Шапошникова Нx - Школа одарённых детей
реклама
МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ АСТРАХАНСКОЙ ОБЛАСТИ ГБОШИ АО «Школа-интернат одарённых детей им.А.П.Гужвина» ДИПЛОМНАЯ РАБОТА «Определение аминокислот в пищевых продуктах» Исполнитель Шапошникова Н.В. Научный руководитель Носачев С.Б. АСТРАХАНЬ 2015 г. Содержание 1.Введение ............................................................................................................................ 3 2.Теоретическая часть ........................................................................................................ 4 2.1.Определение и классификация аминокислот ......................................................... 4 2.2.Особенности и функции белков ............................................................................... 9 2.3.Выделение и очистка белков ................................................................................ 11 2.4.Структура и уровни организации белковой макромолекулы ............................... 12 2.5. Номенклатура и классификация белков …………………………...………………..21 3.Экспериментальная часть…………………………………………………………………....24 4. Вывод……………………………………………………………………………………………..26 5. Список использованной литературы……………………………………………………..26 1.Введение Окружающий нас живой мир представлен, своего рода, атомами биологического мироздания, "кирпичиками" - аминокислотами, из которых природа строит все многообразие окружающего нас животного и растительного мира. В процессе пищеварения съеденный нами белок расщепляется на аминокислотные фрагменты, а затем организм конструирует из них новые белковые цепи - те, что нужны ему самому. Белки - это фундамент нашего существования. Из них состоят наши клетки, органы, мышцы. Они входят в состав всех биоструктур нашего организма, включая гормоны и энзимы.Вышеописанное определяет актуальность выполнения нашей работы. Ученым сегодня известно больше 200 аминокислот. Но особый интерес представляет лишь два десятка тех самых аминокислот, из которых "состоит" человеческое тело.Часть таких аминокислот организм "умеет" синтезировать самостоятельно, по этой причине их назвали заменимыми. А вот незаменимые аминокислоты - это такие, которые мы можем получить лишь с пищей. К незаменимым относятся: изолейцин, лейцин, лизин, метионин, фенилаланин, треонин, триптофан и валин. Совсем недавно ученые предложили третью классификацию: условно незаменимые аминокислоты. Оказалось, что стрессы и физические нагрузки вызывают настолько большой расход некоторых заменимых аминокислот, что организм не в силах восполнить потери за счет внутреннего синтеза. Высокая насыщенность того или иного продукта питания аминокислотами еще не означает его такой же высокой полезности. Весь секрет в количественном соотношение аминокислот. От него как раз и зависит полнота усвоения белка. В связи со всем этим ученые ввели понятие биологической ценности, приняв за 100% белок куриного яйца. Следом идут белки рыбы, мяса, птицы, далее - молочные продукты. А вот овощам не повезло - аминокислот в них по минимуму. Впрочем, зато много полезнейших углеводов, витаминов и минеральных веществ. Для синтеза внутримышечного белка, проще говоря, "создания'' белковой молекулы, нужны все без исключения аминокислоты. Если чего-то не хватает, то синтез прекращается, точно как строительство дома при нехватке стройматериалов. Наши печень, почки и слизистая оболочка кишечника "умеют" накапливать ценные аминокислоты впрок. Так что, если мы что-то недоберем за обеденным столом, организм компенсирует дефицит из внутренних запасов. Заменимые аминокислоты синтезируются в организме человека. Определенная часть аминокислот, в свою очередь, расщепляется до органических кетокислот, из которых в организме вновь синтезируются новые аминокислоты, а затем белки. Аминокислоты всасываются из желудочно-кишечного тракта и с кровью поступают во все органы и ткани, где используются для синтеза белков и подвергаются различным превращениям. В крови поддерживается постоянная концентрация аминокислот. Из организма выделяется около 1 г азота аминокислот в сутки. В мышцах, ткани головного мозга и печени содержание свободных аминокислот во много раз выше, чем в крови, и менее постоянно. Концентрация аминокислот в крови позволяет судить о функциональном состоянии печени и почек. Содержание аминокислот в крови может заметно нарастать при нарушениях функции почек, лихорадочных состояниях, заболеваниях, связанных с повышенным содержанием белка. Исходя из вышеописанного, целью выполнения дипломной работы является экспериментальное доказательство наличия аминокислот и белков и их качественное содержание в составе продуктов питания на примере мясных и рыбных продуктов, яиц и молочных продуктов. 3 2.Теоретическая часть 2.1. Определение и классификация аминокислот Аминокислоты являются карбоновыми кислотами, содержащими амино- и карбоксильную группы, которые находятся у одного и того же углеродногоатома. В организме человека найдено свыше 70 аминокислот, причем 20 из них постоянно входят в состав белка, такую группу аминокислот называют протеиногенными (постоянно встречающимися аминокислотами), остальные аминокислоты составляют непротеиногенную группу аминокислот. Применительно к аминокислотам используют как систематическую, так и тривиальную (источник выделения) номенклатуру. Аминокислоты кроме карбоксильной и аминной группировок содержат боковые радикалы, причем именно эти химические группировки определяют большинство свойств той или иной аминокислоты. Практически все белковые аминокислоты относятся к L-ряду и являются α-аминокислотами. Протеиногенные аминокислоты можно классифицировать на основе полярности их радикалов. Таблица 1.Классификация протеиногенных аминокислот Название аминокислоты Формула аминокислоты Значение Аминокислот С неполярными радикалами Аланин (Ала) СH3CHCOOH Глицин (Гли) H2NCH2COOH Валин (Вал) H 3CCHCHCOOH NH2 H 3C NH 2 Лейцин (Лей) H3CCHCH2CHCOOH Изолейцин (Иле) CH3CH2CHCHCOOH Пролин (Про) NH2 H 3C H3C NH2 N COOH H Входит в состав КоА,пантотеновой кислоты. Входит в состав глутатиона, креатина и др. Исходное вещество для синтеза витамина В3, пенициллина. Применяется для лечения болезней печени, анемий и др. Входит в состав всех белков, незаменимая кислота. Содержится во всех организмах, в свободном и связанном видах. С незаряженными полярными радикалами Метионин (Мет) CH 2CH 2CHCOOH SCH 3 NH 2 4 Служит донором метильных групп, при биосинтезе Серин (Сер) HOCH 2CHCOOH Треонин (Тре) CH 3CHCHCOOH Цистеин (Цис) HSCH2CHCOOH NH 2 HO NH 2 NH2 Аспарагин (Асн) O=CCH2CHCOOH Глутамин (Глн) O=CCH 2CH 2CHCOOH NH2 NH2 NH 2 NH 2 холина, адреналина. Играет важную роль в проявлении каталитической активности сериновых протеаз. Играет важную роль в процессе роста организма. Важен для проявления биологической активности ферментов, гормонов, токсинов. Связывает аммиак в организме. Играет важную роль в процессе обмена азотистых веществ. С положительно заряженными радикалами Лизин (Лиз) Аргинин (Арг) Гистидин (Гис) CH2CH2CH2CH2CHCOOH NH2 NH2 HN=CNHCH2CH2CH2CHCOOH NH2 NH2 CH 2CHCOOH HN N NH 2 Применяют для обогащения кормов и пищевых продуктов. Участвует в синтезе мочевины, в процессах азотистого обмена. Исходное соединение для синтеза гистамина, карнозина, анзерина. С отрицательно заряженными радикалами Аспарагиновая кислота (Асп) HOOCCH2CHCOOH NH2 5 Играет важную роль в процессе обмена азотистых Глутаминовая кислота (Глу) веществ. Играет важную роль в процессе обмена азотистых веществ. HOOCCH2CH2CHCOOH NH2 С ароматическими радикалами Фенилаланин (Фен) Отсутствие приводит к развитию фенилкетонурии и умственной отсталости. Исходное соединение для синтеза адреналина, морфина, кодеина. Используется для биосинтеза витамина В5, серотонина, скатола, индола. CH2CHCOOH NH2 Тирозин (Тир) HO CH2CHCOOH NH2 Триптофан (Трп) CH2CHCOOH NH2 N H Аминокислоты – бесцветные кристаллические вещества с высокими температурами разложения (до 300 ºС). Они хорошо растворимы в воде и имеют по меньше мере две ионизируемые группы – амино- и карбоксильную. В водных растворах одноосновные аминокислоты обнаруживают нейтральную реакцию. Это является следствием того, что в водных растворах аминокислоты находятся преимущественно в виде биполярных ионов (цвиттер-ионы). При этом аминогруппа становится протонированной (NH3+), а карбоксильная группа диссоциированной (СОО-). + NH3 + NH3 OH OH H C R катионная форма H COOH H NH2 + C COO H+ R цвиттер-ион H C COO R анионная форма Кроме этих двух групп в состав некоторых аминокислот входят и другие группы, способные к ионизации, как, например, еще одна NH2- или еще одна СООН, или имидазол, НО-, HS-группы и другие. Ионное строение аминокислот косвенно подтверждается: их высокой температурой плавления; нелетучестью аминокислот; 6 растворимостью в воде и плохой растворимостью в неполярных органических соединениях; высоким значением дипольного момента их водных растворов. Аминокислоты являются амфолитами, т.е. проявляют свойства кислот и оснований. Диссоциация аминокислот может быть хорошо понята с позиции теории кислот и оснований Бренстеда. Согласно этой теории катионная форма аминокислоты представляет собой двухосновную кислоту (ионизированная аминогруппа и неионизированная карбоксильная) и характеризуется значениями рК1 и рК2. Величина рК1является показателем кислотности СООН группы, а величина рК2 является показателем кислотности NH2 группы. Величины рК1 и рК2 для любой аминокислоты можно найти по справочнику или экспериментально определить с помощью электрометрического титрования. Из показателя кислотности аминокислот вытекает важнейшая характеристика аминокислоты – изоэлектрическая точка. Значение рН, при котором суммарный заряд аминокислоты равен нулю (или приближен к нему), называется изоэлектрической точкой (рI). Изоэлектрическую точку (для моноаминомонокарбоновой кислоты) можно найти по формуле: рI = рК1 + рК2/2. В случае аминокислот, имеющих ионизируемый радикал, изоэлектрическая точка определяется с учетом ионизируемой группы. Например, лизин, содержащий две аминогруппы и одну карбоксильную, имеет величину рI 9,74 – среднее значение между двумя величинами рК двух аминогрупп. Например, лизин NH2(CH2)4CH(NH2)COOH имеет значения рК1 = 2,18 рК2 = 8,95 рК3 = 10,53 следовательно, рI = рК2 + рК3 /2. Таблица 2.Величины рКнекоторыхпротеиногенных аминокислот Аминокислота Гли Ала Сер Цис Мет Вал Лей Изолей Тир Фен Три Про Глу Асп Гис Лиз Арг Глн Асн рК1 2,35 2,34 2,21 1,96 2,28 2,32 2,36 2,36 2,60 2,58 2,38 2,00 2,19 2,09 1,77 2,18 2,09 2,17 2,02 рК2 9,78 9,87 9,15 8,18 9,21 9,62 9,60 9,68 9,10 9,24 9,39 10,60 4,28 3,87 6,10 8,95 9,04 9,13 8,80 7 рК3 10,28 10,1 9,66 9,82 8,17 10,53 12,48 Второй важной физико-химической характеристикой аминокислоты является скорость перемещения аминокислоты по фронту растворителя, которая выражается коэффициентом распределения (Rf ): Rf расстояние, пройденое аминокислотой , мм расстояние, пройденное растворителем, мм Величина Rf является индивидуальной характеристикой для каждой аминокислоты, она постоянна при данных условиях опыта (сорт бумаги, температура, состав растворителя и т.д.). ТАБЛИЧНЫЕ ЗНАЧЕНИЯ КОЭФФИЦИЕНТА Rf ДЛЯ НЕКОТОРЫХ АМИНОКИСЛОТ Аланин 0.30 Лизин 0.17 Аргинин 0.15 Метионин 0.50 Аспарагиновая кислота 0.23 Пролин 0.34 Валин 0.51 Серин 0.22 Гистидин 0.11 Тирозин 0.45 Триптофан 0.50 Фенилаланин 0.60 Глицин 0.23 Глутаминоваая кислота 0.28 Цистеин 0.08 Лейцин 0.70 Разнообразные по природе радикалы аминокислот позволяют вводить их в химические реакции с разнообразными реагентами. Расположение в виде тетраэдра четырех различных по природе функциональных групп вокруг α-углеродного атома обуславливает за исключением глицина оптическую активность аминокислот. Структуры, представляющие собой зеркальное отображение друг друга называютсяэнантиомерами (оптические антиподы). HOOC H COOH NH2 H 2N H CH3 H 3C D ряд L ряд Аминокислоты, имеющие правое расположение NH2 группы относятся к Dизомерам, а левое к L- изомерам. Энантиомеры проявляют одинаковые химические и физические свойства, за исключением свойства вращать плоскость поляризации света. Стереоизомер, вращающий плоскость поляризации света по часовой стрелке называют правовращающим (+), а против – левовращающим (-). Стереоизомеры, которые не являются зеркальными отображениями друг друга называютсядиастереоизомерами. 8 HOOC COOH H NH2 NH2 H CH3 H 3C Совокупность равных количеств энантиомеров, которые отличаются способностью вращать поляризованный свет называетсярацематической модификацией. Для количественной характеристики оптически активных аминокислот установлена константа – удельное оптическое вращение [α]D*. Разнообразные по природе радикалы аминокислот позволяют вводить их в реакции с различными химическими реагентами. R CH CONH CH COOH NH 2 R1 1 R CHCOOH NH2 RCH2NH 2 - нингидрин N O H 2O - CO 2 - - CO2 O O - RCHO, - CO2 - H 2O O + NH3 Cl + R1OH RCHCOCl NH3+ Cl - H 2O 1 - HX - N2 - H2 O HNO2 N 2H 4 1 R OH RCHCONHNH2 NH 2 RCHCOONa - H2O - POCl3 RCOH RCHCOOR1 NaOH NH2 - PCl5 - NH3 [O] R CH COOH HCl RCHCOOH H2O RCH=NH R COX NH 2 RCHCOOH X = галоген NHCOR1 RCHCOOH OH Схема 1. Основные химические свойства α-аминокислот Одним из важнейших свойств α-аминокислот является их способность в определенных условиях образовывать пептиды. Этот процесс протекает по типу реакции конденсации. В результате такой реакции можно получать соединения с большой молекулярной массой, такие соединения называют белками. 2.2. Особенности и функции белков Белки можно охарактеризовать как высокомолекулярные органические вещества, характеризующиеся строго определенным элементным составом и распадающиеся при гидролизе в основном до аминокислот. 9 Белки обладают рядом особенностей, которые несвойственны другим классам органических соединений: они отличаются неисчерпаемым разнообразием структуры, при строгой специфичности. Так из 20 белковых α-аминокислот возможно 2 · 1018 различных комбинаций; им присуща способность к различным внутримолекулярным взаимодействиям, что обеспечивает им пластичность, изменчивость, обратимость перехода из фибриллярного состояния в глобулярное; они способны вступать в разнообразные химические и физические взаимодействия как друг с другом, так и с нуклеиновыми кислотами, углеводами, липидами и другими соединениями; им свойственно безошибочное узнавание друг друга, на этом основан процесс биологического катализа; только белки закономерно изменяют свою структуру под влиянием внешнего воздействия и восстанавливают исходное состояние при его снятии. В организме белки выполняют много функций. К основным функциям белков можно отнести: 1. Каталитическую функцию. Большинство ферментов имеют белковую природу. 2.Транспортную функцию. Перенос кислорода крови осуществляется молекулами гемоглобина, являющегося белком эритроцитов. Альбумины сыворотки крови принимают участие в транспорте липидов, образуют комплексы с органическими и неорганическими веществами и обеспечивают их доставку к органам-мишеням. 3. Защитную функцию. В ответ на поступление в организм веществ, несущих на себе отпечаток генетической чужеродности, синтезируются специфические защитные белки-антитела. Защитная функция белков проявляется также в способности их к свертыванию (фибриногенезу), что защищает организм от потери крови при ранениях. 4. Сократительную функцию. Специфические белки мышечной ткани (актин, миозин) играют главную роль в акте мышечного сокращения и расслабления. Сократительной способностью обладают также белки клеточного центра, обеспечивающие расхождение хромосом в процессе митоза. 5. Структурную функцию. Первое место по количеству среди белков тела человека занимают структурные белки (коллаген, кератин, эластин). Белки участвуют в образовании клеточных мембран, межуточного вещества соединительной ткани, в комплексе с углеводами входят в состав ряда секретов (муцин, мукоиды). 6. Гормональную функцию. Гормональная регуляция занимает важное место в регуляции обмена веществ, а ряд гормонов представлен белками, полипептидами или производными аминокислот. 7. Питательную (резервную) функцию. Существуют специальные резервные белки, осуществляющие питание плода (овальбумины) и ребенка (альбумины, казеин). Кроме того, белки участвуют в экспрессии генетической информации, передаче нервных импульсов, поддерживают онкотическое давление крови и клеток, обеспечивают гомеостаз рН внутренней среды организма. 8. Рецепторную функцию. Играют важную роль при передаче нервного импульса в клетку или ее некоторые компартменты. Рецепторы локализованы в мембранах, и механизмы передачи информации связаны в основном с изменениями конформации белка, поглощением или выделением энергии. 9.Токсическую функцию. Такие белки представлены токсинами яда змей, скорпионов, пчел. Они характеризуются низкой молекулярной массой. Токсины растений и микроорганизмов более разнообразны по форме и молекулярной массе. Наиболее распространенными из них – дифтерийный белок, холерный токсин, рицин, абрин. 10 В органах и тканях животных содержится большое количество белков. На долю белков в человеческом теле приходится 45% от сухой массы. Наиболее богаты белком поперечно-полосатые мышцы, легкие, селезенка и почки (72-84%). К органам с умеренным содержанием белка относится кожа, мозг и нервная ткань, сердце, органы пищеварительной системы (47-63%). В твердых тканях костей, зубов и в жировой ткани белки содержатся в небольшом количестве (14-20%). 2.3. Выделение и очистка белков Белки обладают особой чувствительностью к действию большинства химических реагентов (кислот, щелочей, органических растворителей) и разрушаются при нагревании, перегонке, возгонке, экстракции. При этом белок очень легко теряет свои природные (нативные) свойства и переходит в денатурированное состояние. Поэтому, чтобы избежать денатурации белка все операции с ним проводят в мягких условиях (5ºС), нейтральной среде, нормальном атмосферном давлении и избегают действия резких химических реактивов. Существуют следующие этапы выделения белков из биологического материала: измельчение → выделение → очистка → оценка гомогенности Для успешного выделения белков из биологического материала необходимо предварительное измельчение тканей. Измельчение проводят на валовых, шаровых мельницах, в гомогенизаторах, а также с помощью попеременного замораживания и оттаивания тканей. Хорошие результаты дает метод «азотной бомбы». После того, как достигнуто хорошая гомогенизация тканей переходят к этапу выделения белков. Для этой цели белки сначала высаливают. Механизм высаливания связан со способностью солей разрушать гидратную оболочку растворенных белковых молекул, что приводит к их дальнейшей агрегации и осаждению. Далее используют ряд методов концентрирования, причем наиболее эффективными являются хроматографические процедуры. К преимуществам хроматографических методов можно отнести технологическую гибкость, динамичность, а также отсутствие химического взаимодействия в системе сорбат-сорбент. Наибольшее распространение нашли следующие виды хроматографии: адсорбционная хроматография в данном случае используется различие в относительном сродстве соединений к твердому адсорбенту, взятому в качестве неподвижной фазы; распределительная хроматография основана на различной относительной растворимости различных веществ между подвижной фазы и жидкой фазой, удерживаемой неподвижно на пористом инертном носителе; ионообменная хроматография ее применение основано на различном сродстве ионов раствора к ионообменным центрам противоположной полярности в неподвижной фазе. После стадии концентрирования получают продукт, содержащий 50-80% целевого вещества, поэтому на данном этапе необходима стадия тонкой очистки. В данном случае применяют различные методы, например: молекулярных ситоснован на различной скорости перемещения белковых молекул через колонку заполненную сефадексом; высокоэффективная жидкостная хроматография она отличается возможностью выделять высокоочищенные вещества из сложной смеси, включающие по свойствам близкие компоненты. 11 После того, как достигнуто выделение целевого продукта, то переходят к этапу очистки белка от низкомолекулярных примесей. На данном этапе используют следующие методы: диализ (электродиализ) состоит в длительном пропускании воды через сосуд в который погружен диализационный мешок. Данный метод позволяет быстро и эффективно очищать белок от различных низкомолекулярных примесей; ультрафильтрации состоит в пропускании под давлением белковой молекулы через прочную мембрану с калиброванными порами; перекристаллизацииоснован на различной способности белка растворяться в растворителях. После этапа очистки белка необходимо провести оценку гомогенности белка, т.е. оценить его однородность. Существуют различные методы оценки гомогенности, однако наиболее надежным является графический. Он основан на построении и изучении графика зависимости навески белка, взятой для растворения и количеством белка в растворе. Если график имеет один перегиб, то белок признают гомогенным, а если несколько, то неоднородным. 2.4. Структура и уровни организации белковой макромолекулы По вопросу структуры белка было высказано большое количество гипотез. Из них лишь одна выдержала испытания по времени и в свете нового фактического материала, который был получен в последнее время. Это полипептидная теория строения белковой молекулы. Она была предложена в 1902 году Э. Фишером на базе идей, выдвинутых А. Данилевским, о роли пептидных связей в строении белка. Согласно полипептидной теории белковые молекулы представляют собой гигантские полипептидные цепи, которые состоят из сотен тысяч аминокислотных остатков, которые соединены друг с другом с помощью пептидных связей. О том, что белковые молекулы построены именно таким образом свидетельствуют следующие факты: 1) в нативных белках удается обнаружить очень небольшое количество свободных аминных и карбоксильных групп, так как концевые аминокислоты, имеющие такие группы, составляют ничтожную долю огромной полипептидной цепи белка; 2) при гидролизе белка идет постепенное высвобождение аминных и карбоксильных групп в строгом соотношении 1:1, т.е. протекает гидролиз пептидных связей. Одновременно в гидролизате появляется некоторое количество свободных аминокислот. 3) все белки дают положительную биуретовую реакцию, что подтверждает наличие пептидных связей в белках; 4)полипептидная природа простейшего белка – инсулина доказана лабораторным синтезом этого белка; 5) при рентгеноструктурном анализе белка удается рассмотреть непрерывную цепь аминокислотных остатков. Ввиду исключительного значения, которое придается полипептидам, как структурной основе белка, ее строение детально изучено методом рентгеноструктурного анализа. Характерными особенностями полипептидной цепи являются следующие: 1. Атомы углерода и азота в ее хребте располагаются приблизительно в одной плоскости, в то время как атомы водорода и радикалы аминокислот направлены к этой плоскости под углом 109º28/. Кислород карбонильной группы и водород NHгруппы чаще всего находятся в транс-положении, группа, связанная с αуглеродным атомом, обладает свободным вращением. 12 2. Дли на связи C-N в пептидной связи (0,132 нм) носит промежуточный характер между длиной истинной одинарной связи C-N (0,149 нм) и длиной истинной двойной связи C=N (0,127 нм). Это, по-видимому, является следствием сопряжения π-электронов карбонильной группы со свободными р-электронами атома азота. 3. Полипептидный хребет окружен разнообразными по природе радикалами аминокислот. Они представлены как алифатическими (ала, вал, лей), ароматическими (тир, фен) так и гетероциклическими (про, три, гис). Многие из них несут ионизированные группы (асп, глу, лиз), гидроксильные (сер, тре), амидные (асн, глн), тиольные (цис) и другие группы. Долгое время представления о белковой молекуле ограничивались признанием полипептидной цепи, как ее основы, без какой-либо детализации закономерностей чередования аминокислотных остатков или конфигурации цепи. Лишь разработка новых методов исследования структуры белка дала возможность продвинуться вперед в решении как первой, так и второй проблем. В настоящее время в достаточной мере разработан вопрос о первичной, вторичной, третичной и четвертичной структурах белковой молекулы. Впервые представление об уровнях организации белков было выдвинуто К. Линдерстрёмом-Лангом. 2.4.1. Первичная структура белковой макромолекулы Под первичной структурой белковой молекулы понимают последовательность в расположении аминокислотных остатков составляющих полипептидную цепь. Зная первичную структуру белка можно написать его полную химическую формулу. Однако, поскольку в состав белка входит несколько тысяч аминокислотных остатков, то расшифровка первичной структуры белка представляет весьма трудную задачу. Обычно исследуют белок в следующей последовательности. Белок раскрытие дисульфидных мостиков денатурированный белок селективный ферментативный гидролиз смесь пептидов субфракционирование индивидуальные пептиды определение аминокислотной последовательности первичная структура пептида воссоздание первичной структуры белка Определению первичной структуры белков предшествует денатурация белков. Это достигается обработкой белка избытком меркаптоэтанола (HSCH2CH2OH) или 13 надкислотами (HCOOOH). Расщепление на пептиды достигается с помощью ферментативного гидролиза протолитическими ферментами, так пепсин работает по остаткам гидрофобных аминокислот, трипсин работает по остаткам лиз или арг, химотрипсин работает по остаткам три, фен, тир. Далее определяют аминокислотную последовательность различными химическими методами. К наиболее ранним методам можно отнести метод Ф.Сенжера (динитрофенольный метод). Химизм его можно представить следующей схемой: O2N F ДНФ + NO2 H2NCHCO NHCHCO NHCHCO2H n 1 R3 R R2 пептид H 2O NCHCO NHCHCO NHCHCO2H n 3 1 2 R HR R NO2 ДНФ пептид O2N - HF O2N NHCHCO2H + 1 NO2 R ДНФ аминокислота смесь белковых аминокислот + Структуру ДНФ аминокислоты можно определить с помощью качественной реакции или спектральными методами. Этот метод является методом определения Nконцевой аминокислоты. Существуют и другие химические методы дансильный метод (N-концевая аминокислота), метод С. Акабори (С-концевая аминокислота). В 1950 году П.Эдман предложил универсальный метод определения аминокислотной последовательности в пептидах (фенилизотиоцианатный метод). Данный метод позволяет определять всю последовательность аминокислотных остатков. Химизм метода можно представить следующей схемой: PhN=C=S + H2NCHCO NHCHCO NHCHCO2H n 1 2 R R3 R ФТЦ PhNHCNHCHCO NHCHCO NHCHCO2H n 1 2 3 R S R R пептид Ph HCl безв. O N S промежуточное соединение + N R 1 H NHCHCO NHCHCO2H n -1 R2 R3 H ФТГ производное N концевой аминокислоты укороченный пептид СтруктуруфенилтиогидантионногопроизводногоN-концевой аминокислоты обычно определяют спектральными методами. Этим способом возможно определение всех аминокислот в пептиде. Метод Эдмана в настоящее время полностью автоматизирован, расшифровку аминокислот ведут в приборах секвенаторах. Кроме химических методов определения аминокислотной последовательности применяют и физические методы (рентгеноструктурный анализ, масс-спектрометрия), однако они 14 имеют ряд ограничений и поэтому не могут найти абсолютное применение в решении этой проблемы. При рассмотрении первичной структуры белка возникает вопрос, осуществляется ли в белках все потенциально возможные комбинации из аминокислотных остатков, или имеются какие-либо сочетания аминокислот, характерные для части или всех белков? Поскольку из 20 белковых аминокислот теоретически возможно 2 · 10 18 белков, то раньше считали, что в природе возможно встретить любой из 2 · 10 18 изомеров белка. Однако, анализ чередования аминокислотных остатков в белках привел к открытию двух принципов: принцип структурного подобия и принцип взаимозаменяемости. Эти принципы были разработаны Ф. Шормом. Принцип структурного подобия заключается в том, что в различных белках встречаются идентичные пептидные группировки (трипептиды). Тождественные трипептиды: инсулин цепь Арибонуклеаза ала-сер-вал ала-сер-вал 8 9 10 122 123 124 вал-цис-сер вал-цис-сер 10 11 12 57 58 59 Принцип взаимозаменяемости заключается в том, что в полипептидной цепи существуют участки, которые отличаются друг от друга взаимозаменяемыми аминокислотными остатками, близкими по строению или биогенетически. Например, гли – сер; гли – ала; лей – изолей; лей – вал; глу – асп. Аналогичные трипептиды: инсулин цепь Арибонуклеаза глу-глн-цисасн-глн-цис 4 5 6 70 71 72 Таким образом, принцип взаимозаменяемости аминокислот в пептидах тесно увязывается с принципом структурного подобия. 2.4.2. Вторичная структура белковой макромолекулы Пептидные цепи белков организованы во вторичную структуру, стабилизированную водородными связями. Под вторичной структурой белка понимают ту или иную конфигурацию, характерную для одной или нескольких полипептидных цепей. Атом кислорода каждой пептидной группы образует при этом водородную связь с NH-группой, соответствующей пептидной связи. При этом формируются следующие структуры: α-спираль, β-структура и β-изгиб. α-Спираль. Она является одной из наиболее термодинамически выгодных структур, имеет правозакрученное направление, так как в ее состав входят только Lаминокислоты. На рис. 1 изображена α-спираль, в которой каждая карбонильная группа (С=О) образует водородную связь с четвертой по ходу цепи NH-группой. Данная система характеризуется следующими константными значениями: шаг спирали 0,54 нм, угол подъема шага 26º,на шаг спирали приходится 3,6 аминокислотных остатка, расстояние между остатками 0,15 нм, торсионный угол φ (N-Cα) равен 60º, торсионный угол ψ (С-Сα) равен 45º. 15 Рис.1. α-Спираль белка аполипопротенина С-1 (по В.М. Степанову): а – гидрофильная поверхность; б – гидрофобная поверхность α-спирали белка В α-спирали полностью использована возможность образования водородных связей, поэтому она не способна в отличие от β-структуры образовывать водородные связи с другими элементами вторичной структуры. При формировании такой структуры боковые цепи аминокислот могут сближаться, образуя гидрофобные (ориентированы во внутреннюю сферу белковой макромолекулы) или гидрофильные (ориентированы во внешнюю сферу белковой макромолекулы) компактные сайты. Эти сайты играют существенную роль при образовании трехмерной конформации белковой макромолекулы. Для того, чтобы молекула белка могла существовать в α-спирали, она должна соответствовать определенным критериям Л.Полинга и Р.Кори. 1. Модель полипептидной цепи со значениями валентных углов и межатомных расстояний не должна отличаться от их значений, вычисленных при рентгеноструктурном анализе. 2. Конфигурация пептидной связи должна быть плоской. Отклонения от плоскостного строения вызывает увеличение энергии на 4200 кДж/моль. 3. Участки полипептидной цепи должны иметь винтовую симметрию. 4. Модель должна быть насыщена водородными связями. Спираль-клубок. Содержание α-спирали неодинаково и для каждого белка является индивидуальной характеристикой. В среднем глобулярные белки имеют степень спирализации 60-70%. Спирализованные участки чередуются с хаотическими клубками. Спирализация полипептидной цепи зависит от аминокислотных остатков, ее образующих. Например, отрицательно заряженные группы глутаминовой кислоты, расположенные в непосредственной близости друг от друга, испытывают сильное взаимное отталкивание, что препятствует образованию соответствующих водородных связей в α-спирали. Аналогичная картина складывается и в случае близко расположенных положительно заряженных химических группировок лизина и аргинина. Большие размеры радикалов аминокислот также являются причиной, по которой спирализация полипептидной цепи затруднена (например, серин, треонин, лейцин). Наиболее часто интерферирующим фактором при образовании α-спирали, является аминокислота пролин, так как атом азота входит в состав жесткого кольца, что препятствует вращению вокруг связи N-Cα. Кроме того, пролин не образует 16 внутримолекулярную водородную связи из-за отсутствия атома водорода при азоте. Таким образом, во всех случаях, когда в полипептидной цепи встречается пролин, αспиральная структура нарушается и образуется клубок или β-изгиб. β-Изгиб. Глобулярные белки имеют шарообразную форму благодаря тому, что для полипептидной цепи характерно наличие петель, зигзагов, шпилек, причем направление цепи может меняться даже на 180º. В последнем случае имеет место βизгиб, рис.2. Этот изгиб стабилизируется одной водородной связью. Фактором, способствующим его образованию может являться включение в его состав наименьшего аминокислотного остатка – глицина. Фактором, препятствующим его образованию, могут быть большие боковые радикалы аминокислот. Такая конфигурация всегда оказывается на поверхности белковой глобулы, в связи с чем βизгиб принимает участие во взаимодействии с другими полипептидными цепями. Рис. 2. β-Изгиб полипептидной цепи Рис. 3. Параллельная β-структура флаводоксина, пунктиром показаны водородные связи β-Структура. В отличие от α-спирали β-структура стабилизируется за счет межмолекулярных водородных связей между соседними участками полипептидной цепи, так как внутрицепочечные контакты отсутствуют. Если эти цепочки направлены в одну сторону, то такая структура называется параллельной (рис.3), если же в противоположную, то антипараллельной (рис.4). 17 Рис.4. Антипараллельная и кристаллическая структуры супероксиддисмутазы β-Структура имеет зигзагообразную форму и не спирализована. Расстояние между соседними аминокислотными остатками равно 0,35 нм, больше, чем в случае αспирали, число остатков аминокислот приходящихся на один виток равно 2. В отличие от α-спирали, каждый участок полипептидной цепи в β-структуре открыт для образования дополнительных водородных связей как в параллельном так и в антипараллельном вариантах. В отрезке полипептидной цепи, образующей βструктуру, находится от 3 до 7 аминокислотных остатков. Супервторичные структуры. Впервые супервторичные структуры были постулированы а затем и обнаружены Л. Порлингом и Р. Кори. Суперспирализованные структуры чаще всего включают в себя как α-спирали, так и β-складчатые листы. В целом их можно охарактеризовать как домены. Они представляют собой обособленные глобулярные участки, соединенные друг с другом короткими так называемыми шарнирными участками полипептидной цепи. В белках находится как правило несколько структурных доменов каждый из которых содержит до 200 аминокислотных остатков. Примером может служить фермент глицеральдегидфосфатдегидрогеназа (ГАДФ), рис. 5. Рис.5. Домены ГАДФ из мышц омара: а – НАД+ связывающий домен; б – каталитический домен 18 2.4.3. Третичная структура белковой макромолекулы Под третичной структурой белковой молекулы понимают общее расположение в пространстве полипептидной цепи. Установление третичной структуры белка представляет собой сложную задачу. Первая модель третичной структуры белка – миоглобина была расшифрована в 1957 году Дж. Кендрью. К настоящему времени установлена третичная структура миоглобина, субъединиц гемоглобина, рибонуклеазы, лизоцима куриного яйца, химотрипсиногена. На рис. 6 и 7 представлены третичные структуры лактоглобулина и рибонуклеазы. Полагают, что третичная структура белковой молекулы определяется ее первичной структурой, так как решающую роль в поддержании ее структуры принадлежит аминокислотным радикалам. Рис. 6. Третичная структурарибонуклеазы Рис. 7.Нативная структура лактоглобулина Особое значение в формировании и стабилизации третичной структуры придают следующим взаимодействиям: ионные связи, водородные связи, дисульфидные связи, гидрофобные связи, а также гидратируемые группы. На рис. 8 схематично представлены данные виды взаимодействия. 19 Рис.8. Типы взаимодействий, формирующие третичную структуру белков I. Ионная связь относится к электростатическим взаимодействиям. II. Водородная связь возникает между боковыми цепями и пептидными связями. III. Дисульфидная связь образуется между цистеиновыми остатками. IV. Гидрофобная связь отражает взаимодействие неполярных групп. V. Гидратируемые группы. Молекулы воды, окружающие белковую молекулу, могут образовывать структуру, подобную структуре льда. Этот водный слой способствует структурной стабильности белковой молекулы. Одним из способов изучения сворачивания полипептидной цепи в трехмерную структуру является денатурация и последующая ренатурациябелковой молекулы. Одной из распространенных гипотез самоорганизации белка является гипотеза расплавленной глобулы. В рамках этой концепции выделяют несколько этапов самосборки белков. 1 этап. В развернутой полипептидной цепи с помощью водородных связей и гидрофобных взаимодействий образуются отдельные участки вторичной структуры, служащие как бы затравками для формирования полных вторичных и супервторичных структур. 2 этап. Когда число этих участков достигает определенной пороговой величины, происходит переориентация боковых радикалов и переход полипептидной цепи в новую более компактную форму, причем число нековалентных связей значительно увеличивается. Характерной особенностью этой стадии является образование специфических контактов между атомами, находящимися на удаленных участках полипептидной цепи, но оказывающихся сближенными в результате образования третичной структуры. 3 этап. На последнем этапе формируется нативнаяконформация белковой молекулы, связанная с замыканием дисульфидных связей и окончательной стабилизации белковой конформации. Частично свернутая полипептидная цепь (этап 2) называется расплавленной глобулой, а этап 3 является самым медленным при образовании зрелого белка. 2.2.4. Четвертичная структура белковой макромолекулы В природе существует немало генетически детерминированных агрегатов (субъединиц), включающих в себя несколько полипептидных цепей, образующих большие белковые макромолекулы. Четвертичной структурой называют ассоциированные между собой две или более субъединиц, ориентированных в 20 пространстве. Более правильно в этом случае говорить не об агрегатах, а об ансамблях глобул. При образовании четвертичной структуры отдельные субъединицы взаимодействуют друг с другом исключительно при помощи нековалентных связей, в первую очередь водородных и гидрофобных. Существенным является тот факт, что контактные поверхности взаимодействующих субъединиц комплементарны друг другу. В контактных участках расположены гидрофобные группировки, которые получили название «липкие пятачки». Взаимная ориентация электроотрицательных атомов, способствует образованию большого числа водородных связей. Это обеспечивает реализацию кооперативного эффекта и стабилизацию макромолекулы. Белки, имеющие четвертичную структуру называются олигомерными. Различают гомомерные и гетеромерные белки. К гомомерным относят белки, у которых все субъединицы имеют одинаковое строение, например каталаза с четырьмя абсолютно равноценными субъединицами. У гетеромерных белков отдельные субъединицы не только отличаются по строению, но и могут выполнять различные функции. Например, белок РНК-полимераза состоит из 5 субъединиц различного строения и с неодинаковыми функциями. Принципиально важно, что малейшие изменения третичной структуры протомеров способствуют невозможности их соединения в олигомерные структуры. А так как третичная структура задается первичной и зависит от различных факторов рН среды, концентрации солей и других, то даже незначительное изменение первичной структуры приводит к изменению функциональной активности белковой молекулы. Четвертичная структура, как и третичная, определяются при помощи рентгеноструктурного анализа. М. Перутцем была расшифрована структура гемоглобина, состоящая из 574 аминокислотных остатков и содержащая около 10 000 атомов. Гемоглобин (рис. 9) имеет структуру, включающую в себя четыре глобулы: две α-субъединицы и две βсубъединицы. α- и β-Цепи, образующие макромолекулу гемоглобина имеют почти одинаковую степень спирализации, это достаточно консервативная структура, так как третичная и четвертичная структура гемоглобина почти одинакова у различных типов позвоночных животных. Рис.9. Четвертичная структура гемоглобина 2.5. Номенклатура и классификация белков Поскольку белки еще недостаточно изучены, то не существует строгой номенклатуры белков. Названия белкам дают по случайным признакам, чаще всего по источнику выделения белка, например авидин белок яйца (от лат.авис – птица), казеин белок молока (от лат. казеи – сыр). 21 Несовершенна и классификация белков. Белки можно классифицировать как по их структуре, функциям, так и по свойствам. По форме молекулы белки делятся на два класса: глобулярные и фибриллярные белки. Фибриллярные белки имеют вытянутую форму (длина превышает ширину) и, как правило, состоят из нескольких полипептидных цепей. Примерами фибриллярных белков могут быть α-кератин, фиброин шелка. Глобулярные белки имеют шарообразную форму (длина примерно равна ширине) имеют более сложную конформацию и более разнообразные функции. Их полипептидные цепи свернуты в компактные глобулы, и поверхностные радикалы аминокислот обладают высокой реакционной способностью. Примеры глобулярных белков гемоглобин, миоглобин. По степени сложности белки делят на простые белки (протеины) и сложные белки (протеиды). Протеины при гидролизе дают только аминокислоты, а протеиды кроме аминокислот добавочные группы. К наиболее часто встречающимся простым белкам можно отнести следующие. Альбумины– белки животных и растительных тканей. К этой группе относят белки растворимые в воде. Примеры альбуминов альбумины крови, яичного белка, сои. Глобулины– группа белков, характеризующаяся низкой растворимостью в воде. Примеры глобулинов глобулины плазмы крови, сои. Глобулины представляют собой группу белков как растительного, так и животного происхождения. Гистоны – ядерные белки, играющие важную роль в регуляции генной активности и найдены во всех эукариотических клетках. Они представлены высоким содержанием аргинина, лизина и гистидина (не менее 30%). Протамины– положительно заряженные ядерные белки. Они принимают активное участие в регуляции генной активности. Их состав представлен высоким содержанием аргинина (80-90%) и ограниченным набором других аминокислот. Они могут взаимодействовать с нуклеиновыми кислотами посредством ионной связи. Сложные белки, как правило, классифицируют по небелковой компоненте. Липопротеиды составляют большую группу сложных белков. В качестве небелковой компоненты обнаруживается липидная фракция, которая представлена нейтральными жирами, фосфолипидами, холестерином. Эти макромолекулы находятся в митохондриях, эндоплазматическомретикулуме, плазме крови. Липидная компонента соединяется при помощи нековалентных связей различной природы (гидрофобные связи, ионные связи). Гликопротеиды – содержат в своем составе гликозидные компоненты различной природы,ковалентно связанные с белком (через О-, N-гликозидные связи). В качестве углеводной компоненты выступают D-галактоза, D-манноза, N-ацетилглюкозамин, Nацетилгалактозамин. Эти макромолекулы обнаружены в плазме крови, слюне, входят в состав ферментов, рецепторов. Фосфопротеиды в качестве простетической группы содержат ортофосфорную кислоту, связанную с гидроксилом серина или треонина. К фосфопротеидам относят питательные белки казеин, вителлин (белок яичного желтка), ихтулин (белок икры рыб). Хромопротеиды-сложные белки, в состав которых входят окрашенные небелковые компоненты. Среди них обнаружены флавоны (витамин В2), гемы (железопорфириновые соединения), соединения хрома. Нуклеопротеиды -сложные белки, имеющие в качестве простетической группы нуклеиновые кислоты. В большей части присутствуют в ядрах клеток. Металлопротеидысодержат в своем составе металлы (Cu, Fe, Mg) в качестве небелковой группы. Металлы соединены с белками непосредственно и являются составными частями белка. Примеры металлопротеидов: цитохромоксидаза, пластоцианин (медьсодержащие белки), трансферрин, лактоферрин (железосодержащие белки), никелеплазмин. 22 По выполняемой функции белки делят на: регуляторные белки, участвующие в процессе регуляции клеточной или физиологической активности (инсулин, гормон роста, паратиреоидный гормон); каталитически активные белки (ферменты), участвующие в процессе биологического катализа; транспортные белки участвуют в процессе транспорта веществ (гемоглобин, сывороточный альбумин); пищевые и запасные белки используются для питания организма на начальных этапах развития (глиадин, казеин, ферритин); сократительные и двигательные белки обладают способностью к сокращению или передвижению организма в пространстве (актин, миозин, тубулин); структурные и защитные белки выполняют опорную или защитную функцию (коллаген, кератин, фибриноген, тромбин). 23 3.Экспериментальная часть Белковая молекула представляет собой органический биополимер. Она может состоять от 2-3 десятков до нескольких тысяч аминокислотных остатков. Присутствие белка или белковых аминокислот в исследуемом биологическом материале может быть установлено рядом цветных качественных реакций, так как некоторые реагенты с белками и аминокислотами дают окрашенные продукты. Их образование обусловлено присутствием в молекуле белка или аминокислоты определенной химической группировки (пептидная связь, ароматическое кольцо, аминогруппа). Качественные реакции на аминокислоты условно делят на две группы: универсальные и специфические. Универсальные реакции дают все α-аминокислоты, а специфические реакции являются характерными только на индивидуальные аминокислоты. С помощью качественных реакций можно установить аминокислотный состав природных белков, белковую природу вещества, дать количественную оценку содержания той или иной аминокислоты в белке. Цель: освоить методики приготовления растворов белка из различных биологических объектов (на примере мясных, рыбных, молочных продуктов и яиц); провести и изучить качественные реакции белков и аминокислот; сделать вывод о качественном содержании тех или иных аминокислот в изучаемых биологических объектах. Приборы реактивы: и говядина сырая; утка жареная; колбаса вареная «Микоян»; говяжья печень; семга «Дальневосточная»; куриное яйцо птицефабрики «Астраханская»; утиное яйцо частного подворья; перепелиное яйцо частного подворья; козье молоко; сухое цельное молоко; плавленый сыр «Hohland»; сыр «Пармезан»; 10% р-р NaCl (20 мл); нас.вод. р-р (NH4)2SO4 (30 мл); 5% р-р NaNO2 (1 мл); конц. СН3СООН (1 мл); 1%нингидрина в ацетоне (8 мл); сух. Na2CO3(1,5 г); нас.р-р пикриновой кислоты (3 мл); 5% р-р нитропруссида натрия (3 мл); 25% р-р NH4OH (2 мл); 0,1% сульфата меди (3 мл); 3% р-р сульфата меди (5 мл); 10% р-р NaOH (20 мл); конц. серная кислота (2 мл); 0,2% спиртовой р-р α-нафтола (1 мл); 24 р-р гипобромита натрия (1 мл); 40% р-р мочевины (1 мл); 1% р-р сульфаниловой кислоты в 5% р-ре HCl (1 мл); 0,5% р-рNaNO2 (2 мл); 10% р-рNa2CO3(6 мл); конц. HNO3 (6 мл); 20% р-рNaOH (6 мл); штатив с 30 пробирками; спиртовка; стаканы на 50 мл; ножницы; ступка с пестиком; фильтры марлевые; бумажные фильтры; фильтровальные воронки. Выполнение опытов Опыт № 1. Приготовление растворов белка Яичный белок. Белок сырого куриного, утиного и перепелиного яйца отделяли от желтка и смешивали в стакане при перемешивании с 5-10-кратным объемом дистиллированной воды, фильтровали через двойной слой марли. Белок мясных и рыбных продуктов.Кусочки мясных и рыбных продуктов измельчали ножницами, помещали в фарфоровую ступку и растирали пестиком с речным песком постепенно приливая 20 мл 10% р-раNaCl. Смесь выдерживали 10-15 минут и фильтровали через двойной слой марли. Полученные растворы белков использовали в дальнейших опытах. Белки молока и молочных продуктов.К 20 мл сырого молока (20 г заранее измельченных сыров) добавляли равный объем насыщенного раствора (NH4)2SO4. При этом выпадали в осадок казеин и глобулины. Раствор с альбуминами фильтровали через бумажный фильтр. Полученные растворы белков использовали в дальнейших опытах. Опыт № 2. Нингидриновая реакция К 2-3 мл раствора белка (аминокислот), полученного в опыте №1 приливали 1 мл 1% р-ранингидрина в ацетоне. Содержимое нагревали. Развивалась сине-фиолетовая окраска. Опыт № 3. Ксантопротеиновая реакция К 1 мл раствора белка (аминокислот) приливали 0,5 мл конц. HNO3, нагревали до появления желтой окраски. После охлаждения добавляли 2 мл 20% раствора NaOH, растворы окрашивались в оранжевый цвет. Опыт № 4. Реакция с пикриновой кислотой К 2 мл раствора белка (аминокислот) прибавляли 0,5 гNa2CO3, приливали 1 мл насыщенного водного раствора пикриновой кислоты, нагревали. Желтая окраска 25 раствора постепенно переходила в красную, вследствие восстановления пикриновой кислоты в пикраминовую кислоту. Опыт № 5. Нитропруссидная реакция К 3 мл раствора белка (аминокислот) приливали равный объем насыщенного водного раствора (NH4)2SO4 и 2-3 капли 5% раствора нитропруссида натрия, смесь подщелачивали несколькими каплями 25% раствора NH4OH. Развивалось пурпурное окрашивание вследствие наличия цистеина. Опыт № 6. Биуретовая реакция К 2 мл раствора белка (аминокислот) добавляли 4 мл 10% раствора NaOH и несколько капель 0,1% раствора сульфата меди. На границе раздела слоев появляется розово-фиолетовое кольцо. Опыт № 7. Реакция Молиша Многие белки в качестве компонентов содержат углеводы. Поэтому такие белки в присутствии концентрированной серной кислоты и α-нафтола дают характерное фиолетовое окрашивание. К 1 мл раствора белка (аминокислот) приливали 1 мл спиртового раствора αнафтола и осторожно, по стенке, подслаивали 1-2 мл конц. серной кислотой. На границе раздела слоев появлялось фиолетовое окрашивание. Опыт № 8. Реакция Адамкевича на триптофан Реакция триптофана с альдегидами и альдегидокислотами в кислой среде приводит к образованию окрашенных продуктов конденсации. Это качественные реакции на индольное кольцо триптофана. К 1 мл раствора белка (аминокислот) приливали 0,5 мл конц. уксусной кислоты, перемешивали и осторожно по стенке пробирки, наклонив ее, приливали 1 мл конц. серной кислоты так, чтобы не происходило смешения жидкостей. На границе раздела слоев через некоторое время появилось красно-фиолетовое кольцо. Опыт № 9. Реакция Сакагучи на аргинин Эта реакция применяется для идентификации гуанидиновой группировки аргинина. Аргинин с нафтолом и гипобромитом натрия образуют продукт конденсации – нафтохинониминовоепроизводное аргинина. К 1 мл раствора белка (аминокислот) прибавляли 3 капли 10% раствора NaOH, 2 капли спиртового раствора α-нафтола. Хорошо перемешивали и прибавляли 2 капли раствора гипобромита натрия, снова перемешивали. Для стабилизации ярко-красного окрашивания прибавляли 0,5 мл 40% раствора мочевины. Опыт № 10. Реакция Паули на гистидин Гистидин в щелочной среде реагирует с диазобензолсульфокислотой с образованием 2,5-(бис)-азобензолсульфокислоты гистидина. 26 К 1 мл 1% раствора сульфаниловой кислоты в 5% растворе HCl прибавляли 2 мл 0,5% раствораNaNO2, сильно встряхивали и сразу же приливали 2 мл раствора белка (аминокислот). После перемешивания содержимого пробирок приливали 6 мл 10% раствораNa2CO3. Развивалась вишнево-красная окраска. Результаты проведенных опытов представлены в таблице 3. Говядина Утка жареная Колбаса вареная «Микоян» Говяжья печень Семга «Дальневосточная» Куриное яйцо Утиное яйцо Перепелиное яйцо Козье молоко Сухое цельное молоко Плавленый сыр «Hohland» Сыр Пармезан Таблица 3. Результаты опытов на качественные реакции аминокислот и белков в продуктах питания + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +++ + + ++ - +++ ++ + + - + - ++ - - + - +++ ++ - - - + ++ + - - + - +++ +++ +++ + - + + +++ + + ++ + +++ +++ +++ ++ - + ++ + + + + + + + Качественная реакция Приготовление растворов белка Нингидриновая реакция Ксантопротеиновая реакция (на ароматические радикалы) Реакция с пикриновой кислотой Нитропруссидная реакция (на цистеин) Биуретовая реакция Реакция Молиша (на углеводную компоненту) Реакция Адамкевича на триптофан Реакция Сакагучи на аргинин Реакция Паули на гистидин + ++ +++ +++ ++ + - - - ++ ++ + +++ - - - - - - - + ++ + + +++ - - + - + + - ++ +++ + - + - - ++ +++ 27 4.Вывод В результате проведенных качественных реакций на аминокислоты и белки, построенные из них, мы убедились в наличии определенного ряда аминокислот в исследуемых нами продуктах питания. Данные качественные реакции обусловлены определенным химическим строением тех или иных аминокислот, а также наличием соответствующих групп и химически активных реакционных центров в их молекулах. 5.Список используемой литературы 1.Комов В.П. Биохимия: Учебник для вузов / В.П. Комов, В.Н. Шведова. – М.: Дрофа, 2004. – 640 с.: ил. – (Высшее образование:Современный учебник). 2.. Овчинников Ю.А. Биоорганическая химия: учебник для вузов / Ю.А. Овчинников ; М.: Просвещение, 1987. 3. Румянцев Е.В., Антина Е.В., Чистяков Ю.В. Химические основы жизни: учебн. для вузов / Е.В. Румянцев ; М.: Химия, КолосС, 2007. 4..Тырков А.Г. Биоорганическая химия. Курс лекций. / А.Г. Тырков; ИД Астраханский университет, 2009. 5. Тырков А.Г., Щурова Н.А. Биоорганическая химия: лабораторный практикум / А.Г. Тырков, Н.А. Щурова ; ИД Астраханский университет, 2008. 28 29