1 003458 2 Настоящее изобретение относится к спо-

1
Настоящее изобретение относится к способам и композициям, предназначенным для
усиления эффективности оксазолидиноновых
антибактериальных агентов против грамотрицательных микроорганизмов в результате
применения производных аргинина.
Оксазолидиноновые
антибактериальные
агенты представляют собой новый синтетический класс противомикробных препаратов, обладающих мощной активностью против ряда
патогенов человека и животных, включая такие
грамположительные аэробные бактерии, как
устойчивые к размножению стафилококки и
стрептококки, такие анаэробные микроорганизмы, как бактероиды и разновидности клостридий, а также такие кислотоустойчивые микроорганизмы как Mycobacterium tuberculosis и Mycobacterium avium. Было установлено, что особенно эффективными веществами являются оксазолидиноновые соединения, отвечающие структурам I-V
Однако иногда некоторые оксазолидиноны
в используемых концентрациях обладают плохой активностью против таких аэробных грамотрицательных микроорагнизмов, как E.coli,
Haemophilus influenzae, Moraxella catarrhalis,
Pseudomonas aeruginosa или Klebsiella pneumoniae. Так, например, применение таких оксазолидиноновых антибактериальных агентов самих
по себе ограничено инфекционными состояниями, связанными с грамположительными бактериями. В соответствии с этим, в цели настоящего изобретения входит разработка способа усиления ингибирующего спектра действия оксазо-
003458
2
лидинонов. В настоящем изобретении было обнаружено, что при совместном применении оксазолидиноновых антибактериальных агентов с
производным аргинина наблюдается выраженный синергический эффект против грамотрицательных микроорганизмов. Количество
оксазолидинонового антибактериального агента, обеспечивающее полностью эффективное
действие против аэробных грамотрицательных
микроорганизмов, значительно меньше ожидаемого количества в случае применения оксазолидинона без производного аргинина.
В международной заявке WO 96/33285
раскрываются способы скрининга ингибиторов
микробиальных откачивающих насосов, включая те, что экспортируют антибиотики. Такие
способы скрининга основаны на повышении
внутриклеточной концентрации такого соединения, как антибиотик или краситель, в том
случае, когда бактериальные клетки контактируют с ингибитором откачивающего насоса.
Кроме того, настоящее изобретение предусматривает фармацевтические композиции, содержащие ингибиторы откачивающего насоса,
включая определенные производные аргинина,
а также способы лечения микробных инфекций
и усиления антимикробной активности определенных противомикробных агентов.
В реферате материалов 36-го ICAAC,
представленного Pharmacia и Upjohn, Inc. указано, что мутация АсrАВ антибиотического откачивающего насоса в E.coli способствует приобретению восприимчивости к оксазолидиноновым антибактериальным агентам.
Настоящее изобретение представляет собой способ и композицию для лечения инфекционных
заболеваний, вызванных
грамотрицательными микроорганизмами у млекопитающих, причем такой способ заключается в
применении эффективного количества оксазолидинонового антибактериального агента и
производного аргинина формулы А
в которой
R1 представляет собой
a) арил, необязательно замещенный C1-4алкилом, C1-4-алкокси, C1-4-алкилтио, галогеном,
или -NH2,
b) -(СН2)i-арил, в котором арильный фрагмент замещен C1-4-алкилом, C1-4-алкокси, C1-4алкилтио, галогеном, или -NH2,
c) тиенил, фурил, пиридил, бензофуранил,
или бензотиенил;
Z представляет собой R2 или -CHWR2;
R2 представляет собой а) арил, необязательно замещенный одним или двумя C1-4алкилами, C1-4-алкокси, C1-4-алкилтио, галоге-
3
нами, -NH2, C1-4-алкиламино, C1-4-диалкиламино
или -NHOH,
b) C1-4-алкил, необязательно замещенный
фтором,
c) C1-4-алкокси, C1-4-алкилтио,
d) галоген,
e) тиенил, фуранил или пиридил;
W представляет собой Н, -NН2, C1-4алкиламино, C1-4-диалкиламино, галоген, гидроксил, C1-4-алкокси, алкилтио или азагетероцикл;
арил представляет собой фенил или нафтил;
азагетероцикл представляет собой нморфолинил, н-пиперазинил, н-пирролидинил,
н-имидазолил, н-пирролил, н-пиразолил, нтриазолил или н-тетразолил;
i равно 0, 1 или 2;
и фармацевтически приемлемые соли.
В настоящем изобретении указывается, что
при совместном применении оксазолидиноновых агентов с производным аргинина оксазолидиноны проявляют эффективность против таких
аэробных грамотрицательных микроорганизмов,
как E.coli, Haemophilus influenzae, Moraxella
catarrhalis, Pseudomonas aeruginosa или Klebsiella
pneumoniae, а также таких грам-положительных
аэробных бактерий как полирезистентные стафиллококки и стрептококки, таких анаэробных
микроорганизмов, как бактероиды и разновидности клостриды, и таких кислотоустойчивых
микроорганизмов, как Mycobacterium tuberculosis и Mycobacterium avium. Эффективное количество оксазолидинонового антибактериального
агента, обладающее всей полнотой действенности против аэробных грам-отрицательных микроорганизмов, значительно ниже количества,
которое потребуется, если оксазолидинон применяют без производных аргинина.
В целях настоящего изобретения термин
"C1-4-алкил" относится к алкильной группе, содержащей 1-4 углеродных атома, такой как метил, этил, пропил, бутил и их изомерные формы.
Термин "C1-4-алкокси" относится к такой
алкильной группе, содержащей 1-4 углеродных
атомов, присоединенных к кислородному атому
гидроксильной группы, как метокси, этокси,
пропилокси, бутилокси и их изомерные формы.
Термин "C1-4-алкилтио" относится к алкильной группе, содержащей 1-4 углеродных
атомов, и ее изомерным формам, присоединенным к атому серы.
Термин "C1-4-алкиламино" относится к алкильной группе, содержащей 1-4 углеродных
атомов, присоединенных к аминному фрагменту; например, метиламино, этиламино, нпропиламино, н-бутиламино и их изомерным
формам.
Термин "C1-4-диалкиламино" относится к
двум алкильным группам, содержащим 1-4 углеродных атома, присоединенных к аминному
фрагменту; например, диметиламино, метилэтиламино, диэтиламино, дипропиламино, метил-
003458
4
пропиламино, этилпропиламино, дибутиламино
и их изомерным формам.
Термин "галоген" относится к фтору, хлору, брому или иоду, предпочтительно фтору,
хлору или брому.
Термин "арил" относится к фенилу или
нафтилу;
Термин "азагетероцикл" относится к нморфолинилу, н-пиперазинилу, н-пирролидинилу, н-имидазолилу, н-пирролилу, н-пиразолилу, н-триазолилу или н-тетразолилу;
Термин "фармацевтически приемлемые
соли" относится к солям, полезным для применения соединений настоящего изобретения, и
они включают в себя гидрохлорид, гидробромид, гидроиодид, сульфат, фосфат, ацетат, пропионат, лактат, мезилат, малеат, малат, сукцинат, тартрат, цитрат, 2-гидроксиэтилсульфонат,
фумарат и т.д. Эти соли могут использоваться в
гидратированной форме.
Термин "млекопитающее" относится к человеку или животным, представляющим ветеринарный интерес.
Оксазолидиноновые
антибактериальные
агенты относятся к соединениям формулы В
в которой R1 представляет собой метил, этил,
циклопроприл или дихлорметил; R2 представляет собой водород или фтор;
Термин "Het" представляет собой 6членный
насыщенный
гетероциклический
фрагмент, содержащий 1-2 атома, выбранных из
группы, состоящей из атомов серы, азота и кислорода. Необязательно, азотный атом гетероцикла может быть замещен такой подходящей
группой, как гидроксиацетил, а атом серы может присутствовать в окисленном состоянии.
Кроме этого, соединение формулы V охватывает все возможные стереоизомеры и геометрические формы. Предпочтительно, оксазолидиноновые антибактериальные агенты представляют
собой соединения, отвечающие формулам I-V,
как указано ниже.
В литературе имеются многочисленные
ссылки, описывающие большое число производных оксазолидинона и способы их получения. Указанные выше оксазолидиноновые антибактериальные агенты могут быть получены по
методикам, описанным в патентах США №№
5652238 и 5688792, международных патентных
заявках №№ WO 93/23384, WO 97/09328 и WO
98/54161, на которые ссылаются в настоящем
описании.
Производные аргинина формулы А представляют собой известные и легкодоступные
вещества или могут быть получены методами
синтетической химии, известными специалистам в данной области. Предпочтительно, про-
5
изводные аргинина формулы А представляют
собой L-фениаланил-L-аргинил-β-нафтиламид.
Фармацевтические композиции настоящего изобретения содержат оксазолидиноновый
антибактериальный агент и производное аргинина формулы А совместно с одним или более
твердыми или жидкими фармацевтически приемлемыми носителями и необязательными фармацевтически приемлемыми адьювантами или
эксципиентами. Композиции в твердой форме
включают порошки, таблетки, диспергируемые
гранулы, капсулы и свечи. Твердый носитель
может представлять собой, по крайней мере,
одно вещество, способное выполнять функции
разбавителя, отдушки, солюбилизатора, смазочного агента, суспендирующего агента, связующего, агента для дезинтеграции таблеток и инкапсулирующего агента. Инертные твердые носители включают в себя карбонат магния, стеарат магния, тальк, сахар, лактозу, пектин, декстрин, крахмал, желатину, целлюлозные материалы, низкоплавкий воск, масло какао и т.п. Композиции в жидкой форме включают в себя растворы, суспензии и эмульсии. Так, например,
могут быть предусмотрены растворы соединений настоящего изобретения, растворенных в
воде, в системах вода-пропиленгликоль и водаполиэтиленгликоль, необязательно содержащих
традиционные окрашивающие агенты, отдушки,
стабилизаторы и загустители.
Фармацевтические композиции готовят с
использованием традиционной техники. Предпочтительно, такие композиции выполняются в
форме единичной дозы, содержащей эффективное количество оксазолидинонового антибактериального агента, отвечающего формуле В.
Количество оксазолидинонового антибактериального агента в фармацевтической композиции и в единичной дозированной форме может меняться и регулироваться в широких пределах, в зависимости от конкретного метода
применения, мощности конкретного соединения, состояния, подлежащего лечению, и желаемой концентрации лекарственного агента.
Обычно количество оксазолидинонового антибактериального агента составляет величину в
интервале 0,5-90 вес.% от общего веса композиции.
При терапевтическом применении для лечения бактериального инфицирования людей и
других животных, у которых диагностировано
инфицирование аэробными грамотрицательными микроорганизмами, оксазолидиноновый
антибактериальный агент и производные аргинина или их фармацевтические композиции согласно изобретению будут применяться перорально, парентерально, трансдермально и/или
локально при такой дозировке, которая обеспечивает получение и поддержание концентрации,
обеспечивающей количество или уровень содержания в крови активного компонента в организме животного, подвергаемого лечению, ко-
003458
6
торый является антибактериально эффективным. Предпочтительной формой применения
является пероральное применение. Обычно такое антибактериально эффективное количество
дозы активного оксазолидинонового антибактериального агента составляет величину в интервале 0,1-100 мг/кг нормального веса тела, более
предпочтительно 3,0-50 мг/кг веса тела/день.
Должно быть понятно, что указанные дозы могут изменяться в зависимости от требований
пациента, тяжести бактериального инфицирования, подлежащего лечению, и конкретной природы используемых соединений. Также должно
быть ясно, что применяемая начальная доза может быть выше верхнего из указанных пределов
для быстрого достижения желаемого уровня
содержания в крови или начальная доза может
быть меньше оптимальной и, кроме этого, дневная доза может прогрессивно повышаться в ходе лечения в зависимости от конкретной ситуации. В случае необходимости дневная доза может делиться на многократные дозировки для
применения, например 2-4 раза в день.
Используемое количество производного
аргинина формулы А может изменяться с повышением активности конкретного производного аргинина и его способности к поглощению
организмом, подлежащим лечению. Следует
применять достаточные количества производных аргинина с тем, чтобы аэробные грамотрицательные микроорганизмы приобретали
восприимчивость к фармацевтически применимому уровню оксазолидинонового антибактериального агента в организме млекопитающего,
подвергаемого лечению. Достаточное количество конкретного производного аргинина может
быть просто определено путем тестирования на
минимальную ингибиторную концентрацию
(МИК) оксазолидинонового антибактериального
агента и сравнения значения МИК самого антибактериального агента со значением МИК этого
же антибактериального агента, используемого в
комбинации с производным аргинина. Обычно
молярное отношение количества производного
аргинина к количеству применяемого оксазолидинонового антибактериального агента может
составлять величину в интервале 0,01-10, предпочтительно 0,1-1,0. Поэтому дневная дозировка производного аргинина для повышения эффективности оксазолидиноновых антибактериальных агентов против аэробных грамотрицательных микроорганизмов у млекопитающих может иметь величину в интервале
0,01-100 мг/кг нормального веса тела, предпочтительно 0,3-50 мг/кг веса тела. Производные
аргинина могут применяться за 1-4 ч перед
применением оксазолидинонового антибактериального агента или применяться одновременно с
оксазолидиноновыми антибактериальными агентами.
Биологическое тестирование
7
Потенцирование активности оксазолидиноновых антибактериальных агентов против
аэробных грамотрицательных микроорганизмов,
при совместном применении с производным
аргинина формулы А, предусматривает два вида
анализа:
a) традиционный метод шахматной доски и
b) метод центрифугирования в силиконовом масле для количественного определения
радиоактивно меченого оксазолидинонового
антибактериального агента в E.coli.
I. Определение индекса фракционной ингибиторной концентрации (FIC) с использованием метода шахматной доски.
Метод "шахматной доски" представляет
собой метод in vitro, наиболее часто используемый для оценки антимикробных комбинаций
(Lorian, V., изд. Antibiotics in laboratory medicine, третье издание, стр.432, Williams & Wilkins, Baltimore, Maryland 21202, США). В методе микроразбавлений шахматный рисунок формируется в лунках титровального микропланшета, содержащих множественные 2-кратные
разведения двух испытуемых агентов. Тестируемые разведения охватывают интервал концентраций, которые выше и ниже показателя
минимальной ингибиторной концентрации
(МИК) для каждого испытуемого агента для
каждого испытуемого микроорганизма. Реакцию в каждом из испытуемых отношений (наличие или отсутствие роста) используют для
расчета индекса фракционной ингибиторной
концентрации (FIC). Взаимодействие в системе
лекарство-лекарство считается аддитивным в
том случае, когда результат совместного действия двух таких лекарств равен сумме результатов для каждого из двух лекарственных средств
при их раздельном применении (индекс FIC =
1,0). Взаимодействие рассматривается как антагонистическое в том случае, когда результат
действия двух таких лекарств значительно ниже
аддитивной реакции (индекс FIC >1,0). Взаимодействие считается синергическим, когда результат действия двух таких лекарств при их
совместном применении значительно превышает аддитивную реакцию (индекс FIC < 0,50).
II. Количественное определение меченого
радиоактивным изотопом оксазолидинонового
антибактериального агента формулы I. Накопление в E.coli. Последующая предобработка
бактериальных клеток производным аргинина
формулы А.
Измерение меченого радиоактивным изотопом оксазолидинонового антибактериального
агента формулы I, накопленного в E.coli, осуществляли согласно методике, описанной Thanassi
D.G., G.S.B. Suh, H. Nikaido, J.Bacteriology,
1995, стр.177, (4): 998-1007. Вкратце, такая методика состоит в выращивании клеток до среднего размера (ОD530 0,5-0,7) в системе LB/0,2%
глюкозы при 37°С, сборе урожая центрифугиро-
003458
8
ванием, двойной промывке и ресуспендировании до значения OD530 8,0 в 50 мМ растворе
фосфата калия с рН 7,0, 1 мМ MgSCU и 0,2%
глюкозы. Аликвоты клеточной суспензии объемом 1,0 мл предварительно инкубировали в течение 10 мин при 37°С перед добавлением производного аргинина. В качестве положительного контроля использовали карбонилцианид мхлорфенилгидразона (СССР). После добавления
производного аргинина, L-фенилаланил-L-аргинил-β-нафтиламида, клетки инкубировали в течение 30 мин перед добавлением радиоактивно
меченного оксазолидинонового антибактериального агента формулы I до конечной концентрации 25 мМ. Затем клетки инкубировали еще
в течение 15 мин. 50 мл аликвоты удаляли из
системы и наносили слоями на подушку с 300
мл силиконового масла (70% жидкого силиконового масла № 550 и 30% жидкого силиконового масла № 510, Dow Corning Corp. Midland,
MI). Пробирки центрифугировали со скоростью
12000 об/мин в течение 3 мин при 22°С, после
чего замораживали погружением в жидкий азот.
Кончики каждой пробирки, содержащей клеточный осадок после центрифугирования, отрезали и помещали в сцинтилляционные ампулы.
После оттаивания клеточный осадок суспендировали в 200 мл дистиллированной воды и добавляли 4 мл сцинтилляционной жидкости. Образцы тщательно перемешивали и производили
подсчет на сцинтилляционном счетчике. Для
коррекции неспецифического налипания меченого лекарственного средства на поверхность
клеток проводили контрольный эксперимент с
использованием клеток, инкубированных с добавлением только наполнителя и радиоактивно
меченного оксазолидинонового антибактериального агента формулы I.
III. Результаты.
Оксазолидиноновый антибактериальный
агент формулы I сам по себе демонстрирует
очень низкую антибактериальную активность,
требующую использования концентрации 256
мг/мл для ингибирования E.coli. При отдельном
использовании L-фенилаланил-L-аргинил-β-нафтиламида также демонстрируется очень низкая
антибактериальная активность, о чем свидетельствует отсутствие ингибирования роста
вплоть до концентрации порядка 256 мг/мл. Однако при объединении двух таких агентов методом "шахматной доски" проявляется очевидное
доказательство потенцирования активности оксазолидинонового антибактериального агента
формулы I в результате применения Lфенилаланил-L-аргинил-β-нафтиламида.
Так,
например, в присутствии 16 мг/мл Lфенилаланил-L-аргинил-β-нафтиламида оксазолидиноновый антибактериальный агент формулы I ингибирует бактериальный рост при применении в концентрации 16 мг/мл. Расчет индекса FIC дал значение 0,23, что является оче-
9
видным доказательством синергического взаимодействия.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ лечения инфекционных заболеваний млекопитающих, вызванных грамотрицательными микроорганизмами, включающий в себя введение эффективного количества
оксазолидинонового антибактериального агента
и производного аргинина формулы А
в которой R1 представляет собой
a) арил, необязательно замещенный C1-4алкилом, C1-4-алкокси, C1-4-алкилтио, галогеном
или -NH2,
b) -(СН2)i-арил, где арил замещен C1-4алкилом, C1-4-алкокси, C1-4-алкилтио, галогеном
или -NH2, или
c) тиенил, фурил, пиридил, бензофуранил
или бензотиенил;
Z представляет собой R2 или -CHWR2;
R2 представляет собой
a) арил, необязательно замещенный одним
или двумя радикалами из C1-4-алкила, C1-4алкокси, C1-4-алкилтио, галогена, -NH2, C1-4алкиламино, C1-4-диалкиламино или -NHOH,
b) C1-4-алкил, необязательно замещенный
фтором,
c) C1-4-алкокси,
d) C1-4-алкилтио,
e) галоген или
f) тиенил, фуранил или пиридил;
W представляет собой Н, -NH2, C1-4алкиламино, C1-4-диалкиламино, галоген, гидроксил, C1-4-алкокси, C1-4-алкилтио или азагетероцикл;
арил представляет собой фенил или нафтил;
азагетероцикл представляет собой нморфолинил, н-пиперазинил, н-пирролидинил,
н-имидазолил, н-пирролил, н-пиразолил, нтриазолил или н-тетразолил;
i равно 0, 1 или 2;
и фармацевтически приемлемых солей,
причем оксазолидиноновый антибактериальный
агент представляет собой соединения структуры
В
где R1 представляет собой метил, этил, циклопропил или дихлорметил;
R2 представляет собой водород или фтор; а
Het представляет собой 6-членный насыщенный
003458
10
гетероциклический фрагмент, содержащий 1-2
атома, выбранных из группы, состоящей из атомов серы, азота и кислорода.
2. Способ по п.1, где оксазолидиноновый
антибактериальный агент представляет собой
соединение, отвечающее структурам I, II, III, IV
или V
3. Способ по п.1, где оксазолидиноновый
антибактериальный агент представляет собой
соединение, имеющее структуру II
4. Способ по п.1, где производное аргинина формулы А представляет собой L-фенилаланил-L-аргинил-β-нафтиламид.
5. Способ по п.1, где оксазолидиноновый
антибактериальный агент и производное аргинина формулы А назначают в соотношении 10
(оксазолидиноновый антибактериальный агент):
0,01 (производное аргинина формулы А).
6. Способ по п.1, где оксазолидиноновый
антибактериальный агент и производное аргинина формулы А назначают в соотношении 1:1.
7. Способ по п.1, где эффективное количество оксазолидинонового антибактериального
агента составляет примерно от 0,1 до 100 мг/кг
веса тела в день.
8. Способ по п.1, где эффективное количество оксазолидинонового антибактериального
агента составляет примерно от 3 до 50 мг/кг
веса тела в день.
11
003458
9. Способ по п.1, где количество производного аргинина формулы А составляет примерно от 0,01 до 100 мг/кг веса тела в день.
10. Способ по п.1, где количество производного аргинина формулы А составляет примерно от 0,3 до 50 мг/кг веса тела в день.
11. Способ по п.1, где оксазолидиноновый
антибактериальный агент и производное аргинина формулы А назначают одновременно.
12. Способ по п.1, где производное аргинина формулы А назначают примерно за 1-4 ч
до приема оксазолидинонового антибактериального агента.
13. Способ по п.1, где эффективное количество оксазолидинонового антибактериального
агента и производное аргинина формулы А назначают перорально, парентерально, трансдермально или локально.
14. Способ по п.1, где грамотрицательные
микроорганизмы представляют собой аэробные
грамотрицательные микроорганизмы.
12
15. Способ по п.14, где аэробные грамотрицательные микроорганизмы представляют
собой E.coli, Haemophilus influenzae, Moraxella
catarrhalis, Pseudomonas aeruginosa или Klebsiella
pneumoniae.
16. Композиция, предназначенная для лечения инфекционных заболеваний млекопитающих, вызванных грамотрицательными микроорганизмами, содержащая оксазолидиноновый антибактериальный агент формулы В, производное аргинина формулы А и фармацевтически приемлемый носитель.
17. Композиция по п.16, где оксазолидиноновый антибактериальный агент представляет
собой соединения, имеющие структуры I, II, III,
IV или V.
18. Композиция по п.16, где производное
аргинина формулы А представляет собой Lфенилаланил-L-аргинил-β-нафтиламид.
Евразийская патентная организация, ЕАПВ
Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2/6