ТЕРАПЕВТИЧЕСКАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ ОРИГИНАЛЬНОГО КОМБИНИРОВАННОГО ХОНДРОПРОТЕКТОРА НА МОДЕЛИ СИСТЕМНОГО СТЕРОИДНОГО АРТРОЗА У КРЫС

УДК [577.112.6:616.72-018.3-008-085]:57.084.1
Зупанец И.А., Зимин С.М.
ТЕРАПЕВТИЧЕСКАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ ОРИГИНАЛЬНОГО
КОМБИНИРОВАННОГО ХОНДРОПРОТЕКТОРА НА МОДЕЛИ СИСТЕМНОГО
СТЕРОИДНОГО АРТРОЗА У КРЫС
Национальный фармацевтический университет, г. Харьков
Остеоартроз (ОА) является самой частой суставной патологией среди ревматических
заболеваний, а также одной из основных причин преждевременной потери трудоспособности и
инвалидности, особенно в старших возрастных группах. Актуальным является поиск новых
эффективных препаратов-хондропротекторов для лечения ОА, в том числе содержащих
комбинацию хондроитин сульфата и глюкозамина. В настоящем исследовании на модели
системного стероидного артроза (ССА) у крыс проведено изучение хондропротекторной
активности Хондролайф крем-геля, содержащего глюкозамина гидрохлорид, хондроитина
сульфат, камфору, ментол и вспомогательные вещества. Моделирование ССА проводили
путем трехкратного внутримышечного введения в мышцу бедра дексаметазона в разовой дозе
7 мг/кг с интервалом в 1 неделю. Хондролайф крем-гель и референт-препарат Хондроксид
наносили ежедневно наружно путем накожных аппликаций в области коленных суставов на
обоих лапах в эквивалентных количествах в условно-терапевтической дозе 50 мг на каждую,
начиная с 28-го дня эксперимента и на протяжении 4-х недель. Исследование ультраструктуры
суставного хряща крыс проводили с помощью стандартных методов электронной
микроскопии. Производили морфометрические измерения – определяли толщину хряща
(измеряли в 3-х точках и выражали в условных единицах), подсчитывали плотность
расположения хондроцитов на условной единице площади. У животных с экспериментальным
артрозом при нанесении на суставы препарата Хондролайф отмечено восстановление
толщины суставного хряща до интактных величин, а также уменьшение (до 30%) количества
микропрепаратов с отклонениями от нормы. Полученные результаты позволяют сделать
вывод о том, что препарат Хондролайф проявляет позитивное воздействие на течение
экспериментального артроза у крыс и обладает хондропротекторными свойствами – снижает
интенсивность деструктивных процессов в тканях коленных суставов животных с ОА и
повышает регенераторные возможности суставного хряща.
Ключевые слова: остеоартроз, хондропротекторы, хондроитина сульфат, глюкозамин.
Одной из наиболее распространенных жалоб пациентов являются боли в суставах, которые в
большинстве случаев связывают с наличием дегенеративно–дистрофических заболеваний
периферических суставов и позвоночника, в том числе остеоартроза (ОА). ОА является самой
частой суставной патологией среди ревматических заболеваний – до 60%, а распространенность в
общей популяции составляет 15-20% [1]. Социальная значимость ОА определяется также резким
снижением качества жизни у пациентов: резкое снижение двигательной активности приводит к
социальной дезадаптации, потере трудоспособности, а в запущенных случаях и способности к
самообслуживанию, особенно в старших возрастных группах [2]. Кроме того, ОА является одной из
основных причин преждевременной потери трудоспособности и инвалидности, уступая в этом
только ишемической болезни сердца [3].
В основе развития ОА лежит взаимодействие множества факторов, в том числе
дегенеративные изменения суставных структур, обусловленные возрастом, генетическая
предрасположенность, чрезмерная механическая нагрузка на суставы, метаболические
нарушения, воспаление и т.д. [4]. При этом нормальный метаболизм хрящевой ткани изменяется с
превалированием катаболических процессов над анаболическими [5,6]. Согласно классификации
Американской ассоциации ревматологов и Европейской антиревматической лиги [7,8], средства
для лечения остеоартроза подразделяются на симптом–модифицирующие и структурно–
модифицирующие – в зависимости от степени их влияния на прогрессирование заболевания. К
симптоматическим препаратам медленного действия с возможной структурно–модифицирующей
активностью (Symptomatic slow acting drugs for osteoarthritis – SYSADOA) сегодня относят:
глюкозамин (ГА) и хондроитин сульфат (ХС), диацерин, препараты гиалуроновой кислоты для
внутрисуставных инъекций и экстракты авокадо и сои, которые включены в рекомендации EULAR
и OARSI по лечению ОА [9].
Анализ результатов клинических исследований, проведенных с препаратами ХС и ГА, показал,
что характерными для них являются противовоспалительный эффект, сравнимый с
нестероидными противовоспалительными препаратами (НПВП) и позволяющий снизить дозу
последних, возможность сочетания с парацетамолом и НПВП, длительное сохранение лечебного
эффекта, высокая безопасность и отсутствие серьезных побочных эффектов. При этом они
способствуют замедлению прогрессирования ОА (по данным рентгенологических исследований).
Механизм лечебного действия ХС и ГА при ОА связан с их способностью подавлять
катаболические (дегенеративные) и активировать анаболические (восстановительные) процессы в
хрящевой ткани, оказывать собственное противовоспалительное и обезболивающее действие
[10,11]. Также установлено, что ХС и ГА оказывают не совсем идентичное фармакологическое
действие: они дополняют и усиливают эффекты друг друга, что определяет перспективность их
совместного применения в лечении ОА [12]. Таким образом, актуальным является поиск новых
эффективных препаратов для лечения ОА, содержащих комбинацию ХС и ГА. Наше внимание
привлек оригинальный препарат Хондролайф крем-гель – крем для наружного применения,
имеющий следующий состав (г/100 г): действующие вещества – глюкозамина гидрохлорид 5,0 г,
хондроитина сульфат 5,0 г, камфора 3,2 г, ментол 0,5 г; вспомогательные вещества: крем-гелевая
основа до 100 г. Целью настоящего исследования явилось изучение хондропротекторной
активности Хондролайф крем-гель на модели системного стероидного артроза (ССА) у крыс. В
качестве препарата сравнения был использован препарат Хондроксид гель 5% в тубах по 30 г
производства ОАО „Нижфарм” (Россия), содержащий в 100 г хондроитина сульфата 5,0 г.
Материалы и методы
Исследование хондропротекторной активности препарата Хондролайф крем-гель проведено на
50 белых нелинейных крысах-самцах в возрасте 4-5 месяцев, массой 250–300 г. Моделирование
ССА проводили путем трехкратного внутримышечного введения в мышцу бедра дексаметазона в
разовой дозе 7 мг/кг с интервалом в 1 неделю. Все животные были распределены на 4 опытные
группы по 10 животных в каждой следующим образом: 1 группа – интактный контроль; 2 группа –
контрольная патология; 3 группа – крысы с артрозом, получающие препарат Хондролайф кремгель в условно-терапевтической дозе 50 мг; 4 группа – крысы с артрозом, получающие препарат
Хондроксид гель 5% в эквивалентной дозе 50 мг (ежедневно наружно путем накожных аппликаций
в области коленных суставов на обоих лапах в эквивалентных количествах – по 50 мг на каждую,
начиная с 28-го дня эксперимента и на протяжении 4-х недель). В ходе нанесения препарата
проводили тщательное втирание его в кожные покровы крыс, при этом не допускали слизывания
или стирания его самими животными. После завершения нанесения исследуемых препаратов (на
56-е сутки эксперимента) все животные подвергались декапитации под эфирным наркозом с
целью получения биологического материала для проведения биохимических и морфологических
исследований. Исследование ультраструктуры суставного хряща крыс проводили с помощью
стандартных методов электронной микроскопии. Микроскопическое исследование проводили под
микроскопом БИМАМ Р-12 (ПО «ЛОМО», Россия) с системой цифрового вывода изображений
микропрепаратов Olympus-BX-41 (Япония). Для объективизации полученных данных производили
морфометрические измерения. С помощью окуляр-микрометра на микропрепаратах определяли
толщину хряща, которая измерялась в 3-х точках – центральная часть головки, верхний и нижний
край. Толщину суставного хряща выражали в условных единицах. Также подсчитывали плотность
расположения хондроцитов на условной единице площади. Статистическую обработку
результатов проводили методами вариационной статистики с использованием t-критерия
Стьюдента и непараметрических методов анализа (Mann-Whitney U Test) с помощью
компьютерных программ Statistiсa 6.0 и StatPlus 2009 и представляли в виде сравнительных
таблиц с результатами разных групп.
Помимо этого, проводили полуколичественную оценку состояния основных структур сустава в
соответствии с методическими рекомендациями [13]. Представленные в рекомендациях
нарушения структурных компонентов сустава выраженные в баллах суммировались (А+Б+В+Г+Д)
для подсчета среднего балла. Выраженные в баллах изменения в суставе распределялись
следующим образом:
– 23-25 баллов – состояние сустава оценивается как норма;
– 19-22 балла – слабо выраженные нарушения в структуре хряща и капсуле сустава;
– 14-18 баллов – умеренно выраженные изменения в структуре хряща и капсуле сустава;
– 8-13 баллов – выраженные нарушения структуры хряща и капсулы сустава;
– 0-7 баллов – тяжелые нарушения, вплоть до разрушения суставного покрытия, деструкции
субхондральной кости, фибротизации и склерозирования капсулы сустава.
Результаты и обсуждение
Результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что у всех животных после
троекратного введения дексаметазона возникали клинические и морфометрические признаки
поражения опорно-двигательной системы. При микроскопическом исследовании коленного сустава
интактных крыс наблюдается картина, соответствующая современным представлениям о
морфологическом строении суставов и хрящевой ткани. Средняя толщина суставного хряща
интактных крыс составляет 15,33 усл.ед., плотность расположения клеток в нем равняется 42,40
экз. на усл.ед. площади (табл. 1).
Таблица 1
Морфометрические показатели суставного хряща крыс под воздействием
препарата Хондролайф на 56 сутки эксперимента
Условия опыта
Интактный контроль
Контрольная
патология
15,33±1,15
42,40±5,64
Сумма баллов
по системе оценки состояния
хряща
24,5±0,2
13,59±0,57
21,90±1,25*
12,7±0,8*
Толщина хряща,
усл. ед.
Клеточная плотность
на усл.ед. площади
% наблюдений с
патологическими
изменениями
100,0
0
Хондролайф
Хондроксид
16,00±0,62**
13,66±0,59
30,46±1,41*/**
27,30±1,29*/**
●
21,5±1,2*/**/
17,3±1,0*/**
30,0
50,0
Примечания: 1) * – p≤0,05 относительно интактных животных;
2) ** – p≤0,05 относительно группы контрольной патологии;
●
3) – p≤0,05 относительно животных, получавших Хондроксид.
Сама кость имеет типичное для губчатой кости строение (рис. 1). В ячейках переплетенных
трабекул содержится активный полиморфноклеточный костный мозг. Синовиальные оболочки
ареолярного типа выступают в суставную полость в виде клинообразных складок. Синовиоциты
группируются довольно близко друг к другу, на некоторых участках лежат в 3-4 ряда.
Субсиновиальная ткань достаточно бедна клетками, в ней преобладают соединительнотканные
волокна. Встречается и другой тип синовиального слоя – жировой, который покрывает
внутрисуставные жировые подушки. При этом ее поверхностные клетки расположены в один слой.
Рис. 1. Морфоструктура коленного сустава интактной крысы. Гиалиновый хрящ суставной поверхности.
Цитоархитектоника в состоянии нормы. Отчетливо видна зональность расположения хрящевых клеток.
Гематоксилин-эозин. Ув. 200.
При гистологическом исследовании коленных суставов крыс групп контрольной патологии,
проведенном на 56 день эксперимента, обнаруживались признаки патологии, характеризующейся
развитием гиперпластических, воспалительных и деструктивно-дистрофических процессов, что
соответствует общим представлениям о патоморфологических особенностях развития
остеоартроза (рис. 2).
Рис. 2. Морфоструктура коленного сустава крысы с ССА. Нарушение зонального строения хряща, гнездная резорбция
ткани (стрелка). Гематоксилин-эозин. Ув. 200.
При этом отмечалось поражение не только хрящевой ткани, но и ранние тканевые изменения
синовиальных оболочек, в которых преобладали циркуляторные нарушения – появление в
субсиновиальном слое многочисленных новообразованных сосудов, часто расширенных,
кровенаполненных, содержащих в просвете значительное количество лейкоцитов, а также
клеточная пролиферация, с преобладанием в инфильтрате гистиоцитов и фибробластов разной
степени зрелости. У всех животных контрольной группы отмечается деструктивно-дистрофическое
поражение суставного хряща. Обращает на себя внимание стертость зональной структуры
хрящевой ткани: разделение на слои отсутствует, хондроциты расположены беспорядочно.
Плотность расположения хондроцитов снижена по сравнению с интактными показателями (21,9
экземпляров на усл. ед. площади при 42,4 в интактном контроле). Результатом снижения
плотности, а, следовательно, и синтетической активности хондроцитов, являются дегенеративные
изменения межклеточного вещества: окраска основного вещества неравномерная, матрикс
разволокнен, встречается гнездная резорбция хрящевой ткани (рис. 2). Суставная поверхность
теряет четкость границ, часто неровная, изъеденная, на многих участках имеет разной глубины
узуры. В некоторых наблюдениях обнаружены признаки формирования паннуса, когда
гиперплазированная синовиальная оболочка нарастает на суставную поверхность с боковых
сторон. Результатом развития вышеописанных патологических процессов является снижение
такого показателя как толщина хряща, которая составляет 88% от показателей интактных
животных.
При изучении структуры суставного хряща крыс с ССА, которых лечили исследуемым
препаратом Хондролайф, обнаруживалась морфологическая картина близкая к интактным
животным при наличии незначительных патологических изменений Так, толщина суставного хряща
недостоверно превышала уровень интактных животных и в среднем составляла 16,0 усл. ед., а
показатель клеточной плотности достоверно превышал уровень контрольной патологии на 40%
(30,46 против 21,90 экземпляров на усл. ед. площади).
При морфологическом исследовании обнаруженная гистологическая картина в целом
коррелировала с полученными морфометрическими данными. У подавляющего большинства
животных наблюдался суставной хрящ, имеющий ровную поверхность с нормальной
цитоархитектоникой, в котором отмечались три нечетко очерченные зоны и неоднотипность
клеточных
элементов
на
разных
уровнях
структуры.
Матрикс
хряща
выглядел
слабоэозинофильным в поверхностной и базофильным в промежуточной и глубокой зонах (рис. 3).
Синовиальные оболочки без патологических изменений, не гиперплазированы, по клеточному
составу представлены синовиоцитами и фибробластами.
Рис. 3. Морфоструктура коленного сустава крысы с ССА под воздействием препарата Хондролайф. Нормальная
гистоструктура хряща. Цитоархитектоника в состоянии нормы. Гематоксилин-эозин. Ув. 200.
При гистологическом изучении суставов крыс с экспериментальным артрозом под воздействием
референс-препарата Хондроксид наблюдалась картина ткани идентичная группе контрольной
патологии, но при меньшей степени патологических проявлений (рис.4).
Рис. 4. Морфоструктура коленного сустава крысы с ССА под воздействием препарата Хондроксид. Многоклеточные
изогенные группы, соседствующие с бесклеточными участками. Гематоксилин-эозин. Ув. 200.
Так, показатель толщины суставного хряща находился на уровне группы контрольной патологии
(13,66 против 13,59 усл. ед.), в то время как, показатель клеточной плотности достоверно
увеличивался на 25% (27,3 против 21,9 экземпляров на усл. ед. площади). Так же наблюдалось
уменьшение (до 50%) количества микропрепаратов с теми или иными отклонениями от нормы
(табл. 1). В части наблюдений отмечено появление кластеров, соседствующих с относительно
бесклеточными участками (рис. 4), которые, видимо, не в состоянии полноценно синтезировать
межклеточное вещество.
Анализ полученных результатов позволяет сделать вывод о том, что в суставах крыс под
воздействием дексаметазона возникают все морфологические маркеры ранних стадий
деформирующего остеоартроза: снижение клеточной плотности; дистрофические изменения
хондроцитов; многоклеточные изогенные группы, чередующиеся с опустошенными участками;
неравномерная окраска матрикса; патологическая васкуляризация и оссификация хряща в местах,
где имеются изменения; узурированность суставной поверхности; изменения в синовиальных
оболочках; очаговый лизис костной и фиброз миелоидной ткани.
Выводы:
1. Накожное нанесение в лечебных целях исследуемого препарата Хондролайф существенно
снижает выраженность патологических процессов в суставном хряще крыс с ССА – толщина
суставного хряща восстанавливается до интактных величин, а также наблюдается уменьшение (до
30%) количества микропрепаратов, в которых обнаруживаются те или иные отклонения от нормы.
Морфометрические данные коррелируют с особенностями морфологической структуры суставного
хряща – поверхность хряща становится более ровной, без признаков разволокнения, состояние
цитоархитектоники нормализуется, дистрофических изменений в хондроцитах при этом не
наблюдается.
2. Применение комбинированного хондропротектора Хондролайф оказывает позитивное
воздействие на течение экспериментального артроза у крыс, а именно приводит к нормализации
морфоструктуры суставных тканей, с наличием слабо выраженных нарушений в структурах хряща
и капсуле сустава.
Литература
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
Sellam, J. Osteoarthrosis: pathogenesis, clinical aspects and diagnosis [Text] / J. Sellam, G. Herrero-Beamont, F Berenbaum // Arthritis
Rheum. – 2009. – Vol. 60 (2). – Р. 524-533.
Bekkers J.E. Diagnostic modalities for diseased articular cartilage – from defect to degeneration: a review [Text] / J.E. Bekkers, L. Creemers,
W.J. Dhert [et al.]// Cartilage. – 2010. – Vol. 1. – Р. 157-164.
Van der Wall A.C. Cost analysis favours SPECT over PET and CTA for evaluation of coronary artery disease: the SPARC study [Text] / A.C.
Van der Wall // Neth Heart J. – 2014. – Vol. 22. – Р. 257-258.
Клинические рекомендации. Ревматология [Text] / Под ред. Е.Л. Насонова // М. : ГЭОТАР–Медиа, 2008. – С. 99-111.
Luger E.O. The challenge: understanding the molecular pathogenesis of osteoarthritis and developing innovative therapeutic concepts [Text] /
E.O. Luger, A. Radbruch // Z Rheumatol. – 2014. – Vol. 73 (4). – Р. 310-314.
Lajeunesse D. Subchondral bone sclerosis in osteoarthritis: not just an innocent bystander [Text] / D. Lajeunesse, F. Massicotte, J.P. Pelletier
[et al.] // Modern Rheumatology. – 2003. – Vol. 13. – Р. 7-14.
Badokin, V.V. Knee osteoarthrosis: Clinical presentation, diagnosis, treatment [Text] / V.V. Badokin // Modern Rheumatology. – 2013. – Vol.
(3). – Р. 70-75.
Zhang W. EULAR evidence-based recommendations for the diagnosis of knee osteoarthritis [Text] / W. Zhang, M. Doherty, M.A. BiermaZeinstra [et al.] // Ann. Rheum. Dis. – 2010. – Vol. 69. – Р. 483-489.
Zhang W. OARSI recommendations for the Management of hip and knee osteoarthritis Part III: changes in evidence following systematic
cumulative update of research published through January 2009 [Text] / W. Zhang, G. Nuki, R.W. Moskowitz [et al.] // Osteoarthr. Cartilage. –
2010. – Vol. 18 (4). – Р. 476-499.
Bottegoni C. Oral chondroprotection with nutraceuticals made of chondroitin sulphate plus glucosamine sulphate in osteoarthritis [Text] / C.
Bottegoni, R.A. Muzzarelli, F. Giovannini [et al.] // J. Carbohydr. Polym. – 2014. – Vol. 30. – Р. 126-138.
Hochberg M.C. Structure–modifying effects of chondroitin sulfate in knee osteoarthritis: an updated meta–analysis of randomized placebo–
controlled trials of 2–year duration [Text] / M.C. Hochberg // Osteoarthritis Cartilage. – 2010. – Vol. 18. (Suppl 1.). – Р. 28–31.
Clegg D.O. Glucosamine, chondroitin sulfate, and the two in combination for painful knee osteoarthritis [Text] / D.O. Clegg, D.J. Reda, C.L.
Harris [et al.] // N. Engl. J. Med. – 2006. – Vol. 354. – Р. 795–808.
Методические
рекомендации
по
экспериментальному исследованию
и
клиническому изучению
противоартрозных
(хондромодулирующих) лекарственных средств / [И.А. Зупанец, Н.А. Корж, Н.В. Дедух и др.] – К., 1999. – 56 с.
Реферат
ТЕРАПЕВТИЧНА ЕФЕКТИВНІСТЬ ОРИГІНАЛЬНОГО КОМБІНОВАНОГО ХОНДРОПРОТЕКТОРА НА МОДЕЛІ СИСТЕМНОГО
СТЕРОЇДНОГО АРТРОЗУ У ЩУРІВ
Зупанець І.А., Зімін С.М.
Ключові слова: остеоартроз, хондропротектори, хондроїтину сульфат, глюкозамін.
Остеоартроз (ОА) є найчастішою суглобовою патологією серед ревматичних захворювань, а
також однією з основних причин передчасної втрати працездатності та інвалідності, особливо в
старших вікових групах. Актуальним є пошук нових ефективних препаратів – хондропротекторів
для лікування ОА, у тому числі таких, що містять комбінацію хондроїтин сульфату та глюкозаміну. У
цьому дослідженні на моделі системного стероїдного артрозу (ССА) у щурів проведено вивчення
хондропротекторної активності Хондролайф крем-гелю, що містить глюкозаміну гідрохлорид,
хондроїтину сульфат, камфору, ментол та допоміжні речовини. Моделювання ССА проводили
шляхом триразового внутрішньом'язового введення в м'яз стегна дексаметазону в разовій дозі 7
мг/кг з інтервалом в 1 тиждень. Хондролайф крем-гель і референт-препарат Хондроксид наносили
щоденно зовнішньо шляхом нашкірних аплікацій в ділянці колінних суглобів на обох лапах в
еквівалентних кількостях в умовно-терапевтичній дозі 50 мг на кожну, починаючи з 28-го дня
експерименту і протягом 4-х тижнів. Дослідження ультраструктури суглобового хряща щурів
проводили за допомогою стандартних методів електронної мікроскопії. Проводили вивчення
морфометричних показників – визначали товщину хряща (вимірювали в 3-х точках і виражали в
умовних одиницях), підраховували щільність розташування хондроцитов на умовній одиниці площі.
У тварин з експериментальним артрозом при нанесенні на суглоби препарату Хондролайф
відзначено відновлення товщини суглобового хряща до інтактних величин, а також зменшення (до
30%) кількості мікропрепаратів з відхиленнями від норми. Отримані результати дозволяють
зробити висновок про те, що препарат Хондролайф проявляє позитивний вплив на перебіг
експериментального артрозу у щурів і має хондропротекторні властивості – знижує інтенсивність
деструктивних процесів у тканинах колінних суглобів тварин з ОА і підвищує регенераторні
можливості суглобового хряща.