Чайлахян Рубен Карпович , Доктор медицинских наук

СТВОЛОВЫЕ СТРОМАЛЬНЫЕ КЛЕТКИ КОСТНОГО МОЗГА И
КЛЕТОЧНЫЕ ТЕХНОДОГИИ
Чайлахян Р.К.
НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН (Москва)
Кроветворная и лимфоидная ткани представляют собой гетерогенную
популяцию клеток, состоящую из собственно кроветворных и лимфоидных клеток
и стромальных элементов. Стромальный компонент этих органов представлен
различными типами клеток. Главным клеточным типом стромы костного мозга
являются
ретикулярные
клетки,
находящиеся
в
тесном
контакте
с
гемопоэтическими элементами, а также эндотелиальные клетки, клетки эндоста,
адвентиций крупных сосудов, оболочки нервных клеток и жировые клетки. Другим
важным компонентом структурной организации стромального микроокружения
является внеклеточный матрикс, синтезируемый стромальными клетками, через
который они опосредуют свое действие на кроветворные клетки-предшественники.
Он представлен различными типами коллагена, фибронектином, гемонектином,
ламинином и протеогликанами, включая гепаран-сульфат, хондриотин-сульфат и
глюкуроновую кислоту.
В начале 70-х годов были выполнены циклы исследований, выявивших роль
стромальных элементов в формировании и функционировании микроокружения.
Вопрос о том, есть ли в кроветворной ткани особые клетки, определяющие
специфику микроокружения, или она зависит от совокупности всех клеток,
составляющих ткань, удалось решить на модели гетеротопной трансплантации
костного мозга и лимфоидных органов. Этот экспериментальный прием - пересадка
фрагментов костного мозга в несвойственное (гетеротопное) их развитию место,
например, под кожу, в мышцу, в переднюю камеру глаза или под капсулу почки,
известен более 100 лет. В результате пересадки образуется косточка с медулярной
полостью и костным мозгом (Рис 1). Однако механизм развития гетеротопных
2
костномозговых органов был выяснен лишь недавно. Протипировав клетки
таких органов у радиационных химер, толерантных животных, а также животных,
различающихся по секс-антигенам, удалось установить, что вновь образованные
кроветворные органы представляют собой химерные структуры, где строма
принадлежит донору, а репопулирующие на нее кроветворные и лимфоидные
клетки реципиенту. Это свидетельствует, что формирование гетеротопного
костномозгового органа - результат приживления не кроветворных, а стромальных
клеток, причем новообразованная стромальная ткань заставляет репопулирующие
на нее кроветворные клетки-предшественники дифференцироваться в тех же
направлениях, что и на территории исходного костного мозга. Таким образом,
можно
говорить
о
переносе
стромой
инструкций
для
дифференцировки
кроветворных клеток. Показано, что при трансплантации в одинаковые условия
разных фрагментов костного мозга – жирового и красного, жировой костный мозг
дает опять же жировой, а красный – кость с кроветворящим костным мозгом.
Стромальная линия клеток при этом не пополняется за счет стволовых
кроветворных
клеток,
т.е.
является
самостоятельной,
гистогенетически
независимой линией клеток.
Какие же именно клетки стромы ответственны за перенос кроветворного и
лимфоидного микроокружения? Ответ на этот вопрос удалось получить благодаря
разработанному в лаборатории иммуноморфологии НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи
методу избирательного клонирования, с помощью которого впервые была
выявлена уникальная категория стромальных клеток, а именно – клоногенные
стромальные
клетки-предшественники,
свойства
которых
предопределяют
основные характеристики микроокружения. Стромальные механоциты составляют
не более 1-3% среди клеток костного мозга и в суспензии кроветворных клеток они
сильно
разобщены
клетками
других
типов.
костномозговых клеток в монослойные культуры
При
эксплантации
взвеси
через 10-12 дней в них
образуются видимые невооруженным глазом дискретные колонии, состоящие из
нескольких тысяч фибробластов (Рис. 2)
Одной из важнейших задач в комплексном изучении выявленной категории
стромальных клеток-предшественников являлось определение природы колоний
3
фибробластов,
вырастающих
в монослойных
культурах.
Необходимо
было выяснить, являются ли колонии клеточными клонами, и, соответственно, все
клетки, входящие в состав колоний, потомками одной колониеобразующей клетки,
или они образуются в результате пролиферации нескольких клеток. Полученные
доказательства клональной природы колоний, в том числе и с помощью
хромосомного анализа делящихся клеток в колониях и в штаммах, полученных из
индивидуальных колоний, позволило определить содержание этих клеток в органах
кроветворения и иммунитета, изучить изменение их численности при различных
патологических состояниях организма или воздействиях на организм (облучение,
иммунизация, кровопускание, травма).
Наиболее
важным
предшественников
свойством
является
их
клоногенных
способность
стромальных
переносить
клеток-
специфическое
микроокружение. Действительно, при гетеротопной трансплантации под капсулу
почки костномозговых штаммов стромальных фибробластов кроликов на месте
трансплантации формируется полноценный кроветворный орган, в котором
представлены все ростки кроветворения (Рис. 3). Трансплантация же селезеночных
штаммов приводит, соответственно, к формированию лимфоидных органов, где
заселяющие их B - лимфоциты проходят весь путь своего гистогенеза вплоть до
антителообразующих
клеток
(Рис.4).
Подобной
способностью
переносить
специфическое микроокружение обладают не только штаммы стромальных
фибробластов,
полученные
от
нескольких
десятков
или
сотен
клеток-
предшественников, но и отдельные клоны или моноклональные штаммы костного
мозга (Рис.5).
Концентрация стромальных клеток-предшественников в органах гемо- и
лимфопоэза у различных животных и человека колеблется от 1-5х10-4 в костном
мозге, до 10-7
в лимфоузлах. Исследования, проведенные на различных
экспериментальных животных, показали, что концентрация клеток образующих
колонии фибробластов (КОКф) не является видоспецифичной и изменяется в
течение жизни животного. Количество их больше в первые недели жизни, но уже к
концу первого года падает в несколько раз. Связанное с возрастом снижение
содержания КОКф коррелирует со снижением остеогенного потенциала суспензии
4
клеток костного мозга, выявляемого по их способности образовывать кость в
диффузионных камерах.
Стромальные фибробласты, входящие в состав колоний, после обработки
трипсином
легко снимаются
со стекла или пластика. Они поддаются
многократному пассированию, образуя диплоидные штаммы стромальных клеток
(Рис. 6). На представленном графике видно (Рис. 7), что уже после 1 пассажа
количество выросших фибробластов было в 3-7 тысяч раз больше, чем число
стромальных предшественников в эксплантированной взвеси. К
ХV111 пассажу
численность фибробластов в штамме составляла 9-13 триллионов, т.е. за
месяца
клетки
проходили
37-39
удвоений,
что
говорит
об
2-3
огромном
пролиферативном потенциале этих клеток.
При трансплантации диплоидных штаммов костномозговых фибробластов 1-11
пассажа в диффузионные камеры, системы непроницаемой для клеток, в них
образуется костная ткань (Рис. 8). Это свидетельствует, что клетки с остеогенными
потенциями сохраняются в культурах. Следует отметить, что трансплантация
фибробластов в диффузионные камеры большего объема приводила к образованию
в них как костной, так и хрящевой тканей, имеющих типичную морфологию и
гистохимические свойства (Рис. 9).
Ответ на вопрос, происходит ли размножение остеогенных клеток в процессе
культивирования, был получен в опытах, в которых брали лишь часть клеток из
последовательных пассажей разных штаммов и испытывали их остеогенные
потенции, помещая в диффузионные камеры (Рис. 10). При образовании кости в
таких камерах можно утверждать, что в камеру была помещена, по крайней мере,
одна остеогенная единица. Результаты показали, что во всех испытанных пассажах,
включая ХVIII, сохранялась костеобразовательная способность штаммов. При этом
количество остеогенных единиц возрастало. В отдельных пассажах превышение
составляло
более
чем
в
1000
раз,
если
даже
считать,
что
каждая
колониеобразующая клетка была остеогенной. Эти данные означают, что
остеогенные клетки размножаются в культурах, т.е. самоподдерживаются в составе
диплоидных штаммов.
5
Интересно было определить, какое количество
стромальной
ткани
и
в
частности костной ткани, могут построить выращенные в культуре стромальные
клетки, по сравнению с тем количеством кости, которое имеет исходный
костномозговой орган. Количество костной ткани принято определять по ее сухому
весу,
поскольку
костная
ткань
содержит
нерастворимый
Са.
На
схеме
представлены данные двух опытов. Из крыла тазовой кости кролика, содержащей
108
костномозговых клеток, 105
клеток, что составляло 1 / 1000 часть, была
использована для инициации штаммов. На 1Х пассаже эти штаммы содержали 1,5х
109 и 5х109 фибробластов. 105 клеток, оставляющие 2 / 100000 от общего числа
клеток в штамме, образовывали в камере кость массой 2 мг. Если подобным
образом рассадить в диффузионные камеры весь клеточный урожай штамма, то
могло бы образоваться 30 г кости. С учетом того, что для инициации штамма была
использована 1 / 1000 часть костномозговых клеток тазовой кости, суммарный
костеобразовательный
потенциал
всех
остеогенных
предшественников,
содержащихся в этой кости равен 30 кг костной ткани при собственном сухом весе
тазовой кости 500 мг.
Анализ дифференцировочных потенций 29 моноклональных штаммов (Рис.
11) костномозговых стромальных фибробластов в закрытой системе диффузионных
камер показал, что 47 % штаммов способны строить костную ткань, а в камерах
большего объема 25 % штаммов наряду с костной образуют и хрящевую ткань. Эти
исследования явились первым экспериментальным доказательством наличия во
взрослом организме общего предшественника для костной и хрящевой тканей. Этот
вывод правомерен, поскольку в каждой камере, где одновременно сформировалась
костная и хрящевая ткани, находились потомки одной клоногенной стромальной
клетки. Обе ткани имели типичную морфологию.
Таким образом, среди выявленных нами клоногенных стромальных клетокпредшественников имеется категория клеток, которая по своим пролиферативным
и дифференцировочным потенциям являются претендентами на роль стволовых
клеток стромальной ткани костного мозга. Они соответствуют требованиям
предъявляемым к стволовым клеткам: обладают высоким пролиферативным
6
потенциалом,
самоподдерживаются
в процессе
пролиферации
и
дифференцируются в нескольких направлениях.
Теоретические разработки проблемы остеогенных клеток-предшественников и
создание экспериментальной модели восстановления целостности костной ткани
позволили создать и внедрить в клинику метод замещения костных дефектов путем
аутотрансплантации остеогенных клеток костного мозга, выращенных вне
организма (Рис. 12). Процесс лечения предусматривает следующие этапы:
1.Получения трепаната костного мозга и передача его в лабораторию. 2. Выделение
и размножение в культурах остеогенных клеток, 3. Обратная трансплантация,
выращенных в культурах клеток в область дефекта кости больного, чей костный
мозг был использован для культивирования.
Трепанат костного мозга получают из гребня тазовой кости под местным
обезболиванием, для чего больной на одни сутки поступает в стационар. Если
больной до проведения обратной трансплантации клеток
нуждается
в
дополнительном обследовании и лечении (например, при остеомиелите), он
остается в клинике и ему проводится необходимое лечение.
Время культивирования, т.е. получения необходимого числа остеогенных
клеток, зависит от величины дефекта, который предстоит заполнить. В среднем
этот срок равен 1-1,5 месяцам.
За 1-2 дня до операции больной вновь поступает в клинику. Заключительный
этап включает подготовку трансплантата и саму операцию аутотрансплантации.
Выращенные остеогенные клетки в определенной концентрации помещают в
пористые губки приготовленные из аллогенного губчатого костного матрикса.
Такие эластичные губки с ориентацией пор свойственной костной ткани, после
сжатия
быстро
приобретающие
исходную
форму,
обладают
отличной
всасывающей способностью, что является важным моментом для сбора и
удержания выращенных клеток и последующей обратной трансплантации их в
область дефекта. Пересаженные фрагменты губчатого матрикса с клетками
определяют величину и форму кости, которую образуют заполнившие его клетки.
Вновь образованная кость в дальнейшем подвергается ремоделированию и хорошо
встраивается в структуру костного органа.
7
Методика
аутотрансплантации
и ведения больного в послеоперационном
периоде зависят от характера патологии, времени ее возникновения, состояния
функции конечности и возраста больного. Признаки выраженного остеогенеза
наступают через 1,5-2 месяца после проведенной трансплантации.
Пластика костного дефекта / или полости / данным способом обладает рядом
преимуществ перед другими методами. Во - первых, в область регенерации, где
обычно имеет место дефицит остеогенных клеток, помещается большое количество
клеток с высокими костеобразовательными потенциями; во - вторых, помимо
остеогенных трансплантат не содержит примеси других клеток; в - третьих, метод
высокоэффективен,
сокращает
сроки
лечения,
способствует
быстрому
и
равномерному заполнению костей полноценным костным регенератом. Это
позволяет проводить лечение тяжелого контингента больных с ложными
суставами, несросшимися переломами и хроническим остеомиелитом.
Разрешите
продемонстрировать
несколько
клинических
случаев
с
использованием предлагаемого метода. Возраст демонстрируемых больных от 25
до 52 лет. После получения травмы больные лечились гипсовой повязкой,
внутрикостным остеосинтезом и различными аппаратами. В клинику поступили
через 6-9 месяцев после получения травмы и лечения. При обследовании
установлен диагноз – ложного сустава ( 2 случая ), несросшегося перелома и
остеомиелитического очага с большим дефектом кости. У всех больных был
получен трепанат костного мозга и отправлен в лабораторию для культивирования.
Через 1-1,5 месяца была произведена обратная трансплантация, выращенных in
vitro, аутологичных остеогенных клеток-предшественников. Губчатый костный
матрикс, заполненный костномозговыми фибробластами помещался в пазы на
уровне ложного сустава, несросшегося перелома или в костный дефект ,
образованный остеомиелитическим очагом
Больной П., диагноз – ложный сустав левой плечевой кости (Рис.13).
Произведена обратная трансплантация, выращенных in vitro, остегенных клетокпредшественников и наложен аппарат Гофмана. Через 4 месяца при выраженных
признаках остеогенеза аппарат Гофмана был снят. Через 1 год (Рис.14)
рентгенологически определяется хорошее сращение отломков.
8
Больной Т., диагноз – ложный сустав нижней трети большеберцовой
кости (рис.15). Через 1,5 месяца после операции выявлены начальные признаки
консолидации. На представленном отдаленном результате (Рис.16) отломки плотно
срослись, функция конечности восстановлена полностью.
Больной М., диагноз - хронический посттравматический остеомиелит средней
трети большеберцовой кости с большим ее дефектом и действующим свищом (Рис.
17).
Одновременно
с
взятием
трепаната
была
проведена
радикальная
секвестнекрэктомия, ферментативная обработка полости и направленное
медикаментозное лечение. Через 2 месяца после заполнения полости губчатым
костным матриксом, содержащим костномозговые фибробласты, наметились
начальные признаки сращения. Через 6 месяцев (Рис. 18) видно быстрое нарастание
костной мозоли и консолидация между отломками.
Нередко для установки имплантатов приходится наращивать высоту
альвеолярных отростков верхней челюсти путем подсадки различных материалов
(тутафлекс и др.) в гайморову пазуху, т.е. проводить операцию синуслифтинга. Как
правило, на месте трансплантации формируется плотная фиброзная ткань, в
которую устанавливают имплантаты. Мы с этой же целью использовали
аллогенный губчатый костный матрикс с адгезированными на нем аутологичными
остеогенными стромальными клетками. На (Рис. 19) представлен снимок пустой
гайморовой пазухи, а на следующем снимке костная ткань сформированная
комбинированным трансплантатом через 5 месяцев после операции (Рис.20).
Не менее актуальной является проблема лечения повреждений хряща и их
последствий, т.е. восстановление целостности гиалинового хряща крупных
суставов,
которая
сегодня
приобретает
все
большую
значимость
как
в
медицинском, так и социальном аспекте. Достижения современной травматологии
и ортопедии, в частности, компрессионно-дистракционный метод, позволили
клиницистам в определенной степени влиять на скорость и качество репаративных
процессов костной ткани и привели к существенному улучшению результатов
лечения.
В то же время, прогресс в области суставной патологии был достигнут в
значительной мере благодаря созданию и усовершенствованию искусственных
9
суставов и по сути дела не приблизил нас к решению вопроса о регенерационных
возможностях компонентов синовиальной среды сустава и наиболее важного из
них – суставного хряща. Статистика утверждает, что при травмах коленного
сустава в 50-60% случаев артроскопия выявляет повреждение мыщелков и
надколенника, не проникающие в подлежащую кость. Приблизительно такой же
процент случаев повреждения хряща отмечается при травмах других крупных
суставов. Эта категория патологии объединена под общим названием хондропатии.
В развернувшейся дискуссии невозможность восстановления суставного
хряща при его неполнослойном повреждении авторы связывают с неспособностью
хондроцитов вступать в митоз, продукции ими ингибиторов для пролиферации
менее
дифференцированных
клеток,
с
понижением
процессов
обмена
и
особенностями питания.
Многочисленные методы лечения от медикаментозных, механических,
физических до пересадки в область поврежденного хряща биологических
трансплантатов (надкостницы и надхрящницы) не достигали желаемого результата.
В отдельную группу можно выделить методы лечения основанные на пересадке
хондроцитов
выращенных
in
vitro.
Трансплантация
эмбриональных
или
гомологичных хондроцитов приводит к неминуемому их отторжению. В то же
время ряд исследователей предполагают, что структурные особенности матрикса
определяют своеобразие иммунологических свойств хряща и гомотрансплантат,
содержащий живые хрящевые клетки не рассасывается. Это объясняется
невозможностью проникновения из матрикса хряща антигенов трансплантата к
иммунокомпетентным клеткам хозяина и в свою очередь контакта гуморальных
факторов клеток хозяина с клетками трансплантата. Пересадка аутологичных
хондроцитов, полученных из так называемой «некритической или неконтактной
зоны» здорового сустава и размноженные in vitro, предполагает нанесение
дополнительной
травмы.
К
тому
же
не
ясно,
способны
ли
высокодифференцированные хондроциты, полученные из небольшого фрагмента
хряща, пройти необходимое число митозов и образовать клеточную массу
необходимую для трансплантации и последующего замещения дефекта.
10
Предлагаемый
нами
метод восстановления
гиалинового
хряща
суставов основан на схожем биотехнологическом принципе – трансплантации в
сустав аутологичных клеток-предшественников, выращенных вне организма.
Предположение, что во взрослом организме имеется общая клетка-предшественник
для костной и хрящевой тканей высказывалось многими исследователями.
Полученные нами экспериментальные данные явились первыми в мире, которые
подтвердили
потенций
это
предположение.
штамма,
состоящего
При
из
исследовании
потомков
одной
дифференцировочных
стромальной
клетки-
предшественника было показано, что они способны формировать как костную, так
и хрящевую ткани (сл-д 21). Именно это обстоятельство позволило нам разработать
и апробировать в клинике метод восстановления гиалинового хряща суставов при
их неполнослойном повреждении, полученном в результате механической травмы
(Рис. 22,23,24). С этой целью в сустав с поврежденным хрящом трансплантировали
стромальные клетки-предшественники, выделенные из костного мозга больного и
размноженные вне организма. Аутотрансплантация этих клеток при подобной
патологии хряща приводила к полному замещению дефекта истинно гиалиновым
хрящом (Рис.25).
Продолжительность культивирования, т.е. получения необходимого для
трансплантации числа клеток, как и в случае с восстановлением целостности кости
зависит от величины дефекта хряща. Положительный дефект достигается через 2-3
месяца после трансплантации клеток и соответствующего лечения.
Предложенные нами методы восстановления костной и хрящевой тканей
содержат теоретическое, экспериментальное и клиническое обоснование, являются
приоритетными, не имеющими аналогов в мировой медицинской практике.
Проведенные
операции
являются
первыми,
использующие
обратную
трансплантацию аутологичных остео- и хондрогенных клеток-предшественников,
выращенных вне организма.
Принципы предложенных биотехнологических методов лечения являются
универсальными и могут быть использованы как для восстановления гиалинового
11
хряща суставов, так и для лечения больных с дефектами костной ткани
различной локализации (травматология, ортопедия, нейрохирургия, черепнолицевая хирургия, стоматология).