НАКОПЛЕНИЕ АЛАНИНА В КЛЕТКАХ ЭНДОФИТА Klebsiella
реклама
ÑÅËÜÑÊÎÕÎÇßÉÑÒÂÅÍÍÀß ÁÈÎËÎÃÈß, 2012, ¹ 3 ÓÄÊ 631.461.5:579.842.16:579.22 ÍÀÊÎÏËÅÍÈÅ ÀËÀÍÈÍÀ  ÊËÅÒÊÀÕ ÝÍÄÎÔÈÒÀ Klebsiella terrigena Å6  ÓÑËÎÂÈßÕ ÀÇÎÒÔÈÊÑÀÖÈÈ Ì.Ë. ÊÀÇÀÊÎÂÀ, Ê.Ì. ÇËÎÒÍÈÊÎÂ, À.Â. ÊÀÇÀÊÎÂ, À.Ê. ÇËÎÒÍÈÊΠÍà ìîäåëüíîì îáúåêòå (øòàìì Klebsiella terrigena Å6, ñïîñîáíûé êîëîíèçèðîâàòü òêàíè ÿ÷ìåíÿ è ïîäñîëíå÷íèêà) èçó÷àëè âîçìîæíûå ìåòàáîëè÷åñêèå ïóòè âûíîñà ôèêñèðóåìîãî N èç êëåòîê àçîòôèêñèðóþùèõ áàêòåðèé-ýíäîôèòîâ â íåáîáîâûå ðàñòåíèÿ.  èññëåäîâàíèè ðåàëèçîâàí îðèãèíàëüíûé ìåòîäè÷åñêèé ïîäõîä — àíàëèç ïóëà îñíîâíûõ àìèíîêèñëîò â áàêòåðèàëüíûõ êëåòêàõ ñ öåëüþ âûÿâëåíèÿ âîçìîæíîãî àêöåïòîðà àììîíèéíîé ãðóïïû ãëóòàìàòà, îáðàçóþùåãîñÿ ïðè àçîòôèêñàöèè. Îáíàðóæåíî, ÷òî â óñëîâèÿõ àçîòôèêñàöèè äîìèíèðóþùåé àìèíîêèñëîòîé â êëåòêàõ K. terrigena Å6 áûë àëàíèí (53,4 % îò ñóììû àìèíîêèñëîò). Ïðè äîáàâëåíèè â ñðåäó ðîñòà áàêòåðèé ïèðóâàòà íàêîïëåíèå àëàíèíà óâåëè÷èâàëîñü â 1,4 ðàçà. Ïîëó÷åííûå ðåçóëüòàòû ïîçâîëÿþò ïðåäïîëîæèòü, ÷òî àììîíèéíàÿ ãðóïïà ó K. terrigena Å6 ïðè àçîòôèêñàöèè ïåðåíîñèòñÿ èç ãëóòàìàòà íà ïèðóâàò, à îáðàçóþùèéñÿ ïðè ýòîì àëàíèí ìîæåò ñëóæèòü ïåðåíîñ÷èêîì ôèêñèðîâàííîãî àçîòà èç êëåòîê áàêòåðèé. Êëþ÷åâûå ñëîâà: àçîòôèêñàöèÿ, àëàíèí, áàêòåðèàëüíûé ýíäîôèò, Klebsiella terrigena. Keywords: nitrogen fixation, alanine, bacterial endophyte, Klebsiella terrigena. Èçâåñòíî, ÷òî íåêîòîðûå àçîòôèêñèðóþùèå áàêòåðèè (Acetobacter diazotrophicus, Herbaspirillum spp., Azospirillum spp., Klebsiella oxytoca) êîëîíèçèðóþò òêàíè ñåëüñêîõîçÿéñòâåííûõ ðàñòåíèé — ñàõàðíîãî òðîñòíèêà, ðèñà, ñîðãî, êóêóðóçû (1-3). Áûëî ïîêàçàíî, ÷òî àçîòôèêñèðóþùèå ýíäîôèòû K. oxytoca è K. planticola ìîãóò ñíàáæàòü ðàñòåíèå-õîçÿèíà àçîòîì èç àòìîñôåðû (4). Òàê, áàêòåðèàëüíûå ýíäîôèòû Acetobacter diazotrophicus è Herbaspirillum spp., âûäåëåííûå èç ñàõàðíîãî òðîñòíèêà, îáåñïå÷èâàþò äî 80 % ïîòðåáíîñòè ðàñòåíèÿ â àçîòå (3, 5). Êðîìå òîãî, áàêòåðèè-ýíäîôèòû ñïîñîáíû âûäåëÿòü ôèçèîëîãè÷åñêè àêòèâíûå âåùåñòâà, ïîëîæèòåëüíî âîçäåéñòâóÿ íà ðîñò, ðàçâèòèå è èììóíèòåò ðàñòåíèé (5, 6). Àçîòôèêñèðóþùèå áàêòåðèè ðîäà Klebsiella â ýòîé ñâÿçè ïðåäñòàâëÿþò îñîáûé èíòåðåñ. Óñòàíîâëåíî, ÷òî K. oxytoca êîëîíèçèðóåò âíóòðåííèå òêàíè ïøåíèöû, ðèñà è òàáàêà (7, 8), K. terrigena — òêàíè ÿ÷ìåíÿ, òàáàêà è ïîäñîëíå÷íèêà (7, 9). Íàçâàííûå áàêòåðèè òàêæå îòíîñÿòñÿ ê àêòèâíûì ïî÷âåííûì àçîòôèêñàòîðàì, ñèíòåçèðóþò àóêñèíû è ïîäàâëÿþò ðàçâèòèå ôèòîïàòîãåííûõ ãðèáîâ (10). Èíîêóëÿöèÿ ñåìÿí ÿ÷ìåíÿ øòàììîì K. terrigena Å6 ïîâûøàåò ýíåðãèþ ïðîðàñòàíèÿ è ñïîñîáñòâóåò ðîñòó ðàñòåíèé (9). Ïðè î÷åâèäíîì âêëàäå N-ôèêñèðóþùèõ áàêòåðèé-ýíäîôèòîâ â àçîòíîå ïèòàíèå íåáîáîâûõ ðàñòåíèé, êîíêðåòíûå ìåõàíèçìû ïîñòóïëåíèÿ ôèêñèðóåìîãî àçîòà â ðàñòåíèå íå èññëåäîâàíû. Öåëüþ íàøåé ðàáîòû áûëî èçó÷åíèå ïóëà ñâîáîäíûõ àìèíîêèñëîò ó àçîòôèêñèðóþùåãî ýíäîôèòà íåáîáîâûõ ðàñòåíèé K. terrigena Å6 äëÿ âûÿâëåíèÿ âîçìîæíûõ ïåðåíîñ÷èêîâ ôèêñèðîâàííîãî àçîòà èç êëåòîê ýòèõ áàêòåðèé â êëåòêè ðàñòåíèÿ. Ìåòîäèêà. Îáúåêòîì èññëåäîâàíèé ñëóæèëà àçîòôèêñèðóþùàÿ áàêòåðèÿ Klebsiella terrigena E6 èç ðàáî÷åé êîëëåêöèè ëàáîðàòîðèè àäàïòàöèè ìèêðîîðãàíèçìîâ Èíñòèòóòà áèîõèìèè è ôèçèîëîãèè ìèêðîîðãàíèçìîâ (ã. Ïóùèíî). Áàêòåðèè K. terrigena E6 âûðàùèâàëè ïðè 28 °Ñ, â æèäêîé ñðåäå IPG-05 (11) â êîëáàõ Ýðëåíìåéåðà îáúåìîì 750 ìë ñ 250 ìë ñðåäû íà êà÷àëêå (180 îá/ìèí) â òå÷åíèå 1 ñóò. Çàòåì êëåòêè áàêòåðèé îñàæäàëè öåíòðèôóãèðîâàíèåì 30 ìèí ïðè 5000 îá/ìèí. Ïîëó÷åííóþ áèîìàññó ðåñóñïåíäèðîâàëè â 250 ìë ìîäèôèöèðîâàííîé áåçàçîòíîé ñðåäû 98 Äîáåðåéíåð NFb ñëåäóþùåãî ñîñòàâà (ã/ë): D,L-ÿáëî÷íàÿ êèñëîòà — 5,00; Ê2ÍÐÎ4 — 0,5; MgSO4Ł7H2O — 0,20; NaCl — 0,10; CaCl2Ł2H2O — 0,02; ãëþêîçà — 3,00; ðàñòâîð ìèêðîýëåìåíòîâ — 2 ìë, ðàñòâîð âèòàìèíîâ — 1 ìë, pH ñðåäû äîâîäèëè KOH äî 6,8. Ñîñòàâ ðàñòâîðà ìèêðîýëåìåíòîâ (ìã/ë): EDTA — 500; FeSO4Ł7H2O — 1500; ZnSO4Ł7Í2O — 400; MnCl2Ł4H2O — 1000; Í3BO3 — 500; CoCl2Ł6H2O — 300; CuSO4Ł5H2O — 100; NiCl2Ł6H2O — 20; KI — 20; Na2MoO4Ł2H2O — 500. Ñîñòàâ ðàñòâîðà âèòàìèíîâ (ìã/ë): ïàíòîòåíàò Ca — 1000, òèàìèí — 400, áèîòèí — 500 (12). Êëåòêè áàêòåðèé ïîäðàùèâàëè â ýòîé ñðåäå äëÿ èñòîùåíèÿ ñâÿçàííîãî àçîòà ïðè 28 °Ñ íà êà÷àëêå â òå÷åíèå 12 ÷ è îñàæäàëè öåíòðèôóãèðîâàíèåì. Ïî 1 ìë ïîëó÷åííîé ñãóùåííîé ñóñïåíçèè êëåòîê ñ òèòðîì îêîëî 1011 ÊÎÅ/ìë ïîìåùàëè â ïåíèöèëëèíîâûå ôëàêîíû îáúåìîì 15 ìë è ñâåðõó íàñëàèâàëè æèäêóþ ñðåäó Äîáåðåéíåð NFb (1, 2, 3 è 4 ìë) òàê, ÷òîáû âûñîòà ñòîëáèêà ñðåäû íàä ïîäëîæêîé áàêòåðèàëüíîé ñóñïåíçèè áûëà ðàçíîé.  çàâèñèìîñòè îò öåëè ýêñïåðèìåíòà â íàñëàèâàåìóþ ñðåäó Äîáåðåéíåð NFb äîáàâëÿëè ïèðóâàò. Äëÿ àíàëèçà ïóëà ñâîáîäíûõ àìèíîêèñëîò â êëåòêàõ K. terrigena E6 ôëàêîíû ñ áàêòåðèàëüíîé ñóñïåíçèåé êóëüòèâèðîâàëè ïðè 28 °Ñ áåç ïåðåìåøèâàíèÿ, ÷åðåç 6, 12 è 24 ÷ áàêòåðèè îòäåëÿëè îò ñðåäû öåíòðèôóãèðîâàíèåì è âûñóøèâàëè ïðè 60 °Ñ äî ïîñòîÿííîé ìàññû. Èçìåðåíèÿ ïðîâîäèëè ïî ñòàíäàðòíîé ìåòîäèêå (13) íà àìèíîêèñëîòíîì àíàëèçàòîðå Ò339 («Microtechnic Praha», ×åõèÿ); èîíîîáìåííàÿ ñìîëà — LGANB, äåòåêòîð — äèîäíûé ôîòîìåòð (λ = 570 íì). Àçîòôèêñèðóþùóþ àêòèâíîñòü îïðåäåëÿëè àöåòèëåíîâûì ìåòîäîì (14). Ôëàêîíû ñ ñóñïåíçèåé áàêòåðèé è ðàçíûì êîëè÷åñòâîì ñðåäû Äîáåðåéíåð NFb ãåðìåòè÷íî çàêðûâàëè ðåçèíîâûìè ïðîáêàìè, èíêóáèðîâàëè ñ àöåòèëåíîì â òå÷åíèå 3 ÷ ïðè 28 °Ñ áåç ïåðåìåøèâàíèÿ è èçìåðÿëè êîëè÷åñòâî îáðàçîâàâøåãîñÿ ýòèëåíà íà ãàçîâîì õðîìàòîãðàôå Öâåò-101 (Ðîññèÿ) ñ ïëàìåííî-èîíèçàöèîííûì äåòåêòîðîì; äëèíà êîëîíêè — 2 ì, íàïîëíèòåëü — ñïåöèàëüíî îáðàáîòàííûé ñèëèêàãåëü ÊÑÊ (Ðîññèÿ); 90 °Ñ; â êà÷åñòâå ãàçà-íîñèòåëÿ èñïîëüçîâàëè àðãîí. Àêòèâíîñòü àçîòôèêñàöèè âûðàæàëè â íìîëü C2H4/(ìã áåëêà⁄÷). Êîíòðîëåì ñëóæèëè êëåòêè K. terrigena Å6, ïðîêèïÿ÷åííûå íà âîäÿíîé áàíå â òå÷åíèå 10-15 ìèí. Ñîäåðæàíèå áåëêà â áèîìàññå êëåòîê îïðåäåëÿëè ïî Ëîóðè. Âñå îïûòû âûïîëíÿëè â 3 ïîâòîðíîñòÿõ. Ñòàòèñòè÷åñêóþ îáðàáîòêó îñóùåñòâëÿëè ñ ïîìîùüþ ïðîãðàììû Microsoft Excel.  ðåçóëüòàòàõ ïðèâîäÿòñÿ ñðåäíèå çíà÷åíèÿ è ñòàíäàðòíûå îòêëîíåíèÿ ïîëó÷åííûõ âåëè÷èí ïðè óðîâíå çíà÷èìîñòè P = 0,05. Ðåçóëüòàòû. Øòàìì K. terrigena Å6 áûë âûäåëåí èç ðèçîñôåðíîé ïî÷âû åæè ñáîðíîé (Dactylis glomerata) â ñîñòàâå åñòåñòâåííîé áàêòåðèàëüíîé àññîöèàöèè ñ Bacillus firmus E3 (15). Ðàíåå ìû ïîêàçàëè, ÷òî ýòîò øòàìì — ýíäîôèò è ñïîñîáåí êîëîíèçèðîâàòü òêàíè ÿ÷ìåíÿ è ïîäñîëíå÷íèêà (9). Êàê èçâåñòíî, îáðàçóåìàÿ ïðè áèîëîãè÷åñêîé ôèêñàöèè àòìîñôåðíîãî àçîòà ìîëåêóëà àììèàêà ïðè àññèìèëÿöèè ïî ìåòàáîëè÷åñêîìó ïóòè GS–GOGAT âêëþ÷àåòñÿ â ãëóòàìèí è ãëóòàìàò è äàëåå âîâëåêàåòñÿ â îáìåííûå ïðîöåññû N-ìåòàáîëèçìà ïîñðåäñòâîì ðåàêöèé ïåðåàìèíèðîâàíèÿ ãëóòàìàòà (16). Äëÿ âûÿâëåíèÿ âîçìîæíîãî àêöåïòîðà ýòîé àììîíèéíîé ãðóïïû ìû êîëè÷åñòâåííî îöåíèëè ñîñòàâ ïóëà îñíîâíûõ àìèíîêèñëîò â êëåòêàõ, êóëüòèâèðóåìûõ â ñïîñîáñòâóþùèõ àçîòôèêñàöèè óñëîâèÿõ, èñïîëüçîâàâ íàñëîåíèå ðàçíûõ îáúåìîâ æèäêîé áåçàçîòíîé ñðåäû Äîáåðåéíåð NFb íà ñãóùåííóþ ñóñïåíçèþ áàêòåðèé â êà÷åñòâå ïðèåìà, ïîçâîëÿþùåãî îïòèìèçèðîâàòü àýðàöèþ. 99 Ïðè äîáàâëåíèè 1, 2, 3, 4 è 0 ìë (êîíòðîëü áåç ñðåäû) áåçàçîòíîé ñðåäû Äîáåðåéíåð NFb àçîòôèêñèðóþùàÿ àêòèâíîñòü â îáðàçöàõ ñîñòàâèëà ñîîòâåòñòâåííî 11,52; 4,46; 4,11; 3,77 è 0 íìîëü C2H4/(ìã áåëêà⁄÷). Òî åñòü íàèáîëüøóþ àçîòôèêñèðóþùóþ àêòèâíîñòü íàáëþäàëè ïðè íàñëîåíèè 1 ìë ñðåäû, è ýòà àêòèâíîñòü ñîîòâåòñòâîâàëà õàðàêòåðíîé äëÿ K. terrigena Å6 íèòðîãåíàçíîé àêòèâíîñòè 15 íìîëü C2H4/(ìã áåëêà⁄÷) (12). Äîìèíèðóþùåé àìèíîêèñëîòîé â ïóëå îêàçàëñÿ àëàíèí (åãî êîíöåíòðàöèÿ áûëà íàèáîëüøåé ïðè êóëüòèâèðîâàíèè áàêòåðèé â òå÷åíèå 12 ÷) (ðèñ. 1, À). Êîëè÷åñòâî àëàíèíà ïðåâîñõîäèëî êîëè÷åñòâî ãëóòàìàòà ïî÷òè â 5 ðàç è ñîñòàâëÿëî 53,4 % îò ñóììû âñåõ àìèíîêèñëîò. Äëÿ ñðàâíåíèÿ (ñì. ðèñ. 1, Á) ïðèâåäåíî ðàñïðåäåëåíèå àìèíîêèñëîò â êëåòêàõ K. terrigena Å6, âûðàùåííûõ íà ñðåäå IPG-05 â óñëîâèÿõ, èñêëþ÷àþùèõ àçîòôèêñàöèþ. Ïîëó÷åííîå â ýòîì âàðèàíòå ñîîòíîøåíèå êîëè÷åñòâà àìèíîêèñëîò â ïóëå áûëî ñîâåðøåííî èíûì, à äîëÿ àëàíèíà ñîñòàâëÿëà ëèøü 15,4 %. Äîìèíèðîâàíèå àëàíèíà íàä ãëóòàìàòîì (ñì. ðèñ. 1, À) ïðè íàêîïëåíèè â êëåòêàõ áàêòåðèé îòìå÷àëè òîëüêî â óñëîâèÿõ ìàêñèìàëüíîé àçîòôèêñèðóþùåé àêòèâíîñòè ó øòàììà Å6. Ïðè íàñëàèâàíèè 2 è 3 ìë ñðåäû è, ñîîòâåòñòâåííî, ñíèæåíèè àêòèâíîñòè àçîòôèêñàöèè íàáëþäàëè äîìèíèðîâàíèå ãëóòàìàòà. Íà îñíîâàíèè ýòèõ ðåçóëüòàòîâ ìû ïðåäïîëîæèëè, ÷òî ó áàêòåðèé K. terrigena Å6 ïðè àçîòôèêñàöèè àììîíèéíàÿ ãðóïïà èç ãëóòàìàòà ïîÐèñ. 1. Ñîäåðæàíèå àìèíîêèñëîò â êëåòêàõ Klebsiella ter- ñðåäñòâîì ïåðåàìèíèðîâàíèÿ rigena Å6, èíêóáèðóåìûõ â îïòèìàëüíûõ äëÿ àçîòôèêñà- ïåðåäàåòñÿ ãëàâíûì îáðàçîì öèè óñëîâèÿõ (A) è â óñëîâèÿõ, èñêëþ÷àþùèõ àçîò- â àëàíèí. Ïðåäøåñòâåííèêîì ôèêñàöèþ (Á). àëàíèíà ñëóæèò ïèðóâàò, ñëåäîâàòåëüíî, ìîæíî áûëî îæèäàòü, ÷òî â ïðèñóòñòâèè ïèðóâàòà ïðîèçîéäåò íàêîïëåíèå àëàíèíà. Íàøå ïðåäïîëîæåíèå ïîäòâåðäèëè ðåçóëüòàòû, ïîëó÷åííûå ïðè äîáàâëåíèè ïèðóâàòà â ñðåäó Äîáåðåéíåð NFb äëÿ íàñëàèâàíèÿ è ñóñïåíäèðîâàíèÿ áàêòåðèé. Íàèáîëåå çàìåòíîå íàêîïëåíèå àëàíèíà çàðåãèñòðèðîâàëè â âàðèàíòå ñ êîíöåíòðàöèåé ïèðóâàòà 1 ìã/ë (â 1,4 ðàçà Ðèñ. 2. Ñîäåðæàíèå àìèíîêèñëîò â êëåòêàõ Kleb- áîëüøå, ÷åì â êîíòðîëå) (ðèñ. 2). siella terrigena Å6, èíêóáèðóåìûõ ïðè ðàçíîé êîí- Ïðè ýòîì òàêæå âîçðîñëî ñîîòíîøåöåíòðàöèè ïèðóâàòà â áåçàçîòíîé ñðåäå Äîáåðåéíåð íèå ìåæäó êîëè÷åñòâîì àëàíèíà è NFb: à — àëàíèí, á — ãëóòàìàò. ãëóòàìàòà (ñ 2,56-êðàòíîãî ïðåâûøåíèÿ ïåðâîãî â êîíòðîëå äî 3,50-êðàòíîãî — â âàðèàíòå ñ êîíöåíòðàöèåé ïèðóâàòà 1 ìã/ë). Íà îñíîâàíèè ïîëó÷åííûõ ðåçóëüòàòîâ áûëà ïðåäëîæåíà âîçìîæíàÿ ñõåìà âûíîñà àòìîñôåðíîãî àçîòà, ôèêñèðóåìîãî ýíäîôèòíîé áàêòåðèåé K. terrigena Å6, â ðàñòåíèå (ðèñ. 3).  ïðåäëàãàåìîé ñõåìå ðàñòåíèå 100 ïîñòàâëÿåò â êëåòêè ýíäîôèòíûõ áàêòåðèé ñàõàðà. Îíè â ïðîöåññå ãëèêîëèçà ìåòàáîëèçèðóþòñÿ äî ïèðóâàòà, äàëåå âûñòóïàþùåãî â êà÷åñòâå àêöåïòîðà àììîíèéíîé ãðóïïû â ðåàêöèÿõ ïåðåàìèíèðîâàíèÿ ñ ãëóòàìàòîì, à îáðàçóþùèéñÿ ïðè ýòîì àëàíèí ýêñêðåòèðóåòñÿ â ðàñòåíèå. Ðèñ. 3. Âîçìîæíàÿ ñõåìà âûíîñà ôèêñèðîâàííîãî àçîòà â ðàñòåíèå ó ýíäîôèòíîé áàêòåðèè Klebsiella terrigena Å6: Pi — íåîðãàíè÷åñêèé ôîñôàò, GS — ãëóòàìèíñèíòåòàçà, GOGAT — ãëóòàìàòñèíòàçà. Òàêèì îáðàçîì, óñòàíîâëåíî, ÷òî ïðè àçîòôèêñàöèè â êëåòêàõ Klebsiella terrigena Å6 â ïóëå ñâîáîäíûõ àìèíîêèñëîò óâåëè÷èâàåòñÿ äîëÿ àëàíèíà. Íàêîïëåíèå àëàíèíà ñòèìóëèðóåòñÿ åãî ïðåäøåñòâåííèêîì — ïèðóâàòîì. Íàøè ðåçóëüòàòû ïîçâîëÿþò ïðåäïîëîæèòü, ÷òî àììîíèéíàÿ ãðóïïà ó K. terrigena Å6 ïðè àçîòôèêñàöèè ïåðåäàåòñÿ îò ãëóòàìàòà íà ïèðóâàò, à îáðàçóþùèéñÿ ïðè ýòîì àëàíèí ìîæåò ñëóæèòü ïåðåíîñ÷èêîì ôèêñèðîâàííîãî àçîòà. Íà îñíîâàíèè ïîëó÷åííûõ äàííûõ ïðåäëîæåíà ñõåìà âûíîñà ôèêñèðîâàííîãî àçîòà â ðàñòåíèå èç êëåòîê ýíäîôèòíûõ àçîòôèêñèðóþùèõ áàêòåðèé. ËÈÒÅÐÀÒÓÐÀ 1. R o s e n b l u e t h M., M a r t i n e z - R o m e r o E. Bacterial endophytes and their interactions with hosts. Mol. Plant Microbe. Interact., 2006, 19: 827-37. 2. R y a n R.P., G e r m a i n e K., F r a n k s A., R y a n D.J., D o w l i n g D.N. Bacterial endohytes: recent developments and applications. FEMS Microbiol. Lett., 2008, 278: 1-9. 3. J a m e s E.K., R e i s V.M., O l i v a r e s F.L., B a l d a n i J.I., D o b e r e i n e r J. Infection of sugar-cane by the nitrogen-fixing bacterium Acetobacter diazotrophicus. J. Exp. Botany., 1994, 45: 757-766. 4. B r i l l W.J. Biochemical genetics of nitrogen fixation. Microbiol. Rev., 1980, 44: 449-467. 5. H a l l m a n n J., Q u a d t - H a l l m a n n A., M a h a f f e e W.F., K l o e p p e r J.W. Bacterial endophytes in agricultural crops. Can. J. Microbiol., 1997, 43: 895-914. 6. Ø à ï î ø í è ê î â À.È., Á å ë è ì î â À.À., Ê ð à â ÷ å í ê î Ë.Â.,  è â à íê î Ä.Ì. Âçàèìîäåéñòâèå ðèçîñôåðíûõ áàêòåðèé ñ ðàñòåíèÿìè: ìåõàíèçìû îáðàçîâàíèÿ è ôàêòîðû ýôôåêòèâíîñòè àññîöèàòèâíûõ ñèìáèîçîâ (îáçîð). Ñ.-õ. áèîë., 2011, 3: 16-22. 7. Ï å ò à ê À.Ì., Ê î â ò ó í î â è ÷ Ã.Ë., Ê î ç û ð î â ñ ê à ÿ Í.À., Ò ó ð ÿ í è ö à À.È., Ê î ð ä þ ì Â.À. Âçàèìîîòíîøåíèÿ áàêòåðèé ðîäà Klebsiella ñ ðàñòåíèåì. Áèîïîëèìåðû è êëåòêà, 1995, 11(6): 75-80. 8. B a c o n C.W., H i n t o n D.M. Bacterial endophytes: the endophytic niche, its occupants, utility. In: Plant-associated bacteria /S.S. Gnanamanickam (ed.). Springer, Netherlands, 2006, Part 1: 155-194. 9. Ç ë î ò í è ê î â À.Ê., Ê à ç à ê î â à Ì.Ë., Ç ë î ò í è ê î â Ê.Ì., Ê à ç à ê î â À.Â. Íîâûé áàêòåðèàëüíûé ýíäîôèò ñåëüñêîõîçÿéñòâåííûõ êóëüòóð. Ñ.-õ. áèîë., 2006, 3: 62-66. 10. Ç ë î ò í è ê î â À.Ê., Ó ì à ð î â Ì.Ì. Âëèÿíèå èíîêóëÿöèè ðèçîñôåðíîé áàêòåðèàëüíîé àññîöèàöèè Bacillus firmus è Klebsiella terrigena íà ïîðàæåííîñòü ÿðîâîãî ÿ÷ìåíÿ ôèòîïàòîãåííûìè ãðèáàìè. Òåç. Ìåæä. êîíô. «Ñîâðåìåííûå ïðîáëåìû ìèêîëîãèè, àëüãîëîãèè è ôèòîïàòîëîãèè». Ì., 1998: 41-42. 101 11. Ç ë î ò í è ê î â Ê.Ì., × à ò ó å â Á.Ì., È â à ø è í à Ò.Â., Õ ì å ë ü í è ö ê è é Ì.È. Âûäåëåíèå àóêñîòðîôíûõ ìóòàíòîâ ó Rhizobium japonicum è Rhizobium phaseoli. Ãåíåòèêà, 1983, 19(9): 1404-1410. 12. Ç ë î ò í è ê î â À.Ê., Ê à ç à ê î â à Ì.Ë., Ç ë î ò í è ê î â Ê.Ì., Ê à ç à ê î â À.Â., Ó ì à ð î â Ì.Ì. Ôèçèîëîãè÷åñêèå è áèîõèìè÷åñêèå ñâîéñòâà áàêòåðèàëüíîé àññîöèàöèè Klebsiella terrigena Å6 è Bacillus firmus Å3. Ïðèêëàäíàÿ áèîõèìèÿ è ìèêðîáèîëîãèÿ, 2007, 43(3): 339-346. 13. S p a c k m a n D.H., S t e i n W.H., M o o r e S. Chromatography of amino acids on sulfonated polystyrene resins. Anal. Chem., 1958, 30(7): 1185-1189. 14. Ìåòîäû ïî÷âåííîé ìèêðîáèîëîãèè è áèîõèìèè /Ïîä ðåä. Ä.Ã. Çâÿãèíöåâà. Ì., 1991. 15. Z l o t n i k o v A.K., S h a p o v a l o v a Y.N., M a k a r o v A.A. Association of Bacillus firmus E3 and Klebsiella terrigena E6 with increased ability for nitrogen fixation. Soil Biol. Biochem., 2001, 33: 1525-1530. 16. Ø ë å ã å ë ü Ã.Ã. Îáùàÿ ìèêðîáèîëîãèÿ. Ì., 1987. Ôåäåðàëüíîå ãîñóäàðñòâåííîå áþäæåòíîå ó÷ðåæäåíèå íàóêè Èíñòèòóò áèîõèìèè è ôèçèîëîãèè ìèêðîîðãàíèçìîâ èì. Ã.Ê. Ñêðÿáèíà ÐÀÍ, Ïîñòóïèëà â ðåäàêöèþ 12 ñåíòÿáðÿ 2011 ãîäà 142290 Ìîñêîâñêàÿ îáë., ã. Ïóùèíî, ïðîñï. Íàóêè, 5, å-mail: [email protected], [email protected], [email protected], [email protected] ALANINE ACCUMULATION IN CELLS OF ENDOPHYTE Klebsiella terrigena Å6 UNDER THE NITROGEN FIXATION M.L. Kazakova, K.M. Zlotnikov, A.V. Kazakov, A.K. Zlotnikov Summary Possible metabolic pathways of carrying out the fixed N from bacteria-endophyte cells to non leguminous plants were investigated on a model strain (Klebsiella terrigena Å6, colonizing the tissues of barley and sunflower). An original technical approach was realized in this experiment — the analysis of the main amino acids pool in bacterial cells for the detection of possible acceptor of glutamate ammonium group, generated during nitrogen fixation. The authors revealed, that alanine is dominant amino acid in K. terrigena Å6 cells in nitrogen fixation conditions (53.4 % of total amino acids). The addition of pyruvate to growing bacterial medium increased the alanine accumulation by 1.4 times. These data permit to suppose that ammonium group during nitrogen fixation in K. terrigena Å6 is transferred from glutamate to pyruvate, and formed alanine may serve as a carrier for fixed nitrogen transferred from bacterial cells to plant. Íàó÷íûå ñîáðàíèÿ ÑÅÑÑÈß ÊÎÍÃÐÅÑÑÀ «ÔÎÒÎÍÈÊÀ  ÑÅËÜÑÊÎÌ ÕÎÇßÉÑÒÂÅ È ÏÐÈÐÎÄÎÏÎËÜÇÎÂÀÍÈÈ» (íàó÷íàÿ ïðîãðàììà 7-é Ìåæäóíàðîäíîé ñïåöèàëèçèðîâàííîé âûñòàâêè îïòè÷åñêîé, ëàçåðíîé è îïòîýëåêòðîííîé òåõíèêè «ÔÎÒÎÍÈÊÀ. ÌÈÐ ËÀÇÅÐÎÂ È ÎÏÒÈÊÈ-2012») â ðàìêàõ Ìåæäóíàðîäíîé íàó÷íî-ïðàêòè÷åñêîé êîíôåðåíöèè «Ôîòîíèêà â áèîòåõíîëîãèÿõ, ýêîëîãèè è ñåëüñêîì õîçÿéñòâå») (ã. Ìîñêâà, Äîì íàóêè ÂÑÒÈÑÏ ÐÀÑÕÍ, 19-20 àïðåëÿ 2012 ãîäà) Îðãàíèçàòîðû: ÐÀÑÕÍ, Âñåðîññèéñêèé ñåëåêöèîííî-òåõíîëîãè÷åñêèé èíñòèòóò ñàäîâîäñòâà è ïèòîìíèêîâîäñòâà ÐÀÑÕÍ, Ëàçåðíàÿ àññîöèàöèÿ Ðîññèè. Òåìàòèêà: Ìåõàíèçìû âçàèìîäåéñòâèÿ îïòè÷åñêîãî èçëó÷åíèÿ ñ áèîëîãè÷åñêèìè ñèñòåìàìè è ñòðóêòóðàìè Ìîäèôèêàöèîííàÿ èçìåí÷èâîñòü è ýïèãåíåòè÷åñêèå ïðîöåññû ñâåòîâîé ðåãóëÿöèè ýêñïðåññèè ãåíîâ Ôóíäàìåíòàëüíûå è òåîðåòè÷åñêèå âîïðîñû ëàçåðíûõ áèî- è àãðîòåõíîëîãèé Ôîòîíèêà â ñàäîâîäñòâå Ïðàêòè÷åñêîå èñïîëüçîâàíèå îïòè÷åñêîãî èçëó÷åíèÿ â áèîòåõíîëîãèè, ðàñòåíèåâîäñòâå, æèâîòíîâîäñòâå, âåòåðèíàðèè è àêâàêóëüòóðå Òåõíè÷åñêèå ñðåäñòâà äëÿ ýëåêòðîìàãíèòíîé îáðàáîòêè ðàñòåíèé è æèâîòíûõ Ñîâðåìåííûå îïòè÷åñêèå ïðèáîðû è ìåòîäû èçìåðåíèé â áèîëîãèè, áèîòåõíîëîãèè, ýêîëîãèè è ñåëüñêîì õîçÿéñòâå Êîíòàêòû è èíôîðìàöèÿ: http://www.photonics-expo.ru, http://www.vstisp.org, [email protected] 102
