, N и Ca. Из них только О и Са широко представлены в земной коре. Многие элементы, содержащиеся в литосфере в значительном количестве (Si, Al, Fe и др), в органическом мире встречаются сравнительно в невысоких концентрациях. Главная функция макроэлементов состоит в построении тканей и в поддержании осмотического, водно-электролитного, кислотно-основного, окислительно-восстановительного и металло-лигандного гомеостаза, то есть поддержании нормального постоянного внутреннего состояния организма. Микроэлементы входят в состав ферментов, гормонов, витаминов и других биологически активных соединений, в основном в качестве комплексообразователей или активаторов обмена веществ. Микроэлементы неравномерно распределяются между тканями и органами. Большинство микроэлементов в максимальных концентрациях содержатся в ткани печени, поэтому печень рассматривается как депо для микроэлементов. Некоторые микроэлементы проявляют особое сродство к определенным тканям. Например, повышенное содержание йода наблюдается в щитовидной железе, фтора – в эмали зубов, цинка – в поджелудочной железе, молибдена в почках, бария – в сетчатке глаза, стронция – в костях, а марганца, брома, хрома – в гипофизе. Количественное содержание микроэлементов в организме человека подвержено значительным колебаниям и зависит от ряда условий: возраста, пола, времени года и суток, условий труда и т.д. Изменения в распределении микроэлементов между тканями организма могут служить диагностическим тестом и прогнозом того или иного заболевания, а также могут использоваться в судебно-медицинской экспертизе. При нормальном протекании физиологических процессов в организме поддерживается определенный уровень насыщения тканей микроэлементами, т.е. микроэлементный гомеостаз. В поддержании 6 оптимального уровня микроэлементов в организме участвуют гормоны. Содержание микроэлементов ниже или выше этого уровня приводит к серьезным последствиям для здоровья человека. Между элементным составом живых организмов и окружающей средой прослеживаются определенные взаимосвязи, указывающие на единство живой и неживой природы. Так, например, те элементы, которые легко образуют водорастворимые и газообразные соединения, составляют основную массу биосферы (C, N, P, S), хотя в земной коре их содержание относительно невелико. Элементы, которые не дают водорастворимых соединений, широко распространены в неорганической природе, а в составе организмов встречаются в незначительных количествах (Si, Fe, Al). Установлена определенная зависимость между биологической ролью элементов и их местом в периодической системе Менделеева: количественное содержание химических элементов в организме обратно пропорционально их порядковым номерам. Органический мир построен главным образом из легких элементов. В подавляющем большинстве случаев при переходе от легких элементов к тяжелым в пределах одной и той же подгруппы возрастает токсичность элементов и параллельно этому падает их содержание в живых организмах (Zn, Cd, Hg). Элементы некоторых подгрупп взаимозаменяют друг друга в биологических объектах (Ca, Sr, Ba). Таким образом, решающее значение в использовании организмами тех или иных химических элементов связано с их доступностью для организмов в окружающей среде, а также способностью организмов избирательно поглощать и концентрировать их. С точки зрения химии естественный отбор элементов сводится к отбору таких элементов, которые способны к образованию, с одной стороны достаточно прочных, а с другой стороны – лабильных химических связей. Как уже указывалось выше, многочисленные макро- и микроэлементы, образующие живую материю, присутствуют в последней в виде разнообразных химических соединений. Большинство химических компонентов живых организмов представляют собой органические соединения, в которых углерод и азот находятся в гидрированной форме. Все органические биомолекулы в конечном счете происходят из очень простых низкомолекулярных предшественников, получаемых из внешней среды, а именно из СО2, воды и атмосферного азота. Эти предшественники последовательно превращаются через ряд промежуточных продуктов в биомолекулы все большей молекулярной массы, играющие роль строительных блоков, т.е. в органические соединения среднего молекулярного веса. 7 В дальнейшем эти строительные блоки связываются друг с другом ковалентными связями, образуя макромолекулы, обладающие относительно высокой молекулярной массой. Например, аминокислоты – это строительные блоки, из которых образуются белки; мононуклеотиды служат строительными блоками нуклеиновых кислот, моносахариды – строительными блоками полисахаридов, а жирные кислоты – строительными блоками большинства липидов. Немногочисленные простые молекулы, играющие роль строительных блоков макромолекул, имеют еще одну замечательную особенность. Все они обычно выполняют в клетках несколько функций. Так, аминокислоты служат не только строительными блоками белковых молекул, но также предшественниками гормонов, алкалоидов, порфинов, пигментов и многих других биомолекул, а мононуклеотиды используются не только как строительные блоки нуклеиновых кислот, но также как коферменты и вещества-аккумуляторы энергии. Поэтому представляется вполне вероятным, что биомолекулы, играющие роль строительных блоков, отбирались в процессе эволюции по своей способности выполнять не одну, а несколько функций. Живые организмы в обычном состоянии не содержат нефункционирующих соединений, хотя существуют биомолекулы, функции которых пока неизвестны. На следующем, более высоком уровне организации макромолекулы, относящиеся к различным группам, объединяются друг с другом, образуя надмолекулярные комплексы. Например, липопротеиды представляют собой комплексы липидов и белков, или рибосомы – комплексы нуклеиновых кислот и белков. В надмолекулярных комплексах, составляющие их макромолекулы не связываются друг с другом с помощью ковалентных связей; они «удерживаются вместе» при помощи слабых нековалентных сил – ионных взаимодействий, водородных связей, гидрофобных взаимодействий и вандервальсовых сил. Тем не менее, нековалентное связывание макромолекул в надмолекулярные комплексы очень специфично и, как правило, весьма стабильно вследствие тщательной геометрической «подгонки» или комплементарности отдельных частей комплекса. На высшем уровне организации в иерархии клеточной структуры различные надмолекулярные комплексы объединяются в органелы (ядра, митохондрии, хлоропласты) или в другие тельца и включения (лизосомы, микротельца и вакуоли). Установлено, что различные компоненты всех этих структур также объединяются в основном, при помощи нековалентных взаимодействий. Из всех макромолекул в живых организмах чаще встречаются белки, причем это справедливо для всех типов клеток. Оказалось, что все четыре основных типа биологических макромолекул встречаются в разных 8 клетках приблизительно в одних и тех же пропорциях, если не считать «неживые» части живых организмов – наружный скелет, минеральные компоненты кости, внеклеточные образования (волосы, перья), а также инертные запасные вещества, например крахмал и жир. Функции четырех главных классов биомакромолекул во всех клетках также оказались идентичными. Так, универсальная функция нуклеиновых кислот состоит в хранении и передаче генетической информации. Белки являются непосредственными продуктами, а также «реализаторами» действия генов, в которых заключена генетическая информация. Большинство белков наделено специфической каталитической активностью и функционирует в качестве ферментов; остальные белки служат структурными элементами. Полисахариды выполняют две основные функции. Некоторые из них (например крахмал) служат формой, в которой хранится «горючее», необходимое для жизнедеятельности клетки, а другие (например целлюлоза) образуют внеклеточные структурные компоненты. Что касается липидов, то они служат, во-первых, главными структурными компонентами мембран и, вовторых, запасной формой богатого энергией «горючего». Из всего сказанного становится ясным, что при всей сложности молекулярной организации клетки для нее характерна изначальная простота, так как тысячи ее различных макромолекул построены из немногочисленных типов простых молекул – строительных блоков. Очевидно, что постоянство каждого вида организмов сохраняется благодаря наличию лишь ему свойственного набора нуклеиновых кислот и белков. Под функциональным многообразием молекул, являющихся строительными блоками, кроется принцип молекуклярной экономии. Вероятно, живые клетки содержат наименьшее число типов наипростейших из всех возможных молекул, достаточное для того, чтобы обеспечить свойственную им форму существования в определенных условиях среды, т.е. видовую специфичность. Основными типами соединений, входящих в состав живых организмов, являются: белки, нуклеиновые кислоты, углеводы, липиды (жиры и жироподобные вещества), вода, минеральные соли. Кроме них в составе организмов найдены в незначительных количествах углеводороды, спирты, карбоновые кислоты, кетокислоты, аминокислоты, амины, альдегиды, кетоны и другие соединения. У некоторых видов животных, растений и микроорганизмов такие вещества накапливаются в значительных количествах и могут служить систематическим признаком. Только в растениях обнаружены эфирные масла, алкалоиды, дубильные вещества. Для регуляции обмена веществ во всех живых организмах присутствуют в небольших количествах гормоны, ферменты, витамины, антибиотики. Многие из упомянутых 9 соединений обладают мощным физиологическим действием и выполняют роль ускорителей или замедлителей жизненных процессов. Их иногда объединяют под названием биологически активных соединений, хотя химически они очень разнообразны. Среди соединений, входящих в состав организмов, принято выделять пластические и энергетические вещества. Пластические вещества служат строительным материалом при формировании внутриклеточных структур, клеток и тканей. Это главным образом белки, нуклеиновые кислоты, некоторые виды липидов и высокомолекулярных углеводов. Энергетические вещества выполняют роль поставщиков энергии для процессов жизнедеятельности. К ним относятся низкомолекулярные (углеводы) и некоторые высокомолекулярные (гликоген, крахмал) углеводы и отдельные группы липидов (в основном жиры). 1.2. ОБМЕН ВЕЩЕСТВ. МЕТАБОЛИЗМ. Катаболические и анаболические пути метаболизма Совокупность превращений веществ в процессе жизнедеятельности, отражающая взаимосвязь организма с внешней средой, называется метаболизмом или обменом веществ. Обмен веществ представляет собой сложный ансамбль многочисленных, тесно связанных друг с другом биохимических процессов (окисления, восстановления, расщепления, объединения молекул, межмолекулярный перенос групп и т.д.), соединяющий в единую систему представителей всех классов Метаболизм биологически активных природных соединений. представляет собой высоко интегрированный и целенаправленный процесс, в котором участвует целый ряд мультиферментных систем. Ведущая роль в этих превращениях принадлежит белкам. Благодаря каталитической функции белков-ферментов осуществляются процессы распада и биосинтеза. С помощью нуклеиновых кислот создается видовая специфичность при биосинтезе важнейших биополимеров. В результате метаболизма углеводов и липидов постоянно возобновляются запасы АТФ (аденозинтрифосфата) (рис 1.1) – универсального донора энергии для химических преобразований. Вещества, образующиеся в клетках, тканях и органах растений и животных в процессе метаболизма, называются метаболитами. Метаболиты являются естественными, присущими организму веществами. Вещества природного и синтетического происхождения, близкие по строению к метаболитам и вступающие с ними в конкуренцию в биохимических процессах называются антиметаболитами. 10 H2N N N O N N O O O CH2-O-P-O-P-O-P-OH OH OH OH H OH OH Рис.1.1. Аденозинтрифосфорная кислота (АТФ) Метаболизм выполняет четыре специфические функции: а) извлечение энергии из окружающей среды (в форме химической энергии органических веществ или в форме энергии солнечного света); б) превращение экзогенных веществ в «строительные блоки», т.е. предшественники макромолекулярных компонентов клетки; в) сборку белков, нуклеиновых кислот, жиров и других клеточных компонентов из этих строительных блоков; г) разрушение тех биомолекул, которые «отработали» и перестали быть необходимыми для выполнения различных специфических функций данной клетки. Взаимосвязь и взаимообусловленность биохимических превращений, возможность переходов от одного класса органических соединений к другому являются характерными чертами обмена веществ. Общий ход биохимических процессов в организме, регулируемый внутренними и внешними факторами, представляет собой единое неразрывное целое, а организм является саморегулирующейся системой, которая поддерживает свое существование с помощью обмена веществ. Обмен веществ (метаболизм) живой клетки складывается в основном из двух потоков реакций: катаболические и анаболические. Последовательности метаболических реакций сходны у всех живых форм. Катаболические пути (катаболизм) – это процессы деградации, диссимиляции. Это ферментативное расщепление сравнительно крупных пищевых молекул (углеводов, жиров и белков), которое осуществляется преимущественно за счет реакций окисления. В ходе окисления крупные молекулы расщепляются до более мелких молекул. При этом происходит выделение свободной энергии, которая запасается в форме энергии фосфатных связей аденозинтрифосфата (АТФ). Запасенная энергия способна затем использоваться в процессах жизнедеятельности. Катаболизм большинства питательных веществ включает три главные стадии. На первой стадии высокомолекулярные компоненты расщепляются на составляющие их строительные блоки. Белки, например, расщепляются до аминокислот, полисахариды – до гексоз или пентоз, липиды – до жирных кислот, глицирина и других компонентов. 11 На второй стадии (начальная стадия промежуточного обмена) большое число продуктов, образовавшихся на первой стадии, превращаются в более простые молекулы, число типов которых сравнительно невелико. Так, гексозы, пентозы и глицерин, разрушаясь, превращаются сначала в глицеральдегид-3-фосфат, а затем расщепляются далее до ацетильной группы, входящей в состав кофермента ацетил-коэнзима А (ацетил-КоА) – небелковой составляющей сложного фермента, отвечающего за катализ. NH2 N O CH3 OH N CH3-C-S-(CH2CH2NH-CO)2-CH-C-CH2-(O-P)2-O-CH2 HO CH3 O H H Ацетил-коэнзим А O O P OH O N N H H H OH Двадцать различных аминокислот также дают при расщеплении лишь несколько конечных продуктов, а именно ацетил-КоА, -кетоглутаровой, янтарной, фумаровой и щавелевоуксусной кислот. На третьей стадии (конечная фаза промежуточного обмена) продукты, образовавшиеся на второй стадии, окисляются до диоксида углерода и воды. Анаболические пути (анаболизм) – это процессы синтеза, ассимиляции. Это ферментативный синтез сравнительно крупных клеточных компонентов (например, полисахаридов, нуклеиновых кислот, белков или жиров) из простых предшественников. В связи с тем, что анаболические процессы ведут к увеличению размеров молекул и к усложнению их структуры, эти процессы связаны с уменьшением энтропии и потреблением свободной энергии, которая поставляется в форме энергии фосфатных связей АТФ. Анаболизм также состоит из трех стадий, причем соединения, образовавшиеся на третьей стадии катаболизма, являются исходными веществами в процессе анаболизма. То есть третья стадия катаболизма является в то же время первой, исходной, стадией анаболизма. Синтез белка, например, начинается на этой стадии с -кетокислот, являющихся предшественниками -аминокислот. На второй стадии анаболизма кетокислоты аминируются другими аминокислотами до необходимых в настоящее время для организма -аминокислот, а на третьей, 12 заключительной, стадии аминокислоты объединяются и образуют пептидные цепи, состоящие из большого числа различных аминокислот. Пути катаболизма и анаболизма обычно не совпадают. Известно, например, что в процессе расщепления гликогена до молочной кислоты принимают участие 12 ферментов, каждый из которых катализирует отдельный этап этого процесса. Соответствующий анаболический процесс, т.е. синтез гликогена из молочной кислоты, использует только 9 ферментативных этапов синтеза, представляющих собой обращение соответствующих этапов катаболизма; 3 недостающих этапа заменены совершенно иными ферментативными реакциями, которые используются только для биосинтеза. Несмотря на то, что катаболический и анаболический пути неидентичны, их связывает общая третья стадия - так называемые центральные или амфиболические пути (от греч. «амфи» – оба). И катаболизм, и анаболизм слагаются из двух одновременно протекающих и взаимосвязанных процессов, каждый из которых можно рассматривать отдельно. Один из них – это та последовательность ферментативных реакций, в результате которой происходит соответственно разрушение или синтез ковалентного остова данной биомолекулы. При этом образуются метаболиты. Вся цепь превращений объединяется под названием промежуточного метаболизма. Второй процесс – это превращения энергии, сопутствующие каждой из ферментативных реакций промежуточного метаболизма. На некоторых этапах катаболизма химическая энергия метаболитов запасается (обычно в форме энергии фосфатных связей), а на определенных этапах анаболизма она расходуется. Эту сторону метаболизма принято называть сопряжением энергии. Промежуточный метаболизм и сопряжение энергии – взаимосвязанные и взаимозависимые понятия. Связь анаболизма и катаболизма осуществляется на трех уровнях: 1. на уровне источников энергии (продукты катаболизма могут быть исходными субстратами анаболических реакций); 2. на энергетическом уровне ( при катаболизме образуется АТФ и другие высокоэнергетические соединения; анаболические процессы потребляют их); 3. на уровне восстановительных эквивалентов (реакции катаболизма – окислительные, анаболизма – восстановительные) Специфичным для обмена веществ живого организма является скоординированность реакций во времени и пространстве, которая направлена на достижение одной цели – самовозобновление, самосохранение живой системы (организма, клетки). Отдельные биохимические процессы локализованы в определенных участках клетки. Многочисленные мембраны делят клетку на отделы – 13 компартменты. В клетке одновременно, не мешая, друг другу, вследствие пространственного разделения (компартаментализации) идут разнообразные биохимические реакции, часто противоположного характера. Так, например, окисление жирных кислот до ацетата катализируется набором ферментов, локализованных в митохондриях, тогда как синтез жирных кислот из ацетата осуществляется с помощью другого набора ферментов, локализованных в цитоплазме. Благодаря разной локализации соответствующие катаболические и анаболические процессы могут протекать в клетке одновременно и независимо друг от друга. Это – пространственная скоординированность биохимических реакций. Важна координация во времени. Отдельные биохимические процессы протекают в строго определенной временной последовательности, образуя длинные цепи взаимосвязанных реакций. Гликолиз углеводов протекает в 11 стадий, строго следующих одна за другой. При этом предыдущая стадия создает условия для осуществления последующей. К тому же живой организм – саморегулирующаяся открытая стационарная система. Открытая система потому, что в организме постоянно и непрерывно происходит обмен питательными веществами и энергией с внешней средой. При этом скорость переноса веществ и энергии из среды в систему точно соответствует скорости переноса веществ и энергии из системы, то есть, это – стационарная система. Отсюда характерный для живого организма гомеостаз – постоянство состава внутренней среды организма, устойчивость и стабильность биохимических параметров. Например, рН крови = 7.40 0.05, содержание глюкозы около 5 мМ л ( 90 мг/ 100 мл). Если меняются условия среды, то меняется скорость отдельных реакций в организме и, соответственно, меняются стационарные концентрации веществ. Тогда вступают в действие чувствительные механизмы живой клетки, которые выявляют сдвиги концентраций и компенсируют их, возвращают к норме. Происходит саморегуляция. Таким образом, постоянство биохимических параметров живого организма не статическое, пассивное, а динамическое. 1.3. КЛАССИФИКАЦИЯ ЖИВЫХ ОРГАНИЗМОВ Клетки всех организмов, обитающих на Земле, в зависимости от источников используемого для жизнедеятельности углерода, делят на две основные группы: автотрофные («сами себя питающие») и гетеротрофные («питающиеся за счет других») организмы. Клетки автотрофных организмов могут использовать в качестве единственного источника углерода СО2, из которого они способны строить все свои 14 углеродсодержащие компоненты. Клетки гетеротрофных организмов не способны усваивать СО2 и должны получать углерод в виде достаточно сложных восстановленных органических соединений, таких, как глюкоза. Автотрофы способны к независимому существованию, тогда, как гетеротрофы с их потребностью в определенных формах углеродных соединений должны использовать продукты жизнедеятельности других организмов. Все фотосинтезирующие организмы и некоторые бактерии ведут автотрофный образ жизни; высшие животные и большинство микроорганизмов – гетеротрофы. Второй признак, на основе которого классифицируются организмы, - это их отношение к источникам энергии. Организмы, чьи клетки, используют в качестве источника энергии свет, называются фототрофными, а организмы, клетки которых получают энергию в результате окислительновосстановительных реакций, - хемотрофными. Обе эти категории в свою очередь подразделяются на группы в зависимости от природы доноров электронов, которые они используют для получения энергии. Хемотрофы, у которых донорами электронов могут служить только сложные органические молекулы (например, глюкоза), называются хемоорганотрофными. Организмы, способные использовать в качестве доноров электронов молекулярный водород, серу или какие-либо простые неорганические соединения, такие, как сероводород и аммиак, относятся к хемолитотрофам (от греч. «литос»камень). Подавляющее большинство организмов относится либо к фотолитотрофам, либо к хемоорганотрофам. Две другие группы охватывают сравнительно немного видов. Однако эти немногие виды распространены в природе достаточно широко. Некоторые из них играют в биосфере исключительно важную роль. Таковы, в частности, почвенные микроорганизмы, которые фиксируют молекулярный азот и окисляют аммиак до нитратов. Хемоорганотрофы, чаще называемые гетеротрофами, в свою очередь подразделяются на два больших класса: аэробы и анаэробы. В то время как аэробы используют в качестве конечного акцептора электронов молекулярный кислород, анаэробы – какие-нибудь другие вещества. Многие клетки могут существовать как в аэробных, так и в анаэробных условиях, т.е. могут использовать в качестве акцептора электронов либо кислород, либо органические вещества. Такие клетки называются факультативными анаэробами. Большинство гетеротрофных клеток, в особенности клетки высших организмов, - факультативные анаэробы; при наличии кислорода они используют именно его. Все живые организмы в природе так или иначе связаны друг с другом в смысле питания. Рассматривая биосферу в целом, можно заметить, что 15 фотосинтезирующие и гетеротрофные клетки взаимно питают друг друга. Первые образуют из атмосферного диоксида углерода органические вещества, например глюкозу, и выделяют при этом кислород; вторые используют кислород и глюкозу, образуемые фотосинтезирующими клетками, и вновь возвращают СО2 в атмосферу. Круговорот углерода в биосфере связан с энергетическим циклом. Солнечная энергия, трансформированная в процессе фотосинтеза в химическую энергию глюкозы и других продуктов фотовосстановления, используется гетеротрофами для удовлетворения их энергетических потребностей. Таким образом, солнечный свет является, в конечном счете, источником энергии для всех клеток, как автотрофных, так и гетеротрофных. Взаимная зависимость всех живых организмов в природе в отношении питания носит название синтрофии. 1.4. ИСТОЧНИКИ ЭНЕРГИИ И ее ПРЕВРАЩЕНИЕ В ЖИВОЙ КЛЕТКЕ Биохимические реакции обычно происходят при изобарноизотермических условиях. В этих условиях энергетическое состояние системы характеризуется энтальпией, а мерой неупорядоченности системы является произведение энтропии и температуры этой системы. Функцией, учитывающей обе эти характеристики и тенденции их изменения при самопроизвольных процессах, является энергия Гиббса G, которую называют также изобарно-изотермическим потенциалом или свободной энергией: G = H - TS Подобно другим термодинамическим параметрам и функциям, характеризующим состояние системы, изменение энергии Гиббса в результате любого процесса определяется только конечным и начальным состоянием системы, независимо от пути процесса: Gр = Gкон Gнач Биохимические реакции, сопровождающиеся уменьшением энергии Гиббса (Gр 0), называют экзэргоническими реакциями, они могут совершаться самопроизвольно и необратимо. Чем больше значение энергии Гиббса биохимической системы в начальном состоянии (Gнач) по сравнению с ее значением в конечном состоянии (Gкон), тем больше химическое сродство между реагентами в рассматриваемой системе, т.е. их реакционная способность. Биохимические реакции, сопровождающиеся увеличением энергии Гиббса, называются эндэргоническими (Gр 0), и они невозможны без внешнего подвода энергии. Для протекания подобных реакций необходим постоянный подвод энергии. 16 В живых системах эндергонические реакции происходят за счет их сопряжения с экзэргоническими реакциями. Такое сопряжение возможно только в том случае, если обе реакции имеют какое-либо общее промежуточное соединение и на всех стадиях сопряженных реакций суммарный процесс характеризуется отрицательным значением энергии Гиббса (Gсопр.р 0). Гетеротрофные клетки получают необходимую энергию в основном за счет окисления продуктов питания, а для автотрофных (прототрофных) клеток источником энергии часто является солнечный свет. Полученная энергия переводится теми или иными клетками с довольно хорошим КПД (40%) в химическую энергию за счет синтеза в них (АТФ). Это соединение, как уже отмечалось ранее, выполняет функцию аккумулятора энергии, так как при его взаимодействии с водой, т.е. гидролизе, образуются аденозиндифосфорная (АДФ) и фосфорная (Ф) кислоты и выделяется энергия. АТФ + Н2О АТФ + 2Н2О АДФ + Ф O GP = -30,5 кДж / моль АМФ + Ф + Ф GO = -61,0 кДж / моль P Поэтому АТФ называется макроэргическим соединением, а разрывающаяся при гидролизе связь Р-О-Р – макроэргической. Как известно, разрыв любой связи (в том числе и макроэргической) всегда требует затраты энергии. В случае же гидролиза АТФ кроме процесса разрыва связи между фосфатными группами, для которого G 0, происходят процессы гидратации, изомеризации и нейтрализации продуктов, образующихся при гидролизе. В результате всех этих процессов суммарное изменение энергии Гиббса имеет отрицательное значение. Следовательно, макроэргическим является не сам разрыв связи, а энергетический результат ее гидролиза. Следовательно, аденозинтрифосфат функционирует в клетках как промежуточный продукт, обеспечивающий организм энергией, необходимой для протекания жизненно важных эндэргонических процессов: синтеза метаболитов (химическая работа), сокращения мышц (механическая работа), переноса вещества через мембраны против градиента концентрации (активный транспорт) и передачи информации (в частности, для передачи нервных импульсов). Наряду с АТФ в живых организмах имеются другие эффективные макроэргические соединения, гидролиз которых сопровождается выделением большей энергии. С помощью этих соединений происходит синтез АТФ из АДФ. 17 Таким образом, внутренним источником энергии в живых системах являются фосфорилированные соединения, при взаимодействии которых с биосубстратами, включая воду, выделяется энергия. В результате сопряжения этих реакций с другими (эндэргоническими) обеспечивается протекание в клетке необходимых эндэргонических процессов. 2. КЛЕТКА 2.1. ТИПЫ КЛЕТОК Клетка – элементарная живая система, основа строения и жизнедеятельности всех живых организмов. В зависимости от типа клетки живые организмы подразделяют на два вида: прокариотические и эукариотические. К прокариотическим организмам относятся бактерии и цианобактерии, все остальные организмы – от одноклеточных простейших до многоклеточных растений и животных – эукариотические (Табл. 2.1.). Табл. 2.1. Сравнение прокариотических и эукариотических организмов. Прокариоты Эукариоты Организмы грибы растения животные эубактерии архебактерии Форма организма одно- или многоклеточные Органеллы, цитоскелет, аппарат клеточного деления присутствует, сложный, отсутствует специализированный ДНК маленькая, кольцевая, большая, в клеточных ядрах, нет интронов, плазмиды много интронов РНК: синтез и созревание простой, в цитоплазме сложный, в ядрах Белки: синтез и процессинг простой, сложный, связанный с синтезом РНК в цитоплазме и полости rER Обмен веществ анаэробный или аэробный, преимущественно аэробный легко перестраивающийся одноклеточные 18 нет Эндоцитоз и экзоцитоз различные формы Клетки организмов этих двух видов обладают общими основными свойствами: у них сходны основные системы обмена веществ, системы передачи генетической информации (репликация по матричному принципу), энергообеспечение и др. Но между ними и много различий. Во-первых, у прокариотических клеток молекулы ДНК, определяющие наследственные свойства организмов, не собраны в виде клеточного ядра, характерного для эукариотических клеток. Во-вторых, у прокариотических клеток нет многих специальных структур внутри клеток, так называемых клеточных органелл, характерных для эукариотических клеток. Эукариотические клетки более сложно организованы, они могут специализироваться в очень широких пределах и входить в состав многоклеточных организмов. По своей структуре и основным биохимическим свойствам разные клетки эукариотических организмов очень сходны, что говорит об единстве их происхождения на заре возникновения мира живого. 2.2. ГЛАВНЫЕ ЭЛЕМЕНТЫ КЛЕТКИ И ИХ РОЛЬ В ЖИЗНЕДЕЯТЕЛЬНОСТИ ОРГАНИЗМОВ Эукариотические клетки значительно разнообразнее по размеру и структуре, чем прокариотические. Только в организме человека имеются по крайней мере 200 различных типов клеток. Поэтому схему живой клетки можно дать только в предельно упрощенном виде. Эукариотическия клетка организована системой мембран. Снаружи она ограничена плазматической мембраной - тонкой, около 10 нм в толщину, белково-липидной пленкой. Внутренний объем клетки заполнен цитоплазмой, содержащей многочисленные растворимые компоненты. Цитоплазма разделена на хорошо различимые, окруженные внутриклеточными мембранами отделы, называемые клеточными органеллами. Клеточные органеллы возникли в процессе эволюции для поддержания главных свойств клетки – самовоспроизведения, постоянного обмена веществами и энергией с внешней средой, структурного обособления ее (клетки) от внешней среды. Клеточные органеллы обеспечивают координированное и регулируемое протекание основных реакционных процессов, необходимых для постоянного проявления жизненных функций. Для существования живого организма важны следующие клеточные органеллы: ядро, митохондрии, эндоплазматический ретикулум, рибосомы, лизосомы и микротельца (рис. 2.1.). 19 плазматическая мембрана аппарат Гольджи 6% 1 ядро 6% лизосома 1 1% шероховатый эндоплазмати ческий ретикулум 9% эндосома 1% 1 ~2000 цитоплазма пероксисома 1% 200 свободные рибосомы митохондрия 22% 300 54% 400 1 доля от объема клетки число на клетку └──────────10-30 мкм─────────┘ Рис. 2.1. Структура живой клетки. В середине клетки локализуется ядро, окруженное двойной мембраной с порами. Внутри ядра имеются ядрышки. Наружная мембрана ядра является частью эндоплазматического ретикулума, ассоциированного с комплексом Гольджи. Рибосомы расположены на поверхности эндоплазматического ретикулума. Овальные структуры, окруженные двойной мембраной, внутренняя часть которых образует кристы митохондрии. Лизосомы экружены одним мембранным слоем. Они содержат гидролитические ферменты, большинство из которых находится в неактивном состоянии в виде проферментов. В одноклеточных организмах они ответственны за переваривание веществ, попадающих в клетку. В высших организмах лизосомы участвуют в процессах деградации клеток, прекративших выполнять свои функции. Микросомы (пероксисомы) имеют меньший размер, нежели лизосомы. Они содержат оксидазы, катализирующие окисление соединений, которые являются чужеродными для клетки и поэтому должны быть выведены из нее (например, лекарства, ароматические соединения и т. д.). Клетка окружена плазматической мембраной, которая построена так, что в определенных местах появляется возможность прямого переноса соединений из внеклеточного пространства к ядру. Клеточные мембраны, не только отделяют живой организм (клетку) от окружающей среды, но участвуют в образовании определенных отсеков клетки (функциональных подразделений). Они служат структурным элементом всех клеточных 20 органелл и принимают участие в функционировании большинства из них. Масса мембран может достигать 80% массы клетки. Пространство между органеллами, заполненное коллоидной суспензией, богатой белками (ферментами), называется цитозолем. Плазматическая мембрана, окружающая содержимое клетки, цитоплазму и ядро со всех сторон, имеет очень важные свойства: она ограничивает свободное перемещение веществ из клетки наружу и наоборот, избирательно пропускает вещества и молекулы, поддерживая таким образом постоянство состава и свойств цитоплазмы клетки. В мембране содержатся важные ферменты и системы активного переноса ионов Na+ и K+. Кроме того, на плазматической мембране располагаются специальные белковые комплексы (рецепторы), которые «узнают» вещества, отбирают их и с помощью других белков (переносчиков) активно транспортируют внутрь клетки или наружу. Плазматическая мембрана образуется белками (периферическими и интегральными), погруженными в бислой липидов. Интегральные белки имеют гликопротеиновую природу, то есть состоят из углеводных и белковых компонентов. Их N-концевая часть входит в состав внутреннего фосфолипидного слоя, в который проникает часть пептидной цепи, богатой неполярными аминокислотами (в спиральной конформации), а их боковые цепи вступают в многочисленные гидрофобные контакты с алифатическими цепями фосфолипидов. Олигосахаридные цепи интегрального белка могут быть связаны с пептидной цепью интегрального белка на наружной поверхности плазматической мембраны. На конце олигосахаридной цепи обычно стоит N-ацетилнейраминовая кислота, которая обусловливает ее отрицательный заряд. Олигосахариды придают поверхности клетки особые свойства, позволяющие узнавать клетки того же органа или клетки другого вида (антигенность, контактное ингибирование). Олигосахариды на поверхности клетки образуют слой, называемый гликокаликсом. CH3CONH O COOH OH H H OH OH OH CH2OH N-ацетилнейраминовая кислота 21 Структуры, локализованные на поверхности клетки, препятствуют тесному контакту между клетками. Это приводит к тому, что между клетками появляется более или менее узкое пространство, заполненное жидкостью. Общее название таких мест в органе или организме - межклеточное пространство. Сумма всех объемов внутри клеток называется внутриклеточным пространством. Митохондрия. Чтобы клетки выполняли разнообразные функции, им необходима энергия. Важный внутренний источник энергии – молекулы АТФ, которые образуются, в основном, в специальных овальных структурах- митохондриях (от греческих слов mitos – нить и chondrion зернышко, крупинка). Энергия, требуемая для синтеза АТФ, появляется в результате постепенного окисления в дыхательной цепи водородсодержащих субстратов (сахаров, липидов, аминокислот) под действием кислорода. Ферменты, обеспечивающие перенос электронов, являются частью внутренней мембраны митохондрий. Кислород проникает в митохондрии за счет диффузии. Продукт деятельности митохондрий (АТФ) переносится за счет процессов транслокации из места его образования во внемитохондриальное пространство, где он и используется. Для того чтобы обеспечить быстрый перенос АТФ, митохондрии локализуются вблизи структур, где происходят процессы, идущие с потреблением энергии (например, вблизи элементов, участвующих в процессе сокращения). Кроме того, в митохондриях происходит еще целый ряд химических реакций, в результате которых синтезируются нужные клетке низкомолекулярные соединения. Митохондрии ограничены двумя мембранами. Наружная мембрана регулирует поступление веществ в митохондрию и их выведение из нее. Внутренняя мембрана образует складки (кристы), обращенные внутрь митохондрии. Внутри митохондрии находится так называемый матрикс, содержащий различные ферменты, ионы кальция и магния, ДНК и рибосомы митохондрий. Число митохондрий в клетке непостоянно. Увеличение их числа может происходить за счет роста и фрагментации исходной митохондрии. Для образования митохондрий клетка использует белки. Одни из них синтезируются в самих митохондриях, другие же – в цитоплазме. Ядро – важнейшая составная часть клетки эукариот, в которой сосредоточена основная масса генетического материала. Ядро необходимо для роста и размножения клеток. Оно отделено от остальной клетки оболочкой, состоящей из внутренней и внешней ядерных мембран. Если экспериментальным путем отделить от ядра основную часть цитоплазмы, то этот цитоплазматический комочек (цитопласт) может просуществовать без ядра лишь несколько суток. В то же самое время, 22 ядро, окруженное самым узким ободком цитоплазмы (кариопластом), полностью сохраняет свою жизнеспособность и постепенно восстанавливает нормальный объем цитоплазмы. Тем не менее, некоторые специальные клетки, например эритроциты млекопитающих, длительное время функционируют без ядра. Его лишены и тромбоциты – кровяные пластинки, образующиеся как фрагменты цитоплазмы больших клеток – мегакариоцитов. У сперматозоидов ядро есть, но оно совершенно неактивно. В ядре протекают два важнейших процесса. Первый из них – это синтез генетического материала, в ходе которого количество ДНК в ядре удваивается. Этот процесс необходим для того, чтобы при последующем делении клетки (митозе) в двух дочерних клетках оказалось одинаковое количество генетического материала. Второй процесс – транскрипция – производство всех типов молекул РНК, которые, мигрируя в цитоплазму, обеспечивают синтез белков, необходимых для жизнедеятельности клетки. Самые непохожие по форме ядра состоят из одних и тех же компонентов, т.е. имеют общий план строения. В ядре различают: ядерную оболочку, хромосомы, ядрышко и ядерный сок. У каждого ядерного компонента своя структура, состав и функции. Ядерная оболочка включает в себя две мембраны, располагающиеся на некотором расстоянии друг от друга. Пространство между мембранами ядерной оболочки называется перинуклеарным. В ядерной оболочке есть отверстия – поры. Но они не сквозные, а заполнены специальными белковыми структурами, которые называются комплексом ядерной поры. Через поры из ядра в цитоплазму выходят молекулы РНК, а навстречу им в ядро передвигаются белки. Сами же мембраны ядерной оболочки обеспечивают диффузию низкомолекулярных соединений в обоих направлениях. В ядрах живых клеток хорошо заметно ядрышко. Оно имеет вид тельца округлой или неправильной формы и отчетливо выделяется на фоне довольно однородного ядра. Ядрышко – это образование, возникающее в ядре на тех хромосомах, которые участвуют в синтезе РНК рибосом. Район хромосомы, формирующий ядрышко, называют ядрышковым организатором. В ядрышке протекает не только синтез РНК, но и сборка субчастиц рибосом. Число ядрышек и их размеры могут быть различными. Хромосомы – структурные элементы ядра клетки эукариот, содержащие ДНК, в которой заключена наследственная информация организма. Они интенсивно окрашиваются специальными красителями, поэтому немецкий ученый В.Вальдейер в 1888 г. и назвал их хромосомами (от греческих слов croma – цвет и soma – тело). Хромосомой также часто называют 23 кольцевую ДНК бактерий, хотя структура ее иная, чем у хромосом эукариот. ДНК в составе хромосом может быть уложена с разной плотностью, в зависимости от их функциональной активности и стадии клеточного цикла. В связи с этим различают два состояния хромосом – интерфазные и митотические. Митотические хромосомы образуются в клетке во время митоза, то есть деления клетки. Это неработающие хромосомы, и молекулы ДНК в них уложены чрезвычайно плотно. Благодаря такой компактности митотических хромосом обеспечивается равномерное распределение генетического материала между дочерними клетками при митозе. Интерфазными называются хромосомы (хроматин), характерные для стадии интерфазы клеточного цикла, то есть в промежутке между делением. В отличие от митотических, это работающие хромосомы: они участвуют в процессах транскрипции и репликации. ДНК в них уложена менее плотно, чем в митотических хромосомах. Помимо ДНК хромосомы содержат также белки двух видов – гистоны (с основными свойствами) и негистоновые белки (с кислотными свойствами) а также РНК. Гистонов всего 5 видов, негистоновых белков значительно больше (около сотни). Белки прочно связаны с молекулами ДНК и образуют так называемый дезоксирибонуклеопротеиновый комплекс (ДНП). Белки определяют, вероятно, основную укладку ДНК в хромосоме, участвуют в репликации хромосомы и регуляции транскрипции. Большинство клеток каждого вида животных и растений имеют свой постоянный двойной (диплоидный) набор хромосом, или кариотип, который составлен из двух одинарных (гаплоидных) наборов, полученных от отца и матери. Он характеризуется определенным числом, размером и формой митотических хромосом. Число хромосом у разных видов живых организмов различно. Рибосомы, полисомы. Это мельчайшие внутриклеточные частицы, осуществляющие биосинтез белка. При этом с абсолютной точностью происходит воспроизведение его первичной структуры - каждая аминокислота находит отведенное ей место в полипептидной цепи. В каждой клетке содержится от десятков тысяч до миллионов рибосом. Так, число рибосом в бактериальной клетке достигает 104, в животной клетке оно составляет 105. Они состоят приблизительно наполовину из рибонуклеиновой кислоты (РНК) и наполовину из белка. В клетках эукариот синтез рибосомных РНК и присоединение к ним рибосомных белков происходят в ядрышке. После этого готовые рибосомы выходят из ядра в цитоплазму, где и осуществляют свои функции. Рибосомы и полисомы имеют сферическую форму и находятся в цитоплазме либо в свободном состоянии, либо в связанном с мембранами 24 эндо-плазматического ретикулума виде. Здесь они часто образуют полирибосомы (полисомы), содержащие не менее 4 и не более 100 рибосом. Полирибосомы возникают в результате того, что несколько рибосом присоединяются к одной молекуле информационной РНК (иРНК), несущей информацию о первичной структуре белка. Таким образом, в каждой полирибосоме сразу синтезируется несколько молекул белка. Синтез полипептидных цепей белков осуществляется непосредственно в рибосомах. Рибосомы могут распадаться на субъедицы; этот процесс зависит от концентрации ионов магния. Каждая субъедица построена из молекулы мРНК и определенного набора белков. Эндоплазматическнй ретикулум — мембранная структура, расположенная в цитоплазме, вблизи ядра. Эндоплазматический ретикулум (эндоплазматическая сеть) - структура клетки эукариот, которая состоит из сети каналов и цистерн, ограниченных одинарной мембраной. Эндоплазматический ретикулум разветвлен по всему объему цитоплазмы. Эндоплазматическая сеть участвует в обмене веществ: синтезирует липиды для наружной двойной мембраны, обеспечивает транспорт веществ между органеллами клетки, служит копилкой веществ и местом их изоляции. Различают два типа эндоплазматической сети – шероховатую и гладкую. Шероховатая сеть несет на наружной поверхности многочисленные рибосомы. Синтезированные на них белки здесь изолируются от других белков клетки путем переноса их через мембрану канала эндоплазматической сети. Она «узнает» пропускаемые белки по их особым «сигнальным» концам. Отщепление этих концов после прохождения белка через мембрану называют созреванием белка. Одни белки, так называемые секреторные белки, выделяются из клетки, другие включаются во все мембраны клетки. Гладкая сеть состоит из трубочек, каналов и пузырьков меньшего сечения, чем шероховатая сеть. Ее функции так же разнообразны: здесь синтезируются липиды мембран и немембранные липиды (например, особые гормоны животных), специальными ферментными комплексами обезвреживаются ядовитые вещества, накапливаются ионы. Так, в поперечнополосатых мышцах гладкая сеть служит резервуаром ионов кальция. Мембраны этой сети содержат мощные кальциевые «насосы», которые в сотые доли секунды переносят в любую сторону большое количество ионов кальция. В специализированных клетках вид гладкой сети различен, что связано с ее конкретными функциями во внутриклеточном обмене. Эндоплазматическая сеть очень ранима при воздействиях: она быстро теряет рибосомы и разрушается. Однако благодаря способности к быстрым перестройкам может восстанавливаться. 25 Комплекс Гольджи (Аппарт Гольджи) состоит из стопок уплощенных мембранных мешочков, или цистерн, похожих по форме на блюдца. Таких цистерн в стопке от 5 до 10. Отдельные цистерны одной стопки и соседних стопок могут быть соединены мембранными трубочками. Так образуется единая сеть из стопок мембранных мешочков. В клетках растений, беспозвоночных и эмбриональных тканей позвоночных животных отдельные стопки комплекса Гольджи находятся на значительном расстоянии друг от друга. Функции комплекса Гольджи разнообразны. В его цистерны из гранулярной эндоплазматической сети поступают секретируемые белки. Там они оформляются в секреторные гранулы и затем выводятся из клетки. В этом комплексе синтезируются полисахариды, которые в дальнейшем соединяются с белками и образуют гликопротеиды. От цистерн аппарата Гольджи отщепляются мембранные пузырьки – лизосомы, содержащие гидролитические ферменты, которые защищают клетку от вредных веществ и микроорганизмов или принимают участие во внутриклеточном пищеварении. Лизосомы - микроскопические пузырьки, окруженные одним мембранным слоем, содержат гидролитические ферменты (большинство из которых находится в неактивном состоянии в виде проферментов), способные расщеплять белки, нуклеиновые кислоты, полисахариды и липиды. За эту способность им дали название «лизосомы» (от греческих слов lysis – растворение, разложение и soma – тело). Лизосомы были открыты в клетке только в 1955 г. Они были найдены в клетках растений и животных. Размеры лизосом от 0,2 до 0,5 мкм. В одноклеточных организмах они ответственны за переваривание веществ, попадающих в клетку. У лизосом два отличительных признака: значительное количество ферментов и однослойная ограничивающая их мембрана, которая предохраняет структуры и вещества клетки от разрушающего действия этих ферментов. Различают два основных вида лизосом: первичные, служащие лишь вместилищем ферментов, и вторичные, которые образуются в результате слияния первичных лизосом с вакуолями, содержащими предназначенные для переваривания вещества. Лизосомы выполняют в клетке пищеварительную, защитную и выделительную функции. Они переваривают попавшие в клетку сложные для усвоения вещества – осуществляют внутриклеточное пищеварение. Оно особенно хорошо выражено в клетках, способных к фагоцитозу, то есть к процессу захвата и перевариванию различных частиц). Продукты распада и некоторые вредные для клетки вещества превращаются под воздействием ферментов лизосом в нерастворимые продукты. Благодаря 26 лизосомам удаляются отжившие клетки и их части. Белки клетки и ее РНК существуют в клетке ограниченное время, которое измеряется часами, иногда днями, а иногда и минутами. Переваривание таких макромолекул, их разрезание на составные элементы (мономеры – аминокислоты и нуклеотиды) тоже происходит при участии лизосом. Лизосомы участвуют в защите против вирусов (некоторые вирусы «замурованы» в лизосомах), бактерий, инородных тел. Микросомы (пероксисомы) имеют меньший размер, по сравнению с лизосомами. Они содержат оксидазы, катализирующие окисление соединений, которые являются чужеродными для клетки и поэтому должны быть выведены из нее (например, лекарства и т.д.). 2.3. РОСТ И ДЕЛЕНИЕ КЛЕТОК Делением материнской клетки образуются две дочерние клетки. В течение последующего периода клетки растут и готовятся к дальнейшему делению. Интервал между двумя митозами (клеточный цикл) в экспоненциальной фазе роста составляет 10 мин для бактериальной клетки и 24 ч для животной клетки. В течение этого времени клетка проходит несколько фаз роста. В постмитотической фазе G1 клетка синтезирует молекулы РНК и белки (ДНК не синтезируется). Продолжительность этой фазы составляет 30-40% времени всего цикла. Клетки, которые не делятся дальше (например, мышечные и глиальные клетки), постоянно находятся в G1-фазе. В фазе синтеза (S) происходит полная дупликация ДНК. В меньшей степени идет синтез РНК и белков. Эта фаза занимает 30% времени цикла. Подготовка к митозу происходит в фазе G2. Детали этого метаболического процесса в настоящее время неизвестны, но ясно, что в это время запасается энергия, необходимая для митоза. РНК и белки продолжают синтезироваться и в это время. Эта фаза занимает 10-20% времени цикла. Митоз занимает 5-10% цикла и в это время метаболические процессы не происходят. 3. БЕЛКИ Белки иначе называют протеинами; этот термин введен в 1838 г и происходит от греческого слова “proteios”, которое обозначает “первичный”. Этим подчеркивается первостепенная значимость протеинов для всех живых организмов. Белки составляют значительную часть тканей живого организма: до 25% сырой и до 45 – 50% сухой массы. Они содержат 50 -59% углерода, 6,5 – 7,3% водорода, 15 – 18% азота, 21 – 24% кислорода, до 2,5% серы. Для большинства белков характерна довольно постоянная доля азота (в 27 среднем 16% от сухой массы) по сравнению с другими элементами. Этот показатель используют для расчета количественного содержания белка. Для этого массу азота, найденную при анализе, умножают на коэффициент 6,25 (100:16 = 6,25). В составе некоторых белков обнаруживают фосфор, железо, цинк, медь и другие элементы. Функции белков в организме чрезвычайно многообразны. Некоторые из них (например, коллаген) составляют основу костно-мышечной ткани. Другие белки включены в иммунную систему и выполняют защитные функции против инфекций и возбудителей болезней. Наиболее важные белки – ферменты (энзимы), которые катализируют химические реакции, протекающие в организме, и гормоны, регулирующие все биохимические процессы в организме. Белки – это высокомолекулярные азотсодержащие вещества, состоящие из -аминокислот, связанных между собой амидными связями. Для построения белков природа использует 20 -аминокислот L - ряда. В состав белка может быть включено от 50 до 8000 молекул аминокислот, а молекулярная масса белка может достигать 1 млн. В природных соединениях встречаются остатки и других аминокислот, однако они не принимают участия в белковом синтезе, а являются продуктами превращений фрагментов соответствующих аминокислот. 3.1 -АМИНОКИСЛОТЫ Все - аминокислоты имеют следующую общую формулу: H2N-CH-COOH R 3.1.1. КЛАССИФИКАЦИЯ -АМИНОКИСЛОТ В основе классификации лежат свойства боковой группы – заместителя R. В зависимости от химической природы радикалов аминокислоты подразделяются на алифатические, ароматические и гетероциклические. В зависимости от кислотно-основных характеристик аминокислоты подразделяют на: а) нейтральные (такие аминокислоты содержат только одну амино- и одну карбоксильную группы); б) основные или кислые аминокислоты в зависимости от числа амино- или карбоксильных групп, соответственно. Наибольшее распространение получила рациональная классификация, основанная на полярности радикалов, т.е. на сродстве заместителей к воде 28 при биологических значениях рН (вблизи рН=7.0). В зависимости от свойств заместителя R существует четыре группы -аминокислот. 1. Аминокислоты, содержащие неполярный углеводородный заместитель, проявляющий гидрофобные (липофильные) свойства и поэтому труднорастворимые в воде. Это восемь -аминокислот: аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, триптофан и метионин. Особое место занимает пролин, который имеет циклическую структуру. CH3 CH3-CH-COOH NH COOH CH3-CH2-CH-CH-COOH NH2 NH2 Аланин, Ala (6,00) Пролин, Pro (6,3) Изолейцин, Ile (6,0) CH3 CH3-CH-CH2-CH-COOH H2C CH2 CH COOH S CH3 NH2 NH2 Лейцин, Leu (6,0) Метионин, Met (5,7) CH2 CH COOH NH2 Фенилаланин, Phe (5,5) CH3 CH3-CH-CH-COOH NH2 Валин, Val (6,0) CH2 CH COOH NH2 N H Триптофан, Trp (5,9) 2. Аминокислоты, содержащие неионизующийся полярный заместитель, проявляющий гидрофильные свойства. Это пять аминокислот, которые лучше растворяются в воде: глицин, серин, треонин, аспаргин и глутамин. NH2-C-CH2-CH-COOH NH2-C-CH2-CH2-CH-COOH O O NH2 NH2 Аспарагин, Asn (5,4) Глутамин, Gln (5,7) OH NH2-CH2-COOH HO-CH2-CH-COOH Глицин, Gly (6,0) NH2 Серин, Ser (5,7) 29 CH3-CH-CH COOH NH2 Треонин, Thr (5,6) 3. Аминокислоты, содержащие полярный заместитель, проявляющий гидрофильные и кислотные свойства. Это четыре -аминокислоты: глутаминовая и аспарагиновая кислоты, цистеин и тирозин. В аспарагиновой и глутаминовой кислотах заместитель полностью отдает протон своей карбоксильной группы в растворах с рН = 7 и поэтому в этих условиях несет отрицательный заряд. Полная ионизация группы SH в цистеине и группы –ОН в тирозине происходит в растворах с большим значением рН. Перечисленные аминокислоты обычно называют кислотными. HO- -CH2CHCOOH H2N CH COOH HS-CH2-CH-COOH NH2 NH2 Тирозин, Tyr (5,7) HO-CH-CH3 Цистеин, Cys (5,0) HOOC-CH2-CH-COOH Треонин, ThR (5,6) HOOC-CH2-CH2-CH-COOH NH2 NH2 Аспарагиновая кислота ,Arg (3,0) Глутаминовая кислота,Glu (3,2) 4. Аминокислоты, содержащие полярный заместитель, проявляющий основные свойства. Это три аминокислоты: лизин и аргинин, в которых заместитель в растворах с рН = 7 протонирован и несет положительный заряд, а также гистидин, проявляющий слабые основные свойства благодаря присутствию имидазольного цикла в заместителе. HN=C-NH-CH2CH2CH2CHCOOH NH2 N NH2 -CH2-CH-COOH NH Аргинин, Arg (10,8) NH2 Гистидин, His (7,6) NH2CH2CH2CH2CH2CHCOOH NH2 Лизин, Lys (9,7) Многие -аминокислоты синтезируются в живых системах в количестве, достаточном для удовлетворения потребности организма. Такие аминокислоты называют «заменимыми»: аланин, аргинин, аспарагин, аспарагиновая кислота, глицин, глутамин, глутаминовая килота, пролин, 30 серин, цистеин, тирозин. Другие аминокислоты получили название «незаменимых». Они не синтезируются в организме человека или синтезируются в недостаточном количестве и должны пополняться с пищей. Представителями подобных кислот являются: валин, гистидин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, треонин, триптофан, фенилаланин. Установлено, что большинство незаменимых кислот содержат атомы углерода с положительной суммой степеней окисления, а большинство заменимых кислот содержат атомы углерода с отрицательной степенью окисления. Это, по-видимому, указывает на то, что заменимые аминокислоты эволюционно более молоды, по сравнению с незаменимыми кислотами, т.е. они возникли уже в окислительной атмосфере и поэтому содержат больше атомов электроотрицательных элементов (O, N, S). 3.1.2. ФИЗИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА -АМИНОКИСЛОТ Молекулы -аминокислот являются амфолитами. Вследствие этого в их молекулах происходит перенос протона с карбоксильной группы на аминогруппу, т.е. имеет место прототропная таутомерия между таутомером, имеющим неионизованную структуру (I), и таутомером с биполярно-ионной структурой (II). H2N CH H3N COOH CH COO R R II I В связи с тем, что кислотные свойства таутомера (II) в 105 – 106 раз слабее, чем у таутомера (I), в водных растворах и в кристаллическом состоянии это прототропное равновесие для молекул -аминокислот практически полностью смещено в сторону таутомера (II). Поэтому аминокислоты следует изображать в виде таутомера с биполярно-ионной структурой. Биполярные ионы, которые также называют бетаинами, являются внутренними солями и их суммарный заряд равен нулю. Они функционируют либо как кислоты (доноры протонов), либо как основания (акцепторы протонов). H3N - CH - COOH R катионная форма (рН 1-2) H3N - CH - COO H2N - CH - COO R биполярный ион (рН 7-8) R анионная форма (рН 13 – 14) 31 В катионной форме нейтральная -аминокислота (например, аланин) представляет собой сильную двухосновную кислоту. В анионной форме аминокислота является довольно сильным основанием. Значение рН, при котором концентрация биполярных ионов максимальна, а минимальные концентрации катионной и анионной форм равны, называется изоэлектрической точкой (рI). Значения рI для различных аминокислот различны. Для нейтральных аминокислот рI = 5.5 – 6.3, для кислых аминокислот рI = 2 – 3 , для основных - рI = 9 – 10. Помещенная в электрическом поле, аминокислота при рН = рI не перемещается ни к аноду, ни к катоду. При рН рI ее катионная форма движется к катоду, при рН рI анионная форма перемещается к аноду. На различном поведении -аминокислот, отличающихся значениями рI в электрическом поле, основан метод их разделения – электрофорез. В организме кислые -аминокислоты находятся в анионной форме, основные – в виде дикатионов. Биполярно-ионная структура молекул -аминокислот проявляется в их физических свойствах: аминокислоты – бесцветные кристаллические вещества с высокими температурами плавления ( 200 0С), нелетучи, большинство их растворимы в воде и практически нерастворимы в неполярных органических растворителях. Последнее свойство чрезвычайно важно для биологического функционирования аминокислот, способности их к всасыванию и транспортировке в организме. Во всех (кроме глицина) аминокислотах -углеродный атом асимметрический, причем у большинства этих соединений (кроме изолейцина, треонина) имеется только один хиральный центр. Поэтому они могут существать в виде двух конфигурационных изомеров (L- и Dэнантиомеров). H2N CH COOH R COOH H NH2 R COOH H NH2 R аминокислота D- ряда аминокислота L-ряда (R-конфигурация) (S-конфигурация) Природная аминокислота L-треонин, содержащая два асимметрических атома углерода, имеет следующую конфигурацию: 32 COOH H NH2 H OH CH3 (2S, 3R) – 2-амино-3-гидроксимасляная кислота (L-треонин) Почти все природные -аминокислоты имеют L-форму, а Dаминокислоты, как правило, не усваиваются живыми организмами и входят в состав белка крайне редко. Так, D-глутаминовая кислота входит в состав белка клеточной стенки бактерии сибирской язвы. D – изомеры обнаружены также в некоторых природных антибиотиках: Dдиметилцистеин в пеницилине, D- фенилаланин – в грамицидине. 3.1.3. СИНТЕЗ АМИНОКИСЛОТ Основным источником -аминокислот для живых систем служат пищевые белки. Природные аминокислоты можно получить гидролизом белков при нагревании последних в присутствии соляной или серной кислот. Источником белков служат мясо, кожа, желатин, шерсть, волос, перо, казеин из творога и так далее. Большое значение имеют синтетические способы получения аминокислот. Исходными продуктами для синтеза -аминокислот могут служить -галогензамещенные карбоновые кислоты, аминомалоновый эфир, оксопроизводные ароматических и гетероциклических соединений, оксимы, гидразоны. Используются также способы превращения одной аминокислоты в другую. В лаборатории (in vitro) рацемические -аминокислоты получают чаще следующим образом: 1. Реакция Штреккера - Зелинского, заключающаяся в одновременном действии на альдегиды водным раствором смеси хлорида аммония и цианида калия: NH4CN + KCl NH4Cl + KCN R-CH=O NH4CN NH3 -H2O NH3 + HCN R-CH=NH HCN R-CH-C N имин NH2 нитрил -аминокислоты 33 H2O, HCl R-CH-COOH t NH2 Cl гидрохлорид -аминокислоты 2. Реакция аминирования -галогензамещенных кислот. Нуклеофильное замещение галогена на аминогруппу в галогензамещенной кислоте - один из наиболее распространенных методов синтеза -аминокислот. O NH3 (изб.), H2O R-CH-COOH R-CH-C -NH4Br NH2 O NH4 Br o O HCl, H2O R-CH-C pH~6,5 NH2 OH Несмотря на то, что этот метод применим для синтеза не только аминокислот, но и аминокислот с любым удалением аминогруппы от карбоксильной группы, применяется он сравнительно редко из-за невысоких выходов целевого продукта. Обычно саму -галогензамещенную кислоту получают по методу Геля – Фольгарда – Зелинского бромированием карбоновой кислоты в присутствии каталитического количества PBr3. PBr3 R-CH2-COOH + Br2 R-CH-COOH Br -Галогензамещенную кислоту можно получить также с помощью малонового эфира: (C2H5OC)2CH2 O RBr -NaBr C2H5ONa -C2H5OH (C2H5OC)2CHR Br2/ТГФ to (C2H5OC)2CH Na O KOH/H2O o t O (HOC)2CBrR O o t -CO2 (HOC)2CHR O HO-C-CH-R O Br 3. Аминирование эфиров -галогензамещенных кислот по методу Габриэля. Этот метод представляет собой модификацию 34 известного метода синтеза первичных аминов и обеспечивает получение -аминокислот с высоким выходом. O SN2 + CH N K 2-COOC2H5 -KCl Cl O этиловый эфир фталимид калия монохлоруксусной кислоты O KOH/H2O N -CH2-COOC2H5 to O COOH COOH H2O, HCl to + C2H5OH + CH2-COOH NH3 Cl гидрохлорид глицина 4. Синтез на основе малонового эфира. Так называемый фталимидомалоновый метод является комбинацией синтеза при помощи малоновогоо эфира и реакции Габриэля: O CO2C2H5 CH2 CO2C2H5 малоновый эфир Br2 CCl4 -HBr CO2C2H5 CHBr N K O CO2C2H5 броммалоновый эфир O CO C H 2 2 5 C2H5ONa N-CH CO2C2H5 C2H5OH O 35 O CO C H 2 2 5 N-C Na O CO2C2H5 O CO2C2H5 RX NaOH/H2O N-C-R -NaX H2O,HCl O CO2C2H5 COOH + 2 C2H5OH + CO2 + H2N-CH-COOH COOH R 3.1.4. РАЗДЕЛЕНИЕ РАЦЕМИЧЕСКИХ -АМИНОКИСЛОТ Все описанные методы синтеза приводят к получению рацемической смеси оптических изомеров -аминокислот. Наиболее перспективным методом получения оптически чистых -аминокислот является использование биологических систем. Подобный подход основан на том, что организму дают в качестве источника питания рацемическую смесь, но метаболизму подвергается только L-энантиомер, D-энантиомер обычно выделяется. Использование животных для разделения аминокислот затруднительно и дорого. Поэтому вместо животных применяют обычно хиральные ферменты, которые по-разному реагируют с энантиомерами одной той же аминокислоты. Многие ферменты катализируют реакцию только одного энантиомера, в результате чего превращению подвергается один из них, а другой остается без изменения и может быть выделен. Например, в качестве фермента используют ацилазу, выделенную из почек свиньи. Этот фермент катализирует гидролиз амидных связей Lаминокислот, но не D-аминокислот. Поэтому рацемическую смесь аминокислоты сначала ацилируют. L- R-CH-COOH L- R-CH-COOH NH2 NHCOCH3 (CH3CO)2O D- R-CH-COOH NHCOCH3 D- R-CH-COOH NH2 -аминокислота (рацемат) N-ацетил- -аминокислота Полученный рацемический амид подвергают действию фермента ацилазы, который гидролизует только L-изомер. L-Аминокислоту 36 отделяют от D-амида, используя ее способность к солеобразованию. Dаминокислоту получают обычным гидролизом D-амида. L- R-CH-COOH -CH3COOH разделение смеси NH2 Ацилаза D- R-CH-COOH NHCOCH3 Смесь аминокислоты и амида L- R-CH-COOH NH2 H2O, H D- R-CH-COOH D- R-CH-COOH NHCOCH3 NH2 3.1.5. ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА -АМИНОКИСЛОТ -Аминокислоты как гетерофункциональные соединения вступают в реакции, характерные как для карбоксильной группы так и для аминогруппы. Некоторые химические свойства -аминокислот обусловлены наличием функциональных групп в радикале. Комплексообразующие свойства. Аминокислоты как полидентатные лиганды, кроме обычных солей, способны образовывать хелатные комплексы с катионами d-металлов. При этом донорами электронных пар выступают как аминогруппа, так и ионизованная карбоксильная группа аминокислот. Например, все -аминокислоты со свежеприготовленным раствором Cu(OH)2 образуют растворимый электронейтральный комплекс, окрашенный в ярко-синий цвет: Эту реакцию можно использовать также в качестве неспецифического метода обнаружения -аминокислот. 2 H3N-CH-COO + Cu(OH)2 R 37 R O NH2 O Cu O O + 2 H2O R H2N Кислотные и основные -аминокислоты, содержащие дополнительные протонодонорные или протоноакцепторные группы, являются более активными лигандами, по сравнению с нейтральными аминокислотами. Особую активность с позиции комплексообразования с катионами биометаллов и в соответствии с теорией жестких и мягких реагентов проявляют цистеин и гистидин, так как они содержат легкополяризуемые («мягкие») группы, соответственно тиольную и имидазольную. Эти группы образуют достаточно прочные связи с «мягкими» катионами биометаллов. Высокая комплексообразующая способность этих аминокислот за счет активных групп заместителя сохраняется в пептидах и белках их содержащих. Реакции комплексообразования аминокислот играют чрезвычайно важную роль в поддержании металло-лигандного гомеостаза, а также хелатотерапии. Знание комплексообразующих свойств аминокислот позволяет понять соответствующие свойства пептидов и белков. Образование N-ацильных производных. При ацилировании аминокислот галогенангидридами или ангидридами карбоновых кислот получаются соединения, которые можно рассматривать либо как Nацильные производные, либо как N-замещенные амиды. CH2-COOH + C6H5C H2N O NaOH,H2O CH2-COOH -NaCl O NH -C C6H5 N-бензоилглицин Cl глицин При гидролизе N-ацилпроизводных образуются исходные -аминокислоты. Поэтому реакция ацилирования широко используется для защиты аминогруппы. CH2-COOH + (CH3CO)2O NH2 глицин 25 oC CH2-COOH O -CH3COOH NH-C CH3 N-ацетилглицин 38 Защита аминогруппы -аминокислот имеет важное значение в синтезе пептидов. Однако общепринятый способ удаления защитной группы с помощью гидролиза в кислой среде неприемлем из-за опасности одновременного расщепления пептидной связи в молекуле синтезируемого пептида. Это вызывает необходимость использования специальных методов. Широко распространен прием карбобензоксизащиты, где ацилирующим реагентом служит бензилхлорформиат (карбобензоксихлорид или бензиловый эфир хлормуравьиной кислоты). C6H5CH2OH бензиловый спирт O + Cl-C-Cl фосген C6H5CH2-O-C ~20 oC -HCl O C6H5CH2-O-C Cl бензилхлорформиат + CH2-COOH Cl бензилхлорформиат O NH2 глицин -HCl CH-COOH NH-C-OCH2C6H5 O N-бензилоксикарбонилглицин (N-защищенный глицин) В качестве защитной группы используют также третбутоксикарбонильную (Вос) группу. В этом случае в качестве ацилирующего реагента служит трет-бутоксикарбоксазид. O CH2-COOH (CH3)3C-O-C + CH2-COOH -HN3 O N3 NH 2 NH-C трет-бутокси- глицин O-C(CH3)3 карбоксазид (Boc-N3) N-трет-бутоксикарбонилглицин (N-защищенный глицин) Защитная карбобензоксигруппа (бензилоксикарбонильная группа) удаляется без нарушения пептидных связей при каталитическом гидрогенолизе, т.е. при действии водорода в присутствии палладиевого 39 катализатора при обычной температуре. Кроме того, удаление этой защитной группы можно провести смесью бромоводородной и трифторуксусной кислот без нагревания. CH3 H2, Pd/CaCO3 O C6H5CH2-O-C -CO2 CH2CHOO + NH3 NH CH2 COOH HBr/CF3COOH -CO2 CH2Br CH2COOH + NH3 Br Легкость расщепления связей при гидрогенолизе обусловлена термодинамической устойчивостью образующейся промежуточной частицы – бензильного катиона. Этот же принцип, т.е. легкость отщепления защитной группы за счет образования термодинамически устойчивой промежуточной частицы, использован и в случае третбутоксикарбоксазида. Защитная трет-бутоксикарбонильная группа (Вос-группа) легко отщепляется без нагревания при действии 1н. раствора хлороводорода в безводном метаноле или трифторуксусной кислоты. В качестве промежуточной частицы образуется относительно устойчивый третбутилкатион, который затем превращается в 2-метилпропен (изобутилен). HCl, CH3OH CH2-COOH O -CO2 NH-C O-C(CH3)3 CH2COOH +CH3-C=CH2 NH3 Cl CH3 Образование эфиров. При этерификации -аминокислот спиртами в присутствии кислотного катализатора (газообразный хлороводород) с хорошим выходом получаются сложные эфиры в виде гидрохлоридов. Для выделения свободных эфиров реакционную смесь обрабатывают газообразным аммиаком или триэтиламином (все реактивы должны быть безводными во избежание гидролиза эфиров). 40 CH2-COOH NH2 глицин C2H5OH о HCl (сухой), 25 С (C2H5)3N . -(C2H5)3N HCl CH2COOC2H5 NH3 Cl CH2-COOC2H5 NH2 этиловый эфир глицина Для получения бензиловых эфиров аминокислот в качестве катализатора используют бензолсульфоновую кислоту. Выделяющуюся воду отгоняют в ходе реакции. H3N-CH2COO + C6H5CH2OH глицин бензиловый спирт C6H5SO3H -H2O H3N-CH2COOCH2C6H5 C6H5SO3 О-бензилглицинбензолсульфонат Сложные эфиры -аминокислот не имеют диполярного строения, поэтому, в отличие от исходных кислот, они растворяются в органических растворителях и обладают летучестью. Так, глицин – кристаллическое вещество с высокой температурой плавления (292 оС), а его метиловый эфир – жидкость с температурой кипения 130 оС. Впервые перегонка метиловых -аминокислот была произведена Э.Фишером (1901). С этого момента эфирный метод вошел в практику разделения -аминокислот, что открыло путь к анализу белковых гидролизатов. Анализ эфиров аминокислот проводят с помощью газожидкостной хроматографии. Образование галогенангидридов. При действии на аминокислоты с защищенной аминогруппой тионилхлоридом (SOCl2) или хлорокись фосфора (POCl3) образуютcя хлорангидриды -аминокислот: C6H5CH2-O-C-NH-CH2-COOH + SOCl2 O N-бензилоксикарбонилглицин 41 O C6H5CH2-O-C-NH-CH2-C + SO2 + HCl Cl O хлорангидрид N-бензилоксикарбонилглицина Перевод в галогенангидриды использовался в синтезе пептидов как способ активации карбоксильной группы -аминокислот. Однако из-за большой реакционной способности галогенангидридов селективность реакции ацилирования с их участием была невысокой (образовывалось много побочных продуктов), поэтому более подходящим способом активации явилось превращение кислоты в ангидрид. Ангидриды по сравнению с галогенангидридами обладают несколько меньшей ацилирующей способностью, но большей избирательностью. В синтезе пептидов используют смешанный ангидрид -аминокислоты и этилхлорформиата, образующийся при взаимодействии защищенной по аминогруппе -аминокислоты с этилхлороформиатом. O C6H5CH2-O-C-NH-CH2-COOH + C2H5-O-C Cl O N-бензилоксикарбонилглицин этилхлоркарбонат C6H5CH2-O-C-NH-CH2-C-O-C-O-C2H5 O O O смешанный ангидрид N-бензилоксикарбонилглицина и этилкарбоната Образование N-алкилзамещенных -аминокислот. Моноалкилирование аминогруппы не всегда протекает избирательно. Избирательность этой реакции зависит от характера алкилирующего агента. Как правило, в реакции образуется смесь моно- и диалкилзамещенных аминокислот. Более того, при использовании избытка галогеналкана диалкилзамещенная аминокислота алкилируется дальше до получения триалкилзамещенной аимнокислоты. Протеканию реакции алкилирования по атому азота аминокислот способствует щелочная среда. H2N-CH2COOK CH3I, KOH -KI, -H2O 42 CH3NH-CH2COOK CH3I, KOH -KI, -H2O (CH3)2N-CH2COOK CH3I, KOH -KI, -H2O (CH3)3N-CH2COOK Образующееся в итоге соединение имеет фиксированную биполярноионную структуру и называется бетаином аминокислоты, а в случае глицина – просто бетаином. В бетаине атом азота имеет положительный заряд и поэтому бетаин может быть источником метильной группы для нуклеофильного центра другого соединения, т.е. метилирующим реагентом. В организме с помощью бетаина протекает реакция трансметилирования, например алкилирование гомоцистеина с образованием метионина: (CH3)3N-CH2COOK + H3N-CH-COO CH2CH2SH гомоцистеин бетаин (CH3)2N-CH2COOK + H3N-CH-COO CH2CH2SCH3 Калиевая соль N,N-диметилглицина метионин Образование оснований Шиффа. При взаимодействии аминокислот с альдегидами образуются замещенные имины (основания Шиффа) через стадию образования карбиноламинов. OH NH-CH-R H2N-CH-COOH + R-CH=O R -аминокислота альдегид R-CH-COOH карбиноламин N=CH-R R-CH-COOH замещенный имин (основание Шиффа) 43 -H2O Формальдегиды в слабощелочной среде (рН 7) легко вступает в реакцию нуклеофильного присоединения с -аминокислотами, содержащими свободную аминогруппу. В результате образуются относительно устойчивые карбиноламины – N-метилольные производные. При избытке формальдегида образуется N,N-диметилольное производное аминокислоты: H2N-CH-COOK + H2C=O KOH R HOCH2HN-CH-COOK R N-метилольное производное аминокислоты H2C=O KOH HOCH2 N-CH-COOK HOCH2 R N,N-диметилольное производное аминокислоты В таких производных аминокислот основность атома азота сильно уменьшается из-за электроноакцепторных заместителей. Реакцию аминокислот с формальдегидом используют для количественного определения -аминокислот методом формольного титрования (метод Серенсена), где в качестве титранта используется щелочь (индикатор фенолфталеин). Большая склонность аминогрупп в аминокислотах или белках реагировать с формальдегидом приводит к необратимой денатурации белков в его присутствии. Этим объясняются высокая токсичность формальдегида и его стерилизующая способность. Окислительно-восстановительные реакции. -Аминокислоты вступают в разнообразные окислительно-восстановительные реакции, сопровождаемые изменением степеней окисления углеродных атомов. Эти реакции происходят как внутримолекулярно, так и межмолекулярно. Среди всех природных -аминокислот особенно чувствителен к действию окислителей цистеин, легко окисляемый за счет атома серы тиольной группы (-SH) в цистин, содержащий дисульфидную (-S-S-) группировку. -2e, -2H S-CH CH(NH )COO NH -CH-COO 2 3 3 +2e, +H CH2-SH S-CH2CH(NH3)COO цистин цистеин (сопряженный окислитель) (восстановитель) 44 Цистеин и цистин составляют сопряженную восстановительноокислительную пару, для которой характерно тиол-дисульфидное равновесие. Поэтому цистеин является эффективным антиоксидантом, выполняя защитные функции при воздействии на организм сильных окислителей благодаря восстановительным свойствам тиольной группы. Цистеин был первым препаратом, проявившим противолучевое действие, который уменьшал степень лучевого поражения и повышал выживаемость больных. Биологически важные химические реакции. Ряд важных химических превращений -аминокислот, осуществляемых в организме под действием различных ферментов, имеют общий механизм, обусловленный участием одного и того кофермента – пиридоксальфосфата, прочно связанного с ферментом ковалентной связью. Пиридоксальфосфат и -аминокислота образуют альдимин I путем взаимодействия альдегидной группы и аминогруппы -аминокислоты. В альдимине I электронная плотность сопряженной системы смещена к протонированному пиридиновому атому азота, за счет чего возникает сильная поляризация связей -углеродного атома аминокислоты. В зависимости от того, какая из этих трех связей будет принимать участие в дальнейшей реакции (что определяется природой фермента), в конечном счете, могут осуществляться процессы трансаминирования, декарбоксилирования, элиминирования, рацемизации, альдольного расщепления и др. Общность этих существенно различающихся по конечному результату процессов заключается в том, что каждый из них реализуется через стадию образования альдимина I. O CH=O O-POCH2 NH2-CH-COO + O R OH N CH3 H пиридоксальфосфат 45 O O-POCH2 R-CH-COOH N HC H O O N CH3 H альдимин I Декарбоксилирование. Процесс декарбоксилирования аминокислот ведет к образованию биогенных аминов. NH3-CH-COO декарбоксилаза + +пиридоксальфосфат - R-CH2-NH2 + CO2 R амин -аминокислота -Аминокислоты содержат в -положении к карбоксильной группе электроноакцепторную аминогруппу (точнее, протонированную + аминогруппу [-NH3] ), что объясняет их способность к декарбоксилированию. В лабораторных условиях эта реакция протекает при нагревании аминокислот в присутствии поглотителей диоксида углерода, например гидроксида бария Ba(OH)2. o t C R-CH -NH + BaCO NH2-C-COOH + Ba(OH)2 3 2 2 -H2O R Декарбоксилирование в организме. Декарбоксилирование аминокислот происходит сравнительно легко в тканях животных и растений, но особенно оно характерно для микроорганизмов. Процесс происходит с участием ферментов декарбоксилаз и кофермента пиридоксаль-фосфата. Эта реакция осуществляется за счет разрыва в альдимине I полярной связи между -углеродным атомом и карбоксилатной группой. Промежуточная «хиноидная» форма за счет присоединения протона превращается в альдимин Iа, в результате гидролиза которого получаются пиридоксальфосфат и биогенный амин. 46 CH-R R-CH--COO H C N H H O P OCH2 P OCH2 C .. N CH3 -CO2 N N H альдимин I H O +H CH3 H "хиноидная" форма Биогенные амины в организме выполняют важные биологические функции. Например, -аминомасляная кислота (ГАМК), образующаяся при декарбоксилировании глутаминовой кислоты, является нейромедиатором, принимает участие в обменных процессах, происходящих в головном мозге. В медицинской практике эта кислота под названием гамалон, или аминалон, применяется при лечении нервнопсихических заболеваний. Большое биологическое значение имеет декарбоксилирование многих природных -аминокислот – серина, цистеина, лизина, триптофана, аспаргиновой кислоты и др. R-CH2 H P OCH2 N C H H O P OCH2 O C + H2O N CH3 N H OH CH3 H пиридоксальфосфат альдимин Ia + R-CH2-NH2 биогенный амин Трансаминирование. Это основной путь биосинтеза -аминокислот из -оксокислот. Донором аминогруппы служит -аминокислота, имеющаяся в клетках в достаточном количестве или избытке, а ее акцептором - -оксокислота. -Аминокислота при этом превращается в 47 оксокислоту, а -оксокислота – в -аминокислоту с соответствующим строением радикалов. В итоге трансаминирование представляет собой обратимый процесс взаимообмена амино- и оксогрупп. Пример такой реакции – получение L-глутаминовой кислоты из -оксоглутаровой кислоты. Донорной -аминокислотой может служить, например, Lаспарагиновая кислота. донорная -аминокислота акцепторная -оксокислота HOOCCH2CHCOOH NH2 + HOOCCH2CH2CCOOH O L-аспарагиновая кислота 2-оксоглутаровая кислота трансамилаза + + пиридоксальфосфат акцепторная -оксокислота HOOCCH2CCOOH + О 2-оксоянтарная кислота донорная -аминокислота + HOOCCH2CH2CHCOOH NH2 L-глутаминовая кислота Реакция трансаминирования является межмолекулярным окислительновосстановительным процессом, которая сводится к взаимопревращению аминогрупп и карбонильных групп под действием кофермента пиридоксальфосфата и ферментов трансаминаз, называемых также аминотрансферазами. Эта реакция служит не только для разрушения аминокислот, но и для их биосинтеза, т.е с ее помощью регулируется содержание -аминокислот в клетках. Кофермент пиридоксальфосфат выполняет функцию переносчика аминогруппы от донорной -аминокислоты к акцепторной -оксокислоте с промежуточным переходом в форму пиридоксаминфосфата, т.е. пиридоксальфосфат ведет себя как акцептор, а пиридоксаминфосфат – как донор аминогрупп. Процесс трансаминирования происходит путем последующего превращения альдимина I c участием полярной связи между -углеродным атомом и атомом водорода. Наличие СН-кислотного 48 центра и соответственно подвижного атома водорода создает условия для протекания ряда прототропных таутомерных превращений. Альдимин I, отщепляя протон Н+, переходит в промежуточную «хиноидную» форму, в которой за счет присоединения протона восстанавливается ароматичность и образуется кетимин. При гидролизе кетимина получается пиридоксаминфосфат и -оксокислота. Пиридоксаминфосфат способен взаимодействовать в обратном направлении с акцепторной -оксокислотой, в результате чего получается -аминокислота и «возвращается» пиридоксальфосфат. R-CH-COOH HC N P -OCH2 H O P -OCH2 -H N R- C-CHOOH N HC H O +H .. N CH3 CH3 H "хиноидная" форма H альдимин I R- C-CHOOH H2 C P -OCH2 N N H O H2 C P -OCH2 H2O H кетимин OH + N CH3 NH2 CH3 H пиридоксаминфосфат + R-C-COO O -оксокислота P - остаток фосфорной кислоты PO32Реакция трансаминирования является связующим звеном между процессами метаболизма белков (-аминокислоты) и углеводов (оксокислоты). С помощью этой реакции устраняется избыток отдельных 49 -аминокислот, и таким образом регулируется содержание -аминокислот в клетках. Элиминирование. Данный процесс характерен для -аминокислот, у которых в -положении к карбоксильной группе содержатся электроноакцепторные функциональные группы, например гидроксильная или тиольная. При их отщеплении под действием пиридоксальфосфата и соответствующего фермента образуются промежуточные реакционноспособные -енаминокислоты. Последние легко переходят в таутомерные -иминокислоты, которые в результате реакции гидратации по иминной группе превращаются в -оксокислоты. X NH2 NH2 таутомерия R-CH-CH-COOH R-CH=C-COOH -HX -замещенная -аминокислота (X=OH,SH; R=H,CH3 NH2 NH H2O R-CH2-C-COOH R-CH-C-COOH -NH3 -иминокислота OH R-CH2-C-COOH O -оксокислота Альдольное расщепление. Этот процесс имеет место в случае аминокислот, у которых в -положении содержится гидроксильная группа. Например серин расщепляется с образованием глицина и формальдегида (последний не выделяется в свободном виде, а сразу связывается с другим коферментом – тетрагидрофолевой кислотой). Эта реакция имеет большое значение как источник одноуглеродного фрагмента (в виде гидроксиметильной группы), включающегося далее в синтез многих соединений, в том числе метионина и пуриновых нуклеотидов. HO-CH2-CH-COO H3N-CH2-COO + H2C=O NH4 серин глицин формальдегид В основе этой реакции лежит расщепление в альдимине I связи между и -углеродными атомами в радикале аминокислотного остатка. 50 -Аминокислоты являются активными участниками разнообразных метаболических реакций, протекающих с участием многих коферментов. Например они могут превращаться в -оксокислоты не только через трансаминирование, но и путем окислительного дезаминирования. Окислительное дезаминирование. Процесс может осуществляться с участием ферментов дегидрогеназ и кофермента НАД+ или НАДФ+. Например, при окислительном дезаминировании L-глутаминовой кислоты образуется -оксоглутаровая кислота. На первой стадии реакции осуществляется дегидрирование (окисление) глутаминовой кислоты до иминоглутаровой кислоты. OH RO N N N N NH2 O CONH2 O O CH2O-P-O-P-OCH2 OH OH + R=H НАД R=PO3H2 НАДФ+ HO O N OH На второй стадии происходит гидролиз, в результате которого получаются -оксоглутаровая кислота и аммиак. Стадия гидролиза протекает без участия фермента. Образующийся аммиак включается в цикл мочевины. В обратном направлении протекает реакция восстановительного аминирования -оксокислот. Например, всегда содержащаяся в клетках оксоглутаровая кислота (как продукт метаболизма углеводов) превращается этим путем в L-глутаминовую кислоту. NH2 НАД+ HOOCCH2CH2CHCOOH + НАДH,H L-глутаминовая кислота NH H 2O HOOCCH2CH2CCOOH -иминоглутаровая кислота 51 O HOOCCH2CH2CCOOH + NH3 -оксоглутаровая кислота В лабораторных условиях дезаминирование осуществляется азотистой кислотой. При этом образуется соответствующая -гидроксикислота и выделяется газообразный азот, по объему которого судят о количестве вступившей в реакцию -аминокислоты (метод Ван-Слайка). Поэтому эта реакция используется для количественного определения аминогрупп в аминокислотах, а также в белках и продуктах их распада. R-CH-COOH + NaNO2, HCl R-CH-COOH + N2 +H2O HNO2 HO NH2 -аминокислота -гидроксикислота В последнее время открыт новый фермент NO-синтетаза, под действием которого при окислении аргинина и кофермента НАДФ(Н) молекулярным кислородом образуется диоксид азота (II) и циктулин. Полученный оксид азота (II) быстро используется в имунной системе организма для устранения ксенобиотиков, а также для регуляции кровяного давления за счет расслабления мышц кровеносных сосудов. NH=CNH(CH2)3CHCOOH + НАДФ(Н) + 3O2 + H+ NH2 NH2 аргинин NO-синтетаза -2H2O, -2NO O=CNH(CH2)3CHCOOH + НАДФ+ NH2 NH2 цитрулин Наряду с общими для всех или подавляющего большинства аминокислот химическими превращениями в организме протекает множество реакций, связанных с участием отдельных -аминокислот, например гидроксилирование фенилаланина, процесс трансметилирования с участием метионина. В ходе метаболизма аспарагиновая кислота под действием аспартатаммиак-лиазы легко вступает в реакцию внутримолекулярного дезаминирования, в результате которой образуется фумарат аммония. 52 H3N-CH-COO аспартат-аммиак-лиаза H-CH-COO H-C-COO H-CH-COO NH4 аспартат фумарат аммония Реакция носит обратимый характер и используется для регулирования содержания аспаргиновой кислоты в организме. В микробиологической промышленности из фумарата аммония с помощью клеток кишечной палочки, содержащих аспартат-аммиак-лиазу, синтезируют Lаспаргиновую кислоту. Отношение к нагреванию. При нагревании -аминокислоты превращаются в циклические амиды, называемые дикетопиперазинами. Например, аланин циклизуется до 3,6-диметил-2,5-дикетопиперазина. NH-CH-C H HO OH H C-CH-NH O аланин CH3 O t o HN 5 2 O O 6 1 NH 3 4 CH3 3,6-диметил-2,5-дикетопиперазин Гидролизом одной из пептидных связей в 3,6-диметил-2,5дикетопиперазине легко получить соответствующий дипептид. Качественные реакции. Особенность химии аминокислот и белков заключается в использовании многочисленных качественных (как правило, цветных) реакций. В настоящее время, когда исследование проводится с помощью физико-химических методов, многие качественные реакции продолжают применяться для обнаружения аминокислот в хроматографическом анализе. Общая качественная реакция -аминокислот – реакция с нингидрином. Эта реакция окисления -аминокислот нингидрином, сопровождаемая их дезаминированием и декарбоксилированием, а также образованием красителя из нингидрина с участием растворенного в воде кислорода. Продукт нингидринной реакции имеет сине-фиолетовый цвет, что используется для визуального обнаружения аминокислот на хроматограммах (на бумаге, в тонком слое), а также спектрофотометрического определения с помощью аминокислотных анализаторов (продукт поглощает свет в области 550-570 нм). 53 O C O C OH + H2N-CH-COOH OH -CO2 C C OH R -NH3 O O -R-CH=O нингидрин дикетооксигидринден (гидратная форма 1,2,3-индантриона) O O HO C C OH + NH3 + -3H2O C из аминокислоты HO C O O O C C O O N= OH O C C C N= C C C O O C C O NH3 O NH4 O C C C N= C C C O O Для обнаружения ароматических и гетероциклических -аминокислот используется ксантопротеиновая реакция (реакция на фенилаланин, тирозин, гистидин, триптофан). Например, при действии концентрированной азотной кислотой на тирозин образуется нитросоединение, окрашенное в желтый цвет. При добавлении к нему щелочи окраска становится оранжевой в связи с ионизацией фенольной гидроксильной группы и увеличением вклада аниона в сопряжение. O2N HNO3 CH-COOH HO HO CH-COOH NH2 NH2 тиразин (желтая окраска) 54 O2N NaOH O CH-COONa NH2 (оранжевая окраска) Цистеин обнаруживается с помощью нескольких качественных реакций, основанных на реакционной способности содержащейся в нем меркаптогруппы. Например, при нагревании раствора белка с ацетатом свинца в щелочной среде образуется черный осадок тиолята свинца, что указывает на присутствие в белках цистеина. SH (HOOCCHCH2S)2Pb 2CH2CHCOOH + (CH3COO)2Pb -2CH3COOH NH2 NH2 Триптофан обнаруживают при помощи реакции с парадиметиламинобензальдегидом в среде серной кислоты по появляющемуся красно-фиолетовому окрашиванию (реакция Эрлиха). Эта реакция используется для количественного анализа триптофана в продуктах расщепления белков. 3.2. ПЕПТИДЫ, БЕЛКИ Пептиды и белки представляют собой соединения, построенные из остатков -аминокислот. Пептидную или белковую молекулу формально можно представить как продукт поликонденсации -аминокислот, протекающей с образованием пептидной (амидной) связи между мономерными звеньями. O O O H2N-CH-C-OH + H-NH-CH-C-OH + ...H-NH-CH-C-OH R1 R2 Rn O O O H2N-CH-C-NH-CH-C- ...NH-CH-C-OH R1 R2 амидная связь Rn Полиамиды представляют собой неразветвленные цепи, состоящие из чередующихся амидных и замещенных метиновых групп. 55 амидные группы метиновые группы O O O H2N-CH-C-NH-CH-C-...NH-CH-C-OH R1 R2 амидная связь Rn С-конец N-конец Боковые радикалы Один конец цепи, называют N-концом, другой, на котором находится аминокислота со свободной СООН-группой, - С-концом. Пептидные и белковые цепи принято записывать с N-конца. Название пептидов строится путем последовательного перечисления аминокислотных остатков, начиная с N-конца с добавлением суффикса «-ил», а для последней С-концевой аминокислоты сохраняется ее полное название. Для сокращенной записи состава пептидов и белков используются трехбуквенные обозначения аминокислот. Например: трипептид - глутатион -глутамил цистенил глицин H2N - CH - CH2 - CH2 CO - NH - CH - CO - NH - CH2 - COOH COOH CH2 - SH -глутамилцистеинилглицин; сокращенная запись : -глу-цис-гли Для пептидов и белков принято записывать концевые группы неионизованными, хотя в действительности в водных растворах они, конечно, ионизованы и на N-конце находится аммонийная группа, проявляющая кислотные свойства, а на С-конце – ионизованная карбоксильная группа, проявляющая основные свойства. Это особенно принципиально при рассмотрении их кислотно-основных свойств. 3.2.1. СИНТЕЗ ПЕПТИДОВ Сложность синтеза пептидной макромолекулы связана с необходимостью обеспечения строго определенной последовательности 56 аминокислот. В лабораторных условиях пептиды могут быть получены разнообразными методами. а). Классический метод синтеза пептидов основан на использовании на соответствующих этапах защиты (блокирования) одних и активации других функциональных групп. Активными должны быть функциональные группы, образующие амидную связь, т.е. карбоксильная группа одной аминокислоты и аминогруппа другой аминокислоты. Аминогруппу «будущей» N-концевой аминокислоты защищают ацильным радикалом (см. 3.1.5.2), а ее карбоксильную группу активируют путем перевода в смешанный ангидрид (см. 3.1.5.4). В «будущей» С-концевой аминокислоте защищают карбоксильную группу путем превращения ее в сложноэфирную (см. 3.1.5.3). Принципиальная схема синтеза пептидов может быть представлена следующим образом. защита активация защита O X-NHCHC Y R O + NH2CHC OR2 R1 образование пептидной цепи O снятие O O защиты H N-CH-C-NH-CH-COOH X-NH-CH-C-NH-CH-C 2 2 OR R R R1 R1 дипептид пептидная группа Первым примером синтеза биологически активных пептидов послужило воссоздание полной структуры двух гормонов – окситоцина и вазопрессина (1953 – 1955). Крупным успехом был синтез инсулина, осуществленный в нескольких странах (1963 – 1965). Однако синтез дипептида требует нескольких стадий. Для синтеза пептида из 50 аминокислотных остатков понадобится огромное число стадий, что приводит к большим потерям из-за необходимости непрерывного выделения и очистки промежуточных продуктов при синтезе. Это служит основным ограничением классического подхода к получению пептидов. б). Наибольшую известность получил метод твердофазного синтеза пептидов ТФСП, предложенный Р. Меррифилдом в 1962 году (рис. 3.1).. В данном случае СООН-группу исходной аминокислоты защищают присоединением к полимеру, а NH2-группу присоединяемой аминокислоты – трет-бутилоксикарбонильным (БОК) радикалом. После 57 присоединения последнего аминокислотного остатка аддукт полипептида и полимера обрабатывают смесью бромоводорода и трифторуксусной кислоты (ТФУ). В результате полипептид освобождается от полимера, а с N-концевой аминокислоты снимается защитная группа. Преимущество этого метода по сравнению с классическими методами синтеза состоит в том, что ни на одной из стадий он не требует выделения растущей полипептидной цепи. В силу чрезвычайно низкой растворимости аддукт пептида и полимера легко отмывается после каждой реакции от побочных продуктов, растворителей и избытка реагентов без потери пептида, после чего аддукт готов к следующей реакции. В настоящее время этот метод автоматизирован, и запрограммированные аминокислотные синтезатор ы без труда могут присоединять шесть аминокислот к растущей полипептидной цепи за 2 часа. При помощи метода ТФСП были синтезированы инсулин и фермент «рибонуклеаза», состоящий из 124 аминокислот. CH3 CH3-C-O-CO-HN-CH-COOH + ClCH2 CH3 R БОК-аминокислота - полимер хлорметилированный полимер O CH3 CH3-C-O-CO-HN-CH-C-O-CH2 CH3 R - полимер БОК-аминоацилполимер O снятие защиты с NH2группы аминокислоты NH2-CH-C-O-CH2 -CO2 ; -(CH3)2C=CH2 - полимер CH3 CH3-C-O-CO-HN-CH-COOH CH3 R1 58 O O CH3 O CH3-C-O-CO-HN-CH-C-O-NH-CH-C-O-CH2 CH3 R1 R HBr - полимер O NH2-CH-C-O-NH-CH-COOH + CH3C=CH2 + CH3 R R1 дипептид - полимер + BrCH2 Рис.3.1. твердофазного синтеза пептидов и белков в). Жидкофазный синтез (Шемякин М.М.). Этот метод отличается от твердофазного только тем, что вместо твердого носителя используется растворимый полистирол. Синтез в гомогенной фазе (в растворе) протекает с высокой скоростью, не ограничивает выбор защитных групп. 3.2.2. ПРОСТРАНСТВЕННОЕ СТРОЕНИЕ ПОЛИПЕПТИДОВ И БЕЛКОВ Определяющее значение в формировании более высоких уровней организации белковых молекул имеет их первичная структура. Природа -аминокислотных остатков и порядок их соединения обуславливают характер стабилизации более высокоорганизованных структур. При этом существенную роль играет важнейшее звено первичной структуры – пептидная группа. 3.2.2.1. Строение пептидной группы. В пептидной группе связь между карбонильным углеродным атомом и атомом азота, находящимся в sp2состоянии, называется пептидной (амидной) связью. В пептидной (амидной) группе –СONH – атом углерода находится в состоянии sp2-гибридизации. Неподеленная пара электронов атома азота вступает в сопряжение с -электронами двойной связи С=О. С позиций электронного строения пептидная группа представляет собой трехцентровую р,-сопряженную систему, электронная плотность в которой смещена в сторону более электроотрицательного атома кислорода. Атомы С, О и N, образующие сопряженную систему, находятся в одной плоскости. Распределение электронной плотности в амидной группе можно представить с помощью граничных структур (I) и 59 (II) или смещения электронной плотности в результате +М- и –Мэффектов групп – NH и C=O соответственно (III). H H H C N .. C N C N .. O O (II) (I) (III) В результате сопряжения происходит некоторое выравнивание длин связей. Двойная связь С=О удлиняется до 0,124 нм против обычной длины 0,121 нм, а связь С-N становится короче – 0,132 нм по сравнению с 0,147 нм в обычном случае (рис. 3.1.). O Рис. 3.1. Плоскостное расположение пептидной группы – СONH-и углеродных атомов аминокислотных остатков Наличие плоской сопряженной системы в пептидной группе является причиной затруднения вращения вокруг связи С-N (барьер вращения составляет 63-84 кДж/моль) Таким образом, электронное строение предопределяет достаточно жесткую плоскую структуру пептидной группы. Как видно из рис. 3.1, -углеродные атомы аминокислотных остатков располагаются в плоскости пептидной группы по разные стороны от связи С-N, т.е. в более выгодном транс-положении. В этом случае боковые радикалы R аминокислотных остатков будут наиболее удалены друг от друга в пространстве. Полипептидная связь имеет однотипное строение и может быть представлена в виде ряда расположенных под углом друг к другу плоскостей пептидных групп, соединенных между собой через углеродные атомы C - N и С - Сsp2 (рис. 3.2.). 60 Вращение вокруг этих одинарных связей весьма ограничено вследствие затруднений в пространственном размещении боковых радикалов аминокислотных остатков. Таким образом, электронное и пространственное строение пептидной группы во многом предопределяет структуру полипептидной цепи в целом. Это определенным образом сказывается также на свойствах полипептидов и белков: по месту пептидных связей легко осуществляется таутомерная перегруппировка, приводящая к образованию енольной формы пептидной связи, которая отличается повышенной реакционной способностью. OH O C C N N енольная форма кето-форма Рис. 3. 2 Взаимное расположение плоскостей пептидных групп в полипептидной цепи 3.2.3. ПЕРВИЧНАЯ СТРУКТУРА 3.2.3.1. Состав и аминокислотная последовательность При единообразно построенной полиамидной цепи специфичность пептидов и белков определяется двумя важнейшими характеристиками – аминоксилотным составом и аминокислотной последовательностью. 61 Аминокислотный состав пептидов и белков – это природа и количественное соотношение входящих в них -аминокислот. Один из подходов к решению этой проблемы состоит в химическом гидролизе. Амидные связи могут гидролизоваться как в кислой, так и щелочной средах. Пептиды и белки гидролизуются с образованием либо более коротких цепей – это так называемый частичный гидролиз, либо смеси -аминокислот при полном гидролизе. Щелочной гидролиз практически не используется из-за неустойчивости многих -аминокислот в этих условиях. Полный гидролиз осуществляется при нагревании с 20%ой хлороводородной кислотой до температуры 110 оС в течение 24 ч. в запаянной ампуле (в вакууме или атмосфере азота). В результате образуется смесь -аминокислот. Аминокислотный состав устанавливают путем анализа пептидных и белковых гидролизатов чаще всего хроматографическими методами. В настоящее время такой анализ осуществляется с помощью аминокислотных анализаторов. Другой путь – избирательный гидролиз, при котором от фрагмента отщепляют по одной аминокислоте на каждом этапе. Избирательный гидролиз (ферментативный гидролиз) чаще всего проводят с помощью ферментов из поджелудочной железы, так называемых карбоксипептидаз. Эти ферменты способны гидролизовать только С-концевые аминокислоты и, следовательно, постепенно разрушать пептидный фрагмент с С-конца. Нередко достаточно бывает проанализировать различные концентрации аминокислот полученных под действием карбоксипептидазы, которая гидролизовала фрагмент в течение постепенно возрастающих промежутков времени, чтобы получить необходимые данные относительно аминокислотной последовательности. Первичная структура пептидов и белков – это аминокислотная последовательность, т.е. порядок чередования, -аминокислотных остатков. Учитывая, что в составе белковой молекулы содержится как минимум несколько десятков аминокислотных остатков, определение местоположения каждого из них составляет весьма сложную задачу. Первичная структура определяется путем последовательного отщепления -аминокислот с какого-либо конца и их идентификации. Довольно хорошо разработаны химические способы отщепления аминокислот с N-конца. Метод динитрофенилирования. Один из методов, используемых для идентификации NH2-концевых групп в полипептидах, основан на использовании реакции Сэнгера. Высокая нуклеофильность атома азота -аминокислот позволяет проалкилировать его 2,4-динитрофторбензолом (ДНФБ, реактив Сэнгера). В этом соединении электрофильность бензольного ядра вследствие влияния двух сильных 62 электроноакцепторных нитрогрупп значительно повышена, что сильно увеличивает способность атома фтора вступать в реакцию замещения: NO2 NO2 O O F + H2N-CH-C-NH-CH-C-... R1 R ДНФБ KOH -KF, -H2O полипептид NO2 O O HN-CH-C-NH-CH-C-... NO2 R R1 "меченный полипептид" NO2 H O HN-CH-C-OH R NO2 + Смесь -аминокислот ДНФ-производное N-концевой -аминокислоты Образующееся динитрофенильное производное аминокислоты легко выделяется и идентифицируется хроматографически. Метод Эдмана. Более удобный метод идентификации NH2-концевых аминокислот – это расщепление по методу Эдмана. Метод заключается во взаимодействии N-концевой -аминокислоты с фенилизотиоцианатом в щелочной среде. Взаимодействие -аминокислот с фенилизоцианатом протекает по механизму нуклеофильного присоединения. В образовавшемся продукте далее осуществляется внутримолекулярная реакция нуклеофильного замещения, приводящая к образованию циклического замещенного амида. .. C6H5-N=C=S + H2N-CH2-COOH фенилизотиоцианат глицин 63 S O .. C6H5NH-C-NHCH2C S + H -H2O OH C C6H5N C NH CH2 O фенилтиогидантоин Циклические соединения получаются с количественным выходом и представляют собой фенильные производные тиогидантоина, поэтому для них принято название фенилтиогидантоиновых производных (ФТГпроизводных) -аминокислот. ФТГ-производные различаются строением радикала R. При дальнейшей обработке слабой кислотой без нагревания происходит отщепление от цепи «меченной» N-концевой ФТГ-аминокислоты. ФТГаминокислота идентифицируется методом тонкослойной или газожидкостной хроматографии. Преимущество метода Эдмана состоит в том, что при отщеплении каждой концевой -аминокислоты остальная часть пептидной молекулы не разрушается и операции по отщеплению можно повторять. Метод Эдмана оказался пригодным для воспроизведения в автоматическом приборе – секвенаторе (от англ. sequence – последовательность). При помощи этого прибора удалось расшифровать последовательность первых 60 аминокислотных остатков в миоглобине кита (начиная с NH2-конца полипептидной цепи). Дансильный метод. Основан на получении производных N-концевой аминокислоты при обработке дансилхлоридом (5-диметиламинонафталин1-сульфонилхлорид) и последующем отщеплении при гидролизе разбавленной хлороводородной кислотой (105 оС, 12-16 ч). Дансилпроизводные -аминокислот (ДНС-аминокислоты) обладают интенсивной флуоресценцией, позволяющей обнаружить их содержание даже в ничтожно малых количествах. Дансильный метод – один из самых высокочувствительных методов, так как для идентификации ДНСаминокислот используется высокоэффективная жидкостная хроматография с флуоресцентным детектором. По мере совершенствования экспериментальных методов и внедрения автоматических приборов быстро возрастает число пептидов и белков с установленной первичной структурой. 64 N(CH3)2 O O + H2N-CH-C-NH-CH-C-... R R1 SO2Cl дансилхлорид полипептид N(CH3)2 гидролиз O O SO2HN-CH-C-NH-CH-C-... R R1 N(CH3)2 + Смесь -аминокислот O SO2HN-CH-C-OH R дансилпроизводное N-концевой -аминокислоты Химические свойства пептидов и белков и особенно их биологические и физиологические функции зависят не только от числа и последовательности аминокислотных остатков в цепи, но и от конформации цепи в растворе. Поэтому для высокомолекулярных полипептидов и белков наряду с первичной структурой характерны более высокие уровни организации, которые принято называть вторичной, третичной и четвертичной структурами. Первые три уровня характерны для структурной организации всех белковых молекул. Четвертый уровень встречается при образовании единых белковых комплексов, состоящих из нескольких полипептидных цепей. Конформации макромолекулы белка в растворе представляют собой различные ее пространственные формы, возникающие в результате поворотов отдельных молекулярных фрагментов вокруг одинарных связей. Они стабилизируются за счет межмолекулярных взаимодействий между отдельными группами данной макромолекулы или молекулами веществ, находящихся в окружающем растворе. Взаимные переходы 65 конформаций в основном осуществляются без разрыва ковалентных связей в макромолекуле белка. 3.2.4. ВТОРИЧНАЯ СТРУКТУРА БЕЛКА Под вторичной структурой белка подразумевают способ укладки полипептидной цепи в упорядоченную структуру, которая протекает не хаотично, а в соответствии с программой, заложенной в первичной структуре. Строго линейное расположение полипептидной цепи энергетически невыгодно, так как оно практически исключает взаимодействия между различными радикалами аминокислотных остатков. В результате именно таких взаимодействий возникают дополнительные связи, которые стабилизируют ту или иную конформацию белковой цепи в пространстве. Это происходит за счет следующих взаимодействий: ион-ионного взаимодействия; водородной связи; гидратации полярных групп; дисульфидной связи; взаимодействий Ван-дер-Ваальса между неполярными заместителями; гидрофобных взаимодействий, в результате которых выталкиваются молекулы воды из зоны взаимодействия неполярных заместителей между собой, а также донорно-акцепторной связи между ионом комплексообразователя и лигандными группами белка. По конфигурации выделяют следующие элементы вторичной структуры: спираль и складчатый слой. Модель строения спирали, учитывающая все свойства пептидной связи, была разработана Л. Полингом и Р. Кори (1949-1951гг.) (рис. 3.3). Полипептидная цепь сворачивается таким образом, что витки спирали регулярны, поэтому спиральная конфигурация имеет винтовую симметрию. На каждый виток (шаг) спирали приходится 3,6 аминокислотных остатков, радикалы которых направлены всегда наружу и немного назад, т.е. отклонены в сторону начала полипептидной цепи. Расстояние между витками вдоль оси или шаг спирали равен 0,54 нм, а на один аминокислотный остаток приходится 0,15 нм. Угол подъема спирали равен 26 0; через каждые 5 витков спирали (18 аминокислотных остатков) структурная конфигурация полипептидной цепи повторяется. Это означает что период повторяемости (или идентичности) спиральной структуры составляет 2,7 нм. 66 Рис. 3.3. -Спиральная конформация полипептидной цепи Закручивание полипептидной цепи происходит по часовой стрелке (правый ход спирали, если смотреть в торец молекулы со стороны Nконцевой аминокислоты полипептидной цепи – начало молекулы). Это обусловлено L-аминокислотным составом природных белков. Формирование и поддержание -спиральной конфигурации происходит за счет образования водородных связей между каждым кислородом группы С=О первого аминокислотного остатка и водородом NН-группы каждого пятого аминокислотного остатка. Водородные связи почти параллельны оси -спирали. Хотя энергия этих связей невелика, большое количество их приводит к значительному энергетическому эффекту, в результате чего спиральная конфигурация достаточно устойчива. Предполагают, что электроны СО- и NH-группировок полипептидной цепи могут вступать во взаимодействие через водородные связи, осуществляющие контакт соседних витков -спирали. В результате на спирализованном участке белковой молекулы возникают зоны сопряжения электронов, служащие для передачи энергии возбуждения электронов. Это имеет большое значение для осуществления химических реакций и трансформации одного вида энергии в другой. Боковые радикалы аминокислотных остатков не участвуют в поддержании -спиральной конфигурации. 67 Обычно белковые цепи спирализованы не полностью, а лишь частично. Так, цепь миоглобина спирализована на 75%. Отсутствие спирализации для остальной части молекулы связано с наличием Rгрупп в цепи препятствующих этому. Складчатый слой – второй элемент вторичной структуры (рис. 3.4). В отличие от спирали -складчатый слой имеет линейную, а не стержневую форму. Линейная структура удерживается благодаря возникновению водородных связей между пептидными группировками, стоящими на разных участках полипептидной цепи, расположенных параллельно. Эти участки оказываются сближенными на расстояние водородной связи между –С=О и HN-группами (0,272 нм). При этом Rгруппы располагаются в регулярном порядке над и под плоскостью складчатого слоя. Большинство складчатых листков содержат не более шести полипептидных цепей. В случае, если цепи, образующие листок, параллельны (имеют одинаковое направление от N-конца к С-концу, то образуется параллельный складчатый листок. Рис. 3.4. Вторичная структура полипептидной цепи в виде складчатого листа (-структура) В случае антипараллельных цепей возникает структура антипараллельного складчатого листа. Структура антипараллельного листка может возникнуть и у одной цепи, если она изгибается «сама на себя» и в пространстве сближаются два ее участка. Во многих белках одновременно имеются и спиральные, и складчатые структуры. Доля спиральной конфигурации у разных белков различна. Так, мышечный белок парамиозин практически на 100% 68 спирализован. Напротив, у трипсина и рибонуклеазы значительная часть полипептидной цепи укладывается в слоистые структуры. Белки опорных тканей – кератин (белок волос), коллаген (белок кожи и сухожилий) – имеют конфигурацию полипептидных цепей. Складчатые листки могут быть плоскими и закрученными. Например, феброин шелка содержит очень длинные скрученные ленты складчатого листка. Структура широкого (шестицепочечного) складчатого листка соответствует по геометрическим параметрам желобу двойной спирали ДНК. Невысокая прочность водородных связей позволяет сравнительно легко трансформировать вторичную структуру под внешним воздействием: изменением температуры, состава, рН среды или под механическим воздействием. В результате трансформации вторичной структуры белка меняются его нативные, т.е. первичные от природы, свойства, а, следовательно, его биологические и физиологические функции. 3.2.5. ТРЕТИЧНАЯ СТРУКТУРА БЕЛКА Третичная структура белка – это способ укладки полипептидной цепи в пространстве. Для того чтобы белок приобрел присущие ему функциональные свойства, полипептидная цепь должна определенным образом свернуться в пространстве, сформировав функционально активную структуру. Такая структура называется нативной. Решающая роль в формировании и стабилизации третичной структуры белковой молекулы принадлежит взаимодействию боковых заместителей аминокислот, которые сближаются в пространстве за счет изгиба полипептидной цепи. Третичная структура белковой молекулы возникает автоматически в результате самоорганизации полипептидной цепи в соответствии с ее первичной и вторичной структурами, а также в соответствии с составом окружающего раствора. Стабилизируют третичную структуру белка боковыми радикалами взаимодействия, возникающие между аминокислотных остатков разных участков полипептидной цепи. Эти взаимодействия подразделяются на сильные и слабые. К сильным взаимодействиям относятся ковалентные связи между атомами серы остатков цистеина, стоящих на разных участках полипептидной цепи. Иначе такие связи называются дисульфидными мостами. Кроме ковалентных связей третичная структура белковой молекулы поддерживается слабыми взаимодействиями, которые, в свою очередь, поразделяются на полярные и неполярные. К полярным взаимодействиям относятся ионные и водородные связи. Ионные взаимодействия образуются при контакте положительно 69 заряженных групп боковых радикалов лизина, аргинина, гистидина и отрицательно заряженной СООН-группы аспарагиновой и глутаминовой кислот. Водородные связи возникают между функциональными группами боковых радикалов аминокислотных остатков. Неполярные или ван-дер-вальсовы взаимодействия между углеводородными радикалами аминокислотных остатков способствуют формированию гидрофобного ядра (жирной капли) внутри белковой избежать глобулы, т.к. углеводородные радикалы стремятся соприкосновения с водой. Чем больше в составе белка неполярных аминокислот, тем большую роль в формировании его третичной структуры играют Ван-дер-вальсовы силы. Многочисленные связи между боковыми радикалами аминокислотных остатков определяют пространственную конфигурацию белковой молекулы (рис. 3.5.) Рис. 3.5. Типы связей, поддерживающих третичную структуру белка; а – дисульфидный мостик; б – ионная связь; в, г – водородные связи; д – ван-дер-ваальсовы связи Третичная структура отдельно взятого белка уникальна, как уникальна и его первичная структура. Только правильная пространственная укладка белка делает его активным. Различные нарушения третичной структуры под воздействием внешних факторов приводят к изменению свойств белка и потере биологической активности. Третичная структура белка, по сравнению с его вторичной структурой, еще более чувствительна к 70 действию слабых окислителей, смене растворителей, изменению ионной силы, рН среды и температуры. 3.2.6. ЧЕТВЕРТИЧНАЯ СТРУКТУРА БЕЛКА Белки с молекулярной массой более 60000 обычно представляют собой агрегаты, которые состоят из нескольких полипептидных цепей со сравнительно небольшой молекулярной массой. Структура, состоящая из определенного числа полипептидных цепей, занимающих строго фиксированное положение относительно друг друга, вследствие чего белок обладает той или иной активностью, называется четвертичной структурой белка. Белок, обладающий четвертичной структурой, называется эпимолекулой или мультимером, а каждая цепь, сохраняя характерную для нее первичную, вторичную и третичную структуру, называется субъединицей или протомером. Характерным свойством белков с четвертичной структурой является то, что отдельная субъединица не обладает биологической активностью. Стабилизация четвертичной структуры белка происходит за счет полярных взаимодействий между боковыми радикалами аминокислотных остатков, локализованных на поверхности субъединиц. Такие взаимодействия прочно удерживают субъединицы в виде организованного комплекса. Участки субъединиц, на которых происходят взаимодействия, называются контактными площадками. Классическим примером белка, имеющего четвертичную структуру, является гемоглобин (рис.3.6). H3C CH=CH2 N H3C CH3 N HOOCCH2CH2 Fe N CH=CH2 N HOOCCH2CH2 CH3 Рис. 3.6. гемин-фрагмент гемоглобина 71 Молекула гемоглобина состоит из 4 субъединиц двух разных типов - и . Субъединица состоит из 141 аминокислотного остатка, а из 146. Третичная структура - и -субъединиц сходна. Каждая субъединица содержит простетическую группу гем. Группировка гема представляет собой сложную копланарную циклическую систему, состоящую из центрального атома, который образует координационные связи с четырьмя остатками пиррола, соединенными метиновыми мостиками (=СН). В гемоглобине железо обычно находится в состоянии окисления (2). Четыре субъединицы две и две соединяются в единую структуру таким образом, что субъединицы контактируют только с субъединицами и наоборот (рис. 3.6). Как видно из рисунка (рис.3.7), одна молекула гемоглобина способна переносить 4 молекулы кислорода. Рис. 3.7. Схематическое изображение четвертичной структуры гемоглобина. Fe - гем гемоглобина И связывание, и освобождение кислорода сопровождается конформационными изменениями структуры - и -субъединиц гемоглобина и их взаимного расположения в эпимолекуле. Этот факт свидетельствует о том, что четвертичная структура белка не является абсолютно жесткой. В организме гемоглобин выполняет функции переносчика кислорода из легких в мышечные ткани. Связывание кислорода в легких с образованием оксигемоглобина происходит при достаточно высоких значениях рН (7,6). При более низких значениях рН (7,2), что имеет место в тканях, гемоглобин протонируется, освобождая при этом кислород и связывая диоксид углерода, который присоединяется 72 к концевой -аминогруппе каждой из четырех полипептидных цепей с образованием карбаминогемоглобина. Другой глобулярный белок, миоглобин, присутствующий в мышечных тканях (особенно морских млекопитающих), в отличие от гемоглобина выполняет кислород-связывающие функции. Миоглобин запасает связанный кислород и способствует его переносу в митохондрии, которые потребляют кислород при окислении поступающих в клетку питательных веществ. В молекуле миоглобина содержится одна полипептидная цепь из 153 аминокислотных остатков и одна гемогруппа. 3.2.7. КЛАССИФИКАЦИЯ БЕЛКОВ Ввиду огромного числа белков, функционирующих в живых организмах, не существует единой классификации. В настоящий момент действует несколько классификаций; в основу каждой из них положен какой-либо признак, по которому белки объединяют в узкие или широкие группы. В зависимости от молекулярной массы полиамида различают олигопептиды – полиамиды, содержащие не более 10 аминокислотных остатков и полипептиды, в состав которых входит до 100 аминокислотных остатков. Полиамиды, содержащие более 100 молекул аминокислот, называются белками. Молекулярная масса белков варьирует в очень широких пределах: от 10000 до 1000000 и выше. По степени сложности строения белки делят на простые и сложные. Простые или однокомпонентные белки состоят только из белковой части и при гидролизе дают аминокислоты. К сложным или двухкомпонентным относят белки, в состав которых входит протеин и добавочная группа небелковой природы, называемая простетической. В качестве простетической группы могут выступать липиды, углеводы, нуклеиновые кислоты. В зависимости от химической природы простетические группы различают следующие классы протеидов: Класс протеидов Гемопротеиды Гликопротеиды Липопротеиды Фосфопротеиды Металлопротеид ы Простетическая группа Гем Углеводы Липиды Фосфатные группы Железо Цинк 73 Пример Гемоглобин -Глобулин крови 1-Липопротеин крови Казеин молока Ферритин Алкогольдегидроген аза По форме белковой молекулы белки разделяют на две группы: фибриллярные (волокнистые) и глобулярные (корпускулярные). Фибриллярные белки характеризуются структурой -складчатого листка, имеют волокнистое строение, не растворяются в воде. Их молекулы обычно собраны в пучки, которые образуют волокна. Фибриллярные белки являются главными компонентами наружного слоя кожи, образуя защитные покровы тела человека. Они также участвуют в образовании соединительной ткани, включая хрящи и сухожилия. Примеры: -кератин (белок волос, роговой ткани), -феброин (белок шелка), миоинозин (белок мускульной ткани). Подавляющее количество природных белков относится к глобулярным. Для глобулярных белков характерна -спиральная структура, цепи изогнуты в пространстве, вследствие чего макромолекула принимает форму сферической частицы. Эти белки растворяются в воде и солевых растворах с образованием коллоидных систем. Имея более сложную конформацию, глобулярные белки выполняют более разнообразные, по сравнению с фибриллирными белками, функции. Примерами таких белков являются альбумин (яичный белок), глобин (белковая часть гемоглобина), миоглобин. По отношению к условно выбранным растворителям выделяют альбумины и глобулины. Альбумины очень хорошо растворяются в воде и в концентрированных солевых растворах. Для них характерна растворимость в водном растворе сульфата аммония (NH4)2SO4 c концентрацией, превышающей 50% от насыщения белкового раствора. Глобулины не растворяются в воде и в растворах солей умеренной концентрации. При 50-процентной концентрации сульфата аммония в белковом растворе глобулины полностью выпадают в осадок. В природе существуют белки, строение которых, не соответствует ни -, ни -структурам. Типичным примером таких белков является коллаген – фибриллярный белок, составляющий основную массу соединительной ткани в организме человека и животных. Коллаген – волокнистый, нерастворимый в воде белок. В естественных условиях коллаген находится в форме длинных фибриллярных нитей, однако при нагревании эти нити превращаются в беспорядочные клубочки, получившие название желатины. Коллаген легко адсорбирует воду и сморщивается при нагревании. У коллагена специфический аминокислотный состав и последовательность аминокислот, придающий ему своеобразную вторичную структуру. В коллагенах высокий процент глицина (30-33%) и около 10-12%, гидроксипролина и гидроксилизина (образуются 74 гидроксилированием уже включенных в цепь пролиновых и лизиновых остатков), мало тирозина и метионина и почти нет триптофана и цистеина. Из-за высокого содержания пролина и гидроксипролина в этих цепях нет -спиралей; почти каждая третья аминокислота представлена глицином. По этим причинам, а также благодаря регулярности расположения пролина и гидроксипролина триплетная цепь принимает форму «ломаной спирали». Каждые три полипептидные цепи в коллагене скручены и образуют тройную спираль. Между цепями водородные связи возникают только за счет NH-группы глицина и С=О группы пролина или другой аминокислоты. Ограничение в образовании водородных связей вызвано отсутствием атомов водорода при азоте пролина и гидроксипролина. Спиральные цепи сильно сближены и в целом суперспираль имеет компактную структуру. Внутрь спирали погружены только атомы водорода при С-атомах глицина. R-группы других аминокислот расположены на внешней стороне суперспирали. С нарушением в синтезе коллагена в организме связаны некоторые заболевания, например цинга. Витамин «С» выполняет функцию кофермента при ферментативном гидроксилировании пролина и лизина, поэтому его недостаток вызывает нарушения синтеза коллагена. В результате недостатка коллагена происходит ослабление костной и зубной тканей, связок. Коллаген, как биополимер, используется в медицине. Из него изготовляют новые пластические биосовместимые материалы. Функциональная классификация белков наиболее удовлетворительная, поскольку в ее основу положен не случайный признак, а выполняемая функция. Кроме того, можно выделить сходство структур, свойств и функциональной активности входящих в какой-либо класс конкретных белков. Каталитически активные белки называются ферментами. Они осуществляют катализ практически всех химических превращений в клетке. Гормоны регулируют обмен веществ внутри клеток и интегрируют обмен в различных клетках организма в целом. Примерами простых гормонов являются окситоцин и вазопрессин, которые выделяются гипофизом и состоят из 9 аминокислотных остатков. 75 2 1 3 S S S 5 7 8 3 H3N-Cys-Tyr-Phe S 6 2 1 H3N-Cys-Tyr-Ile 4 Cys-Asn-Gln 6 5 7 8 4 Cys-Asn-Gln 9 9 Pro-Leu-Gly(CONH2) Pro-Arg-Gly(CONH2) вазопрессин окситоцин Окситоцин встречается только у женских особей, вызывая сокращение мышечных волокон молочных желез и мускулатуры матки. Вазопрессин содержится и в женском, и в мужском организме, регулируя минеральный обмен и водный баланс. Большую роль в поддержании уровня сахара в крови выполняет гормон инсулин, вырабатываемый поджелудочной железой. Он содержит 51 аминокислотный остаток и состоит из двух пептидных цепей, соединенных между собой двумя дисульфидными мостиками. Он регулирует метаболизм глюкозы. При недостаточном уровне биосинтеза инсулина в поджелудочной железе человека (в норме ежесуточно синтезируется 2 мг инсулина) развивается характерное заболевание – диабет. При этом повышается содержание глюкозы в крови. Одновременно развиваются различные вторичные явления – падает содержание гликогена в мышцах, замедляется биосинтез пептидов, белков и жиров, нарушается минеральный обмен и т.д. Поэтому его нередко принимают при лечении диабета. 1 7 Phe N-конец 1 Gly 6 Cys 19 Cys Cys S S S S 7 Cys 11 Cys Ala Цепь Б C-конец 20 Cys S 30 21 Asn Цепь А S инсулин Транспортные белки осуществляют связывание и транспорт веществ между тканями и через мембраны клетки. Структурные белки. Прежде всего, к этой группе относят белки, участвующие в построении различных биологических мембран. Белки – ингибиторы ферментов составляют многочисленную группу эндогенных ингибиторов. Они осуществляют регуляцию активности ферментов. 76 Сократительные белки обеспечивают механический процесс сокращения с использованием химической энергии. Токсичные белки – некоторые белки и пептиды, выделяемые организмами (змеями, пчелами, микроорганизмами), являющиеся ядовитыми для других живых организмов. Защитные белки. К этой группе белков принадлежат антитела – вещества белковой природы, вырабатываемые животным организмом в ответ на введение антигена. Антитела, взаимодействуя с антигенами, дезактивируют их и тем самым защищают организм от воздействия чужеродных соединений, вирусов, бактерий и т.д. Приведенные выше классы не исчерпывают перечень белков по функциональной классификации. Молекулы белков и отдельные их фрагменты рассматриваются как носители биологической информации, в которой роль букв алфавита играют 20 аминокислотных остатков. В основе считывания этой различные виды межмолекулярных информации находятся взаимодействий и стремление системы использовать их эффективно. Информационные свойства белков лежат в основе иммунитета, представляющего собой целостную систему биологических механизмов самозащиты организма, в основе которых лежат информационные процессы распознавания «свой» и «чужой». 3.2.8. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БЕЛКОВ Пептидная связь в пептидах и белках устойчива при 37 0С в нейтральной среде, но в кислой и щелочной средах может гидролизоваться. В организме гидролиз белка осуществляется под действием ферментов пептидаз и строго контролируется. Для белков характерна высокая вязкость растворов, незначительная диффузия, способность к набуханию в больших пределах, оптическая активность, низкое осмотическое давление, способность к поглощению ультрафиолетовых лучей при 280 нм (это свойство, обусловленное присутствием в белках ароматических аминокислот, используют для количественного определения белков). Молекулы белков содержат разные -аминокислоты, имеющие и гидрофобные радикалы на основе алифатических и ароматических углеводородов, и гидрофильные радикалы, включая пептидную группировку. Эти радикалы распределены по всей цепи, и поэтому большинство белков являются поверхностно-активными веществами (ПАВ). Характерная особенность белковых ПАВ – наличие в их молекулах фрагментов с резко различными гидрофильно-липофильным балансом. Это делает их эффективными стабилизаторами для лиофобных 77 дисперсных систем, эмульгаторами жиров и холестерина и активными компонентами биологических мембран. При этом липопротеины в основном транспортируют холестерин в клетки, а -липопротеины выводят из клеток избыток холестерина. Белки, как и -аминокислоты являются полиамфолитами. Взаимодействуя с окружающими молекулами растворителя (вода), свободные NH2 и СООН-группы белковой молекулы ионизируются, образуя катионные и анионные центры молекулы белка. В зависимости от их соотношения белковая молекула получает суммарный (+) или (-) заряд, а также характеризуется тем или иным значением рН среды при достижении изоэлектрической точки белка. Изоэлектрическая точка белка является характерной константой белка и для большинства белков животных тканей лежит в пределах от 5,5 до 7,0, что свидетельствует о частичном преобладании кислых аминокислот. Однако в природе имеются белки, у которых pI лежит при крайних значениях рН среды. В частности, pI пепсина (фермента желудочного сока) равна 1, а pI сальмина (основного белка из молок семги) около 12. В зависимости от аминокислотного состава белки подразделяются на «нейтральные» (рI = 5,0 7,0), «кислотные» (рI 4,0) и “основные”, или “щелочные” (рI 7,5). В “кислотных” белках повышенное содержание аспарагиновой или глутаминовой кислот, а в “основных” – аргинина, лизина или гистидина. В изоэлектрической точке белки наименее устойчивы и легко выпадают в осадок, обладая наименьшей растворимостью. Изоэлектрическая точка белка в сильной степени зависит от присутствия в растворе ионов солей, в то же время на ее величину не влияет концентрация белка. Различие в кислотно-основных свойствах белков лежит в основе разделения и анализа белковых смесей методами электрофореза и ионообменной хроматографии. Анализ белка с помощью электрофореза широко применяется в клинической биохимии для диагностики заболеваний. Еще одно своеобразное качество белков – денатурация. Денатурацией называется разрушение природной (нативной) конформации макромолекулы белка под внешним воздействием. При денатурации разрушаются четвертичная, третичная и вторичная структуры, а первичная структура белка сохраняется. При этом разрушаются в основном нековалентные (в частности, водородные) связи и дисульфидные мостики и не затрагиваются пептидые связи остова полипептидной цепи. Поэтому, в зависимости от природы белка и интенсивности внешнего воздействия, денатурация может иметь необратимый и обратимый характер. При определенных условиях 78 денатурированный белок можно частично или полностью вернуть к исходному состоянию. Такой белок называют ренатурированным. Необратимая денатурация обычно происходит при тепловом воздействии (например, свертывание яичного альбумина при варке яиц). У денатурированных глобулярных белков уменьшается сродство к воде, так как на поверхности молекул оказывается много гидрофобных радикалов. Поэтому снижается их растворимость, появляются хлопья и осадок. При денатурации утрачивается биологическая активность и глобулярных, и фибриллярных белков, что наблюдается при многих способах их выделения. Во избежание денатурации белка и для сохранения его нативной конформации в процессе выделения все операции проводят в мягких условиях при температуре не выше 5 0С, избегая резких воздействий химических реагентов. Процесс денатурации часто используют для практических целей, например при получении и хранении ферментов или других биологически активных белковых препаратов, в ряде процессов пищевой промышленности (при приготовлении яичного порошка, консервов и т.д.). Процесс денатурации используется и в медицинской практике. Так при отравлении сулемой или другими солями тяжелых металлов пострадавшему в качестве «противоядия» дают пить молоко или раствор яичного белка. При этом происходит адсорбция металлов на поверхности белка, образуются нерастворимые комплексы белка с металлами. 79 Борисова Елена Яковлевна Колобова Татьяна Петровна Борисова Надежда Юрьевна ХИМИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ЖИЗНИ Учебное пособие Подписано в печать Бумага писчая Отпечатано на ризографе. Тираж 50 экз. Заказ № Лицензия на издательскую деятельность ИД № 03507 (рег. № 003792) код 221 Московская государственная академия тонкой химической технологии им. М.В.Ломоносова Издательско-полиграфический центр 119571 Москва, пр. Вернадского 86. 80
