BBL Lowenstein-Jensen Medium + PACT

 BBL Lowenstein-Jensen Medium + PACT

8011670
2003/07
Русский
См. словарь символов в конце вкладыша.
НАЗНАЧЕНИЕ
Продукт BBL Lowenstein-Jensen Medium + PACT (Среда Левенштейна-Йенсена BBL с PACT) предназначен для
культивирования микобактерий Mycobacterium tuberculosis и других видов микобактерий.
КРАТКИЙ ОБЗОР И ОПИСАНИЕ
Среда Левенштейна-Йенсена BBL с PACT представляет собой содержащую антимикробные препараты среду на яичной
основе. Стандарт DIN 58943-3 «Диагностика туберкулеза. Часть 3. Определение микобактерий методами культивирования»
рекомендует использовать среду на яичной основе с антимикробными препаратами; например: для среды культивирования
на яичной основе рекомендуется содержание полимиксина B в количестве 200 000 ед./л, амфотерицина B в количестве
1
10 мг/л, карбенициллина в количестве 50 мг/л и триметоприма в количестве 10 мг/л (PACT).
Левенштейн (Lowenstein) разработал рецептуру среды для культивирования микобактерий, в которой конго красный и
2,3
малахитовый зеленый были объединены для частичного ингибирования других бактерий. Эти красители использовались
4
5
с той же целью другими исследователями, в частности, Зонненшайном (Sonnenschein) и Хоном (Hohn) . В США была
6
7
популярна среда Корпера (Corper) и Петрова (Petroff) с генциановым фиолетовым, а также среда Петраньяни (Petragnani),
8
содержащая малахитовый зеленый. Настоящая рецептура, разработанная Йенсеном (Jensen) , слегка отличается
содержанием цитрата и фосфата, не содержит конго красного, и в большей концентрации содержит малахитовый зеленый.
В 1972 г. Мичисон (Mitchison) с соавторами разработал селективную питательную среду для микобактерий, добавив
9
полимиксин B, амфотерицин B, карбенициллин и триметоприма лактат к агару Миддлбрука и Кона 7H10. В среде
Левенштейна-Йенсена BBL с PACT используется то же сочетание селективных веществ.
ПРИНЦИПЫ МЕТОДИКИ
Базовая среда Левенштейна-Йенсена имеет относительно простой состав, который требует дополнения для поддержания
роста микобактерий. До начала процесса сгущения в среду добавляются глицерин и яичная масса. В этих веществах
содержатся жирные кислоты и белки, необходимые для метаболизма микобактерий. При коагуляции яичного альбумина во
время стерилизации образуется плотная среда для посева. Аспарагин добавляется для инициирования и увеличения
скорости роста. Частичное ингибирование бактерий достигается благодаря присутствию красителя малахитового зеленого.
Селективность среды BBL Левенштейна-Йенсена с PACT обусловлена объединением в рецептуре полимиксина B,
амфотерицина B, карбенициллина и триметоприма лактата. Карбенициллин — это синтетический пенициллин, который
обладает бактерицидным действием на грамотрицательные бактерии, особенно на Pseudomonas aeruginosa и Proteus,
10
ингибируя синтез оболочки клетки. Полимиксин B — это полипептидный антибиотик, ингибирующий грамотрицательные
10
бактерии благодаря разрушению их плазматических мембран, изменяя тем самым проницаемость клеток. Амфотерицин
— это гептаеновый антибиотик, активно ингибирующий грибки за счет изменения проницаемости клеточных мембран,
которые содержат холестерин или эргостерин. Таким образом обеспечивается проникновение различных
11
микромолекулярных соединений в клетку. Триметоприм ингибирует синтез фолиевой кислоты у грамположительных
12
бактерий, которым требуется фолиевая кислота.
РЕАГЕНТЫ
BBL Lowenstein-Jensen Medium + PACT
Приблизительная рецептура* на литр среды
Картофельный крахмал................................ 18,60 г
L-аспарагин ...................................................... 2,23 г
Фосфат калия одноосновный......................... 1,55 г
Натрия цитрат .................................................. 0,37 г
Малахитовый зеленый.................................... 0,25 г
Магния сульфат ............................................... 0,15 г
Глицерин........................................................... 7,44 мл
Цельные яйца .............................................. 620,00 мл
Очищенная вода.......................................... 373,00 мл
Полимиксин В........................................ 200 000,00 единиц
Амфотерицин В ............................................. 10,00 мг
Карбенициллин ............................................100,00 мг
Триметоприм .................................................. 10,00 мг
* При необходимости изменяется и/или дополняется для соответствия критериям эффективности.
Предупреждения и меры предосторожности
Для диагностического использования в условиях in vitro.
Пробирки с плотными крышками следует открывать осторожно, чтобы не разбить пробирку и не пораниться осколками.
В клинических образцах могут присутствовать патогенные микроорганизмы, в том числе вирус гепатита и вирус
иммунодефицита человека (ВИЧ). При работе с образцами, загрязненными кровью или другими биологическими
13-16
жидкостями, следует соблюдать стандартные меры предосторожности
и инструкции учреждения. Перед утилизацией
стерилизуйте в автоклаве контейнеры из-под образцов и другие загрязненные материалы.
1
При неаэрозольной обработке клинических образцов, например при подготовке окрашенных мазков кислотоустойчивых
штаммов, необходимо использовать изолирующее оборудование и средства биологической защиты, а также применять
меры биологической безопасности 2 уровня. Все операции, связанные с образованием аэрозолей, необходимо проводить в
биологическом защитном шкафу класса I или II. При лабораторном размножении и обработке культур M. tuberculosis и
M. bovis необходимо использовать изолирующее оборудование и средства биологической защиты, а также применять меры
15
биологической безопасности 3 уровня. При исследовании животных также требуется соблюдение специальных методик.
Условия хранения
После получения храните пробирки в темном месте при температуре 2 – 8 °C. Не допускайте замораживания или перегрева.
Открывайте непосредственно перед использованием. Среда, хранящаяся в пробирках в соответствии с указаниями на
этикетке, может быть засеяна до истечения срока годности и выдержана в течение рекомендуемого инкубационного
периода. Сведите к минимуму воздействие света.
Разложение продукта
При наличии признаков бактериального заражения, изменения цвета, высыхания или других признаков разложения
продукта не используйте пробирки.
ВЗЯТИЕ И ОБРАБОТКА ОБРАЗЦОВ
Подходящие для культивирования образцы можно обрабатывать, используя различные методики. Подробную информацию
17,18
см. в соответствующих документах.
Образцы следует собирать до введения противомикробных препаратов.
Необходимо обеспечить своевременную доставку в лабораторию.
МЕТОДИКА
Предоставленные материалы. Lowenstein-Jensen Medium + PACT
Необходимые, но не предоставленные материалы. Для данной методики необходимы дополнительная питательная
среда, реагенты, культуры микроорганизмов для контроля качества и лабораторное оборудование.
Методика тестирования. Соблюдайте асептическую методику работы.
Используются методики тестирования, рекомендованные центрами по контролю и профилактике заболеваний США (CDC)
19
для предварительного выделения из образцов, содержащих микобактерии. Рекомендуется использование раствора
N-ацетил-L-цистеина и гидроксида натрия (NALC-NaOH) в качестве мягкого, но эффективного растворяющего и
деконтаминирующего вещества. Подробные инструкции по деконтаминации и культивированию см. в соответствующих
18-21
справочных материалах.
После посева держите тестируемые контейнеры закрытыми от света и поместите их в соответствующую систему,
поддерживающую аэробную атмосферу, обогащенную 5 – 10 % диоксида углерода. Выдерживайте при температуре 35 ± 2 °C.
Среду следует выдерживать горизонтально, пока не абсорбируется посевной материал. В течение первых трех недель не
следует плотно закрывать пробирки с завинчивающейся крышкой, чтобы инициировать рост путем циркуляции диоксида
углерода. Впоследствии для предотвращения обезвоживания плотно закройте крышки; раз в неделю открывайте на
короткое время. При недостатке пространства устанавливайте пробирки вертикально.
ПРИМЕЧАНИЕ. Культуры с участков пораженной кожи, предположительно M. marinum или M. ulcerans, для
предварительного выделения следует выдерживать при температуре 25 – 33 °C; оптимальный рост культур,
предположительно содержащих M. avium или M. xenopi, проявляется при температуре 40 – 42 °C. Следует выдерживать
дубликат культуры при 35 – 37 °C.
Контроль качества
1. С помощью стерильных палочек для посева засейте скошенные питательные среды Левенштейна-Йенсена
исходными культурами подходящих штаммов микобактерий.
2. Выдерживайте пробирки с неплотно закрытыми крышками в обогащенной диоксидом углерода аэробной
атмосфере при температуре 35 ± 2 °C, пока не начнется активный рост (обычно в течение 2 – 3 недель).
3. Соберите культуру с помощью стерильного заостренного аппликатора, аккуратно удаляя клеточную массу с
поверхности среды. Не захватывайте культуральную среду при сборе клеточной массы.
A. Методика для вида Mycobacterium tuberculosis ATCC 25177:
1) Поместите культуру в 5,0 мл бульона Миддлбрука 7H9 с глицерином в стерильной стеклянной пробирке с
завинчивающейся крышкой и стерильными стеклянными шариками.
2) Перемешайте в вихревой мешалке (в течение нескольких минут), пока в суспензии не разойдутся крупные
комки.
3) Сравните суспензию со стандартом нефелометра Макфарланда № 1. Суспензия должна быть более мутной
по сравнению со стандартом.
4) Поместите пробирку в штатив на 2 – 3 часа и дайте отстояться при комнатной температуре, чтобы крупные
частицы осели на дно.
5) Перелейте отстоявшийся раствор в стерильный контейнер.
6) Установите мутность суспензии по стандарту Макфарланда № 1, медленно добавляя стерильный бульон
Миддлбрука 7H9 с глицерином. Хорошо встряхните.
5
7) Перед использованием разбавьте до 10 КОЕ/мл. Хорошо перемешайте и засейте штрихами тестовую
среду, используя калиброванную петлю 0,01 мл.
B. Методика для остальных штаммов микобактерий:
1) Поместите культуру в стерильную центрифужную пробирку с завинчивающейся крышкой объемом 50 мл,
содержащую 8 – 12 стерильных стеклянных шариков (диаметром 2 мм) и 5 мл растворителя для
микобактерий, приготовленного следующим образом.
2
4.
5.
6.
а. Перемешайте следующие ингредиенты в колбе объемом 1 л и установите pH, используя 1н. раствор
гидроксида натрия, в интервале 6,7 – 7,0.
Альбумин бычьей сыворотки (без жирных кислот) 1,0 г
Полисорбат 80
0,1 мл
Очищенная вода
500,0 мл
b. Простерилизуйте фильтрованием через микропористую мембрану (фильтр 0,2 мкм).
c. Асептическим способом разлейте по 5,5 мл в стерильные пробирки с завинчивающимися крышками.
2) Приготовьте эмульсию культуры микобактерий на боковой стенке центрифужной пробирки с
завинчивающейся крышкой, используя аппликатор. Перемешайте культуру с растворителем.
3) Закройте пробирку крышкой и поместите в вихревую мешалку примерно на 10 минут, пока культура не
превратится в суспензию без крупных комков.
4) Добавьте 15 мл стерильного растворителя для микобактерий и тщательно перемешайте.
5) Сравните суспензию со стандартом нефелометра Макфарланда № 1. Суспензия должна быть более мутной
по сравнению со стандартом.
6) Поместите пробирку в штатив на 2 – 3 часа и дайте отстояться при комнатной температуре, чтобы крупные
частицы осели на дно.
7) Аспирируйте отстоявшийся слой жидкости и переместите его в стерильный контейнер. Суспензия должна
быть более мутной, чем стандарт Макфарланда № 1 и не должна содержать крупных частиц. Если крупные
частицы все же присутствуют, перемешайте и дайте отстояться дополнительно в течение часа. Перелейте
отстоявшийся раствор в стерильный контейнер.
8) Установите мутность суспензии по стандарту Макфарланда № 1, медленно добавляя немного стерильного
растворителя для микобактерий. Хорошо встряхните.
9) Для помещения в морозильную камеру отберите аликвотные пробы суспензии во флаконы с маркировкой с
указанием идентификации микроорганизма и даты приготовления.
10) Заморозьте суспензии, поместив флаконы в морозильную камеру при температуре –60 °C. Флаконы могут
храниться до 6 месяцев.
11) Для использования извлеките замороженный флакон из морозильной камеры и быстро разморозьте
содержимое, поместив пробирку в водяную баню с температурой 30 – 35 °C. Перед использованием
5
разбавьте до 10 КОЕ/мл. Хорошо перемешайте и засейте штрихами тестовую среду, используя
калиброванную петлю 0,01 мл.
Выдерживайте неплотно закрытые пробирки при температуре 35 ± 2 °C в аэробной атмосфере, обогащенной
диоксидом углерода.
Через 7, 14 и 21 день проверяйте пробирки на наличие роста, селективности и пигментации.
Предполагаемые результаты
МИКРООРГАНИЗМ
Mycobacterium tuberculosis H37Ra ATCC 25177
Mycobacterium kansasii, группа I ATCC 12478
Mycobacterium fortuitum, группа IV ATCC 6841
Escherichia coli ATCC 25922
ВЫДЕЛЕНИЕ
Хорошее
Хорошее
Хорошее
От частичного до полного ингибирования
Следуйте требованиям контроля качества в соответствии с применимыми местными законами, законами штата и (или)
государственными законами, требованиями аккредитации и методиками контроля качества, принятыми в лаборатории.
Пользователям рекомендуется руководствоваться соответствующими документами Национального комитета по
клиническим лабораторным стандартам США (NCCLS) и положениями Закона о совершенствовании работы клинических
лабораторий (CLIA).
РЕЗУЛЬТАТЫ
Культуры следует наблюдать через 5 – 7 дней после посева и после этого раз в неделю в течение 8 недель.
Запишите результаты наблюдения:
1. Число дней, необходимое для развития колоний до видимых размеров. При быстром росте колонии созревают в
течение 7 дней; при медленном росте требуется более 7 дней для образования зрелых колоний.
2. Продуцирование пигмента.
Белый, кремовый или темно-желтый — нехромогенный (НХ).
Лимонный, желтый, оранжевый, красный — хромогенный (Х).
ОВ окрашенных мазках могут быть видны кислотоустойчивые бациллы, которые указываются только как
«кислотоустойчивые бациллы», пока не будут выполнены окончательные тесты.
ОГРАНИЧЕНИЯ ПРИМЕНЕНИЯ МЕТОДИКИ
Для идентификации должны использоваться микроорганизмы чистой культуры. Для окончательной идентификации
необходимо выполнять морфологические, биохимические и (или) серологические тесты. Дополнительную информацию и
17,18,22
рекомендованные методики см. в соответствующих документах.
3
РАБОЧИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
Перед выпуском все лоты среды Lowenstein-Jensen Medium + PACT тестируются на соответствие специальным
характеристикам продукта. С помощью калиброванной петли 0,01 мл образцы засевают штрихами следующими культурами,
3
разбавленными до 10 колониеобразующих единиц (КОЕ) в 0,01 мл: Mycobacterium kansasii группы I (ATCC 12478),
4
M. fortuitum группы IV (ATCC 6841) и M. tuberculosis (ATCC 25177); Escherichia coli (ATCC 25922) разбавляют до 10 КОЕ в
0,01 мл и засевают тем же способом. После посева пробирки выдерживают неплотно закрытыми при температуре 35 ± 2 °C
в атмосфере, обогащенной 5 – 10 % диоксида углерода. Пробирки проверяют на наличие роста и пигментации после 7, 14 и
21 дня выдерживания. Все микобактерии проявляют умеренный или активный рост в течение 21 дня. Морфология колоний
выглядит следующим образом: M. kansasii образуют ровные кремовые колонии при росте в темноте, которые при
воздействии света приобретают цвет от ярко-лимонного до оранжевого; M. tuberculosis и M. fortuitum имеют кремовый цвет
(M. fortuitum может приобрести зеленый оттенок из-за поглощения красителя). У E. coli рост отсутствует или наблюдается
умеренный рост после 14 дней выдерживания.
НАЛИЧИЕ
№ по кат.
220501
220502
Описание
BBL Lowenstein-Jensen Medium + PACT, 10 пробирок размера A в упаковке
BBL Lowenstein-Jensen Medium + PACT, 100 пробирок размера A в коробке
СПРАВОЧНЫЕ МАТЕРИАЛЫ
1. DIN 58943-3: Diagnosis of tuberculosis – Part 3: Detection of mycobacteria by culture methods. Beuth-Verlag, Berlin 1996.
2. Lowenstein, E. 1931. Die Zachtung der Tuberkelba zillen aus dem stramenden Blute. Zentalbl. Bakteriol. Parasitenkd.
Infektionskr. Hyg. Abt. I Orig. 120:127.
3. Lowenstein, E. 1933. Der kulturelle Nacheweis von Tuberkelbakterien in Milch auf Malachitgrun Einahrboden. Ann. Inst.
Pasteur. 50:161.
4. Sonnenschein. 1930. Dtsh. Tierartze. Wehnschr. 38:115.
5. Hohn, J. 1931. Der Z-Einahrboden zur Kultur des Tuberkel-bazilus. Zentralbl. Bakteriol. Parasitenkd. Infektionskr. Hyg. Abt. I.
Orig. 121:488-506.
6. Corper, J.J. 1919. The cultivation of recently isolated and laboratory strains of human tubercle bacilli on artificial media. Am.
Rev. Tuberc. 3:461-472.
7. Petroff, S.A. 1918. J. Inf. Dis. 23:267.
8. Jensen, K.A. 1932. Rinzuchtung und Type stim mung von Tuberkelbazillentammen. Zentralbl. Bakteriol. Parasitenkd.
Infektionskr. Hyg. Abt. I. Orig. 125:222-239.
9. Mitchison, D.A., B.W. Allen, L. Carrol, J.M. Dickinson, and V.R. Aber. 1972. A selective oleic acid albumin agar medium for
tubercle bacilli. J. Med. Microbiol. 5:165-175.
10. Garrod, L.P., F. O’Grady. 1971. Antibiotics and chemotherapy, 3rd ed. The Williams and Wilkins Company, Baltimore.
11. Korzybski, T., Z. Rowszyk-Gindifer, and W. Kurylowicz. 1978. Antibiotics – origin, nature and properties, vol. II. American
Society for Microbiology, Washington, D.C.
12. Hitchings, G.H. 1974. Mechanisms of action of trimethoprim-sulfamethoxazole, p. 1-4 In Trimethoprim-sulfamethoxazole-I.
Microbiological, pharmacological and clinical considerations. The University of Chicago Press, Chicago.
13. National Committee for Clinical Laboratory Standards. 2001. Approved Guideline M29-A2. Protection of laboratory workers
from occupationally acquired infections, 2nd ed. NCCLS, Wayne, Pa.
14. Garner, J.S. 1996. Hospital Infection Control Practices Advisory Committee, U.S. Department of Health and Human Services,
Centers for Disease Control and Prevention. Guideline for isolation precautions in hospitals. Infect. Control Hospital Epidemiol.
17:53-80.
15. U.S. Department of Health and Human Services. 1999. Biosafety in microbiological and biomedical laboratories, HHS
Publication (CDC), 4th ed. U.S. Government Printing Office, Washington, D.C.
16. Directive 2000/54/EC of the European Parliament and of the Council of 18 September 2000 on the protection of workers from
risks related to exposure to biological agents at work (seventh individual directive within the meaning of Article 16(1) of
Directive 89/391/EEC). Official Journal L262, 17/10/2000, p. 0021-0045.
17. Murray, P.R., E.J. Baron, M.A. Pfaller, F.C. Tenover, and R.H. Yolken (ed.). 1999. Manual of clinical microbiology, 7th ed.
American Society for Microbiology, Washington, D.C.
18. Forbes, B.A., D.F. Sahm, and A.S. Weissfeld. 1998. Bailey & Scott’s diagnostic microbiology, 10th ed. Mosby, Inc., St. Louis.
19. Kent, P.T., and G.P. Kubica. 1985. Public health mycobacteriology: a guide for the level III laboratory. USDHHS. Centers for
Disease Control, Atlanta.
20. Isenberg, H. (ed). 1992. Clinical microbiology procedures handbook, vol. 1. American Society for Microbiology, Washington,
D.C.
21. Carnoch, P.I., R.K. Enns, M.A. Soubolle, and R.J. Wallace, Jr. 1994. Cumitech 16A, Laboratory diagnosis of the
mycobacterioses. Coordinating ed., A.S. Weissfeld. American Society for Microbiology, Washington, D.C.
22. Holt, J.G., N.R. Kreig, P.H.A. Sneath, J.T. Staley, and S.T. Williams (ed.). 1994. Bergey’s Manual™ of determinative
bacteriology, 9th ed. Williams & Wilkins, Baltimore.
4
5