модификация структуры мембран клеток крови как модулятор

Известия Челябинского научного центра, вып. 1 (22), 2004
МЕДИКО–БИОЛОГИЧЕСКИЕ ПРОБЛЕМЫ
УДК 612.111+577.352.336
МОДИФИКАЦИЯ СТРУКТУРЫ МЕМБРАН КЛЕТОК КРОВИ
КАК МОДУЛЯТОР ИЗМЕНЕНИЯ ПРОНИЦАЕМОСТИ МЕМБРАН
ДЛЯ АДФ ПРИ ИХ СДВИГОВОЙ ДЕФОРМАЦИИ
В.С. Глушков, С.А. Сторожок, А.М. Петровец
е–mail: [email protected]
Тюменская государственная медицинская академия, г. Тюмень, Россия
Статья поступила 31 декабря 2003 г.
Введение
В настоящее время не вызывает сомнений важная роль сдвиговой деформации мембран клеток в регуляции их функции. Реакция клеток крови в ответ на сдвиговую деформацию получила название деформационного стресса и она играет важную роль в регуляции их
функции. Указанная реакция выявлена для эндотелия кровеносных сосудов и клеток крови.
Деформационный стресс возникает при физиологических усилиях сдвига, то есть таких, которые имеют место при движении форменных элементов крови в кровеносных сосудах.
Сдвиговая деформация мембран эндотелия стимулирует в этих клетках синтез NO. При
сдвиговой деформации эритроцитов происходит увеличение проницаемости мембран для
ионов Ca, K, Na. Для ионов K и Na изменение проницаемости мембран носит дозозависимый характер от величины усилия сдвига в интервале от 140 до 220 дин/см2 [Larsen e.a.
1981, Johnson R.M., Tang K., Hebbel R.P. 1990—1992].
В настоящее время установлено, что при деформационном стрессе изменяется проницаемость мембран эритроцитов не только для ионов натрия и калия, но и для макромолекул
(гемоглобин) и небольших полярных молекул (аденозинтрифосфорная кислота и аденозиндифосфорная кислота) [Alkhamis T.M., Bessinger R.L. 1994].
Аденозиндифосфат является одним из активаторов процесса агрегации тромбоцитов.
Изменения в структуре мембран эритроцитов, которые приводят к увеличению их проницаемости для АДФ при деформациях эритроцитов, могут являться причиной активации
внутрисосудистого свертывания крови [Alkhamis T.M. e.a. 1990 ].
Рост проницаемости мембран эритроцитов для катионов при деформационном стрессе
объясняют уменьшением плотности упаковки липидного бислоя мембран. В пользу этого
предположения свидетельствует и то, что накопление гидроперекисей липидов в мембранах
эритроцитов оказывает синергический эффект на увеличение проницаемости мембран для
одновалентных катионов при деформационном стрессе [Hebbel R.P., e.a. 1991].
Важную роль в патогенезе таких заболеваний как инфаркт миокарда, стенокардия, артериальная гипертензия, сахарный диабет, играет активация процессов пероксидации липидов плазмы крови и клеточных мембран [Зенков Н.К., Ланкин В.З. и др. 2001].
Таким образом, весьма интересным являлось изучение изменения проницаемости мембран клеток крови для аденозиндифосфата при деформационном стрессе на фоне модификации структуры мембран в результате свободнорадикального окисления липидов.
Целью настоящего экспериментального исследования являлось изучение зависимости
выхода АДФ из клеток крови при их деформации на фоне модификации мембран при активации процессов свободнорадикального окисления липидов.
226
В.С. Глушков, С.А. Сторожок, А.М. Петровец
Для достижения указанной цели решались следующие задачи:
1. Постановка высокочувствительного метода количественного оперделения АТФ.
2. Создание экспериментальной технологии для обеспечения сдвиговой деформации клеток крови с контролируемой величиной усилия сдвига.
3. Разработка экспериментального метода модификации мембран клеток крови в процессе
контролируемого свободнорадикального окисления липидов.
1. Методика исследования
Учитывая, что при сдвиговой деформации эритроцитов содержание АДФ во внеклеточной среде возрастает незначительно, конечные концентрации не более 10–9М, для количественного определения АДФ нами использовался высокочувствительный хемилюминисцентный метод анализа. Предварительно АДФ фосфорилировали до АТФ в реакции
с фосфоенолпируватом, катализируемой пируваткиназой. Реакционная среда имела следующий состав: 5 ЕД пируваткиназы; 10 мкл раствора фосфоенолпирувата (исходная концентрация 26 мМ/л) [пр–во Sigma-Aldr. Comp.]; 20 мкл раствора KCl (исходная концентрация
5 М/л); 900 мкл 0,5 мМ трис–ацетатного буфера, pH 7,4 с добавлением 1 мМ MgCl2 и 0,1 мл
исследуемого образца плазмы крови или стандартного раствора АДФ [Garcia–Carmona F.,
e.a. 1981]. Для полного фосфорилирования АДФ до АТФ реакционную смесь выдерживали
не менее 50 минут при комнатной температуре. Количество АТФ, образующееся в результате указанной реакции, прямопропорционально содержанию АДФ в исследуемом образце.
В ходе люциферазной реакции, катализируемой люциферазой светлячков, АТФ участвует
в окислении люциферина, а интенсивность возникающего при этом свечения прямопропорционально количеству АТФ в реакционной среде (риc. 1). Интенсивность светового потока
оценивалась с помощью хемилюминометра собранного в нашей лаборатории, в котором
в качестве фотоприемника используется фотоэлектронный умножитель ФЭУ–35(область
спектральной чувствительности 300…600 нм), включенный по схеме измерения фототока,
с заземлением положительного полюса источника питания, что позволяет избежать влияния
нестабильности питания ФЭУ на величину выходного сигнала. С сопротивления нагрузки
выходной сигнал ФЭУ поступает на вход усилителя, к выходу которого подключен аналогово-цифровой преобразователь PGI–9118 фирмы AdLink inc., что обеспечивает прямой ввод
информации в компьютер. Для обработки информации использован специальный аппаратно-програмный интерфейс (авторская разработка нашей лаборатории). Использованный
нами метод определения АДФ позволял выявлять его содержание в инкубационной среде
в количестве не менее 10–11М. Обработка полученных результатов производилась при помощи пакета Statistika for Windows 5.0.
Рис. 1. Изменение уровня интенсивности люминесценции (I) в зависимости от концентрации АДФ
в исследуемом образце
Модификация структуры мембран клеток крови
227
Клетки цельной крови, взятой посредством венепункции у добровольцев (здоровые
юноши в возрасте от 18 до 22 лет), стабилизированной гепарином (2ЕД на 1 мл) подвергалась сдвиговой деформации, при прохождении через тефлоновый капилляр длинной 0,23 м
и диаметром 0,7×10–3 м, при температуре 37 °С, объемная скорость составляла 0,016 мл/сек
при этом обеспечивалось усилие сдвига в пределах \ 13 Н/м2.
Модификация структуры мембран клеток крови обеспечивалась в процессе контролируемого свободнорадикального окисления липидов мембран. Для активации процессов
свободнорадикального окисления липидов, в образцы исследуемой крови добавляли различные концентрации гидроперикиси третбутила и инкубировали в течение 30 мин. при температуре 37 °С. Из графика представленного на рис. 2. видно, что имеет место наличие линейной зависимости между содержанием в эритроцитах малонового диальдегида (одного из
конечных продуктов свободнорадикального окисления липидов) и концентрацией гидроперикиси третбутила. Таким образом, использованная нами экспериментальная технология
позволяла контролировать уровень свободнорадикального окисления липидов мембран
клеток крови.
Рис. 2. Изменение количества малонового диальдегида (МДА) в эритроцитах
в зависимости от концентрации гидроперикиси третбутила (ГТБ) в реакционной среде:
точки на графике соответствуют среднему значению семи измерений
Реологические свойства эритроцитов оценивались с помощью эктацитометра, в ячейке
которого создавались следующие усилия сдвига: 5, 10, 15, 20 x10–2 Н/м2, при температуре
37 °С [С.А. Сторожок и соавт. 1997].
2. Результаты исследования
В плазме образцов крови, мембраны клеток которых подвергались деформации, наблюдалось достоверное увеличение количества АДФ, которое зависело от длительности
воздействия деформационного стресса (рис. 3).
В дальнейшей серии экспериментов мы исследовали выход АДФ из клеток крови при их
деформации, мембраны которых были модифицированы в результате свободнорадикального окисления липидов. Результаты этих экспериментов представлены на рис. 4, они позволяют говорить о зависимости выхода АДФ из клеток крови при их деформации от степени
свободнорадикального окисления липидов мембран. При малых концентрациях гидроперикиси третбутила, используемых для активации свободнорадикальных процессов пероксидации липидов мембран клеток крови, наблюдалось уменьшение выхода аденозиндифосфата
228
В.С. Глушков, С.А. Сторожок, А.М. Петровец
из клеток крови при их деформации. Эти результаты были достоверными в сравнении с результатами для образцов крови, которые не подвергались деформации, или подвергались
воздействию деформационного стресса, но мембраны клеток не были модифицированы
в процессе свободнорадикального окисления липидов. По мере увеличения глубины окисления липидов мембран клеток крови, инициированной гидроперикисью третбутила, наблюдалось увеличение выхода АДФ при деформационном стрессе. Таким образом, можно говорить о наличии U–образной зависимости проницаемости мембран клеток крови при их
деформации для молекул аденозиндифосфата в зависимости от степени окисления липидов мембран (рис. 4).
Рис. 3. Изменение содержания аденозиндифосфата в плазме,
в зависимости от времени воздействия сдвиговой деформации на клетки крови:
1 — опыт; 2 — контроль (образцы крови, которые инкубировали при темп.
37 °С и не подвергали сдвиговой деформации)
Рис. 4. Изменение количества аденозиндифосфата в плазме крови:
1 — контроль — образцы крови не подвергались деформационному стрессу и не обрабатывались гидроперикисью
третбутила; 2 — образцы крови подвергались деформационному стрессу после модификации мембран гидроперикисью третбутила; 3 — образцы крови подвергались только деформационному стрессу
Модификация структуры мембран клеток крови
229
Для более полного представления выявленного эффекта, нами были проведены исследования реологических свойств эритроцитов, мембраны которых подвергались модификации
указанными концентрациями гидроперикиси третбутила. В результате чего нами выявлена
зависимость степени деформации мембран эритроцитов от концентрации гидроперикиси
третбутила. При возрастании концентрации гидроперикиси третбутила способность эритроцитов к деформации снижается. Это можно объяснить тем, что при свободнорадикальном
окислении липидов мембраны эритроцитов приобретают более жесткую структуру, в результате модификации вязкоэластических свойств белкового цитоскелета мембран [Chasis
J.A. 1986].
3. Обсуждение
Для объяснения выявленной нами зависимости выхода АДФ из клеток крови при деформационном стрессе от глубины свободнорадикального окисления липидов мембран
прежде всего следует исходить из того, что от этого зависит характер структурных изменений в мембранах клеток крови. В процесс свободнорадикального окисления вовлекаются
в первую очередь остатки ненасыщенных жирных кислот молекул фосфолипидов мембран
клеток крови, как наиболее окисляемый субстрат. В результате возрастает плотность упаковки молекул в липидном бислое мембран, уменьшается их проницаемость для различных
веществ. Увеличение плотности упаковки молекул сопровождается уменьшением общей
свободной энергии липидного бислоя и ростом энергии когезии в материале мембраны
[Whol, 1946; Demel, De Kruyff, 1976; Demel e.a. 1977; Yeagle, 1985—87]. В этом случае для
изменения площади мембраны требуются затраты дополнительной энергии для преодоления возросших сил межмолекулярного взаимодействия, количественно это характеризуется
увеличением модуля поверхностного сжатия мембраны. Вероятно этим и обусловлено выявленное нами уменьшение выхода АДФ из клеток крови при их деформации, в случае
не глубокого свободнорадикального окисления липидов мембран. По мере увеличения глубины окисления липидов мембран и накопления гидрофильных продуктов пероксидации липидов возрастает проницаемость мембран клеток крови для воды и полярных молекул.
Действительно в тех случаях когда для активации свободнорадикального окисления липидов мембран клеток крови использовались высокие концентрации гидроперикиси третбутила, что обеспечивало глубокую степень окисления липидов мембран, мы наблюдали увеличение выхода АДФ из клеток крови при их деформации.
Заключение
Таким образом, в настоящей работе впервые показано наличие зависимости выхода
АДФ из клеток крови при их сдвиговой деформации от степени свободнорадикального окисления липидов мембран.
Список литературы
Зенков Н.К., Ланкин В.З., Меньщикова Е.Б. Окислительный стресс МАИК Наука / Интерпериодика
2001, 123 с.
С.А. Сторожок, А.Г. Санников, Ю.М. Захаров Молекулярная структура мембран эритроцитов и их механические свойства. Изд–во Тюменского государственного университета 1997, 234 с.
Alkhamis T.M., Bessinger R.L. Surface and bulk effects on platelet adhesion and aggregation during simple
(laminar) shear flow of whole blood. //J Biomater Sci Polym Ed 1994. Vol. 6. P. 746—751.
Chasis J.A., Mohands N. Erythrocyte Membrane Deformabilityand Stability. Two Distinct Membrane Properties that are Independently Regulated by Skeletal Protein Associations. // J. Cell. Biol. 1986. Vol. 103.
P. 343.
Hebbel R.p., Mohands N. Reversible Deformation–Dependent Erythrocyte Cation Leak. Extreme Sensitivity
Conferred by Minimal Peroxidation // Biophys J., 1991. Vol. 60. P. 712—715
Demel R.A., De Kruyff B. The Function of Sterols in Membranes // Biochim. Biophys. Acta., 1976. Vol. 457
P. 109—132.
Demel R.A., Jansen J.W.C.M., Van Dijck P.W.M., Van Deenen L.L.M. The Preferential Interaction of Cholesterol with Different Classes of Phospholipids // Biochim. Biophys. Acta., 1977. Vol. 465. P. 1—10.
230
В.С. Глушков, С.А. Сторожок, А.М. Петровец
Garcia–Carmona F., Garcia–Canaves F., Lozano J.A. Optimizing Enzyme Assays with One or Two Coupling
Enzymes // Anal. Biochem., 1981. Vol. 113. P. 286—291.
Johnson R.M. Membrane Stress Increases Cation Permeability in Red Cells // Biophys J., 1992. Vol. 67.
P. 1876—1881
Johnson R.M., Gannon S.A. Erythrocyte Permeability Induced by Mechanical Stress: a Model for Sickle Cell
Cation Loss // Am J Physiol., 1990. Vol. 259. P. 746—751.
Johnson R.M., Tang K. Induction of a Ca2+ — Activated K+ Channel in Human Erythrocytes by Mechanical
Stress. //Biochim Biophys Acta. 1992. Vol. 1107. P. 314—318.
Whol K. Thermodynamic Evaluation of Binary and Ternary Liquid Systems //Am. Inst. Chem. Eng. 1946.
Vol. 42. P. 215—249.
Yeagle P.L. Cholesterol and the Cell Membrane // Biochim. Biophys. Acta., 1985. Vol. 822. P. 267—287.
Yeagle P.L The Membranes of Cells. /Academic Press. Inc. Orlando. Florida., 1987. P. 120—138.