ПРОЦЕССЫ САМОАССОЦИАЦИИ МОЛЕКУЛ

ВЕСТНИК ЮЖНОГО НАУЧНОГО ЦЕНТРА РАН
Том 8, № 2, 2012, стр. 18–26
ХИМИЯ И НОВЫЕ МАТЕРИАЛЫ
УДК 542.06.542.61.542.46.808.542.97.542.93
ПРОЦЕССЫ САМОАССОЦИАЦИИ МОЛЕКУЛ ГЛИЦИРРИЗИНОВОЙ
КИСЛОТЫ: МАСС-СПЕКТРАЛЬНОЕ
И КВАНТОВОХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ
© 2012 г.
А.В. Лекарь1, А.А. Милов2, С.Н. Борисенко3,
Е.В. Ветрова3, Н.И. Борисенко1
Выполнены квантовохимические расчеты для изучения устойчивости изомеров глицирризиновой
кислоты (ГК). Показано, что для глицирризиновой кислоты возможно образование кластеров общего
вида Xn (n = 1… n = 6). Показано, что наибольшей стабильностью обладают кластеры, построенные по
принципу “голова–хвост”. Самоассоциат ГК, состоящий из двух молекул ГК, образует полость между
ними, достаточную для включения соразмерных молекул-гостей. Методом масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением выполнена экспериментальная проверка расчетных данных. Данные
масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением обнаруживают наличие автоассоциатов глицирризиновой кислоты (1) для образцов 0,2%-ного раствора моноаммониевой соли глицирризиновой
кислоты при рН 5,5 и рН 2.
Ключевые слова: самоассоциация, глицирризиновая кислота, масс-спектрометрия, ионизация
электрораспылением, квантовохимические расчеты, комплексообразование, супрамолекулярные комплексы.
ВВЕДЕНИЕ 1
2
3
Четкое понимание механизмов терапевтического действия лекарственных препаратов на молекулярном уровне является одной из важнейших задач
биохимии и медицинской химии, поскольку понимание процессов связывания и диссоциации лиганд-рецепторных комплексов позволяет выявить
механизм действия лекарства, разработать методы
для контроля действия лекарства и минимизировать возможные побочные эффекты для организма.
До настоящего времени такие процессы изучены
недостаточно полно: отсутствуют четкие представления о механизмах связывания лекарства с рецептором, нет данных о дальнейшей трансформации
комплекса на активном центре рецептора, ведущей
к его диссоциации. Одним из классов биологически активных веществ, широко используемых в качестве адъювантных средств (adjuvants), являются
сапонины, чья селективная способность к образованию ассоциатов с молекулами других веществ
1
Эколого-аналитический центр Южного федерального
университета, 344090 Ростов-на-Дону, ул. Зорге, 7.
2
Южный научный центр Российской академии наук,
344006, Ростов-на-Дону, пр. Чехова, 41.
3
НИИ физической и органической химии Южного Федерального университета, 344090 Ростов-на-Дону, пр. Стачки,
194/2; e-mail: [email protected]
известна давно [1]. Это свойство сапонинов применяется в настоящее время при направленном поиске новых лекарственных субстанций c заданными
характеристиками на основе комплексов типа “хозяин–гость” [2]. Привлекательность такого подхода
состоит в том, что в качестве базового фрагмента
можно использовать композиции известных, клинически апробированных препаратов. Кроме того,
применение уже испытанных препаратов позволяет
значительно снизить затраты на доклинические исследования и клиническую апробацию новых композиций.
Так, в настоящее время активно создаются лекарственные субстанции на основе известных базовых физиологически активных компонентов (фармаконов) и глицирризиновой кислоты (ГК) [3; 4].
Было обнаружено значительное количество примеров усиления действия ряда фармаконов в комплексах с ГК [5; 6], что позволяет уменьшить эффективные дозы лекарственных препаратов в 100–200 раз.
В процессах получения таких комплексов молекулы глицирризиновой кислоты выступают в роли
полидентантных лигандов, образующих с базовыми фармаконами комплексы различной стехиометрии, которые и используются как низкодозные
лекарственные субстанции. При этом для установления фундаментальных связей структура – свойства особенно важно изучение механизмов процес-
ВЕСТНИК ЮЖНОГО НАУЧНОГО ЦЕНТРА РАН
Том 8
№2
2012
ПРОЦЕССЫ САМОАССОЦИАЦИИ МОЛЕКУЛ ГЛИЦИРРИЗИНОВОЙ КИСЛОТЫ
19
Таблица 1. Cтроение автоассоциатов глицирризиновой кислоты 1
Соотношение m/z
Заряд z
Строение иона
273,106 и 273,443
410,179 и 410,678
547,218 и 547,560
–3
–2
–3
821,362
1232,541
–1
–2
1643,723
–1
[М–3Н]–3
[М–2Н]–2
[(М–Н)…(М–2Н)]–3
или [М…(М–3Н)]–3
[М–Н]–
[(М–Н)…М…(М–Н)]–2
или [М…(М–2Н)…М]–2
[(М–Н)…М]–
сов образования супрамолекулярных комплексов
по типу “гость – хозяин”, где сапонин в качестве
молекулы-“хозяина” может образовывать в гидрофильной среде эндолипофильную полость для молекулы-“гостя” [7; 8].
При всей многочисленности примеров использования такого подхода [3–6] детали механизма процесса формирования низкодозных лекарственных
комплексов глицирризиновой кислоты 1 с фармаконами в различных соотношениях (1:1, 1:2 и 1:4)
до сих пор изучены недостаточно. Практически не
известны данные по геометрии и свойствам самоассоциатов глицирризиновой кислоты, которые и
определяют, в значительной степени, возможность
образования полости внутри самоассоциатов глицирризиновой кислоты, так необходимой для размещения молекулы базового фармакона.
В этой связи целью данной работы стало проведение квантовохимических расчетов для предсказания геометрии и свойств автоассоциатов глицирризиновой кислоты 1 и доказательства формирования
автоассоциатов с использованием масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением.
Коэффициент
ассоциации
Относительная
доля иона
1
1
2
8
429
1
1
3
286
52
2
13
ограничения на использование методов ab initio и
теории функционала плотности [10]. Все обсуждаемые далее структуры соответствуют минимумам
на соответствующих поверхностях потенциальной
энергии. Графические изображения молекулярных
структур, представленные на рис. 1–4, были получены с использованием программы Chemcraft [11],
где в качестве исходных данных использовали расчетные данные.
Съемки масс-спектров проведены с использованием масс-спектрометра “Bruker Daltonics
micrOTOF-Q” с вводом пробы напрямую, ионизация электрораспылением, детектирование отрицательных и положительных ионов в интервале от 50
до 3000 Да с точностью не менее 1 · 10–2 Да. Напряжение на капилляре распылителя ±4200 В, параметры газа-осушителя (азот “осч”, 5 л/мин, 200 °С)
и энергия ионов на квадруполе (5,0 эВ) оптимизированы для детектирования пиков псевдомолекулярных и ассоциатных ионов.
Для прямого ввода взяты растворы в ацетонитриле (фирма Merck, квалификация HPLC/MS) в
концентрации до 0,2 мг/мл (10–7÷10–6 М). Результаты масс-спектрометрии приведены в табл. 1.
Масс-спектры автоассоциатов глицирризиновой
кислоты 1 получены для 0,2 %-ного раствора моноаммониевой соли глицирризиновой кислоты при
рН 5,5 и рН 2 (добавка муравьиной кислоты).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Расчеты проводили при помощи пакета программ Gaussian-03 [9] полуэмпирическим методом
PM3. Выбор этого приближения обусловлен размерами изучаемых ассоциатов, накладывающими
Квантовохимические расчеты кластеров ГК общего вида Xn (n = 1… 6). Как показывают расчеты,
бимолекулярная система (n = 2) образует устойчивые структуры 2–4, которые стабилизируются
системой водородных мостиковых O–H–O связей.
Характеристики данных структур приведены на
рис. 1, где в частности показаны наименьшие длины связи между молекулами ГК. Комплекс 2 относится к типу “голова – голова”, а комплексы 3, 4
имеют структуру “голова–хвост”. Расчеты показывают, что наибольшей устойчивостью обладают ас-
ВЕСТНИК ЮЖНОГО НАУЧНОГО ЦЕНТРА РАН
№2
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Том 8
2012
2*
20
А.В. ЛЕКАРЬ и др.
Рис. 1. Геометрическое строение бимолекулярных комплексов глицирризиновой кислоты (структуры 2–4) по данным полуэмпирических PM3 расчетов. Также приведены энергии комплексообразования. Здесь и на рис. 2, 3 расстояния в ангстремах
социаты 3, 4, энергии комплексообразования которых составляют 15–16 ккал/моль, что согласуется
с моделью стабилизации димерных ассоциатов ГК
по типу “голова к хвосту”, предложенной на основании данных спектроскопии ЯМР [4]. Необходимо
отметить, что наиболее энергетически устойчивый
бимолекулярный ассоциат 4 имеет внутреннюю
полость, достаточную для включения соразмерных
молекул-гостей.
Для оценки влияния растворителя на стабилизацию димеров ГК был изучен ассоциат, включающий структуру 4 и шесть молекул воды. Как
видно из рис. 2, соответствующая ему структура 5 характеризуется другим размером внутренней полости. Ее энергия стабилизации составляет
42,3 ккал/моль, при этом, как показывают расчеты,
на каждую молекулу воды приходится 4,4 ккал/моль
вклада в общую стабилизацию кластера 5.
При переходе к тримолекулярным системам
(n = 3) по-прежнему наиболее устойчивыми оказываются структуры типа “голова–хвост” (структуры
6, 7, рис. 3). В этих структурах молекулы ГК начинают формировать трехмерный каркас с размером
полости ~9–10 Å. Дальнейшее увеличение числа
молекул ГК (до n = 6) показывает предпочтительность упаковки “голова–хвост” с сохранением размеров полости (~9–10 Å) супрамолекулы.
Как показывают расчеты, увеличение энергии
комплексообразования при росте числа молекул ГК
в системе имеет нелинейный характер. Так, если
энергия стабилизации димера составляет ~15–
16 ккал/моль, то при переходе к структурам с n = 3
эта величина растет на ~10 ккал/моль. Дальнейшее
увеличение размера ассоциата (n = 4, 5) сопровождается ростом энергии комплексообразования на
15–20 ккал/моль в результате присоединения одной
молекулы ГК. Наименьший прирост энергии комп-
ВЕСТНИК ЮЖНОГО НАУЧНОГО ЦЕНТРА РАН
Том 8
№2
2012
ПРОЦЕССЫ САМОАССОЦИАЦИИ МОЛЕКУЛ ГЛИЦИРРИЗИНОВОЙ КИСЛОТЫ
21
Рис. 2. Геометрическое строение структуры 5 по данным полуэмпирических PM3 расчетов.
Рис. 3. Геометрическое строение тримолекулярных комплексов 6, 7 по данным полуэмпирических PM3 расчетов. Также приведены энергии комплексообразования
лексообразования дает переход от пентамолекулярных кластеров к ассоциатам с количеством молекул ГК n = 6, величина последнего в этом случае не
превышает 10 ккал/моль.
Для гексамолекулярных кластеров ГК (n = 6)
обнаружены стабильные симметричные структу-
ры – ассоциаты 8, 9 (рис. 4). Рассчитанные для них
размеры полости составляют ~10 Å, как и для ассоциатов ГК с n = 3…5. Следует отметить, что ассоциат 8, связывающийся по типу “голова–хвост”,
оказывается стабилизирован на 28,3 ккал/моль относительно изомера 9 (“голова–голова”), что под-
ВЕСТНИК ЮЖНОГО НАУЧНОГО ЦЕНТРА РАН
№2
Том 8
2012
22
А.В. ЛЕКАРЬ и др.
Рис. 4. Геометрическое строение гексамолекулярных комплексов 8, 9 по данным полуэмпирических PM3 расчетов. Также приведены элементы симметрии и энергии комплексообразования
тверждает исключительную стабилизацию комплексов ГК типа “голова–хвост”.
Таким образом, квантовохимические расчеты
подтверждают предположение о возможности образования супрамолекулярных самоассоциатов
глицирризиновой кислоты с предпочтительной стабилизацией структур типа “голова–хвост”. Исходя
из динамики роста энергии комплексообразования при увеличении числа молекул ГК(n), а также
учитывая, что возможность образования крупных
кластеров кинетически маловероятна, можно предположить, что с наибольшей вероятностью в реальной системе будут существовать ассоциаты ГК
с n = 2–4. Показано, что устойчивые ассоциаты
имеют полости, достаточные для внедрения в них
молекулы-“гостя”. Установлено, что присутствие
воды в системе значительно стабилизирует комп-
лексы ГК, обеспечивая наилучшее связывание молекул в системе. Это позволяет уже для димерных
систем иметь размеры полости, сопоставимые с полостями гексамолекулярных кластеров.
Данные масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением. Для экспериментальной проверки заключений, основанных на данных расчетов,
сняты масс-спектры моноаммонийной NH4-соли
глицирризиновой кислоты. Молекулярная масса
глицирризиновой кислоты 1 С42H62O16 составляет
822,370 Да. Типичный масс-спектр моноаммонийной NH4-соли глицирризиновой кислоты приведен
на рис. 5.
Масс-спектры моноаммонийной NH4-соли глицирризиновой кислоты при рН2 (рис. 5) регистрируют при выбранных экспериментальных условиях
наличие как однозарядных пиков, отвечающих мо-
ВЕСТНИК ЮЖНОГО НАУЧНОГО ЦЕНТРА РАН
Том 8
№2
2012
ПРОЦЕССЫ САМОАССОЦИАЦИИ МОЛЕКУЛ ГЛИЦИРРИЗИНОВОЙ КИСЛОТЫ
23
Рис. 5. Масс-спектр моноаммонийной NH4-соли глицирризиновой кислоты при рН = 2
лекулярному иону глицирризиновой кислоты, так и
однозарядных пиков, соответствующих самоассоциатам кислоты.
Так, например, пик, регистрируемый с m/z 821,36
(67% интенсивности), отвечает мономерному аниону [М–Н]– кислоты 1 (см. рис. 5).
Димерному (содержащему две молекулы глицирризиновой кислоты) однозарядному моноаниону [2М–Н]– однозначно отвечает пик (3% интенсивности) с массой 1643,723 Да.
На этом же спектре регистрируется, в отрицательных ионах, наряду с пиками мономеров и димеров ГК, двухзарядный пик с m/z 1232,541 (12%
интенсивности), который отвечает тримерному
автоассоциату кислоты 1. Такой тример может
иметь строение сэндвича [(М–Н)+М+(М–Н)]2– или
[М+(М–2Н)+М]2– (см. табл. 1).
Поскольку глицирризиновая кислота 1 является
трехосновной кислотой, то ее масс-спектр содержит, соответственно, пики мономерных псевдомолекулярного трианиона [М–3Н]3– с m/z 273,106
и изотопного трианиона [М–3Н+1]3– с m/z 273,443
(см. рис. 6).
Интенсивность пика [М–3Н]3– в 54 раза меньше
интенсивности пика [М–2Н]2– и в 36 раз меньше
интенсивности пика [М–Н]–, следовательно, в условиях ионизации электрораспылением при рН2
трехосновная кислота 1 диссоциирует в основном
по первой и второй ступеням.
Наряду с димерным трианионом [(М–Н)+(М–
2Н)]3–, которому соответствуют пики с m/z 547,218,
тримерному трехзарядному аниону [3М–3Н)]3–
должен соответствовать пик с m/z 821,36, который
достоверно в полученных масс-спектрах не фик-
ВЕСТНИК ЮЖНОГО НАУЧНОГО ЦЕНТРА РАН
№2
Том 8
2012
24
А.В. ЛЕКАРЬ и др.
Рис. 6. Фрагменты масс-спектра анионов глицирризиновой кислоты 1: трианиона [М–3Н]–3 с m/z 273,106 и изотопного трианиона
[М–3Н+1]–3 с m/z 273,443
сируется. Как видно из рис. 6, в масс-спектре наблюдается убывание интенсивности пиков в ряду
трехзарядных анионов [М–3Н]3– (интенсивность
2,3 × 104), [2М–3Н]–3 (2,9 × 103) и ожидаемого
[3М–3Н]3– (≤102). Это позволяет прогнозировать
практическое отсутствие трехзарядных анионов со
степенью ассоциации более 3 при выбранных условиях ионизации. Наблюдаемые зависимости напрямую связаны с возрастанием роли кулоновских
взаимодействий в процессах ионизации тримерных
и выше ассоциатов.
Кулоновским отталкиванием можно объяснить
также отсутствие димерных тетраанионов [(М–
2Н)+(М–2Н)]4– и [(М–Н)+(М–3Н)]4–, что подтверждено отсутствием пиков с m/z 410,179 для иона
[2М–4Н]4–.
Отсутствие пика, отвечающего тримерному ассоциату [М+(М–Н)+М]– с m/z 2466,10, отвергает
модель цепочечного ассоциата и подтверждает модель образования димерных ассоциатов кислоты 1
типа “голова к хвосту”. Соответствующая модель
предложена Г.А. Тостиковым [5] на основании данных спектроскопии ЯМР: димерные автоассоциаты состоят из двух изогнутых молекул сапонина,
с полостью между ними, достаточной для включения соразмерных молекул-гостей. Это согласуется
также с результатами наших квантовохимических
расчетов, приведенными выше.
Характерно, что с увеличением рН от 2 до 5,5 доля
трехзарядного аниона [М–3Н]3– с m/z 273,106 увеличивается на 65%, тогда как доли ди- и моноанионов
кислоты 1 изменяются менее существенно.
ВЕСТНИК ЮЖНОГО НАУЧНОГО ЦЕНТРА РАН
Том 8
№2
2012
ПРОЦЕССЫ САМОАССОЦИАЦИИ МОЛЕКУЛ ГЛИЦИРРИЗИНОВОЙ КИСЛОТЫ
Таким образом, данные масс-спектрометрии с
ионизацией электрораспылением подтверждают
результаты квантовохимических расчетов: глицирризиновая кислота 1 образует димерные автоассоциаты за счет свободных карбоксильных групп в
углеводной цепи и при атоме С-28 агликона. Причем устойчивость этих комплексов достаточна для
преодоления кулоновского отталкивания в трианионе. Наибольшее зарегистрированное значение коэффициента ассоциации составляет 3 (автоассоциат [3М–2Н]–2 с m/z 1232,541, см. табл. 1).
25
президента РФ МК-4425.2011 и ФЦП “Научные и
педагогические кадры инновационной России” г/к
16.740.11.0600.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Работа выполнена при финансовой поддержке
грантов РФФИ 11-03-12141-офи-м-2011, гранта
1. Sarnthein-Graf C., La Mesa C. Association of saponins
in water and water-gelatine mixtures // Thermochimica
Acta. 2004. Vol. 418. Is. 1–2. P. 79–84.
2. Sidhu G.S., Oakenfull D.G. A mechanism for the
hypocholesterolaemic activity of saponins // British Journal of Nutrition. 1986. Vol. 5. Is. 03. P. 643–649.
3. Толстиков Г.А., Балтина Л.А., Шульц Э.Э., Покровский А.Г. Глицирризиновая кислота // Биоорганическая химия. 1997. Т. 23. № 9. C. 691–703.
4. Толстикова Т.Г., Толстиков А.Г., Толстиков Г.А. На
пути к низкодозным лекарствам // Вестник Российской академии наук. 2007. Т. 77. № 10. C. 867–874.
5. Стоник В.А., Толстиков Г.А. Природные соединения
и создание отечественных лекарственных препаратов // Вестник Российской академии наук. 2008. Т. 78.
№ 8. C. 675–682.
6. Толстикова Т.Г., Сорокина И.В., Брызгалов А.О.,
Лифшиц Г.И., Хвостов М.В. Использование подхода
комплексообразования с глицирризиновой кислотой
для создания новых кардиотропных средств // Биомедицина. 2006. № 4. C. 115–117.
7. Vögtle F., Weber E. Multidentate Acyclic Neutral Ligands
and Their Complexation // Angewandte Chemie Int. Ed.
1979. Vol. 18. № 10. P. 753–776.
8. Weber E., Vögtle F. Classification and Nomenclature
of Coronands, Cryptands, Podands, and of Their
Complexes // Inorg. Chim. Acta. 1980. Vol. 45. P. 65–
67.
9. Frisch M.J., Trucks G.W., Schlegel H.B. et al. Gaussian
98. Revision A.9. Gaussian, Inc., Pittsburgh PA, 1998.
10. Стариков А.Г., Миняев Р.М., Старикова А.А.,
Минкин В.И. Механизм аддуктообразования пиридина с β-дикетонатами Zn(II) и Cu(II) // Вестник Южного научного центра РАН. 2011. Т. 7. № 2.
С. 27–34.
11. Zhurko G.A., Zhurko D.A. ChemCraft version 1.6 (build
304). URL: http://www.chemcraftprog.com/index.html
ВЕСТНИК ЮЖНОГО НАУЧНОГО ЦЕНТРА РАН
№2
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Квантовохимические расчеты показали, что
устойчивые изомеры глицирризиновой кислоты
для кластеров общего вида Xn могут быть получены вплоть до n = 6. Согласно данным расчетов,
наибольшей стабильностью обладают кластеры,
построенные по принципу “голова–хвост”, что согласуется с моделью образования димерных ассоциатов кислоты 1 типа “голова к хвосту”. При этом
самоассоциат ГК из двух изогнутых молекул сапонина образует полость между ними, достаточную
для включения соразмерных молекул-гостей.
Экспериментальная проверка расчетных данных
выполнена методом масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением и показала наличие автоассоциатов глицирризиновой кислоты 1 для образцов 0,2%-ного раствора моноаммониевой соли
глицирризиновой кислоты при рН 5,5 и рН 2.
Отсутствие в масс-спектрах пика, отвечающего тримерному ассоциату [М+(М–Н)+М]– с m/z
2466,10, подтверждает данные квантовохимического расчета об образовании димерных ассоциатов
кислоты 1 типа “голова–хвост” и отвергает модель
цепочечного ассоциата.
Том 8
2012
26
А.В. ЛЕКАРЬ и др.
SELF-ASSOCIATION PROCESSES OF MOLECULES
OF GLYCYRRHIZINIC ACID:
MASS-SPECTROMETRY AND QUANTUM-CHEMICAL
INVESTIGATION
A.V. Lekar’, A.A. Milov, S.N. Borisenko, E.V. Vetrova, N.I. Borisenko
Quantum-chemical calculations have been made to study the stability of isomers of glycyrrhizinic acid
(GA). It has been shown that glycyrrhizinic acid may form clusters of Xn (n = 1… n = 6) type and that the
most stable clusters are formed according to the principle of “head-tail”. Self-associated complex of GA
composed of two molecules of GA creates a cavity between them, which is enough to include guest molecules
of the similar size. Quantum-chemical experimental data have been checked applying mass-spectrometry
with electrospray ionization. Data of mass-spectrometry with electrospray ionization indicate self-associated
complexes of GA for samples of 0.2% solution of GA monoammonium salt under pH 5.5 and pH 2.
Key words: self-association, glycyrrhizinic acid, mass-spectrometry, electrospray ionization, quantumchemical calculations, complexation, supramolecular complex.
ВЕСТНИК ЮЖНОГО НАУЧНОГО ЦЕНТРА РАН
Том 8
№2
2012