006441 Область техники, к которой относится изобретение

006441
Область техники, к которой относится изобретение
Данное изобретение относится к композиции, содержащей пребиотический агент (пребиотический
адъювант), для уменьшения воспалительного процесса посредством улучшения гомеостаза неспецифических параметров иммунной защиты (иммунитета) и субпопуляций лимфоцитов. Оно относится также к
применению готовой формы пребиотика в приготовлении лекарственного средства или пищевой композиции, или кормовой композиции для домашних любимых животных для уменьшения воспалительного
процесса и/или аномальной активации неспецифических параметров иммунитета, таких как фагоциты.
Уровень техники
Хорошо известно, что пребиотические агенты (пребиотики) содержат углеводы и более конкретно
олигосахариды. Кроме того, известно, что они широко использовались в качестве функциональных ингредиентов пищевых продуктов. Они противостоят гидролизу ферментами пищеварительного тракта
человека, могут достигать ободочной кишки в недеградированном виде и обеспечивают углеводное вещество, особенно подходящее для роста бифидобактерий. Олигосахариды могут быть получены из глюкозы, галактозы, ксилозы, мальтозы, сахарозы, лактозы, крахмала, ксилана, гемицеллюлозы, инулина,
камеди или их смесей. Очищенные коммерчески доступные продукты, такие как фруктоолигосахариды,
содержат более приблизительно 95% твердых веществ в форме олигосахаридов.
Фруктоолигосахариды исследовались на людях в основном для функциональных притязаний, относящихся к биодоступности минералов, липидному метаболизму и регуляции свойств пищеварительного
тракта (Roberfroid, M.В. Delzenne, N.M. Annu Rev Nutr 1998; 18:117-143). Мало внимания уделялось их
влиянию на иммунологические функции, хотя из исследований на животных поступают указания на модификацию канцерогенеза и стимуляцию связанной с кишечником лимфоидной ткани (Pierre, F., et al.
Cancer Res 1997; 57:225-228).
Действительно, фруктоолигосахариды с длинной цепью (инулин) и короткой цепью (олигофруктоза) находятся среди углеводов, которые избегают переваривания в верхней части желудочно-кишечного
тракта. Затем они ферментируются в ободочной кишке и селективно стимулируют рост бифидобактерий.
Кишечная флора человека с ее важной метаболической активностью, возможно, связана со многими
связанными со здоровьем функциями, такими как поддержание гомеостаза кишечника, метаболизм ксенобиотиков и стимуляция иммунитета кишечника. На нее влияют заболевание, пищевой рацион, стресс
и, возможно, старение. Толстая кишка содержит до 1012 бактерий/г фекалий с приблизительно 103 различных видов из приблизительно 40-50 родов бактерий. Большинство из них являются облигатными анаэробами, но с большой популяцией факультативных анаэробов. Основными анаэробными видами являются Bacteroides, бифидобактерии, эубактерии, которые составляют до 99% общей флоры фекалий, за
которыми следуют клостридии, молочнокислые бактерии (лактобациллы) и грамположительные кокки,
энтерококки, колиформные бактерии, метаногены (образующие метан бактерии семейства Methanobacteriacae) и в гораздо более низких уровнях сульфатвосстанавливающие бактерии (Hill, M.J. Normal gut
bacterial flora. 1995; 3-17).
Характеристики микрофлоры взрослых присутствуют с двухлетнего возраста. Кишечная микрофлора взрослых является, по-видимому, довольно стабильной, хотя сообщалось о некоторых изменениях
в процессе старения, в основном, о низких уровнях бифидобактерий и Bacteroides (Hopkins, M.J., et al.,
Gut 2001; 48:198205). Кишечная флора может быть подразделена на виды, которые имеют полезные действия, такие как бифидобактерии, или вредные действия, такие как Pseudomonas aeruginosa, виды Proteus,
стафилококки, некоторые клостридии и Veilonellae, и виды, которые являются промежуточными в их
действии, такие как энтерококки, Escherichia coli, Enterococci и Bacteroides. Сообщалось, что бифидобактерий и лактобациллы оказывают полезное влияние на специфические иммунные функции (Schiffrin,
E.J., et al. J. Dairy Sci 1995; 78:491-497).
Обычно сообщается, что с возрастом количество бифидобактерий уменьшается, тогда как число
Clostridium perfringens, Enterococci и Enterobacteriaceae увеличивается (Mitsuoka, Т. Hayakawa, K. Zentralbl Bakteriol [Orig A] 1973; 223:333-342). Чрезмерное развитие микрофлоры встречается часто в пожилом возрасте вследствие высокого преобладания атрофического гастрита и гипохлоргидрии. Чрезмерное
развитие микрофлоры, по-видимому, не имеет клинических симптомов в здоровом пожилом человеке,
оно может иметь некоторое значение в ослабленных пожилых людях в возрасте >75 лет, и ассоциированная с Clostridium difficile диарея является более частой у пожилых людей в случаях экстренной терапии или долгосрочной терапии в связи с лечением антибиотиками и, возможно, пониженной иммунной
реакцией. Старение связано с понижением иммунной функции, и было установлено существование
взаимосвязи между питанием и иммунной функцией (Meydani, S. N. Status of Nutritional Immunology
Studies: J Nutr Immunol 1994; 2:93-97).
Изменения в иммунной функции (ремоделирование продукции цитокинов и нарушение регуляции
иммунных функций) ассоциируются с увеличенной частотой инфекций и смертностью, связанной с инфекцией. Воздействия посредством изменения питания, в основном добавления витаминов и минеральных веществ, могут улучшать иммунную реакцию в ослабленных пожилых людях [Lesourd, В.М., Am J
Clin Nutr 1997; 66:478S-484S 41].
-1-
006441
Данное изобретение относится к обеспечению новой композиции, способной ограничивать нарушение регуляции иммунной функции и более конкретно аномальную активацию неспецифической иммунной реакции, такой как фагоциты и система моноцитарно-макрофагальных клеток, а также сохранять
субпопуляции лимфоцитов при нормальном уровне активации.
Сущность изобретения
Таким образом, в первом аспекте данное изобретение обеспечивает применение композиции, содержащей по меньшей мере один пребиотик, для уменьшения воспалительного процесса и/или аномальной активации неспецифических иммунных параметров.
Например, оно может быть предназначено, в частности, для уменьшения аномальной активации фагоцитов.
Неожиданно было обнаружено, что добавление пребиотика может индуцировать уменьшение воспалительного процесса и, в частности, может индуцировать изменения в неспецифическом иммунитете,
например, уменьшенную фагоцитарную активность, а также уменьшенную экспрессию мРНК интерлейкина-6 в моноцитах периферической крови.
Во втором аспекте данное изобретение обеспечивает по меньшей мере один пребиотик в приготовлении лекарственного средства, или пищевой композиции, или кормовой композиции для домашних любимых животных для уменьшения воспалительного процесса в млекопитающем.
В третьем аспекте данное изобретение обеспечивает применение по меньшей мере одного пребиотика в приготовлении лекарственного средства, или пищевой композиции, или кормовой композиции для
домашних любимых животных для уменьшения аномальной активации неспецифических иммунных параметров в млекопитающих.
В четвертом аспекте данное изобретение обеспечивает способ уменьшения воспалительного процесса в млекопитающем, предусматривающий введение эффективного количества пребиотика или композиции, содержащей по меньшей мере один пребиотик.
В пятом аспекте данное изобретение обеспечивает способ уменьшения аномальной активации неспецифических параметров в млекопитающем, предусматривающий введение эффективного количества
пребиотика или композиции, содержащей по меньшей мере один пребиотик.
Преимуществом данного изобретения является то, что оно обеспечивает уменьшение воспалительного процесса, в частности, уменьшение экспрессии мРНК интерлейкина-6 в мононуклеарных клетках
периферической крови.
Другим преимуществом данного изобретения является то, что оно обеспечивает уменьшение фагоцитарной активности гранулоцитов и моноцитов, в частности, в ослабленном пациенте с хронической
воспалительной ситуацией.
Еще одним преимуществом данного изобретения является то, что оно может быть использовано для
улучшения воспалительной ситуации в млекопитающем и, следовательно, уменьшения риска развития
пагубных инфекций простым потреблением пищевой композиции данного изобретения. Должно быть
понятно, что внутривенное или подкожное введение лекарственного средства требует опыта и в сравнении с пероральным введением оно не является безопасным, удобным или приемлемым для пациента. В
свете этих беспокойств данное изобретение обеспечивает явное преимущество пищевого и/или терапевтического продукта, который может вводиться перорально.
Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения
Согласно первому аспекту, эта композиция предпочтительно содержит по меньшей мере один пребиотик или смесь пребиотиков.
Предпочтительно пребиотический агент (пребиотик) содержит олигосахарид, полученный из глюкозы, галактозы, ксилозы, мальтозы, сахарозы, лактозы, крахмала, ксилана, гемицеллюлозы, инулина,
камеди (например, аравийской камеди) или их смеси. Более конкретно, этот олигосахарид содержит
фруктоолигосахарид (ФОС). Наиболее предпочтительно этот пребиотик содержит смесь фруктоолигосахарида и инулина. Предпочтительно эта смесь содержит PREBIO1® или смесь коммерчески доступных
RAFTILOSE® и RAFTILINE®.
Предпочтительно пребиотик содержит приблизительно 50-95% ФОС. Более предпочтительно он
содержит приблизительно 60-80% ФОС.
Предпочтительно пребиотик содержит приблизительно 10-50% инулина. Более предпочтительно он
содержит приблизительно 20-40% инулина. Наиболее предпочтительно он содержит приблизительно
30% инулина.
Пребиотик может содержать смесь фруктоолигосахаридов и инулина в количествах по весу 70%
фруктоолигосахаридов и 30% инулина.
Предпочтительно композиция содержит пробиотик наряду с пребиотиком. Пробиотиком может
быть, например, Bifidobacterium bifidum или Streptococcus thermophilus. Предпочтительно Bifidobacterium
bifidum является Bifidobacterium lactis.
В одном варианте эта композиция может быть полным и сбалансированным в питательном отношении пищевым продуктом или кормом для домашних любимых животных. Она может быть также, напри-2-
006441
мер, диетической добавкой. Она предпочтительно предназначена для пожилых людей, или старых домашних любимых животных, или критически больных пациентов с хроническим воспалением.
Таким образом, может быть приготовлен полноценный в пищевом отношении корм для домашних
животных. Полный в питательном отношении корм для домашних животных может быть в любой подходящей форме; например в высушенной форме, полувлажной форме или влажной форме; он может
быть охлажденным или стабильным при хранении кормовым продуктом для домашних животных. Эти
кормовые продукты для домашних животных могут быть приготовлены общепринятым образом. Предпочтительно пребиотик обеспечивают в форме растительного материала, который содержит пребиотик.
Подходящие растительные материалы включают в себя спаржу, артишоки, сорта лука, пшеницу, уасоn
или цикорий или остатки этих растительных материалов. Альтернативно, пребиотик может быть обеспечен в виде экстракта инулина или продуктов его гидролиза, обычно известных как фруктоолигосахариды, галактоолигосахариды, ксилоолигосахариды или олигопроизводные крахмала. Особенно подходящими являются экстракты из цикория. Максимальный уровень пребиотика в корме для домашних животных равен предпочтительно приблизительно 20 вес.%, особенно предпочтительно приблизительно 10
вес.%. Например, пребиотик может содержать приблизительно 0,1-5 вес.% корма для домашних животных. Для кормов домашних животных, которые применяют в качестве пребиотика цикорий, цикорий
может быть включен в таком количестве, что он составляет приблизительно 0,5-10 вес.% кормовой смеси; более предпочтительно приблизительно 1-5 вес.%.
Кроме пребиотика данного изобретения эти корма для домашних животных могут включать в себя
один или несколько из источника углеводов, источника белка и источника липидов.
Может быть использован любой подходящий источник углеводов. Предпочтительно источник углеводов обеспечивают в форме зерен, муки и крахмалов. Например, источником углеводов может быть
рис, ячмень, сорго, просо, овес, кукурузная мука или пшеничная мука. Могут также использоваться простые сахара, такие как сахароза, глюкоза и кукурузные сиропы. Количество углевода, обеспечиваемого
этим источником углевода, может быть выбрано по желанию. Например, корм для домашних животных
может содержать до приблизительно 60 вес.% углевода.
Подходящие источники белка могут быть выбраны из любого подходящего источника животного
или растительного белка, например мышечного или скелетного мяса, мясной кормовой или костной кормовой муки, кормовой муки из домашней птицы, рыбной муки, белков молока, клейковины кукурузы,
клейковины пшеницы, соевой муки, концентратов соевого белка, изолятов соевого белка, яичных белков,
молочной сыворотки, казеина клейковины и т.п. Для стареющих животных предпочтительно, чтобы источник белка содержал высокое количество животного белка. Количество белка, обеспечиваемого источником белка, может быть выбрано по желанию. Например, корм для домашних животных может содержать приблизительно 12-70 вес.% белка в расчете на сухой вес.
Корм для домашних животных может содержать источник жира. Может быть использован любой
подходящий источник жира, как животные жиры, так и растительные жиры. Предпочтительно источником жира является источник животного жира, такой как твердый животный жир (сало). Могут быть также использованы растительные масла, такие как кукурузное масло, подсолнечное масло, сафлоровое
масло, рапсовое масло, соевое масло, оливковое масло и другие масла, богатые мононенасыщенными и
полиненасыщенными жирными кислотами. Кроме незаменимых жирных кислот (линолевой и альфалинолевой кислоты) источник жира может включать в себя жирные кислоты с длинной цепью. Подходящие жирные кислоты с длинной цепью включают в себя гамма-линолевую кислоту, стеариновую кислоту, арахидоновую кислоту, эйкозапентановую кислоту и докозагексановую кислоту. Подходящим
источником эйкозапентановой кислоты и докозагексановой кислоты является рыбий жир. Подходящими
источниками гамма-линолевой кислоты являются борачниковое масло, масло семян черной смородины и
масло ослинника. Подходящими источниками альфа-линолевой кислоты являются рапсовое масло, соевое масло, льняное масло и ореховое масло. Подходящими источниками линолевой кислоты являются
сафлоровые масла, подсолнечные масла, кукурузные масла и соевые масла. Подходящими источниками
мононенасыщенных жирных кислот являются оливковое масло, рапсовое (канола) масло, подсолнечное
и сафлоровое масло с высоким содержанием олеиновой кислоты, арахисовое масло, рисовое масло. Количество жира, обеспечиваемое источником жира, может быть выбрано по желанию. Например, корм
для домашних животных может содержать приблизительно 5-40 вес.% жира в расчете на сухой вес.
Предпочтительно корм для домашних животных имеет относительно пониженное количество жира.
Корм для домашних животных может содержать другие активные агенты, такие как жирные кислоты с длинной цепью. Подходящие жирные кислоты с длинной цепью включают в себя альфа-линолевую
кислоту, гамма-линолевую кислоту, линолевую кислоту, эйкозапентановую кислоту и докозагексановую
кислоту. Рыбий жир является подходящим источником эйкозапентановой кислоты и докозапентановой
кислоты. Подходящими источниками гамма-линолевой кислоты являются борачниковое масло, масло
семян черной смородины и масло ослинника. Подходящими источниками линолевой кислоты являются
сафлоровые масла, подсолнечные масла, кукурузные масла и соевые масла.
Выбор источников углеводов, белка и липидов не является критическим и будет осуществляться на
основе потребностей питания животного, вкусовых качеств и с учетом типа приготовляемого продукта.
-3-
006441
Кроме того, если желательно, в корм для домашних животных могут быть также включены различные
другие ингредиенты, например, сахар, соль, специи, пряности, витамины, минеральные вещества, ароматизаторы (вкусовые вещества), камеди и пробиотические микроорганизмы.
Может быть также добавлен пробиотический микроорганизм. Он может быть выбран из одного или
нескольких микроорганизмов, пригодных для потребления животными, который способен улучшать баланс микробов в кишечнике. Примеры подходящих пробиотических микроорганизмов включают в себя
дрожжи, такие как Saccharomyces, Debaromyces, Candida, Pichia и Torulopsis, плесневые грибы, такие как
Aspergillus, Rhizopus, Mucor и Penicillium и Torulopsis, и бактерии, такие как роды Bifidobacterium, Bacteroides, Clostridium, Fusobacterium, Melissococcus, Propionibacterium, Streptococcus, Enterococcus, Lactococcus, Staphylococcus, Peptostrepococcus, Bacillus, Pediococcus, Micrococcus, Leuconostoc, Weissella, Aerococcus, Oenococcus и Lactobacillus. Пробиотические микроорганизмы могут быть в порошкообразной,
высушенной форме, в частности, в форме спор микроорганизмов, которые образуют споры. Далее, если
желательно, пробиотический микроорганизм может быть инкапсулирован для дополнительного увеличения возможности выживания, например, в сахарный матрикс, жировой матрикс или полисахаридный
матрикс. При применении пробиотического микроорганизма корм для домашних животных, предпочтительно, содержит приблизительно 104-1010 клеток пробиотического микроорганизма на грамм корма для
домашних животных, более предпочтительно приблизительно 106-108 клеток пробиотического микроорганизма на грамм. Корм для домашних животных содержит приблизительно 0,5-20 вес.% смеси пробиотического микроорганизма, предпочтительно приблизительно 1-6 вес.%, например, приблизительно 3-6
вес.%.
Для стареющих домашних животных корм для домашних животных, предпочтительно, содержит
пропорционально меньше жира, чем корм для более молодых домашних животных. Далее, источники
крахмала могут включать в себя овес, рис, ячмень, пшеницу и кукурузу.
Для высушенных кормов для домашних животных подходящим способом является экструзия с
пропариванием, хотя могут быть использованы выпечка и другие подходящие процессы. При экструзии
с пропариванием высушенный корм для домашних животных получают обычно в форме муки грубого
помола. При применении пребиотика этот пребиотик может быть смешан с другими ингредиентами высушенного корма для домашних животных перед обработкой. Подходящий процесс описан в европейской патентной заявке № 0850569. При применении пробиотического микроорганизма этот организм
предпочтительно наносят в виде покрытия или помещают в виде наполнителя в сухой корм для домашних животных. Подходящий способ описан в европейской патентной заявке № 0862863.
Для влажных кормов для домашних животных процессы, описанные в патентах США 4781939 и
5132137, могут быть использованы для получения имитированных мясных продуктов. Могут быть использованы также другие процедуры для получения продуктов типа больших кусков, например варка в
паровой печи. Альтернативно, продукты типа запеченного мясного хлеба могут быть получены эмульгированием подходящего мясного материала для получения мясной эмульсии, добавлением подходящего
гелеобразующего агента и нагреванием этой мясной эмульсии перед заполнением ими консервных банок
или других контейнеров.
В другом варианте готовят пищевую композицию для потребления человеком. Эта композиция может быть питательной полной смесью, молочным продуктом, охлажденным напитком или стабильным
при хранении напитком, диетической добавкой, заменителем муки и пищевой плиткой или кондитерским
изделием.
Кроме пребиотика в соответствии с данным изобретением питательная смесь может содержать источник белка. В качестве источника белка используют предпочтительно диетические белки. Диетические
белки могут быть любым подходящим диетическим белком, например животными белками (такими как
молочные белки, белки мяса и яичные белки), растительными белками (такими как соевый белок, белок
пшеницы, белок риса и белок гороха), смесями свободных аминокислот или их комбинациями. Молочные белки, такие как казеин, сывороточные белки и соевые белки, являются особенно предпочтительными. Эта композиция может также содержать источник углеводов и источник жира.
Если питательная смесь включает в себя источник жира, этот источник жира предпочтительно
обеспечивает приблизительно 5-55% энергии питательной смеси, например, приблизительно 20-50%
энергии. Липиды, представляющие источник жиров, могут быть подходящим жиром или смесями жиров.
Особенно подходящими являются растительные жиры, например соевое масло, пальмовое масло, кокосовое масло, сафлоровое масло, подсолнечное масло, кукурузное масло, масло канолы (рапса), лецитины
и т.п. Могут быть также добавлены, если желательно, животные жиры, такие как молочный жир.
К питательной смеси может быть добавлен источник углеводов. Он, предпочтительно, обеспечивает приблизительно 40-80% энергии питательной композиции. Могут быть использованы любые подходящие углеводы, например сахароза, лактоза, глюкоза, фруктоза, твердые вещества кукурузного сиропа и
мальтодекстрины и их смеси. Если желательно, может быть также добавлена диетическая клетчатка. При
использовании диетической клетчатки она содержит до приблизительно 5% энергии питательной смеси.
Диетическая клетчатка может быть любого подходящего происхождения, в том числе, например, происходящей из сои, гороха, овса, пектина, гуаровой камеди, аравийской камеди и фруктоолигосахаридов. В
-4-
006441
питательную смесь могут быть включены подходящие витамины и минеральные вещества в количестве,
удовлетворяющем соответствующим основным требованиям.
Если желательно, в питательную смесь могут быть включены один или несколько эмульгаторов
пищевой категории, например, эфиры диацетилвинной кислоты моно- и диглицеридов, лецитин и монои диглицериды. Могут быть также включены подходящие соли и стабилизаторы.
Питательная смесь является, предпочтительно, вводимой энтерально, например, в форме порошка,
таблетки, капсулы, жидкого концентрата, твердого продукта или готового для питья напитка. Если желательно получить порошкообразную питательную смесь, гомогенизированную смесь переносят в подходящий сушильный аппарат, такой как распылительная сушилка или сублимационная сушилка, и превращают в порошок.
В другом варианте питательная композиция содержит злаки на основе молока вместе с готовой
формой пребиотика. Предпочтительно злаки на основе молока являются зерновыми смесями для детей,
которые функционируют в качестве носителя готовой формы пребиотика.
В другом варианте обычный пищевой продукт может быть обогащен по меньшей мере одним пребиотиком в соответствии с данным изобретением. Например, используют ферментированное молоко,
йогурт, свежий сыр, молоко, обработанное сычужным ферментом, кондитерское изделие, например
сладкий или подслащенный напиток, кондитерскую плитку, зерновой завтрак в виде хлопьев или брикетированных концентратов, напитки, сухое молоко, продукты на основе сои, немолочные ферментированные продукты или питательные добавки для диетотерапии. После обогащения количество добавленной композиции равно предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно 0,01 вес.%.
Следующие примеры приводятся только для иллюстрации и никаким образом не должны рассматриваться как ограничивающие предмет данной заявки. Вес приведен в процентах или частях, если нет
других указаний. Примерам предшествует краткое описание фигур.
Фиг. 1 - влияние потребления в домашних условиях (дом престарелых) 8 г фруктоолигосахаридов с
короткой цепью (ФОС) на число жизнеспособных бифидобактерий в пробах свежих фекалий пожилых
людей. Временными точками были точки до (2), во время (3) и после (4) периода трех недель приема
ФОС. (А) Величины индивидуумов. (В) Диаграммы в виде блоков. Блоки указывают 25-й и 75-й процентили, сплошные линии внутри блока показывают величины медиан и Т-образные - 5-й и 95-й процентили; точка, нарисованная сплошной линией, указывает выпадающую величину.
Фиг. 2 - влияние фруктоолигосахаридов (ФОС) на бифидобактерий у взрослых и пожилых людей.
Зависимость ответной реакции от дозы: ссылка 24 (Bouhnik Y. et al. J. Nutr 1999; 129:113) дозы от 2,5 до
20 г ФОС/день - 18-47-летние взрослые; ссылка 25 (Menne E. et al. J Nutr 2000; 130: 1197) доза 8 г
ФОС/день - 20-50-летние взрослые; ссылка 26 (Gibson G.R. J Nutr 1999; 129:1438S) доза 15 г ФОС/день молодые взрослые; ссылка 27 (Kruse H.P. et al. Brit J Nutr 1999; 82:375) доза инулина до 34 г/день - 26-53летние взрослые; ссылка 28 (Kleessen В. et al. Am J Clin Nutr 1997; 65:1397) доза 20 г ФОС/день - пожилые субъекты, имеющие констипацию (запор), в возрасте 68-89 лет; данное изобретение: доза 8 г
ФОС/день - домашние условия (дом престарелых) - престарелые в возрасте 77-91 лет.
Фиг. 3 - различия в экспрессии мРНК IL-6 в мононуклеарных клетках периферической крови
(РВМС) пожилых людей, которым добавляли в пищу ФОС. Экспрессию мРНК IL-6 в РВМС измеряли с
использованием полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). Оценку количественных изменений выполняли сканированием интенсивности полос с использованием программы NIHimage и рассчитывали в виде отношения плотностей мРНК IL-6 к мРНК β-актина в процентах. Временными точками были точки до (2), во время (3) и после (4) периода трех недель приема ФОС. (А) Репрезентативное изображение индивидуальных изменений из окрашенных бромидом этидия гелей. (В) Количественная оценка экспрессии мРНК IL-6: изменения в мРНК IL-6 во время приема ФОС являются значимо отличающимися от таковых перед приемом ФОС (р=0,018).
Пример 1. Действие олигосахарида на флору фекалий и неспецифическую иммунную систему в
пожилых людях.
Материалы и способы.
План исследования.
Исследование было типа «претест/посттест» 19 пожилых пациентов дома престарелых (см. схему
исследования).
-5-
006441
Измерение веса тела и взятие проб стула, крови и мочи проводили во временной точке 1 (претест
или в начале периода промывания), 2 (перед приемом пребиотика), 3 (во время приема пребиотика) и 4
(после периода последующего наблюдения).
Во время всего исследования прием кисло-молочных продуктов ограничивали и были ограничены
пищевые продукты, содержащие фруктоолигосахариды (лук, лук-порей, корни цикория).
Субъекты.
Девятнадцать пожилых субъектов в доме престарелых были отобраны для этого исследования.
Субъекты, удовлетворяющие одному или более из следующих критериев, исключались из участия в данном исследовании:
лечение антибиотиками в последний месяц,
хроническое нарушение кишечника,
конкретный диетический режим (например, вегетарианский),
диагноз желудочно-кишечного рака,
наличие метеоризма.
Было получено одобрение из ведомственного комитета по этике. Письменное информированное согласие было получено от всех субъектов. Это исследование проводили в местном доме для престарелых,
Le Mont-Pelerin, Switzerland.
Алиментарный статус.
В начале исследования алиментарный статус (состояние питания) оценивали с использованием минитеста для оценки алиментарного статуса (Mini Nutritional Assesment, MNA), который включает в себя
следующие пункты: антропометрические измерения (окружность икры и плеча - сегмента верхней конечности от туловища до локтя, роста, веса и потери веса), общие оценки (стиль жизни, лекарственные
средства, подвижность), диетические анкеты (вопросники - количество приемов пищи, приема жидкости
и пищевых продуктов, автономия питания) и субъективные оценки (собственное мнение в отношении
здоровья и питания) [Guigos, Y., et al. Nutr Rev 1996; 54:S59-S65]. MNA классифицировал алиментарный
статус (состояние питания) с использованием 30-точечной шкалы: MNA ≥24 = хорошо питавшиеся, MNA
17⋅23,5 = при риске недостаточного (неправильного) питания и MNA <17 = неправильно питавшиеся
(недоедающие).
Пребиотическая добавка.
8 г/день фруктоолигосахаридов (ФОС) с короткой цепью вводили следующим образом: дважды в
день 4 г порошка ФОС (Actilight 950P, Beghin-Meiji industries, Neuilly-sur-Seine, France) медицинские сестры включали в блюдо во время еды. Для оценки соблюдения пациентом режима и схемы лечения ежедневное потребление добавки регистрировалось медсестрами в таблице ежедневных записей.
Исследования микробов.
Определяли число эндогенных популяций лактобацилл, Bacteroides, Enterobacteriaceae, энтерококков, бифидобактерий и Clostridium perfringens.
Пробы стула брали в день 0, 21, 42 и 63 от каждого субъекта. Пробы стула немедленно (в пределах
30 мин) помещали в анаэробный сосуд и хранили при 4°С до анализа (максимум 6 ч). Стократные серийные разведения выполняли в предварительно восстановленном растворе Рингера, содержащем 0,5% цистеина, от -2 до -8. Чашки Петри с различными средами инокулировали и инкубировали в течение 48 ч
при 37°С в анаэробной атмосфере с использованием Anaerocult A (Merck, Darmstadt, Germany), за исключением энтерококков и Enterobacteriaceae, инкубируемых в течение 24 ч при 37°С в аэробной атмосфере.
Бактерии детектировали на селективной или полуселективной среде следующим образом: Enterobacteriaceae на среде Drigalski (Sanofi Diagnostics Pasteur, France), бифидобактерии на среде Eugon Tomato (Wadsworth Anaerobic Bacteriology Manual, V. Suter, D. Citron and S. Finegold Third edition), лактобациллы в
MRS (Difco, M.I., USA) с антибиотиками (фосфомицин (79,5 мг/л) + сульфаметоксазол (0,93 мг/л) + триметоприм (5 мг/л), Clostridium perfringens нa NN-агаре (Lowbury and Lilli, 1995), Bacteroides на среде
Schaedler Neo-Vanco (BioMerieux, Marcy-l'Etoile, France) и энтерококки на азидном агаре (Difco).
После инкубирования колонии считали и дополнительно идентифицировали, если это было необходимо. Штаммы лактобацилл и бифидобактерий идентифицировали микроскопией и биохимически с использованием API gallery system (BioMerieux), API 50 CHL gallery для лактобацилл и API ID 32A gallery
для бифидобактерий соответственно. Числа бактерий выражали в виде log10 колониеобразующих единиц
(КОЕ) на грамм свежей фекальной пробы с пределом детектирования при 3,30 КОЕ/г.
рН фекалий.
рН фекалий измеряла медсестра непосредственно после выделения в трех различных точках в необработанных фекалиях при помощи микроэлектрода (Orion). Среднюю величину рН рассчитывали для
каждой временной точки.
Взятие проб крови.
Пробы крови брали натощак перед началом этого исследования (4 мл) и в день 0, 21, 42 и 63 (23 мл)
у каждого субъекта. Кровь брали утром (до 10 ч утра) после ночного голодания. Пробы брали в
vacutainer-пробирки. Собирали 13 мл в гепаринизированную пробирку и 10 мл давали свертываться при
-6-
006441
комнатной температуре в течение 30-60 мин. Пробы сыворотки хранили в замороженном виде при -70°С
до анализа. Гепаринизированную кровь использовали для определения функциональных иммунных параметров (фагоцитоза, см. ниже) и гематологии.
Иммунологический анализ.
Популяции мононуклеарных клеток периферической крови и их фагоцитарную активность анализировали в свежих пробах гепаринизированной крови с использованием Simulset и Pagotest (Becton
Dickinson, Basel, Switzerland).
Анализ экспрессии мРНК интерлейкина-6 при помощи ПЦР: анализ экспрессии мРНК в мононуклеарных клетках периферической крови оценивали с использованием ПЦР в соответствии со способом,
описанным Delneste, Y., et al. (Nutr Rev 1998; 56:S93-S98). Праймерными последовательностями были
следующие последовательности:
Биохимические измерения.
Концентрации сывороточного альбумина, транстиретина (преальбумина), С-реактивного белка и
α1-кислота-гликопротеина анализировали иммуно-нефелометрией с использованием нефелометра Behring (способы и реагенты из Behring, Marburg, Germany). Концентрации фолата и витамина В12 (кобаламина) анализировали радиоиммуноанализом (Dual Count, Diagnostic Product Corporation, Los Angeles,
California, USA).
Статистический анализ.
t-критерий для одной пробы или критерий Уилкоксона с рангами знаков рассчитывали на компьютере на средних различиях для оценки статистической значимости при 0,05% уровне для основной гипотезы: имеется ли действие пребиотиков на различные измеряемые параметры. Дополнительно t-критерий
для одной пробы рассчитывали на компьютере на средних различиях для оценки статистической значимости при 0,025% (коррекция на потерю степени свободы) для двух вопросов, связанных со схемой данного исследования, которая включала в себя претест- и посттест-периоды: имеется ли влияние прекращения приема кисло-молочного продукта (=период промывания) на различные измеряемые параметры;
имеется ли влияние прекращения приема пребиотиков (=последующее наблюдение) на различные измеряемые параметры? Весь статистический анализ выполняли с использованием статистического программного обеспечения NCSS 6.0.22.
Результаты.
Субъекты.
19 субъектов, 4 мужчин и 15 женщин, имели средний возраст 85 ± 6,0 лет (77-97 лет). Женщины
имели значительно меньший вес, чем мужчины. Характеристики субъектов при начале исследования
приведены в табл. 1.
-7-
006441
Таблица 1
Характеристики субъектов
Только один субъект имел неправильное питание, 7 женщин при риске неправильного питания
имели диапазон верхней оценки 21,4-23, и средний балл MNA был в диапазоне хорошо питавшихся:
24±3,0 точек.
Сывороточный альбумин (нормальный диапазон 35-55 г/л) и транстиретин (преальбумин, нормальный диапазон 0,16-0,40) были в нижнем нормальном диапазоне, тогда как белки острой фазы, α1кислота-гликопротеин (нормальный диапазон 0,5-1,3) и С-реактивный белок (нормальные величины <10
мг/л и отклоняющиеся от нормы величины для пожилых >20 мг/л) не показали присутствия воспалительного процесса, за исключением 2 мужчин (повышенные уровни С-реактивного белка) и 2 женщин
(низкие уровни альбумина при нормальном транстиретине и находящемся на грани С-реактивном белке).
Эти результаты предполагают группу пожилых людей, которые являются все еще хорошо питающимися,
но довольно ослабленными.
Бактериологические анализы и рН фекалий.
Количества бифидобактерий увеличивались в среднем на 2,8±0,57 log10 КОЕ во время 3 недель добавления ФОС (р<0,001), но количество Bacteroides также увеличивалось (р<0,032) (см. табл. 2а и 2b и
фиг. 1).
-8-
006441
Таблица 2а
Действие введения ФОС на флору и рН фекалий
Прекращение потребления кисло-молочных продуктов и/или прием фруктоолигосахаридов (ФОС)
не оказывали значимого влияния на количество бактерий для Enterobacteriaceae, энтерококков и лактобацилл. Хотя для бифидобактерий этот эффект, по-видимому, является специфической реакцией на прием
внутрь ФОС, он приводил, в основном, к увеличенному количеству бифидобактерий для субъектов, обнаруживающих log10 КОЕ менее 7, перед началом введения ФОС. Прекращение добавления ФОС значимо снижало количество бифидобактерий на 1,1±0,39 log10 КОЕ, но не до стартового уровня (табл. 2а и 2b
и фиг. 1). На фиг. 2 изменения в количестве бифидобактерий, полученные в этом исследовании, сравниваются с предыдущими исследованиями, и сравнение показывает, что пожилые люди являются, по
меньшей мере, такими же чувствительными к действию ФОС, как и более молодые взрослые люди. Ни
прекращение потребления кисло-молочных продуктов, ни введение ФОС не изменяло рН фекалий (табл.
2а).
Неспецифический иммунитет.
Прием внутрь ФОС приводил к значимо увеличенному проценту Т-лимфоцитов периферической
крови, а также субпопуляций лимфоцитов, CD4+, CD8+ Т-клеток (табл. 3а и 3b) Прием внутрь ФОС не
влиял на общее количество лейкоцитов, активированных Т-лимфоцитов и природных клеток-киллеров
(NK) (табл. 3а и 3b).
Таблица 3а
Периферические иммунологические параметры: субпопуляции лимфоцитов
-9-
006441
Таблица 3b-c-d
Изменения в периферических иммунологических параметрах (приведенные данные представляют
среднее различие ± стандартная ошибка среднего (SEM) после каждого периода 3 недель)
1
ФОС = 4 г/дважды в день,
Действие прекращения приема кисло-молочных продуктов = среднее изменение между выборкой протеста и
началом добавления пребиотика (3-недельный период промывания),
3
Действие добавления ФОС (4 г/дважды в день) = среднее изменение между началом добавления пребиотика и
концом добавления пребиотика (3-недельный период приема пребиотика),
4
Действие прекращения добавления ФОС = среднее изменение между концом добавления пребиотика и концом исследования (3-недельный период последующего наблюдения),
5
t-критерий для одной пробы на средних различиях.
2
Фагоцитарная активность гранулоцитов и моноцитов значимо уменьшались в результате приема
внутрь ФОС: фагоцитарная активность, выраженная в виде медианы интенсивности флуоресценции, изменялась для гранулоцитов от 130±10 до 52±2 (р<0,001) и для моноцитов от 75±5 до 26±2 (р<0,001).
Это возможное уменьшение в воспалительном процессе предполагается также значимым уменьшением уровней мРНК интерлейкина-6 в мононуклеарных клетках периферической крови после приема
внутрь ФОС (фиг. 3).
Статус витамина В12 и фолата.
Добавление ФОС не влияло ни на уровни витамина B12, ни на уровни фолата в сыворотке: уровни
витамина B12 в сыворотке были 271±143 нг/л перед добавлением ФОС и 289±160 нг/л во время добавления ФОС. Однако три субъекта имели дефицит витамина В12. Два субъекта возвращались к нормальному
статусу во время этого исследования, тогда как третий субъект оставался с дефицитом витамина B12 в
течение всего исследования. Уровни фолата в сыворотке были 5,9±2,0 мкг/л перед добавлением и 5,7±1,9
мкг/л во время добавления.
Результаты авторов изобретения подтверждают бифидогенные эффекты фруктоолигосахаридов у
пожилых субъектов с увеличением 2 log в количестве бифидобактерий, так как ослабленные пожилые
субъекты в данном исследовании обнаруживали низкие количества в начале исследования. Уменьшение
- 10 -
006441
в воспалительном процессе предполагается за счет снижения экспрессии мРНК IL-6 в моноцитах периферической крови.
Фактически данное изобретение подтверждает положительное действие добавления ФОС на бифидобактерий, наблюдаемое у взрослых и пожилых субъектов (фиг. 2), указывая на то, что пожилые люди
отвечают на прием внутрь пребиотика (ФОС) увеличением бифидобактерий, подобно более молодым
взрослым субъектам или даже в большей степени, если количества бифидобактерий являются низкими.
Хотя из различных исследований видно, что зависимость доза-ответ присутствует, отдельные исследования указывают на то, что выше порога 4-5 г/день получают максимальный ответ и что увеличение количества бифидобактерий, по-видимому, является более зависимым от их исходного количества (фиг. 1 и
2). Часто добавленный к диете ФОС увеличивал уровни бифидобактерий за счет потенциально вредных
бактерий, в основном, Clostridium и Bacteroides. Но авторы наблюдали значимое увеличение Bacteroides
на протяжении этого исследования (табл. 2а и 2b).
Авторы изобретения наблюдали важное уменьшение фагоцитарной активности. Это уменьшение
фагоцитарной активности могло быть отражением уменьшенной активации макрофагов, связанной с
возможным уменьшением патогенных бактерий, и, следовательно, можно было бы предположить
уменьшение воспаления вследствие более низкой нагрузки эндотоксинов. Однако неожиданно это возможное уменьшение в воспалительном процессе предполагается связанным с уменьшением уровней
мРНК интерлейкина-6 в мононуклеарных клетках периферической крови (фиг. 3).
Пример 2. Пищевая добавка.
Пищевую добавку готовят смешиванием или перемешиванием фруктоолигосахарида с инулином в
соотношениях по весу приблизительно 70% фруктоолигосахарида к приблизительно 30% инулина. Полученная смесь пребиотика может быть добавлена к любому подходящему носителю или смешана с любым подходящим носителем, например, кисло-молочным продуктом, йогуртом, свежим сыром, обработанным сычужным ферментом молоком, кондитерской плиткой, зерновыми хлопьями или брикетированными концентратами для завтрака, напитком, сухим молоком, продуктом на основе сои, немолочным
ферментированным продуктом или питательной добавкой для диетотерапии.
Пример 3. Сухой корм для домашних животных.
Кормовую смесь готовят до приблизительно 58 вес.% кукурузы, приблизительно 5,5 вес.% клейковины кукурузы, приблизительно 22 вес.% муки из куриного мяса, 2,5% высушенного цикория, 1% карнитина, солей, витаминов и минеральных веществ в остальной части.
Кормовую смесь подают в устройство для предварительного кондиционирования и увлажняют. Затем увлажненный кормовой продукт подают в пропаривающий экструдер и желируют. Желированный
матрикс, остающийся в экструдере, подают под давлением через мундштук и экструдируют. Экструдат
нарезают на кусочки, пригодные для кормления собак, сушат при приблизительно 110°С в течение приблизительно 20 мин и охлаждают с образованием шариков.
Этот сухой корм для собак предназначен, в частности, для уменьшения воспалительного процесса
и/или аномальной активации неспецифических иммунных параметров, таких как фагоциты.
Пример 4. Влажный, помещенный в консервные банки корм для домашних животных.
Готовят смесь из 56% тушки курицы, легких свиньи и печени свиньи (измельченных), 13% рыбы,
16% пшеничной муки, 2% плазмы, 10,8% воды, 2,2% красителя, 1% полуочищенного каппа-карагеннана,
неорганических солей и 9% масла, богатого мононенасыщенными жирными кислотами (оливкового масла), и 3% цикория. Эту смесь эмульгируют при 12°С и экструдируют в форме пудинга, который затем
варят при температуре 90°С, охлаждают до 30°С и нарезают на большие куски.
30% этих кусков (имеющих содержание воды 58%) включают в основу, приготовленную из 23%
куриной тушки, 1% гуаровой камеди, 1% красителя и вкусового агента и 75% воды. Затем жестяные банки заполняют этим продуктом и стерилизуют при 127°С в течение 60 мин.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Применение композиции, содержащей по меньшей мере один пребиотический агент и необязательно пробиотик, для уменьшения воспалительного процесса и/или аномальной активации неспецифической иммунной реакции в организме млекопитающего.
2. Применение п.1, согласно которому пребиотический агент содержит олигосахарид, полученный
из глюкозы, галактозы, ксилозы, мальтозы, сахарозы, лактозы, крахмала, ксилана, гемицеллюлозы, инулина, камеди или их смеси.
3. Применение по любому из пп.1-2, согласно которому пребиотический агент содержит фруктоолигосахарид.
4. Применение по любому из пп.1-3, согласно которому пребиотический агент содержит смесь
фруктоолигосахарида и инулина.
5. Применение по любому из пп.1-4, согласно которому пребиотический агент содержит приблизительно 60-80 вес.% фруктоолигосахарида и приблизительно 20-40 вес.% инулина.
- 11 -
006441
6. Применение по любому из пп.1-5, согласно которому пробиотик выбран из группы, состоящей из
Bifidobacterium bifidum и Streptococcus thermophilus.
7. Применение по любому из пп.1-6, согласно которому млекопитающее является стареющим домашним животным.
8. Применение по любому из пп.1-6, согласно которому млекопитающее является пожилым человеком или критическим больным с хроническим воспалением.
9. Применение по меньшей мере одного пребиотического агента для приготовления композиции
для уменьшения воспалительного процесса и/или анормальной активации неспецифической иммунной
реакции в организме млекопитающего.
10. Применение по п.9, согласно которому пребиотический агент содержит олигосахарид, полученный из глюкозы, галактозы, ксилозы, мальтозы, сахарозы, лактозы, крахмала, ксилана, гемицеллюлозы,
инулина, камеди или их смеси.
11. Применение по любому из пп.9-10, согласно которому пребиотический агент содержит фруктоолигосахарид или смесь фруктоолигосахарида и инулина.
12. Применение по любому из пп.9-11, согласно которому пребиотический агент содержит приблизительно 60-80 вес.% фруктоолигосахарида и приблизительно 20-40 вес.% инулина.
13. Применение по любому из пп.9-12, согласно которому композиция дополнительно содержит
пребиотик, в частности, Bifidobacterium bifidum и Streptococcus thermophilus.
14. Применение по любому из пп.9-13, согласно которому млекопитающее является стареющим
домашним животным.
15. Применение по любому из пп.9-13, согласно которому млекопитающее является пожилым человеком или критически больным с хроническим воспалением.
16. Способ уменьшения воспалительного процесса и/или аномальной активации неспецифической
иммунной реакции в организме млекопитающего, предусматривающий введение млекопитающему эффективного количества пребиотического агента или композиции, содержащей по меньшей мере один
пребиотический агент и необязательно пробиотик.
17. Способ по п.16, согласно которому пребиотический агент содержит олигосахарид, полученный
из глюкозы, галактозы, ксилозы, мальтозы, сахарозы, лактозы, крахмала, ксилана, гемицеллюлозы, инулина, камеди или их смеси.
18. Способ по любому из пп.16-17, согласно которому пребиотический агент содержит фруктоолигосахарид.
19. Способ по любому из пп.16-18, согласно которому пребиотический агент содержит смесь фруктоолигосахарида и инулина.
20. Способ по любому из пп.16-19, согласно которому пребиотический агент содержит приблизительно 60-80 вес.% фруктоолигосахарида и приблизительно 20-40 вес.% инулина.
21. Способ по любому из пп.16-20, предусматривающий введение эффективного количества композиции, содержащей пробиотик.
- 12 -
006441
Фиг. 1
Фиг. 2
- 13 -
006441
Фиг. 3
Евразийская патентная организация, ЕАПВ
Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2/6
- 14 -