ГЛИКОЗАМИНОГЛИКАНЫ ХРЯЩЕВОЙ ТКАНИ КРЫС ПРИ

УДК 616.72-018.3:615.361.018.5.013.8
Гликозаминогликаны хрящевой ткани крыс
при механической травме: нормализующее
влияние низкомолекулярной фракции
кордовой крови и крови молочных телят
А. К. ГУЛЕВСКИЙ, В. И. ГРИЩЕНКО, Е. Г. ИВАНОВ
Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, Харьков;
e-mail: [email protected]
Исследовали влияние низкомолекулярной (до 5 кДа) фракции кордовой крови (ФКК) по сравнению с применяемым в настоящее время препаратом «Актовегином», полученным из крови молочных
телят, на содержание полисахаридных компонентов матрикса и протеинов соединительной ткани
хряща после механической травмы. Установлено, что внутримышечное введение ФКК крысам существенно стимулирует накопление основных компонентов матрикса: гексозамина, гексуроновых кислот,
гиалуроновой кислоты, хондроитинсульфатов и гепарина, а также компонентов важнейших структурных протеинов в регенерате хряща коленного сустава крыс.
К л ю ч е в ы е с л о в а: хрящ, механическая травма, кордовая кровь коров, препарат «Актовегином», крысы, гликозаминогликаны, протеогликаны, аминокислоты.
В
настоящее время установлено, что скорость репаративной регенерации хрящевой ткани определяется интенсивностью протекающих в ней процессов обмена
веществ [1–3]. Однако при прочих равных условиях, она, прежде всего, зависит от метаболизма полисахаридных элементов матрикса и
соединительнотканных протеинов, формирующих остов хрящевой ткани [3, 4]. В качестве
препаратов, нормализующих содержание этих
компонентов хрящевой ткани, в современной
медицине чаще всего используются хондропротекторы, такие как глюкозамина гидрохлорид,
хондроксид, терафлекс и афлутоп, полученные
из хрящевой ткани [5–7]. На наш взгляд, не
менее перспективными в комплексном лечении травмы хряща являются препараты, полученные из других природных источников, в
частности из фракции кордовой крови (ФКК),
которая обладает огромным биологическим
потенциалом, обусловленным специфическим
набором биомолекул, способных поддерживать
и активировать как клеточный метаболизм,
так и его сбалансированность [8–10]. В этом
аспекте наибольший интерес представляет
изучение активности низкомолекулярной (до
5 кДа) ФКК, выделенной из криогемолизата,
которая, как и широко известные актовегин и
солкосерил, полученные из онтогенетически
близкого источника – крови молочных телят,
может обладать выраженной биологической активностью.
ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2009, т. 81, № 3
Исследование влияния низкомолекулярной ФКК коров и крови молочных телят на
содержание полисахаридных компонентов
матрикса и протеинов соединительной ткани
хряща после механической травмы и было целью настоящего исследования.
Материалы и методы
Выделение низкомолекулярной (до 5 кДа)
ФКК осуществлялось по методу, описанному
в статье [10]. Исследование выполнено на 65
крысах-самцах линии Вистар с массой тела
290–310 г. Контрольными сроками эксперимента были 7-, 14-, 21- и 28-е сутки после
моделирования механического повреждения
хряща коленного сустава животных. Крыс
(n = 65) разделили на 4 группы: 1 – здоровые
животные; 2 – крысы, не получавшие лечения
(контроль); 3–4 – животные, которым в течение 21 сут вводили соответственно актовегин
(1,17 мг/100 г массы тела) или ФКК в дозировке, эквивалентной актовегину.
Механическое повреждение хряща осуществляли наконечником бормашины. Размер отверстия в хряще составлял 4 мм вглубь
и 0,7 мм в диаметре. В пробах крови определяли содержание гликозаминогликановых и
протео­гликановых компонентов: гексозамина
[11], гексуроновых кислот [12], гиалуроновой
кислоты, гепарина и хондроитинсульфатов
(гликозаминогликанов), оксипролина [13] и
тирозина [3]. Данные статистически обраба117
експериментальні роботи
тывали по программе Microsoft excel 2003 с
учетом критерия Манна–Уитни [14]. Все манипуляции с животными выполнены согласно
принципам Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для
экспериментальных и других научных целей
(Страсбург, 1985).
рует накопление хондроитинсульфатов в регенерате хряща во все сроки наблюдения, однако
по сравнению с ФКК уровень их на 14-, 21- и
28-е сутки в среднем оказывается более низким – в 1,7 раза. Что касается накопления гиалуроновой кислоты, то следует отметить, что
актовегин на 21-е сутки значительно лучше
по сравнению с ФКК стимулирует ее накопление в регенерате хряща, однако этот еффект
уменьшается на 28-е сутки. Менее значительным оказывается действие ФКК относительно
гепарина, но и в этом случае его содержание
в течение всего эксперимента в среднем в 1,9
раза выше по сравнению с животными, не получавшими лечения (рис. 1, В). При введении
им актовегина стимуляция накопления гепа0,4 такой
0,25 в регенерате хряща была примерно
рина
*
же, как и после применения ФКК.
0,35
*
*
*
Аналогичные
результаты
получены и
*
0,2
*
накопления
при изучении динамики
0,3протео­
*
гликановых компонентов хряща. Анализируя
данные,
представленные на рис. 2, 0,25
А, можно
0,15
сделать вывод, что у животных, получавших
0,2
*
*
*
инъекции ФКК,
содержание
гексозамина в ре0,1
0,15
генерате
хряща *уже на 7-е сутки эксперимента
*
достоверно не отличается от такого в хряще
0,1
интактных
крыс, а на 28-е сутки количество
0,05
этого компонента в хрящевой ткани0,05
даже достоверно возрастает. В то же время у крыс, не
0
0
получавших
лечения, содержание гексоз­амина
7
14
21
28
7 в
в регенерате хряща было более низким, чем
ɋɭɬɤɢ
хряще здоровых животных. На 7-е и 14-е сут-
Результаты и обсуждение
ɦɝ/%
ɦ ɝ /%
Как известно, интенсивность регенерации
хряща во многом определяется активностью
хондроцитов, образующих компоненты матрикса – гексозамин, гексуроновые кислоты,
гиалуроновую кислоту, гепарин и хондроитинсульфаты, а также активностью фибробластов,
синтезирующих соединительнотканные элементы регенерата хряща [2–4, 15].
Сравнивая динамику накопления в регенерате хряща экспериментальных и контрольных животных гликозаминогликановых компонентов – гепарина, хондроитинсульфатов и
гиалуроновой кислоты, можно сделать вывод,
что под влиянием ФКК происходит существенная нормализация уровня этих соединений
(рис. 1; А и Б). Нормализация количества хондроитинсульфатов и гиалуроновой кислоты
наблюдается уже на 28-е сутки, в то время как
у животных, которым вводили физиологический раствор, оно к этому сроку регенерации
существенно снижается – в 3,5 и в 5,8 раза соот­
ветственно. Как следует из рис. 1, А, введение
крысам актовегина также достоверно стимули-
1
**
*
*
**
*
**
0,35
0,35
0,35
**
*
**
*
**
**
В
*
0,30,3
0,30
**
*
** *
0,25
0,25
0,25
**
*
0,1
0,10
0,1
*
*
*
*
**
*
мг/%
мг/%
0,15
0,15
0,15
**
0,20
0,20,2
**
0,15
0,15
0,15
*
*
**
*
**
*
**
*
0,25
0,25
**
**
**
**
0,2
0,20
**
*
0,15
0,15
0,10
0,1
* *
**
**
77
14
14
* *
*
*
* **
*
0,10,1
0,10
0,05
0,05
0,05
0 00
Б
*
ɦɝ/%
*
ɦɝ/%
ɦɝ/%
ɦ ɝ /%
ɦ ɝ /%
*
0,20
0,2
0,2
0,40,4
0,40
0,05
0,05
0,05
0,05
0,05
0
0 0
7 77
14
14 14
21
21 21
28
28 28
0
7 7
7
ɋɭɬɤɢ
ɋɭɬɤɢ
14 14 21
21 21
14
Сутки
28 28
28
ɋɭɬɤɢ
ɋɭɬɤɢ
21
21
28
28
ɋɭɬɤɢ
ɦɝ/%
ɦɝ/%
Рис. 1. Влияние ФКК и препарата «Актовегина» на содержание гликозаминогликановых компонентов
3
1 1 А, Б, В – содержание в регенерате
2 2 хондроитинсульфатов, гиалуроновой кислоты и
матрикса хряща:
гепарина соответственно. На этом и последующих рисунках: – животные, не получавшие лечения,
0,250,25 ФКК,
– инъекция крысам
–инъекция крысам актовегина,
– здоровые животные. Здесь и на
Ɋɢɫ.1.
рис. 2, 3: * данные достоверны
по
сравнению
с
животными,
не
получавшими
лечения, Р < 0,05
* *
* *
* *
* *
0,2 0,2
*
*
118
* ** *
0,150,15
0,1 0,1
*
*
*
*
* ** *
ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2009, т. 81, № 3
*
*
*
* *
14
2
мг/%
А
0,25
0,25
0,25
*
21
А. К. ГУЛЕВСКИЙ, В. И. ГРИЩЕНКО, Е. Г. ИВАНОВ
0,8
0,8
мг/%
0,7
0,7
*
**
*
**
* *
0,8
* * *
0,7 * ** *
**
*
* ** * *
1,6
*
* * 1,2
0,6
1
0,5
0,5
0,5
0,8
0,4
0,4
0,4
0,3
0,3
0,3
0,2
0,2
0,2
0,1
0,1
0,1
14
21 7
14
21
Сутки
*
*
*
*
**
*
**
**
* *
**
0,8
0,8
0,4
0,4
0,4
0,2
0,2
0,2
ɋɭɬɤɢ
**
1,0
1
0,6
0,6
21
*
**
1,4
1,4
0,6
0
28 14
28
1,6
1,6
1,2 *
1,2
**
*
0
77
*
1,4
0,6
0,6
00
**
ɦɝ/%
0,9
Б
мг/%
ɦɝ/%
ɦɝ/%
0,9
0,9
1
ɦɝ/%
А
1,01
**
*
**
*
*
*
0
0
287
ɋɭɬɤɢ
14
21 7
7
28 14
21
14
21
Сутки
ɋɭɬɤɢ
28
28
ɋɭɬɤɢ
Рис. 2. Влияние ФКК и препарата «Актовегина» на содержание протеогликановых компонентов матрикса хряща: А – гексозамина,
Б – гексуроновых
кислот 2
1
1
2
Ɋɢɫ.2.
Ɋɢɫ.2.
ки регенерации
его количество
меньше, чем в
хрящевой ткани здоровых животных – в 3,1
и 3,3 раз), а на 21-е и 28-е сутки – в 1,8 и 1,7
раза соответственно. Как следует из этого же
рисунка, стимулирующее действие инъекций
ФКК достоверно не отличается от эффекта
актовегина.
Динамика накопления гексуроновых кислот (рис. 2, Б) в регенерате хряща животных,
получавших инъекции ФКК, также значительно лучше, чем у животных, не получавших лечения. На протяжении всего периода
исследования наблюдалось, что содержание
гексуроновых кислот у крыс опытной группы
в 2,5 раза превышает такое в контрольной. Однако следует отметить, что этот показатель на
протяжении всего эксперимента, включая 28-е
сутки после травмы хряща коленного сустава,
даже при лечении ФКК оказывается в 1,2 раза
ниже, чем у здоровых животных. Стимулирующее дей­ствие ФКК в течение исследуемого
периода находится примерно на том же уровне,
что и при введении крысам в эквивалентных
дозировках актовегина.
Для полноценного формирования хрящевой ткани чрезвычайно важным является соотношение концентраций гликозаминогликанов и протеинов, в частности коллагеновых и
неколлагеновых. Этот процесс можно оценить
по содержанию соответственно оксипролина
и тирозина в щелочном гидролизате протеина
[3, 11]. Анализ данных представлен на рис. 3,
А. Эти данные свидетельствуют, что содер-
ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2009, т. 81, № 3
жание оксипролина уже на 7-е сутки достоверно выше, чем в контроле. Положительная
динамика накопления оксипролина в регенерате хряща у травмированных животных по
сравнению со здоровыми наблюдается и в по­
следующие сроки эксперимента. На 28-е сутки
наблюдения содержание оксипролина у крыс,
получавших инъекции ФКК, не отличается от
его уровня в хрящевой ткани здоровых. Введение животным актовегина, в отличие от ФКК,
достоверно не влияет на накопление оксипролина в регенерате хряща во все сроки эксперимента. В последующей серии исследований
нами было изучена динамика накопления
тирозина в регенерате хрящевой ткани, которая в известной мере отражает содержание
неколлагеновых протеинов [1, 3, 12]. Сравнивая накопления тирозина в регенерате хряща
(рис. 3, Б) животных опытной и контрольной
груп, можно прийти к заключению, что во все
сроки наблюдения количество этой аминокислоты в регенерате хряща крыс, получавших
инъекции ФКК, повышается в 2,8 раза. Вместе
с тем анализируя данные, представленные на
этом рисунке, можно утверждать, что даже при
лечении ФКК уровень тирозина в регенерате
хряща на протяжении всего периода наблюдения ниже, чем в хряще нетравмированных
крыс. Следует отметить, что стимулирующий
эффект актовегина по отношению к этой аминокислоте в регенерате хряща также наблюдается на 7-е сутки, а в дальнейшем он находится примерно на том же уровне, что и после
применения ФКК. На 28-е сутки регенерации
119
експериментальні роботи
0,5
0,5
0,5
* *
* *
* *
*
мг/%
0,3
0,3
*
*
*
*
0,3
*
*
3
2
1,5
0,2
0,2
0,2
*
*
2,5
**
*
0,4
0,4
0,4
*
ɦɝ/%
*
3,5
2,0
2
* *
*
7
7
14
14
7
21
21
14
28
28
21
28
*
*
*
*
* *
* **
*
* **
7
14
2114
1,5
1,5
**
**
* *
*
*
0,5
0,5
0,5
0
**
1,0
1
0,1
00
* *
* *
3,0
3
2,5
2,5
1
0,1
0,1
Б
3,5
3,5
мг/%
ɦɝ/%
ɦɝ/%
0,6
0,6
А
ɦɝ/%
0,6
00
0
21
28
28
2821
Сутки
Сутки
ɋɭɬɤɢ
ɋɭɬɤɢ
ɋɭɬɤɢ
ɋɭɬɤɢ
Рис. 3. Влияние ФКК и препарата сравнения «Актовегина» на содержание протеиновых компонентов
в регенерате матрикса хряща: А –1оксипролина, Б – тирозина
2
1
хряща эффект от введения ФКК все же в 1,2
раза выше, чем при инъекции актовегина.
Таким образом, результаты проведенных
Ɋɢɫ.3.показывают, что внутримыэкспериментов
Ɋɢɫ.3.
шечное введение ФКК крысам существенно
стимулирует как накопление основных компонентов матрикса в регенерате хряща, так и
важнейших аминокислот – оксипролина и тирозина, отражающих содержание в нем коллагеновых и неколлагеновых элементов.
глікозаміноглікани ХРЯЩОВої
ТКАНИНИ щурів за МЕХАНІЧНОЇ
ТРАВМИ: нормалізаційний
ВПЛИВ НИЗЬКОМОЛЕКУЛЯРНОЇ
ФРАКЦІЇ КОРДОВОЇ КРОВІ ТА КРОВІ
МОЛОЧНИХ ТЕЛЯТ
7
14 7
2
них телят, на вміст полісахаридних компонентів матриксу та протеїнів сполучної тканини
хряща після механічної травми. Встановлено,
що внутрішньом’язове введення щурам ФКК
значно стимулює накопичення основних компонентів матриксу: гексозаміну, гексуронових
кислот, гіалуронової кислоти, хондроїтинсульфатів та гепарину, а також важливих компонентів структурних протеїнів у регенераті хряща
колінного суглоба щурів.
К л ю ч о в і с л о в а: хрящ, механічна травма, кордова кров корів, препарат «Актовегін»,
щури, глікозаміноглікани, протеоглікани, амінокислоти.
О. К. Гулевський, В. І. Грищенко,
Є. Г. Іванов
Інститут проблем кріобіології і
кріомедицини НАН України, Харків;
e-mail: [email protected]
Вивчали вплив низькомолекулярної (до
5 кДа) фракції кордової крові (ФКК) та препарату «Актовегіну», одержаного із крові молоч-
120
ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2009, т. 81, № 3
А. К. ГУЛЕВСКИЙ, В. И. ГРИЩЕНКО, Е. Г. ИВАНОВ
Glycosaminoglycanes
of cartilage tissue after
the mechanical trauma:
the influence of lowmolecular fraction from
the cord blood and blood
of veal calves
A. K. Gulevsky, V. I. Grishchenko,
E. G. Ivanov
Institute for Problems of Cryobiology
and Criomedicine, National Academy
of Sciences of Ukraine, Kharkov;
e-mail: [email protected]
Summary
Influence of low-molecular fraction (to
5 kDa) from cord blood (FCB) compared with
«Actovegin» derived from the blood of veal calves
on the content of the matrix polysaccharide components from and proteins of the cartilage connecting tissue after the mechanical trauma was
investigated. It is established, that intramuscular
administration of FCB essentially stimulates the
accumulation of the basic components of the mat­
rix: hexosamine, uronic acid, hyaluronic acid,
chondroitinsulfate and heparin, and also the most
important components of structural proteins in the
cartilage regenerate of the rat knee joint.
K e y w o r d s: cartilage, mechanical trauma,
cord blood of cow, preparation «Actovegin», rats,
glycosaminoglycanes, proteoglycanes, amino acids.
1. Павлова В. Н., Копьева Т. Н., Слуцкий Л. И.,
Павлов Г. Г. Хрящ. – М.: Медицина, 1988. –
320 с.
2. Риггз Б. Л., Мелтон III Л. Дж. Остеопороз. –
М. – СПб.: ЗАО: БИНОМ, «Невский
диалект, 2000. – 560 с.
3. Слуцкий Л. И. Биохимия нормальной и
патологически измененной соединительной
ткани. – Л.: Медицина, 1969. – 376 с.
4. Jordan J. M., Helmick C. G., Renner J. B. et al.
// J. Rheumatol. – 2007. – 34, N 1. – P. 172–
180.
5. Лила А. М., Мазуров В. П., Шостак М. С.
// Рос. мед. журн. – 2005. – 13, № 24. –
С. 1618–1622.
6. Поворознюк В. В. // Новости мед. и
фармации. – 2003. – 11, № 4. – С. 10–13.
7. Бур’янов О. А., Соболевський Ю. А., Магоме­
дов С. Л. та ін. // Орт. травмат. и протез. –
2007. – № 2. – С. 62–65.
8. Абакумова О. С., Моїсєєва Н. М. / Зб. тез
міжнарод. наук. конф. студ. та аспірантів
«Молодь та поступ біології». – Листопад,
Львів, 2007. – С. 463–464.
9. Моисеева Н. Н., Трифонова А. В., Тягилева В. П.
и др. / Зб. тез міжвуз. конф. молодих учених
«Медицина
третього
тисячоліття». –
Квітень, Харків, 2006. – С. 15–16.
10. Гулевський О. К., Грищенко В. І., Моісєє­
ва Н. М. // Укр. журн. гематол. та транс­
фузіології. – 2005. – С. 5–14.
11. Boas N. P. // J. Biol. Chem. – 1953. 2. –
P. 553–562.
12. Dische Z. // Ibid. – 1962. – N 4. – P. 189–
198.
13. Stegemann H., Stalder P. // Clin. Chim. Acta. –
1967. – N 2. – P. 267–273.
14. Лапач С. Н., Чубенко А. В., Бабич П. Н.
Статистические
методы
в
медико –
биологических исследованиях с исполь­
зованием Excel. – К.: МОРИОН, 2000. –
320 с.
15. Purser J. L., Renner J. B., Woodard J.,
Jordan J. M. // Arthritis Rheum. – 2006. –
54, N 9. – P. 153–161.
Получено 13.04.2009
ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2009, т. 81, № 3
121