Хрусталёва Т.А.1, Хрусталёв В.В.2, Барковский Е.В.2

Полученные данные свидетельствуют о том, что внесение в тест-систему растительной композиции привело к статистически значимому уровню снижения мутирования в изученном диапазоне концентраций от 0,188 до 3%. Так, добавление
образца композиции снижало уровень индуцированных этидиум бромидом мутаций на тест-штамме Salmonella typhimurium
ТА 98 на 7–30%, а уровень индуцированных азидом натрия мутаций на тест-штамме Salmonella typhimurium ТА 100 — на
3–34%, в зависимости от изученной концентрации. Наибольший уровень антимутагенной активности отмечен для 3% раствора композиции.
Показано, что эффект снижения уровня мутирования существенно не отличался для варианта без метаболической активации и с неполной метаболической активацией. На уровень снижения мутирования влияли такие факторы, как концентрация антимутагенного агента и используемый тест-штамм микроорганизма.
Таким образом, согласно результатам исследования установлено, что композиция, содержащая водные экстракты
корня сельдерея, чеснока, перца черного молотого, кориандра, обладала антимутагенной активностью в краткосрочном тесте с использованием ауксотрофных штаммов Salmonella typhimurium.
Вопрос об использовании продуктов питания и отдельных пищевых компонентов для профилактики индуцированного мутагенеза интенсивно обсуждается. Более того, не в явной форме пищевые химиопревенторы мутагенеза уже применяются, примером чего может служить обогащение пищевых продуктов витаминами-антиоксидантами, антимутагенные свойства которых хорошо известны. Однако использование пряно-ароматических растений как компонентов пищевых продуктов, имеющих антимутагенные свойства, не нашло широкого применения. Поэтому исследования антимутагенной активности пищевых продуктов с добавками пряноароматических растений является актуальным и перспективными для практического использования.
Заключение. На основе теста Эймса разработан метод количественной оценки антимутагенных свойств растительных композиций в краткосрочном тесте, использование которого позволило установить, что растительная композиция, содержащая водные экстракты корня сельдерея, чеснока, перца черного молотого, кориандра, снижала уровень мутирования
тестерных штаммов микроорганизмов в изученном диапазоне концентраций на 3–34%.
Литература
1.Бочков, Н.П. Система поиска и изучения соединений с антимутагенной активностью (методические рекомендации) / Н.П. Бочков,
А.Д. Дурнев, П.А. Журков // Хим.-фарм. журн. — 1992. — № 9–10. — С. 42–46.
2.Ямненко, М.И. Исследование антимутагенных эффктов некоторых природных веществ / М.И. Ямненко, Г.Д. Бердышев // Авиакосм. и эколог. медицина. — 2001. — Т. 35, № 1. — С. 79–82.
3.Antimutagenicity of extracts of Hericium erinaceus / J.C.Wang [et al.] // Kaohsiung J. Med. Sci. — 2001. — Vol. 17, № 5. — P. 230–238.
4.Antimutagenicity of some edible Thai plants, and a bioactive carbazole alkaloid, mahanine, isolated from Micromelum minutum / K.
Nakahara [et al.] // J. Agric. Food Chem. — 2002. — Vol.14, № 50 (17). — P. 479–802 [Электронный ресурс]. — Режим доступа: http://www.ncbi.
nlm.nih.gov/sites/entrez. — Дата доступа: 27.08.2008.
5.Anti-mutagenicity activity of dehydroepiandrosterone / S. Yang [et al.] // Zhonghua Zhong Liu Za Zhi. — 2002. — Vol. 24, № 2. — P.
137–140 [Электронный ресурс]. — Режим доступа: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez. — Дата доступа: 27.08.2008.
6.Antimutagenic activity of isoflavone from Pueraria lobata / M. Miyazawa [et al.] // J. Agric Food Chem. — 2001. — Vol. 49, № 1. — P.
336–341.
QUANTITATIVE EVALUATION OF ANTIMUTAGENIC ACTIVITY OF PLANT COMPOSITION IN SHORT-TERM
TESTS
Dudchik N.V.
Scientific Practical Center of Hygiene, Minsk, Belarus
Methodological approaches and quantitative assessment of antimutagenic activity of plant materials in short-term tests have
been developed. It was shown that the plant composition reduced the level of mutation test strains in the studied concentration range
by 3–34%.
Keywords: antimutagenic activity, plant composition, test strains.
Поступила 15.07.2014
ИОНЫ МАРГАНЦА (II) УСИЛИВАЮТ КАТАЛИТИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ
АСПАРТАТАМИНОТРАНСФЕРАЗЫ СЫВОРОТКИ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА
Хрусталёва Т.А.1, Хрусталёв В.В.2, Барковский Е.В.2
2Белорусский
1Институт физиологии НАН Беларуси, Минск;
государственный медицинский университет, Минск, Беларусь
Реферат. Активность аспартатаминотрансферазы сыворотки крови человека определялась кинетическим методом
при восьми различных концентрациях ионов марганца (II). Нами показано, что повышенная концентрация (10-5 моль/л и
выше) ионов марганца (II) достоверно усиливает активность фермента. Сайт связывания иона марганца выявлен с помощью
алгоритма «VVTAK Mn(II)» на дне полости, содержащей активный центр. Этот сайт перекрывается с неправильным сайтом
связывания аспартата, выявленным с помощью Docking Server. Таким образом, координация ионов марганца (II) должна способствовать правильной ориентации субстрата в активном центре аспартатаминотрансферазы.
Ключевые слова: марганец, аспартатаминотрансфераза, ферментативная активность, докинг.
Введение. Марганец является эссенциальным биогенным элементом. Ионы марганца (II) играют значительную роль
в репликации, транскрипции и антиоксидантной защите, поскольку связываются со специфическими активными сайтами
221
ферментов, осуществляющих данные процессы. В высоких концентрациях данный элемент оказывает токсическое воздействие на организм. Одним из проявлений марганцевой интоксикации является паркинсонизм [1].
В избыточном количестве марганец может поступать в организм через легкие (с пылью на вредных производствах)
[2], через желудочно-кишечный тракт (в случае ошибочного употребления препаратов марганца внутрь) [1], а также внутривенно (при употреблении неочищенных наркотических средств, приготовленных с использованием перманганата калия) [3].
В любом случае около 95% поступившего марганца подвергается детоксикации в гепатоцитах. Известно, что концентрация
10-3 моль/л не является летальной для культуры клеток печени [2]. Благодаря работе гепатоцитов избыток марганца выводится из организма с желчью. В результате детоксикации концентрация ионов марганца в крови не повышается более чем в
10 раз по сравнению с нормой даже непосредственно после внутривенного введения наркотического препарата с концентрацией марганца, превышающей таковую в крови в 10000 раз [3]. Необходимо отметить, что 90% марганца в крови находится
в эритроцитах (в т. ч. в связанном с гемоглобином состоянии) и лишь 10% — в плазме.
Аспартатаминотрансфераза — это фермент, катализирующий перенос альфа-аминогруппы (трансаминирование)
аспарагиновой или глутаминовой кислоты соответствующей кетокислоте. Аспартатаминотрансфераза экспрессируется в
клетках печени, сердца, скелетных мышц, почек и мозга, а также в эритроцитах [4]. По активности данного фермента судят
о целостности соответствующих клеток.
По результатам недавнего исследования активность печеночных ферментов (в т. ч. аспартатаминотрансферазы) в
крови у рабочих, подверженных воздействию высоких концентраций марганца в воздухе, достоверно превышает таковую в
группе сравнения. Однако различия не столь велики: 29,96±16,68 Ед/л у рабочих вредных производств и 26,39±8,07 Ед/л в
контрольной выборке [2]. Интересно отметить, что нормальный уровень активности этого фермента для мужчин — 20–40
Ед/л; для женщин — 15–31 Ед/л. Рост активности аспартатаминотрансферазы может быть связан не только с увеличением
ее концентрации в крови за счет цитолиза гепатоцитов, но и за счет возможной активации фермента ионами марганца (II). С
другой стороны, ионы марганца (II) могут угнетать активность аспартатаминотрансферазы и тем самым «скрывать» увеличение ее концентрации в крови.
Цель работы — оценка влияния ионов марганца (II) на активность аспартатаминотрансферазы сыворотки крови человека в эксперименте in vitro и описание сайта связывания ионов марганца (II) с данным ферментом при помощи оригинального компьютерного алгоритма.
Материалы и методы. Материалом для исследования служила сыворотка крови 16 практически здоровых людей.
Средний уровень активности аспартатаминотрансферазы в данной выборке составил 25,88±3,67 Ед/л. Однако разброс значений был довольно широким: от 16,72 до 41,15 Ед/л. По этой причине значения активности аспартатаминотрансферазы в
каждой пробе (при определенной концентрации ионов марганца) делились на активность в контроле (без добавления раствора, содержащего ионы марганца) для данной сыворотки. Так, для каждой сыворотки были получены значения относительной
активности фермента при восьми концентрациях ионов марганца (II): от 10-3 до 10-10 моль/л.
Активность аспартатаминотрансферазы определяли кинетическим методом с помощью набора фирмы «Векторбест» (РФ) на спектрофотометре SOLAR PV1251C (РБ). Метод основан на двух ферментативных реакциях: аспартатаминотрансфераза катализирует образование оксалоацетата из аспартата, малатдегидрогеназа катализирует образование малата из оксалацетата. В последней реакции расходуется НАДН. Скорость окисления НАДН прямо пропорциональна активности аспартатаминотрансферазы в пробе.
Поскольку на связывание ионов марганца (II) белками могут влиять анионы [5], в экспериментах были использованы две соли: MnCl2•4H2O и MnSO4•5H2O. В одних экспериментах к сыворотке крови добавляли хлорид марганца (II), в других — сульфат марганца (II).
В термостатируемую кювету помещали 1 мл раствора соли или деионизованной воды (контроль) и 200 мкл исследуемого материала, тщательно перемешивали и инкубировали при 37ºС в течение 1 ч. Затем прибавляли прогретый заранее до
температуры определения рабочий реагент в количестве 2 мл, тщательно перемешивали. Инкубировали 1 мин при температуре 37ºС (время инкубации отсчитывается с момента прибавления рабочего реагента), измеряли оптическую плотность раствора по отношению к деионизованной воде при длине волны 340 нм. Точно через 1 и 2 мин повторяли измерения и рассчитывали среднее изменение оптической плотности за 1 мин (∆А/мин). Каталитическую активность аспартатаминотрансферазы (в Е/л) в исследуемой пробе определяют по формуле 1:
Е/л = (∆А/мин) × F.
(1)
Величина F равна 1768 согласно инструкции к набору реагентов для определения активности аспартатаминотрансферазы кинетическим методом при длине волны λ = 340 нм, длине оптического пути 1 см, температуре 37ºС, объеме исследуемого образца 100 мкл и объеме рабочего реагента 1 мл.
В связи с увеличением объема образца и добавлением раствора соли, значение коэффициента F было пересчитано и
составило 2572.
Согласно тесту Харке–Бера, полученные данные подчиняются нормальному распределению. Это позволило сравнить средние значения относительных активностей аспартатаминотрансферазы при добавлении различных концентраций
каждой из двух солей со значением активности при физиологической концентрации (10-7 моль/л) с помощью попарного
t-теста. Достоверный рост активности фермента при концентрации ионов марганца 10-5 моль/л наблюдался как в эксперименте с хлоридом, так и с сульфатом (p = 0,012 и p = 0,040 соответственно). При более высоких концентрациях солей наблюдался дальнейший рост активности фермента в обеих выборках. Это позволило объединить две выборки в одну и применить
для ее анализа t-тест для выборок с неравным отклонением, рассчитать значения ошибок для каждой концентрации соли.
Материалом для in silico экспериментов послужила 3D структура аспартатаминотрансферазы (3II0) из Protein Data
Bank (www.pdb.org). Поиск сайтов связывания ионов марганца на этой 3D структуре был осуществлен с помощью оригинального компьютерного алгоритма «VVTAK Mn(II)» (www.chemres.bsmu.by).
Алгоритм «VVTAK Mn(II)» основан на четырех вероятностных шкалах. Первая шкала представляет собой набор вероятностей распределения элементов вторичной структуры вокруг аминокислот, непосредственно координирующих ион
марганца, отнесенных к суммам вероятностей их распределения вокруг остатков, связывающих и не связывающих эти ионы.
222
Фактически уровень вероятности выше 0,5 по данной шкале означает, что по особенностям вторичной структуры в положениях от –5 до +5 данный остаток может связывать ион марганца. Конкретные особенности вторичной структуры вокруг связывателей интересующих нас ионов заключаются в наличии бета-тяжа по направлению к N-концу от данного аминокислотного остатка и неструктурированной области — по направлению к C-концу [5]. Вторая шкала основана на вероятностях распределения вокруг связывателей марганца (II) аминокислотных остатков. Третья шкала базируется на вероятности встречаемости специфических комбинаций из гидрофобных и гидрофильных остатков (32 возможных пентапептидов) вокруг аминокислот, координирующих ионы марганца. Что касается четвертой шкалы, то она основана на попарных комбинациях аминокислот вокруг связывателя иона марганца в рамках: «–1 — +1»; «–2 — +2»; «–3 — +1»; «–1 — +3»; «–2 — +1»; «–1 — +2».
Алгоритм работает только с теми аминокислотами, которые связывают ионы марганца наиболее часто: с гистидином, аспарагиновой и глутаминовой кислотами. Для каждого из этих трех остатков используются собственные вероятностные шкалы. Аминокислотный остаток считается «активным связывателем» иона марганца (II) в двух случаях: если по всем четырем
шкалам вероятность превышает 0,5; если по первой шкале вероятность выше 0,58, а по четвертой — выше 0,35. «Пассивные связыватели» предсказываются следующим образом: атомы кислорода карбоксильных групп аспарагиновой и глутаминовой кислот, а также имидазольный атом азота гистидина должны быть на расстоянии до 6 ангстрем от аналогичных атомов «активных связывателей».
Для докинга аспартата к аспартатаминотрансферазе, очищенной от прочих лигандов (включая кофермент — витамин
В6), использовался Docking Server (www.dockingserver.com) [6-7].
Результаты и их обсуждение. Для работы аспартатаминотрансферазы необходим кофермент — витамин B6 (пиридоксин) [4]. Как видно на рисунке 1, эта молекула занимает свое место глубоко в полости фермента. Витамин В6 связывают 12 аминокислотных остатков (Gly108, Gly109, Thr110, Trp141, Asn195, Asp223, Ala225, Tyr226, Ser256, Ser258, Lys259 и
Arg267). Над молекулой пиридоксина располагается сайт связывания субстрата данного фермента (аспарагиновой кислоты).
С молекулой аспарагиновой кислоты взаимодействуют: Gly39, Trp141, Asn195, Tyr226, Lys259, Phe361, Arg387.
С помощью оригинального алгоритма «VVTAK Mn(II)» была предсказана координационная сфера, которая может
связывать ион марганца (II). В эту сферу включены три остатка гистидина (His144, His190 и His194), а также остаток аспарагиновой кислоты Asp223. Единственным «активным связывателем» среди них является His190. Надо отметить, что этот
остаток предсказывается как связыватель по всем четырем вероятностным шкалам алгоритма. Как видно на рисунке 1, атомы, способные к образованию координационных связей с ионами марганца, расположены в том же самом «кармане» аспартатаминотрансферазы, что и кофермент с субстратом. Однако ни витамин В6, ни аспартат с остатками, способными к связыванию ионов марганца, непосредственно не взаимодействуют. Можно сказать, что координационная сфера для ионов марганца (II) находится в наиболее глубокой части полости фермента.
Рисунок 1 — Взаимное расположение субстрата (аспартата) и кофермента (витамина B6) в активном центре
аспартатаминотрансферазы человека (3II0); выделены атомы, способные к координации ионов марганца (II)
согласно результатам работы алгоритма «VVTAK Mn(II)»
Результаты докинга молекулы аспартата к очищенной от лигандов трехмерной структуре аспартатаминотрансферазы
показали, что наиболее вероятный сайт связывания субстрата находится на дне полости фермента (рисунок 2).
Эти результаты говорят о том, что в отсутствии кофермента субстрат занимает неправильное положение и не подвергается трансаминированию. Нельзя не отметить, что в таком положении с аспарагиновой кислотой должны взаимодействовать те же остатки, с которыми связываются ионы марганца (II). Остатки гистидина (His190 и His144) участвуют в полярных взаимодействиях, а остаток аспарагиновой кислоты (Asp223) образует водородную связь с субстратом фермента. Помимо них в состав неправильного сайта связывания входят Trp141, Asn195, Tyr226 и Lys259, взаимодействующие как с витамином В6, так и с аспартатом в случае формирования правильного комплекса, а также Ala225, входящий в состав остатков, связывающих исключительно пиридоксин. Свободная энергия связывания аспартата без участия кофермента составляет 5,36 ккал/моль.
223
Рисунок 2 — Расположение субстрата (аспартата) в активном центре
аспартатаминотрансферазы человека (3II0) без кофермента (витамина B6)
по результатам алгоритма «Docking Server»
Судя по результатам докинга ионов марганца (II) и аспартата к аспартатаминотрансферазе, возможно возникновение конкуренции между этими двумя лигандами за сайт связывания на дне полости фермента. Ионы марганца (II), скоординированные четырьмя аминокислотными остатками (His144, His190, His194 и Asp223), могут препятствовать занятию неправильного положения молекулой аспарагиновой кислоты. Эти ионы теоретически могут препятствовать проникновению
аспартата внутрь каталитического кармана фермента в случае отсутствия в нем кофермента. Таким образом, можно предположить, что повышение концентрации ионов марганца (II) должно увеличивать каталитическую активность аспартатаминотрансферазы.
Наше предположение было подтверждено в эксперименте in vitro (рисунок 3). При сравнении с активностью аспартатаминотрансферазы при физиологической концентрации марганца (II), равной 10-7 моль/л, был выявлен достоверный рост
ее активности при концентрации 10-5 моль/л (на 5,6±3,8%, p = 0,027), 10-4 моль/л (на 7,4±3,9%, p = 0,005) и 10-3 моль/л (на
25,2±4,1%, p<0,001).
Концентрация ионов марганца (II), равная 10-5 моль/л, в крови при хронической интоксикации данным элементом
практически не достижима [1–3]. Тем не менее непосредственно после внутривенного введения наркотиков с концентрацией марганца около 10-2 моль/л или вскоре после вдыхания пыли с высоким содержанием марганца активность аспартатаминотрансферазы может возрастать в клетках печени (где на некоторое время аккумулируется данный элемент). Печеночный
фермент может координировать ионы марганца (II) в глубине своего кармана, находясь в цитоплазме гепатоцита (до цитолиза). Если гепатоциты подвергаются цитолизу, аспартатаминотрансфераза со связанным марганцем может попадать в кровь.
Действительно такой комплекс распадется только после диссоциации кофермента с ферментом. Таким образом, активность
аспартатаминотрансферазы может быть несколько повышена в сыворотке крови в результате связывания ионов марганца
(II), а не только за счет усиления цитолиза гепатоцитов.
Рисунок 3 — Активность аспартатаминотрансферазы сыворотки крови человека
в присутствии различных концентраций ионов марганца (II) относительно контроля
224
Заключение. Активность аспартатаминотрансферазы человека повышается в in vitro эксперименте с сывороткой
крови при концентрации ионов марганца (II) 10-5 моль/л на 5,6±3,8% от таковой при физиологической концентрации (10-7
моль/л), на 7,4±3,9% — при концентрации 10-4 моль/л и на 25,2±4,1% — при концентрации 10-3 моль/л.
Рост активности фермента объясняется наличием координационной сферы для связывания иона марганца (II) на дне
кармана, в котором находится активный центр. Скоординированный ион марганца (II) препятствует неправильному положению субстрата за счет конкуренции за остатки His190, His144 и Asp223.
Рост активности аспартатаминотрансферазы у рабочих вредных производств можно объяснить не только усилением
цитолиза гепатоцитов, но и тем, что на дне кармана данного фермента могут координироваться ионы марганца (II) в процессе выведения этого металла гепатоцитами. При этом условии активность аспартатаминотрансферазы может быть повышена
и при физиологической скорости цитолиза клеток печени.
Литература
1.Moderate hyperhomocysteinemia and neuropsychiatric symptoms in manganese-induced Parkinsonism / S. Bleich [et al.] // Germ. J.
Psych. — 2000. — Vol. 3. — P. 14–20.
2.Interaction of occupational manganese exposure and alcohol drinking aggravates the increase of liver enzyme concentrations from a crosssectional study in China / Q. Deng [et al.] // Environmental Health. — 2013. — Vol. 12. — P. 1–30.
3.Manganese-induced Parkinsonism due to ephedrone abuse / K. Sikk // Parkinson’s Disease. — 2011. — Vol. 2011. — P. 1–8.
4.The amino acid sequence of cytosolic aspartate aminotransferase from human liver / J.M. Doyle [et al.] // Biochem. J. — 1990. — Vol.
270. — P. 651–657.
5.Khrustaleva, T.A. Secondary structure preferences of Mn2+ binding sites in bacterial proteins / T.A. Khrustaleva // Advances in
Bioinformatics. — 2014. — Vol. 1. — P. 1–14.
6.Bikadi, Z. Application of the PM6 semi-empirical method to modeling proteins enhances docking accuracy of AutoDock / Z. Bikadi, E.
Hazai // J. Cheminform. — 2009. — Vol. 1. — P. 1–15.
7.A semiempirical free energy force field with charge-based desolvation
/ R. Huey [et al.] // J. Computat. Chem. — 2007. — Vol. 28. — P. 1145–1152.
MANGANESE (II) IONS INCREASE CATALYTIC ACTIVITY OF ASPARTATE AMINOTRANSFERASE FROM
HUMAN SERUM
Khrustaleva T.A.1, Khrustalev V.V.2, Barkovsky E.V.2
2
1Institute of Physiology of NAS of Belarus, Minsk;
Belarusian State Medical University, Minsk, Belarus
The activity of aspartate aminotransferase from human sera has been measured by kinetic method in the presence of eight
different concentrations of manganese (II) ions. An increased manganese (II) ions concentration (10-5 mol/L and higher) significantly
activated the enzyme. The binding site for manganese ion was mapped by «VVTAK Mn(II)» algorithm at the bottom of pocket
containing active center. That site was overlapped by the wrong binding site for aspartate mapped by Docking Server. So, manganese
(II) ion coordination should promote correct orientation of the substrate in the active center.
Keywords: manganese; aspartate aminotransferase; enzymatic activity; docking.
Поступила 30.05.2014
225