Федеральное государственное бюджетное учреждение «Российский научный центр «Восстановительная травматология и ортопедия»
advertisement
Федеральное государственное бюджетное учреждение «Российский научный центр «Восстановительная травматология и ортопедия» имени академика Г.А. Илизарова» Минздрава России На правах рукописи Ступина Татьяна Анатольевна Структурная реорганизация нагружаемых участков суставного хряща при биомоделировании остеоартроза и экспериментальной разработке технологий ортопедического удлинения конечности 03.03.04. – «Клеточная биология, цитология, гистология» Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант: Щудло Михаил Моисеевич д.м.н. Курган 2014 2 ОГЛАВЛЕНИЕ Список обозначений и условных сокращений…………………………………...4 Введение……………………………………………………………………………….5 Глава 1. Современные гистологические сведения о строении суставного хряща. Суставной хрящ в норме и в условиях действия механических факторов. Изменения суставного хряща при чрескостном дистракционном остеосинтезе (обзор литературы) 1.1. Современные гистологические сведения о строении суставного хряща. Рост, физиологическая регенерация, инволютивные изменения..……….........................14 1.2. Роль механических факторов в патогенезе остеоартроза ………………...…...30 1.3. Репаративная регенерация суставного хряща…………………………………..33 1.4. Методы количественной оценки изменений суставного хряща у животных и человека………………………………………………………………………………..40 1.5. Изменения суставного хряща при чрескостном дистракционном остеосинтезе…………………………………………………………………………...43 Глава 2. Материал, методика эксперимента, методы исследования 2.1. Материал исследования, методика эксперимента………..................................48 2.2. Методы исследования…………………………………………………………....52 Глава 3. Гистоморфометрическая характеристика суставного хряща интактных собак в разные возрастные периоды……………….....................…………………..66 Глава 4. Структурная реорганизация суставного хряща при моделировании остеоартроза в эксперименте………………………………………………………...91 Глава 5. Структурная реорганизация нагружаемых участков суставного хряща мыщелков бедра при удлинении конечности 5.1. Структурная реорганизация нагружаемых участков суставного хряща мыщелков бедра при удлинении конечности с различной дробностью и темпом дистракции в ручном и автоматическом режимах …….…………………………115 5.2. Морфофункциональное состояние нагружаемых участков суставного хряща мыщелков бедра при автоматическом удлинении голени с темпом 1 мм за 60 приемов, осуществляемом в дневное и ночное время………………………........156 5.3. Морфофункциональное состояние нагружаемых участков суставного хряща мыщелков бедра при автоматическом удлинении голени с темпом 3 мм за 120 и 180 приемов................................................................................................................180 5.4. Структурная реорганизация хряща нагружаемых участков мыщелков бедра при метадиафизарном удлинении голени…………………………………….......203 Глава 6. Гистоморфометрические характеристики синовиальной оболочки интактных и экспериментальных собак…………………….………...............................212 3 Глава 7. Сопоставительный анализ морфофункционального состояния суставного хряща при возрастных изменениях, при ортопедическом удлинении голени и моделировании остеоартроза (обсуждение результатов собственных исследований и заключение)……………………………………………………………………....237 Выводы……………………………………………………………………………..265 Практические рекомендации……………………………………………………...269 Список литературы………………………………………………………………...270 Приложение………………………………………………………………………...300 4 СПИСОК ОБОЗНАЧЕНИЙ И УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ h - толщина хряща (мкм); NАch - численная плотность хондроцитов (мкм-2); NNem.lac. - доля пустых лакун (%) от общего количества лакун; NNis.gr. - долю хондроцитов в составе изогенных групп (%) от общего количества хондроцитов; VVch - объемная плотность хондроцитов (%); Sch - площадь хондроцитов (мкм2); VVn - объемная плотность ядра (в долях единицы); VVс - объемная плотность цитоплазмы (в долях единицы); NCI - ядерно-цитоплазматический индекс; dmin - минимальный диаметр (мкм) клеток и их ядер; dmax - максимальный диаметр (мкм) клеток и их ядер; Ff - фактор формы (в долях единицы) клетки и ядра; СЭМ – сканирующая электронная микроскопия; МТХ – метахромазия; МОА – модель остеоартроза; ГАГ – гликозаминогликаны; ГМК - гладкомышечные клетки. 5 ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы. Удлинение нижних конечностей является одним из важных разделов хирургического лечения врождённых и приобретённых ортопедических заболеваний [64, 142]. Метод удлинения по Илизарову получил широкое признание и внедрение в практику, однако вплоть до настоящего времени при его применении остаётся нерешённой проблема функциональной реабилитации пациентов, в частности восстановление объёма движений в суставах [7, 109]. Cуставной хрящ является одной из наиболее важных частей сустава. В настоящее время достижения в области морфологических и биохимических исследований [19, 25, 54, 55, 104] позволили приблизиться к пониманию особенностей его морфофункциональных характеристик, определяющих нормальное функционирование сустава. Морфологические изменения суставного хряща в зависимости от условий удлинения конечности изучены крайне недостаточно. Известны лишь единичные работы, освещающие отдельные аспекты этой проблемы [121, 122, 189, 257, 258]. В эксперименте при исследовании коленного сустава при удлинении большеберцовой кости с суточным темпом 1 мм за 1 прием на 20℅ от исходной длины, были выявлены дегенеративные изменения в суставном хряще, которые подвергались обратному развитию по мере нормализации функции конечности [121]. С целью уменьшения травматизации тканей при дистракционном остеосинтезе академик Г.А. Илизаров предложил разделить суточное удлинение (1 мм) на несколько или несколько десятков приёмов (разовых удлинений) принцип дробной и высокодробной дистракции [58, 59, 60]. В условиях дозированной низкодробной дистракции, в частности – разделение суточного удлинения в 1 мм на 2 приема (разовое удлинение 0,5 мм) зарубежными 6 исследователями [189, 257, 258] были отмечены истончение, разволокнение суставного хряща, в части наблюдений выявлены некротические изменения. Если же при темпе дистракции 1 мм в сутки применяются специальные автоматические устройства, позволяющие увеличить дробность дистракции до 120 (разовое удлинение 1/120 мм), повреждения суставного хряща существенно уменьшаются по сравнению с ручным режимом дистракции - 1 мм в день за один приём [232, 233]. Одной из актуальных задач при удлинении конечности, требующих теоретического обоснования и практического оптимального режима дистракции результатов и сокращения решения, является выбор c целью улучшения функциональных сроков лечения, поэтому разработка, экспериментальная апробация и морфологическое обоснование новых технологий дистракционного остеосинтеза продолжаются. Вплоть до настоящего времени вопросы о механизмах клеточной гибели, регенерации суставного хряща и ее источниках при разных видах повреждения остаются дискутабельными. Представления об источниках и механизмах структурного самоподдержания и самовосстановления суставного хряща также противоречивы. Недостаточно выяснены вопросы о возможности, типе и месте пролиферации хондроцитов. Учитывая зональную неоднородность суставного хряща, исследователи высказывали различные мнения о наличии какой-то определенной зоны, имеющей наибольшее значение для его роста и восстановления [81, 91, 92, 103, 104, 230, 276]. При изучении влияния различных факторов на состояние суставного хряща существует необходимость разработки способов объективной комплексной количественной морфологической оценки его деструктивно-репаративных и адаптационно-пластических изменений. Отсутствие стандартных методик (алгоритма количественного анализа) не позволяют однозначно судить о степени реактивно-деструктивных, регенеративных и адаптационно-пластических 7 изменений гиалинового хряща суставов в разных экспериментальных условиях и в различные периоды постнатального онтогенеза. В частности, несмотря на значительные успехи в распознавании патогенеза дегенеративно-дистрофических процессов в суставе, нет единого мнения о пусковых механизмах и степени структурных перестроек его компонентов при инволютивных изменениях и на ранних стадиях остеоартроза [45, 231]. Проведенный анализ литературных данных свидетельствует об актуальности проблемы и необходимости проведения данного исследования. Цель и задачи исследования. Цель работы - выявить закономерности структурной реорганизации нагружаемых участков суставного хряща коленного сустава при биомоделировании остеоартроза и экспериментальной разработке технологий ортопедического удлинения голени. Для достижения цели были поставлены задачи: 1. Изучить основные гистоморфометрические и метаболические характеристики суставного хряща интактных животных (собак) в различные периоды онтогенеза, уделяя особое внимание периодам интенсивного роста. 2. Определить основные тенденции изменений суставного хряща при моделировании остеоартроза с редуцированным кровоснабжением. 3. В экспериментах по биомоделированию ортопедического удлинения конечности выявить зависимость изменений суставного хряща от режима ручной и автоматической дистракции («1 мм за 4 приёма в день», «1 мм за 8 приёмов в сутки», «1 мм за 60 приёмов в день», «3 мм за 180 приёмов в сутки»). 4. Разработать, адаптировать к объекту и применить в исследованиях технологию колориметрического анализа метахромазии в цифровых полноцветных изображениях микропрепаратов суставного хряща. 5. Провести сравнительный анализ морфофункционального состояния суставного хряща при автодистракции, проводимой в дневное и ночное время («1 мм за 60 приёмов в день», «1 мм за 60 приёмов в течение ночи»). 8 6. Изучить компенсаторно-приспособительные изменения суставного хряща при повышенном темпе автодистракции в зависимости от её дробности («3 мм за 120 приёмов» и «3 мм за 180 приёмов»). 7. Выявить особенности структурной реорганизации нагружаемых участков суставного хряща при метадиафизарном удлинении голени у экспериментальных животных. 8. Провести сопоставительный анализ реактивно-деструктивных изменений и восстановительных процессов в суставном хряще в условиях удлинения конечности в эксперименте, в процессе естественного роста и при моделировании остеоартроза. 9. Оценить морфофункциональное состояние синовиальной оболочки при моделировании остеоартроза с редуцированным кровоснабжением, при инволютивных изменениях и при ортопедическом удлинении конечности. Научная новизна. Впервые на достаточном материале с применением современных методов световой и электронной микроскопии, компьютерной морфометрии проведено гистологическое исследование нагружаемых участков суставного хряща коленного сустава экспериментальных и интактных животных в различные периоды онтогенеза. Изучены гистоморфометрические признаки реактивно-деструктивных, компенсаторно-приспособительных и адаптационнопластических изменений суставного хряща в процессе удлинения голени при дробных режимах ручной и автоматической дистракции. Выявлена зависимость степени повреждения суставного хряща от условий удлинения смежного сегмента конечности в эксперименте. Разработана и адаптирована к объекту исследования технология изготовления гистологических препаратов, позволяющая проводить комплексные количественные исследования цифровых изображений. Разработаны количественные критерии оценки степени реактивно-деструктивных изменений и восстановительных процессов в суставном хряще в условиях удлинения конечности в эксперименте, в процессе естественного роста, естественных инволютивных изменений и при моделировании остеоартроза с редуцированным кровоснабжением. Определены градации зрелости и признаки регенерации 9 хондроцитов (ядерно-цитоплазматический индекс, количество и численный состав изогенных групп), что позволило выявить потенциальные возможности клеточных элементов и хряща в целом. Разработана и адаптирована к объекту технология колориметрического анализа метахромазии в цифровых полноцветных изображениях микропрепаратов суставного хряща. Получены новые данные о влиянии на состояние суставного хряща разных режимов дистракции и теоретически обоснована возможность использования этих режимов в клинической практике. Теоретическая и практическая значимость. Результаты исследований послужат основой для разработки щадящих методик дистракционного остеосинтеза, учитывающих состояние смежных с удлиняемым сегментом конечности суставов и направленных на профилактику развития в них патологических процессов. Разработанная и адаптированная к объекту технология изготовления гистологических препаратов, позволяющая проводить количественное исследование с применением компьютерных технологий, может быть использована в научно-клинических и экспериментально-морфологических подразделениях. Разработанная методика количественного исследования суставного хряща может быть применена при изучении патологических изменений, эффектов роста, старения, влияния физических упражнений, иммобилизации, лекарственных препаратов на структуру хряща. Некоторые положения диссертации относятся к фундаментальным и представляют теоретический интерес. Методология и методы исследования. Объекты исследования - суставной хрящ мыщелков бедра с подлежащей субхондральной костью, синовиальная оболочка интактных собак (контроль) в возрасте 1,5-2 лет (n=7) и собак такого же возраста, которым удлиняли голень (n=79), моделировали остеоартроз (n=20). Кроме того, изучены морфологические особенности суставного хряща и синовиальной оболочки при естественном растяжении смежного сегмента конечности в условиях физиологического роста 10 собак и возрастные изменения (щенки в возрасте от 2 до 10 месяцев, животные в возрасте 5-8 лет, n=18). При проведении экспериментов соблюдали требования Министерства здравоохранения Российской Федерации к работе экспериментально- биологических клиник (Федеральный закон принятый Государственной Думой 1 декабря 1999 г. «О защите животных от жестокого обращения», «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных» согласно приказу МЗ СССР №755 от 12.08.1987г), а также «Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей». Все манипуляции, проводимые на животных, были рассмотрены и одобрены этическим комитетом «РНЦ «ВТО» им. академика Г.А. Илизарова». Оперативные вмешательства выполняли под тиопенталовым внутривенным наркозом, животных выводили из опыта передозировкой барбитуратов. Результаты эксперимента оценивали на макро- и микроскопическом уровнях. Были использованы следующие методы: экспериментально- клинический, рентгенологический, гистологический (световая микроскопия целлоидиновых, парафиновых, иммуногистохимический, полутонких стереологический, срезов), гистохимический, статистический; сканирующая электронная микроскопия, рентгеновский электронно-зондовый микроанализ, информационные технологии: гистоморфометрический, колориметрический компьютерный анализ транспортированных по локальной сети полноцветных цифровых изображений гистологических препаратов. Основные положения диссертации, выносимые на защиту. 1. При экспериментальных моделировании животных ортопедического наибольшие удлинения структурные голени преобразования развиваются в поверхностной и глубокой зонах нагружаемых участков хряща коленного сустава, деструктивные изменения и гибель хондроцитов выражены в меньшей степени, чем инволютивных изменениях. при моделировании остеоартроза и возрастных 11 2. Регенерация суставного хряща в условиях удлинения конечности осуществляется за счет собственных возможностей хондроцитов, пролиферирующих преимущественно в верхних слоях промежуточной зоны, а также очагами в поверхностной и глубокой зонах. 3. Применение автодистракции создаёт оптимальные условия для реализации адаптационно-пластических возможностей суставного хряща и повышает реабилитационные возможности метода дистракционного остеосинтеза. 4. Возрастные инволютивные изменения суставного хряща на протяжении длительного времени сопровождаются компенсаторными реакциями - усилением пролиферативной и секреторной активности хондроцитов. 5. При моделировании остеоартроза с редуцированным кровоснабжением наиболее выраженные деструктивные изменения хондроцитов развиваются в промежуточной зоне, существенная роль в патогенезе принадлежит функциональной и структурной денервации сиовиальной оболочки. 6. Разработанная методология количественного исследования суставного хряща на органном, тканевом и клеточном уровнях структурной организации, расширяет возможности гистоморфометрических исследований, повышает их точность, эффективность, обеспечивает воспроизводимость получаемых данных. Апробация работы. Материалы диссертации доложены на Международной конференции молодых ученых «Медицина в XXI веке: эстафета поколений» (г.Курган, 13-15 июня, 2001 г.), областной научно-практической конференции «IV Зауральский фестиваль научно-исследовательского, технического и прикладного творчества молодежи и студентов Курганской области» (г.Курган, 30 мая, 2002 г.), Международной конференции «Информационные технологии и системы: наука и практика» (г.Владикавказ, 26 октября, 2002 г.), Всероссийской конференции «Молодые ученые медицине» (г.Самара, 25-26 сентября, 2003 г.), Всероссийской научной конференции «Реактивность и пластичность гистологических структур в нормальных, экспериментальных и патологических условиях» (г.Оренбург, 18-20 октября, 2003 г.), Международной научной 12 конференции «Фундаментальные и прикладные проблемы гистологии. Гистогенез и регенерация тканей» (г.Санкт-Петербург, 8-9 апреля, 2004 г.), Международной научно-практической конференции «Морфо-функциональные аспекты регенерации и адаптационной дифференцировки структурных компонентов опорно-двигательного аппарата в условиях механических воздействий» (г.Курган, 20-21 октября, 2004 г.), заседании научного общества ортопедов-травматологов ФГУН «Российский научный центр "Восстановительная травматология и ортопедия" имени академика Г.А. Илизарова Росздрава» (г.Курган, ноябрь, 2004 г.), научно-практической конференции с международным участием «От фундаментальных исследований – к прогрессу в медицине» (г.Харьков, 17-18 января, 2005 г.), Всероссийской молодежной конференции «Физиология и медицина» (г.Санкт-Петербург, 14-16 апреля, 2005 г.), Всероссийской научнопрактической конференции молодых ученых «Молодые ученые: новые идеи и открытия» (г.Курган, 14-16 июня, 2006 г.), Всероссийской. научн. конференции «Нейробиологические аспекты морфогенеза и регенерации» (г.Оренбург 18-19 ноября, 2008 г). Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием с элементами науч. шк. для молодежи, посвящ. 90-летию со дня рождения заслуж. деят. науки РСФСР проф. Я. Л. Цивьяна: (Цивьяновские чтения, г.Новосибирск, 2010 г., 2011г.), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «ИЛИЗАРОВСКИЕ ЧТЕНИЯ» (г.Курган, 2011 г., 2012 г.), V Всероссийском симпозиуме с международным участием (г.Уфа, 2012 г.), 8th International Conferense of Skeletal Deformities Correction (Cairo, Egipt, 20-22 June, 2012), Международном Конгрессе ASAMI и BR (Греция, 6-9 июня, 2012 г.), Всероссийской научной конференции с международным участием «Актуальные проблемы морфологии, адаптогенеза и репаративных гистогенезов», посвященная памяти чл.-корр. АМН СССР профессора Ф.М. Лазаренко (г.Оренбург, 19-20 ноября, 2013 г.). Реализация исследований результатов используются исследовательских работ исследования. при в ФГБУ Результаты выполнении «Российский проведённых плановых научный научноцентр 13 "Восстановительная травматология и ортопедия" имени академика Г.А. Илизарова». Подготовлены методические рекомендации и лекции, которые включены в программу кафедры усовершенствования врачей ФГБУ «РНЦ «ВТО» им. акад. Г.А. Илизарова». Публикации. По теме диссертации опубликовано 88 работ, из них 25 в академических изданиях, рекомендованных ВАК РФ, на научных форумах Всероссийского и Международного уровней представлено 30 докладов, подготовлены 2 методических рекомендации и 3 изобретения. Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 299 страницах машинописного текста (без приложения). Состоит из введения, 7 глав, заключения, выводов. Работа содержит 201 иллюстрацию, 33 таблицы (не считая таблиц приложения). В списке литературы 282 наименования, из них отечественных авторов – 152, зарубежных – 130. Приложение включает 14 таблиц и 4 рисунка. Диссертационная работа выполнена по плану НИР ФГБУ «РНЦ «ВТО» имени академика Г.А. Илизарова» Минздрава России, № госрегистрации 01201155770. 14 Глава 1. Современные гистологические сведения о строении суставного хряща. Суставной хрящ в норме и в условиях действия механических факторов. Изменения суставного хряща при чрескостном дистракционном остеосинтезе (обзор литературы) 1.1. Современные гистологические сведения о строении суставного хряща. Рост, физиологическая регенерация, инволютивные изменения. Суставной хрящ относится к категории гиалинового с той особенностью, что его свободная поверхность не покрыта надхрящницей. Ни одна из разновидностей хряща не испытывает в такой мере воздействий механических факторов, как суставной хрящ, что сказывается как на его строении, так и свойствах: он может подвергаться упругим деформациям и в то же время сохранять способность к обмену веществ и росту. Суставной хрящ состоит из клеточного компартмента и внеклеточного матрикса. Они находятся в тесной генетической, морфологической и функциональной связи друг с другом, представляя в целом единую тканевую систему. Клеточный компартмент составляет 5-10% тотального объёма, внеклеточный матрикс – 90-95% [28, 29, 30, 39]. С позиций клеточно-дифферонного состава хрящевая ткань относится к монодифферонным тканям. Дифферон хрящевой ткани: хондрогенные клетки – хондробласты – хондроциты. В типе растущих тканей, к которым относится хрящевая ткань, преобладают процессы роста. В таких тканях одновременно присутствуют клетки средней и конечной частей дифферона [28, 29, 30, 39, 165, 194, 195, 239]. Хондроциты формируются в результате дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток. Особенности слабодифференцированного состояния дифференцировки до старения и клеток от функциональной 15 дегенерации отражены в ряде работ отечественных и зарубежных исследователей [15, 54, 56, 57, 81, 84, 130, 261, 276, 282]. Основным условием индукции эмбрионального хондрогенеза является повышенная плотность пролиферирующих мезенхимальных клеток [56, 158, 187, 261, 276]. В дальнейшем клеткам хрящевой бластемы свойственны синтез коллагена II типа, преобладание синтеза хондроитин-4-сульфата над синтезом хондроитин-6-сульфата, минимальный митотический индекс, необратимость дифференцировки. В большинстве работ такие клетки именуются уже хондроцитами [15, 54, 81, 103, 158, 261]. Хондроциты участвуют в регуляции синтеза (анаболизм) и деградации (катаболизм) компонентов хрящевого матрикса, эти процессы в норме находятся в сбалансированном состоянии. Хрящевые клетки - имеют овальную форму. Они лежат в особых полостях межклеточного вещества – лакунах. В отличие от метаэпифизарного хряща в суставном хряще хондроцит занимает всю лакуну. Хондроциты часто образуют т.н. изогенные группы из 2-6 клеток, которые произошли из одной клетки. При этом некоторые хондроциты сохраняют способность к делению, а другие активно синтезируют компоненты межклеточного вещества [37, 38, 45, 156]. Структурно-функциональной единицей хряща является хондрон. В состав хондрона входят хондроцит, перицеллюлярный матрикс и перицеллюлярная капсула [42, 94, 160, 247, 262]. Уникальная роль хондроцитов состоит в продукции внеклеточного матрикса, который определяет форму и биомеханические свойства хряща [90, 92, 104, 230, 276]. Доказано, что один и тот же дифференцированный хондроцит синтезирует и секретирует как коллаген, так и протеогликаны одновременно. Хондроцит обладает значительной чувствительностью к содержанию протеогликанов в окружающем матриксе и быстро реагирует на его изменения [170, 171, 180, 276]. Внеклеточный матрикс состоит из трёх первичных компонентов: коллагена, протеогликанов и воды. В суставном хряще выявлено несколько иммуногистохимически определяемых типов коллагена: II, VI, IX, X и XI. Тип II - 16 доминирует, составляя 95% общего коллагена хряща [129, 186, 262]. Роль коллагеновых волокон хряща состоит в сопротивлении нагрузкам, возникающим при артикуляции [51, 90, 196, 246, 262]. Используя достижения сканирующей и трансмиссионной электронной микроскопии, Р.И. Еникеев (1988), I.C. Clarke (1971), De Bont Lambert G.M. et al. (1986), A.P. Gwynn et al. (2000) показали, что волокна располагаются параллельно суставным поверхностям в поверхностной, рандомически – в средней и перпендикулярно суставным поверхностям – в глубокой зонах [51, 175, 200, 214]. Второй главный компонент внеклеточного матрикса – протеогликаны. Протеогликаны состоят из сердцевинной протеиновой цепочки и одной или больше гликозаминогликановых боковых цепей [129, 145]. Боковые цепочки гликозаминогликанов не формируют организованных филаментов, они склонны ветвиться рандомически. Поскольку каждая дисахаридная единица гликозаминогликанов содержит, по крайней мере, одну отрицательно заряженную сульфатную или карбоксильную группу, они, по сути, являются длинными отрицательно заряженными цепями. Эти отрицательные заряды связывают большое количество молекул воды, которая составляет до 80% веса суставного хряща и обеспечивает способность хряща эффективно гасить ударные волны [166]. Гистохимически сульфатированные гликозаминогликаны выявляются при окраске тиазиновыми красителями. При этом возникает явление метахромазии, обусловленное наличием в субстрате кислотных групп, например –OSO32– и – COO–, от плотности расположения которых зависит цвет, интенсивность реакции [70, 106, 115]. Сульфатированные гликозаминогликаны играют основную роль в поддержании гомеостаза хрящевой ткани, обеспечивают её прочность, архитектонику, межклеточные взаимодействия, митогенную активность и рецепторную функцию клеток [55]. Именно гликозаминогликаны обеспечивают упругость матрикса в течение жизни, что и обусловливает высокую способность хряща к адаптации [40,41, 165, 176]. На гистологическом срезе суставного хряща отчетливо виден зональный полиморфизм хондроцитов. Клетки хряща на различной глубине залегания 17 отличаются друг от друга по объему, форме, репродуктивным свойствам, плотностью распределения в матриксе, ультраструктурной организацией и др. Различия структурно-функционального состояния генетически однородных клеток являлись следствием их адаптации к условиям, складывающимся в процессе морфогенеза самого суставного хряща [81, 253]. В суставном хряще различают три фенотипа хондроцитов. Хондроциты I типа характеризуется содержат умеренно эндоплазматическая немногочисленны. высоким ядерно-цитоплазматическим электронно-плотное сеть Они относительно способны ядро; комплекс слабо митотически отношением, Гольджи выражены, делиться, т.е. и вакуоли являются источником репродукции изогенных групп клеток. Преобладают в молодом, развивающемся хряще. Хондроциты II типа отличаются снижением ядерноцитоплазматического отношения. Это зрелые, высокодифференцированные, активные в секреторном отношении клетки, имеют высоко электронно-плотное неровной формы ядро; комплекс Гольджи и эндоплазматическая сеть хорошо развиты; постоянным цитоплазматическим включением является гликоген. Они обеспечивают образование и секрецию гликозаминогликанов и протеогликанов в межклеточное вещество. Хондроциты III типа отличаются самым низким ядерноцитоплазматическим отношением. Их ультраструктурные особенности свидетельствуют об активной секреторной деятельности. Клетки содержат значительные скопления гликогена. Эти клетки сохраняют способность к образованию и секреции белка (коллагена), но в них снижается синтез гликозаминогликанов [37, 92, 104, 253]. Хондроциты поддерживают высокий клеточный метаболизм, несмотря на ограниченную доступность нутриентов; это доказывается наличием крупного ядра с одним или более ядрышками и базофильной цитоплазмой [81, 234]. Цитоплазма большинства клеток вакуолизирована. В виде включений она содержит жир и гликоген, причем последний, преимущественно, в клетках молодых животных. Установлено, что гликоген накапливают хондроциты всех зон суставного хряща [110]. 18 Исследованию роли жировых включений посвящено значительное количество работ [21, 23, 34, 103 и др.]. Широко распространен взгляд, что жировые включения - это запас питательных веществ. Специальные исследования показали, что жировые включения имеются постоянно, не исчезают при голодании и находятся в связи с ростом хряща [21, 34]. Г.Г. Павлов (1988), В.Н. Павлова, Т.Н. Копьева, Л.И. Слуцкий, Е.В. Виноградова (2000), обнаруживая появление вакуолей, заполненных жиром, считают это признаком дегенеративного перерождения клетки [23, 103]. Поскольку хондроциты секретируют внеклеточный матрикс, они оказываются замурованными в характерные пространства, которые называют клеточными гнёздами или лакунами [91, 92, 103, 230, 276]. Методами поляризационной и электронной микроскопии при постановке гистохимических реакций на коллаген и гликозаминогликаны описаны три зоны: околоклеточный (перицеллюлярный) территориальный матрикс, в пределах которого выявляются макромолекулярные компоненты и идет их самосборка; территориальный, со интертерриториальный матрикс, сформированными в пределах которого макромолекулами; обнаруживается наибольшая степень организованности и упорядоченности макромолекул; структурная взаимосвязь и пространственная упорядоченность коллагена и гликозаминогликанов формируются в онтогенезе [92, 103, 170, 262]. Морфологически в суставном хряще выделяют несколько зон и построение хряща выглядит следующим образом: 1) поверхностный слой, отделенный от суставной полости тонкой бесклеточной пластинкой, в котором располагаются плоские хондроциты; 2) средний слой, содержащий округлые или овальные хондроциты со многими мелкими отростками; 3) радиальный или глубокий слой, где располагаются колонки хондроцитов между мощными радиальными пучками коллагеновых волокон межтерриториального матрикса и 4) обызвествленный слой (или зона кальцификации), отделенный от радиального слоя извилистой гематоксифильной линией. Эта базофильная линия не является мембранной 19 структурой, а представляет фронт минерализации на границе хряща и кости. Субхондральная костная пластинка непосредственно прилегает к установлено, что обызвествленному слою. С помощью современных методов исследования суставной хрящ имеет более сложное строение и это обусловлено разным функциональным значением отдельных его зон в разные возрастные периоды. Эти зоны более четко выражены в участках, подвергающихся постоянной механической нагрузке. На основании исследований с помощью световой и электронной микроскопии в суставном хряще взрослого различают семь зон, каждая из которых имеет определенные структурные и гистохимические особенности [26]. Результаты сканирующей электронной микроскопии показали, что рельеф суставной поверхности имеет регулярную волнистость – закономерные ундуляции и выпуклости [90, 103, 104, 175]. Изучение суставного хряща с помощью световой, фазовоконтрастной [193], сканирующей электронной микроскопии [176] подтвердило наличие бесклеточной пластинки. Бесклеточная пластинка покрывает суставной хрящ снаружи, не содержит клеток. Тонкая структура зоны изучена еще не полностью, но известно, что она содержит тонкие коллагеновые волокна и большое количество гиалуроновой кислоты, соотношение которых меняется с возрастом [176, 266]. Н.А. Волошин с соавт., (2009) показали, что бесклеточная пластика близка по строению к синовиальному слою капсулы. Бесклеточная пластинка играет важную роль в механизмах смазывания и трения суставной поверхности, нарушение ее целостности является одним из пусковых механизмов развития деструктивных заболеваний суставов [25, 26]. L.J. Sandell (2001) выделяет поверхностную тангенциальную зону, которая состоит из 1 - 2 слоев узких вытянутых клеток, ориентированных вдоль суставной поверхности, с ядром уплощенной формы [253]. По характеру и развитию органелл клетки поверхностной зоны относят к зрелым дифференцированным, но 20 малоактивным хондроцитам [91, 103, 230, 276]. Это подтверждается результатами стереометрического анализа – поверхностная плотность мембран гранулярной эндоплазматической сети хондроцитов наименьшая в поверхностной зоне и наибольшая – в базальной [242, 243]. Хондроциты в поверхностной зоне не имеют признаков репродукции [81, 91, 92, 103, 230]. Результаты исследований П.М. Мажуги (1999) показали, что высокое содержание гиалуроновой кислоты в верхних слоях поверхностной зоны создает особый метаболический фон, исключающий возможность прогрессивной дифференцировки хондроцитов. Они пребывают здесь как бы в незрелом состоянии [81]. По данным S.C. Gilmore Ruth, A.I. Palfrey (1988) плотность хондроцитов на единицу объема самая высокая в поверхностной зоне суставного хряща [195]. Матрикс основной части поверхностной зоны состоит из тесно прилежащих друг к другу пучков коллагеновых волокон диаметром 30-32 мкм. Строго тангенциально ориентированные коллагеновые волокна поверхностного слоя обеспечивают равномерное распределение внешнего давления по поверхности суставного хряща [103, 195]. Основное вещество содержит меньше, чем в других зонах сульфатированных гликозаминогликанов, о чем можно судить по незначительной альцианофилии; реакция на гликозаминогликаны усиливается по направлению к субхондральной кости [92, 129]. До настоящего времени обсуждается вопрос - является ли суставная поверхность гладкой или шероховатой. Ряд исследователей считают, что поверхность нормального суставного хряща не содержит погибших клеток, их можно наблюдать только при патологии [92, 103, 104]. Существует и другая точка зрения: результаты исследований W. Mohr (1986) и П.М. Мажуги (1999) позволяют утверждать, что в клетках и матриксе поверхностной зоны происходит их постепенное угасание, деградация и неизбежная гибель со стороны суставной «трущейся» поверхности. С разрушением хондроцитов и их элиминацией за пределы суставной поверхности одновременно слущиваются самые наружные слои матрикса [81, 230]. 21 Переходная зона суставного хряща состоит из клеток, меняющих форму от уплощенных в поверхностном слое к округлым у зоны изогенных групп. Зона изогенных групп расположена под переходной зоной. Клетки ее имеют овальную или округлую форму и большие размеры. В верхней части зоны они располагаются одиночно или парами, а в нижней части образуют изогенные группы из 3 - 4 клеток. Клетки данной зоны, особенно в верхнем отделе, молодые, функционально активные с четкими признаками пролиферации. В хондроцитах более глубоких слоев этой зоны хорошо развиты гранулярная эндоплазматическая сеть, аппарат Гольджи, митохондрии, а также разной величины и формы вакуоли, что отражает активное состояние в них метаболизма и биосинтеза, направленных на удовлетворение потребностей саморепродукции клеток и пополнение компонентов матрикса [81, 276]. По мнению ряда исследователей за счет клеток этой зоны осуществляется интерстициальный рост суставного хряща [92, 111]. Для большинства клеток характерно включение экзогенных 35 S-сульфата, 14 С-глюкозы, 3 Н-глицина, отмечено, что метки изотопов распределяются в хондроцитах с неодинаковой интенсивностью в одно и то же время на разных территориях. Это явление обусловлено тем, что в разных субпопуляциях хондроцитов структурное состояние, характер последовательно и изменяются интенсивность соответственно специфического их биосинтеза дифференцировке и направленности одних в сторону глубокой зоны, других - к поверхностной. Неоднородность хондроцитов в промежуточной зоне сопряжены с их ролью камбия для всей структуры суставного хряща [81]. Наибольшая численная плотность клеток типична для слоя, непосредственно прилежащего к поверхностной зоне [37, 92]. Глубокая зона суставного хряща – переходный слой между хрящом и костью – представляет собой фундамент суставного хряща, через который давление передается субхондральной кости. Ее принято делить на слои: радиальный (зона колонок и гипертрофированных клеток) и кальцификации. Зона колонок особенно четко выражена в участках, постоянно испытывающих 22 нагрузку. Клетки расположены в виде столбиков, содержащих по 2 - 6 клеток, направленных перпендикулярно поверхности хряща, имеют овальную, округлую или неправильную форму. По ультраструктуре хондроциты этой зоны являются зрелыми дифференцированными клетками. Колонки окружены полосой базофильного основного вещества. Зону колонок у растущего организма считают областью направленного роста хрящевого эпифиза. Можно предположить, что колонки у взрослых являются опорными структурами, расположенными в местах нагрузки [194, 195, 280]. Зона гипертрофированных клеток. В состав этой зоны входят гипертрофированные нижние клетки некоторых колонок, короткие колонки из гипертрофированных клеток и одиночные хондроциты, которые отличаются большими размерами (13х20 мкм), богатством органелл, обеспечивающих активные синтетические и секреторные процессы, отсутствием признаков деструкции. Цитоплазма большинства клеток вакуолизирована и содержит липидные и углеводные (гликоген) включения [103]. По существу это усиленно функционирующие хондроциты II и III типов. В настоящее время не решен вопрос: является ли увеличение их размеров следствием истинной гипертрофии, усиления трофики, пластического обмена, или это результат начинающихся дистрофических процессов при нарушениях обмена [104]. Ряд авторов функцию гипертрофированных хондроцитов связывают с процессом кальцификации. Вокруг клеток, заканчивающих свой жизненный цикл и разрушающихся (пузырчатый хрящ), отложения кальция снаружи цитоплазматической мембраны имеют вид грубых наложений [168, 194, 195, 280]. Зона дистрофии и первичной кальцификации. Верхняя граница этой зоны четко выражена, хотя базофильная линия еще не сформирована и наблюдается лишь в отдельных участках. Клетки этой зоны отличаются очень большими размерами, округлы, располагаются одиночно, парами или короткими неправильными колонками. По мере приближения к границе с костью в клетках отчетливо проявляются признаки нарастающей деструкции. Электронно- микросконически выявляются очаги кальцификации основного вещества. На 23 границе с костью местами видны сосуды, не окруженные костной манжеткой, и наблюдаются типичные участки энхондральной оссификации. В слое кальцификации имеется своеобразный участок, базофильная или пограничная линия “tidemark” (по Гонгадзе Л.Р., 1987). Согласно данным Л.Р. Гонгадзе (1987), В.Н. Павловой с соавт. (1988) пограничная линия суставного хряща взрослого человека содержит сложный набор таких компонентов, как белки, фосфолипиды, гликозаминогликаны, ферменты в больших, чем соседние участки матрикса, концентрациях [31, 32, 103]. Это не мембранная структура, а морфологически и гистохимически обособленный слой матрикса, который формируется на последних этапах энхондрального окостенения, присутствует у взрослых людей и млекопитающих, изменяется, но не исчезает с возрастом; она обеспечивает селективное проникновение веществ из кости в хрящ, имеет непосредственное отношение к транспорту воды, электролитов, продуктов метаболизма и солей кальция [32]. Результаты исследований Л.Р. Гонгадзе (1987), Н.А. Слесаренко (1994) позволяют утверждать, что базофильная линия предотвращает кальцификацию суставного хряща. Зона первичной кальцификации является промежуточным звеном между суставным хрящом и эпифизом [31, 32, 118]. Данная классификация структурных зон суставного хряща, как и любая классификация, в значительной степени условна. В настоящее время на практике при характеристике суставного хряща наиболее часто применяют классификацию, включающую четыре структурные зоны: поверхностную, промежуточную, глубокую и зону кальцифицированного хряща [116]. По данным электронной и световой микроскопии, наименее дифференцированные клетки в суставном хряще зрелых животных расположены в верхней части промежуточной зоны (переходная зона), а наиболее дифференцированные в глубокой зоне (зона колонок и гипертрофированных клеток) [81, 92, 276]. Зональные различия хондроцитов и матрикса свидетельствуют о том, что в суставном хряще клетки на различной глубине залегания находятся в 24 неодинаковых условиях питания, поэтому существенно различаются по метаболическим и биосинтетическим свойствам [81, 92, 103, 195, 276]. Суставной хрящ - аваскулярная структура. Обмен в нем осуществляется благодаря перемещению воды между компонентами матрикса, которая содержит все необходимые клеткам метаболиты. Питание суставного хряща осуществляется путем диффузии [226, 239]. Суставной хрящ имеет два источника питания: первый – синовиальная жидкость, омывающая обнаженный хрящ суставных поверхностей, второй – кровь в капиллярах субхондральной кости [29, 81, 103, 194, 230]. В суставном хряще, как и в других соединительных тканях, интерстициальное (межфибриллярное и межклеточное) пространство заполнено основным веществом (интегративно-буферной метаболической средой). Компонентами этой среды являются вода, протеогликаны, минеральные соли, молекулярные предшественники коллагена, плазменные белки. От качественного и количественного состава этой среды во многом зависят свойства суставного хряща и его жизнедеятельность [100]. Матрикс хряща благодаря агрегированным протеогликанам, пространственно ориентированным и создающим феномен переплетения и эффект исключенного объема, представляет собой своеобразное «молекулярное сито», которое регулирует диффузию низкомолекулярных продуктов обмена [55]. Особая роль в транспорте метаболитов принадлежит сульфатированным гликозаминогликанам, которые обладают ионообменной активностью [55, дифференциального 117]. В зависимости распределения от межклеточного объема и размерного матрикса определяют метаболическую активность суставного хряща [45]. Существование двух взаимодействующих, неразрывно связанных систем микроканалов различного диаметра, сообщающихся с лакунами хондроцитов и суставной полостью, и интерстициального пространства определяет пути транспорта продуктов метаболизма и перемещение жидкости. Это является одним из механизмов, посредством которого осуществляется регуляция жизнедеятельности суставного хряща и выполнение им своих биомеханических функций [45, 161, 162]. 25 Отсутствие в суставном хряще собственных кровеносных сосудов и уникальная топография хрящевого покрова в суставах, при которой его основание органически спаяно с подлежащей костью, а суставная поверхность омывается синовиальной жидкостью, явились обстоятельствами разногласий вопроса об источниках трофики суставного хряща. Большую роль в состоянии суставного хряща играет синовиальная оболочка. Через ее сосудистую сеть происходит удаление продуктов распада хондроцитов, поступление энергетических и пластических материалов в хрящевую ткань [16, 101, 102, 210]. Ведущая роль синовиальной жидкости как источника питания суставного хряща лежит в основе концепции В.Н. Павловой (1980) о синовиальной среде суставов [101]. По данным Павловой В.Н. с соавт. (2011), трофическая функция синовиальной жидкости заключается: в участии вместе с тканями хряща и синовиальной оболочки в процессах обмена между суставным содержимым и микроциркуляторными руслами структур сустава, включая и интерстициальные пути в бессосудистом суставном хряще; обеспечении поступления воды, электролитов и органических соединений в матрикс суставного хряща (особенно поверхностного и промежуточного слоев хряща); участии макрофагов и ферментов синовиальной жидкости в процессах лизиса клеток и разрушении матрикса структур сустава с последующим удалением их из суставной полости через лимфатическое русло [104]. По данным П.М. Мажуги (1999), синовиальная жидкость по своему составу и свойствам не может быть питательным субстратом. Из всех компонентов, входящих в состав синовиальной жидкости, в матрикс хряща физически способна проникать только гиалуроновая кислота, которая не может быть субстратом для питания клеток. Гиалуроновая кислота, обладая свойствами гидрофильности, способствует поддержанию в поверхностных слоях хряща необходимого тургора при высоком уровне внутритканевого ацидоза. Это не только исключает возможность дифференцировки хондроцитов, но и существенно тормозит 26 нормальную жизнедеятельность клеток по мере их приближения к суставной поверхности, где концентрация гиалуроновой кислоты самая высокая. Таким путем не может поступать к хондроцитам и кислород. Источником трофики суставного хряща является хорошо васкуляризованная подлежащая костная пластинка [81]. Питание суставного хряща со стороны кости достаточно хорошо выражено в коленном и тазобедренном суставах взрослого человека. Субхондральная костная пластинка в зоне непосредственного контакта с хрящом имеет микроскопические выступы, внутри которых располагаются кровеносные капилляры, часть из них проникает в зону кальцифицированного хряща, а в патологических ситуациях некальцифицированный кальцифицированного хрящ хряща – и [6, через 45, сохраняют базофильную 67, 194, 211, линию 231]. жизнеспособность в Клетки благодаря монолитному его слиянию с хорошо васкуляризованной костью. Особую роль выполняют гипертрофированные хондроциты глубоких слоев хряща. Цитоплазма в таких клетках находится в состоянии геля, удерживающего 85-90% воды. Такое гидрофильное содержимое клеток ставит их в положение посредников эффективного пути диффузии в хрящ питательных веществ и кислорода [81]. На основе данных литературы [6, 67, 194, 211, 231] диффузионный механизм питания суставного хряща со стороны субхондральной кости можно схематизировать следующим образом (Рисунок 1). В работах ряда авторов указывается, что в основе роста хряща лежит увеличение размеров клеток, их пролиферация, а также увеличение содержания межклеточного вещества [10, 81]. «Размер является важным признаком, по которому определяется зрелость и степень дифференцировки хондроцита. Молодые хондроциты, как правило, не имеют правильной сферической формы, они сплющены. Зрелые хрящевые клетки обычно больше по размерам и имеют округлую форму» [29]. 27 Рисунок 1 - Диффузионный механизм питания суставного хряща со стороны субхондральной кости. Согласно M.F. Meaney (1974), максимальная интенсивность метаболизма сульфатированных гликозаминогликанов наблюдается в начале онтогенеза, после чего интенсивность обмена существенно снижается. Известно, что к 20 годам жизни человека обмен гликозаминогликанов снижается почти в 6 раз по сравнению с новорожденными [229]. Ахмедов Ш.М. с соавт. (2002), при исследовании суставного хряща коленного сустава человека в подростковом возрасте выявили, что по сравнению с предыдущим возрастным периодом количество и объем клеток значимо уменьшаются, цитоплазменно-ядерное отношение незначительно увеличивается. В пожилом и старческом возрасте резко увеличиваются межклеточные расстояния, объем клетки и цитоплазменно-ядерное отношение. Появление крупных, светлых, безъядерных клеток в старческом периоде свидетельствует о нарастании и углублении дистрофического процесса [10, 11]. Физиологическое самовосстановление (физиологическая регенерация). В морфологии позвоночных дискуссионными до сих пор оставались вопросы, 28 касающиеся источников и механизмов структурного самоподдержания суставного хряща. Учитывая зональную неоднородность суставного хряща, различные исследователи высказывали противоречивые мнения о наличии какой-то определенной зоны, имеющей значение для его роста. Способность клеток глубокой зоны к активному делению позволяла говорить о зоне вставочного роста [62]. Но Цончев В.Т. и Философ Т. (1965) в этой зоне признаков деления хрящевых клеток не обнаружили. Авторы делают заключение, что механизм восстановления суставного хряща без сомнения существует, но осуществляется он неизвестным путем [132]. По данным В.П. Модяева (1983), в суставном хряще постоянно имеются признаки репродукции и отмирания клеток. Прямые и косвенные признаки деления хондроцитов (двуядерные клетки, тесные клеточные пары и др.) чаще всего встречаются в переходной зоне [92]. В настоящее время известно, что рост суставного хряща осуществляется за счет пролиферации хондроцитов и увеличения объема матрикса - интерстициальный рост или по-другому интуссусцептивный (вставочный) рост (Рисунок 2). За счёт деятельности хондроцитов происходит увеличение массы хряща изнутри [28, 29, 39, 81]. Рисунок 2 - Схема физиологической регенерации суставного хряща. 29 Как упоминалось выше, хондроциты промежуточной зоны образуют изогенные группы. Уже само явление изогении свидетельствует о способности клеток к саморепродукции, которая сохраняется в этой зоне в течение всей жизни. В настоящее время доказано, что формы клеточного деления в хрящевой ткани суставов – митоз и амитоз. Митотическое деление клеток происходит обычно в хряще растущих животных, главным образом в промежуточной зоне, по окончании роста животного митоз становится редким, преобладает амитоз [179, 213, 223]. Изменения деструктивные; хряща они с возрастом сопровождаются оцениваются как количественными дистрофически- и качественными изменениями отдельных биомолекул, дистрофией и деструкцией хондроцитов, гиалинозом, гомогенизацией и кальцификацией [23, 78]. Обычно дегенеративные изменения возникают в центральных областях хрящевой ткани в виде дегенерации. Пройдя путь своего развития, клетки хряща постепенно атрофируются и замещаются основным веществом. По данным Pilin A. et al. (2007), изменение в окраске тканей может быть маркером определенного возраста и развивающихся дистрофических изменений В [245]. цитоплазме хондроцитов происходит накопление липидов и электронноплотных включений. Последние, могут быть связаны с накоплением кальция. Известно, что митохондрии хондроцитов принимают участие в транспорте кальция и минерализации внеклеточного матрикса. При нарушении функции митохондрий, что наблюдается при дегенеративных изменениях хондроцитов, кальций остается в клетке и происходит ее минерализация [162]. С возрастом объемное отношение клетки/матрикс уменьшается, физиологическая дегенерация клеточных элементов хряща приводит к появлению в нем больших бесклеточных территорий [11, 22, 62, 88]. Число и толщина коллагеновых фибрилл увеличивается с уменьшением промежутков между ними. Межфибриллярная сеть протеогликанов становится более редкой, протеогликановые филаменты часто сливаются в гомогенные массы. Это приводит к перераспределению воды в хряще и, соответственно, других 30 водорастворимых компонентов, существенно влияя на метаболизм ткани. Было показано также, что возрастные изменения имеют выраженный индивидуальный характер и происходят несинхронно в хрящах разной топографоанатомической локализации. 1.2. Роль механических факторов в патогенезе остеоартроза. Одним из самых широко распространенных заболеваний суставов является остеоартроз. В настоящее время затруднена трактовка морфологических особенностей хряща при остеоартрозе ввиду сходности патологических и возрастзависимых изменений, особенно на ранних стадиях, а также из-за отсутствия установившегося представления о механизмах развития заболевания [5, 78, 103, 133, 135, 215]. Существенный вклад в раскрытие механизмов патогенеза остеоартроза вносят исследования суставов животных, подвергшихся различным воздействиям, в результате которых в тканевых компонентах суставов возникают изменения, аналогичные таковым при остеоартрозе у человека [89]. Существует множество методик, позволяющих получить дегенеративные изменения в суставном хряще. Известны способы экспериментального моделирования остеоартроза путем воздействия на сустав различных факторов: химических (стероидных препаратов, дексаметазона, папаина и др.); физических (воздействие жидким азотом); механических (компрессия, иммобилизация сустава) и травматических (дырчатый дефект, рассечение передней крестовидной связки, удаление части мениска и др.). Выбор того или иного метода зависит от цели исследования [36, 68]. По своей природе остеоартроз - заболевание полиэтиологическое. К факторам, индуцирующим развитие патологических процессов в суставном хряще и субхондральной кости, относятся механическое повреждение суставного хряща, изменение нормальной биомеханики сустава после травмы или хирургического вмешательства, инфекции, нарушение питания хряща, обменные нарушения, эндокринные дисфункции, интенсивные и длительные физические нагрузки [6, 67, 77, 133]. 31 Среди перечисленных причин остеоартроза особое значение придается механическому фактору, нарушению трофики и кровоснабжения сустава, обменных процессов в организме в целом и в тканях сустава в частности [45, 77, 80, 82, 95, 133, 218]. Основные изменения сустава происходят в суставном хряще [181, 231, 275]. В основе дегенеративно-дистрофических поражений суставного хряща лежит нарушение синтетических процессов, обуславливающих снижение репарации и преобладание деградации. Начальные события повреждения хрящевой ткани связаны со снижением синтеза гликозаминогликанов матрикса хряща [263]. В результате этих процессов хрящ истончается, становится шероховатым, мутным, менее упругим, в местах максимальной нагрузки появляются эрозии. При этом гистологически обнаружено разволокнение межклеточного вещества, гибель клеток, формирование глубоких узур, появление многоклеточных пролифератов, нарушение непрерывности базофильной линии, проникновение сосудов [16, 23, 103, 118]. С помощью современных количественных методов исследования на ранних стадиях остеоартроза выявлено уменьшение толщины хряща, уменьшение размеров клеток, коэффициента их формы, снижение количества ядер, их площади [5, 16, 131]. К настоящему времени установлено, что деградация хряща происходит медленно и сопровождается прогрессивным уменьшением количества протеогликанов, коллагена, гиалурона, ДНК. Катаболическая активность ткани при остеоартрозе высокая. Отмечается уменьшение в хряще лизосомных протеаз (катепсины) и нейтральных металлопротеаз. В то же время в хряще в эксперименте установлена высокая активность клеточного деления, вновь образованные клетки метаболически активны и синтезируют увеличенное количество коллагена, протеогликанов и гиалурона [78]. Имеющиеся методы оценки гистопатологии остеоартроза не являются оптимальными для выявления ранних стадий заболевания, а также недостаточно валидны и воспроизводимы. Международным обществом по изучению 32 остеоартроза (OARSI) разработана новая классификация гистопатологических изменений остеоартроза [248]. Большим достоинством предложенной системы является способность выявлять изменения на ранних стадиях (степень 1-3). Синовиальная оболочка, синовиальная жидкость и суставной хрящ образуют единую синовиальную систему. Именно в ней развертывается, в основном, патологический процесс при воспалительных и дегенеративных заболеваниях сустава [267]. Синовиальная оболочка — наименьшая по массе и объему, играет большую роль в состоянии суставного хряща [16]. Гистологически она представляет собой пласт соединительной ткани, состоящий из покровного, коллагенового и эластического слоев [69, 104]. Синовиальная оболочка в норме имеет известное количество складок и пальцевидных ворсин и формирует тонкий синовиальный слой (называемый иногда покровным слоем); в его состав входят слой покровных клеток, образующий выстилку несочленяющихся поверхностей сустава, и субсиновиальный поддерживающий слой, состоящий из фиброзно-жировой соединительной ткани различной толщины, которая соединяется с капсулой. Синовиальный слой часто сливается с субсиновиальной тканью путем плавного перехода от аваскулярного внутреннего покрытия, содержащего множество клеток, к васкуляризированной субсиновиальной соединительной ткани с меньшим количеством клеток, которая по мере приближения к соединению ее с фиброзной капсулой становится все более насыщенной коллагеновыми волокнами [16, 104]. Некоторые авторы отводят ведущее место в развитии дегенеративных процессов сустава латентному синовиту [252]. В то же время другие исследователи трактуют синовит как реактивный ответ на появление фрагментов хряща в синовиальной полости [131, 157]. В исследованиях ряда авторов [16, 50, 69] показано, что при дегенеративных заболеваниях суставов морфологические изменения синовии незначительны: нерезко выраженная гиперемия синовиальной оболочки, единичные лимфоидные инфильтраты. Артрозный процесс в синовиальной оболочке может проявляться с 33 самого начала в двух формах: воспалительной и невоспалительной, однако чаще наблюдаются невоспалительные изменения, сопровождающиеся атрофией синовиальных ворсин, покровных синовиоцитов и редукцией капилляров. В биоптатах наблюдаются преимущественно фиброзная, жировая, реже - рыхлая соединительная ткань. Интерес к изучению субхондральной кости возник благодаря появлению новых сведений о патогенезе остеоартроза, когда стало ясно, что данное заболевание проявляется не только потерей суставного хряща, но и изменениями в костной ткани, которые, возможно, являются первичными и способны инициировать деградацию хряща [6]. Различные варианты нарушения структуры субхондральной кости, отмеченные при дистрофических повреждениях суставного хряща, подтверждают тот факт, что степень морфологических изменений субхондральной кости соответствует глубине разрушения хрящевого покрова [52, 77, 211]. Прогрессирование дистрофических изменений суставного хряща приводит к более интенсивному ремоделированию субхондральной кости, которое в условиях дефекта костных клеток протекает с нарушением минерализации и увеличением объема остеоида [67, 222], что объясняет появление характерных нарушений ультразвуковой структуры субхондральной кости в виде разрыхления и повышения звукопроводимости [52]. Повышение давления на субхондральную кость в результате повреждения коллагенового компонента матрикса субхондральной кости суставного хряща сопровождаются и нарушение формированием кровоснабжения мелких участков остеонекроза и субхондральных кист, доминированием процессов резорбции в цикле костного ремоделирования [211, 272]. 1.3. Репаративная регенерация суставного хряща. Регенерация в общем виде проявляется в закономерном соотношении морфологической изменчивости структурных элементов (гетероморфия), временной организации процесса развития и регенерации клеток и тканей (гетерохрония) и пространственной организации составляющих элементов (гетерокинезис) [38]. за счет перемещения 34 Большинство тканей реагируют на повреждение однородным ответом, который включает три фазы. Первая фаза - некроз, который наступает немедленно после повреждения. Вторая фаза - воспаление, которое сопровождается вазодилатацией и повышением проницаемости сосудистой стенки. Это приводит к выпотеванию жидкости на раневой поверхности, последняя приносит фагоцитирующие клетки, разрушающие повреждённые ткани, и полипотентные стволовые клетки, способные формировать новую ткань. Третья финальная фаза стадия ремоделирования. На этой стадии формируется либо новая ткань, которая восстанавливает структуру и функцию оригинала, либо в дефекте развивается фиброзный рубец [224, 225]. Все хрящи, но особенно хрящи опорно-двигательного аппарата постоянно подвергаются микротравматизации. Учитывая большую социальную значимость заболеваний крупных суставов, регенерация хряща является одним из наиболее актуальных вопросов, связанных с морфологией и функцией суставного хряща. Способность хряща к репаративной регенерации лимитирована двумя факторами: отсутствием прямого кровоснабжения и особенностями структуры. Аваскулярная природа хряща делает невозможным развёртывание воспалительной фазы и миграцию стволовых клеток в хрящ. Плотный внеклеточный матрикс формирует физический барьер для миграции в дефект существующих хондроцитов. Особенностью хрящевой ткани, по сравнению с другими видами тканей в организме, является то, что в ней мало клеток, и они окружены большим количеством межклеточного пространства. На основании способности к клеточному обновлению, хрящевая ткань относится к тканям растущего типа, для которой характерно постепенное снижение митотической активности. Хотя хондроциты продуцируют матрикс на протяжении всей жизни, эта продукция не может обеспечить потребности, которые развиваются после повреждений суставного хряща. При неглубоких повреждениях хрящевая ткань мобилизирует свои регенераторные возможности в виде пролиферации хондроцитов, внутриклеточной гипертрофии и фибробластической их трансформации [103, 133, 225]. 35 Репаративная регенерация суставного хряща выражается в возбуждении пролиферативных и секреторных возможностей хондроцитов [103, 134, 205]. Установлено, что хондроцит в ответ на повреждение начинает делиться, однако, избыточная пролиферация не ведет к увеличению секреторно-активных клеток. В процессе заживления не все клетки способны к делению. Во вновь формирующихся изогенных группах часть хондроцитов активно синтезирует коллаген и протеогликаны. Увеличение числа активно продуцирующих клеток, способных создавать новые участки матрикса – основной восстановительных процессов в суставном хряще. взаимосвязаны, и именно этим определяется источник Оба процесса тесно и пролиферация, и дифференцировка, и жизнеспособность восстанавливающегося хряща [37,73, 75, 103, 104]. Вплоть до настоящего времени вопросы о механизмах клеточной гибели, регенерации суставного хряща и ее источниках при разных видах повреждения остаются дискутабельными. Реакция клеток на повреждение зависит от типа, продолжительности действия, тяжести повреждающего фактора. Некроз и апоптоз признаются разновидностями клеточной смерти. Особую роль апоптоз играет в развитии остеоартроза, связанного с нарушением биомеханики суставов [16]. Установлено, что механическое давление на хрящ ведет к увеличению секреции оксида азота, сопровождающемуся развитием апоптоза значительной части хондроцитов [131]. Образуемые хондроцитами апоптотические тела проявляют функциональные свойства (содержат щелочную фосфатазу, преципитируют кальций), которые могут способствовать кальцификации хряща [154, 202]. Недостаточно выяснены вопросы о возможности и месте пролиферации хондроцитов. Учитывая зональную неоднородность суставного хряща, исследователи высказывали различные мнения о наличии какой-то определенной зоны, имеющей наибольшее значение для его роста и восстановления. По данным ряда исследователей [81, 103, 230, 276] в суставном хряще постоянно имеются признаки репродукции и отмирания клеток. Прямые и косвенные признаки 36 деления хондроцитов (двуядерные клетки, тесные клеточные пары и др.) чаще встречаются в промежуточной зоне. Хондроциты промежуточной зоны сохраняют способность пролиферировать в течение всей жизни и выполняют роль камбия для всей структуры суставного хряща. Возможность репродукции клеток глубокой зоны подтверждена рядом исследователей [81, 276], которые обнаружили в глубокой зоне хряща клетки с фигурами митотического деления. Результаты исследований ряда авторов позволяют считать хондроциты поверхностной зоны резервными клетками, а поверхностную зону – зоной резервных клеток, так как при действии ряда факторов в период восстановления часть клеток поверхностной зоны подвергается делению [91, 103, 179]. Хрящ может регенерировать за счет собственного потенциала (размножение хондроцитов и рост матрикса) и, что не менее важно, за счет других видов соединительной ткани, которые имеют общее с ним происхождение. При повреждении хряща источниками регенерации являются:1) сам хрящ; 2) синовиальная оболочка сустава, нарастающая с краев дефекта и превращающаяся в хрящеподобную ткань; 3) костные клетки, которые могут трансформироваться в хрящевые; 4) клетки костного мозга, которые могут служить источником регенерации при глубоких повреждениях хрящей в сочетании с костным повреждением [104]. По-видимому, степень и качество регенерации хряща зависит от глубины его повреждения, площади поврежденного участка и от условий существования хряща после повреждения. При частичных повреждениях суставного хряща значительную роль играет синовиальная оболочка, нарастающая с краев дефекта [18, 103, 235]. Исследователи полагают, что главная причина неспособности хряща к восстановлению - отсутствие доступа стволовых клеток. Если эта гипотеза верна, то индукция миграции стволовых клеток должна обеспечить восстановление. Одна из идей состоит в обеспечении контакта суставного хряща и костного мозга, который является богатым источником мезенхимальных стволовых клеток [165, 228, 254]. Субхондральное рассверливание инициирует рост ткани в 37 рассверленном отверстие. Однако образованная ткань не включается в хрящ и быстро рассасывается [254]. Ограниченные способности суставного хряща к регенерации привели к развитию заместительных операций: пересадка надкостницы, надхрящницы, пластика костно-хрящевыми ауто- и аллотрансплантатами, «костномозговая стимуляция», применение метода клеточной и тканевой инженерии [13, 76, 83, 112, 151, 177, 182, 199, 209, 219, 238, 274]. Каждый из этих методов успешно применяется, но может лишь частично помочь восстановлению функционирования сустава. Ни один из этих способов не приводит к образованию гиалинового хряща, способного выдерживать нагрузку, которая прилагается к суставу в естественных условиях. Проблема заключается в том, что после трансплантации жизнеспособные хондроциты обладают пониженной пролиферативной и синтетической активностью [76]. Это послужило основанием для разработки новых подходов в лечении дефектов хряща на основе культивирования клеток [199, 238, 274]. Известно, что лабораторные условия культивирования, при которых выращиваются тканево-инженерные конструкции, не повторяют физиологическое микроокружение, которое существует в хрящевой и костной тканях. Высокая трудоемкость и стоимость процесса культивации ограничивает применение этого метода. В настоящее время среди способов стимуляции рапаративного остео- и хондрогенеза широкое распространение получили субхондральная туннелизация, абразия и формирование микропереломов субхондральной кости, объединенные названием – «костномозговая стимуляция» [46, 84, 165, 234]. Однако особенности строения регенератов, туннелизации, мало образующихся изучены и после применения недостаточно субхондральной согласованы с реальным восстановлением функции коленного сустава. Вновь образующая ткань, носит характер скорее соединительнотканной, чем хрящевой, значительно отличается от нормального хряща по биомеханическим и биохимическим свойствам, чем нарушает гомеостаз синовиальной среды сустава [46, 74, 75, 76, 237]. 38 Таким образом, самостоятельное восстановление хряща после глубокого повреждения никогда не бывает полным. Добиться реституции сустава удается редко. В связи с этим, с целью обеспечения положительного анатомофункционального результата в настоящее время актуален поиск более эффективных способов стимуляции и оптимальных условий репаративной регенерации суставного хряща. Регулирующая роль механических факторов особенно существенна в отношении суставных хрящей, для которых механическая функция является главной. Механическое сжатие является одним из факторов, способствующих приобретению мезенхимными дифференцировка происходит, клетками если фенотипа мезенхимные хондроцитов. клетки Такая подвергаются сочетанному действию компрессии и понижения концентрации кислорода. Напротив, растяжение предотвращает хондрогенез, и мезенхима дифференцируется в фиброзную соединительную ткань, особенно при сочетании растяжения с повышением концентрации кислорода. Соответственно, содержание и биосинтез протеогликанов выше в глубоких слоях суставных хрящей, чем в поверхностных [190, 227]. Основной причиной деструкции хряща является несоответствие между механической нагрузкой на суставной хрящ и его возможностью сопротивляться этому воздействию. О включении механического компонента в патогенез свидетельствует локализация очагов деструкции в участках высокой нагрузки на хрящ [98, 103]. Г.Г. Помогайбо (1989) отмечал: «С увеличением продолжительности физической нагрузки в суставном хряще нарушается организация базофильной линии, кровеносные сосуды с напластыванием вокруг них костной ткани в виде пиков проникают вплоть до глубокой зоны» [107]. Гипокинезия, связанная с частичным выключением функции конечности при лечении переломов костей (гипсовая иммобилизация), играет ведущую роль в механизме изменений структуры суставного хряща. Длительное ограничение 39 движений в суставе влечет уменьшение массы хрящей и понижение концентрации протеогликанов в матриксе [265]. Н.А. Слесаренко с соавт. (1989) установили, что условия гипокинезии способствуют ослаблению трофики суставного хряща: утолщенная субхондральная пластинка создает определенную микродистанцию между подлежащими капиллярными терминалями и хрящевым покровом [119]. Механические факторы могут оказывать прямое действие на метаболизм хондроцитов, усиливая или угнетая синтез протеогликанов [93]. Одним из моментов, обусловливающих эти метаболические нарушения, является отсутствие в неподвижном суставе перемешивания синовиальной жидкости, приводящее к замедлению диффузии молекул в хрящевую ткань и, следовательно, к ухудшению питания хондроцитов [41, 101, 102]. Несомненная роль в развитии дистрофии от бездействия принадлежит и недостаточности прямой механической нагрузки на хондроциты [240, 269]. При иммобилизации сустава выявлены истончение, расщепление и некроз хряща [33, 136, 169, 265]. A. Trias (1971), изучая воздействие постоянного давления на суставной хрящ, установил, что дегенерация его в значительной степени является результатом неправильного распределения давления по поверхности сустава. Симптомами повреждения хряща было его прогрессирующее истончение и исчезновение «клеточной границы» хондроцитов [268]. При этом, Crelin E. S., Southwick W. О. еще в 1960 году отмечали, что при действии постоянного давления на суставной хрящ, в его поверхностной зоне были обнаружены фигуры митоза [179]. В хрящах суставов, подвергаемых усиленному сжатию, содержание протеогликанов выше, чем при нормальных условиях [172]. Работы отечественных и зарубежных исследователей показали, что основным условием успешной репарации хряща является обеспечение ранней функции сустава [24, 75]. J.S. Wayne с соавторами (2001) отмечали улучшение качества новообразованного хряща при восстановлении компрессии и стресса от 40 сдвига [273]. Механические стрессы на определенном этапе необходимы биологическим материалам для созревания и поддержания гомеостаза [14, 185, 264]. В то же время механические условия – это единственный барьер для создания полезной модели изучения регенерации хряща [183]. 1.4. Методы количественной оценки изменений суставного хряща у животных и человека. На данный момент существует необходимость разработки способов объективной комплексной количественной морфологической оценки репаративных и адаптационных изменений суставного хряща при суставной патологии. При изучении закономерностей репаративного хондрогенеза многие авторы в качестве экспериментальной модели используют коленный сустав собаки [24, 83, 189, 257]. Общеизвестно, что зоны гиалинового хряща коленного сустава собаки и человека сходны по расположению и строению, что важно при экстраполяции экспериментальных данных [46]. Суставной хрящ мыщелков бедра – одна из наиболее часто страдающих зон [92, 103], при распознавании причин патологических изменений которого (хондропатий) могут возникать большие трудности, непреодолимые методами клинического исследования. В таких случаях, если условия позволяют, патолог исследует биопсийный материал. Учитывая, что качественная оценка высокосубъективна, возникает необходимость применения количественных методов исследования, которые повышают информативность морфологического анализа, позволяют сравнивать результаты, полученные разными исследователями и во временной динамике [3, 17, 20, 97]. При изучении влияния различных факторов на состояние суставного хряща существует необходимость разработки способов объективной комплексной количественной морфологической оценки его деструктивно-репаративных и адаптационно-пластических изменений. Для определения степени отклонения гистоморфометрических характеристик суставного хряща от нормы возникает необходимость сравнения их с аналогичными параметрами суставного хряща интактных животных. 41 Первые морфометрические исследования суставного хряща, выполненные на светооптическом уровне, были связаны с двумерным анализом тканевых структур. В таких исследованиях главными параметрами были толщина хряща и плотность клеточных профилей [201, 260, 271]. Толщина целлоидиновых (15-20 мкм) и парафиновых (5-10 мкм) срезов сопоставима с размерами исследуемых структур и не позволяет четко дифференцировать границы хондроцитов, проводить морфометрические исследования без поправок на эффект Холмса. Для суставного хряща (диаметр хондроцитов 10–20 мкм) оптимальными являются срезы толщиной 0,5-1 мкм; изготовить качественные парафиновые срезы такой толщины проблематично, требуется более плотная заливочная среда – например, эпоксидные смолы. В литературе известны морфометрические исследования суставного хряща по эпоксидным полутонким срезам [242]. В работе представлены методические приемы ручной морфометрии, авторы определяли параметры - толщина хряща и его зон, численная плотность клеток (точечный счет). Данный метод требовал значительных временных и технических затрат, кроме того определение ряда параметров (ядерно-цитоплазматического индекса, объемной плотности клеток по зонам) невозможно, из за недостаточного количества анализируемых полей зрения. Возможности использования полутонких эпоксидных срезов ограничивает их малая стандартная площадь — до 1 мм2, затрудняющая получение репрезентативных выборок изображений для стереологических исследований. Количественные методы оценки структурной организации хряща многочисленны, некоторые из них [208] включают несколько технологий изготовления препаратов (срезы толщиной 200 мкм для люминесцентной и конфокальной лазерной микроскопии и стандартные полутонкие срезы). Связано это с тем, что на толстых срезах невозможно определить цитологические параметры, а площадь полутонких не позволяет оценить зональную организацию и измерить толщину хряща. Использование многочисленных первичных, 42 вторичных и даже третичных параметров, многие из которых дублируют друг друга [208], неоправданно. Мультипараметрический подход должен увеличить информативность количественного анализа, но не трудности интерпретации данных. Для того чтобы проводить морфометрию без поправок на эффект Холмса [97, 147], необходимо применять тонкие парафиновые срезы (1-2 мкм) недекальцинированного суставного хряща, качественное изготовление которых проблематично. У стандартных полутонких эпоксидных срезов малая площадь – до 1 мм2. Это затрудняет получение репрезентативных выборок изображений для стереологических исследований. Источником дополнительной информации может быть количественный анализ цветовых характеристик, обычно описываемых лишь словесно (выраженная базофилия цитоплазмы, слабая метахроматическая окраска, резко эозинофильная зернистость и т.п.). Известны полуколичественные методы визуальной экспертной оценки количества осадка красителя в баллах. В медикобиологических исследованиях порядковые шкалы используются довольно часто. Так, Д.А. Новиков, В.В. Новочадов (2005) разработали морфологическую шкалу оценки заживления поврежденного суставного хряща. Максимальным количеством баллов (до 20) оценивали такие критерии, как клеточный состав ткани, степень заполнения дефекта и восстановление субхондрального слоя кости. Авторы отмечают, что использование порядковой шкалы в современных исследованиях нежелательно, хотя и не исключено [99]. Анализ современной литературы свидетельствует, что в единичных исследованиях разрабатываются способы количественной оценки цвета по цифровым изображениям [203, 281]. Один из показателей биосинтетических потенций суставного хряща – состояние его неклеточного матрикса, в частности - протеогликанов. Они обеспечивают прочность хряща, его архитектонику, митогенную активность, рецепторную функцию клеток и межклеточные взаимодействия [55]. Полианионный характер протеогликанов, обусловленный наличием кислотных 43 групп, определяет их гистохимические свойства, в первую очередь метахромазию – способность изменять цвет катионных красителей [70, 115]. В суставном хряще изменения реакции метахромазии характеризуют сдвиги его структурной организации в различных экспериментальных [216] или патологических условиях [256]. Возможность количественно оценивать интенсивность метахромазии в топографически различных участках хряща позволяет определять природу химических сдвигов, так как известна [70] зависимость устойчивости и степени выраженности реакции метахромазии от плотности расположения свободных анионных групп в молекулах субстрата. 1.5. Изменения суставного хряща при чрескостном дистракционном остеосинтезе. Удлинение укороченных конечностей, несмотря на значительные достижения в этой области ортопедии, до сих пор остается актуальной проблемой, требующей решения на новом теоретическом и технологическом уровнях [49]. В вопросах удлинения конечностей важное место занимает проблема сохранения функциональных возможностей суставов. Широкое внедрение в клиническую практику чрескостного дистракционного остеосинтеза вызывает необходимость углубленного изучения процессов, происходящих в смежных с удлиняемым сегментом конечности суставах, поскольку сохранение их функциональных возможностей имеет очень большое значение для медицинской, социальной реабилитации и улучшения качества жизни пациентов. Реакция суставов на удлинение конечности аппаратом Илизарова отмечалась в клинике многими авторами [48, 63, 139, 140, 143, 150, 204, 221]. По мнению исследователей, в процессе дистракционного остеосинтеза сустав подвергается действию комплекса факторов, однако значение каждого из них еще не получило полной теоретической оценки. Вынужденное ограничение функции удлиняемой конечности сопровождается изменением распределения нагрузки на суставные поверхности, изменением состояния сосудистого русла, длительным раздражением периферических нервов, что влечет нарушение трофики костной 44 ткани и компонентов сустава с развитием функциональных нарушений [48, 63, 123, 124, 125, 141, 149]. Под действием постоянной сдавливающей нагрузки, создаваемой аппаратом для чрескостного остеосинтеза, возникает статическая перегрузка, происходят дегидратация и уменьшение толщины суставного хряща. При этом ослабевает или выключается диффузионный механизм питания, что приводит к дегенеративнонекробиотическим изменениям, накоплению метаболитов, продуктов клеточного распада и протеолитических ферментов, вызывающих дезорганизацию матрикса хряща [12, 124]. Биохимические исследования, выполненные в РНЦ «ВТО», показали, что при удлинении голени методом чрескостного дистракционного остеосинтеза в гиалиновом хряще не только оперированной, но и контрлатеральной конечности происходят изменения его химического состава, показателей обмена гликозаминогликанов и обусловленных ими механических свойств [79, 86, 87, 138]. Установлено увеличение доли мономеров и протеогликанов низкой степени агрегации, уменьшение количества протеогликанов, входящих в состав суперагрегатов и прочно связанных с коллагеном, наибольшее снижение агрегированности протеогликанов наблюдалось в период фиксации [79, 86]. Ухудшение упругих свойств суставного хряща, коррелирующих со снижением гидратированности, содержанием протеогликанов и коллагена, тем существеннее, чем продолжительнее эксперимент [33, 79]. Вместе с тем, результаты биохимических исследований дают основания считать, что при подобных изменениях суставной хрящ сохраняет высокую способность к реституции [86]. Различия в структуре и составе протеогликанов суставного хряща собак аналогичны в экспериментах по удлинению конечности и в онтогенетическом развитии [33]. Вопрос о морфологических изменениях в суставном хряще в зависимости от условий удлинения конечности изучен недостаточно. В литературе встречаются лишь единичные работы, освещающие отдельные аспекты этой проблемы. 45 При экспериментально-морфологическом исследовании коленного сустава при удлинении большеберцовой кости с суточным темпом 1 мм за 1 прием на 20℅ от исходной длины, были выявлены дегенеративные изменения в суставном хряще - очаговый поверхностный некроз, паннус, васкуляризация со стороны субхондральной кости, которые подвергались обратному развитию под влиянием нормализации функции конечности [121, 122]. При гистологическом исследовании суставного хряща в условиях дозированного удлинения смежного сегмента конечности с темпом 1 мм за 2 приема и 0,75 мм за 1 прием на 30% от исходной длины зарубежными исследователями были отмечены истончение, разволокнение суставного хряща, снижение интенсивности метахромазии межклеточного вещества, в части наблюдений выявлены некротические изменения [189, 232, 233, 257, 258]. Авторы предполагают, что глубина изменений суставного хряща зависит от длительности периода дистракции и фиксации конечности в аппарате. По мнению E. Nakamura, H. Mizuta, K. Takagi (1995), увеличение дробности дистракции может предотвратить повреждения смежных суставов [233]. Одной из актуальных задач удлинения конечности, требующих теоретического и практического решения, является выбор оптимального дифференцированного темпа дистракции в зависимости от индивидуальных особенностей пациента, максимальное повышение дробности дистракции с помощью автоматических устройств. В РНЦ «ВТО» высокодробная дистракция в автоматическом режиме начала внедряться в 80-90е годы прошлого века [53, 59, 60, 137]. Преимущества автоматической дистракции неоспоримы, применение автоматических дистракторов позволило снизить травматичность хирургической коррекции и приблизить адаптивные реакции растяжения к естественным процессам роста [59, 199]. Высокая дробность дистракции (1 мм за 60 и более импульсов в сутки) по сравнению с ручной (1 мм за 4-6 приемов) приближают процесс удлинения конечности к естественному физиологическому росту. При этом не происходит скачков дистракционных усилий, которые обуславливают постоянную микротравматизацию и раздражение нервно-мышечного аппарата, 46 нервных и сосудистых стволов, что приводит к нежелательным нейротрофическим реакциям, сдерживающим процесс регенерации. Иными словами, создаются благоприятные условия для регенерации тканей [137]. При удлинении голени собак аппаратом Илизарова на 14-16 % от исходной длины с суточным темпом 1 мм в двух режимах: за 60 приемов (автодистракция) и за 8 приемов (ручные подкрутки) в суставном хряще наружного мыщелка бедра были выявлены структурно-функциональные изменения реактивного и/или деструктивно-репаративного характера, степень которых зависела от величины разового удлинения. Наиболее интенсивно деструктивные изменения были выражены при 8-кратной дробности дистракции. При этом регенерация хряща осуществлялась за счет активизации пролиферативных и биосинтетических процессов. Выраженность процессов пролиферации и биосинтеза в суставном хряще при разных режимах дистракции различна и зависела от степени повреждения. При 8-кратной дробности дистракции в суставном хряще были более выражены пролиферативные процессы, при 60-кратной – биосинтетические. К концу эксперимента при автодистракции репаративная регенерация по типу реституции завершалась формированием суставной поверхности, приближающейся по структуре к интактной, при 8-кратной дробности дистракции регенерация суставного хряща имела незавершенный характер [148]. При количественном исследовании на клеточном уровне – цито- и кариометрии наиболее ярко выражены изменения хондроцитов неповрежденных участков поверхностной зоны. На всех этапах эксперимента в неповрежденных участках поверхностной зоны наблюдалось увеличение параметров, характеризующих размер, форму клеток и их ядер, за счет увеличения в большей степени объемной доли цитоплазмы. Выявлено снижение ядерно- цитоплазматического индекса, что свидетельствовало об активно развивающихся процессах внутриклеточной регенерации (гипертрофии, гиперплазии структурных компонентов). Максимальные количественные характеристики клеток промежуточной и глубокой зон были выявлены в конце периода фиксации [126]. 47 Изменения в коленном суставе при удлинении голени зависят и от уровня остеотомии большеберцовой кости [122]. В единичных публикациях имеются сведения о гистологических изменениях суставного хряща при диафизарном удлинении голени диафизарного экспериментальных удлинения доказаны животных в [233]. Преимущества экспериментальных исследованиях зарубежных и отечественных авторов [105, 167, 191, 259, 279], однако в клинике наиболее часто отдаётся предпочтение метафизарному и метадиафизарному удлинению. Таким образом, анализ специальной литературы свидетельствует об отсутствии единой методологии исследований суставного хряща на разных уровнях структурной организации (органном, тканевом, клеточном) с применением морфо- и стереометрических методов исследования. Кроме того не решены проблемы получения репрезентативной выборки при исследовании полутонких срезов, количественного анализа цвета по цифровым изображениям суставного хряща, в частности с целью анализа реакции метахромазии. Дальнейшее развитие направления по выбору оптимального темпа и ритма дистракции требует изучения состояния физиологических резервов, резистентности и адаптивности тканей удлиняемой конечности в зависимости от режима дистракции, в том числе адекватной оценки реактивных изменений и репаративных потенций суставного хряща, которая невозможна без сопоставления с данными о его изменениях в периоды интенсивного онтогенетического роста, естественной возрастной инволюции и при биомоделировании дегенеративно-дистрофических заболеваний (остеоартроза). 48 Глава 2. Материал, методика эксперимента, методы исследования 2.1. Материал исследования, методика эксперимента. Объект исследования - суставной хрящ мыщелков бедра с подлежащей субхондральной костью, синовиальная оболочка интактных собак в возрасте 1,5-2 лет (n=7) и собак такого же возраста, которым удлиняли голень (n=79). Кроме того, изучены морфологические особенности суставного хряща и синовиальной оболочки при естественном растяжении смежного сегмента конечности в условиях физиологического роста собак, возрастные изменения (щенки в возрасте от 2 до 10 месяцев, животные в возрасте 5-8 лет, n=18) и при моделировании остеоартроза (n=20). Весь материал (n=124, приложение, таблица 1-7) распределен на 9 экспериментальных серий: серия - возрастные изменения; серия – модель остеоартроза; контрольная серия - интактные животные; и семь серий, в которых животным удлиняли голень, используя разные режимы дистракции и способы нарушения целостности кости. Характеристика опытов с удлинением голени представлена в таблице 1. Таблица 1 - Характеристика опытов с удлинением голени № п.п. 1 2 3 3А 4 4А 5* ДИСТРАКЦИЯ скорость длительность дробшаг (мм/сутки) (дней) ность (мм) 1,0 28 4 0,25 1,0 28 8 0,125 1,0 28 60 0,016 1,0 28 60 0,016 3,0 10 180 0,016 3,0 10 120 0,025 1,0 28 4 0,25 Примечание * - метадиафизарное удлинение. Кол-во опытов режим время (n) суток ручной дневное 18 ручной дневное 10 авто дневное 12 авто ночное 10 авто круглосут. 9 авто круглосут. 14 ручной дневное 6 49 В 1 - 4А сериях нарушение целостности большеберцовой кости осуществляли путем флексионной остеоклазии (Рисунок 3), заключающейся в статическом изгибе с помощью специального поднадкостничного перелома с сохранением аппарата до костного мозга, получения экстра- и интраоссальных сосудов [61]. Рисунок 3 - Схема нарушения целостности большеберцовой кости путем флексионной остеоклазии. Фиксацию костных фрагментов производили аппаратом Илизарова, состоящим из четырех опор. Через 5 суток после операции у всех опытных животных начинали дозированное удлинение правой голени на одинаковую величину – 28 мм (≈15%), но в разных режимах. В 1-й и 2-й сериях удлинение осуществляли в течение 28 суток путем ручного поворота гаек на резьбовых стержнях аппарата с темпом 1 мм, но с разной дробностью. В 1-й серии – за 4 приема (величина разового удлинения 0,25 мм), во 2-й серии за 8 приемов (величина разового удлинения 0,125 мм). В сериях 3, 3А, 4 и 4А удлинение достигали с помощью автоматического дистрактора конструкции Г.А. Илизарова, А.П. Предеина, В.М. Быкова (1986) [58], в 3-й и 3А 50 сериях в течение 28 суток с темпом 1 мм за 60 приемов (величина разового удлинения 0,017 мм), в 3-й серии в дневное, в 3А серии в ночное время, в 4-й и 4А сериях в течение 10 суток с темпом 3 мм за 180 и 120 приемов соответственно (величина разового удлинения 0,017 мм и 0,025 мм). После прекращения дистракции костные фрагменты фиксировали аппаратом до формирования корковой пластинки в регенерате, затем аппарат снимали и животных наблюдали еще в течение месяца. Морфологическое исследование проводили на этапах эксперимента: конец дистракции, месяц фиксации и месяц после снятия аппарата. В пятой серии 6-ти собакам была выполнена поперечная остеотомия долотом большеберцовой кости на уровне проксимального метадиафиза и остеосинтез аппаратом Г.А.Илизарова. Через 5 суток после операции начинали дистракцию по 1 мм в день за 4 приёма (шаг дистракции 0,25 мм). В течение 28 суток величина диастаза между костными фрагментами достигала 14-15% исходной длины. Затем в течение 35 суток голень фиксировали в аппарате до момента консолидации костного регенерата, после чего аппарат снимали и животных наблюдали еще в течение месяца. Морфологическое исследование проводили на этапах эксперимента: конец дистракции и 30 суток после снятия аппарата. В эксперименте по моделированию остеоартроза исследование выполнено на 20 беспородных собаках в возрасте 1,5-2 лет. В настоящее время развитие дегенеративно-дистрофических процессов при гонартрозе связывают с нарушением функции сустава и микроциркуляции в суставных концах, с последующим развитием застойных явлений [78, 82, 133, 151]. Учитывая эти данные, моделирование остеоартроза осуществляли путем иммобилизации обоих коленных суставов с пересечением бедренной артерии [Макушин В.Д., Степанов М.А., Ступина Т.А. Патент 2452999 РФ]. Для этого у наркотизированных животных, после обработки операционного поля, с медиальной поверхности бедра через прямолинейный разрез мягких тканей выделяли бедренную артерию 51 на уровне средней части бедренной кости, лигировали ее на двух уровнях и пересекали между лигатурами (Рисунок 4). А Б Рисунок 4 - Пересечение бедренной артерии у собаки. А - уровень пересечения. Б – этап операции. Операционную рану ушивали послойно. После этого коленный сустав иммобилизировали аппаратом Илизарова, состоящим из двух дугообразных опор, соединенных шарнирными узлами с резьбовыми хвостовиками. Одна из опор располагалась в нижней трети бедра, другая в верхней трети голени. В качестве костных фиксаторов использовали спицы Киршнера, по три на каждой опоре (Рисунок 5). Рисунок 5 - Иммобилизация коленных суставов аппаратом Илизарова. 52 После операции все животные получали анальгетики и антибиотики широкого спектра действия в соответствующих дозировках. Период иммобилизации составил от 28 до 40 суток. С целью подтверждения адекватности полученной модели собак для морфологического исследования выводили из опыта через 28 суток и через 40 суток после иммобилизации. Остальных животных выводили из опыта через 14, 28 и 90 суток, 1 и 3 года после моделирования остеоартроза (период иммобилизации - 28 суток). При проведении экспериментов соблюдали требования Министерства здравоохранения Российской Федерации к работе экспериментально- биологических клиник (Федеральный закон принятый Государственной Думой 1 декабря 1999 г. «О защите животных от жестокого обращения», «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных» согласно приказу МЗ СССР №755 от 12.08.1987г), а также «Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей». Все манипуляции, проводимые на животных, были рассмотрены и одобрены этическим комитетом «РНЦ «ВТО» им. академика Г.А. Илизарова». Оперативные вмешательства выполняли под тиопенталовым внутривенным наркозом, животных выводили из опыта передозировкой барбитуратов. По данным ряда исследователей [83, 122, 123] мыщелки бедра являются наиболее нагружаемыми трущимися поверхностями, а суставной хрящ мыщелков бедра - одна из наиболее часто страдающих зон. Учитывая эту информацию, в качестве объекта выбран суставной хрящ нагружаемых поверхностей мыщелков бедра как репрезентативный участок для изучения состояния суставного хряща в условиях удлинения смежного сегмента конечности. 2.2. Методы исследования. Результаты эксперимента оценивали на макро- и микроскопическом уровнях. Были использованы следующие методы: экспериментально- клинический, рентгенологический, гистологический (световая микроскопия целлоидиновых, парафиновых, иммуногистохимический, полутонких стереологический, срезов), гистохимический, статистический; сканирующая 53 электронная микроскопия, рентгеновский электронно-зондовый микроанализ, информационные технологии: гистоморфометрический, колориметрический компьютерный анализ транспортированных по локальной сети полноцветных цифровых изображений гистологических препаратов. Клинико-экспериментальное исследование проводили на протяжении всего эксперимента; оно заключалось в наблюдении за животными как до, так и после операции. Регистрировали функциональное состояние оперированной конечности. 2.2.1. Макроскопическое исследование. Анатомический метод включал макроскопическое препарирование и описание объектов исследования. Забор материала осуществляли после эвтаназии собак введением летальной дозы барбитуратов. Выпиливали коленный сустав, вскрывали суставную сумку. Суставные поверхности оценивали макроскопически (форма, контур, цвет). Изображения макропрепаратов (Рисунок 6) оцифровывали и анализировали на аппаратно-программном комплексе «ДиаМорф» (Москва). Рисунок 6 - Дистальный суставной конец бедренной кости интактного животного. 54 2.2.2. Гистологическое исследование. Для морфологического исследования на светооптическом уровне часть материала обрабатывали по общепринятым гистологическим методикам. Для этого дистальный суставной конец бедренной кости фиксировали от 2 до 4 недель в 10% растворе нейтрального формалина. Далее препарат промывали в проточной воде и распиливали его в парасагиттальной плоскости, затем его латеральную часть обезжиривали в ацетоне, декальцинировали 2-3 недели в 7% растворе азотной кислоты, нейтрализовали 5% раствором алюмокалиевых квасцов, обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации и заливали часть материала в целлоидин, часть в парафин. Изготавливали целлоидиновые и парафиновые срезы. Гистологический метод исследования включал следующие методики: 1) общие - гематоксилин-эозин, метиленовый синий-основной фуксин; 2) специальные - ван Гизон (окрашивание ядер, изучение степени зрелости структур коллагенового каркаса), трихром по Массону пропись с анилиновым синим (выявление коллагена, степени минерализации); 3) гистохимические - альциановый синий при рН 1,0 и 2,5, толуидиновый синий, метиленовый синий (выявление сульфатированных и несульфатированных ГАГ), окраска сафранином и альциановым синим (для оценки биосинтетической активности клеток по степени конденсации хроматина); 4) иммуногистохимические (анализ топографии и интенсивности пролиферации хондроцитов с помощью маркера Ki-67). Исследования и оцифровку изображений гистологических препаратов проводили с помощью фотомикроскопа фирмы "Оpton" (Германия) с аппаратнопрограммным комплексом "ДиаМорф" (Москва). Для световой микроскопии полутонких срезов наружную часть коленного сустава для сохранения нативного расположения тканей фиксировали в смеси 2% параформальдегида, 2% глютаральдегида и 0,1% пикриновой кислоты на фосфатном буфере при рН 7,4. После фиксации тканей с передней и боковой поверхностей наружного мыщелка бедра вырезали кусочки суставного хряща с 55 подлежащей субхондральной костью размером 2-3 х 3-5мм (Рисунок 7). Участки синовиальной оболочки иссекали из супрапателлярной зоны. Затем осуществляли их обработку по стандартной для электронно–микроскопических исследований методике [128]. Фрагменты ткани постфиксировали в 1% растворе четырехокиси осмия с добавлением 1,5% красной кровяной соли, дегидратировали в спиртах возрастающей концентрации и ацетоне, заливали в аралдит, при этом для получения репрезентативных препаратов с учетом резко выраженной вертикальной анизоморфии суставного хряща кусочки ориентировали так, чтобы плоскость среза была перпендикулярна суставной поверхности. Рисунок 7 - Схема вырезки суставного хряща наружного мыщелка бедра. Полутонкие срезы толщиной 1,0 мкм готовили на ультратоме "Nova" фирмы LKB (Швеция). Применение аралдита в качестве уплотняющей среды и стеклянных или алмазных ножей минимизировало деформацию объекта при изготовлении срезов. Микропрепараты окрашивали метиленовым синим, метиленовым синимосновным фуксином [128], исследовали и оцифровывали на фотомикроскопе фирмы "Оpton" при увеличениях 80х; 200х; 500х, 1250х. 56 При описании микропрепаратов суставного хряща использовали деление на 3 зоны: поверхностная, промежуточная (средняя) и глубокая (базальная) [103, 116]. Выраженность синовита оценивали по шкале экспертных оценок [212], предложенной V.Krenn et al. (2006). Гистохимичекие 2.2.3. и иммуногистохимические методы исследования. На парафиновых и полутонких срезах, изготовленных по описанной технологии (см.2.2.2.), ставили ШИК-реакцию на гликоген и гликопротеиды [4]. Для выявления гликозаминогликанов полутонкие срезы окрашивали метиленовым синим, толуидиновым синим (метахроматическое окрашивание сульфатированных гликозаминогликанов - ГАГ), [70, 106, 115]. Часть парафиновых срезов окрашивали альциановым синим при рН 1,0 и 2,5 (выявление сульфатированных и несульфатированных ГАГ). Реакции проводили в максимально одинаковых условиях, все препараты окрашивали одновременно в одной порции красителя. Для выявления пролиферативной активности хондроцитов суставного хряща на парафиновых срезах, помещенных на стекла с поли-л-лизином, с использованием визуализации набора реактивов для иммуногистохимии и системы RE7140-К, моноклональных антител к Ki-67 (готовые к применению) фирмы «Novocastra» (Великобритания) определяли экспрессию белка Ki67 согласно протоколу фирмы производителя. Срезы докрашивали гематоксилином и заключали в канадский бальзам. Для контроля исследования использовали гистологические срезы суставного хряща интактных животных. Гистохимические и иммуногистохимические препараты суставного хряща изучали в большом исследовательском фотомикроскопе фирмы "Оpton" (Германия), укомплектованном аппаратно-программным комплексом "ДиаМорф" (Москва). С помощью последнего в программе “Color” оцифровывали полноцветные 24-хбитные изображения выбранных для анализа полей зрения, сопровождая каждое текстовой легендой. Анализ проводили в программах- 57 графических редакторах “Adobe Photo-Shop” разных версий, “PhotoFinish” и “DiaMorph Cito-W” версии 1996 г. Компьютерный анализ метахромазии осуществляли по разработанному нами способу [Щудло М.М., Ступина Т.А. Удостоверение №29/2003г. РНЦ "ВТО" им. акад. Г.А. Илизарова]. В качестве объекта использованы цифровые изображения окрашенных метиленовым синим полутонких срезов суставного хряща взрослых беспородных собак на сроке 30 суток фиксации после удлинения голени с суточным темпом 1 мм за 8 приемов (ручные подкрутки) – 1 группа и 1 мм за 60 приемов (автодистракция) – 2 группа. Направления исследования метахромазии в гистохимических препаратах суставного хряща представлены в таблице 2. Таблица 2 - Направления исследования метахромазии в переданных по компьютерной сети цифровых изображениях гистохимических препаратов Задача исследования Технология исследования Топография зон метахромазии Их распространенность Описательная гистология (Ог) Ог+компьютерная морфометрия (КМ), денситометрия (КД), точкосчетная объемометрия (Vv) + статистический анализ (СА) Ог+КМ, КД + СА Интенсивность метахромазии Её цветовые характеристики Ог+КД + СА Измерения проводили в микрометрах после геометрической калибровки изображений по оцифрованному в тех же условиях изображению шкалы объектмикрометра. При денситометрии пользовались общепринятой шкалой из 256 градаций интенсивности и цветовой моделью RGB [85, 127]. При оценке объемных отношений в трехмерном объекте по результатам точкосчетной волюметрии его двумерных эквивалентов гистологических срезов) исходили из принципа А.Delesse [1, 2, 97]: (изображений 58 Vvi = AАi = Ppi, где VVi - объемная доля i-структуры в общем объеме объекта, AAi - доля площади сечения i-структуры в площади среза - двумерного эквивалента трехмерного объекта, Ppi – доля количества точек, попавших на i-структуру от общего количества точек тестовой системы. 2.2.4. Метод компьютерной морфо- и стереометрии. Для проведения количественного исследования разработаны специальные методические и технологические приемы [Ступина Т.А., Щудло. М.М. Удостоверение на РП №21/2008г.; Ступина Т.А., Щудло М.М. Удостоверение на РП №21/2010г.; Ступина Т.А., Щудло М.М. Патент 2466375РФ]. При планировании морфо- и стереометрических исследований суставного хряща учитывали: 1) ориентацию среза, 2) толщину среза, 3) способ получения репрезентативной выборки. Для суставного хряща с резко выраженной вертикальной анизоморфией, репрезентативными (включающими максимально возможное количество анализируемых структур для морфометрического исследования) являются перпендикулярные суставной поверхности срезы. Выбор адекватной толщины среза связан с несколькими условиями – еще при планировании нужно учитывать размер структур, подлежащих стереологическому анализу, и возможности стандартных патогистологических методик, предопределяющих, в частности, соотношение толщины и площади среза при использовании различных заливочных сред. Срезы должны быть достаточно тонкими по сравнению с размерами исследуемых деталей; иначе объёмные доли непрозрачных структур, содержащихся в срезе, будут завышены за счет затенения ими (“эффект Холмса”) прозрачных и полупрозрачных компонентов [35, 97, 153, 163]. Для суставного хряща (диаметр хондроцитов 10– 20 мкм) оптимальными являются срезы толщиной 0,5-1 мкм; изготовить качественные парафиновые срезы такой толщины проблематично, требуется более плотная заливочная среда, например эпоксидные смолы. Оптимальными, для определения морфометрических и стереометрических параметров структур 59 суставного хряща, являются полутонкие срезы толщиной 0,5–1 мкм; однако их малая – до 1 мм2 – стандартная площадь затрудняет получение репрезентативных выборок изображений для стереологических исследований. Чтобы преодолеть указанное противоречие, мы разработали и апробировали в повседневной практике ряд технических приемов, позволивших увеличить площадь одномикронных полутонких срезов до 4–8 мм2 [Ступина Т.А., Щудло М.М. Патент 2466375 РФ]. Для получения достаточной площади полутонких срезов недекальцинированного суставного хряща с подлежащей субхондральной костью мы применяли следующие технические приемы: 1) применение специального режима проводки материала (увеличение экспозиции и дополнительная пропитка в смоле при комнатной температуре); 2) при заточке блока площадь основания пирамидки при ее высоте до 1,0 мм должна быть как минимум в 4 раза больше площади среза, что позволяет избежать вибрации блока и образования механических дефектов на срезах при ультратомировании; 3) тщательный контроль качества и отбор стеклянных ножей, либо использование алмазного ножа с достаточной длиной режущей кромки; 4) при ультратомировании блок следует ориентировать так, чтобы срез начинался с гиалинового хряща, а не с субхондральной кости, что позволяет избежать образования механических дефектов на срезах из-за различных биомеханических свойств хряща и кости; 5) применение специальных приемов фиксации срезов к предметному стеклу [146] для предотвращения появления при окраске неровностей и складок из-за различных биомеханических свойств тканевых составляющих исследуемого объекта. Использование полученных по описанной технологии полутонких срезов большой площади позволило оцифровывать достаточное количество качественных изображений для формирования репрезентативной выборки и 60 получать достоверные количественные характеристики объекта, пренебрегая эффектом Холмса. Серийные перпендикулярные суставной поверхности полутонкие (0,5–1,0 мкм) срезы увеличенной площади (6–8 мм2) готовили на ультратоме "Nova" фирмы LKB (Швеция). Исследование и оцифровку изображений гистологических препаратов проводили с помощью фотомикроскопа фирмы "Оpton" (Германия) с аппаратнопрограммным комплексом "ДиаМорф" (Москва). При морфометрии учитывали принятое в гистологии разделение суставного хряща на зоны: поверхностную, промежуточную, глубокую, что позволяло количественно охарактеризовать морфофункциональное состояние каждой из них. Для стереологического анализа отбирали каждый 10-ый срез. Систематический ввод полей зрения рядами, ориентированными строго по длиннику среза, обеспечивал получение наиболее репрезентативной выборки. При оцифровке важно надежно исключить взаимоперекрытие тестовых полей. Выборку формировали тотально, при этом количество анализируемых структур целиком попавших в поле зрения, оказывалось максимальным. При увеличениях объективов - 6,3; 16; 40; 100МИ проводили гистологическое исследование суставного хряща – изучали зональное строение, цитоархитектонику, состояние межклеточного вещества, хондроцитов, базофильной линии, субхондральной кости. Для количественной оценки состояния суставного хряща на органном, тканевом и клеточном уровнях по полутонким срезам большой площади определяли комплекс параметров: - толщина хряща (h, мкм); - численная плотность хондроцитов (NАch, мкм-2) – характеризует численный состав хондроцитов, их гибель и репродукцию; - рассчитывали долю пустых лакун (NNem.lac., %) от общего количества лакун. 61 - объемная плотность хондроцитов (VVch, %) и площадь хондроцитов (Sch, мкм2) – характеризует степень дифференцировки клеток по зонам, их биосинтетическую активность; - пролиферативную активность клеток оценивали косвенно по результату пролиферации – количеству изогенных групп [8, 9, 29, 103], рассчитывали долю хондроцитов в составе изогенных групп (NNis.gr., %) от общего количества хондроцитов. Для определения параметра – h изображения хряща при увеличении 80 оцифровывали на АПК «ДиаМорф» (Россия) в программе «Color» (Рисунок 8А), с каждого случая в программе «DiaMorph Medias» по специально разработанному макросу проведено 30 измерений. Для определения параметров – NАch, Sch, VVch, NNem.lac., NNis.gr изображения хряща при увеличении 500 оцифровывали на АПК «ДиаМорф» (Россия) в программе «Color» (Рисунок 8Б), из каждого случая в программе «DiaMorph Medias» по специально разработанному макросу анализировали в среднем до 200 полей зрения. Для характеристики функциональной активности хондроцитов изображения хряща при увеличении 1250 оцифровывали на АПК «ДиаМорф» (Россия) в программе «Color» (Рисунок 8В), с каждого случая в программе «DiaMorph Medias» по специально разработанному макросу анализировали в среднем 100150 клеток в каждой зоне хряща, определяли параметры: - объемная плотность ядра (VVn, в долях единицы); - объемная плотность цитоплазмы (VVс, в долях единицы); - ядерно-цитоплазматический индекс (NCI); - минимальный и максимальный диаметры (dmin, dmax, мкм) клеток и их ядер; - фактор формы (Ff, в долях единицы) клетки и ядра. 62 А Б В Рисунок 8 - Полутонкий срез суставного хряща. Окраска метиленовым синим (А), метиленовым синим-основным фуксином (Б, В). Изображения хряща оцифрованы на АПК «ДиаМорф» (Россия) в программе «Color». А - при увеличении 80, позволяют проводить количественное исследование на органном уровне. Б, В при увеличениях 500, 1250 (соответственно) позволяют проводить количественное исследование на тканевом и клеточном уровнях. В качестве контроля морфометрировали суставной хрящ интактных животных. Измерения проводили в микрометрах после предварительной геометрической калибровки по оцифрованной с тем же увеличением шкале объект-микрометра, результатом которой является таблица автоматической калибровки в программе «Medias». В синовиальной оболочке определяли толщину покровного слоя (мкм), количество рядов синовиальных клеток, численную плотность микрососудов в 1 мм2. Гистоморфометрические исследования выполнены с помощью аппаратнопрограммного комплекса «ДиаМорф» (Россия, Москва) и программы «ВТМастер-Морфология» (фирма "ВидеоТест", Россия, Санкт-Петербург). 2.2.5. Сканирующая электронная микроскопия (СЭМ). Для исследования рельефа суставной поверхности, фиксированные в альдегидном фиксаторе (смесь 2% параформальдегида, 2% глютаральдегида и 0,1% пикриновой кислоты на фосфатном буфере при рН 7,4) кусочки промывали в проточной воде с последующим споласкиванием в дистиллированной воде. Затем материал дегидратировали в спиртах возрастающей концентрации, пропитывали в камфене (3,3–диметил-2- метиленбицикло[2,2,1] гептан) ГОСТ 15039 - 76 по оригинальной методике [Силантьева Т.А., Горбач Е.Н., Ирьянов 63 Ю.М., Ступина Т.А., Варсегова Т.Н. Патент № 2397472РФ], высушивали на воздухе, напыляли алюминием, медью или серебром в вакуумном напылителе «JEE-4 Х/5 В» (Eiko, Япония) и ионном напылителе «IB-6» (Eiko, Япония) для создания электро- и теплопроводности и изучали в сканирующем электронном микроскопе «JSM-840» (Jeol, Япония). Наиболее типичные участки суставной поверхности (Рисунок 9) фиксировали на фотопленке для последующего сканирования и анализа цифровых изображений. Рисунок 9 - Поверхность интактного суставного хряща. СЭМ. Увеличение 1100. 2.2.6. Методика рентгеновского электронно-зондового микроанализа. Поверхности эпоксидных блоков суставного хряща после изготовления полутонких срезов напыляли алюминием, медью или серебром в вакуумном напылителе «JEE- 4 Х/5В» (Eiko, Япония) и ионном напылителе «IB-6» (Eiko, Япония). Исследования проводили на рентгеновском электронно-зондовом микроанализаторе «INСA Energy 200» (Oxford Instrumets Analytical, Англия), смонтированном на сканирующем электронном микроскопе «JSM-840» (Jeol, Япония), при ускоряющем напряжении 20 кэВ. Определяли распределение и концентрацию (ω, в вес.%) кальция, серы в суставном хряще наружного мыщелка бедра. Результаты исследований получали в виде элементных карт - Smart Map 64 (Рисунок 10) и данных количественного элементного анализа в весовых процентах. А Б Рисунок 10 - Суставной хрящ с подлежащей костью. А – поверхность эпоксидного блока, СЭМ, увеличение 70, 1 – некальцифицированный хрящ, 2кальцифицированный хрящ, 3 - кость, стрелки – базофильная линия. Б элементная карта (Smart Map), отражающая распределение кальция в суставном хряще и субхондральной кости. С целью получения однотипных, стандартных результатов проводили калибровку прибора по образцу – эталону волластонита (СаО:SiO2). На всех этапах работы соблюдали одинаковые условия эксперимента и обработки материала по методикам. 2.2.7. Статистические методы исследования. Анализ цифрового материала был проведен общепринятыми для медикобиологических исследований методами вариационной статистики в программе Microsoft Excel 97 (программное обеспечение AtteStat, версия 1.0, Гайдышев И.П., 2003) [27]. После получения параметров описательной статистики анализировали характер распределения в вариационных рядах, относящихся к индивидуальным выборкам. Индивидуальные выборки были объединены в одну общую 65 (генеральную совокупность) после статистической проверки нулевой гипотезы о межиндивидуальных различиях. В зависимости от характера распределения и объема выборок использовали либо критерий Вилкоксона, либо критерий Стьюдента [1, 3, 27]. Для параметра h хряща гистограмма распределения вариант имела форму гауссовой кривой, что характерно для нормального распределения (среднее арифметическое, медиана и мода совпадали), поэтому для определения достоверности различий применяли критерий Стьюдента. Для параметров VVch, NAch, Sch, VVn, VVс, NCI, dmin, dmax, Ff характерно ассиметричное распределение (среднее арифметическое, медиана и мода различаются), поэтому для определения достоверности различий применяли непараметрический критерий – критерий Вилкоксона. Для всех параметров различия считали статистически достоверными на уровне значимости p < 0,05. В работе относящиеся к количественного использовали «новым приемы количественной информационным исследования цифровые телепатологии, технологиям» изображения [152]: для микропрепаратов суставного хряща транспортировали по телекоммуникационным каналам – локальной учрежденческой компьютерной сети. Первичный материал и результаты его обработки архивировали в базы данных разного уровня: оперативный архив формировали на жестком диске компьютера, тактический и стратегический – на компакт-дисках (СD-RW и СD-R соответственно). По нашему опыту, такая трехуровневая система необходима и достаточна для сохранности информации, и, в то же время, обеспечивает условия для текущего и ретроспективного анализа данных, а также позволяет осуществлять выборочный контроль качества и, при необходимости, вносить соответствующие коррективы [65, 66]. 66 Глава 3. Гистоморфометрическая характеристика суставного хряща интактных собак в разные возрастные периоды В 2 месяца постнатальной жизни отсутствовала цитоархитектоника, характерная для зрелого суставного хряща. Матрикс средней части хряща и более глубоких слоев содержал сосуды (Рисунок 11). Рисунок 11 - Общий вид суставного хряща. Парафиновый срез, окраска гематоксилином и эозином. Лупа 10. В верхних слоях хряща хондроциты небольшого размера (Sch – 19,78 6,75 мкм2), сплющены (Ff – 0,62 0,15; dmin - 3,57 1,15 мкм; dmax - 8,4 2,33 мкм), встречались двуядерные клетки. Их цитоплазма интенсивно базофильна (Рисунок 12А, Б). Ядра округлой и овальной формы, светлые гомогенные (Рисунок 12В). В среднем слое хондроциты крупнее (Sch – 35,16 7,55 мкм2), овальной формы (Ff – 0,78 0,13; dmin - 4,93 0,79 мкм; dmax - 9,76 1,97 мкм) располагались в виде двухчленных изогенных групп и одиночно. 67 А Б В Рисунок 12 - Суставной хрящ щенков в возрасте 2-х месяцев. Поверхностный и средний слои. Полутонкий срез, окраска метиленовым синим (А, Б), метиленовым синим-основным фуксином (В). А - об. – 2,5; ок. – 12,5х. Б - об. – 6,3; ок. – 12,5х. В - об. – 100МИ; ок. – 12,5х. При окраске тиазиновыми красителями (толуидиновый синий, метиленовый синий) во всех слоях хряща выявлялась γ-метахромазия разной степени интенсивности. Наиболее интенсивная реакция наблюдалась в территоральном матриксе среднего слоя (Рисунок 13А). А Б В Рисунок 13 - Суставной хрящ щенков в возрасте 2-х месяцев. Полутонкие срезы. А - интенсивная γ-метахромазия территориального матрикса в среднем слое хряща, окраска толуидиновым синим. Об. – 16; ок. – 12,5х. Б - хондроциты среднего слоя, окраска метиленовым синим-основным фуксином. Об. – 100; ок. – 12,5х. В – ШИК-реакция. Об. – 16; ок. – 12,5х. Одиночно расположенные хондроциты содержали большое количество секреторных включений (Рисунок 13Б). В хрящевых клетках накапливаются ШИК-положительные вещества (Рисунок 13В). В межклеточном матриксе ШИКреакции была повышена в зоне гипертрофированных клеток. 68 В более глубоких слоях хрящевые клетки расположены в виде многочленных изогенных групп (Рисунок 14А), состоящих в основном из гипертрофированных (пузырчатых) хондроцитов (Sch – 67,46 19,29 мкм2). Некоторые клетки глубоких слоёв хряща находились в состоянии гибели, отличались конденсированным состоянием ядра и цитоплазмы, сжатием, потерей контактов с межклеточным матриксом (Рисунок 14Б). Матрикс глубоких слоёв хряща пронизывали сосуды. Базофильная линия в этом возрасте ещё не сформирована, гипертрофированный хрящ непосредственно контактировал с межбалочным пространством субхондральной губчатой кости (Рисунок 14В). А Б В Рисунок 14 - Глубокий слой суставного хряща щенков в возрасте 2-х месяцев. Полутонкие срезы. Окраска метиленовым синим-основным фуксином (А, Б), метиленовым синим (В). А, Б – об. – 100; ок. – 12,5х. В – об. – 16; ок. – 12,5х. В возрасте 4-х и 6-ти месяцев более четко, по сравнению с предыдущим сроком, определялось зональное расположение хондроцитов. Хондроциты поверхностной зоны овальной формы, располагались параллельно суставной поверхности (Рисунок 15А, Б). В верхней части промежуточной зоны клетки образовывали двухчленные изогенные группы (Рисунок 15А), количество которых снижалось относительно предыдущего срока. Наблюдалось снижение ШИК-реакции в цитоплазме клеток и увеличение ее интенсивности в межклеточном матриксе. Реакция метахромазии усиливалась по направлению от суставной поверхности к субхондральной кости. В глубокой зоне отмечена тенденция к колончатому расположению хондроцитов, отличавшихся 69 большими размерами. В отдельных участках начала формироваться базофильная линия (Рисунок 16). А Б Рисунок 15 - Суставной хрящ щенков в возрасте 4-х месяцев. Полутонкий срез, окраска метиленовым синим-основным фуксином. А - об. – 16; ок. – 12,5х. Б - об. – 100МИ; ок. – 12,5х. Рисунок 16 - Суставной хрящ с подлежащей костью щенков в возрасте 6-ти месяцев. Формирование базофильной линии (стрелки), КХр – кальцифицированный хрящ. Парафиновый срез, окраска гематоксилином и эозином. Об. – 6,3; ок. – 12,5х. Сохранялись участки, в которых базофильная линия не была сформирована, гипертрофированный хрящ непосредственно соприкасался с субхондральной костью, которая имела трабекулярное строение. 70 В 10 месяцев отчетливо выражено зональное строение хряща (Рисунок 17). Относительно предыдущего возрастного периода отмечено снижение клеточной плотности. Рисунок 17 - Суставной хрящ с подлежащей костью щенков в возрасте 10-ти месяцев. Базофильная линия (стрелки), КХр – кальцифицированный хрящ, СК – субхондральная костная пластинка. Парафиновый срез, окраска гематоксилином и эозином. Об. – 2,5; ок. – 12,5х. При светооптическом исследовании полутонких срезов были отмечены очаги с нарушением гомогенности межклеточного вещества поверхностной зоны, в которых хондроциты были аномальной формы с пикнотичными ядрами (Рисунок 18). А Б Рисунок 18 - Поверхностная зона суставного хряща щенков в возрасте 10 месяцев. Полутонкий срез, окраска метиленовым синим-основным фуксином. А - Об. – 16; ок. – 12,5х. Б - Об. – 40; ок. – 12,5х. 71 Основная часть хондроцитов промежуточной и глубокой зон функционально активна (Рисунок 19). Отмечены изогенные группы клеток, интенсивная метахромазия территориального матрикса. Пустые клеточные лакуны были выявлены единично во всех зонах хряща. А Б Рисунок 19 - Суставной хрящ щенков в возрасте 10-ти месяцев. Полутонкий срез, окраска метиленовым синим-основным фуксином. А - хондроциты промежуточной зоны. Об. – 100МИ; ок. – 12,5х. Б - глубокая зона, сформирована базофильная линия (стрелки). Об. – 40; ок. – 12,5х. На большем протяжении сформировалась базофильная линия, разделяющая некальцифицированный и кальцифицированный хрящ (Рисунок 17, 19Б). Под хрящевым покрытием дифференцировалась субхондральная кость в виде замкнутой пластинки. Субхондральная пластинка была образована непрерывной пластинчатой костью, сохранялись участки, в которых кальцифицированный хрящ контактировал с межбалочным пространством субхондральной губчатой кости. Сосуды, со стороны субхондральной кости, не пересекали базофильную линию. В субхондральной кости были отмечены явления остеокластической резорбции (Рисунок 20). 72 Рисунок 20 - Участок субхондральной зоны, Окл – остеокласт, резорбирующий основное вещество костной трабекулы. ЛХ - резорбционная лакуна Хаушипа. Полутонкий срез, окраска толуидиновым синим. Об. – 40; ок. – 12,5х. В суставном хряще собак в возрасте 1,5 - 2х лет исследование цитоархитектоники позволило четко выделить три структурные зоны: поверхностную, обращенную к синовиальной полости сустава; среднюю или промежуточную и глубокую или базальную, обращенную к кости (Рисунок 21), что соответствовало обобщенной классификации [92, 103, 271]. Наблюдалось увеличение доли глубокой зоны в общей площади среза хряща. Рисунок 21 - Общий вид суставного хряща собаки в возрасте 1,5-2 лет. Целлоидиновый срез. Окраска гематоксилином и эозином. Об. - 2,5; ок. - 12,5х. 73 На гистологическом срезе суставного хряща хондроциты на различной глубине залегания отличались друг от друга по размерам, форме, плотности распределения в матриксе (Таблица 3, 4, 5,6). В поверхностной зоне межклеточное вещество выглядело гомогенным, слабо базофильным, за исключением суперфициальной части поверхностной зоны, которая была интенсивно базофильна (Рисунок 22). А Б Рисунок 22 - Поверхностная зона суставного хряща собаки в возрасте 1,5-2 лет. Полутонкий срез, окраска метиленовым синим-основным фуксином. А - Об. – 40; ок. - 12,5х. Б - Об. – 100МИ; ок. - 12,5х. Ортохроматическая окраска метиленовым синим свидетельствовала о сравнительно невысоком содержании гликозаминогликанов. ШИК-позитивные соединения равномерно определялись по всей поверхностной зоне. Клетки продолговатой формы (Ff – 0,47 0,13; dmin - 1,28 1,17 мкм; dmax - 10,75 1,84 мкм) располагались преимущественно поодиночке в четко выраженных лакунах, вытянутых параллельно поверхности хряща (Рисунок 22). Хондроциты имели короткие, но хорошо выраженные отростки, небольшой объем цитоплазмы, ядерно-цитоплазматический индекс составлял 0,75 0,23 (Таблица 3). Некоторые клетки, расположенные ближе к суставной поверхности имели признаки деструкции - пикнотичные ядра, вакуолизированную цитоплазму. Межклеточное вещество промежуточной зоны было так же гомогенно и слабо эозинофильно. При окраске метиленовым синим выявлялась γ- метахромазия разной степени интенсивности. Наиболее интенсивная реакция 74 наблюдалась в участках, непосредственно окружающих хрящевые клетки территориальном матриксе. По сравнению с основным веществом поверхностной зоны ШИК-реакция была более слабой. Хондроциты образовывали изогенные группы (Рисунок 23), количество содержащихся в них клеток убывало по направлению к поверхностной зоне. А Б Рисунок 23 - Изогенные группы хондроцитов промежуточной зоны суставного хряща собаки в возрасте 1,5-2 лет. Полутонкий срез, окраска метиленовым синимосновным фуксином. А - Об. – 16; ок. - 12,5х. Б - Об. – 100МИ; ок. - 12,5х. В цитоплазме отдельных клеток наблюдались секреторные гранулы и липидные включения. Полученные данные являлись показателем активного участия этих клеток в синтезе компонентов межклеточного вещества. В глубокой зоне отмечалась интенсивная базофилия территориального и межтерриториального матрикса (Рисунок 24А). Хондроциты располагались колонками. В области колонок интенсивность метахромазии увеличивалась (Рисунок 24Б). Здесь отмечены гипертрофированные клетки. Они характеризовались большими размерами (Таблица 3), наличием секреторных гранул, липидных вакуолей, отсутствием признаков деструкции (Рисунок 25А). 75 А Б Рисунок 24 - Глубокая зона суставного хряща собаки в возрасте 1,5-2 лет. Полутонкий срез. А - окраска метиленовым синим-основным фуксином. Об. - 16; ок. - 12,5х. Б - окраска метиленовым синим. Об. – 40; ок. - 12,5х. В зонах колонок и гипертрофированных клеток интенсивность ШИК- реакции была повышена (Рисунок 26). Зона кальцифицированного хряща составляла около 1/5 от всей толщины гиалинового хряща, имела четкую визуализацию и была ограничена хорошо выраженной непрерывной базофильной линией (Рисунок 25Б). Большая часть хондроцитов этой зоны находилась в состоянии деструкции. А Б Рисунок 25 - Суставной хрящ собаки в возрасте 1,5-2 лет. Полутонкий срез, окраска метиленовым синим-основным фуксином. А - хондроциты глубокой зоны. Об.100МИ; ок. - 12,5х. Б - граница глубокой зоны и кальцифицированного хряща (КХр). Об. – 40; ок. - 12,5х. 76 Рисунок 26 - Суставной хрящ собаки в возрасте 1,5-2 лет. Полутонкий срез. ШИК – реакция. Об. – 6,3; ок. – 12,5х. Отмечено увеличение толщины кальцифицированного хряща относительно предыдущего возрастного периода. Под хрящевым покрытием дифференцировалась субхондральная кость в виде замкнутой пластинки, которая составляла продолжение замыкающей пластинки (коркового слоя) остальных поверхностей кости. Суставной хрящ животных 5-ти лет истончен, разволокнен, на полутонких срезах нарушена гомогенность межклеточного вещества, отмечена демаскировка коллагеновых волокон (Рисунок 27А). В промежуточной зоне основная часть хондроцитов находилась в состоянии деструкции (Рисунок 27Б). В глубокой зоне отсутствовало колончатое расположения клеток (Рисунок 27В). А Б В Рисунок 27 - Суставной хрящ собаки в возрасте 5-ти лет. Полутонкий срез, окраска метиленовым синим-основным фуксином. Об. – 40; ок. – 12,5х. А – поверхностная зона, нарушена гомогенность межклеточного вещества, демаскировка коллагеновых волокон (ДКВ). Б – промежуточная, В – глубокая зоны. 77 В части наблюдений выявлено нарушение целостности базофильной линии, проникновение сосудов в хрящ (Рисунок 27В). Хондроциты имели меньшие размеры и находились в состоянии деструкции. Отмечалось значительное количество опустошенных лакун (Таблица 3). Гистохимическая реакция на сульфатированные ГАГ существенно ослаблена (Рисунок 28), метахромазия имела очаговый характер (Рисунок 28Б). А Б Рисунок 28 - Суставной хрящ собаки в возрасте 5 лет. Полутонкий срез. Об. - 6,3; ок. – 12,5х. А - окраска альциановым синим-сафранином О, сульфатированные ГАГ синего цвета, определяются очагами в промежуточной зоне и в территориальном матриксе отдельных хондроцитов глубокой зоны. Б – окраска метиленовым синим. Очаговая метахромазия в промежуточной и глубокой зоне. Методом электронно-зондового микроанализа выявлено значительное снижение содержания серы (Таблица 7). ШИК-реакия имела очаговый характер, участки с интенсивной ШИК-реакией, чередовались с менее интенсивной. По данным Pilin A. et al. (2007), изменение в окраске тканей может быть маркером определенного возраста и развивающихся дистрофических изменений [245]. На большем протяжении кальцифицированных хрящ отсутствовал, либо сохранялся небольшими участками, глубокая зона хряща контактировала непосредственно с субхондральной костью. В суставном хряще собак в возрасте 8-ми лет, как и в предыдущем возрастном периоде, сохранялись очаги разволокнения, отмечено проникновение сосудов в глубокую зону. На границе поверхностной и промежуточной зон 78 наблюдалось достаточно высокое содержание хондроцитов, характеризующихся как биосинтетически активные. Такие клетки имели светлые гомогенные ядра и базофильную цитоплазму (Рисунок 29А). В более глубоких слоях промежуточной и в глубокой зоне отмечены дезинтегрированные хондроциты, а также накопившиеся липиды (Рисунок 29Б). Метахроматическая реакция на протеогликаны более выражена и сопровождалась увеличением содержания серы (Таблица 7) относительно предыдущего возрастного периода. Наблюдалось нарушение четкости контуров базофильной линии (Рисунок 29В). Выявлено врастание кровеносных сосудов в кальцифицированный слой хряща и стимуляция остеокластов. В результате зона кальцифицированного хряща была неравномерной толщины, отмечены участки, в которых кальцифицированный хрящ истончен, либо замещался костью (Рисунок 29В). В субхондральной зоне выявлен очаговый остеосклероз. А Б В Рисунок 29 - Суставной хрящ собаки в возрасте 8-ми лет. Полутонкий срез, окраска метиленовым синим-основным фуксином. Об. – 40; ок. – 12,5х. А – граница поверхностной и промежуточной зон, Б – хондроциты глубокой зоны, В – граница кальцифицированнго хряща (КХр) и субхондральной кости (СК). Количественный анализ суставного хряща на тканевом уровне выявил следующее, в 2 месяца толщина суставного хряща составляла 1641,29±13,91 мкм, в возрасте 2-х лет снижалась более чем в 3 раза, в 8 лет составляла 449,12 3,51 мкм, что достоверно (р<0,001) ниже показателей предыдущего возрастного периода (Таблица 3). 79 Таблица 3 - Количественные характеристики суставного хряща в разные возрастные периоды Параметры 2 месяца 4 месяца 6 месяцев 10 месяцев VVch (%,М σ) 7,81 2,81 11,17 5,17 6,33 2,47 5,11 1,43 NAlac (M σ) 20,12 10,28 17,28 5,73 16,89 5,24 14,26 6,54 NAch (M σ) 19,05 8,21 16,08 5,18 14,21 3,82 12,22 5,62 NNem.lac. (%) 5,4 8,09 15,9 14,18 NNis.gr. (%) 25,62 31,58 15,45 27,85 h хряща (мкм, M m) 1641,29 13,91 1521,59 18,9 543,42 8,21 525,53 1,11 2 года 5 лет 8 лет 9,03 4,54 4,68 1,36 8,61 2,75 7,56 2,92 7,04 3,71 14,4 5,01 6,15 2,45 4,37 1,62 10,42 4,53 13,6 38,8 28,18 14,51 24,65 16,45 475,55 1,31 463,87 1,61 449,12 3,51 Примечание: жирным шрифтом выделены достоверные различия с предыдущим возрастным периодом. Возрастная динамика численной плотности хондроцитов выглядела следующим образом: в 2 месяца отмечена высокая клеточность, в 4 и 6 месяцев выявлено достоверное (р<0,05) снижение данного параметра. В 10 месяцев NАch продолжала достоверно (р<0,05) снижаться относительно предыдущего возрастного периода, в 2 года составляла 6,15±2,45мкм-2, в 5 лет достоверно (р<0,05) снижалась, к 8-ми годам увеличивалась до 10,42 4,53 мкм-2 (Рисунок 30). Рисунок 30 - Численная плотность хондроцитов (мкм-2) в суставном хряще в различные возрастные периоды. При этом объемная плотность хондроцитов изменялась следующим образом: в 2 месяца, несмотря на высокие значения численной плотности, данный 80 параметр составил 7,8 2,81 % и был достоверно ниже значений в 4 месяца (Рисунок 31), что обусловлено меньшим размером хондроцитов (Таблица 4, 5, 6). Рисунок 31 - Объемная плотность хондроцитов (%) в суставном хряще в различные возрастные периоды. В 6 и 10 месяцев, относительно предыдущего возрастного периода, отмечено значительное снижение данного параметра – за счет снижения численной плотности хондроцитов в промежуточной и глубокой зонах и уменьшения их размеров, особенно в возрасте 10 месяцев в поверхностной зоне. В 2 года, несмотря на дальнейшее снижение численной плотности клеток, их объемная плотность увеличивалась за счет увеличения размеров хондроцитов, наиболее выраженного в промежуточной и глубокой зонах. В 5 лет выявлено снижение данного параметра – при этом во всех зонах хряща увеличивалось количество хондроцитов в состоянии деструкции. В 8 лет объемная плотность хондроцитов вновь увеличивалась – параллельно с увеличением численной плотности клеток и их гипертрофии, наиболее выраженной в глубокой зоне хряща. Во всех возрастных периодах в суставном хряще выявлены косвенные признаки репродукции хондроцитов (Рисунок 32) - двуядерные клетки, тесные клеточные пары, частота встречаемости которых с возрастом уменьшалась. 81 А В Б Г Рисунок 32 - Двуядерные клетки, тесные клеточные пары. Полутонкие срезы. Окраска метиленовым синим-основным фуксином. Об. – 100МИ; ок. – 12,5х. А, Б – в 2 месяца, В, Г – в 4 месяца. Количество изогенных групп клеток от 2 мес. до 2 лет снижалось (в 2 месяца этот показатель составлял 25,6%, в возрасте 2-х лет - 14,5%), в 5 лет количество изогенных групп увеличивалось до 24,6%, в 8 лет снижалось до 16,45% (Рисунок 33). Рисунок 33 - Количество изогенных групп (%) в суставном хряще в разные возрастные периоды. 82 Количество пустых лакун с возрастом увеличивалось от 5,4% в возрасте 2-х месяцев до 28,18% в 8 лет, максимальные значения выявлены в 5 лет – 38,8% (Рисунок 34). Рисунок 34 - Количество пустых клеточных лакун (%) в суставном хряще в разные возрастные периоды. В поверхностной зоне хондроциты меняли свою форму и размеры. Для щенков 2-х, 4-х месячного возраста характерна овальная и полигональная форма хондроцитов. В возрасте 10-ти месяцев и 2 лет она становится вытянутой, хондроциты сплющены. В 5-8 лет хондроциты вновь приобретали овальную форму (Таблица 4). Анализ количественных характеристик на клеточном уровне в поверхностной зоне выявил увеличение площади клеток в период от 2 до 4 месяцев, уменьшение этого параметра к 6-10 месяцам и вновь прогрессивное в период от 10 месяцев до 5 лет с последующим снижением к 8 годам (Рисунок 35). Молодые хондроциты, как правило, не имеют правильной сферической формы, они сплющены. Зрелые хрящевые клетки обычно больше по размерам и имеют округлую форму» [29]. У собак 8-ми лет достоверное снижение размеров хондроцитов сопровождалось увеличением объемной плотности ядер по сравнению с возрастом 5 лет (Рисунок 36). 83 Рисунок 35 - Площадь (мкм2) хондроцитов и их ядер в поверхностной зоне суставного хряща в разные периоды постнатального онтогенеза. Рисунок 36 - Объемная плотность (%) ядра и цитоплазмы хондроцитов поверхностной зоны суставного хряща в разные периоды постнатального онтогенеза. Таблица 4 - Количественные характеристики хондроцитов поверхностной зоны суставного хряща собак на этапах постнатального онтогенеза (M σ) 2 месяца 4 месяца 6 месяцев 10 месяцев 1,5-2 года 5 лет 8 лет 0,54±0,12 0,42±0,09 0,38±0,11 0,49±0,09 0,41±0,12 0,23±0,10 0,30±0,03 0,46±0,13 0,58±0,10 0,62±0,12 0,51±0,06 0,58±0,09 0,77±0,10 0,69±0,14 1,19±1,08 0,75±0,22 0,78±0,23 1,04±0,67 0,82±0,26 0,34±0,15 0,55±0,14 19,78± 41,43± 36,78± 27,68± 45,35± 56,11± 52,2± 8,75 8,33 7,27 7,79 8,16 12,92 12,39 d min 3,57±1,15 5,74±1,20 3,74±1,11 4,01±1,33 1,28±0,86 6,88±0,98 5,65±0,01 d max 8,43±2,23 10,81±2,07 13,34±2,12 11,68±3,16 10,75±2,09 11,4±2,19 13,44±2,87 Ff 0,62±0,15 0,61±0,16 0,7±0,12 0,57±0,09 0,47±0,16 0,79±0,10 0,65±0,06 S 9,61±2,78 18,11±3,85 18,04±2,73 12,48±3,59 11,43±3,12 13,21±3,26 15,85±1,43 d min 2,49±0,71 3,27±0,11 3,53±0,61 2,73±0,99 2,53±0,54 1,08±0,52 3,16±0,45 d max 5,26±1,27 6,71±0,83 6,33±0,04 6,11±1,05 8,06±1,17 6,45±1,79 5,89±1,47 Ff 0,74±0,14 0,78±0,01 0,83±0,10 0,67±0,08 0,72±0,17 0,52±0,11 0,79±0,14 Примечание: жирным шрифтом выделены достоверные различия с предыдущим возрастным периодом. Ядро Клетка Возраст Vvn Vvc NCI S 84 По мере смещения к суставной поверхности в верхней суперфициальной части поверхностной зоны во всех возрастных группах хондроциты сплющены с признаками деструкции, основное вещество выглядело мелкозернистым и волокнистым. В промежуточной зоне в период роста с 2 месяцев до 2 лет площадь хондроцитов увеличивалась более чем в 3 раза (Рисунок 37), при этом, как и в поверхностной зоне, отмечено уменьшение объемной плотности ядер (Рисунок 38). В 5 лет отмечено снижение площади клеток и увеличение объемной плотности ядер (Таблица 5). Присутствие таких клеток может являться отражением деструктивных изменений, апоптоза, либо дедифференцировки клеток и восстановления их пролиферативных потенций. Известно, что дедифференцировка, как реактивно-приспособительное изменение клеток, сопровождается увеличением относительных объемов ядер [39, 94]. В этом возрасте отмечено повышение численной плотности пустых лакун и изогенных групп по сравнению с предыдущим возрастным периодом. В 8 лет, относительно возраста 2 лет сохранялись сниженные значения площади хондроцитов (Рисунок 37) и объемной плотности их ядер (Рисунок 38). Таблица 5 - Количественные характеристики хондроцитов промежуточной зоны суставного хряща собак на этапах постнатального онтогенеза (M σ) 2 месяца 4 месяца 6 месяцев 10 месяцев 1,5-2 года 5 лет 8 лет 0,49±0,12 0,32±0,07 0,44±0,09 0,32±0,12 0,21±0,03 0,24±0,06 0,19±0,04 0,51±0,08 0,68±0,09 0,56±0,11 0,68±0,10 0,79±0,03 0,76±0,04 0,81±0,08 0,98±0,35 0,56±0,17 0,85±0,18 0,52±0,14 0,27±0,08 0,33±0,12 0,23±0,01 35,16± 67,51± 59,92± 61,35± 119,9± 80,64± 111,34± 9,55 15,14 13,25 18,11 16,08 15,73 16,26 dmin 4,93±0,79 7,76±1,72 6,58±1,16 7,45±1,08 5,82±1,31 8,76±1,33 9,51±0,41 dmax 9,76±2,97 11,99±2,83 12,03±2,42 10,94±2,33 13,13±1,79 11,83±2,19 15,74±1,28 Ff 0,78±0,13 0,83±0,09 0,87±0,07 0,82±0,13 0,72±0,09 0,92±0,05 0,82±0,07 S 14,83±3,88 24,74±6,23 26,51±4,26 20,19±3,63 13,54±3,63 18,74±4,89 21,56±2,69 dmin 3,54±0,52 4,29±0,43 4,25±0,41 4,67±0,75 4,81±0,71 2,11±0,62 3,84±0,64 dmax 5,42±1,04 5,77±0,78 5,85±0,57 6,71±1,18 6,77±1,12 6,12±1,27 6,68±1,16 Ff 0,91±0,08 0,97±0,02 0,96±0,03 0,92±0,02 0,82±0,04 0,76±0,15 0,81±0,09 Примечание: жирным шрифтом выделены достоверные различия с предыдущим возрастным периодом. Ядро Клетка Возраст Vvn Vvc NCI S 85 Рисунок 37 - Площадь (мкм2) хондроцитов и их ядер в промежуточной зоне суставного хряща в разные периоды постнатального онтогенеза. Рисунок 38 - Объемная плотность (%) ядра и цитоплазмы хондроцитов промежуточной зоны суставного хряща в разные периоды постнатального онтогенеза. В глубокой зоне выявлено увеличение площади хондроцитов и уменьшение объемной плотности их ядер с возрастом животного (Таблица 6, Рисунок 39, 40). В период роста максимальные значения анализируемых параметров отмечены в 6 месяцев. 86 Таблица 6 - Количественные характеристики хондроцитов глубокой зоны суставного хряща собак на этапах постнатального онтогенеза (M σ) 2 месяца 4 месяца 6 месяцев 10 месяцев 1,5-2 года 5 лет 8 лет 0,32±0,10 0,28±0,11 0,29±0,08 0,27±0,12 0,19±0,04 0,13±0,06 0,12±0,08 0,68±0,12 0,72±0,16 0,71±0,06 0,73±0,16 0,81±0,06 0,87±0,07 0,87±0,09 0,48±0,17 0,43±0,14 0,51±0,19 0,42±0,17 0,25±0,09 0,16±0,07 0,15±0,04 67,46± 87,18± 162,17± 83,99± 129,31± 136,9± 141,53± 19,29 29,66 28,16 23,32 19,24 143,91 19,72 dmin 7,55±1,61 8,67±2,25 12,6±4,26 8,57±1,48 4,83±1,58 11,52±1,27 11,22±1,24 dmax 12,26±3,22 12,41±2,11 13,47±2,62 18,02±3,81 12,61±1,73 15,27±2,43 16,76±2,19 Ff 0,81±0,11 0,84±0,09 0,86±0,08 0,91±0,04 0,69±0,09 0,97±0,04 0,88±0,04 S 21,73±7,42 29,56±9,26 44,08±2,03 25,35±5,09 15,22±5,57 18,01±5,96 18,2±3,33 dmin 4,36±0,81 5,14±1,04 6,87±1,07 4,96±0,68 1,29±0,81 4,18±0,83 4,19±0,91 dmax 5,51±0,81 5,91±1,04 6,24±1,04 8,02±1,12 5,99±0,68 5,71±1,12 6,23±1,19 Ff 0,96±0,03 0,97±0,03 0,99±0,02 0,95±0,01 0,61±0,16 0,96±0,08 0,66±0,06 Примечание: жирным шрифтом выделены достоверные различия с предыдущим возрастным периодом. Ядро Клетка Возраст Vvn Vvc NCI S Рисунок 39 - Площадь (мкм2) хондроцитов и их ядер в глубокой зоне суставного хряща в разные периоды постнатального онтогенеза. % Рисунок 40 - Объемная плотность (%) ядра и цитоплазмы хондроцитов глубокой зоны суставного хряща в разные периоды постнатального онтогенеза. 87 Возрастная динамика ядерно-цитоплазматического индекса (NCI) выглядела следующим образом. В верхнем и среднем слоях хряща щенков 2-х месяцев хондроциты имели больший объем ядер, по сравнению с цитоплазмой, ядерноцитоплазматический индекс таких клеток был больше и/или равен 1, что характерно для малодифференцированных клеток. В более глубоких слоях хряща клетки характеризовались высокой функциональной активностью: имели больший по сравнению с ядром объем цитоплазмы, в которой содержались секреторные включения, NCI составил в среднем 0,48 0,17. В последующие возрастные периоды наблюдалось увеличение в большей степени объемной доли цитоплазмы, чем ядра, наиболее выраженной в промежуточной зоне. У щенков 4х и 10-ти месяцев выявлено снижение NCI во всех зонах (за исключением NCI хондроцитов в поверхностной зоны в 10 мес.) относительно предыдущего возрастного периода. В последующие возрастные периоды (в 2 года и в 8 лет) значения NCI продолжали снижаться, в поверхностной зоне до 0,75 0,22 и 0,55 0,14, в промежуточной до 0,27 0,08 и 0,23 0,01, в глубокой до 0,25 0,09 и 0,15 0,04 соответственно. С возрастом в большей степени снижались значения NCI хондроцитов в промежуточной и глубокой зонах. Методом электронно-зондового микроанализа обнаружено неравномерное распределение серы по зонам суставного хряща: наибольшее содержание серы было выявлено в глубокой зоне, наименьшее - в поверхностной (Таблица 7). Сера в суставном хряще является маркером сульфатированных гликозаминогликанов. При гистохимическом исследовании гликозаминогликанов во всех возрастных периодах интенсивность реакции усиливалась по направлению от поверхностной зоны к субхондральной кости. Содержание гликозаминогликанов в хрящевом матриксе характеризует синтетическую активность хондроцитов. Известно, что пролиферативные и биосинтетические процессы являются конкурентными на уровне клетки [39]. В период роста более выражены пролиферативные процессы, по окончании роста превалируют биосинтетические, что сопровождается повышением содержания серы в суставном хряще к 2 годам. По литературным 88 данным, у людей в хрящевой ткани суставов суммарное количество гликозаминогликанов с возрастом увеличивается, при этом меняется соотношение хондроитинсульфата и кератансульфата. При старении в хрящевой ткани снижается гидратация фибрилл матрикса, одновременно увеличивается содержание гликозаминогликанов и изменяется их состав [226]. Таблица 7 - Изменение содержание серы (вес.%) в суставном хряще с возрастом Возраст 2 месяца 4 месяца 6 месяцев 10 месяцев 1,5-2 года 5 лет 8 лет Концентрация серы (М±m) в вес.% Поверхностная Промежуточная Глубокая зона Во всех зонах зона зона 0,21±0,05 0,29±0,06 0,53±0,06 1,03±0,05 0,53±0,02 0,27±0,03 0,34±0,04 1,14±0,02 0,29±0,03 0,36±0,05 0,51±0,02 1,16±0,03 0,28±0,05 0,35±0,02 0,38±0,02 1,01±0,04 0,35±0,01 0,4±0,04 0,52±0,02 1,26±0,02 0,20±0,02 0,35±0,04 0,37±0,02 0,92±0,03 0,33±0,03 0,52±0,01 0,63±0,04 1,43±0,03 Примечание: жирным шрифтом выделены достоверные различия с предыдущим возрастным периодом. С возрастом отмечено накопление кальция в некальцифицированном и кальцифицированном хряще (Таблица 8). Таблица 8 - Изменение содержание кальция (вес.%) в суставном хряще с возрастом Возраст Концентрация кальция (М±m) в вес.% в хряще 2 месяца 4 месяца 6 месяцев 10 месяцев 1,5-2 года 5 лет 8 лет 0,08±0,02 0,12±0,02 0,12±0,02 0,14±0,02 0,15±0,02 0,27±0,03 0,41±0,08 Концентрация кальция (М±m) в вес.% в зоне кальцифицированного хряща 5,52±2,11 10,72±0,38 14,28±2,36 20,22±0,34 26,16±3,04 29,51±7,52 Примечание: жирным шрифтом выделены достоверные различия с предыдущим возрастным периодом. H.I. Roach et al. (1995), Y. Ischikawa, L.N.Y. Wu, B.R. Genge (1997) и H.S. Cheung, L.M. Ryan (1999) обнаружили, что апоптотические тела, происходящие из хондроцитов, продуцируют осаждаемый кальций [174, 209, 250]. По данным биохимических исследований увеличение кальция объясняется накоплением 89 гликановым компонентом протеогликанов анионных групп, которые улавливают и связывают кальций субхондральной кости [47, 108]. Резюме главы. Таким образом, в процессе роста организма суставной хрящ претерпевал значительные морфологические постнатальном периоде онтогенеза неоднородна: в составе его преобразования. популяция присутствуют клеток В суставного раннем хряща малодифференцированные, высокодифференцированные и деградирующие хондроциты. С ростом организма соотношение клеток меняется – возрастает количество высокодифференцированных форм. В возрасте 5-ти и 8-ми лет большая часть клеток находится в неактивном состоянии либо в фазе дегенерации. Результаты гистоморфометрического исследования показали, что основные количественные изменения хондроцитов по мере удаления от суставной поверхности заключались в увеличении размеров клеток и их ядер. Такая своеобразная перестройка морфологии хондроцитов отражает последовательный путь их созревания и дифференцировки [22, 81, 92, 195, 230]. Особенностью суставного хряща мыщелков бедра собак являлось преобладание матрикса над клетками, доля клеточного компонента в исследуемом объекте в разные возрастные периоды составляла от 11,2 до 4,68% от общего объема. Зональное строение суставного хряща прослеживалось с 4-х месячного возраста. После четырех месяцев у щенка начинается новый период онтогенеза – ювенильный, или как его иначе называют, подростковый или предадультный, т.е. предшествующий взрослению. В этот период наблюдается интенсивный рост щенка, с 4-х до 10 месяцев происходит особенно бурный рост трубчатых костей, щенок растет в высоту [114]. В возрасте 10 мес. в суставном хряще выявлено нарушение гомогенности межклеточного вещества поверхностной зоны, отмечено повышение доли пустых лакун от общего количества лакун. В суставном хряще исследованных животных во всех возрастных периодах наблюдались признаки репродукции и отмирания клеток. С ростом организма морфометрические показатели суставного хряща характеризовались тем, что увеличивалось количество основного вещества, при этом количество клеток и 90 изогенных групп уменьшалось, снижалась способность клеток к пролиферации, сохранялась способность к синтезу компонентов межклеточного вещества. К инволютивным изменениям можно отнести нарушение гомогенности межклеточного вещества поверхностной зоны, изменение окраски межклеточного вещества (снижение интенсивности, очаговое окрашивание), отсутствие колончатого расположения клеток в глубокой зоне, нарушения базофильной линии (размытые контуры, фрагментация) и проникновение сосудов со стороны субхондральной зоны. Морфологическая организация хрящевой ткани суставов в возрасте 5-ти и 8-ми лет свидетельствовала о наличии деструктивнодегенеративных процессов. Деструктивно-дегенеративные процессы наиболее выражены в возрасте 5 лет. Возможно, в период от 5 до 8 лет в хряще развиваются компенсаторно-приспособительные изменения, препятствующие дальнейшему старению. Полученные гистоморфометрические характеристики могут быть использованы для оценки деструктивно-репаративных изменений суставного хряща при моделировании и лечении суставной патологии в эксперименте. 91 Глава 4. Структурная реорганизация суставного хряща при моделировании остеоартроза в эксперименте 4.1. Результаты клинических исследований. В течение первых 3-5 суток после резекции бедренной артерии и иммобилизации коленных суставов у собак наблюдалась субфебрильная общая температура в пределах 39-39,5ºС, отек на конечностях был небольшой и локализовался в основном в области бедра. Местная температура повышалась незначительно и сохранялась в течение 7-14 суток после оперативного вмешательства. На момент снятия аппарата (28 суток иммобилизации) опороспособность тазовых конечностей у собак сохранялась, они передвигались самостоятельно, но походка их была «скованной». Клинически у животных наблюдалась разгибательная контрактура коленных суставов. Угол пассивного сгибания составлял 45 градусов. Разгибание было полным. Через 14 суток после снятия аппарата у всех животных контрактуры исчезали, функция конечностей восстанавливалась. В дальнейшем на протяжении всего эксперимента заметных клинических изменений в общем состоянии животных не наблюдалось. Иммобилизация коленных суставов в течение 28 суток вызывала временную контрактуру, которая разрешалась через 14 суток после снятия аппарата. 4.2. Результаты рентгенологических и макроскопических исследований. При моделировании остеоартроза (МОА), на 28 сутки фиксации коленных суставов аппаратом Илизарова, на рентгенограммах наблюдалось сужение суставной щели, остеопороз дистального метафиза бедренной кости, очаговый остеосклероз субхондральной зоны, а контуры суставных поверхностей были, как будто перфорированы (Рисунок 41). 92 А Б Рисунок 41 - Рентгенограммы коленного сустава, боковая проекция. А – до моделирования артроза, Б – после создания модели деформирующего остеоартроза. Макроскопически суставной хрящ был неоднородного цвета, с фиолетовыми, красноватыми и синюшными пятнами (Рисунок 42). Количество синовиальной жидкости было увеличено. А Б Рисунок 42 - Мыщелки бедренной кости. А - интактный сустав, Б - после моделирования остеоартроза. Через 14 суток после МОА в мыщелках бедренной кости структура костной ткани была порозная, однородная (Рисунок 43). 93 Рисунок 43 - Рентгенограммы коленного сустава в боковой проекции через 14 суток после МОА. На 28-90 сутки после МОА структура костной ткани мыщелков бедренной кости имела однородную плотность, явления остеопороза не просматривались, контуры суставных поверхностей были четкие (Рисунок 44). А Б Рисунок 44 - Рентгенограммы коленных суставов в боковой проекции через 28 суток (А) и 90 суток (Б) после МОА. Макроскопически через 90 суток после МОА суставной хрящ в сравнении с интактным был более синюшный и менее глянцевый. 94 Таким образом, выбранная модель воспроизводит основные рентгенологические признаки остеоартроза: сужение суставной щели, остеопороз дистального метафиза бедренной кости, очаговый остеосклероз субхондральной зоны. Макроскопическая картина суставного хряща свидетельствовала о дегенеративно-дистрофических процессах происходящих в нем. 4.3. Результаты гистоморфометрического исследования суставного хряща и субхондральной кости при моделировании остеоартроза. Через 28 суток иммобилизации при исследовании суставной поверхности в СЭМ выявлены очаги разволокнения, вскрытые клеточные лакуны (Рисунок 45). Рисунок 45 - Суставная поверхность. Срок эксперимента 28 суток иммобилизации. СЭМ. Увеличение 400. На полутонких срезах выявлено нарушение гомогенности межклеточного вещества поверхностной зоны со снижением интенсивности его окраски. В очагах разволокнения хондроциты были аномальной формы с пикнотичными ядрами (Рисунок 46). 95 Рисунок 46 - Поверхностная зона. Срок эксперимента 28 суток иммобилизации. Полутонкий срез, окраска метиленовым синим-основным фуксином. Об. - 40; ок. - 12,5х. Во всех зонах хряща резко редуцировано количество клеток. В промежуточной зоне хрящевые клетки располагались одиночно, изогенные группы отмечены единично, входящие в их состав клетки находились на разных стадиях дегенерации. Основная масса хондроцитов этой зоны находилась в неактивном состоянии или в состоянии гибели и деструкции (Рисунок 47). Рисунок 47 - Хондроциты промежуточной зоны (монтаж). Срок эксперимента 28 суток иммобилизации. Полутонкий срез, окраска метиленовым синим-основным фуксином. Об. - 100МИ; ок. - 12,5х. Наблюдалось значительное количество опустошенных лакун. Процентное содержание пустых клеточных лакун от общего количества составило 49,6%. В глубокой зоне часть хондроцитов была гипертрофированна, в них более 50% профиля цитоплазмы было занято крупными скоплениями секреторных гранул и 96 липидными включениями. Выявлено большое количество клеток с признаками дегенерации, пустые клеточные лакуны, лакуны с некротизированными клетками, клеточным детритом (Рисунок 48А). Базофильная линия была неравномерно окрашена, расслоена (Рисунок 48Б). А Б Рисунок 48 - Глубокая зона хряща. Срок эксперимента 28 суток иммобилизации. Полутонкий срез, окраска метиленовым синим-основным фуксином. А – хондроциты в состоянии деструкции. Об. – 100МИ; ок. – 12,5х. Б - граница глубокой зоны и кальцифицированного хряща, расслоение базофильной линии (стрелки). Об. – 40; ок. – 12,5х. Гистохимическая реакция на сульфатированные гликозаминогликаны существенно ослаблена, межклеточное вещество поверхностной зоны не окрашивалось, в промежуточной и глубокой интенсивно окрашенные участки чередовались с бледно-голубыми или бесцветными (Рисунок 49). Рисунок 49 - Суставной хрящ. Срок эксперимента 28 суток иммобилизации. Гистохимическая реакция на сГАГ. Парафиновый срез, окраска альциановым синим при pH 1,0. Об. – 6,3; ок. – 12,5х. 97 С помощью электронно-зондового микроанализа обнаружено снижение концентрации серы по сравнению с контролем: в поверхностной зоне в 1,8 раза, промежуточной – в 1,4 раза и глубокой – в 1,7 раза. Морфометрически выявлено достоверное (p<0,001) уменьшение толщины хряща до 318,61±2,75 мкм, в контроле данный параметр составлял 475,55±1,31 мкм. Обнаружено достоверное (p<0,05) снижение численной плотности клеток – 5,41±2,13 (в контроле – 6,15±2,45), объемная плотность хондроцитов почти в 2 раза была ниже нормы. Зарегистрировано снижение площади хондроцитов (Рисунок 50А). Наиболее интенсивно дистрофические изменения выражены в хондроцитах промежуточной и глубокой зон хряща. При цито- и кариометрии во всех зонах выявлено уменьшение ядерноцитоплазматического индекса (Рисунок 50Б) в связи со снижением объемной плотности ядра и увеличением доли цитоплазмы. А Б Рисунок 50 - Значения площади (мкм2) хондроцитов (А) и ядерноцитоплазмтического индекса (Б) через 28 суток иммобилизации. При этом в хондроцитах поверхностной и промежуточной зон отмечали гетерохроматизацию ядер, обширную вакуолизацию цитоплазмы (Рисунок 51А, Б), в части хондроцитов глубокой зоны - значительное накопление трофических включений (гранулы гликогена) и миелиновых структур (Рисунок 52). 98 А Б Рисунок 51 - Дегенеративные изменения хондроцитов при моделировании остеоартроза. Срок эксперимента 28 суток иммобилизации. Полутонкий срез. Окраска метиленовым синим-основным фуксином. Об. - 100МИ; ок. - 12,5х. А – поверхностная зона, гетерохроматизация ядра (стрелка). Б – промежуточная зона. А Б Рисунок 52 - Хондроциты глубокой зоны хряща. Модель остеоартроза. Срок эксперимента 28 суток иммобилизации. А – в цитоплазме гранулы гликогена (стрелка). Парафиновый срез, ШИК-реакция. Об. - 40; ок. - 12,5х. Б - в цитоплазме миелиновые структуры (МС). Полутонкий срез. Окраска метиленовым синим-основным фуксином. Об. - 100МИ; ок. - 12,5х. В субхондральном отделе выявлены структурные признаки нарушения микроциркуляции - агрегация эритроцитов и «предтромбоз» кровеносных сосудов (Рисунок 53А). Отмечены микрососуды, в которых внутрисосудистое пространство заполнено светлой плазмой зернистой структуры, стенки утолщены, гладкомышечные клетки (ГМК) с признаками деструкции (Рисунок 53Б). 99 А Б Рисунок 53 - Микрососуды в субхондральном отделе мыщелка бедра. Срок эксперимента 28 суток иммобилизации. Полутонкий срез. Окраска метиленовым синим-основным фуксином. А - стаз микрососудов субхондральной зоны. Об. - 40; ок. - 12,5х. Б - стенка сосуда утолщена, ГМК с признаками деструкции. Об. - 100МИ; ок. - 12,5х. В одних участках на границе с кальцифицированным хрящом наблюдалась активация остеобластов, которые имели интенсивно базофильную цитоплазму (Рисунок 54А). В других - отмечены признаки угнетения активности остеобластов, преобладания явлений остеокластической резорбции костной ткани (Рисунок 54Б). А Б Рисунок 54 - Граница кальцифицированного хряща и субхондральной зоны. Срок эксперимента 28 суток иммобилизации. Полутонкий срез. Окраска метиленовым синим-основным фуксином. А - активированные остеобласты на границе с кальцифицированным хрящом (стрелка). Об. - 40; ок. - 12,5х. Б - остеокласт, резорбирующий основное вещество костной трабекулы. Резорбционная лакуна Хаушипа (стрелка). Об. - 100МИ; ок. - 12,5х. 100 В эпифизе бедренной кости были выявлены морфологические проявления остеопороза в виде разряжения губчатой кости, истончения костных трабекул, увеличения межтрабекулярных промежутков. С увеличением периода иммобилизации (40 суток) деструктивные изменения суставного хряща прогрессировали. Увеличена доля пустых лакун, лакун с клеточным детритом (Рисунок 55А, Б). В глубокой зоне снижена клеточная плотность, преобладали так называемые «темные хондроциты», характеризующиеся очаговой конденсацией хроматины и темной интенсивно базофильной цитоплазмой (Рисунок 55В). А Б В Рисунок 55 - Дегенеративно-деструктивные изменения хондроцитов в поверхностной (А), промежуточной (Б), глубокой (В) зонах хряща. Срок эксперимента 40 суток иммобилизации. Полутонкий срез. Окраска метиленовым синим-основным фуксином. Об. - 100МИ; ок. - 12,5х. В субхондральной зоне выявлены активные остеокласты, резорбирующие основное вещество отсутствовала зона кальцифицированного кальцифицированного хряща. В отдельных хряща, отмечено участках нарушение целостности базофильной линии, проникновение костномозгового паннуса в хрящ (Рисунок 56). 101 Рисунок 56 - Общий вид суставного хряща. Срок эксперимента 40 суток иммобилизации. Полутонкий срез, окраска метиленовым синим-основным фуксином. Об. - 6,3; ок. - 12,5х. 4.4. Результаты изучения репаративных возможностей суставного хряща после моделирования остеоартроза. Через 14 суток после МОА (период иммобилизации 28 суток) при исследовании в СЭМ сохранялись очаги разволокнения суставной поверхности, отмечены вскрытые лакуны, наблюдалось формирование узур (Рисунок 57). Рисунок 57 - Поверхностная зона, вскрытые клеточные лакуны. СЭМ. 14 суток после моделирования остеоартроза. Увеличение 3300. 102 На полутонких срезах в поверхностной зоне отмечено разволокнение межклеточного вещества с демаскировкой коллагеновых волокон. Большая часть хондроцитов находилась в состоянии лизиса. Клетки теряли способность к окрашиванию, хотя и сохраняли свои обычные размеры (Рисунок 58). А Б Рисунок 58 – Суставной хрящ через 14 суток после моделирования остеоартроза. Полутонкий срез, окраска метиленовым синим-основным фуксином. Об. - 40; ок. - 12,5х. А - поверхностная зона, Б – промежуточная зона. Хондроциты глубокой зоны находились в неактивном состоянии или состоянии деструкции. Были обнаружены лакуны с некротизированными клетками, клеточным детритом (Рисунок 59). Рисунок 59 - Хондроцит глубокой зоны в состоянии деструкции. 14 суток после моделирования остеоартроза. Полутонкий срез, окраска метиленовым синимосновным фуксином. Об. – 100МИ; ок. - 12,5х. Репаративная регенерация хряща выражалась увеличением количества клеток, объемной плотности хондроцитов и количества изогенных групп с 103 функционально активными клетками, незначительным увеличением содержания серы относительно МОА (Таблица 9). Через 28 суток после МОА отмечено увеличение частоты встречаемости и объема участков разволокнения (Рисунок 60). А Б Рисунок 60 - Суставной хрящ через 28 суток после моделирования остеоартроза. А – разволокнение суставной поверхности, СЭМ, увеличение 2500. Б - поверхностная зона. Полутонкий срез. Окраска метиленовым синим-основным фуксином. Об. - 40; ок. - 12,5х. Во всех зонах клетки имели в основном мелкие, часто пикнотически сморщенные ядра и скудную цитоплазму, много пустых лакун. В промежуточной зоне межклеточное вещество территориального матрикса не окрашивалось, хондроциты в составе изогенных групп находились в состоянии гибели и деструкции (Рисунок 61). А Б Рисунок 61 - Суставной хрящ через 28 суток после моделирования остеоартроза. Промежуточная зона. Полутонкий срез. Окраска метиленовым синим-основным фуксином. А - об.40; ок. 12,5х. Б - об. – 100МИ; ок. - 12,5х. 104 Основная часть хондроцитов глубокой зоны находилась в неактивном состоянии или состоянии деструкции. В части наблюдений отмечено расслоение, неравномерное окрашивание базофильной линии. Значения численной и объемной плотности хондроцитов не имели достоверных отличий от предыдущего срока (Таблица 9). Толщина хряща достоверно (p≤0,001) превышала значения МОА и контроля, что обусловлено более выраженной дезорганизацией межклеточного вещества поверхностной зоны, набуханием основного вещества и коллагеновых волокон. Таблица 9 - Количественные характеристики суставного хряща при биомоделировании остеоартроза Параметры Контроль h (мкм, M m) 475,55 1,31 NAch (мм-2, M σ) 6,15 2,45 NNem. lac. (%) 13,61 NNis. gr (%) 14,52 VVch ωS (вес.%) (%,М σ) 9,03 4,54 1,26 0,02 МОА 318,61 2,75 5,41 2,13 43,39 23,85 4,61 1,68 14 суток после МОА 28 суток после МОА 90 суток после МОА 563,21 13,15 * 510,98 1,82 * 326,67 6,37 5,74 2,62 31,35 16,24 6,42 2,37 * 7,61 2,22 * 35,73 16,19 40,38 8,91 5,52 2,49 0,81 0,025 * * 5,46 2,44 0,72 0,015 * 6,09 2,05 0,56 0,037 * * 0,70 0,02 Примечание: жирным шрифтом выделены достоверные отличия с контролем, * - с моделью остеоартроза. Через 90 суток после МОА деструктивные изменения прогрессировали, сохранялись очаги разволокнения с демаскировкой коллагеновых волокон (Рисунок 62). Во всех зонах много пустых лакун, особенно в промежуточной зоне, в которой отмечены бесклеточные поля, межклеточное вещество при окраске альциановым синим выглядело бесцветным. Основная часть хондроцитов в состоянии лизиса (Рисунок 63). Обнаружены изменения цитоархитектоники глубокой зоны – отсутствовало колончатое расположение клеток. В части наблюдений сохранялись участки, в которых нарушена целостность базофильной линии. 105 А Б Рисунок 62 - Суставной хрящ через 90 суток после МОА. А – разволокнение суставной поверхности, вскрытые лакуны, СЭМ, увеличение 850, Б – поверхностная зона. Полутонкий срез. Окраска метиленовым синимосновным фуксином. Об. - 40; ок. - 12,5х. А Б В Рисунок 63 - Деструкция матрикса и клеток хряща через 90 суток после МОА. Полутонкий срез. Окраска метиленовым синим-основным фуксином. Об. 100МИ; ок. - 12,5х. А – поверхностная зона, Б – промежуточная зона, В – глубокая зона. Наблюдалось увеличение численной плотности хондроцитов по сравнению с предыдущими сроками эксперимента, за счет увеличения клеток в поверхностной зоне, при этом клетки уменьшены в размерах, прогрессировало снижение параметра – площадь хондроцитов (Рисунок 64А). Значения ядерноцитоплазматического индекса в поверхностной зоне снижены относительно контроля и предыдущего этапа эксперимента, в глубокой зоне сопоставимы с контролем, в промежуточной зоне выявлена тенденция к увеличению (Рисунок 64Б), за счет снижения доли цитоплазмы, обусловленного присутствием преапоптозных клеток (Рисунок 65). 106 А Б Рисунок 64 - Значения площади (мкм2) хондроцитов (А) и ядерноцитоплазмтического индекса (Б) через 90 суток после МОА. Рисунок 65 - Хондроцит промежуточной зоны. 90 суток после МОА. Сжатие клетки, вакуолизация цитоплазмы. Полутонкий срез. Окраска метиленовым синим-основным фуксином. Об. - 100МИ; ок. - 12,5х. Окраска альциановым синим имела очаговый характер, значительно снижена ее интенсивность, содержание серы достоверно (p≤0,05) ниже предыдущих сроков и значений при МОА (Таблица 9). В таблице 10 представлены качественные характеристики суставного хряща интактных и экспериментальных животных. Увеличение доли пустых лакун и снижение доли изогенных групп в общем объеме выборки, прогрессирующего уменьшения содержания на фоне сульфатированных гликозаминогликанов, свидетельствовало о срыве компенсаторных возможностей хряща. Закономерным выглядело достоверное (p<0,001) снижение толщины хряща (Таблица 9). 107 Таблица 10 - Качественные характеристики суставного хряща при биомоделировании остеоартроза Базофильная линия (БЛ) Хондроциты (Хц) Межклеточное вещество Суставная поверхность (МКВ) Харак терист ики В Интактный хрящ Модель остеоартроза (28 суток иммобилизации) Не разволокнена Разволокнена, в отдельных наблюдениях очаги разволокнения углублялись до промежуточной зоны. Дефекты поверхности с потерей матрикса в поверхностной зоне. Гомогенно во всех Нарушена зонах, гомогенность МКВ интенсивность поверхностной зоны. реакции на Гистохимическая сульфатированные реакция на сГАГ гликозаминогликаны существенно (сГАГ) ослаблена. увеличивалась от поверхностной к глубокой зоне. Хц имели Основная часть Хц в нормальное строение состоянии гибели и деструкции. Увеличение пустых лакун, изогенных групп. БЛ не нарушена, Неравномерное имела четкие окрашивание контуры. фрагментация, проникновение костномозгового паннуса. субхондральной кости и 90 суток после МОА Сохранялись разволокнения. очаги Нарушена гомогенность МКВ поверхностной зоны, демаскировка коллагеновых волокон. Снижена интенсивность реакция на сГАГ. Во всех зонах много пустых лакун, в промежуточной зоне бесклеточные поля. В глубокой зоне отсутствовало колончатое расположение клеток. Хц уменьшены в размерах. Повышена клеточная плотность в поверхностной зоне. Фрагментация БЛ, в части БЛ, наблюдений нарушение целостности. эпифизе (Таблица 11) наблюдалось неравномерное окрашивание и расщепление вдоль линии склеивания костного вещества с демаскировкой костных пластин, снижение минерализации. 108 Таблица 11 - Качественные характеристики кальцифицированного хряща и субхондральной зоны при биомоделировании остеоартроза Эпифиз Субхондральная зона (СХЗ) Кальцифицированный хрящ (КХ) Харак терист ики Интактный хрящ Зона КХ имела четкую визуализацию, ограничена хорошо выраженной БЛ. КХ присутствовал на всем протяжении. Отмечена инвазия сосудов. Субхондральная кость в виде замкнутой пластинки плавно переходящая в трабекулярную часть эпифиза, хорошо васкуляризована. Костные трабекулы содержат остеоциты и окружены снаружи слоем остеобластов (в основном неактивных). Межтрабекулярные промежутки заполнены костным мозгом (преобладает красный костный мозг). МОА (28 суток иммобилизации) На границе с КХ в зонах замедления микроциркуляции активация остеокластической резорбции, отмечены участки, в которых КХ отсутствовал. В отдельных участках отмечено утолщение зоны КХ. В СХЗ выявлен очаговый остеосклероз, наблюдалась активация остеобластов, утолщение костных трабекул. Агрегация эритроцитов и «предтромбоз» кровеносных сосудов микроциркуляторного русла. Выявлены морфологические проявления остеопороза в виде разряжения губчатой кости, истончения костных трабекул. 90 суток после МОА Неравномерная толщина КХ. В одних участках КХ отсутствовал, отмечена инвазия сосудов, в других - замещение КХ костной тканью. В СХЗ очаговый остеосклероз, расщепление вдоль линии склеивания костного вещества с демаскировкой костных пластин. На границе с КХ образование округлых дефектов - кист, заполненных соед. тканью. Преобладал желтый костный мозг. Сохранялись морфологические признаки остеопороза. Прогрессировала деструкция костных трабекул - расщепление вдоль линии склеивания костного вещества с демаскировкой костных пластин, что свидедельствовало о снижении минерализации. В отдаленные сроки эксперимента через 1 год после МОА при светооптическом зональной исследовании структуры хряща. полутонких Очаги срезов выявлено разволокнения нарушение захватывали поверхностную зону и большую часть промежуточной зоны (Рисунок 66). всю 109 Рисунок 66 - Нарушение зональной структуры суставного хряща через 1 год после МОА. Полутонкий срез. Окраска метиленовым синим-основным фуксином. Об.- 6,3; ок. - 12,5х. В очагах разволокнения отмечены: демаскировка коллагеновых волокон, что свидетельствовало о прогрессирующем снижении содержания сульфатированных гликозаминогликанов в матриксе хряща; некротические изменения межклеточного вещества; хондроциты аномальной формы, пустые клеточные лакуны (Рисунок 67А, Б). А Б Рисунок 67 - Деструктивные изменения суставного хряща через 1 год после МОА. Полутонкий срез. Окраска метиленовым синим-основным фуксином. Об.- 40; ок. - 12,5х. А – демаскировка коллагеновых волокон в очагах разволокнения поверхностной зоны. Б – некротические изменения межклеточного вещества, пустые лакуны в промежуточной зоне. 110 Во всех зонах хряща хрящевые клетки уменьшены в размерах, занимали часть лакуны. Основная часть хондроцитов с признаками деструкции, клетки имели в основном мелкие, часто пикнотически сморщенные ядра и скудную цитоплазму. Увеличена доля бесклеточных полей. Во всех зонах выявлены пустые лакуны, функционально активные хондроциты отмечены единично. В глубокой зоне нарушена цитоархитектоника, хондроциты располагались одиночно, редко в виде 2-х членных изогенных групп. На большем протяжении базофильная линия фрагментарно утолщена в виде гиперхромных глыбок (Рисунок 68А). В отдельных участках нарушалась непрерывность базофильной линии, отмечены ее разрывы. В таких участках отсутствовала зона кальцифицированного хряща, отмечено проникновение сосудов субхондральной зоны в глубокую зону хряща (Рисунок 68Б). Рисунок 68 - Глубокая зона суставного хряща через 1 год после МОА. Бесклеточные поля, хондроциты в состоянии деструкции. Полутонкий срез. Окраска метиленовым синим-основным фуксином. Об.- 40; ок. - 12,5х. А – бесклеточные поля, хондроциты в состоянии деструкции, базофильная линия фрагментирована. Б – проникновение сосудов в хрящ. Гистохимическая реакция на сульфатированные гликозаминогликаны существенно ослаблена, межклеточное вещество поверхностной и промежуточной зон не окрашивалось, в глубокой зоне бледно-голубые участки чередовались с бесцветными (Рисунок 69). 111 Рисунок 69 - Суставной хрящ. Срок эксперимента 1 год после МОА. Гистохимическая реакция на сГАГ. Парафиновый срез, окраска альциановым синим при pH 1,0. Об. – 6,3; ок. – 12,5х. Прогрессировало снижение морфометрируемых параметров: толщины хряща - 306,86±0,99 мкм; численной и объемной плотности хондроцитов – 5,75±1,36 и 4,77±1,24% соответственно. Подавлена пролиферативная активность хондроцитов, значительно снижена доля изогенных групп (4,8%) в общем объеме выборки. Сохранялись высокие значения доли пустых лакун – 27,08%. Через 3 года после МОА при светооптическом исследовании полутонких срезов выявлено снижение интенсивности окраски межклеточного вещества, особенно в поверхностной и верхних слоях промежуточной зоны, нарушение цитоархитектоники, отмечена демаскировка коллагеновых волокон во всех зонах хряща (Рисунок 70). Подавлена пролиферативная активность хрящевых клеток, изогенные группы отмечены единично. Гистохимическая сульфатированные гликозаминогликаны существенно ослаблена. реакция на 112 Рисунок 70 - Нарушение структуры суставного хряща через 3 года после МОА. Полутонкий срез. Окраска метиленовым синим-основным фуксином. Об.- 6,3; ок. - 12,5х. В поверхностной зоне хондроциты имели неправильную отросчатую форму, их цитоплазма интенсивно базофильна, ядра пикнотически окрашены. Отмечены хондроциты в состоянии деструкции, остатки погибших клеток. Нарушена гомогенность межклеточного вещества, оно стало волокнистым, перицеллюлярный матрикс выглядел бесцветным (Рисунок 71). По-видимому, хондроциты поверхностной зоны литически воздействовали на окружающее межклеточное вещество. А Б Рисунок 71 - Поверхностная зона суставного хряща через 3 года после МОА. Полутонкий срез. Окраска метиленовым синим-основным фуксином. А – демаскировка коллагеновых волокон в очагах разволокнения поверхностной зоны. Об. - 40; ок. - 12,5х. Б – хондроциты с интенсивно базофильной цитоплазмой. Об. - 100МИ; ок. - 12,5х. 113 В промежуточной и глубокой зонах снижена клеточная плотность, отмечены пустые лакуны, увеличена доля бесклеточных полей, четко выявлялся коллагеновый каркас, что свидетельствовало о резком обеднении матрикса протеогликанами, обеспечивающие гомогенность межклеточного вещества. В отличие от предыдущего срока эксперимента отмечены хондроциты, которые отличались увеличением размеров, имели светлые гомогенные ядра, хорошо развитую цитоплазму, содержащую трофические включения, миелиновые структуры (Рисунок 72). А Б Рисунок 72 - Промежуточная (А) и глубокая (Б) зоны суставного хряща через 3 года после МОА. Полутонкий срез. Окраска метиленовым синим-основным фуксином. Об. - 100МИ; ок. - 12,5х. Как и на предыдущем сроке эксперимента базофильная линия на большем протяжении фрагментарно утолщена в виде гиперхромных глыбок, в отдельных участках нарушалась ее непрерывность, отмечены разрывы. Истончалась зона кальцифицированного хряща, отмечено проникновение сосудов субхондральной зоны в глубокую зону хряща (Рисунок 73). 114 Рисунок 73 - Глубокая зона суставного хряща через 3 года после МОА. Фрагментация базофильной линии, истончение зоны кальцифицированного хряща, проникноверние сосудов в хрящ. Полутонкий срез. Окраска метиленовым синим-основным фуксином. Об. - 100МИ; ок. - 12,5х. Резюме главы. При данных условиях моделирования остеоартроза наблюдалось разволокнение суставной поверхности, выявлены дистрофические изменения, выражающиеся Выявленные гибелью неравномерное значительное снижение и деструкцией окрашивание интенсивности части межклеточного гистохимической хондроцитов. матрикса и реакции на сульфатированные гликозаминогликаны сопровождались снижением толщины хряща. В мыщелках бедренной кости отмечены остеопороз, очаговый остеосклероз субхондральной зоны, нарушение микроциркуляции - агрегация эритроцитов и «предтромбоз» кровеносных сосудов микроциркуляторного русла. Выявленные морфологические изменения соответствуют ранним стадиям остеоартроза - степень 1-3 (Всего 6 стадий по гистологической классификации Международного общества изучения остеоартроза OARSI, 2006.). В отдаленные сроки эксперимента после моделирования остеоартроза в суставах отмечен нарастающий артроз. Выраженность признаков регенерации была незначительной, с увеличением срока эксперимента деструктивные изменения прогрессировали. 115 Глава 5. Структурная реорганизация нагружаемых участков суставного хряща мыщелков бедра при удлинении конечности 5.1. Структурная реорганизация нагружаемых участков суставного хряща мыщелков бедра при удлинении конечности с различной дробностью и темпом дистракции в ручном и автоматическом режимах (в 1 серии – 1 мм за 4 приема, во 2 серии – 1 мм за 8 приемов, в 3 серии – 1мм за 60 приемов, в 4 серии – 3 мм за 180 приемов). При клинических наблюдениях за экспериментальными животными всех серий к концу дистракции в смежных суставах определялись контрактуры, наиболее выраженные в сериях «1/4» и «3/180». У собак в серии «1/60» положение стопы было близко к физиологическому, тогда как у животных в сериях «1/8» и «3/180» стопа находилась в эквинусном положении. Через 30 суток фиксации в сериях «1/60» и «1/8» собаки практически полностью нагружали оперированную конечность, амплитуда движений в коленном суставе приближалась к норме, положение стопы было близко к физиологическому. Животные серий «1/4» и «3/180» к этому сроку щадили оперированную конечность, у собак в серии «3/180» стопа находилась в эквинусном положении. Через месяц после снятия аппарата функция коленного сустава собак практически не отличалась от исходных значений. 5.1.1. Морфофункциональное состояние суставного хряща при разных условиях удлинения смежного сегмента конечности в ручном и автоматическом режимах. Сканирующая электронная микроскопия и светооптическое исследование полутонких срезов выявили, что к концу периода дистракции наиболее ранние изменения во всех сериях появляются в поверхностной и глубокой зонах хряща. В поверхностной зоне с помощью СЭМ во всех сериях выявлены очаги c утратой 116 бесклеточной пластинки и разволокнением, лакуны хондроцитов были часто вскрыты, часть из них не содержала клеток (Рисунок 74). А Б В Г Рисунок 74 - СЭМ, поверхность, обращенная в полость сустава. Конец периода дистракции. А – серия «1/4», увеличение 850, Б – серия «1/8», увеличение 500, В – серия «1/60», увеличение 500. Г – серия «3/180», увеличение 900. Наиболее интенсивные деструктивные изменения – разволокнение коллагенового каркаса поверхностной зоны с формированием узур - отмечены в серии «1/4» (Рисунок 74А). При микроскопии полутонких срезов во всех сериях обнаружено нарушение гомогенности межклеточного вещества, снижение интенсивности его окрашивания основными красителями, выявлены очаги разволокнения (Рисунок 75). В очагах разволокнения хондроциты аномальной формы, часть из них с пикнотичными ядрами, в состоянии гибели. Наиболее выраженные 117 деструктивные изменения - вплоть до запустевания отдельных участков поверхностной зоны - выявлены в серии «1/4» (Рисунок 75А). А Б В Г Рисунок 75 - Поверхностная зона хряща. Конец периода дистракции. Полутонкие срезы, окраска метиленовым синим-основным фуксином. Об. - 40; ок. - 12,5х (А, В, Г). Об. - 100МИ; ок. - 12,5х (Б). А – серия «1/4», Б – серия «1/8», В – серия «1/60», Г – серия «3/180». Наряду с разволокненными (Рисунок 76А) были обнаружены участки хряща, имеющие обычную структуру поверхностной зоны, с сохранением бесклеточной пластинки (Рисунок 76Б). 118 А Б Рисунок 76 - Поверхностная зона хряща. Конец периода дистракции, серия «1/60». Полутонкие срезы, окраска метиленовым синим-основным фуксином. Об. – 100МИ; ок. - 12,5х. А – поверхностные изменения хряща, разрушение бесклеточной пластинки (БПл), Б – неповрежденный участок суставной поверхности, сохранена бесклеточная пластинка. Во всех сериях, кроме серии «1/60», в единичных опытах было отмечено нарушение целостности базофильной линии, а также проникновение сосудов и костномозгового паннуса в глубокую зону хряща (Рисунок 77). А Б В Рисунок 77 - Нарушение целостности базофильной линии, проникновение сосудов (А, В), костномозгового паннуса (Б) в глубокую зону хряща. Конец периода дистракции. Полутонкие срезы, окраска метиленовым синим-основным фуксином. Об. – 100МИ; ок. - 12,5х (А, В). Об. - 16; ок. - 12,5х (Б). А – серия «1/4», Б – серия «1/8», В – серия «3/180». В суставном хряще экспериментальных животных деструктивно измененные хондроциты выявлены во всех зонах, но наибольшая частота встречаемости отмечена в поверхностной и глубокой зонах. Наблюдали явления 119 вакуолизации ядра (Рисунок 78А), кариопикноза (Рисунок 78Б), кариорексиса (Рисунок 78В). А Б В Рисунок 78 - Морфологические признаки повреждения хондроцитов суставного хряща при удлинении смежного сегмента конечности. Полутонкие срезы, окраска метиленовым синим-основным фуксином. Об. – 100МИ; ок. - 12,5х. А - вакуолизации ядра. Серия «1/4». Б – кариопикноз. Серия «1/8». В – кариорексис. Серия «1/4». Признаки повреждения клеток выявляли и в цитоплазме, отмечали мелкозернистую массу (Рисунок 79А). Наблюдали хондроциты, в которых цитоплазма уплотнена, выглядела однородной, стекловидной, вокруг таких клеток формировались перицеллюлярные очаги распада ткани (Рисунок 79Б). А Б Рисунок 79 - Морфологические признаки повреждения хондроцитов суставного хряща при удлинении смежного сегмента конечности. Полутонкие срезы, окраска метиленовым синим-основным фуксином. Об. – 100МИ; ок. - 12,5х. А - серия «1/60», хондроциты в состоянии деструкции (стрелки). Б – серия «3/180», очаги распада перрицеллюлярного матрикса (ПрМ), пикноз ядра (Я) хондроцита справа, скопление секреторных гранул (СГр). 120 При исследовании в СЭМ отмечали функционально активные хондроциты, которые занимали всю клеточную лакуну, поверхность таких клеток имела бугристый рельеф, многочисленные отростки контактировали со стенкой лакуны, фиксируя положение клетки (Рисунок 80А). Наряду с этим наблюдали явления сжатия клеток с сохранением контактов с межклеточным матриксом (Рисунок 80Б). Отмечали клетки, которые занимали лишь часть лакуны, имели округлые контуры; поверхность таких клеток была гладкая, наблюдалась потеря контактов с межклеточным матриксом (Рисунок 81). А Б Рисунок 80 - СЭМ. Хондроцит в лакуне. А - увеличение 4300. Серия «1/8». Поверхность клетки имеет бугристый рельеф. Многочисленные отростки (О) контактируют со стенкой лакуны. Стенки лакуны построены из коллагеновых фибрилл (Кф). Б – увеличение 5500. Серия «1/4». Рисунок 81 - Серия «1/4». Хондроцит в лакуне. Увеличение 5000. 121 Наряду с отмеченными выше признаками некротической гибели хондроцитов обнаруживались клетки с признаками апоптоза, что рассматривалось нами не только как проявление физиологического обновления гиалиновой хрящевой ткани, но и как реакцию на условия эксперимента. Наиболее часто морфологические картины апоптоза хондроцитов выявлены в серии «1/4», где наиболее часто были отмечены клетки с признаками повреждения (Рисунок 82Б). Наблюдаемые деструктивные изменения имели мозаичный характер и сопровождались изменением количественных характеристик хряща на тканевом и клеточном уровнях структурной организации. А Б Рисунок 82 - Хондроциты промежуточной зоны хряща. Полутонкие срезы, окраска метиленовым синим-основным фуксином. Об. – 100МИ; ок. - 12,5х. А – серия «3/180». Функционально активный хондроцит, занимает всю лакуну с хорошо развитой цитоплазмой. Б – серия «1/4». Хондроцит с признаками апоптоза, наблюдается сжатие клетки, занимает часть лакуны, доля ядра значительно превышает долю цитоплазмы, хроматин конденсируется по периферии, при этом образуются плотные массы различной формы и размеров (стрелки). 5.1.2. Сравнительный анализ количественных характеристик суставного хряща. В поверхностной зоне к концу дистракции численная плотность клеток в сериях «1/60» и «3/180» не имела достоверных (p>0,05) различий с интактной нормой (Рисунок 83). При ручных режимах в сериях «1/4» и «1/8» исследуемый 122 параметр достоверно снижался (р<0,05), минимальные значения отмечены при удлинении смежного сегмента конечности в режиме 1 мм за 4 приема. Достоверность различий между экспериментальными сериями указана в приложении (Таблица 8-13). Достоверность различий анализируемого параметра мкм -2 относительно контроля обусловлена присутствием пустых клеточных лакун. 14 12 10 8 6 4 2 0 контроль контроль 1 мм за 8 приемов 3 мм за 180 приемов конец дистракции 30 дней фиксации 30 дней без аппарата 1 мм за 4 приема 1 мм за 60 приемов в дневное время Рисунок 83 - Динамика численной плотности хондроцитов (NAch) поверхностной зоны суставного хряща на этапах эксперимента. Сравнительный анализ долей пустых клеточных лакун (NNem.lac.) в суставном хряще интактных и экспериментальных собак обнаружил существенную разницу в степени выраженности деструктивного процесса в зависимости от режима дистракции. Максимальные значения NNem.lac. к концу дистракции выявлены в серии «1/4» (Рисунок 84). Через месяц фиксации в сериях «1/60» и «3/180» численная плотность клеток снижена относительно предыдущего срока, наибольшее снижение выявлено в серии «3/180», в которой значения NNem.lac. были максимальными. В сериях «1/4» и «1/8», относительно предыдущего срока эксперимента наблюдалась тенденция к увеличению численной плотности клеток, максимальные значения выявлены в серии «1/4». 123 Рисунок 84 - Доля пустых клеточных лакун (NNem.lac., %)в суставном хряще на этапах эксперимента. Повышение численной плотности клеток в сериях «1/4» и «1/8» наблюдалось в результате увеличения в поверхностной зоне количества изогенных групп, состоящих из 2, 4, 6, 8 клеток, такие участки, как и очаги разволокнения имели мозаичный характер (Рисунок 85). А Б Рисунок 85 - Поверхностная зона хряща. Фиксация 30 суток. Полутонкие срезы, окраска метиленовым синим-основным фуксином. А – серия «1/4». Об. – 16; ок. 12,5х. Б – серия «1/8». Об. – 40; ок. - 12,5х. Это может быть обусловлено более выраженной реактивной реакцией хондроцитов в ответ на действие механических факторов (компрессией) при данных режимах дистракции (величина разового удлинения – 0,25 мм в 1 серии и 0,125 мм во 2 серии). О включении механического компонента в патогенез 124 свидетельствует локализация деструктивного процесса в участках высокой нагрузки. К концу эксперимента в сериях «1/8» и «1/60» численная плотность клеток сохраняла сниженные значения, за счет увеличения доли межклеточного вещества. В серии «3/180» значения анализируемого параметра были сопоставимы с нормой, в серии «1/4» превышали контроль, что обусловлено реакцией хрящевых клеток на более выраженное повреждение поверхностной зоны при данном режиме дистракции. Средние значения площади хондроцитов поверхностной зоны к концу периода дистракции во всех сериях снижены, минимальные значения отмечены в серии «1/4», относительно сравниваемых серий в меньшей степени площадь клеток снижена в серии «1/60» (Рисунок 86). Рисунок 86 - Площадь хондроцитов (Sch, мкм2) поверхностной зоны суставного хряща на этапах эксперимента. На последующих этапах эксперимента в серии «1/4» данный параметр продолжал снижаться. В сериях «1/8» и «3/180» выявлена сходная динамика – на этапе фиксации отмечено повышение, к концу эксперимента снижение анализируемого параметра. При автодистракции с темпом 1 мм площадь хондроцитов увеличивалась и достигала максимальных значений к концу 125 эксперимента (Рисунок 86). Достоверность различий между экспериментальными сериями указана в приложении (Таблица 8-13). Объемная плотность хондроцитов поверхностной зоны к концу дистракции во всех сериях достоверно (p<0,05) уменьшалась по сравнению с контролем (Рисунок 87). Наибольшее снижение анализируемого параметра отмечено в сериях «1/4» и «1/8», что обусловлено снижением количества клеток и увеличением количества пустых лакун, уменьшением размеров хондроцитов, находящихся в состоянии деструкции. Через месяц фиксации в серии «1/60» объемная плотность клеток продолжала снижаться, что обусловлено снижением численной плотности клеток относительно предыдущего срока. В сериях «1/4», «1/8» и «3/180» относительно предыдущего срока выявлена тенденция к увеличению анализируемого параметра, за счет увеличения количества изогенных групп клеток. В серии «1/8» объемная плотность хондроцитов была сопоставима с нормой. Рисунок 87 - Динамика объемной плотности хондроцитов (VVch) поверхностной зоны суставного хряща на этапах эксперимента. Через месяц после снятия аппарата объемная плотность клеток в сериях «1/8» и «1/60» достигала, или приближалась к норме, в сериях «1/4» и «3/180» сохранялись сниженные значения. Достоверность различий экспериментальными сериями указана в приложении (Таблица 8-13). между 126 Необходимо учитывать, что при автодистракции с темпом 3 мм период дистракции составлял 10 суток, поэтому срок эксперимента в отличие от других серий был сокращен на 18 суток. Низкие значения объемной плотности хондроцитов при 4-х кратном режиме дистракции обусловлены наличием пустых клеточных лакун (сохранялись высокие значения NNem.lac.) и хондроцитов, находящихся в состоянии деструкции (значения Sch минимальные). При количественном исследовании на клеточном уровне – цито- и кариометрии наиболее ярко выражены изменения хондроцитов неповрежденных участков поверхностной зоны. Во всех экспериментальных сериях на протяжении всего эксперимента выявлено снижение ядерно-цитоплазматического индекса (NCI) в связи с более значительным ростом объемной доли цитоплазмы по сравнению с ядром, наиболее выраженным при автодистракции с темпом 1 мм (Рисунок 88). контроль 1 мм за 8 приемов 3 мм за 180 приемов 1 мм за 4 приема 1 мм за 60 приемов в дневное время 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 конец дистракции 30 дней фиксации 30 дней без аппарата А Б Рисунок 88 - А – хондроциты неповрежденных участков поверхностной зоны, срок эксперимента 30 суток фиксации. Полутонкие срезы, окраска метиленовым синим-основным фуксином. Об. – 100МИ; ок. - 12,5х. Монтаж, сверху вниз: контроль, серия «1/4», серия «1/8», серия «1/60», серия «3/180». Б - динамика ядерно-цитоплазматического индекса (NCI) хондроцитов поверхностной зоны суставного хряща на этапах эксперимента. Динамика изменений NCI на этапах эксперимента в сериях «1/60» и «3/180» имела одинаковый характер и свидетельствовала об усилении биосинтетической 127 активности клеток поверхностной зоны. Наименьшее снижение NCI на всех сроках эксперимента выявлено при 4-х кратной дистракции. При ручных режимах дистракции к концу эксперимента NCI приближался к контрольным значениям. Судя по увеличению фактора формы и значению минимального диаметра (Рисунок 89), во всех изученных сериях опыта хрящевые клетки поверхностной зоны округлялись. Рисунок 89 - Динамика минимального диаметра (мкм) хондроцитов поверхностной зоны суставного хряща на этапах эксперимента. Это удавалось подтвердить с помощью СЭМ (Рисунок 90): в контроле (у интактных животных) клетки поверхностной зоны имели узко- продолговатую форму (Рисунок 90А), а для опытов с удлинением голени были характерны хондроциты сферической формы (Рисунок 90Б), причём наиболее часто такие формы встречались на этапе фиксации голени в аппарате. Во всех сериях на протяжении всего эксперимента минимальный диаметр клеток превышал норму, но в наибольшей степени – при автодистракции с темпом 1 мм на этапах дистракции и фиксации. 128 А Б Рисунок 90 - Хондроциты поверхностной зоны, СЭМ. А – контроль, увеличение 8500, Б – «1/60», 30 суток фиксации, увеличение 5500. К концу эксперимента при атодистракции с темпом 3 мм отмечено дальнейшее увеличение анализируемого параметра относительно предыдущих сроков, что вероятно связано с более коротким периодом дистракции в этой серии, в связи с чем, адаптационные процессы были выражены в более поздний срок. В остальных сериях отмечена тенденция к снижению, относительно предыдущего срока. Известно, что функционально активные клетки больше по размерам и имеют округлую форму [29, 39]. Полученные данные указывали на усиление биосинтетической активности хондроцитов поверхностной зоны - синтезе компонентов межклеточного вещества, наиболее выраженной при автодистракции с темпом 1 мм. В глубокой зоне при автодистракции с темпом 1 мм и при 8-ми кратных ручных подкрутках к концу периода дистракции численная плотность клеток превышала контроль (Рисунок 91), за счет увеличения количества клеток в колонках, формирования изогенных групп вокруг которых территориальный матрикс отсутствовал (Рисунок 92Б, В). мкм-2 129 8 7 6 5 4 3 2 1 0 контроль конец дистракции контроль 1 мм за 8 приемов 3 мм за 180 приемов 30 дней фиксации 30 дней без аппарата 1 мм за 4 приема 1 мм за 60 приемов в дневное время Рисунок 91 - Динамика численной плотности хондроцитов (NAch) глубокой зоны суставного хряща на этапах эксперимента. А Б В Г Рисунок 92 - Глубокая зона хряща. Конец периода дистракции. Полутонкие срезы, окраска метиленовым синим (В) и метиленовым синим-основным фуксином (А, Б, Г). Об. – 16; ок. - 12,5х. А – серия «1/4». Б – серия «1/8». В – серия «1/60». Г – серия «3/180». При 4 - кратных ручных подкрутках и при автодистракции с темпом 3 мм значения данного параметра значимо снижены, минимальные значения выявлены 130 при повышенном суточном темпе удлинения. При светооптическом исследовании полутонких срезов в этих сериях выявлено изменение цитоархитектоники глубокой зоны, отсутствовало колончатое расположение клеток, появлялись бесклеточные поля, часть хондроцитов в состоянии деструкции, выявлены пустые лакуны (Рисунок 92А, Г). Через месяц фиксации голени в аппарате по сравнению с предыдущим этапом эксперимента и контролем в сериях «1/4» и «1/8» наблюдалось увеличение численной плотности хондроцитов (Рисунок 91). В серии «1/60» значения численной плотности хондроцитов снижены относительно контроля, за счет снижения количества клеток в колонках. В серии «3/180» относительно предыдущего срока на этапе фиксации голени в аппарате выявлена тенденция к увеличению данного показателя, а к концу эксперимента (через 30 суток после снятия аппарата) численная плотность хондроцитов превышала контроль. В остальных сериях к концу эксперимента значения данного параметра снижены по сравнению с контролем, минимальные значения выявлены в серии «1/4», что связано не только с изменением объёма матрикса, но и гибелью хондроцитов. Достоверность различий между экспериментальными сериями указана в приложении (Таблица 8-13). Площадь хондроцитов (Sch) глубокой зоны к концу периода дистракции во всех сериях достоверно ниже нормы, наибольшее снижение отмечено в серии «1/4». Через месяц фиксации в сериях «1/4» и «1/60» наблюдалось увеличение, а в сериях «1/8» и «3/180» незначительное снижение данного параметра относительно предыдущего срока. К концу эксперимента через месяц после снятия аппарата во всех сериях выявлено увеличение площади клеток относительно срока 30 суток фиксации, максимальные значения отмечены в серии «1/60», однако относительно интактного контроля во всех сериях значения снижены (Рисунок 93). 131 Рисунок 93 - Площадь хондроцитов (Sch, мкм2) глубокой зоны суставного хряща на этапах эксперимента. Объемная плотность хондроцитов (Vvch) глубокой зоны к концу периода дистракции во всех сериях ниже нормы, минимальные значения выявлены в сериях «1/4» и «3/180» (Рисунок 94). Достоверность различий между % экспериментальными сериями указана в приложении (Таблица 8-13). 14 12 10 8 6 4 2 0 контроль контроль 1 мм за 8 приемов 3 мм за 180 приемов конец дистракции 30 дней фиксации 30 дней без аппарата 1 мм за 4 приема 1 мм за 60 приемов в дневное время Рисунок 94 - Динамика объемной плотности (Vvch) хондроцитов глубокой зоны суставного хряща на этапах эксперимента. 132 На последующих этапах наблюдалась тенденция к увеличению. Через месяц после снятия аппарата во всех сериях сохранялись сниженные значения относительно контроля, минимальные значения отмечены в серии «1/4», максимальные в серии «3/180». Ядерно-цитоплазматический индекс в сериях «1/8» и «3/180» к концу периода дистракции превышал контроль, максимально при режиме «1/8». Через месяц фиксации значения NCI в серии «3/180» продолжали увеличиваться, в серии «1/8» снижались, к концу эксперимента в обеих сериях значения NCI были сопоставимы с контролем (Рисунок 95). В серии «1/60» через 28 суток дистракции значения NCI не отличались от контроля, к концу эксперимента выявлена тенденция к снижению данного параметра, за счет увеличения объемной плотности цитоплазмы. В серии «1/4» NCI к концу периода дистракции незначительно снижался, через месяц фиксации вновь достигал контроля, к концу эксперимента достоверно снижен. Рисунок 95 - Динамика ядерно-цитоплазматического индекса хондроцитов глубокой зоны суставного хряща на этапах эксперимента. Во всех экспериментальных сериях наблюдаемые деструктивные изменения имели мозаичный характер и сопровождались процессами, которые можно рассматривать как компенсаторные, направленные на пластическое обеспечение репарации суставной поверхности. К таким процессам можно отнести активную пролиферацию хондроцитов, что проявляется в увеличении доли изогенных групп 133 клеток (NNis.gr) во всех экспериментальных сериях. На протяжении всего эксперимента NNis.gr во всех сериях была повышена по сравнению с интактным контролем (Рисунок 96). % контроль 1 мм за 8 приемов 3 мм за 180 приемов 1 мм за 4 приема 1 мм за 60 приемов в дневное время 40 35 30 25 20 15 10 5 0 конец дистракции 30 дней фиксации 30 дней без аппарата Рисунок 96 - Доля изогенных групп клеток (NNis.gr., %) в суставном хряще на этапах эксперимента. К концу периода дистракции максимальные значения доли изогенных групп в общем объеме выборки (NNis.gr) отмечены в сериях «1/60» и «1/4», что связано с увеличением двуядерных клеток и изогенных групп в неповрежденных участках поверхностной зоны. Через месяц фиксации максимальные значения NNis.gr отмечены в сериях «3/180» и «1/8». При 4-х кратной дистракции данный показатель на этапах фиксации и месяц после снятия аппарата ниже сравниваемых серий, в части изогенных групп хондроциты находились в состоянии деструкции. К концу эксперимента во всех сериях сохранялись повышенные значения NNis.gr, максимальные значения отмечены в серии «1/8». Во всех сериях наибольшая частота встречаемости изогенных групп клеток наблюдалась в верхней части промежуточной зоны. Необходимо так же отметить наличие изогенных групп клеток и в неповрежденных участках поверхностной и глубокой зоны. Во всех сериях фактор пролиферации – белок Кi67 был выявлен в виде окрашенного в коричневый цвет ядерного субстрата хрящевых клеток 134 преимущественно в верхних слоях промежуточной зоны, а также очагами в поверхностной и глубокой зонах (Рисунок 97). А Б В Рисунок 97 - Характер экспрессии Ki 67 хондроцитами суставного хряща собаки при удлинении голени в режиме 1 мм за 4 приема, фиксация 30 суток. Общий вид суставного хряща (А). Ок. - 6,3; об. - 12,5х. Поверхностная и верхние слои промежуточной зоны (Б), промежуточная зона (В). Ок. - 16; об. - 12,5х. По литературным данным в нормальных условиях деления клеток поверхностной зоны практически не наблюдается [81, 92, 103, 230]. Результаты исследований ряда авторов позволяют считать хондроциты поверхностной зоны резервными клетками, а поверхностную зону – зоной резервных клеток, так как при действии ряда факторов, в период восстановления часть клеток плотность клеток поверхностной зоны подвергается делению [71, 92]. Во всех экспериментальных сериях численная промежуточной зоны превышала контрольные значения. При автодистракции с темпом 1 мм увеличение NAch относительно контроля наблюдалось только на аппаратном этапе и было выражено в меньшей степени по сравнению другими сериями (Рисунок 98). Достоверность различий между экспериментальными сериями указана в приложении (Таблица 8-13). 135 Рисунок 98 - Динамика численной плотности хондроцитов (NAch) промежуточной зоны суставного хряща на этапах эксперимента. Площадь хондроцитов промежуточной зоны к концу периода дистракции в сериях «1/4», «1/8» и «3/180» достоверно ниже контроля, минимальные значения отмечены при режимах 1 мм за 4 приема и 3 мм за 180 приемов, при автодистракции с темпом 1 мм сопоставима с контролем (Рисунок 99). Рисунок 99 - Площадь хондроцитов (Sch, мкм2) промежуточной зоны суставного хряща на этапах эксперимента. Через месяц фиксации в сериях «1/4», «1/8» и «3/180» отмечена тенденция к увеличению, наиболее выраженная при режиме дистракции 1 мм за 8 приемов, 136 при автодистракции с темпом 1 мм наблюдалось снижение Sch. К концу эксперимента в сериях «1/8», «1/60» и «3/180» отмечено увеличение Sch относительно предыдущего срока эксперимента, при этом в сериях «1/8» и «3/180» значения достоверно ниже контроля, в серии «1/60» достоверно превышали контроль. При 4-кратной дистракции к концу эксперимента выявлено снижение Sch. Объемная плотность хондроцитов (Vvch) промежуточной зоны концу периода дистракции в сериях «1/4», «1/8» и «3/180» достоверно ниже контроля, минимальные значения отмечены при режимах 1 мм за 4 приема и 3 мм за 180приемов, при режиме 1 мм за 60 приемов незначительно превышала контроль (Рисунок 100). Достоверность различий между экспериментальными сериями указана в приложении (Таблица 8-13). Через месяц фиксации в сериях «1/4», «1/8» и «3/180» отмечена тенденция к увеличению, наиболее выраженная в серии «1/8», в серии «1/60» наблюдалось снижение данного параметра. К концу эксперимента значения Vvch в сериях «1/8» и «3/180» достигали, в серии «1/60» достоверно превышали контроль, в серии «1/4» достоверно ниже контроля. Рисунок 100 - Динамика объемной плотности хондроцитов промежуточной зоны суставного хряща на этапах эксперимента. При 8-ми кратной ручной дистракции и при автодистракции с темпом 1 мм к концу периода дистракции dmin клеток и dmin ядер промежуточной зоны 137 превышали контроль, максимальные значения (Рисунок 101) выявлены в срок 30 суток фиксации, к концу эксперимента значения данных параметров приближались к норме. Рисунок 101 - Динамика минимального диаметра (мкм) хондроцитов и их ядер в промежуточной зоне суставного хряща на этапах эксперимента. При 4-х кратной дистракции относительно сравниваемых серий на этапе фиксации значения dmin клеток и dmin ядер были максимальными, к концу эксперимента незначительно снижались, но превышали значения других серий эксперимента. При автодистракции с темпом 3 мм этап дистракции укорочен на 18 суток, в связи с чем, адаптационные процессы развились на более поздних этапах и значения данных параметров к концу дистракции и через месяц фиксации ниже сравниваемых серий, через месяц после снятия аппарата наблюдалось увеличение анализируемых параметров. В серии «1/4» в промежуточной зоне на этапе дистракции NCI значительно превышал норму (Рисунок 102), за счет увеличения (р 0,001) объемной плотности ядра, на последующих этапах эксперимента NCI снижался, относительно контроля сохранялись высокие значения. Увеличение объемной плотности ядер коррелирует с повышенным содержанием ДНК (пролиферация), либо РНК (биосинтез) [39]. При 8-ми кратной дистракции и автодистракции с темпом 1 мм на аппаратном этапе наблюдалась одинаковая динамика NCI: к концу дистракции значения NCI в равной степени превышали контроль, через месяц фиксации также 138 в равной степени снижались. К концу эксперимента при 8-ми кратной дистракции NCI достоверно (р 0,001) выше контроля, при автодистракции с темпом 1 мм достоверно снижен. (Рисунок 102). Рисунок 102 - Динамика ядерно-цитоплазматического индекса (NCI) хондроцитов промежуточной зоны суставного хряща на этапах эксперимента. При автодистракции с суточным темпом 3 мм на аппаратном этапе NCI достоверно (р 0,001) ниже контроля, к концу эксперимента незначительно превышал контроль. Увеличение параметров, характеризующих размер и форму клеток и их ядер, свидетельствовало об усложнении структуры хондроцитов, усилении биосинтетической и пролиферативной активности. Полученные данные о регенераторных возможностях суставного хряща при удлинении смежного сегмента конечности согласуются с литературными данными о компенсаторных процессах хрящевой ткани [39, 104]. Регенерационный гистогенез растущих тканей (к которым относится хрящевая ткань) включает процессы, как клеточной пролиферации, так и внутриклеточных биосинтезов, сопровождающихся увеличением объема клетки [39]. По данным В.В. Кормильченко c соавт. (2002) и К.Г. Редько с соавт. (2002), при суставной патологии выявлено снижение количественных характеристик хрящевых клеток [72, 113]. Полученные данные свидетельствовали о достаточно высокой степени выраженности компенсаторных 139 реакций гиалиновой хрящевой ткани мыщелка бедра в данных условиях удлинения голени. Динамика концентрации (ω) кальция по данным электронно-зондового микроанализа на этапах эксперимента выглядела следующим образом: к концу дистракции во всех сериях ω кальция достоверно (р<0,05) превышала контрольные значения, наибольшее увеличение отмечено в сериях «1/4» и «3/180», наименьшее при автодистракции с темпом 1 мм (Рисунок 103). Через месяц фиксации наблюдалось дальнейшее увеличение исследуемого параметра, наиболее выраженное в серии «1/4». H.I. Roach et al. (1995), Y. Ischikawa, L.N.Y. Wu, B.R. Genge (1997) и H.S. Cheung, L.M. Ryan (1999) обнаружили, что апоптотические тела, происходящие из хондроцитов, продуцируют осаждаемый кальций [174, 209, 252]. По данным биохимических исследований увеличение кальция объясняется накоплением гликановым компонентом протеогликанов анионных групп, которые улавливают и связывают кальций субхондральной кости [47, 108]. Рисунок 103 - Динамика концентрации кальция (вес. %) в суставном хряще на этапах эксперимента. К концу эксперимента в сериях «1/4» и «3/180» наблюдалось снижение концентрация кальция относительно предыдущего срока, во всех сериях значения данного параметра достоверно (р<0,05) превышали контроль, максимальные 140 значения отмечены в серии «1/4», что вероятно обусловлено более выраженной деструкцией протеогликанового компонента (разволокнением межклеточного вещества). При гистохимическом исследовании сульфатированных гликозаминогликанов во всех сериях интенсивность реакции усиливалась по направлению от поверхностной зоны к субхондральной кости (Рисунок 104). А Б В Рисунок 104 - Суставной хрящ, парафиновый срез, окраска альциановым синим при pH 1,0 (реакция на сГАГ). Об. – 2,5; ок. – 12,5х. А – контроль, Б – «3/180», 30 суток фиксации, В – «1/4», 30 суток без аппарата. Электронно-зондовый микроанализ подтвердил вышеописанное распределение. Концентрация серы увеличивалась от поверхностной зоны к глубокой (Рисунок 105). А Б Рисунок 105 - Суставной хрящ с подлежащей костью. Серия «3/180», 30суток без аппарата. А – поверхность эпоксидного блока, СЭМ, увеличение 100, линия сканирования перпендикулярна суставной поверхности. Б - элементная карта (Smart Map), отражающая распределение серы в суставном хряще и субхондральной кости. 141 Во всех сериях на всех этапах эксперимента методом электронно-зондового микроанализа выявлены сниженные (р<0,05) значения концентрации (ω) серы по сравнению с интактным хрящом (Рисунок 106). Рисунок 106 - Динамика концентрации серы (вес. %) в суставном хряще на этапах эксперимента. Необходимо отметить, что в серях «1/4» и «3/180», где интенсивнее были выражены деструктивные процессы, динамика ω серы имела одинаковый характер: снижение на этапе дистракции, увеличение относительно предыдущего периода к концу фиксации и снижение к концу эксперимента относительно периода фиксации, с минимальными значениями ω серы в серии «1/4». В сериях «1/8» и «1/60» на этапах фиксации и после снятия аппарата наблюдалась тенденция к увеличению анализируемого параметра относительно срока - конец дистракции. К концу эксперимента максимальные значения ω серы отмечены в серии «1/60» (Рисунок 106). Возможность и степень восстановления суставной поверхности иллюстрируют данные, полученные через месяц после снятия аппарата. При автодистракции с темпом 1 мм репаративная регенерация по типу реституции завершалась формированием суставной поверхности, приближающейся по структуре к интактной (Рисунок 107В). 142 А Б В Г Рисунок 107 - СЭМ, поверхность, обращенная в полость сустава. 30 суток после снятия аппарата. А – «1/4», увеличение 650, Б – «1/8», увеличение1000, В – «1/60» серия, увеличение 800, Г – «3/180» серия, увеличение 800. Отмечено восстановление гомогенности межклеточного вещества поверхностной зоны (Рисунок 108В) и толщины хряща (Рисунок 109). В остальных сериях регенерация суставного хряща имела незавершенный характер – в части наблюдений при исследовании в СЭМ выявлены участки, в которых определялись вскрытые клеточные лакуны (Рисунок 107А, Б, Г), на полутонких срезах сохранялось нарушение гомогенности поверхностной зоны (Рисунок 108А, Б, Г). межклеточного вещества 143 А Б В Г Рисунок 108 - Поверхностная зона суставного хряща. 30 суток после снятия аппарата. Полутонкие срезы. Окраска метиленовым синим-основным фуксином. Об. – 40; ок. – 12,5х (А, В, Г), об. – 16; ок. – 12,5х (Б). А – «1/4» серия, Б – «1/8» серия, В – «1/60» серия, Г – «3/180» серия. Морфометрический анализ выявил у животных серии «1/4» в период дистракции достоверное увеличение толщины хряща (Рисунок 109, таблица 12), что обусловлено выраженной дезорганизацией межклеточного вещества поверхностной зоны, при этом возникает набухание основного вещества и коллагеновых волокон в результате накопления и перераспределения гидрофильных гликозаминогликанов, дающих реакцию метахромазии. На последующих этапах эксперимента данный параметр достоверно ниже нормы. При высокодробных режимах к концу периода дистракции выявлено снижение толщины хряща, к концу эксперимента наблюдалось увеличение 144 данного параметра, но только в сериях с режимом дистракции «1/8» и «1/60» – до интактной нормы (Таблица 13, 14). Рисунок 109 - Динамика толщины (мкм) суставного хряща на этапах эксперимента. Таблица 12 - Характеристики суставного хряща на этапах эксперимента (1 мм за 4 приема, ручные подкрутки) Параметры Контроль I II III общее 28 суток дистракции I II III общее I II III общее I II III общее 30 суток фиксации 30 суток без аппарата VVch (%,М σ) NAch Sch (мкм-2,M σ) (мкм2,M σ) Контроль 6,12 2,43 8,21 2,19 45,34 10,51 8,75 2,54 4,45 1,34 119,91 24,37 12,26 3,21 5,73 2,15 129,31 28,14 9,03 4,54 6,12 2,45 87,52 16,58 1 мм за 4 приема (ручные подкрутки) 3,42 1,96* 5,42 1,68* 44,23 12,98 3,9 0,68* 4,94 1,33 53,64 10,38* 4,99 1,18* 4,91 1,56* 70,81 19,45* 4,13 1,01 5,14 2,13 55,93 14,89 4,12 1,26* 11,5 3,44* 29,53 7,15* 4,67 1,04* 6,3 1,44* 71,13 18,36* 6,58 1,43* 6,51 1,15* 80,75 14,13* 5,13 1,66* 7,97 3,16 58,91 17,36 4,14 0,97* 12,21 2,62* 27,75 4,32* 6,01 1,39* 7,13 2,68* 66,61 15,01* 6,91 1,97* 3,84 2,64* 103,25 29,92* 5,65 1,55 6,32 3,49 63,31 25,91 h (мкм, M m) NNem.lac. (%) NNis.gr. (%) 475,55 1,31 13,6 14,5 710,34 7,16 *** 29,97 24,7 421,15 4,82 *** 20,85 20,18 416,94 4,37 *** 21,12 15,4 Примечание: I – поверхностная, II – промежуточная, III – глубокая зоны хряща. Различия достоверны: *** - при р 0,001, * при р 0,05. 145 Таблица 13 - Характеристики суставного хряща на этапах эксперимента (1 мм за 8 приемов, ручные подкрутки) Параметры Контроль I II III общее 28 суток дистракции I II III общее I II III общее I II III общее 30 суток фиксации 30 суток без аппарата NAch Sch h (мкм, (мкм-2,M σ) (мкм2,M σ) M m) Контроль 6,12 2,43 8,21 2,19 45,34 10,51 475,55 1,31 8,75 2,54 4,45 1,34 119,91 24,37 12,26 3,21 5,73 2,15 129,31 28,14 9,03 4,54 6,12 2,45 87,52 16,58 1 мм за 8 приемов (ручные подкрутки) 3,73 1,62* 7,75 1,79* 30,09 6,65* 369,91 2,57 6,41 2,34* 5,94 1,56* 68,71 16,33* *** 9,06 3,85* 6,01 1,49* 96,86 30,14* 6,44 2,48 6,57 2,03 65,36 23,55 6,32 2,43 7,92 2,39* 52,73 18,44* 415,38 2,13 9,22 3,18* 5,68 1,84* 102,34 19,74* *** 9,16 3,27* 6,36 2,08* 90,94 23,66* 8,24 2,46 6,63 2,85 82,46 29,68 6,53 2,12 4,59 1,19* 71,02 21,61* 468,24 0,53 8,71 1,68 4,53 1,12 121,71 22,35 8,50 1,34* 4,87 1,28* 116,11 33,18* 7,89 1,12* 4,63 1,69* 103,23 25,06* VVch (%,М σ) NNem.lac . (%) NNis.gr. (%) 13,6 14,5 20,4 21,14 19,7 31,2 15,8 33,5 Примечание: I – поверхностная, II – промежуточная, III – глубокая зоны хряща. Различия достоверны: *** - при р 0,001, * при р 0,05. Таблица 14 - Характеристики суставного хряща на этапах эксперимента (1 мм за 60 приемов, автодистракция в дневное время) Параметры Контроль 28 суток дистракции 30 суток фиксации 30 суток без аппарата NAch Sch h (мкм, -2 2 (мкм ,M σ) (мкм ,M σ) M m) Контроль I 6,12 2,43 8,21 2,19 45,34 10,51 475,55 1,31 II 8,75 2,54 4,45 1,34 119,91 24,37 III 12,26 3,21 5,73 2,15 129,31 28,14 общее 9,03 4,54 6,12 2,45 87,52 16,58 1 мм за 60 приемов (автодистракция в дневное время) I 5,44 1,46* 8,56 2,5942,38 18,09 356,45 1,51 II 9,04 3,15* 4,67 1,26* 120,63 23,37 *** III 10,14 3,23 7,17 1,59* 103,61 39,28* общее 8,34 1,18 6,84 2,83 89,31 33,81 I 4,39 1,63* 5,79 1,27* 47,17 13,39* 392,73 2,19 II 7,83 1,12* 4,56 1,33* 106,94 21,82* *** III 8,06 2,74* 4,87 1,54* 100,52 26,68* общее 6,81 1,48 5,02 1,88 87,16 23,79 I 6,36 2,69 5,84 2,37* 67,48 19,22* 464,68 6,53 II 9,29 2,52* 4,12 1,33 142,15 31,46* III 7,86 1,14* 4,31 1,49* 118,27 47,68* общее 7,96 2,67 4,79 1,19 109,83 46,49 VVch (%,М σ) NNem.la c. (%) NNis.gr. (%) 13,6 14,5 24,3 25,6 16,3 28,8 15,4 29,9 Примечание: I – поверхностная, II – промежуточная, III – глубокая зоны хряща. Различия достоверны: *** - при р 0,001, * при р 0,05. 146 При повышенном темпе «3/180» сохранялись сниженные значения (Таблица 15). Таблица 15 - Характеристики суставного хряща на этапах эксперимента (3 мм за 180 приемов, автодистракция) Параметры Контроль I II III общее 10 суток дистракции I II III общее I II III общее I II III общее 30 суток фиксации 30 суток без аппарата VVch (%,М σ) NAch Sхц (мкм-2,M σ) (мкм2,M σ) Контроль 6,12 2,43 8,21 2,19 45,34 10,51 8,75 2,54 4,45 1,34 119,91 24,37 12,26 3,21 5,73 2,15 129,31 28,14 9,03 4,54 6,12 2,45 87,52 16,58 3 мм за 180 приемов (автодистракция) 4,15 1,35* 8,01 2,0429,41 9,05* 4,68 2,26* 5,31 2,43* 46,95 18,12* 5,54 1,73* 4,03 1,88* 91,28 22,75* 4,79 1,15* 5,88 1,51 55,44 14,25 4,52 0,94* 5,52 1,87* 53,75 22,73* 5,64 1,34* 4,55 1,77* 83,26 22,75* 6,01 2,15* 4,61 1,91* 87,36 37,23* 5,43 2,26 4,84 1,88 75,76 24,66 5,84 1,47* 7,88 1,54* 37,95 14,76* 8,38 1,68 5,68 1,63* 87,58 28,21* 9,82 1,34* 6,46 2,01* 85,42 23,75* 7,72 1,29 6,56 2,21 71,08 24,17 h (мкм, M m) NNem.lac . (%) NNis.gr. (%) 475,55 1,31 13,61 14,52 375,74 1,89 *** 25,9 18,8 439,52 1,85 *** 28,9 22,1 446,84 1,67 *** 22,8 22,5 Примечание: I – поверхностная, II – промежуточная, III – глубокая зоны хряща. Различия достоверны: *** - при р 0,001, * при р 0,05. 5.1.3. Количественная оценка метахромазии в цифровых изображениях гистохимических препаратов суставного хряща. Проведенный анализ гистоморфометрических исследований показал, что менее травматичными для суставного хряща при удлинении смежного сегмента конечности явились при ручных режимах дистракции - режим 1 мм за 8 приемов, при автодистракции - режим 1 мм за 60 приемов. Для выявления различий состояния суставного хряща при этих режимах мы использовали метод анализа цветовой информации – колориметрию. Учитывая, что максимально деструктивно-репаративные процессы выражены в срок 30 суток фиксации, на этом этапе эксперимента исследовали суставной хрящ при удлинении голени с суточным темпом 1 мм за 8 приемов (ручные подкрутки) - 1 группа и 1 мм за 60 приемов (автодистракция) – 2 группа. 147 В окрашенных метиленовым синим, препаратах суставного хряща визуально обнаружена γ-(красная)-метахромазия (МТХ) разной интенсивности в топографически различных зонах межклеточного матрикса (Рисунок 110), что определило направления исследования: 1. цветовые характеристики орто- и метахромазии разной интенсивности; 2. объемные отношения орто- и метахроматически окрашенных структур в объекте; 3. топография зон метахромазии в объекте исследования; 4. определение в топографически различных участках хряща природы химических сдвигов, так как известна [71, 106] зависимость устойчивости и степени выраженности реакции от плотности расположения свободных анионных групп в молекулах субстрата. п.1. Цветовые характеристики орто- и метахромазии разной интенсивности. В контрольной серии (суставной хрящ интактных животных) при окраске метиленовым синим гликозаминогликанов было по обнаружено зонам хряща. неравномерное Реакция МТХ распределение усиливалась по направлению от суставной поверхности к субхондральной кости. Наиболее интенсивная реакция наблюдалась в территориальном матриксе промежуточной и глубокой зон. Электронно-зондовый микроанализ подтвердил вышеописанное распределение. Содержание серы в поверхностной зоне – 0,34%, в промежуточной – 0,42%, глубокой – 0,50%. В поверхностной зоне суставного хряща животных 1-й группы межклеточное вещество ортохроматично, на поверхности демаскированных в условиях эксперимента пучков коллагеновых волокон выявлялись мелкоточечные участки интенсивной метахромазии (Рисунок 110А). В группе 2 очаги разволокнения поверхностной зоны отсутствовали, участков интенсивной метахромазии в поверхностной зоне не обнаружено, определялись ортохроматически и слабой интенсивности метахроматически окрашенные участки межклеточного матрикса (Рисунок 110Б). 148 А Б Рисунок 110 - Цифровое полноцветное изображение микропрепарата суставного хряща. А - группа 1 (собака №0942). Б - группа 2 (собака №2210). Полутонкий срез, окраска метиленовым синим. Об.- 6,3; ок.- 12,5х. К – кость, 0 – орто- и 1-3 – метахроматически окрашенные участки межклеточного матрикса. В обеих группах в гомогенном матриксе промежуточной зоны небольшие ортохроматически (0) окрашенные участки соседствовали с обширными слабо метахроматичными (1) полями. Глубокая зона отличалась выраженной интенсивной метахромазией территориального матрикса (3) и присутствием в межтерриториальном матриксе участков с метахроматической реакцией слабой и средней (2) интенсивности. Определение цветовых характеристик орто- и метахромазии разной интенсивности проводили в программе “DiaMorph Cito-W” версии 1996г, по линии сканирования, проходящей через орто- и разной интенсивности метахроматические участки межклеточного матрикса. Результатом этой функции является денситограмма (Рисунок 111) и представленные в виде таблицы количественные данные, характеризующие каждый пиксель через который прошла линия сканирования. 149 Рисунок 111 - Результаты компьютерной колориметрии по RGB-каналам Группа 1. Собака №0942. А – по линии Л1, Б – отношения цветовых составляющих в зонах орто- и разной интенсивности метахроматического окрашивания: ортохром – участки ортохроматического окрашивания, метахром – метахроматически окрашенные участки (1 – слабая, 2 – среднейстепени и 3 – интенсивная метахромазия). В таблице 16. представлены количественные цветовые характеристики орто- и метахроматических участков суставного хряща. При анализе цветовых характеристик орто- и разной степени интенсивности метахроматических участков суставного хряща животных 1-й и 2-й групп установлено, что синий цвет является преобладающим по значению интенсивности (Рисунок 111Б). Их различия определялись взаимоотношениями красного и зелёного (Таблица 17). 150 Таблица 16 - Результаты компьютерной колориметрии (в моделях RGB) участков разной степени выраженности (0, 1, 2, 3) метахроматической реакции (Группа 1, №с0942) Цветовая модель RGB Параметры Красный (R) Зеленый (G) Синий (B) ЗОНА 0 – ортохроматическое окрашивание Среднее 130,740 161,104 187,438 Стандартная ошибка ±0,310 ±0,031 ±0,705 ЗОНА 1 – слабая метахромазия (МТХ+) Среднее 127,725 138,788 178,988 Стандартная ошибка ±0,104 ±0,058 ±0,509 ЗОНА 2 – метахромазия средней интенсивности (МТХ++) Среднее 111,176 115,313 173,000 Стандартная ошибка ±0,080 ±0,065 ±0,870 ЗОНА 3 – метахромазия высокой интенсивности (МТХ+++) Среднее 127,409 115,646 182,305 Стандартная ошибка ±0,046 ±0,037 ±0,135 Таблица 17 - Отношения цветовых составляющих в зонах орто- и разной интенсивности метахроматического окрашивания участков межклеточного матрикса суставного хряща Орто- и метахроматичные Отношения цветовых участки межклеточного составляющих матрикса Орто- BGR γ-МТХ + BGR G-R=от11до25 γ-МТХ ++ BGR G-R=от1до10 γ-МТХ+++ BRG G-R=>25 BR=G В ортохроматических участках второй по значению интенсивности – зеленый компонент отделен от синего интервалом в 25 и более условных единиц (у.е.) в 256-ступенчатой шкале, настолько же уступает зеленому значение третьей – красной составляющей. Метахроматическое окрашивание сопровождается уменьшением зелено-красного интервала до ≈10 у.е. при слабой и до 1 у.е. – при средней степенях выраженности реакции. В очагах метахромазии высокой 151 интенсивности значение красной составляющей выводит ее на вторую позицию. Такой сдвиг цвета в красную часть спектра характерен для γ-метахромазии. п.2. Объемные отношения орто- и метахроматически окрашенных структур в объекте. По данному направлению информация может быть получена не только описательным, но и количественными методами. При реализации последних наиболее интересными нам представились возможности стереологического анализа результатов компьютерной морфо- и колориметрии полученных по сети цифровых изображений микропрепаратов. Для анализа объемных отношений орто- и метахроматически окрашенных структур в полноцветных цифровых изображений специально разработана и апробирована тестовая решетка равноудаленных точек с прозрачными центрами (Рисунок 112). Рисунок 112 - Изображение тестовой решетки равноудаленных точек с прозрачными центрами (слева) и ее фрагмент при большем увеличении После случайного совмещения решетки с исследуемым изображением колориметрировали попавшие в центры ее узлов пикселы. Сопоставляя результаты с предварительно полученными колориметрическими 152 характеристиками различно окрашенных зон, определяли количество отнесенных к каждой из них узлов решетки и рассчитывали их доли в общей площади изображения. Результаты точко-счетной планиметрии в свою очередь служили основанием для расчета объемных отношений (Таблица 18) в трехмерном объекте по репрезентативной серии его двумерных эквивалентов (срезов). Таблица 18 - Доли (%) орто- и разной интенсивности метахроматического окрашивания в общей площади изображения Группа γМТХ γМТХ γМТХ + Орто +++ ++ 1 13,22 21,95 43,94 19,84 2 10,87 29,30 41,50 12,38 п.3. Топография зон метахромазии. Общая доля метахроматически окрашенных участков в общей площади изображения в группах 1 и 2 отличалась незначительно (81,67% и 79,11%). Также незначительны отличия долей метахромазии высокой и слабой интенсивности. Несколько больше отличались доли ортохроматических участков и метахромазии средней интенсивности (Таблица 18). Существенные отличия в сравниваемых группах имело топографическое распределение орто- и метахроматических участков. В обеих группах ортохроматически окрашенные участки межклеточного матрикса выявлены в поверхностной и глубокой зонах. В 1-й группе визуально коллагеновых определялась волокон в ортохромазия поверхностной демаскированных зоне суставного пучков хряща. Доля ортохроматически окрашенных участков в этой группе была выше на 7,5%. При цветовой сегментации выявлены линейные и мелкоточечные участки метахромазии слабой и средней интенсивности, распределённые по поверхности волокон; в аморфной части матрикса поверхностной зоны (между волокнами) определялись участки интенсивной метахромазии (Рисунок 113). 153 Рисунок 113 - Орто- и разной интенсивности метахроматического окрашивания участки межклеточного матрикса суставного хряща. Сверху – 2 группа, снизу – 1 группа. В группе 2 очаги разволокнения поверхностной зоны отсутствовали, участков интенсивной метахромазии в поверхностной зоне нет, в виде многочисленных точечных участков определялась метахромазия слабой интенсивности. В глубоких слоях поверхностной зоны выявлена метахромазия средней интенсивности в виде немногочисленных точечных участков (Рисунок 113). В обеих группах распределение многочисленных очажков метахромазии малой интенсивности имело градиент от поверхностных к глубоким слоям, доля участков МТХ+ в общей площади изображения в группах 1 и 2 отличалась незначительно (43,94% и 41,50% соответственно). При автодистракции в гомогенном матриксе промежуточной зоны небольшие ортохроматически окрашенные участки соседствовали с обширными слабо метахроматичными полями. Глубокая зона отличалась выраженной интенсивной метахромазией территориального матрикса и присутствием в 154 межтерриториальном матриксе участков с метахроматической реакцией слабой и средней интенсивности (Рисунок 113). При ручной дистракции как в промежуточной, так и глубокой зонах отмечается преимущественное сосредоточение участков интенсивной метахромазии в территориальном матриксе, а среднеинтенсивной метахромазии в межтерриториальном матриксе. В опытах с автодистракцией эти градиенты выражены менее отчётливо (Рисунок 113). п.4. Определение в топографически различных участках хряща природы химических сдвигов. Возможность количественно оценивать интенсивность метахромазии в топографически различных участках хряща позволяет определять природу химических сдвигов, так как известна [70, 106] зависимость устойчивости и степени выраженности реакции метахромазии от плотности расположения свободных анионных групп в молекулах субстрата. Интенсивная метахромазия в разволокненной поверхностной зоне суставного хряща животных 1-й группы вызвана высвобождением реактивных групп СООН, SО3Н демаскированных протеогликанов (в основном сульфатированных гликозаминогликанов). Чем сильнее выражено разволокнение межклеточного вещества, тем интенсивнее метахромазия. Во 2-й группе очаги разволокнения отсутствовали. В обеих группах в промежуточной и глубокой зонах хряща выявлена интенсивная метахромазия территориального матрикса, которая обусловлена усиленной продукцией хондроцитами сульфатированных гликозаминогликанов. В межтерриториальном матриксе, концентрация сульфатированных гликозаминогликанов снижается по мере удаления от клеток, поэтому для этих участков межклеточного матрикса характерна метахромазия средней и слабой степени интенсивности. Ортохроматичные участки межклеточного вещества в обеих группах выявлены в межклеточном матриксе поверхностной и глубокой зон, что 155 обусловлено их высокоорганизованным межклеточным матриксом – отсутствием свободных (несвязанных) анионных групп. Таким образом, в суставном хряще мыщелка бедра выявлены деструктивные изменения, наиболее выраженные при ручной дистракции, проявляющиеся интенсивной МТХ в разволокненной поверхностной зоне. В обеих группах компенсаторные процессы проявлялись интенсивной МТХ территориального матрикса промежуточной и глубокой зон, обусловленной усиленной продукцией клетками сульфатированных гликозаминогликанов. По результатам компьютерной колориметрии получены четкие количественные критерии, позволяющие обнаруживать метахромазию, определять ее тип (β или γ) и интенсивность. При этом получаемые табличные данные служат основанием для стереологического анализа с возможностью регистрировать с высокой точностью (до 1 pix) изменения такого параметра как объемные плотности ортохроматической и разной интенсивности метахроматических зон. Резюме. Исследование структурной реорганизации нагружаемых участков суставного хряща при удлинении конечности с различной дробностью и темпом дистракции позволило выявить существенные отличия влияния режима дистракции на состояние хряща. Комплекс стереологических и цитометрических показателей свидетельствовал о более щадящем характере режимов высокодробной дистракции («1/8» и «1/60») при удлинении с суточным темпом 1 мм. Данные электронно-зондового микроанализа (содержание кальция и серы) выявили преимущества режима «1/60» в плане метаболических показателей. Колориметрическое исследование метахромазии свидетельствовало о более выраженной дезорганизации внеклеточного матрикса в серии «1/8» по сравнению с серией «1/60». В серии «1/60» установлена возможность полноценной репарации хряща. При таком же шаге высокодробной автоматической автодистракции (0,017 мм) были проведены эксперименты с увеличенным суточным темпом (3 мм в сутки за 180 включений автомата). В этой серии в конце опыта не восстанавливалась структура суставной поверхности и толщина хряща, однако динамика количественных параметров указывала на усиление и 156 биосинтетической, и пролиферативной активности клеток, что свидетельствовало о возможности дальнейшей реституции. 5.2. Морфофункциональное состояние нагружаемых участков суставного хряща мыщелков бедра при автоматическом удлинении голени с темпом 1 мм за 60 приемов, осуществляемом в дневное и ночное время (в дневное время – серия 3, в ночное время – серия3А). При клинических наблюдениях за животными обеих серий существенных различий в функциональном состоянии удлиняемой конечности не выявлено. К концу дистракции большинство животных пользовались удлиненной конечностью, приступая на нее в стойке или при ходьбе. При этом не было отмечено значительных ограничений движений в суставах: в коленном определялась умеренная сгибательная контрактура, амплитуда движений составляла 80º-90º (норма 100º–110º), в голеностопном – в пределах 30º-50º (норма 90), положение стопы, как правило, было близко к физиологическому. В период фиксации все собаки практически полностью нагружали оперированную конечность, амплитуда движений в коленном суставе приближалась к норме и составляла 90º-100º, в голеностопном суставе сохранялось ограничение амплитуды движений – 50º-60º. После снятия аппарата функция коленного сустава не отличалась от исходных значений, животные в полном объеме пользовались оперированной конечностью. Проведенные морфологические исследования на макро- и микроуровне показали, что в период автоматического удлинения голени со скоростью 1 мм за 60 приемов в дневное и ночное время в суставном хряще выявлены сходные изменения. В конце дистракции в обеих сериях макроскопически суставной хрящ был жемчужно-белого цвета, местами шероховатый. При изучении в СЭМ отмечали углубления, вдавления, неровности суставной поверхности, на отдельных участках отсутствовала бесклеточная пластинка, отмечены вскрытые клеточные лакуны (Рисунок 114). 157 А Б Рисунок 114 - Конец периода дистракции. Поверхность, обращенная в суставную полость, вскрытые клеточные лакуны с хондроцитами (Б) и без (А). СЭМ. А – автодистракция в дневное время, увеличение 2500, Б – автодистракция в ночное время, увеличение 2000. При светооптическом исследовании полутонких срезов отмечена сохранность зональной структуры суставного хряща, целостность базофильной линии не нарушена. В большей части наблюдений отмечены изменения в поверхностной зоне, которые выражались снижением интенсивности окраски межклеточного вещества основными красителями, нарушением его гомогенности, появлением участков разволокнения. В участках разволокнения наблюдалось уменьшение клеточной плотности, что связано с гибелью и деструкцией части клеток. Выявлены пустые лакуны. При исследовании в СЭМ наибольшая частота встречаемости очагов разволокнения суставной поверхности на этом этапе эксперимента была отмечена при автодистракции в дневное время. Аналогичные картины деструктивных изменений суставной поверхности наблюдали и через месяц фиксации (Рисунок 115). Отличительным было то, что гибель клеток в серии 3 происходила в основном по типу кариопикноза, в серии 3А, как по типу кариопикноза так и по типу лизиса (Рисунок 116). Такие клетки окрашивались диффузно и обычно бледнее, чем неповрежденные клетки, хроматин конденсировался в крупные глыбки. Наблюдаемые морфологические признаки некроза, чаще отмечены при автодистракции в ночное время. 158 А Б Рисунок 115 - СЭМ. Поверхность, обращенная в суставную полость. Фиксация 30 суток. А - автодистракция в дневное время, увеличение 1700, Б - автодистракция в ночное время, увеличение 1600. А Б Рисунок 116 - Дистракция 28 суток (в ночное время). Полутонкий срез. Окраска метиленовым синим-основным фуксином. Хондроциты поверхностной зоны в состоянии лизиса. А - об. – 40; ок. - 12,5х. Б – монтаж, об. – 100МИ; ок. - 12,5х. Также отличительным было и то, что при автодистракции в ночное время, особенно в период фиксации и после снятия аппарата в промежуточной и глубокой зонах большая часть клеток гипертрофирована, находилась в состоянии вакуольной дистрофии. В таких хондроцитах более 80% цитоплазмы было занято вакуолями, в части клеток встречались миелиновые структуры (Рисунок 117). Известно, что набухание митохондрий и деструкция (разрушение) мембран органелл вызывают вакуолизацию цитоплазмы [96]. В литературе такие хондроциты характеризуют как неактивные или находящиеся в фазе дегенерации. Процессам дегенерации подвергаются клетки, прошедшие фазу гипертрофии, обычно накапливающие липиды или гликоген [23]. 159 А Б Рисунок 117 - Автодистракция ночью. Фиксация 30 суток. Полутонкий срез, окраска метиленовым синим-основным фуксином. Хондроциты глубокой зоны. Об. - 100МИ; ок. - 12,5х. Обозначения: Я – ядро, ВЯ – вакуолизация ядер, МС – миелиновые структуры. А – собака №2003, пикноз и вакуолизация ядер, Б – собака №2210, светлое гомогенное ядро. В обеих сериях были единично отмечены хондроциты, в которых наблюдали явления гиперконденсации хроматина, такие клетки уменьшены в размерах, сжавшиеся, цитоплазматические выросты не определялись (Рисунок 118). Наблюдаемая морфологическая картина соответствовала гибели клеток путем апоптоза. Количественный анализ на тканевом уровне выявил следующее: динамика толщины хряща в обеих сериях имела одинаковый характер (Рисунок 119). К концу дистракции наблюдалось достоверное уменьшение анализируемого параметра, через 30 суток фиксации выявлена тенденция к увеличению по сравнению с предыдущим сроком (р3-3А<0,05). На аппаратном этапе уменьшение толщины хряща, как и очаги разволокнения были менее выражены при автодистракции в ночное время. Через 30 суток после снятия аппарата толщина хряща в обеих сериях приближались к контрольным значениям (р3-3А>0,05). 160 Рисунок 118 - Автодистракция днем. Фиксация 30 суток. Преапоптозное состояние хондроцитов. Сжатие клетки, потеря контактов с межклеточным матриксом. Доля ядра значительно превышает долю цитоплазмы, конденсация хроматина. Полутонкий срез, окраска метиленовым синим-основным фуксином. Об. - 100МИ; ок. - 12,5х. Рисунок 119 - Динамика толщины (мкм) суставного хряща на этапах эксперимента. В таблице 19 представлена динамика численной и объёмной плотности хондроцитов в различных зонах суставного хряща. 161 Таблица 19 - Численная (NAch) и объемная (VVch) плотности хондроцитов в суставном хряще при автодистракции голени в дневное и ночное время Срок эксперимента Контроль Зоны суставного хряща NAch (мкм-2,M σ) VVch (%,М σ) Поверхностная 8,22 2,19 6,12 2,43 Промежуточная 4,45 1,34 8,75 2,54 Глубокая 5,73 2,15 12,26 3,21 8,56 2,59 (5,72 1,69) * 4,67 1,26 (4,77 1,63) 5,44 1,46 (4,31 1,32) * 9,04 3,15 (8,01 2,14) * 10,14 3,23 (9,18 2,51) * 4,39 1,63 (4,96 1,82) * 7,83 1,12 (8,6 1,04) * 8,06 2,74 (10,2 3,13) * 6,36 2,69 (5,16 1,64) * 9,29 2,52 (8,19 1,09) * 7,86 1,14 (6,89 1,95) * Поверхностная 28 суток дистракции Промежуточная Глубокая Поверхностная 30 суток фиксации Промежуточная Глубокая Поверхностная 30 суток без аппарата Параметры Промежуточная Глубокая 7,17 1,59 (5,18 1,71) * 5,79 1,27 (6,23 1,68) * 4,56 1,33 (4,29 1,43) 4,87 1,54 (5,45 * 5,84 2,37 (9,84 * 4,12 1,33 (4,03 * 4,31 1,49 (5,29 * 1,77) 3,65) 1,06) 1,36) Примечание: в скобках указаны параметры суставного хряща при автодистракции в ночное время. Жирным шрифтом выделены достоверные различия с контролем (р 0,05), * - достоверные различия между сериями (р 0,05). Поверхностная зона демонстрирует наиболее ранние изменения. Через 28 суток дистракции численная плотность хондроцитов (NAch) в серии 3А достоверно снижена относительно контроля и серии 3 (Рисунок 120), что связано с гибелью и деструкцией клеток (Рисунок 121Б). В серии 3 NAch сопоставима с контролем, за счет увеличения количества двухчленных неповрежденных участках (Рисунок 121А). изогенных групп клеток в 162 Рисунок 120 - Динамика численной плотности хондроцитов (NAch, мкм-2) в поверхностной зоне суставного хряща на этапах эксперимента. А Б Рисунок 121 - 28 суток автодистракции. Поверхностная зона, полутонкий срез, окраска метиленовым синим-основным фуксином. Об. - 40; ок. - 12,5х. А - в дневное время, 2-х членные изогенные группы (стрелки), Б – в ночное время, пустые клеточные лакуны (стрелки). К концу фиксации в серии 3 выявлено достоверное снижение NAch, различия при сравнении с серией 3А недостоверны (р3-3А>0,05). В серии 3А наблюдается тенденция к увеличению анализируемого параметра и к концу эксперимента NAch достоверно выше нормы. В серии 3 сохранялись сниженные значения (р3-3А<0,05) анализируемого параметра относительно контроля и предыдущих этапов эксперимента, что обусловлено преобладанием к этому сроку в поверхностной зоне доли межклеточного вещества. 163 Объемная плотность хондроцитов (Vvch) в поверхностной зоне обеих серий в период дистракции и в конце фиксации достоверно ниже контроля (Рисунок 122), различия между сериями достоверны (р3-3А<0,05). контроль 1 мм за 60 приемов в дневное время 1 мм за 60 приемов в ночное время 7 % 6 5 4 3 2 1 0 контроль 28 дней дистракции 30 дней фиксации 30 дней без аппарата Рисунок 122 - Динамика объемной плотности хондроцитов в поверхностной зоне суставного хряща на этапах эксперимента. К концу эксперимента в серии 3 анализируемый параметр незначительно превышал норму, в серии 3А сохранялись сниженные значения (р3-3А<0,05). Наблюдаемые деструктивные изменения сопровождались процессами, которые можно рассматривать как компенсаторные, направленные на пластическое обеспечение репарации поверхностной зоны. В обеих сериях хондроциты неповрежденных участков поверхностной зоны отличались большими размерами, округлой формой, без признаков вакуольной дистрофии (Рисунок 123). При количественном исследовании на клеточном уровне – цито- и кариометрии в обеих сериях наиболее ярко выражены изменения хондроцитов поверхностной зоны. 164 А Б Рисунок 123 - Функционально активные хондроциты поверхностной зоны. Полутонкие срезы, окраска метиленовым синим-основным фуксином. Монтаж. Об. – 100МИ; ок. - 12,5х. А – автодистракция в дневное время, Б – автодистракция в ночное время. На аппаратном этапе эксперимента в поверхностной зоне хряща выявлено снижение ядерно-цитоплазматического индекса (NCI) в связи с более значительным ростом объемной доли цитоплазмы по сравнению с ядром, наиболее выраженным в серии 3 (Рисунок 124). К концу эксперимента в 3 серии сохранялись повышенные значения объемной плотности клеток, NCI по сравнению с предыдущими этапами эксперимента увеличивался, но оставался ниже контроля. В серии 3А объемная плотность клеток снижалась, NCI превышал контроль. Различия значений NCI между сериями достоверны (р3-3А<0,05) на всех этапах эксперимента. 165 Рисунок 124 - Динамика ядерно-цитоплазматического индекса (NCI) хондроцитов поверхностной зоны суставного хряща на этапах эксперимента. Увеличение значений фактора формы и минимального диаметра клеток поверхностной зоны указывало на то, что клетки округлялись, что подтверждает СЭМ (Рисунок 125). Рисунок 125 - Хондроцит поверхностной зоны, СЭМ. Режим дистракции 1 мм за 60 приемов (день), срок эксперимента -30 суток фиксации. Увеличение 4000. 166 Максимальные значения минимального диаметра выявлены в серии 3 (Рисунок 126). Рисунок 126 - Минимальный диаметр (мкм) хондроцитов поверхностной зоны на этапах эксперимента. К концу эксперимента наблюдалось снижение анализируемого параметра, наиболее выраженное в серии 3А. Различия между сериями достоверны (р3-3А<0,05) на всех этапах эксперимента. Увеличение размеров клеток и их ядер, снижение NCI, наиболее выраженные к концу фиксации, свидетельствовали о повышении синтетической активности хондроцитов поверхностной зоны. К компенсаторным процессам можно отнести активную пролиферацию хондроцитов, что проявляется в увеличении количества изогенных групп клеток (NNis.gr). В обеих сериях на всех этапах эксперимента NNis.gr была достоверно выше нормы (Рисунок 127). К концу эксперимента в 3 серии сохранялись повышенные значения анализируемого параметра, в 3А серии выявлена тенденция к снижению по сравнению со сроком 30 суток фиксации. Увеличение количества изогенных групп клеток в суставном хряще в условиях удлинения голени является, очевидно, реакцией хряща на компрессию, так как известно влияние механического сжатия на пролиферативную активность хондроцитов [29]. 167 Рисунок 127 - Доля изогенных групп клеток (NNis.gr., %) в суставном хряще на этапах эксперимента. Более высокая пролиферативная активность хондроцитов в 3 серии (Рисунок 128, 129) может быть обусловлена проведением дистракции в дневное время, когда более выражено действие механических факторов – сжатие, трение суставных поверхностей при удлинении голени и функциональной активности животных днем. Известно, что активная пролиферация хондроцитов является компенсаторной реакцией на травматизацию [62, 92, 104]. Рисунок 128 - Автодистракция в дневное время. Двухчленная изогенная группа в поверхностной зоне. Дистракция 28 суток. СЭМ, увеличение 5000. 168 А Б Рисунок 129 - Автодистракция в дневное время. Изогенные группы в промежуточной зоне (стрелки). Фиксация 30 суток. Полутонкий срез. Окраска метиленовым синим-основным фуксином. А - об. – 16; ок. – 12,5х, Б - об. – 40; ок. – 12,5х. Наибольшая частота встречаемости изогенных групп в обеих сериях отмечена в промежуточной зоне хряща, а также на аппаратном этапе в поверхностной зоне в 3 серии, реже изогенные группы были отмечены и в глубокой зоне хряща. В промежуточной зоне численная плотность клеток при автодистракции в дневное время на аппаратном этапе превышала контрольные значения, к концу эксперимента сопоставима с контролем (Рисунок 130А). Объемная плотность хондроцитов в этой серии на этапах дистракции и после снятия аппарата превышала контроль, к концу периода фиксации была достоверно ниже контроля (Рисунок 130Б), что обусловлено преобладанием в этот срок вновь образованных изогенных групп. При автодистракции в ночное время в промежуточной зоне на этапе дистракции численная плотность превышала контроль, к концу эксперимента выявлено снижение данного параметра (Рисунок 130А). Увеличение объемной плотности хондроцитов отмечено к концу периода фиксации, после снятия аппарата данный параметр достоверно ниже контроля (Рисунок 130Б). Различия анализируемых параметров между сериями достоверны (р3-3А<0,05) на всех этапах эксперимента. мкм-2 169 % А Б Рисунок 130 - Динамика численной (А) и объемной (Б) плотности хондроцитов промежуточной зоны суставного хряща на этапах эксперимента. Количественные исследования на клеточном уровне при автодистракции в дневное время выявили увеличение минимального диаметра клеток и их ядер в промежуточной зоне, максимальные значения отмечены в срок 30 суток фиксации, к концу эксперимента выявлена тенденция к снижению анализируемых параметров, относительно контроля сохранялись повышенные значения (Рисунок 131). Максимальный диаметр клеток на всех этапах эксперимента сопоставим с контролем. Максимальный диаметр ядер на этапах дистракции и фиксации сопоставим с контролем, к концу эксперимента незначительно снижался. Максимальные количественные характеристики клеток промежуточной зоны в 3 серии выявлены в срок 30 суток фиксации. Различия анализируемых параметров между сериями достоверны (р3-3А<0,05) на всех этапах эксперимента. 170 Рисунок 131 - Минимальный диаметр хондроцитов и их ядер промежуточной зоны суставного хряща на этапах эксперимента. Увеличение размеров клеток и их ядер в промежуточной зоне при автодистракции в дневное время свидетельствовали о высокой функциональной активности хондроцитов (Рисунок 132). А Б Рисунок 132 - Функционально активные хонроциты промежуточной зоны хряща, автодистракция в дневное время. Полутонкий срез. Окраска метиленовым синимосновным фуксином. Об. – 100МИ; ок. – 12,5х. А – 2-х членные изогенные группы вертикальной стрелкой обозначена молодая изогенная группа, хондроциты находятся в одной лакуне, территориальный матрикс не сформирован, горизонтальной стрелкой – образование территориального матрикса, расхождение клеток. Дистракция 28 суток. Б – биосинтетически активный хондроцит, гомогенное светлое ядро, базофильная цитоплазма. Фиксация 30 суток. 171 Динамика морфометрических характеристик хондроцитов в анализируемых сериях опытов представлена в таблицах 20 и 21. Таблица 20 - Количественные характеристики хондроцитов суставного хряща при автоматическом удлинении голени с темпом 1 мм за 60 приемов в дневное время (M σ) Срок эксперимента Контроль Дистракция Фиксация Без аппарата Поверхностная зона 0,256±0,08* 0,26±0,06* 0,29±0,07* 0,74±0,08* 0,74±0,06* 0,71±0,07* 0,37±0,15* 0,37±0,12* 0,44±0,16* Клетка d min 3,38±0,86* 5,69±1,45* 2,71±1,01* d max 12,77±2,15* 15,07±2,54* 11,03±2,69 Ff 0,59±0,01* 0,63±0,02* 0,57±0,14 Ядро d min 2,2±0,38 2,96±0,75* 1,92±0,93* d max 5,69±1,03* 6,07±1,38* 5,76±1,55* Ff 0,67±0,01* 0,74±0,02* 0,63±0,11* Промежуточная зона Vvn 0,21±0,03 0,23±0,09 0,18±0,06* 0,19±0,09 Vvc 0,79±0,03 0,77±0,09* 0,81±0,06* 0,81±0,09* NCI 0,27±0,08 0,32±0,18* 0,24±0,14* 0,25±0,16* Клетка d min 5,82±1,31 6,39±1,34* 7,43±1,38* 6,31±2,33* d max 13,13±1,79 13,17±2,13 14,3±2,52* 12,54±2,81* Ff 0,72±0,09 0,76±0,06* 0,76±0,14* 0,72±0,05 Ядро d min 2,11±0,62 3,37±0,35* 3,47±0,39* 2,42±1,51 d max 6,12±1,27 5,93±0,76* 5,96±0,78* 5,66±1,98 Ff 0,76±0,15 0,77±0,05 0,78±0,12* 0,67±0,12* Глубокая зона Vvn 0,19±0,06 0,20±0,06* 0,18±0,09* 0,16±0,07* Vvc 0,81±0,06 0,79±0,06* 0,815±0,09 0,84±0,07 NCI 0,25±0,09 0,26±0,09* 0,23±0,15* 0,19±0,11* Клетка d min 4,83±1,58 8,25±1,48* 6,99±1,97* 7,32±2,25* d max 12,41±2,11 12,64±1,15 14,61±2,46* 12,73±2,79 Ff 0,69±0,09 0,79±0,08* 0,74±0,08* 0,75±0,07* Ядро d min 1,29±0,81 2,62±0,74* 2,26±0,83* 1,38±0,87 d max 5,91±1,04 5,54±0,77* 5,74±1,41 5,87±1,27 Ff 0,61±0,16 0,72±0,08* 0,71±0,07* 0,61±0,15 Примечание: проверка различий проведена с помощью критерия Вилкоксона.* достоверные различия с контролем при р<0,05. Vvn Vvc NCI 0,42±0,09 0,58±0,09 0,75±0,22 1,28±0,86 10,75±2,09 0,47±0,16 1,08±0,52 6,71±0,83 0,52±0,11 172 Таблица 21 - Количественные характеристики хондроцитов суставного хряща при автоматическом удлинении голени с темпом 1 мм за 60 приемов в ночное время (M σ) Срок эксперимента Контроль Vvn Vvc NCI Клетка d min d max Ff Ядро d min d max Ff 0,42±0,09 0,58±0,09 0,75±0,22 1,28±0,86 10,75±2,09 0,47±0,16 1,08±0,52 6,71±0,83 0,52±0,11 Vvn Vvc NCI Клетка d min d max Ff Ядро d min d max Ff 0,21±0,03 0,79±0,03 0,27±0,08 5,82±1,31 13,13±1,79 0,72±0,09 2,11±0,62 6,12±1,27 0,76±0,15 Vvn Vvc NCI Клетка d min d max Ff Ядро d min d max Ff 0,19±0,06 0,81±0,06 0,25±0,09 4,83±1,58 12,41±2,11 0,69±0,09 1,29±0,81 5,91±1,04 0,61±0,16 Дистракция Фиксация Поверхностная зона 0,33±0,09* 0,31±0,07* 0,66±0,09* 0,68±0,07* 0,54±0,24* 0,47±0,12* 2,71±0,82* 2,54±0,98* 10,1±1,82* 11,91±2,54* 0,59±0,13* 0,53±0,11* 2,18±0,76* 1,25±0,78* 5,41±0,93* 6,37±1,76* 0,65±0,09* 0,56±0,14* Промежуточная зона 0,19±0,07* 0,17±0,06* 0,81±0,07* 0,83±0,06* 0,27±0,13 0,22±0,13* 5,95±2,01 8,01±2,04* 12,58±1,46* 13,48±2,51* 0,71±0,05 0,78±0,06* 1,93±0,39* 1,58±0,71* 5,59±1,23* 5,61±0,97* 0,65±0,07* 0,65±0,15* Глубокая зона 0,15±0,07* 0,15±0,08* 0,85±0,07* 0,85±0,08* 0,18±0,12* 0,18±0,13* 6,78±2,35* 8,28±1,49* 13,59±2,41* 13,47±2,55* 0,73±0,07* 0,77±0,05 1,56±0,95* 1,52±0,71* 4,89±0,98* 5,24±1,21* 0,62±0,16 0,63±0,17* Без аппарата 0,41±0,11 0,59±0,11 0,76±0,34 1,61±0,59* 10,07±1,86 0,48±0,11 1,36±0,92* 6,11±1,33* 0,54±0,12 0,21±0,06 0,79±0,06 0,26±0,11 4,39±0,95* 11,62±2,07* 0,63±0,22* 1,89±0,74* 5,37±1,09* 0,64±0,18* 0,17±0,05* 0,83±0,05* 0,21±0,07* 6,98±2,38* 12,89±2,18 0,74±0,16* 1,23±0,62* 5,35±1,59* 0,58±0,17* Примечание: проверка различий проведена с помощью критерия Вилкоксона.* - достоверные различия с контролем при р<0,05. Повышение пролиферативной активности характеризовалось повышением объемной плотности ядер и ядерно-цитоплазматического индекса (NCI) относительно контроля в период дистракции, а повышении синтетической активности, наиболее выраженной в период фиксации, характеризовалось увеличением в большей степени объемной плотности цитоплазмы, чем объемной плотности ядра и снижением NCI относительно контроля. 173 При автодистракции в ночное время минимальный диаметр клеток промежуточной зоны увеличивался к сроку 30 суток фиксации, через месяц после снятия аппарата достоверно ниже контроля. При этом максимальный диаметр клеток незначительно превышал контроль на этапе фиксации, к концу дистракции и через месяц после снятия аппарата достоверно ниже контроля, минимальные значения отмечены к концу эксперимента. Минимальный и максимальный диаметры ядер на всех этапах достоверно снижены. Выявленная динамика количественных характеристик клеток промежуточной зоны в этой серии предположительно обусловлена преобладанием к концу эксперимента явлений так называемой постпролиферативной терминальной дифференцировки хондроцитов (Рисунок 133) с последующей их гибелью. А Б Рисунок 133 - Хондроциты промежуточной зоны хряща при автодистракции в ночное время. Полутонкий срез. Окраска метиленовым синим-основным фуксином. Об. – 100МИ; ок. – 12,5х. А – гипертрофированный тёмный хондроцит. Фиксация 30 суток. Б – разделившиеся гипертрофированные вакуолизированные светлые хондроциты. Без аппарата 30 суток. В глубокой зоне численная плотность (NAch) клеток превышала контроль лишь на этапе дистракции в серии 3 (Рисунок 134А). На последующих этапах эксперимента значения данного параметра в обеих сериях достоверно ниже контроля, что обусловлено деструкцией и гибелью части клеток. Объемная плотность хондроцитов (Vvch) в обеих сериях на всех этапах эксперимента 174 достоверно снижена, минимальные значения отмечены к концу эксперимента при автодистракции в ночное время (Рисунок 134Б), что обусловлено преобладанием хондроцитов в состоянии вакуольной дистрофии. Различия анализируемых мкм2 параметров между сериями достоверны (р3-3А<0,05) на всех этапах эксперимента % А Б Рис. 134. Динамика численной (А) и объемной (Б) плотности хондроцитов глубокой зоны суставного хряща на этапах эксперимента. В обеих сериях значения минимального диаметра ядросодержащих клеток глубокой зоны превышали контроль (Рисунок 135), значения максимального диаметра клеток были сопоставимы, либо превышали контроль. 175 Рисунок 135 - Минимальный диаметр хондроцитов и их ядер глубокой зоны суставного хряща на этапах эксперимента. Максимальный диаметр ядер при автодистракции днем на всех этапах эксперимента сопоставим с нормой, при автодистракции ночью достоверно ниже контроля, к концу эксперимента отмечена тенденция к увеличению данного параметра относительно предыдущих сроков эксперимента. Различия анализируемых параметров между сериями достоверны (р3-3А<0,05) на всех этапах эксперимента, за исключением минимального диаметра ядра в конце эксперимента. Увеличение объемной плотности ядра и цитоплазмы, снижение NCI при автодистракции днем свидетельствовало об усложнении структуры клеток, усилении биосинтетической активности и сопровождалось приростом толщины хряща относительно предыдущего срока. В серии 3 наряду со вновь образованными изогенными группами (Рисунок 136А), отмечали изогенные группы, в которых хондроциты характеризовались различным уровнем биосинтетической активности (Рисунок 136Б, В). Об этом свидетельствовали базофилия цитоплазмы, секреторные скопления, интенсивная окраска территориального матрикса. Между клетками появляется слабо окрашивающаяся гомогенная прослойка, которая увеличивается, и клетки постепенно расходятся. 176 А Б В Рисунок 136 - Срок опыта 30 дней фиксации. Серия «1/60» (днем). Полутонкий срез, окраска метиленовым синим-основным фуксином. Об. – 100; ок. – 12,5х. А – молодая изогенная группа, отсутствие сформированнного территориального матрикса. Б, В – функционально активные хондроциты. При этом в серии 3А наблюдали хондроциты в состоянии вакуольной дистрофии, в которых большая часть цитоплазмы занята вакуолями, отмечены миелиновые структуры - клетки «функционально изношенные». Морфология хондроцитов промежуточной и глубокой зон хряща в серии 3А указывала, что увеличение размеров клеток являлось как следствием истинной гипертрофии, усиления трофики, так и результатом начинающихся дистрофических процессов при нарушениях обмена. Методом электронно-зондового микроанализа в обеих сериях к концу дистракции выявлено достоверное снижение концентрации серы относительно контроля (Рисунок 137), наиболее выраженное в серии 3 (р3-3А<0,05). Рисунок 137 - Содержание серы (вес. %) в суставном хряще на этапах эксперимента. 177 Сера в суставном хряще является маркером сульфатированных гликозаминогликанов. Низкое содержание серы обусловлено разрушением протеогликанового компонента и сопровождалось разволокнением суставной поверхности наиболее выраженной в 3 серии эксперимента. На последующих этапах эксперимента наблюдалась тенденция к увеличению концентрации серы относительно предыдущего срока (р3-3А<0,05), что соответствовало интенсивной метахромазии территориального матрикса промежуточной и межтерриториального матрикса глубокой зон. К концу эксперимента в обеих серия концентрация серы продолжала увеличиваться относительно предыдущих этапов эксперимента, но не достигала контроля. Наименьшие значения анализируемого параметра выявлены в серии 3А (р3-3А<0,05), что обусловлено присутствием клеток в состоянии вакуольной дистрофии. Динамика концентрации кальция на этапах эксперимента выглядела следующим образом: к концу дистракции в обеих сериях концентрация кальция превышала контроль, максимальные значения отмечены в 3 серии (р3-3А<0,05). Через месяц фиксации наблюдалось дальнейшее увеличение исследуемого параметра (Рисунок 138), наиболее выраженное в поверхностной промежуточной зонах, различия между сериями не достоверны (р3-3А>0,05). Рисунок 138 - Содержание кальция (в вес.%) в суставном хряще на этапах эксперимента. и 178 К концу эксперимента концентрация кальция в обеих сериях превышала контроль, максимальные значения отмечены в серии 3А (р3-3А<0,05). Возможность и степень восстановления суставной поверхности в обеих экспериментальных сериях иллюстрируют данные, полученные через месяц после снятия аппарата. Макроскопически отмечали блестящие гладкие суставные поверхности жемчужно-белого цвета. При изучении в СЭМ определялись обширные участки с регулярной волнистостью, патологические очаги не выявлены (Рисунок 139А, 140А). На полутонких срезах структура хряща не нарушена, наблюдалось восстановление гомогенности межклеточного вещества поверхностной зоны, увеличение интенсивности его окраски (Рисунок 139Б, 140Б). Репаративная регенерация по типу реституции завершалась формированием суставной поверхности приближающейся по структуре к интактной с восстановлением толщины хряща. А Б Рисунок 139 - Суставной хрящ. 30 суток без аппарата. Автодистракция в дневное время. А - поверхность, обращенная в суставную полость. СЭМ. Увеличение 1100. Б – поверхностная зона, полутонкий срез, окраска метиленовым синим. Об. – 40; ок. – 12,5х. 179 А Б Рисунок 140 - Суставной хрящ. 30 суток без аппарата. Автодистракция в ночное время. А - поверхность, обращенная в суставную полость. СЭМ. Увеличение 800. Б – поверхностная зона, полутонкий срез, окраска метиленовым синим-основным фуксином. Об. – 40; ок. – 12,5х. Резюме. Таким образом, автодистракция в режиме «1 мм за 60 приёмов», проводимая в дневное либо в ночное время может быть отнесена к щадящим режимам удлинения конечности, поскольку в обеих сериях к концу опыта достигнута реституция структуры суставной поверхности. Однако при ночном режиме к концу периода дистракции в поверхностной зоне более выражены явления клеточной гибели, а в промежуточной и глубокой зонах в конце эксперимента выявлены признаки постпролиферативной терминальной дифференцировки хондроцитов, при этом пролиферативная активность, особенно к концу эксперимента, снижена. Динамика метаболических показателей (содержание серы и кальция) в суставном хряще также указывает на более благоприятный для структурно-функционального восстановления сустава режим дневной автодистракции по сравнению с ночной. 180 5.3. Морфофункциональное состояние нагружаемых участков суставного хряща мыщелков бедра при автоматическом удлинении голени с темпом 3 мм за 120 и 180 приемов (4А серия - за 120, 4 серия – за 180 приемов) При клинических наблюдениях за животными обеих серии существенных различий в функциональном состоянии удлиняемой конечности не выявлено. Через 10 суток дистракции собаки не наступали на оперированную (удлиненную) конечность. В смежных суставах определялись контрактуры. В коленном суставе пассивное сгибание осуществлялось в полном объеме, разгибание было ограничено до 150° (при норме 170° - 180°). Стопа находилась в физиологическом положении, в скакательном (голеностопном) суставе амплитуда движений была также ограниченной - не более 30° (при норме 80° -90°), в ряде опытов движения были качательными. К 30 суткам фиксации животные наступали на конечность в стойке и приступали при ходьбе. Разгибание в коленном суставе достигало 160°, стопа находилась в эквинусном положении, объем движений в голеностопном суставе 30° - 50°. Через месяц оперированную после конечность, снятия аппарата амплитуда собаки движений хорошо в нагружали коленном суставе приближалась к норме, в голеностопном суставе сохранялась контрактура, с амплитудой движений до 60°, стопа находилась в положении близком к эквинусу. Проведенные морфологические исследования на макро- и микроуровне показали, что в период автоматического удлинения голени с суточным темпом 3 мм в суставном хряще обеих серий выявлены сходные изменения. Через 10 суток дистракции при макроскопическом исследовании суставной хрящ животных обеих серий был истончен, матовый, по боковым поверхностям мыщелков определялись эрозии. При изучении в СЭМ отмечали деструкцию суставной поверхности в виде очагов разволокнения (Рисунок 141). 181 Рисунок 141 - Поверхность, обращенная в суставную полость. Очаг разволокнения. Серия «3/120». 10 суток дистракции. СЭМ. Увеличение 500. При светооптическом исследовании полутонких срезов в большей части наблюдений деструктивные изменения наиболее интенсивно были выражены в поверхностной и глубокой зонах хряща. Отмечено нарушение гомогенности межклеточного вещества, демаскировка коллагеновых волокон поверхностной зоны (Рисунок 142). А Б Рисунок 142 - Поверхностная зона, полутонкий срез, окраска метиленовым синим-основным фуксином. Об. – 40; ок. – 12,5х. Обозначения: ДКВ демаскировка коллагеновых волокон. А – серия «3/120». Б – серия «3/180». 182 Определялись очаги разволокнения, местами захватывающие часть промежуточной зоны. Окраска метиленовым синим выявляла метахромазию межклеточного вещества в участках разволокнения на поверхности коллагеновых волокон. Наблюдалось увеличение содержания клеток с вакуолизированной цитоплазмой, а также клеточных форм с кариопикнозом. В суставном хряще экспериментальных животных деструктивно измененные хондроциты были выявлены во всех зонах, но наибольшая частота встречаемости отмечена в поверхностной и глубокой зонах. В глубокой зоне в обеих сериях обнаружены клетки с признаками дегенерации, пустые клеточные лакуны (Рисунок 143). А Б Рисунок 143 - Дегенерирующие хондроциты глубокой зоны. Дистракция10 суток. Полутонкий срез. Окраска метиленрвым синим-основным фуксином. Об. – 100МИ; ок. – 12,5х. А – серия «3/120», Б – серия «3/180». Межклеточное вещество теряло гомогенное строение, в отдельных участках выявлялись демаскированные коллагеновые волокна. В обеих сериях в части наблюдений отмечено нарушение целостности базофильной линии – проникновение сосудов со стороны субхондральной кости (Рисунок 144), выявлены активные остеокласты, резорбирующие кальцифицированного хряща (Рисунок 145). основное вещество 183 А Б Рисунок 144 - Проникновение сосудов в глубокую зону хряща. Дистракция10 суток. Полутонкий срез. Окраска метиленовым синим-основным фуксином. Об. – 40; ок. – 12,5х. А – серия «3/120», размытые контуры базофильной линии (стрелки). Б – серия «3/180», отсутствует зона кальцифицированного хряща - КХр (стрелка). Рисунок 145 - Остеокласт, резорбирующий основное вещество кальцифицированного хряща. Серия «3/120». Дистракция10 суток. Полутонкий срез. Окраска метиленрвым синим-основным фуксином. Об. – 100МИ; ок. – 12,5х. Сходные картины деструктивных изменений наблюдали и через месяц фиксации. При светооптическом исследовании полутонких срезов в обеих сериях по сравнению с предыдущим сроком эксперимента отмечено уменьшение частоты встречаемости и объема участков разволокнения. Морфометрический анализ комплекса параметров на органном, тканевом и клеточном уровнях позволил более точно выявить различия в состоянии 184 суставного хряща при автодистракции с повышенным темпом в режимах «3/120» и «3/180» (Таблица 22). Таблица 22 – Количественные характеристики суставного хряща при автоматическом удлинении голени с темпом 3 мм Параметры VVch (%,М σ) NAch Sch (мкм-2M σ) (мкм2,M σ) Контроль 8,21 2,19 45,34 10,51 4,45 1,34 119,91 24,37 5,73 2,15 129,31 28,14 3 мм за 120 приемов (серия 4А) 9,32 2,87* 14,51 7,79* 3,81 2,19* 31,62 19,91* 4,98 1,51* 51,15 16,39* 12,41 3,23* 13,21 2,92* 8,78 2,56* 38,13 11,23* 5,67 2,36 53,26 6,59* h (мкм, M m) NNem.lac (%) NNis.gr. (%) 475,55 1,31 13,6 14,5 379,72 3,79 * 25,3 6 366,75 2,61 * 21,4 19 427,55 2,52 * 17,8 23,7 375,76 1,8 * 25,9 18,8 Контроль I II III 6,12 2,43 8,75 2,54 12,26 3,21 10 суток дистракции I II III I II III 5,45 3,56 4,65 3,26 4,65 4,37 30 суток без аппарата I II III 3,66 0,59* 4,42 0,89* 5,73 1,27* 10 суток дистракции I II III 3 мм за 180 приемов (серия 4) 4,15 1,35*■ 8,01 2,04■ 29,41 9,05* ■ 4,68 2,26*■ 5,31 2,43*■ 46,95 4,05*■ 5,54 1,73*■ 4,03 1,88*■ 91,28 18,12*■ 30 суток фиксации I II III 4,52 0,94*■ 5,64 1,34*■ 6,01 2,15*■ 5,52 1,87*■ 4,55 1,77*■ 4,61 1,91*■ 53,75 22,73*■ 83,26 22,75*■ 87,36 37,23*■ 439,55 1,8 *■ 28,9 22,1 30 суток без аппарата I II III 5,84 1,47*■ 8,38 1,68■ 9,82 1,34*■ 7,88 1,54*■ 5,68 1,63*■ 6,46 2,01*■ 37,95 14,76*■ 87,58 28,21*■ 85,42 23,75* 446,82 1,6 *■ 22,8 22,5 30 суток фиксации 1,17* 1,85* 1,49* 0,81* 1,11* 1,48* 12,25 1,98* 6,63 2,05* 5,64 2,76 24,3 2,83* 56,74 6,72* 83,46 13,96* Примечание: I – поверхностная, II – промежуточная, III – глубокая зоны хряща. * - достоверные различия с контролем, ■ - достоверные различия между сериями. Так, к концу дистракции в обеих сериях по сравнению с контролем отмечено достоверное (p<0,001) уменьшение толщины хряща (Рисунок 146), различия между сериями не достоверны (p4-4А>0,001). Через 30 суток фиксации в серии «3/120» сохранялись сниженные значения (p4-4А<0,001), в серии «3/180» выявлена тенденция к увеличению анализируемого параметра по сравнению с предыдущим сроком. Через 30 суток после снятия аппарата толщина хряща в обеих сериях относительно предыдущих этапов эксперимента увеличивалась, максимальные значения отмечены в серии «3/180» (Таблица 22), различия между сериями достоверны (p4-4А<0,001). 185 Рисунок 146 - Динамика толщины (мкм) суставного хряща на этапах эксперимента. В обеих сериях к концу периода дистракции выявлено значительное увеличение численной плотности пустых лакун в общем объеме выборки (Рисунок 147). На этапе фиксации в серии «3/180» значения доли пустых лакун были максимальными. К концу эксперимента выявлена тенденция к снижению доли пустых лакун в обеих сериях, наиболее выраженная в серии «3/120». Рисунок 147 - Динамика численной плотности пустых лакун (%) в суставном хряще на этапах эксперимента. Поверхностная зона демонстрирует наиболее ранние изменения стереологических параметров. Через 10 суток дистракции численная плотность хондроцитов (NAхц) в серии «3/180» достоверно снижена относительно контроля 186 и серии «3/120» (Рисунок 148), что связано с гибелью и деструкцией клеток. В серии «3/120» анализируемый параметр на всех этапах эксперимента превышал контроль (p<0,05). В серии «3/180» к концу эксперимента NAхц достигала контроля (р>0,05). Рисунок 148 - Динамика численной плотности хондроцитов (мкм-2) в поверхностной зоне суставного хряща на этапах эксперимента. Объемная плотность хондроцитов в поверхностной зоне обеих серий в период дистракции и в конце фиксации достоверно ниже контроля, минимальные значения отмечены к концу периода фиксации в серии «3/120» (Рисунок 149). Рисунок 149 - Динамика объемной плотности хондроцитов (%) в поверхностной зоне суставного хряща на этапах эксперимента. К концу эксперимента в серии «3/180» значения анализируемого параметра приближались к контролю, в серии «3/120» достоверно (p<0,05) снижены. Низкие 187 значения объемной плотности хондроцитов в серии «3/120» к концу эксперимента, на фоне высокой численной плотности клеток, вероятно обусловлены резким снижением площади хондроцитов (Таблица 22). Наблюдаемые деструктивные изменения сопровождались процессами, которые можно рассматривать как компенсаторные, направленные на пластическое обеспечение репарации поверхностной зоны, наиболее интенсивнее выраженные в серии «3/180». Через 30 суток фиксации в серии «3/120» на фоне высокой численной плотности хондроцитов основная часть клеток была с пикнотичными ядрами и с признаками вакуольной дистрофии (Рисунок 150А), значения площади хондроцитов минимальные (Таблица 22). В серии «3/180» увеличено количество изогенных групп, входящие в их состав хондроциты имели овальную либо округлую форму, гомогенные ядра и интенсивно базофильную цитоплазму (Рисунок 150Б). А Б Рисунок 150 - 30 суток фиксации. Полутонкие срезы, окраска метиленовым синим-основным фуксином. А – серия «3 за 120». Об. – 40; ок. - 12,5х. Б – функционально активные хондроциты поверхностной зоны в серии «3 за 180». Об. – 100МИ; ок. - 12,5х. Динамика морфометрических характеристик хондроцитов в анализируемых сериях опытов представлена в таблицах 23 и 24. 188 Таблица 23 - Количественные характеристики хондроцитов суставного хряща при автоматическом удлинении голени с темпом 3 мм за 120 приемов (M σ) Срок эксперимента Vvn Vvc NCI Клетка d min d max Ff Ядро d min d max Ff Vvn Vvc NCI Клетка d min d max Ff Ядро d min d max Ff Срок эксперимента Vvn Vvc NCI Клетка d min d max Ff Ядро d min d max Ff Контроль Дистракция Поверхностная зона 0,42±0,09 0,33±0,07* 0,58±0,09 0,66±0,07* 0,75±0,22 0,56±0,27* 1,28±0,86 2,97±0,92* 10,75±2,09 7,79±1,31* 0,47±0,16 0,67±0,18* 1,08±0,52 1,61±0,58* 6,71±0,83 4,79±1,71* 0,52±0,11 0,66±0,22* Промежуточная зона 0,21±0,03 0,28±0,05* 0,79±0,03 0,72±0,05* 0,27±0,08 0,48±0,28* 5,82±1,31 5,47±1,57* 13,13±1,79 9,07±2,38* 0,72±0,09 0,86±0,12* 2,11±0,62 3,09±1,06* 6,12±1,27 4,55±1,42* 0,76±0,15 0,95±0,29* Глубокая зона Контроль Дистракция 0,19±0,06 0,81±0,06 0,25±0,09 4,83±1,58 12,41±2,11 0,69±0,09 1,29±0,81 5,91±1,04 0,61±0,16 0,19±0,06 0,81±0,06 0,25±0,09 6,99±1,29* 11,23±2,55* 0,86±0,09* 3,08±0,83* 4,86±0,89* 0,87±0,13* Фиксация Без аппарата 0,42±0,09 0,58±0,09 0,73±0,13 3,09±0,68* 9,16±1,62* 0,61±0,09* 2,04±0,75* 5,01±1,09* 0,78±0,17* 0,40±0,06* 0,60±0,06* 0,71±0,21* 3,58±0,65* 11,64±1,93* 0,59±0,12* 2,29±0,48* 6,58±1,45* 0,72±0,12* 0,31±0,07* 0,69±0,07* 0,48±0,19* 7,04±1,36* 11,25±2,94* 0,89±0,11* 4,02±0,91* 5,99±1,38 0,89±0,11* 0,29±0,08* 0,70±0,08* 0,52±0,25* 7,42±1,49* 11,06±2,89* 0,88±0,13* 3,99±0,72* 5,85±0,85* 0,95±0,16* Фиксация Без аппарата 0,21±0,04* 0,79±0,04* 0,31±0,17* 8,56±1,34* 12,01±1,81* 0,91±0,06* 3,73±0,81* 5,57±1,09* 0,84±0,12* 0,19±0,07 0,81±0,07 0,25±0,11 9,77±1,68* 13,01±2,09* 0,92±0,05* 4,22±0,89* 6,44±1,09* 0,75±0,16* Примечание: проверка различий проведена с помощью критерия Вилкоксона. Достоверные различия с контролем * p<0,05; Жирным шрифтом – различия не достоверны. 189 Таблица 24 - Количественные характеристики хондроцитов суставного хряща при автоматическом удлинении голени с темпом 3 мм за 180 приемов (M σ) Срок эксперимента Vvn Vvc NCI Клетка d min d max Ff Ядро d min d max Ff Vvn Vvc NCI Клетка d min d max Ff Ядро d min d max Ff Vvn Vvc NCI Клетка d min d max Ff Ядро d min d max Ff Контроль Дистракция Поверхностная зона 0,42±0,09 0,29±0,09* 0,58±0,09 0,71±0,09* 0,75±0,22 0,44±0,21* 1,28±0,86 3,19±1,08* 10,75±2,09 11,1±2,15 0,47±0,16 0,61±0,11* 1,08±0,52 1,3±0,76 6,71±0,83 5,9±1,79* 0,52±0,11 0,54±0,12 Промежуточная зона 0,21±0,03 0,19±0,08 0,79±0,03 0,80±0,08 0,27±0,08 0,26±0,16 5,82±1,31 6,02±3,63 13,13±1,79 11,2±2,77* 0,72±0,09 0,75±0,15* 2,11±0,62 0,9±0,22* 6,12±1,27 4,7±1,87* 0,76±0,15 0,48±0,09* Глубокая зона 0,19±0,06 0,21±0,06* 0,81±0,06 0,79±0,06* 0,25±0,09 0,27±0,09* 4,83±1,58 5,8±2,93* 12,41±2,11 11,2±2,21* 0,69±0,09 0,75±0,12* 1,29±0,81 0,95±0,49 5,91±1,04 5,14±1,54* 0,61±0,16 0,5±0,17* Фиксация Без аппарата 0,28±0,08* 0,71±0,08* 0,409±0,16* 3,46±0,3* 11,2±0,4 0,58±0,14* 1,7±0,82* 5,7±1,24* 0,61±0,12* 0,32±0,09* 0,678±0,09* 0,50±0,23* 3,43±0,46* 10,5±0,3 0,62±0,08* 2,2±0,23* 5,58±0,33* 0,67±0,11* 0,19±0,06* 0,81±0,06* 0,25±0,11* 7,02±1,54* 12,2±2,48 0,76±0,08* 1,8±0,93* 5,6±1,24 0,64±0,16* 0,22±0,06 0,77±0,06 0,29±0,11 8,67±2,37* 13,7±2,14 0,79±0,06* 3,9±1,19* 6,01±1,87 0,8±0,03* 0,23±0,09* 0,76±0,09* 0,33±0,19* 5,2±2,34* 10,6±1,14* 0,72±0,12* 1,5±0,67* 5,13±1,28* 0,63±0,16 0,20±0,07 0,79±0,07 0,26±0,12 8,64±1,73* 13,4±1,39* 0,79±0,06* 3,1±0,74* 5,9±1,08 0,75±0,18* Примечание: проверка различий проведена с помощью критерия Вилкоксона. Достоверные различия с контролем * p<0,05. Жирным шрифтом – различия не достоверны. К концу дистракции в обеих сериях площадь хондроцитов снижена, через 30 суток фиксации в серии «3/180» значения анализируемого параметра значительно увеличивались, в серии «3/120» продолжали снижаться (Рисунок 151). 190 Рисунок 151 - Площадь хондроцитов (мкм2) поверхностной зоны суставного хряща на этапах эксперимента. К концу эксперимента в серии «3/120» выявлена тенденция к увеличению данного параметра, в серии «3/180» – к снижению, минимальные значения на всех этапах эксперимента выявлены в серии «3/120». При режиме 3 мм за 120 приемов снижение ядерно-цитоплазматического индекса (NCI) отмечено только к концу периода дистракции, на последующих этапах NCI сопоставим с контролем (Рисунок 152). Рисунок 152 - Динамика ядерно-цитоплазматического индекса хондроцитов поверхностной зоны суставного хряща на этапах эксперимента. При режиме 3 мм за 180 приемов на всех этапах эксперимента в поверхностной зоне хряща выявлено снижение ядерно-цитоплазматического 191 индекса в связи с более значительным ростом объемной доли цитоплазмы по сравнению с ядром. К концу эксперимента выявлена тенденция к увеличению NCI, но относительно контроля сохранялись сниженные значения. На всех этапах эксперимента различия между сериями анализируемого параметра достоверны (p4-4А<0,05). Судя по увеличению фактора формы и минимального диаметра клетки поверхностной зоны округлялись, максимальные значения минимального диаметра выявлены в серии «3/180» (Рисунок 153). Различия между сериями достоверны (p4-4А<0,05) на этапе дистракции и через месяц после снятия аппарата. Рисунок 153 - Минимальный диаметр хондроцитов поверхностной зоны суставного хряща на этапах эксперимента. Снижение объемной плотности, площади и увеличение NCI хондроцитов поверхностной зоны хряща в серии «3/120» интенсивнее выражены в период фиксации. Присутствие таких клеток может являться отражением деструктивных изменений, апоптоза, либо дедифференцировки клеток и восстановления их пролиферативных потенций (Рисунок 154). Известно, что дедифференцировка, как реактивно-приспособительное увеличением относительных изменение объемов ядер клеток, [39, 94]. сопровождается Самым ранним морфологическим проявлением апоптоза является появление в ядре резко 192 очерченных уплотненных масс хроматина с внутренней стороны ядерной оболочки [39]. А Б Рисунок 154 - Хондроциты поверхностной зоны хряща. Серия «3/120». Полутонкие срезы, окраска метиленовым синим-основным фуксином. Об. – 100МИ; ок. - 12,5х. А – сверху хондроцит в состоянии деструкции, ниже два хондроцита с признаками апоптоза, доля ядра значительно превышает долю цитоплазмы, хроматин конденсируется по периферии, образуя плотные массы различной формы и размеров. Б – хондроцит без признаков деструкции, доля ядра значительно превышает долю цитоплазмы, ядерный хроматин частично конденсирован и диспергирован по всему ядру, цитоплазма базофильная, имеет зернистый вид. В серии «3/180» увеличение размеров клеток и их ядер, снижение NCI, наиболее выраженные к концу фиксации, свидетельствовали о повышении биосинтетической компенсаторным активности процессам хондроцитов можно отнести поверхностной активную зоны. К пролиферацию хондроцитов, что проявляется в увеличении количества изогенных групп клеток. В серии «3/180» численная плотность изогенных групп на всех этапах эксперимента была достоверно выше нормы (Рисунок 155). В серии «3/120» к концу дистракции численная плотность изогенных групп меньше контроля, при этом изогенные группы отмечены единично в поверхностной и глубокой зонах. 193 Рисунок 155 - Динамика численной плотности изогенных групп (%) в уставном хряще на этапах эксперимента. На этапе фиксации значения доли изогенных групп увеличивались и к концу эксперимента были сопоставимы со значениями серии «3/180». Наибольшая частота встречаемости изогенных групп в серии «3/180» на всех сроках эксперимента отмечена в промежуточной зоне хряща (Рисунок 156А). А Б Рисунок 156 - Промежуточная зона суставного хряща. 10 суток дистракции. Полутонкий срез. Окраска метиленовым синим-основным фуксином. А – серия «3/180». Об. – 16; ок. – 12,5х. Б – серия «3/120». Об. – 40; ок. – 12,5х. Значения численной плотности клеток в промежуточной зоне на всех этапах эксперимента превышали или были сопоставимы с контрольными значениями (Рисунок 157). В серии «3/120» к концу периода дистракции низкие значения 194 численной плотности обусловлены увеличением доли бесклеточных полей (Рисунок 156Б), изогенные группы были выявлены в поверхностной зоне. На последующих этапах эксперимента наибольшая частота встречаемости изогенных групп в серии «3/120» отмечена в промежуточной зоне, что сопровождалось увеличением численной плотности. Рисунок 157 - Динамика численной плотности хондроцитов (мкм-2) промежуточной зоны суставного хряща на этапах эксперимента. В обеих сериях на аппаратном этапе эксперимента выявлено снижение объемной плотности хондроцитов промежуточной зоны, минимальные значения отмечены в серии «3/120» (Рисунок 158). К концу эксперимента в серии «3/180» значения анализируемого параметра приближались к контрольным значениям, в серии «3/120» сохранялись сниженные значения. Количественные исследования на клеточном уровне выявили снижение площади хондроцитов промежуточной зоны в обеих сериях, наиболее выраженное в серии «3/120» (Рисунок 159). К концу эксперимента выявлена тенденция к увеличению данного параметра, относительно контроля сохранялись сниженные значения, минимальные значения отмечены в серии «3/120». 195 Рисунок 158 - Динамика объемной плотности хондроцитов (%) промежуточной зоны суставного хряща на этапах эксперимента. Рисунок 159 - Динамика площади хондроцитов (мкм2) промежуточной зоны суставного хряща на этапах эксперимента. Динамика минимального диаметра клеток в промежуточной зоне в обеих сериях имела одинаковый характер. На этапе дистракции значения данного параметра незначительно снижены в серии «3/120» и сопоставимы в серии «3/180» с контролем, к концу эксперимента увеличивались, максимальные значения выявлены в серии «3/180» (Рисунок 160). Различия между сериями достоверны (p4-4А<0,05) на всех этапах эксперимента. При этом максимальный диаметр (dmax) клеток достоверно ниже контроля в серии «3/120» на всех этапах эксперимента, в серии «3/180» только в срок 10 суток дистракции (Таблица 23, 24). Различия между сериями анализируемого 196 параметра достоверны (p4-4А<0,05) на всех этапах эксперимента. Анализ размерных характеристик показал, что хондроциты промежуточной зоны по сравнению с контролем уменьшены в размерах имели округлую форму (значения фактора формы клеток в обеих сериях превышали контроль, максимальные значения выявлены в серии «3/120»). Рисунок 160 - Минимальный диаметр хондроцитов (мкм) промежуточной зоны суставного хряща на этапах эксперимента. Максимальные количественные характеристики клеток промежуточной зоны в обеих сериях выявлены в срок 30 суток без аппарата. В серии «3/120» наблюдалось увеличение параметров, характеризующих размер и форму ядер, за исключением dmax. Выявлено достоверное (p<0,05) увеличение объемной плотности ядра (Vvn), в результате чего NCI на всех этапах эксперимента превышал контроль (Рисунок 161). В серии «3/180» за счет увеличения в большей степени объемной плотности цитоплазмы значения NCI в период дистракции и фиксации незначительно снижены, к концу эксперимента сопоставимы с контролем. Различия между сериями значений NCI достоверны (p4-4А<0,05) на всех этапах эксперимента. 197 Рисунок 161 - Динамика ядерно-цитоплазматического индекса (NCI) хондроцитов промежуточной зоны суставного хряща на этапах эксперимента. Выявленная динамика количественных цитологических характеристик промежуточной зоны в серии «3/120» может являться отражением апоптоза (Рисунок 162А), либо дедифференцировки клеток и восстановления их пролиферативных потенций (к концу эксперимента доля изогенных групп в общем объеме выборки увеличивается). В серии «3/180» более интенсивно выражены процессы пролиферации и биосинтеза (Рисунок 162Б). А Б Рисунок 162 - Хондроциты промежуточной зоны хряща. 30 суток без аппарата. Полутонкий срез. Окраска метиленовым синим-основным фуксином. Об. – 40; ок. – 12,5х. А – серия «3/120», стрелкой указан хондроцит с признаками апоптоза, сжатие клетки, хроматин конденсируется по периферии. Б – серия «3/180», горизонтальной стрелкой обозначена молодая изогенная группа, хондроциты находятся в одной лакуне, территориальный матрикс не сформирован, вертикальной стрелкой – образование территориального матрикса, расхождение клеток. 198 В глубокой зоне численная плотность хондроцитов на этапах дистракции и фиксации голени в аппарате в обеих сериях ниже нормы, что обусловлено разрушением и гибелью части клеток. Наибольшее снижение параметра отмечено в серии «3/180», различия между сериями достоверны (Рисунок 163). К концу эксперимента значения численной плотности хондроцитов в серии «3/120» сопоставимы контролем, в серии «3/180» превышали контроль. Рисунок 163 - Динамика численной плотности хондроцитов (мкм-2) глубокой зоны суставного хряща на этапах эксперимента. Динамика объемной плотности хондроцитов в обеих сериях имела одинаковый характер: на всех этапах эксперимента достоверно снижена, минимальные значения отмечены в серии «3/120», к концу эксперимента выявлена тенденция к увеличению данного параметра, наиболее выраженная в серии «3/180» (Рисунок 164). Низкие значения объемной плотности хондроцитов в обеих сериях обусловлены резким снижением площади хондроцитов, более выраженным в серии «3/120» (Рисунок 165). 199 Рисунок 164 - Динамика объемной плотности хондроцитов (%) глубокой зоны суставного хряща на этапах эксперимента. Рисунок 165 - Динамика площади хондроцитов (мкм2) глубокой зоны суставного хряща на этапах удлинения голени. Динамика минимального и максимального диаметров клеток глубокой зоны в обеих сериях имела одинаковый характер. Увеличение значений dmin и снижение dmax интенсивнее выражены в серии «3/120» и сопровождались увеличением фактора формы клеток (Таблица 23). В серии «3/120» NCI на этапах дистракции и через 30 суток после снятия аппарата сопоставим с контролем (Рисунок 166), в срок 30 суток фиксации за счет увеличения Vvn превышал контроль. 200 Рисунок 166 - Динамика ядерно-цитоплазматического индекса (NCI) хондроцитов глубокой зоны суставного хряща на этапах эксперимента. В серии «3/180» за счет более выраженного увеличения Vvn относительно серии «3/120» на этапе дистракции и в конце эксперимента значения NCI были сопоставимы, а в срок 30 суток фиксации превышали контроль. Различия между сериями значений NCI достоверны (p4-4А<0,05) на всех этапах эксперимента. Анализ размерных характеристик показал, что хондроциты промежуточной и глубокой зон суставного хряща в экспериментальных сериях уменьшены в размерах, имеют более округлую форму, по сравнению с контролем. Максимальные количественные характеристики клеток выявлены в срок 30 суток без аппарата. Возможность и степень восстановления суставной поверхности в обеих экспериментальных сериях иллюстрируют данные, полученные через месяц после снятия аппарата. Макроскопически отмечали суставные поверхности белого цвета местами шероховатые. При изучении в СЭМ определялись обширные участки с регулярной волнистостью. При этом сохранялись и участки с вскрытыми клеточными лакунами. Изображения СЭМ суставной поверхности и полутонких срезов суставного хряща в серии «3/180» см. в главе 5.1.. На полутонких срезах сохранялось нарушение организации поверхностной зоны (Рисунок 167). матрикса суперфициальной части 201 А Б Рисунок 167 - Суставной хрящ. 30 суток без аппарата. Серия «3/120». А – общий вид суставного хряща. Об. – 6,3; ок. – 12,5х. Б – поверхностная зона, полутонкий срез, окраска метиленовым синим-основным фуксином. Об. – 40; ок. – 12,5х. В промежуточной и глубокой зонах сохранялось повышенное количество изогенных групп клеток (Рисунок 168). Хондроциты характеризовались как биосинтетически активные, об этом свидетельствовали, наличие секреторных включений, образование миелиновых структур, базофилия и гомогенность территориального и межтерриториального матрикса (Рисунок 168). А Б Рисунок 168 - Функционально активные хондроциты. Полутонкий срез, окраска метиленовым синим-основным фуксином. Серия «3/120». А – промежуточная зона. Об. 40; ок. 12,5х. Б – глубокая зона. Об. 100МИ; ок. 12,5х. Обозначения: Я – ядро, МС – миелиновые структуры. 202 Мозаичность распределения очагов деструкции, наличие неповрежденных участков и клеток нормальной структуры свидетельствовали о возможности репаративных реакций в суставном хряще при данных условиях эксперимента. Резюме. В обеих экспериментальных сериях в период дистракции деструктивные изменения интенсивнее выражены в поверхностной и глубокой зонах хряща. Соотношение количественных параметров в изученных сериях к концу дистракции свидетельствует о том, что в серии «3/120» происходит более выраженное снижение биосинтетической и пролиферативной активности хондроцитов, чем в серии «3/180». В срок 30 суток фиксации голени в аппарате толщина хряща и размерные характеристики хондроцитов в серии «3/180» возрастают по сравнению с предыдущим сроком, а в серии «3/120» продолжают снижаться. Через 30 суток без аппарата толщина хряща в обеих сериях относительно предыдущих этапов эксперимента увеличивалась, но не достигала контроля, максимальные значения отмечены в серии «3/180». При использовании автодистракции с повышенным темпом изменения суставного хряща имеют обратимый характер. Восстановление структуры суставного хряща осуществляется, как за счет межклеточного матрикса, так и за счет собственных возможностей хондроцитов. Сравнивая течение восстановительного процесса при автодистракции с повышенным темпом, можно отметить, что при режиме «3/180» восстановление протекает более интенсивно. 203 5.4. Структурная реорганизация хряща нагружаемых участков суставной поверхности коленного сустава при метадиафизарном удлинении голени. Клинические наблюдения показали, что по окончании периода дистракции у двух собак отсутствовала опорная функция оперированной конечности. У остальных животных наблюдалась хромота. Угол разгибания в коленном суставе составил 130°-145°. Отмечалась тенденция к эквинусному положению лапы, объем движений в скакательном суставе достигал 80°-90°. По завершению этапа фиксации конечности в аппарате (35 суток) хромота значительно уменьшалась, сохранялась тенденция к эквинусной установке лапы. Объем движений в коленном и скакательном суставах не изменился. Через месяц после снятия аппарата животные пользовались удлиненной конечностью, однако имело место перемежающая хромота. В коленном суставе сохранялась сгибательная контрактура (95°-105°). Рентгенологически к окончанию дистракции у 4 животных имело место смещение проксимального костного фрагмента вперед на 5-8°, кнутри на 6-10°, у двух животных на 2° и 4° соответственно, что обусловило формирование сочетания антекурвационной и вальгусной деформаций голени. Снижение стабильности фиксации появилось на третьей (n=4), четвертой (n=2) неделях дистракции и было обусловлено расширением спицевых каналов. В течение периода фиксации деформации не увеличились. При патогистологическом исследовании через 28 суток дистракции у собаки №5027 с минимальным смещением проксмального костного фрагмента сохранена зональная структура хряща (Рисунок 169А). Деструктивные изменения отмечены в поверхностной зоне в виде разволокнения суперфициальной ее части, в отдельных участках сохранена бесклеточная пластинка. Часть клеток поверхностной зоны с пикнотичными ядрами, неповрежденные хондроциты характеризовались как функционально активные, имели светлые гомогенные ядра, базофильную цитоплазму. В промежуточной зоне отмечены хондроциты с 204 признаками вакуольной дистрофии, содержащие в цитоплазме миелиновые структуры, единично отмечены двухчленные изогенные группы (Рисунок 169Б). В глубокой зоне хондроциты небольших размеров, часть из них с пикнотичными ядрами, признаками деструкции, отмечены пустые лакуны (Рисунок 169В). А Б В Г Рисунок 169 - Суставной хрящ. Полутонкие срезы, окраска метиленовым синим основным фуксином. А – общий вид. Об. – 2,5; ок. – 12,5х. Б – функционально активные хондроциты промежуточной зоны. Об. – 100МИ; ок. – 12,5х. В – глубокая зона хряща, пустые лакуны. Об. – 40; ок. – 12,5х. Г – остеокласт, резорбирующий основное вещество кальцифицированного хряща. Об. – 100МИ; ок. – 12,5х. Целостность базофильной линии не нарушена. В отдельных участках выявлены истончение зоны кальцифицированного хряща, явления остеокластической резорбции (Рисунок 169Г). В суставном хряще собак со смещением проксимального костного фрагмента более 5° интенсивнее выражены деструктивные изменения. У собаки №5128 суставной хрящ истончен, отмечено разволокнение поверхностной и части 205 промежуточной зон (Рисунок 170А, Б). Большая часть хондроцитов в состоянии деструкции. В промежуточной и глубокой зонах много пустых лакун (Рисунок 170В, Г). В отдельных участках отсутствовала зона кальцифицированного хряща (Рисунок 170А). А Б В Г Рисунок 170 - Суставной хрящ собаки №5128. Полутонкие срезы, окраска метиленовым синим основным фуксином. А – общий вид, истончение хряща, разволокнение матрикса поверхностной и промежуточной зон. Об. – 2,5; ок. – 12,5х. Б – разволокнение поверхностной зоны. Об. – 100МИ; ок. – 12,5х. В – функционально активные хондроциты и хондроциты в состоянии гибели в промежуточной зоне. Об. – 100МИ; ок. – 12,5х. Г – глубокая зона хряща, пустые лакуны. Об. – 40; ок. – 12,5х. У собаки №5143 хрящ истончен, нарушена его архитектоника, во всех зонах отмечена демаскировка коллагеновых волокон (Рисунок 171). Хондроциты аномальной формы. Много клеток в состоянии гибели и деструкции. 206 А Б В Г Рисунок 171 - Суставной хрящ собаки №5143. Полутонкие срезы, окраска метиленовым синим основным фуксином. А – общий вид. Об. – 2,5; ок. – 12,5х. Б – поверхностная, В – промежуточная, Г – глубокая зоны хряща. Об. – 40; ок. – 12,5х. При гистоморфометрическом анализе (Таблица 25) у собаки №5027 отмечено снижение параметров: толщины хряща, объемной плотности хондроцитов. Увеличена численная плотность хондроцитов, доля хондроцитов в составе изогенных групп и доля пустых лакун. Такие отличия от интактного контроля свидетельствовали о развитии деструктивно-репаративных процессов. При гистоморфометрическом исследовании микропрепаратов от собак №№5128 и 5143 установлено, что по сравнению с наблюдением №5027 более выражено снижение параметров: толщины хряща, объемной плотности хондроцитов (Таблица 25). Увеличение численной плотности хондроцитов на фоне значительного увеличения доли пустых лакун и снижения доли хондроцитов в составе изогенных групп свидетельствовало о прогрессировании деструктивных изменений. 207 Таблица 25 - Количественные характеристики суставного хряща на этапах эксперимента Параметры Контроль VVch (%,М σ) 9,03 4,54 5027* 5128 5,77±2,06 4,62±0,72 5143 4,46±1,57 NAch NNem.lac( -2 %) (мкм , M σ) 19,6 6,1 2,45 28 суток дистракции 27,5 8,21±3,42 40,6 8,43±1,61 11,16±3,27 44,6 NNis.gr. (%) 14,5 h (мкм, M m) 18,8 4,1 424,87±2,15 323,6±6,17 2,5 282,94±2,14 475,5 1,3 Примечание: Жирным шрифтом выделены достоверные отличия с контролем при р 0,05. *- опыт с минимальным смещением проксимального костного фрагмента Через месяц после снятия аппарата при исследовании структуры суставного хряща наименьшая травматизация обнаруживалась у собаки №5075 с минимальным смещеним проксимального костного фрагмента кпереди и медиально (2 и 4° соответственно). Очаги разволокнения не выявлены (Рисунок 172). А Б В Г Рисунок 172 - Суставной хрящ собаки №5075. Полутонкие срезы, окраска метиленовым синим-основным фуксином. Об. – 6,3; ок. – 12,5х (А). Об. – 40; ок. – 12,5х (Б, В, Г). А – общий вид. Б – поверхностная зона. В – промежуточная зона. Г – глубокая зона. 208 Деструктивные изменения выражались в виде гибели отдельных хондроцитов, отмеченных во всех зонах хряща, особенно, в промежуточной, где наблюдалось увеличение доли бесклеточных полей (Рисунок 172В). У собак №5076 и №5151 со смещением проксимального костного фрагмента более 5° в суставном хряще сохранялось разволокнение поверхностной зоны, выявлено нарушение целостности базофильной линии, проникновение сосудов в хрящ (Рисунок 173, 174). В суставном хряще собаки №5151 наблюдалось повышение пролиферативной активности хондроцитов, отмечено увеличение частоты встречаемости 2-х, 3-х членных изогенных групп клеток. А Б В Г Рисунок 173 - Суставной хрящ собаки №5076. Полутонкие срезы, окраска метиленовым синим-основным фуксином. А – общий вид. Об. – 2,5; ок. – 12,5х. Б – поверхностная, В – промежуточная, Г – глубокая зоны хряща. Об. – 40; ок. – 12,5х. Относительно предыдущего этапа эксперимента отмечено увеличение параметров: толщины хряща, объемной плотности хондроцитов, доли 209 хондроцитов в составе изогенных групп. По сравнению с контролем сохранялись высокие значения доли пустых лакун (Таблица 26.). А Б В Г Рисунок 174 - Суставной хрящ собаки №5151. Полутонкие срезы, окраска метиленовым синим-основным фуксином. А – общий вид. Об. – 2,5; ок. – 12,5х. Б – поверхностная, В – промежуточная, Г – глубокая зоны хряща. Об. – 40; ок. – 12,5х. При гистоморфометрическом исследовании суставного хряща собаки №5075 относительно предыдущего этапа эксперимента отмечено увеличение параметров: толщины хряща, объемной плотности хондроцитов, снижение доли хондроцитов в составе изогенных групп. По сравнению с контролем сохранялись высокие значения доли пустых лакун (Таблица 26.). У собак №5076 и 5151 толщина хряща увеличивалась относительно предыдущего этапа эксперимента в меньшей степени чем, у собаки №5075, относительно контроля сохранялись достоверно сниженные значения. По 210 сравнению с предыдущим этапом эксперимента выявлено снижение доли пустых лакун и увеличение доли изогенных групп. Таблица 26 - Количественные характеристики суставного хряща на этапах эксперимента Параметры VVch (%,М σ) NAch (мкм-2,M σ) NNem lac (%) NNis gr (%) h (мкм, M m) Контроль 9,03 4,54 6,1 2,45 19,6 14,5 475,5 1,3 30 суток без аппарата 25,2 7,54±4,02 26,5 9,25±3,39 27,6 11,26±4,26 8,2 12,6 16,5 471,95±3,82 411,66±8,42 456,95±3,61 5,77±2,55 6,44±2,61 7,89±2,01 5075* 5076 5151 Примечание: Жирным шрифтом выделены достоверные отличия с контролем при р 0,05. *- опыт с минимальным смещением проксимального костного фрагмента. Резюме. Анализ особенностей структурной реорганизации нагружаемых участков суставного хряща в условиях метадиафизарного удлинения голени у 6 собак (три выведены из опыта в конце периода дистракции и три через 30 суток после снятия аппарата) выявил существенные межиндивидуальные различия описательных и количественных характеристик, обусловленные неоднородностью условий эксперимента, а именно степенью нарушения стабильности фиксации и развития антекурвационно-вальгусной деформации костного регенерата. У большей части собак (4 из 6) с деформациями более 5° отмечены выраженные деструктивные изменения к концу периода дистракции и их прогрессирование к концу опыта вплоть до проникновения сосудов в хрящ. Единичные наблюдения (2 из 6) с деформациями, не превышавшими 4 градусов свидетельствовали о лучшей, по сравнению с диафизарным удлинением сохранностью поверхностной зоны и более близкими к интактному контролю значениями количественных параметров. Однако низкий показатель доли изогенных групп и состояние промежуточной зоны (появление бесклеточных полей) в конце опыта свидетельствует о регрессивных изменениях гиалинового хряща и неблагоприятном функциональном прогнозе. 211 В дальнейших экспериментальных исследованиях следует разработать эффективные способы профилактики угловых смещений костных фрагментов при удлинении и уточнить представления об оптимальном уровне нарушения целостности кости. 212 Глава. 6. Гистоморфометрические характеристики синовиальной оболочки интактных и экспериментальных собак Рассматривая синовиальную оболочку как составную часть синовиального сустава, обеспечивающую пластические, энергетические и защитные функции суставного хряща остановимся на ее морфофункциональных особенностях в разных возрастных периодах, а так же при разных условиях эксперимента (моделировании остеоартроза с редуцированным кровоснабжением и ортопедическом удлинении голени). 6.1. Гистоморфометрическая характеристика синовиальной оболочки интактных животных в разные возрастные периоды. У щенков в возрасте 6-ти месяцев покровный слой синовиальной оболочки представлен синовиоцитами, которые располагались в 1-2 ряда (Рисунок 175А). А Б Рисунок 175 - Поперечный полутонкий срез синовиальной оболочки коленного сустава щенка в возрасте 6 месяцев. Окраска метиленовым синим-основным фуксином. А – в покровном слое (ПС) синовиоциты расположены в 1-2 ряда. В субсиновиальном слое (СбС) преобладает межклеточное вещество. Об. – 40; ок. – 12,5х. Б – синовиоциты фибробластического типа. Об. – 100МИ; ок. – 12,5х. Толщина покровного слоя составила 16,12±4,79 мкм. Синовиальные клетки полиморфны, большинство из них можно отнести к фибробластическим. Довольно часто встречались клетки с округлыми крупными светлыми ядрами, 213 крупными ядрышками, звёздообразным хроматином и относительно небольшим количеством цитоплазмы (Рисунок 175Б), иногда – двуядерные клетки. Покровный слой сливался с субсиновиальным путем плавного перехода от аваскулярного внутреннего покрытия, содержащего множество клеток, к васкуляризированной субсиновиальной соединительной ткани с большим содержанием кровеносных сосудов и с меньшим количеством клеток, среди которых преобладали клетки фибробластического ряда. Численная плотность микрососудов составила 369,71±35,13 в 1 мм2. Многие сосуды субсиновиального слоя с дилатированными просветами и толстыми стенками (Рисунок 176А). А Б В Г Рисунок 176 - Сосуды субсиновиального слоя синовиальной оболочки коленного сустава щенка в возрасте 6 месяцев. Окраска метиленовым синим-основным фуксином. Об. – 100МИ; ок. – 12,5х (А, Б, Г). Об. – 40; ок. – 12,5х (В). А просветы микрососудов расширены, стенки гипертрофированы. Б - микрососуды с «адвентицией», дистрофические изменения эндотелия и мышечных клеток. В – артерия малого калибра. Г – тучная клетка (ТК) в периваскулярном пространстве вены. 214 Отмечены микрососуды с «адвентицией» и дистрофическими изменениями эндотелия и мышечных клеток (Рисунок 176Б). В составе стенок артерий малого калибра встречались эндотелиоциты булавовидного фенотипа и гладкомышечные клетки (ГМК) с продольной ориентацией (Рисунок 176В). Повышено количество периваскулярных клеток. Среди них встречались тучные клетки с тёмнобазофильными крупными гранулами и крупными светлыми ядрами (Рисунок 176Г). Нервы субсиновиального слоя содержали большое количество безмиелиновых и миелинизирующихся нервных волокон преимущественно малого калибра миелинизированные и с тонкими волокна миелиновыми единичны (Рисунок оболочками, 177). Высокая крупные частота ядросодержащих профилей нервных волокон указывала на большое количество мелких шванновских клеток в составе их оболочек и, соответственно, короткие сегменты миелина. Рисунок 177 - Нервы субсиновиального слоя. Полутонкий срез, окраска толуидиновым синим. Об. – 100МИ; ок. – 12,5х. По мере приближения к соединению с фиброзной капсулой субсиновиальный слой представлен коллагеновыми волокнами, которые имели параллельное расположение (Рисунок 178). 215 Рисунок 178 - Глубокий субсиновиальный слой синовиальной оболочки коленного сустава щенка в возрасте 6 месяцев. Полутонкий срез, окраска метиленовым синим-основным фуксином. Об. – 16; ок. – 12,5х. В 10 месяцев по сравнению с предыдущим сроком в покровном слое выражено более резкое преобладание фибробластических синовиоцитов (Рисунок 179), основная функция которых синтез компонентов межклеточного матрикса. Толщина покровного слоя составила 18,59±2,91 мкм. В субсиновиальном слое наряду с фибробластами/фиброцитами отмечены макрофаги, увеличена частота встречаемости тучных клеток. А Б Рисунок 179 - Поперечный полутонкий срез синовиальной оболочки коленного сустава щенка в возрасте 10 месяцев. Окраска метиленовым синим-основным фуксином. А - синовиоциты покровного слоя расположены в 1-2 слоя. Об. – 40; ок. – 12,5х. Б – фибробластические синовиоциты (стрелки). Об. – 100МИ; ок. – 12,5х. 216 Многие сосуды субсиновиального слоя имели закрытые и даже облитерированные просветы. В артериях малого калибра в составе интимы отмечены модифицированные ГМК – миоинтимальные клетки, выражен интерстициальный отёк субэндотелиального слоя, вакуольная дегенерация ГМК медии (Рисунок 180Б). Возможность замещения эндотелиоцитов миоинтимальными клетками была доказана ультраструктурными исследованиями [270] в условиях нормальной жизнедеятельности, в качестве ускоряющего этот процесс фактора рассматривалось повреждение сосудов. А Б Рисунок 180 - Сосуды субсиновиального слоя синовиальной оболочки коленного сустава щенка в возрасте 10 месяцев. Окраска метиленовым синим-основным фуксином. А - Об. – 40; ок. – 12,5х., Б - Об. – 100МИ; ок. – 12,5х. Относительно предыдущего возрастного периода численная плотность микрососудов незначительно (р>0,05) увеличивалась (Таблица 27). В возрасте 2 лет покровный слой синовиальной оболочки представлен фибробластическими синовиоцитами, которые имели вытянутую, веретенообразную форму и расположены 1-2 слоями (Рисунок 181А). Толщина покровного слоя составила 26,08±2,14 мкм. В субсиновиальном слое много клеточных элементов (главным образом фибробластов). Численная плотность микрососудов по сравнению с предыдущими возрастными периодами снижалась (р<0,05) до 335,05±28,88 в 1 мм2. По мере приближения к соединению с фиброзной капсулой субсиновиальный слой относительно предыдущих возрастных периодов более 217 насыщен коллагеновыми волокнами, которые имели равномерное параллельное расположение (Рисунок 181Б). А Б Рисунок 181 - Поперечный полутонкий срез синовиальной оболочки коленного сустава интактной собаки в возрасте 2 лет. Окраска метиленовым синимосновным фуксином. А - синовиоциты (Сц) покровного слоя (ПС) расположены 1-2 слоями. В субсиновиальном слое (СбС) преобладает межклеточное вещество, содержатся микрососуды (стрелки). Об. – 40; ок. – 12,5х. Б – коллагеновоэластический слой. Об. – 6,3; ок. – 12,5х. В возрасте 5 лет выявлен умеренный склероз синовиальной оболочки с атрофией покровного слоя. Наблюдали чередование участков синовиальной оболочки различного строения: одни - с резким преобладанием уплощённых и веретёновидных фибробластических синовиоцитов (Рисунок 182А), в этих участках толщина покровного слоя составила 22,17±1,12 мкм; другие – с выраженными деструктивными изменениями и дефектами покровного слоя (Рисунок 182Б), толщина которого 10,47±2,58 мкм; третьи – с утолщением и гиперплазией покровного слоя (Рисунок 182В). В участках гиперплазии повышено содержание макрофагальных синовиоцитов и клеток с повышенной пиноцитозной активностью, толщина покровного слоя увеличена (р<0,05) до 39,27±3,69 мкм. Клеточность субсиновиального слоя варьировала, в основном была представлена фибробластами/фиброцитами. 218 А Б В Рисунок 182 - Поперечный полутонкий срез синовиальной оболочки коленного сустава интактной собаки в возрасте 5 лет. Покровный слой. Окраска метиленовым синим-основным фуксином. Об. – 40; ок. – 12,5х (А, В). Об. – 100МИ; ок. – 12,5х (Б). Отмечены тучные клетки, которые локализованы в периваскулярном пространстве вен и находились в состоянии частичной дегрануляции (Рисунок 183А). Микрососудов много, в основном это расширенные капилляры и венулы. В артериолах и венах выражен отёк и фиброз субэндотелиального слоя (Рисунок 183Б). А Б Рисунок 183 - Сосуды субсиновиального слоя синовиальной оболочки коленного сустава интактной собаки в возрасте 5 лет. Полутонкий срез. Окраска метиленовым синим-основным фуксином. Об. –100МИ; ок. – 12,5х. А – тучная клетка (ТК) в состоянии частичной дегрануляции. Б – артериола, отек и фиброз субэндотелиального слоя. Численная плотность микрососудов по сравнению с предыдущими возрастными периодами увеличивалась (р>0,05) до 372,61±60,65 в 1 мм2 (Таблица 27). 219 Таблица 27 - Гистоморфометрические характеристики синовиальной оболочки интактных собак Параметры Толщина покровного слоя (мкм, М±σ) Количество рядов синовиальных клеток 6 месяцев 16,12±4,79 1-2 Численная плотность микрососудов (мм-2, М±σ) 369,71±35,13 10 месяцев 2 года 18,59±2,91 26,08±2,14 1-2 1-2 381,26±31,81 335,05±28,88 5 лет 10,47±2,58 39,27±3,69 1-4 372,61±60,65 Примечание: жирным шрифтом выделены достоверные отличия с предыдущим возрастным периодом при р<0,05. Выявлены нервы субсиновиального слоя с резко выраженным отёком эндоневрия (Рисунок 184) и деструкцией проводниковой части – эндоневральные трубки содержали лишь вакуолизированные шванновские клетки, формирующие ленты Бюнгнера и макрофаги. По мере приближения к соединению с фиброзной капсулой пучки коллагеновых волокон субсиновиального слоя дезорганизованы и фрагментированы. Рисунок 184 - Синовиальная оболочка коленного сустава интактной собаки в возрасте 5 лет. Нервы субсиновиального слоя с резко выраженным отёком эндоневрия и деструкцией проводниковой части. Полутонкий срез. Окраска метиленовым синим-основным фуксином. Об. –100МИ; ок. – 12,5х. Таким образом, в период интенсивного роста щенков в возрасте от 6 до 10 месяцев увеличивалась толщина покровного слоя синовиальной оболочки, преобладающей клеточной формой являлись фибробластические синовиоциты. К 2 годам покровный слой синовиальной оболочки представлен преимущественно 220 фибробластическими синовиоцитами, которые имели более вытянутую, веретенообразную форму (в возрасте 6, 10 мес. – синовиоциты округлой, овальной формы) и были расположены 1-2 рядами. С возрастом наиболее функционально важный участок синовиальной оболочки — покровный слой на большем протяжении истончается, лишается клеточных элементов, и практически атрофируется, отмечены участки гиперплазии, в которых повышено содержание макрофагальных синовиоцитов и клеток с повышенной пиноцитозной активностью. Наиболее выраженные изменения сосудов и особенно нервов субсиновиального слоя обнаружены в возрасте 5 лет. Расширение капилляров и венул, фиброз и отёк субэндотелиального слоя, выраженный в артериолах и венах, сопровождались увеличением численной плотности микрососудов по сравнению с другими возрастными периодами. В это же время в некоторых нервах субсиновиального слоя обнаруживались признаки нарушений циркуляции эндоневральной жидкости и практически полная деструкция нервных волокон. 6.2. Гистоморфометрическая характеристика синовиальной оболочки коленного сустава при экспериментальном моделировании остеоартроза. При моделировании остеоартроза на 28 сутки иммобилизации в синовиальной оболочке отмечена очаговая гиперплазия синовиальной оболочки (Рисунок 185А). Толщина покровного слоя в этих участках составляла 62,75±6,47 мкм. Утолщение покровного слоя происходило за счёт увеличения размеров клеток и количества слоёв (Таблица 28). Синовиоциты располагались в 2-4 слоя. Основная часть синовиоцитов имела характеристики клеток макрофагального типа. Клетки имели выросты, которые видны даже на световом уровне. Ядро располагалось эксцентрично, цитоплазма содержала зернистые включения (Рисунок 185Б). значительно вакуолизирована, 221 А Б Рисунок 185 - Выраженная гиперплазия синовиальной оболочки коленного сустава при моделировании остеоартроза. Полутонкий срез. Окраска метиленовым синим-основным фуксином. А - синовиоциты покровного слоя расположены 2-4 слоями. В субсиновиальном слое липоматоз. Об. – 16; ок. – 12,5х. Б – синовиоциты макрофагального типа. Об. – 100МИ; ок. – 12,5х. В собственном веществе покровного слоя пучки коллагеновых волокон фрагментированы. На большем протяжении в покровном слое синовиоциты были мелкими с пикнотичными ядрами, местами и вовсе отсутствовали (Рисунок 186А). В верхних слоях субсиновиального слоя выражен липоматоз (Рисунок 186А, Б), в глубоких слоях отмечены признаки отека - редкое расположение коллагеновых волокон (Рисунок 186А), их разволокнение, увеличение оптических пустот между волокнами. В части нервных фасцикул большинство миелиновых волокон в состоянии деструкции (Рисунок 186В). В нервах субсиновиального слоя выражен отёк эндоневрия и осевых цилиндров безмиелиновых волокон, многие миелинизированные волокна в состоянии аксональной атрофии или дегенерации. Численная плотность микрососудов по сравнению с контролем достоверно (р<0,05) снижена (Таблица 28). 222 А Б В Рисунок 186 - Поперечный полутонкий срез синовиальной оболочки коленного сустава при моделировании остеоартроза. Окраска метиленовым синим-основным фуксином. Об. – 6,3; ок. – 12,5х (А, Б). Об. – 100МИ; ок. – 12,5х (В). А – отсутствие синовиоцитов в покровном слое (стрелка), липоматоз верхних слоев субсиновиального слоя. Б – коллагеново-эластический слой. В – нервный фасцикул, основная часть миелиновых волокон в состоянии деструкции. Просветы большинства микрососудов сужены, стенки сосудов гипертрофированы (Рисунок 187). Около сосудов обнаруживалось умеренное количество тучных клеток. В крупных сосудах, в части наблюдений отмечен некроз гладкомышечных клеток, отек периваскулярных пространств. Рисунок 187 - Поперечный полутонкий срез синовиальной оболочки коленного сустава. Окраска метиленовым синим-основным фуксином. А - просветы микрососудов сужены, стенки гипертрофированы, ТК – тучная клетка. Об. – 100МИ; ок. – 12,5х. 223 Таблица 28 - Гистологические и морфометрические характеристики синовиальной оболочки интактных и экспериментальных собак Параметр Контроль Модель остеоартроза, 28 суток иммобилизации Толщина покровного слоя 26,08±2,14 62,75±6,47 (мкм, М±σ) Характеристика клеток Преобладают В очагах гиперплазии покровного слоя фибробластические преобладали синовиоциты макрофагальные синовиоциты Количество слоёв 1-2 2-4 синовиальных клеток Изменение Липоматоз субсиновиального слоя Численная плотность 335,05±28,88 150,19±18,26 микрососудов (мм-2,М±σ) Преобладающие изменения Аксональная атрофия нервных волокон в нервах или дегенерация субсиновиального слоя Примечание: Жирным шрифтом выделены достоверные отличия с контролем при р 0,05. С увеличением периода иммобилизации (40 суток) прогрессировали признаки воспаления синовиальной оболочки: диффузная плазмоцитарнолимфоцитарной инфильтрация (Рисунок 188). Результаты оценки выраженности синовита при моделировании остеоартроза приведены в таблице 29. Рисунок 188 - Поперечный полутонкий срез синовиальной оболочки коленного сустава. Окраска метиленовым синим-основным фуксином. Диффузная плазмоцитарно-лимфоцитарная инфильтрация. Об. – 40; ок. – 12,5х. 224 Таблица 29 - Оценка выраженности синовита по V.Krenn et al. (2006) Оценка Утолщение покровного слоя Клеточность субсиновиального слоя Выраженность плазмоцитарнолимфоцитарной инфильтрации Сумма баллов Модель остеоартроза 28 суток 40 суток иммобилизации иммобилизации 1-2 2-3 2 2 3 3 6-7 7-8 В отдаленные сроки эксперимента через 1 и 3 года после моделирования остеоартроза (период иммобилизации 28 суток) в синовиальной оболочке отчетливо выявлялись признаки липоматоза и фиброза (Рисунок 189), истончение покровного слоя – 12,56±2,64 мкм и 10,24±1,71 мкм соответственно. В покровном слое синовиоциты очень мелкие, с пикнотичными ядрами, местами и вовсе отсутствовали. А Б Рисунок 189 - Поперечный полутонкий срез синовиальной оболочки коленного сустава после моделирования остеоартроза. Окраска метиленовым синимосновным фуксином. А – гибель синовиоцитов покровного слоя, фиброз верхних слоев субсиновиального слоя. Срок эксперимента 1 год после моделирования остеоартроза. Об. – 40; ок. – 12,5х. Б – гибель синовиоцитов покровного слоя, липоматоз верхних слоев субсиновиального слоя. Срок эксперимента 3 года после моделирования остеоартроза. Об. – 16; ок. – 12,5х. 225 Относительно моделирования остеоартроза (период иммобилизации 28 суток) выявлено достоверное увеличение (р<0,05) численной плотности микрососудов до 239,95±21,66 в 1 мм2 через 1 год после МОА и до 337,94±51,5 в 1 мм2 через 3 года после МОА. По сравнению с интактной нормой через 1 год после МОА сохранялись достоверно (р<0,05) сниженные значения, через 3 года после МОА различия с контролем не достоверны (р>0,05). Происходило склерозирование артерий малого калибра и артериол. В артериях с гиперплазией мышечных элементов значительная часть миоцитов находилась в состоянии вакуольной дегенерации (Рисунок 190А), миоинтимальные утолщения деформировали просвет. В венах наряду с вакуольной дегенерацией миоцитов выявлялся фиброз субэндотелиального слоя (Рисунок 190Б). А Б Рисунок 190 - Сосуды субсиновиального слоя. 1 год после моделирования остеоартроза. А – артерия, ГМК в состоянии вакуольной дегенерации, Б – вена, фиброз субэндотелиального слоя. Полутонкий срез, окраска метиленовым синимосновным фуксином. Об. – 100; ок. – 12,5х. Гиперплазия медии артериол в одних случаях сочеталась с гиперплазией адвентиции - увеличением количества фибробластов/фиброцитов, формирующих несколько концентрически расположенных клеточных слоёв вокруг сосуда (Рисунок 191А). В других сосудах с гипертрофированной мышечной оболочкой был выражен фиброз адвентиции и периваскулярных тканей (Рисунок 191Б). 226 А Б Рисунок 191 - Гипертрофия медии и адвентиции артериол субсиновиального слоя. 3 года после моделирования остеоартроза. Полутонкий срез, окраска метиленовым синим-основным фуксином. Об. – 100; ок. – 12,5х. А - формирование концентрических слоёв фибробластов адвентиции; Б – фиброз адвентиции и периваскулярных тканей. В нервах субсиновиального слоя через 1 год после операции обнаруживали выраженный отёк эндоневрия (Рисунок 192), увеличенное повышение количества макрофагов в эндоневрии и немногочисленные безмиелиновые и гипомиелинизированные нервные волокна с отёчными аксонами, а также денервированные бюнгнеровы ленты. Рисунок 192 - Нервы субсиновиального слоя. 1 год после моделирования остеоартроза. Полутонкий срез, окраска метиленовым синим-основным фуксином. Об. – 100МИ; ок. – 12,5х. Через 3 года после операции большинство нервов субсиновиального слоя содержали буквально единичные безмиелиновые и миелинизированные волокна с 227 гипертрофированными шванновскими оболочками, что наряду с липидными вакуолями в периневральных клетках свидетельствовало о прогрессировании нейродеструктивных изменений (Рисунок 193). Рисунок 193 - Нервы субсиновиального слоя. 3 года после моделирования остеоартроза. Полутонкий срез, окраска метиленовым синим-основным фуксином. Об. – 100; ок. – 12,5х. 6.3. Гистоморфометрические изменения синовиальной оболочки коленного сустава при удлинении голени. При удлинении конечности к концу периода дистракциии (при метадиафизарном удлинении в режиме 1 мм за 4 приема в 1 серии, период дистракции составил 28 суток, при диафизарном удлинении в режиме 3 мм за 120 приемов во 2 серии, период дистракции - 10 суток) в обеих сериях признаков воспаления в синовиальной оболочке не обнаружено. Отмечали утолщение покровного слоя (Таблица 30) в 1 серии до 44,81±10,36 мкм (р 0,05), во 2 серии – 50,06±5,89 мкм (р 0,05). В 1 серии основная часть синовиальных клеток с признаками деструкции, клетки уменьшены в размерах, имели аномальную форму (Рисунок 194А). Во 2 серии отмечали гипертрофию синовиоцитов, клетки имели светлые гомогенные ядра, базофильную цитоплазму, в наружном слое синовиоциты имели признаки клеток макрофагального типа – цитоплазма вакуолизирована, содержала зернистые включения (Рисунок 194Б). 228 А Б Рисунок 194 - Конец периода дистракции. Поперечный полутонкий срез синовиальной оболочки коленного сустава конец периода дистракции. Утолщение покровного слоя за счет пролиферации синовиоцитов. Окраска метиленовым синим-основным фуксином. Об. – 40; ок. – 12,5х. А – 1 мм за 4 приема. Б – 3 мм за 120 приемов. Численная плотность микрососудов незначительно превышала норму: 381,26±17,33 в 1 мм2 в 1 серии и 369,7±46,21 в 1 мм2 во 2 серии, различия с контролем недостоверны (р>0,05). В субсиновиальном слое выявлены явления липоматоза. В 1 серии в крупных сосудах внутрисосудистое пространство заполнено светлой плазмой зернистой структуры и эритроцитами, стенки сосудов утолщены (Рисунок 195А), в части наблюдений отмечен некроз гладкомышечных клеток (Рисунок 195Б). В артериях малого калибра преобладала продольная ориентация ГМК. Интима некоторых артерий отличалась неоднородностью клеточного состава: создавалось впечатление, что не только субэндотелиальный слой, но и люминальная выстилка содержала модифицированные ГМК - миоинтимальные клетки (Рисунок 196А). В нашем материале в артериях, венах и многих сосудах микроциркуляторного русла нередки явления вакуольной дегенерации и некротической гибели некоторых эндотелиоцитов и ГМК. Иногда встречались профили сосудов с выраженной дезинтеграцией слоёв сосудистой стенки и облитерацией просвета (Рисунок 196Б). 229 А Б Рисунок 195 - 1 серия (1 мм за 4 приема). Конец периода дистракции. Полутонкий срез, окраска толуидиновым синим (А), метиленовым синимосновным фуксином (Б). Об. – 100; ок. – 12,5х. А – стенка сосуда утолщена, за счет гипертрофии гладкомышечных клеток (ГМК), Б – некроз ГМК (стрелки). А Б Рисунок 196 - Изменения артерий малого калибра в субсиновиальном слое. 28 суток дистракции. 1 мм за 4 приема. Окраска метиленовым синим-основным фуксином. А – признаки замещения эндотелиоцитов миоинтимальными клетками: 1 – гладкомышечные клетки, мигрировашие в субэндотелиальный слой и отслаивающие эндотелий; 2 – миоинтимальные клетки в позиции эндотелиоцитов. Об. – 40; ок. – 12,5х. Б– вакуольная дегенерация и гибель эндотелиальных и гладкомышечных сосудистых клеток, дезинтеграции интимы и медии, облитерация просвета артерии. Об. – 100МИ; ок. – 12,5х. В нервных фасцикулах около 50% миелиновых волокон деструктивно изменены (Рисунок 197), однако наряду с явлениями дегенерации в некоторых 230 эндоневральных трубках наряду с продуктами распада видны регенерирующие аксональные отпрыски. Рисунок 197 - Конец периода дистракции. 1 серия (1 мм за 4 приема). Нервный фасцикул, часть миелиновых волокон в состоянии деструкции. Полутонкий срез, окраска толуидиновым синим. Об. – 100; ок. – 12,5х Во 2 серии просветы большинства микрососудов закрыты ядром эндотелиальных клеток, развернутым во внутрисосудистое пространство, выявлено увеличение размеров периваскулярных пространств (Рисунок 198А). В субсиновиальном слое, как и в 1 серии отмечено утолщение стенок сосудов, в наружной оболочке концентрическими субсиновиального сосудистой слоями слоя стенки (Рисунок отмечено фибробласты 198Б), сужение в более просвета, расположены глубоких вплоть до слоях полной облитерации (Рисунок 198Б, В). В нервных фасцикулах выражено гофрирование периневрия, субпериневральный отёк, отмечены деструктивно измененные миелиновые волокна и большое количество макрофагов в субпериневральном пространстве (Рисунок 198Г). 231 А Б В Г Рисунок 198 - Конец периода дистракции. 2 серия (3 мм за 120 приемов). Поперечный полутонкий срез синовиальной оболочки коленного сустава. Об. – 40; ок. – 12,5х (А, Б, В). Об. – 100МИ; ок. – 12,5х (Г). Окраска толуидиновым синим (А), метиленовым синим-основным фуксином (Б, В, Г). А просветы микрососудов закрыты ядром эндотелиальных клеток (стрелки), Б, В облитерации просвета сосудов субсиновиального слоя, Г – нервы субсиновиального слоя. Через месяц после снятия аппарата в 1 серии основная часть синовиальных клеток находилась в состоянии деструкции, отмечено наличие клеточного детрита, относительно предыдущего срока эксперимента увеличено количество микрососудов (Рисунок 199А). Толщина покровного слоя снижалась относительно предыдущего срока до 28,17±2,31 мкм. Численная плотность микрососудов достоверно превышала контроль – 439,03±37,88 в 1 мм2. В субсиновиальном слое стенки сосудов утолщены, просветы сужены (Рисунок 199Б), отмечены тучные клетки (рис.199В). В одном наблюдении выявлены признаки воспаления - лимфоциты, определялось повышенное содержание плазматических клеток (Рисунок 199Г). 232 А Б В Г Рисунок 199 - 30 суток после снятия аппарата. 1 серия (1 мм за 4 приема). Полутонкий срез синовиальной оболочки коленного сустава. Окраска метиленовым синим-основным фуксином (А, Г), толуидиновым синим (Б, В). Об. – 16; ок. – 12,5х (А). Об. – 100МИ; ок. – 12,5х (Б, В, Г). А – покровный и субсиновиальной слой синовиальной оболочки, увеличение количества микрососудов. Б – сосуд субсиновиального слоя, плазматическая клетка (ПК), В тучная клетка. Г – плазматические клетки. Пучки коллагеновых волокон дезорганизованы и фрагментированы. Повышалась частота встречаемости профилей капилляров с ядросодержащими участками перицитов и увеличивалось количество клеток вокруг сосудов микроциркуляторного русла (Рисунок 200). Среди них на светооптическом уровне можно различить фибробласты, макрофаги, но создаётся впечатление о преобладании перицитов, которые, как известно, могут покидать свои типичные для зрелых капилляров и других сосудов микроциркуляторного русла позиции, мигрировать и пролиферировать, что отражает их участие в процессах ангиогенеза и воспаления. 233 Рисунок 200 - 30 суток без аппарата. 1 серия (1 мм за 4 приема). Сосуды микроциркуляторного русла в субсиновиальном слое. Окраска метиленовым синим-основным фуксином. Об. – 40; ок. – 12,5х. 1 – срез капилляра с ядросодержащим участком перицита; 2 – фибробласты, 3 – макрофаги, 4 – перициты и перицитоподобные клетки. В нервах субсиновиального слоя определяли эндоневральный отёк либо локусы субпериневрального отёка, увеличение количества макрофагов в субпериневральном пространстве и в эндоневрии, явления дегенерации- регенерации нервных волокон. Во 2 серии в покровном слое отмечали гипертрофию синовиоцитов (Рисунок 201А). Толщина покровного слоя превышала контроль, но достоверно (р 0,05) снижена относительно предыдущего срока эксперимента (Таблица 30). Таблица 30 - Гистологические и морфометрические характеристики синовиальной оболочки интактных и экспериментальных собак Параметр Толщина покровного слоя (мкм) Количество рядов синовиальных клеток Численная плотность микрососудов (мм-2) Интактные 1 мм за 4 приема 3 мм за 120 приемов 28 суток дистракции 30 суток без аппарата 10 суток дистракции 30 суток без аппарата 26,08 ±2,14 1-2 44,81 ±10,63 2-4 28,17 ±2,31 1-2 50,06 ±5,89 2-4 36,45 ±7,82 2-3 335,05 ±28,88 381,26 ±17,33 439,03 ±37,88 369,7 ±46,21 300,39 ±43,99 Примечание: жирным шрифтом выделены достоверные отличия с контролем при р 0,05. 234 В верхних отделах субсиновиального слоя отмечены признаки фиброза, уплотнение межклеточного вещества, глубже выявлены очаги деструкции коллагеновых волокон (Рисунок 201Б), тучные клетки (Рисунок 201В), наблюдалось увеличение доли жировой ткани. Численная плотность микрососудов незначительно снижалась относительно предыдущего этапа эксперимента – 300,39±43,99 в 1 мм2, различия с контролем недостоверны. Стенки крупных сосудов утолщены, отмечен некроз гладкомышечных клеток, ядра эндотелиальных клеток набухшие, перекрывающие внутрисосудистое пространство (Рисунок 201Г). А Б В Г Рисунок 201 - 2 серия (3 мм за 120 приемов). 30 суток после снятия аппарата. Поперечный полутонкий срез синовиальной оболочки коленного сустава. Окраска метиленовым синим-основным фуксином. Об. – 40; ок. – 12,5х (А, Б). Об. – 100МИ; ок. – 12,5х (В, Г). А – формирование синовиальных ворсин. Б – деструкция коллагеновых волокон субсиновиального слоя. В – тучная клетка, Г – сосуд субсиновиального слоя. 235 По сравнению с предыдущим сроком в нервах субсиновиального слоя сохранялись признаки циркуляторных расстройств и углублялись реактивнодеструктивные изменения нервных волокон: безмиелиновые волокна не выявлялись, большинство миелинизированных волокон с признаками аксомиелиновой дегенерации. Результаты оценки выраженности синовита по V.Krenn et al., 2006 в сериях 1 и 2 приведены в таблице 31. Таблица 31 - Оценка выраженности синовита по V.Krenn et al. (2006) Критерии 1 мм за 4 приема Конец После дистракции снятия аппарата 1 0-1 Утолщение покровного слоя 3 мм за 120 приемов Конец После дистракции снятия аппарата 1-2 1 Клеточность субсиновиального слоя 1 2 1 1 Выраженность плазмоцитарнолимфоцитарной инфильтрации Сумма баллов 0 2 1 0 2 4-5 4 2 Резюме главы. В период интенсивного роста щенков (от 6 до 10 месяцев) увеличивалась толщина покровного слоя синовиальной оболочки, преобладающей клеточной формой являлись фибробластические синовиоциты. К 2 годам покровный слой синовиальной оболочки представлен преимущественно фибробластическими синовиоцитами. С возрастом наиболее функционально важный участок синовиальной оболочки — покровный слой на большем протяжении истончается, лишается клеточных элементов, и практически атрофируется, отмечены участки гиперплазии, в которых повышено содержание макрофагальных синовиоцитов и клеток с повышенной пиноцитозной активностью. Наиболее выраженные изменения сосудов и особенно нервов субсиновиального слоя обнаружены в возрасте 5 лет. Расширение капилляров и венул, фиброз и отёк субэндотелиального слоя, выраженный в артериолах и 236 венах, сопровождались увеличением численной плотности микрососудов по сравнению с другими возрастными периодами. В это же время в некоторых нервах субсиновиального слоя обнаруживались признаки нарушений циркуляции эндоневральной жидкости и практически полная деструкция нервных волокон. При моделировании остеоартроза 1-2 степени в синовиальной оболочке коленного сустава выявлен более выраженный по сравнению с экспериментом по удлинению конечности процесс структурно-функциональной реорганизации, проявляющийся в дезорганизации волокнистых элементов оболочки, липоматозе, деструкцией покровных синовиоцитов. Выявлено усиление пролиферативной и макрофагальной функции синовиоцитов. Очаговые воспалительные изменения отмечены при увеличении периода иммобилизации до 40 суток. Наиболее выраженные изменения сосудов и особенно нервов субсиновиального слоя обнаружены Большинство в отдаленные нервов сроки после субсиновиального моделирования слоя остеоартроза. содержало единичные безмиелиновые и миелинизированные волокна, что свидетельствовало об усилении нейродеструктивных изменений. Состояние синовиальной оболочки коленного сустава при удлинении голени существенно зависит от методики удлинения. При остеотомии на уровне метадиафиза и ручной дистракции в режиме 1 мм в день за 4 приёма, развивается выраженный синовит, гиперваскуляризация, реактивно-деструктивные изменения нервных волокон в нервах субсиновиального слоя с тенденцией к регенерации. Деструкция синовиоцитов покровного слоя интенсивнее выражена при ручном режиме дистракции с темпом 1 мм за 4 приема, как и при моделировании остеоартроза. При остеоклазии на уровне середины диафиза и применении автодистракции с повышенным суточным темпом (3 мм за 120 приёмов) выявлен синовит умеренной и слабой степени выраженности на фоне прогрессирующих деструктивных изменений сосудов и нервов синовиальной оболочки. 237 Глава 7. Сопоставительный анализ морфофункционального состояния суставного хряща при возрастных изменениях, при ортопедическом удлинении голени и моделировании остеоартроза с редуцированным кровоснабжением (обсуждение результатов собственных исследований и заключение) Увеличение доли лиц пожилого возраста среди населения большинства развитых и развивающихся стран, распространённость дегенеративно- дистрофических заболеваний суставов и нерешённые задачи функциональной реабилитации ортопедо-травматологических больных, перенесших операции по удлинению конечности, определили актуальность, цель и задачи проведённого исследования. В последние десятилетия изучение суставного хряща животных и человека при физиологических возрастных изменениях и патологических состояниях проводятся с помощью новых биомеханических методов [164], магнитнорезонансной томографии [184, 206, 207], конфокальной лазерной микроскопии в сочетании со стереологическим анализом [208, 249]. Несмотря на выявленные этими методами отличия количественных параметров структурной организации суставного хряща человека от разных видов животных, используемых в ортопедических исследованиях [208], биомоделирование повреждений и заболеваний суставного хряща остаётся актуальным. В процессе экспериментальных исследований суставного хряща животных мы разработали адаптированную к объекту методологию его количественного исследования, включающую единую технологию изготовления микропрепаратов. Известно, что наиболее часто применяемые в гистологических исследованиях целлоидиновые и парафиновые срезы имеют толщину более 5 мкм, которая не позволяет четко дифференцировать границы хондроцитов и определять цитологические параметры без поправки на эффект Холмса [153, 163]. 238 Оптимальными для определения морфометрических и стереометрических параметров структур суставного хряща (диаметр хондроцитов 10–20 мкм), являются полутонкие срезы толщиной 0,5–1 мкм; однако их малая – до 1 мм2 – стандартная изображений площадь для затрудняет получение стереологических репрезентативных исследований. выборок Разработанная нами технология изготовление полутонких срезов недекальцинированного суставного хряща с подлежащей субхондральной костью увеличенной площади существенно повышает разрешение препаратов, позволяет проводить исследования на органном, тканевом и клеточном уровнях структурной организации, формировать репрезентативную выборку для количественного исследования, получать достоверные количественные характеристики объекта, пренебрегая эффектом Холмса. После изготовления срезов эпоксидные блоки можно изучать в сканирующем электронном микроскопе и использовать без дополнительной шлифовки для проведения микроанализа суставного хряща и субхондральной кости. Для количественной оценки состояния суставного хряща на органном, тканевом и клеточном уровнях по полутонким срезам увеличенной площади нами разработан алгоритм определения комплекса параметров в главе 2, раздел 2.2.4.. Примененная трехуровневая система архивирования информации обеспечила условия для текущего и ретроспективного анализа данных, корректировки и контроля результатов. Разработанная методология позволила дополнить и уточнить сведения о нормальном и патологически изменённом суставном хряще экспериментальных животных (собак) в различные периоды постнатальной жизни по сравнению немногочисленными описательными данными, известными из литературы [277]. В главе 3 приведены результаты исследования возрастных изменений суставного хряща от 2 месяцев до 8 лет постнатальной жизни собак. В процессе роста организма суставной хрящ претерпевал значительные морфологические преобразования. Полученные данные согласуются с литературными [92], в раннем постнатальном периоде онтогенеза популяция клеток суставного хряща 239 неоднородна: в его составе присутствуют малодифференцированные, высокодифференцированные и деградирующие хондроциты. С ростом организма соотношение клеток менялось – возрастало количество высокодифференцированных форм. В возрасте 5-ти и 8-ми лет большая часть клеток находилась в неактивном состоянии либо в фазе дегенерации. Результаты гистоморфометрического исследования показали, что основные количественные изменения хондроцитов по мере удаления от суставной поверхности заключались в увеличении размеров клеток и их ядер. Такая своеобразная перестройка морфологии хондроцитов отражает последовательный путь их созревания и дифференцировки [22, 81, 92, 195, 230]. В суставном хряще исследованных животных во всех возрастных периодах наблюдали признаки репродукции и отмирания клеток. С ростом организма морфометрические показатели суставного хряща характеризовались тем, что увеличивалось количество основного вещества, при этом количество клеток и изогенных групп уменьшалось, снижалась способность клеток к пролиферации, сохранялась способность к синтезу компонентов межклеточного вещества. Особенностью суставного хряща мыщелков бедра собак являлось преобладание матрикса над клетками, доля клеточного компонента в исследуемом объекте в разные возрастные периоды составляла от 11,2 до 4,68% от общего объема. В 2 месяца постнатальной жизни у щенков отсутствовала цитоархитектоника, характерная для зрелого суставного хряща. Матрикс средней части хряща и более глубоких слоев содержал сосуды. Зональное строение суставного хряща прослеживалось только с 4-х месячного возраста. По мнению H. Brommer et al. (2005), хрящ новорожденного «биомеханически белый» и потому гистологически гомогенный, но функциональная адаптация к механическим нагрузкам имеет место уже в ранней постнатальной жизни и результатом является всё более отчётливая гетерогенность морфо-функциональных характеристик [164]. 240 После четырех месяцев у щенка начинается новый период онтогенеза – ювенильный, или как его иначе называют, подростковый или предадультный, т.е. предшествующий взрослению. В этот период наблюдается интенсивный рост щенка, с 4-х до 10 месяцев происходит особенно бурный рост трубчатых костей, (щенок растет в высоту) [114]. В возрасте 6 и 10 месяцев в суставном хряще выявлено увеличение количества пустых лакун относительно предыдущих возрастных периодов. В возрасте 10 месяцев отмечено нарушение гомогенности межклеточного вещества поверхностной зоны, снижалась объемная плотность хондроцитов. К 1,5-2 годам гомогенность межклеточного вещества поверхностной зоны восстанавливалась, снижалось количество пустых лакун, увеличивалась объемная плотность хондроцитов. Аналогичные изменения были выявлены при исследовании суставного хряща коленного сустава человека в подростковом возрасте [10]. К инволютивным изменениям можно отнести нарушение гомогенности межклеточного вещества поверхностной зоны, изменение окраски межклеточного вещества (снижение интенсивности, очаговое окрашивание), отсутствие колончатого расположения клеток в глубокой зоне, нарушения базофильной линии (размытые контуры, фрагментация) и проникновение сосудов со стороны субхондральной зоны. Морфологическая организация хрящевой ткани суставов в возрасте 5-ти и 8-ми лет свидетельствовала о наличии деструктивнодегенеративных процессов выраженных во всех зонах хряща, но интенсивнее в глубоких слоях (глубокая зона, зона кальцифицированного хряща) и субхондральной кости. Выраженные признаки инволютивных преобразований, выявленные в 5 лет постнатальной жизни собак, включали минимальные по сравнению с другими возрастными периодами показатели содержания серы, численной и объёмной плотности хондроцитов, но максимальную площадь хондроцитов поверхностной зоны хряща. По сравнению с двухлетним возрастом в этот период значительно увеличены доля пустых лакун и доля изогенных групп, содержание кальция. 241 По данным Ш.М. Ахмедова с соавт. (2002), выявленные скачкообразные изменения морфометрических параметров суставного хряща человека в пожилом и старческом возрасте не свидетельствуют о функциональной активности, а являются показателем деструктивных изменений, что по видимому, не обеспечивает адаптации хряща к факторам нагрузки [11]. В возрасте 8 лет площадь хондроцитов промежуточной зоны достигала максимума, и по сравнению с двухлетним возрастом на 13,5% было увеличено содержание серы, но и содержание кальция увеличивалось. Возможно, в период от 5 до 8 лет в хряще развиваются компенсаторно-приспособительные изменения, препятствующие дальнейшему старению, зарегистрировано повышение значений доли изогенных групп в общем объеме выборки. В главе 6 показано, что с возрастом наиболее функционально важный участок синовиальной оболочки — покровный слой на большем протяжении истончался, лишался клеточных элементов, и практически атрофировался, отмечены участки макрофагальных гиперплазии, синовиоцитов и в которых клеток с повышено повышенной содержание пиноцитозной активностью. Наиболее выраженные изменения сосудов и особенно нервов субсиновиального слоя обнаружены в возрасте 5 лет. Расширение капилляров и венул, фиброз и отёк субэндотелиального слоя, выраженный в артериолах и венах, сопровождались увеличением численной плотности микрососудов по сравнению с другими возрастными периодами. В это же время в некоторых нервах субсиновиального слоя обнаружены признаки нарушений циркуляции эндоневральной жидкости и практически полная деструкция нервных волокон. Несмотря на значительные успехи в распознавании патогенеза дегенеративно-дистрофических процессов в суставе, нет единого мнения о пусковых механизмах и степени структурных перестроек его компонентов при инволютивных изменениях [45, 231]. 242 В главе 4 представлены результаты гистологического исследования суставного хряща и субхондральной кости при моделировании остеоартроза с редуцированным кровоснабжением. Биологические модели остеоартроза, известные по результатам многочисленных экспериментальных исследований на грызунах, собаках, кошках, обезьянах включают модификации, спонтанные возрастные интраартикулярные изменения, инъекции, генетические иммобилизацию, дестабилизирующие операции, избыточные нагрузки и скарификацию хряща, моделирование ожирения и нарушений эндокринного статуса - овариоэкттомия [197, 217]. С учётом имеющихся в литературе сведений о роли сосудистой патологии в инициации и прогрессировании остеоартроза [188, 192] нами использована модель, сочетающая два патогенетических фактора - иммобилизацию сустава и редуцированное кровоснабжение конечности. В условиях этого опыта обнаруживались дефекты суставной поверхности с потерей матрикса и очагами разволокнения, которые в отдельных наблюдениях углублялись до промежуточной зоны. Гомогенность межклеточного вещества поверхностной зоны была нарушена, а интенсивность реакции на сульфатированные гликозаминогликаны существенно снижена. Наряду с этим выявлено неравномерное окрашивание базофильной линии, её фрагментация, нарушение целостности, проникновение костномозгового паннуса. По сравнению с интактными 8-летними животными у животных в возрасте 1,5-2 лет с моделированием остеоартроза выявлено существенное снижение толщины хряща (на 37,7%), значительно увеличивалась доля пустых лакун и снижалась доля изогенных групп. При этом хондроциты уменьшены в размерах, и повышена клеточная плотность в поверхностной зоне. Известно, что при иммобилизации сустава происходит нарушение диффузионно-нагрузочного механизма снабжения его трофическими и пластическими веществами, нарушение микроциркуляции всех тканей сустава [124]. Кроме того, в условиях эксперимента было предусмотрено создание 243 гипоксии и ухудшение трофики субхондральной кости (пересечение бедренной артерии). Необходимо отметить, что в данных условиях эксперимента наиболее уязвимым оказались хондроциты промежуточной зоны, которые равноудалены от васкулярного и синовиального факторов питания (около 50% клеток в состоянии деструкции). Известно, что физиологическое самовосстановление структуры суставного хряща осуществляется механизмами интерстициального роста благодаря постоянно поддерживающейся репродукции хондроцитов в промежуточной зоне [81]. Выявленная последовательность событий свидетельствует о том, что в прогрессировании остеоартроза ведущая роль принадлежит нарушениям функции хондроцитов и последующей их гибели. По мнению P. Mainil-Varlet et al. (2003), «раньше остеоартроз рассматривался как болезнь «изнашивания и стирания» - то есть, деградация суставного хряща происходит независимо от биологического ответа. Однако, как и в других тканях, реакция суставного хряща на повреждение представляет собой определённую последовательность событий: повышение содержания воды, деградация матрикса эндогенными энзимами, клеточный апоптоз и некроз, разрушение внеклеточного матрикса и выход его составляющих в полость сустава, запускающий воспалительный ответ синовиальной оболочки [220]. Механизмы клеточной гибели хондроцитов являются предметом дискуссий вплоть до настоящего времени. В исследованиях Almonte-Becerril M. с соавт. (2010), на экспериментальной модели остеоартроза, включающей удаление мениска, показана модификация процесса гибели хондроцитов в разных зонах хряща. На ранней стадии остеоартроза гибель хондроцитов начиналась с апоптоза в поверхностной и части промежуточной зоны хряща. С течением дегенеративного процесса в хондроцитах тех же зон суставного хряща была обнаружена высокая частота активации каспазы-3 и LC3II-экспрессия, что указывало на комбинацию двух процессов гибели клеток – апоптоза и аутофагии. В глубокой зоне хряща, на фоне 244 аномальной оссификации субхондральной кости, имеющей место при остеоартрозе, наблюдался только апоптоз [155]. В исследованиях Н.В. Дедух, Л.М. Бенгус с соавт. (2011) при изучении ультраструктурной организации суставного хряща у животных с экспериментальным глюкокортикоид-индуцированным остеоартрозом авторы наблюдали активизацию апоптоза хондроцитов. В таких хондроцитах выявлялась значительная гетерохроматизация и нередко фрагментация клеточного ядра. При этом в цитоплазме хондроцитов обнаруживалось обилие вакуолей [43, 44]. Аналогичные изменения части хондроцитов поверхностной и промежуточной зон отмечены и в нашем исследовании. При этом создавалось впечатление, что гибель клеток происходила преимущественно по типу некроза, хотя это абсолютно противоречит аваскулярной природе хряща. H.I. Roach, T. Aigner, J.B. Kouri (2004) для обозначения смерти хондроцитов предложили термин «хондроптоз», отражая отличия от типичной программируемой гибели. Хондроптоз включает начальную стадию гипертрофии эндоплазматического ретикулума и аппарата Гольджи и повышения синтеза протеинов. Мембраны цитоплазму на эндоплазматического компартменты, в которых ретикулума сегментируют цитоплазма и органеллы перевариваются. В дополнение к этому деструкция осуществляется внутри аутофагических вакуолей, а остатки клеток вспениваются в лакунах. В совокупности эти процессы ведут к полной аутодеструкции и появлению пустых лакун. Авторы предполагают, что путь через гипертрофию эндоплазматического ретикулума играет более существенную роль в хондроптозе, чем рецепторные и митохондриальные пути и так же важен, как активация каспаз. Поскольку хондроптоз не зависит от фагоцитоза, он является преобладающим механизмом гибели хондроцитов, изолированных в лакунах [251]. По мнению Grogan S.P. & D’Lima D.D. (2010), существуют три механизма гибели хондроцитов (апоптоз, аутофагия, некроз), которые имеют скорее перекрывающие друг друга, чем морфологически различные черты [198]. 245 Восстановление включает ограниченную активацию репликации клеток, повышение синтеза внеклеточного матрикса и реорганизацию матрикса эндогенными клетками. Несмотря на то, что некоторые хондроциты при развитии остеоартроза продолжают пролиферировать, их способность к миграции в участки тканевых дефектов подвергается сомнению [236]. В главе 6 представлены результаты исследования синовиальной оболочки при моделировании остеоартроза. Установлено, что перевязка бедренной артерии и иммобилизация коленного сустава в изученной нами экспериментальной модели приводят к гиповаскуляризации и частичной потере иннервации субсиновиального слоя; изменения синовиальной оболочки свидетельствовали о синовите значительной степени выраженности. Известно, что симптоматика остеоартроза у людей в значительной степени определяется неинфекционным воспалением, проявляющимся инфильтрацией синовиальной оболочки и синовиальной жидкости [244]. Оценка выраженности синовита по шкале V. Krenn et al. (2006), свидетельствовала о выраженном и медленно прогрессирующем синовите в период от 28 до 40 суток иммобилизации (от 6-7 до 7-8 баллов). По данным E.X. Cao et al. (2012), использовавших такую же оценочную шкалу на другой экспериментальной модели (удаление мениска у кролика), синовит был максимально выражен через 4 недели (5 баллов), но к 8 неделям оценка снизилась вдвое [173]. В мыщелках бедренной кости (глава 4) отмечен остеопороз, очаговый остеосклероз субхондральной зоны, нарушение микроциркуляции - агрегация эритроцитов и «предтромбоз» кровеносных сосудов микроциркуляторного русла. Таким образом, вследствие нарушения кровообращения и ограничения функции в суставном хряще развивается трофическая недостаточность, обусловленная с одной стороны - патологическими изменениями субхондральных отделов, осуществляющих питание глубоких слоев хряща, с другой изменениями синовиальной оболочки, питающей его поверхностные слои. Наблюдаемые изменения являлись следствием нарушения обменных процессов 246 (ремоделирования) суставного хряща, синовиальной оболочки и субхондральной кости, свидетельствующих о снижении синтеза и преобладании катаболических процессов. Выявленные морфологические изменения соответствовали ранним стадиям остеоартроза - степень 1-3 (по гистологической классификации Международного общества изучения остеоартроза OARSI, 2006) [248]. Полученные результаты оценки морфофункционального состояния суставного хряща, синовиальной оболочки и субхондральной кости показали, что разработанная экспериментальная модель позволяет получить гонартроз, патогенетически основное место в развитии которого, занимает фактор изменений режима функциональных нагрузок и кровоснабжения сустава, определяющие диффузное питание хряща. Для изучения собственных регенераторных возможностей хряща были проведены исследования через 14, 28, 90 суток, 1 год и 3 года после моделирования остеоартроза (МОА). Через 14 суток после МОА репаративная регенерация хряща выражалась увеличением количества клеток, объемной плотности хондроцитов и количества изогенных групп с функционально активными клетками, незначительным увеличением содержания серы относительно МОА. Через 28 и 90 суток после моделирования остеоартроза в промежуточной зоне выявлены бесклеточные поля, в глубокой зоне отсутствовало колончатое расположение клеток, снижалось содержание серы. В отдаленные сроки эксперимента у собак в возрасте 3-х, 5-ти лет через 1 и 3 года после моделирования остеоартроза деструктивные изменения прогрессировали, подавлена пролиферация хондроцитов, отмечено нарушение цитоархитектоники, демаскировка коллагеновых волокон во всех зонах, нарушение целостности базофильной линии, проникновение сосудов в хрящ. Если суставном хряще интактых животных в возрасте 5-ти, 8-ми лет развивались компенсаторноприспособительные изменения, препятствующие дальнейшему старению, то после моделирования остеоартроза у собак в возрасте 3-х, 5-ти лет влияние дополнительных факторов (иммобилизация сустава и редуцированное 247 кровоснабжение конечности) привело к ускоренной дегенерации хряща, опережающей инволютивные изменения. В главе 5 представлены результаты исследования структурной реорганизации суставного хряща при удлинении конечности. Данные литературы свидетельствуют, что экспериментальные исследования влияния удлинения на суставной хрящ единичны. D.F. Stanitski et al. (1996) выявили выраженное разволокнение хряща и снижение интенсивности окраски на протеогликаны в коленном суставе у собак при 30%-ном удлинении бедра [258]. При иммобилизации и разгибании коленного сустава аппаратом эти изменения удавалось разрешить, что привело авторов к выводу о необходимость предотвращения компрессии суставов во время удлинения. B. Fink et al. (2001) не выявили влияния 30%-ного удлинения голени на состояние хряща и менисков коленного сустава при темпе дистракции 0,5 мм в день [189]. Nakamura E. et al. (1995) удлиняли голень кроликов с суточным темпом 1 мм за 2 и 120 приёмов; через 3 и 6 месяцев после окончания дистракции признаки артроза выявлены в первой, но не во второй группе [233]. Нами выполнены планомерные исследования нагружаемых участков хряща коленного сустава у собак при удлинении голени, которые позволили подтвердить представления о зависимости состояния хряща от режима дистракции и уровня удлинения. В экспериментах (глава 5, разделы 5.1.,5.2. и 5.3.) использовалась стандартная биологическая модель, которая предусматривала нарушение целостности кости с сохранением содержимого костно-мозговой полости и формирование дистракционного регенерата на уровне середины диафиза большеберцовой кости [144]. Исследование структурной реорганизации нагружаемых участков суставного хряща в обозначенных условиях позволило выявить существенные отличия влияния режима дистракции на состояние хряща. Наиболее выраженное разволокнение коллагенового каркаса и узурирование поверхностной зоны 248 выявлены в серии «1 мм за 4 приема». Во всех сериях, кроме «1 мм за 60 приемов», были отмечены единичные нарушения целостности базофильной линии, проникновение костномозгового сосудистого паннуса в хрящ. Наибольшее количество деструктивных изменений хондроцитов наблюдалось в поверхностной и глубокой зонах. Изменения хондроцитов имели мозаичный характер: наряду с разнообразными деструктивно изменёнными встречались и функционально активные хондроциты. Проведенное количественное исследование по разработанной нами технологии позволило получить объективные данные о характере изменений структуры суставного хряща в условиях удлинения смежного сегмента конечности в зависимости от режима дистракции. Деструктивные изменения и гибель хондроцитов приводили к снижению стереологических параметров – толщины хряща, объемной и численной плотностей хондроцитов. В неповрежденных участках хондроциты демонстрировали реактивные изменения адаптивного характера, проявляющиеся активизацией пролиферативных (увеличены количество изогенных групп, численная плотность клеток промежуточной зоны) и биосинтетических (гипертрофия клеток во всех зонах и, особенно, в неповрежденных участках поверхностной зоны, снижение ядерно-цитоплазматического индекса) процессов, за счет которых осуществлялась регенерация хряща. Полученные данные свидетельствовали о высокой степени выраженности компенсаторных реакций хрящевой ткани наружного мыщелка бедра в условиях удлинения голени. Комплекс свидетельствовал стереологических о более щадящем и цитометрических характере режимов показателей высокодробной дистракции («1 мм за 8 приемов» и «1 мм за 60 приемов») при удлинении с суточным темпом 1 мм, однако отличия между этими сериями данными показателями определяются неотчётливо: например, численная плотность хондроцитов поверхностной зоны в конце опыта ближе к интактному показателю в серии «1/60», показатели промежуточной зоны – в серии «1/8», колебания многих других параметров асинхронны. Данные микроанализа (содержание 249 кальция и серы) выявили преимущества режима «1 мм за 60 приемов» в плане метаболических показателей. Данные компьютерной колориметрии (определение топографии распределения реакции метахромазии разной интенсивности в поверхностной, промежуточной и глубокой зонах суставного хряща) свидетельствовали о более выраженной дезорганизации внеклеточного матрикса в серии «1/8» по сравнению с серией «1/60», что позволило уточнить данные о распределении результатами сульфатированных гистохимического гликозамингликанов исследования и по сравнению с электронно-зондового микроанализа. Наиболее существенный результат проведённых исследований - установлена возможность полноценной репарации хряща коленного сустава при экспериментальном удлинении голени у собак автодистрактором с темпом 1 мм за 60 приёмов. Через 30 суток после снятия аппарата (срок эксперимента 93 суток) микроскопическая структура суставной поверхности была сопоставима с интактной, восстанавливалась толщина хряща. Выявленные изменения суставного хряща при высокодробной дистракции в режиме «1 мм в сутки за 60 приёмов» наиболее приближены к процессу интенсивного естественного роста по сравнению с другими изученными режимами. При таком же шаге высокодробной автоматической автодистракции (0,017 мм) были проведены эксперименты с увеличенным суточным темпом (3 мм в сутки за 180 включений автомата). В этой серии в конце опыта в отдельных участках суставной поверхности обнаруживались вскрытые клеточные лакуны, не восстанавливалась толщина хряща, однако динамика количественных параметров указывала на усиление и биосинтетической, и пролиферативной активности клеток, что свидетельствовало о возможности дальнейшей реституции. Наиболее вероятные причины, определяющие разницу деструктивнопролиферативных и адаптационно-пластических изменений суставного хряща при дистракции разной дробности - различия в величине «разового удлинения». Повидимому, снижение этого параметра позволяет перевести в более щадящий режим взаимосдавление суставных поверхностей («компрессию суставов») и 250 создать более благоприятные условия для адаптационных реакций сосудистого русла и нервных образований, от состояния которых зависит трофика хряща. В главе 5 раздел 5.2. проведено сопоставительное исследование результатов высокодробной автоматической дистракции («1 мм за 60 приёмов»), проводимой в течение 12 часов в разное время суток (с 9 до 21 часа либо с 21 часа до 9 часов). Установлено, что автодистракция в режиме «1 мм за 60 приёмов», проводимая в дневное либо в ночное время может быть отнесена к щадящим режимам удлинения конечности. В обеих сериях через 30 суток после снятия аппарата достигнута реституция структуры суставной поверхности. Вместе с тем комплексный анализ качественный и количественных параметров структурной организации суставного хряща позволяет сделать вывод о преимуществах автодистракции в дневное время. При автодистракции в дневное время на аппаратном этапе более выражены изменения межклеточного вещества – разволокнение поверхностной зоны (действие механического фактора), при автодистракции в ночное время – более повреждены клетки (метаболические нарушения). При ночном режиме к концу периода дистракции в поверхностной зоне более выражены явления клеточной гибели, а в промежуточной и глубокой зоне больше изменённых хондроцитов с признаками постпролиферативной терминальной дифференцировки, в то время как пролиферативная активность хондроцитов при ночном режиме ниже, особенно к концу эксперимента. Динамика метаболических показателей (содержание серы и кальция) в суставном хряще также указывала на более благоприятный для структурно- функционального восстановления сустава режим дневной автодистракции по сравнению с ночной. На наш взгляд, наиболее вероятная причина выявленной разницы дневного и ночного режима – депривация сна у животных в группе с ночной автодистракцией и как следствие – гипокинезия в дневное время. Именно поэтому в конце дистракции у животных серии «день» более выражено разволокнение поверхностной зоны. Однако условия серии «ночь» создают больше предпосылок 251 для развития нарушений метаболической и пролиферативной активности хондроцитов. В главе 5 раздел 5.3. проведено сопоставительное исследование результатов высокодробной автоматической дистракции с повышенным темпом и разной дробностью («3 мм за 180 приёмов» и «3 мм за 120 приёмов»). По существу исследовался вопрос о том, влияет ли на состояние суставного хряща увеличение разового удлинения от 17 мкм до 25 мкм. В обеих экспериментальных сериях в период дистракции деструктивные изменения интенсивнее выражены в поверхностной и глубокой зонах хряща. Очаги разволокнения имели мозаичный характер, частота встречаемости и глубина разволокнения увеличены в серии «3/120». Морфометрический анализ выявил к этому сроку эксперимента в обеих сериях одинаковое снижение толщины хряща, различия между сериями не достоверны. При практически одинаковой численной плотности пустых лакун численная плотность изогенных групп в серии «3/120» резко снижена по сравнению с контролем, а в серии «3/180» увеличена. Площадь хондроцитов поверхностной зоны снижена в обеих сериях, но более значительно в серии «3/120». В промежуточной зоне в серии «3/120» выявлено более сильное снижение не только площади, но и объемной плотности хондроцитов, увеличена доля бесклеточных полей. В глубокой зоне в серии «3/180» площадь хондроцитов не отличалась от контроля, а в серии «3/120» резко снижена. По-видимому, к концу дистракции в серии «3/120» происходит более выраженное снижение биосинтетической и пролиферативной активности хондроцитов, чем в серии «3/180». В срок 30 суток фиксации толщина хряща и размерные характеристики хондроцитов в серии «3/180» возрастали по сравнению с предыдущим сроком, а в серии «3/120» продолжали снижаться. Через 30 суток без аппарата толщина хряща в обеих сериях относительно предыдущих этапов эксперимента увеличивалась, но не достигала контроля, максимальные значения отмечены в серии «3/180», различия между сериями достоверны. 252 При использовании автодистракции с повышенным темпом изменения суставного хряща имеют обратимый характер. Восстановление структуры суставного хряща осуществляется, как за счет межклеточного матрикса, так и за счет собственных возможностей хондроцитов. Уже в период дистракции в обеих сериях реактивная реакция хрящевой ткани выражалась в активации пролиферативных и биосинтетических процессов, наиболее выраженных серии «3/180». Максимальные количественные характеристики хондроцитов всех зон хряща в обеих сериях выявлены к концу эксперимента. Полученные данные о компенсаторных процессах хрящевой ткани согласуются с литературными [73, 92, 103]. Регенерационный гистогенез растущих тканей (к которым относится хрящевая ткань) включает процессы, как клеточной пролиферации, так и внутриклеточных биосинтезов, сопровождающихся увеличением объема клетки [39]. Сравнивая течение восстановительного процесса при автодистракции с повышенным темпом, можно отметить, что при режиме «3 мм за 180 приемов» восстановление протекает более интенсивно. Во всех опытах с удлинением голени (раздел 5.1. 5.2. и 5.3.) на протяжении всего эксперимента в неповрежденных участках поверхностной зоны выявлено снижение ядерно-цитоплазматического индекса (NCI) хондроцитов в связи с более значительным ростом объемной доли цитоплазмы по сравнению с ядром, наиболее выраженным при автодистракции с суточным темпом 1 мм. Динамика изменений NCI на этапах эксперимента при автодистракции с суточным темпом 1 за 60 приемов и 3 мм за 180 приемов имела одинаковый характер и свидетельствовала об усилении биосинтетической активности клеток поверхностной зоны. Наименьшее снижение NCI на всех сроках эксперимента выявлено при 4-х кратной дистракции. При ручных режимах «1/4» и «1/8» к концу эксперимента NCI приближался к контрольным значениям. Судя по увеличению фактора формы и минимального диаметра, клетки округлялись, что подтверждает сканирующая электронная микроскопия, в то время как в норме клетки поверхностной зоны узкие продолговатой формы. 253 В промежуточной и глубокой зонах максимальные количественные характеристики клеток и их ядер в сериях «1/8», «1/60» выявлены в срок 30 суток фиксации, а в сериях «3/120» и «3/180» – через месяц после снятия аппарата. В этих сериях этап дистракции укорочен на 18 суток, и адаптационные процессы развились на более позднем этапе. В серии «1/4» максимальные количественные характеристики клеток и их ядер в промежуточной зоне выявлены в срок 30 суток фиксации, в глубокой зоне в срок 30 суток после снятия аппарата. Известно, что увеличение размеров ядер коррелирует с усилением белкового синтеза или с повышенным содержанием ДНК [37]. Увеличение параметров, характеризующих размер и форму клеток и их ядер, свидетельствовало об усложнении структуры хондроцитов, усилении биосинтетической и пролиферативной активности. Так, во всех сериях на протяжении всего эксперимента процентная доля хондроцитов в составе изогенных групп от общего количества хондроцитов (NNis.gr) была выше нормы. К концу периода дистракции максимальные значения NNis.gr отмечены при автодистракции с темпом 1 мм и при 4-х кратной дистракции, что связано с увеличением двуядерных клеток и изогенных групп в неповрежденных участках поверхностной зоны. Через месяц фиксации максимальные значения NNis.gr отмечены при автодистракции с темпом 3 мм и при 8-ми кратной дистракции. При 4-х кратной дистракции данный показатель на этапах фиксации и месяц после снятия аппарата ниже сравниваемых серий, в части изогенных групп хондроциты находились в состоянии деструкции. К концу эксперимента во всех сериях сохранялись повышенные значения NNis.gr, максимальные значения отмечены в серии «1/8». Во всех сериях наибольшая частота встречаемости изогенных групп клеток наблюдалась в верхнем слое промежуточной зоны, а также очагами в поверхностной и глубокой зонах, что подтверждается результатами экспрессии фактора пролиферации – белка Кi67. Усиленная пролиферация приводит к появлению 2, 3, 4-х членных изогенных групп, клетки которых впоследствии расходятся в результате новообразования ими межклеточного вещества. Численная плотность клеток промежуточной зоны во всех экспериментальных 254 сериях превышала контрольные значения. При автодистракции с суточным темпом 1 мм увеличение численной плотности хондроцитов относительно контроля наблюдалось только на аппаратном этапе и было выражено в меньшей степени по сравнению другими сериями. Репаративная регенерация суставного хряща при удлинении смежного сегмента конечности осуществлялась за счет механизмов лежащих в основе его роста и физиологической регенерации – интерстициального роста – пролиферативных и биосинтетических процессов, за счет которых происходит восстановление и увеличение объема межклеточного матрикса. Основная зона восполнения клеточной популяции (физиологическая регенерация) – это промежуточная зона, в которой отмечено наибольшее количество изогенных групп клеток, что характерно для суставных хрящей животных других видов и человека [73, 81, 92, 103]. Полученные нами результаты о функциональной значимости хондроцитов поверхностной зоны как резерва клеточной пролиферации также согласуются с литературными данными. Результаты исследований ряда авторов позволяют считать хондроциты поверхностной зоны – резервными клетками, а поверхностную зону – зоной резервных клеток, так как при действии ряда факторов, в период восстановления часть клеток поверхностной зоны подвергается делению [71, 92]. В нормальных условиях деления клеток поверхностной зоны практически не наблюдается [81, 104, 230]. В главе 5 раздел 5.4. изучено состояние суставного хряща при метадиафизарном удлинении голени. Эта серия отличалась от серий с диафизарным удлинением тем, что несмотря на меры профилактики смещения проксимальных отломков берцовых костей во время остеосинтеза, стабильность их фиксации снижалась на третьей-четвёртой неделе дистракции. По данным авторов 259 , средняя величина углового смещения проксимального фрагмента при метадиафизарном удлинении в 4,9 раза больше, чем при диафизарном. Известны данные о том, что нарушения стабильности фиксации в периоде дистракции сказываются отрицательно не только на консолидации 255 дистракционного костного регенерата, но и приводят к замедлению естественного роста молодых индивидов [167], вызывают механические и гемодинамические повреждения артерий, что приводит к гиповаскуляризации и нейротрофическим нарушениям мышц [105]. Последнее вполне объясняет разницу в функциональном статусе животных в сериях с диафизарным и метадиафизарным удлинением. В последнем случае в связи с более выраженной контрактурой коленного и голеностопного суставов имело место снижение функциональной нагрузки на конечность, что объясняет лучшую, по сравнению с диафизарным удлинением, сохранность поверхностной зоны и более близкими к интактному контролю значениями количественных параметров. Однако низкий показатель доли изогенных групп и состояние промежуточной зоны (появление бесклеточных полей) в конце опыта свидетельствовало о регрессивных изменениях суставного хряща и неблагоприятном функциональном прогнозе. Поэтому в дальнейших экспериментальных исследованиях следует разработать эффективные способы профилактики угловых смещений костных фрагментов при удлинении и уточнить представления об оптимальном уровне нарушения целостности кости. Полученные в условиях метадиафизарного удлинения голени результаты согласуются с литературными данными о трофическом влиянии функциональной нагрузки на суставной хрящ [75, 103, 124, 265, 273] и подтверждают, что динамические нагрузки являются необходимым условием сохранения структурной организации суставного хряща. Таким образом, общей особенностью опытов по удлинению голени является локализация деструктивных изменений преимущественно в поверхностной и глубокой зонах суставного хряща. Разволокнение поверхностной зоны хряща отражает реакцию на избыточную статическую нагрузку, а проникновение сосудов в глубокую зону со стороны субхондральной кости - на нарушение кровоснабжения. Поскольку хондроциты – единственный тип клеток, формирующих хрящ и поддерживающих динамическое равновесие между синтезом и деградацией 256 внеклеточного матрикса, разрушение хряща связано прежде всего со смертью хондроцитов, а затем уже с потерей матрикса. Соответственно восстановительные процессы определяются степенью активации биосинтетической активности выживших хондроцитов, их пролиферации, постпролиферативного восстановления биосинтетической активности и участием в реорганизации матрикса. Динамика деструктивно-репаративных и адаптационно-пластических изменений в различных зонах хряща выглядела асинхронной. Это согласуется с известными из литературы представлениями о различиях метаболической активности хондроцитов различных зон хряща. Хондроциты поверхностной зоны синтезируют небольшое количество матрикса, состоящего в основном из коллагена и небольшого количества протеогликанов [158], хондроциты промежуточной зоны синтезирует больше матрикса с большим содержанием протеогликанов [178]. Самую высокую биосинтетическую активность имеют хондроциты глубокой зоны [278]. Представляет практический интерес сопоставление степени повреждения и регенерации суставного хряща при экспериментальном моделировании остеоартроза и удлинении голени (приложение: рисунок 1-4, таблица 14), которое может быть проведено с применением визуальной гистологической оценочной шкалы (Таблица 32). Результаты визуальной гистологической оценки, проведённые в сопоставимые сроки эксперимента (в серии с моделированием остеоартроза – через 90 суток после операции, в сериях с удлинением – через 30 суток после снятия аппарата, срок опыта 93 дня при удлинении с темпом 1 мм и 75 дней при удлинении с темпом 3 мм) представлены в таблице 33. Визуальная гистологическая шкала позволяет выявить неблагоприятное для функциональной реабилитации состояние суставного хряща при метадиафизарном удлинении голени, приближенное по нескольким параметрам к индуцированному остеоартрозу. Преимущества ручной высокодробной «1/8» дистракции и автодистракции «1/60» согласуются с данными количественного анализа. 257 Таблица 32 - Визуальная гистологическая оценочная шкала (по Mainil-Varlet P., 2003) Параметр Градация Оценка Поверхность Гладкая непрерывная 3 Прерывистая/нерегулярная 0 Матрикс Гиалиновый 3 Смесь гиалинового и волокнистого 2 хряща Волокнистый хрящ 1 Фиброзная ткань 0 Распределение Колончатое 3 клеток Смешанное колончато-кластерное 2 Кластеры 1 Одиночные клетки/дезорганизация 0 Жизнеспособность Преобладают жизнеспособные 3 клеточной клетки популяции Частично жизнеспособны 1 Менее 10% жизнеспособны 0 Субхондральная кость Нормальная 3 Повышено ремоделирование 2 Некроз/Грануляционная ткань 1 Разрушена/фрактуры/мозоль 0 Минерализация хряща Нормальная 3 Аномальная/неправильная 0 локализация Максимальная оценка 18 Различия между сериями «1/60-день» и «1/60-ночь», а также между «1/4», «3/180» и «3/120» не выявляются полуколичественным методом, но, как было показано выше, установлены по результатам гистоморфометрии и стереологического анализа. В обзоре P.C. Pastoureau, E.B. Hunziker, J.P. Pelletier (2010) отмечено существенное преимущество применения методов гистоморфометрии в оценке экспериментальных моделей остеоартроза [241]. 258 Таблица 33 - Оценка регенерации хряща в экспериментальных сериях по визуальной гистологической шкале P.Mainil-Varlet (2003) Серия/ Параметр МОА 1/4М 1/4 1/8 1/60 1/60 3/180 3/120 день ночь Поверхность 0 0 0 0 3 3 0 0 Матрикс 3 3 3 3 3 3 3 3 Распределение клеток Жизнеспособность клеточной популяции Субхондральная кость Минерализация хряща Суммарная оценка 0 2 2 2 2-3 2-3 2 2 0-1 1 3 3 3 3 3 3 2-1 2 2 3 3 3 2 2 0 0 0 3 3 3 0 0 5-6 8 10 14 17-16 17-18 10 10 Примечание: 1/4М – метадиафизарное удлинение в режиме 1 мм за 4 приема. В нашем исследовании методы количественной морфологии позволили получить комплекс нормативных показателей, характеризующих суставной хрящ экспериментальных животных в различные периоды постнатального онтогенеза, при моделировании остеоартроза с редуцированным кровоснабжением и выявить влияние различных условий ортопедического удлинения конечности на структурную реорганизацию суставного хряща. В дальнейших исследованиях эти данные могут использоваться при доклинических испытаниях лечебно- профилактических воздействий, направленных на предотвращение развития суставной патологии у ортопедо-травматологических больных. В главе 6 мы провели гистоморфометрический анализ синовиальной оболочки на двух экспериментальных моделях удлинения голени у собак. При метадиафизарном удлинении голени в режиме 1 мм за 4 приема способ нарушения целостности кости, суточный темп и ритм дистракции соответствовали методике удлинения, наиболее часто применяемой в клинике. Во второй экспериментальной модели впервые апробирован повышенный суточный темп автодистракции. На первый взгляд, полученные описательные и 259 количественные данные несопоставимы, поскольку модели отличались способом нарушения целостности кости, режимом дистракции и сроками опыта (в силу разницы суточных темпов). Однако сравнение закономерностей изменений синовиальной оболочки позволило оценить диапазон деструктивно-репаративных реакций в столь разных экспериментальных условиях. В обеих моделях выявлена гиперплазия покровного слоя синовиальной оболочки. Активность воспалительного процесса при метадиафизарном удлинении в ручном режиме была незначительной в конце периода дистракции и выраженной на этапе после снятия аппарата. При автодистракции в режиме 3 мм за 120 приемов динамика оценки синовита диаметрально противоположна. Перестройка сосудистого русла синовиальной оболочки при метадиафизарном удлинении «1/4» отражала гипердинамическое состояние кровотока, высокую активность ангиогенеза и развитие гиперваскуляризации. При автодистракции «3/120» колебания численной плотности микрососудов не обнаруживали статистически значимых отличий от показателя интактной группы, но деструктивные изменения сосудистого русла, особенно состояние артериоартериолярного его звена, указывали на редукцию кровоснабжения, которая являлась наиболее вероятной причиной более выраженных признаков нарушения циркуляции эндоневральной жидкости и деструктивных изменений нервных волокон в нервах субсиновиального слоя по сравнению с метадиафизарным удлинением «1/4». Следует отметить, что признаки регенерации повреждённых нервных волокон у животных при метадиафизарном удлинении «1/4» обнаружены уже к концу периода дистракции - через 33 дня эксперимента. При автодистракции «3/120» они не выявлялись вплоть до 75 дней. В этот же срок опыта фиброз автодистракции и липоматоз «3/120» субсиновиального был значительно слоя более у животных выражен, чем при при метадиафизарном удлинении «1/4». Компенсаторно-приспособительные изменения субсиновиального слоя у животных при метадиафизарном удлинении «1/4» - ангиогенез, гиперваскуляризация, регенерация деструктивно изменённых нервных элементов, 260 выраженные как в конце дистракции, так и через месяц после снятия аппарата, сопровождались нарастанием активности воспалительного процесса в синовиальной оболочке, что прогностически неблагоприятно для восстановления функции суставов. При автодистракции «3/120» была предпринята попытка снижения травматичности методики удлинения: уровень нарушения целостности кости и удлинения дистанцирован от коленного сустава, в 10 раз уменьшен шаг дистракции (разовое растяжение), на 23 дня сокращен период пребывания конечности в аппарате – не только за счёт более быстрой дистракции, но и сокращения периода фиксации в аппарате. В этих условиях происходило более раннее формирование и консолидация дистракционного костного регенерата, но в синовиальной оболочке выражены регрессивные нейрососудистые изменения, что также неблагоприятно для структурного и функционального восстановления суставов. Известно, что при воспалительных и дегенеративных заболеваниях суставов состояние синовиальной оболочки коррелирует с деструктивно-репаративными процессами в суставном хряще и клиническими проявлениями патологического процесса [69, 255]. Этим определяется практическая значимость исследований гистологических изменений синовиальной оболочки не только при клинической патологии, но и в экспериментальной практике. ЗАКЛЮЧЕНИЕ С целью нагружаемых выявления участков закономерностей суставного хряща структурной коленного реорганизации сустава при биомоделировании остеоартроза и разработке новых технологий ортопедического удлинения голени нами последовательно решались задачи по исследованию возрастных изменений хряща и синовиальной оболочки интактных собак, в экспериментах с биомоделированием остеоартроза и ортопедического удлинения. Установлено, что период бурного роста (от 6 до 10 мес. постнатальной жизни) характеризовался очаговыми нарушениями гомогенности межклеточного вещества поверхностной зоны, незначительным снижением толщины хряща, 261 увеличением объёма межклеточного вещества в расчёте на одну клетку, единичными пустыми лакунами и существенным возрастанием доли изогенных групп. Аналогичные изменения были отмечены при исследовании суставного хряща коленного сустава человека в подростковом возрасте [10]. К 1,5-2 годам гомогенность межклеточного вещества поверхностной зоны восстанавливалась, снижалось количество пустых лакун, увеличивалась объемная плотность хондроцитов. Выраженные признаки инволютивных преобразований, выявленные в 5 лет постнатальной жизни собак, включали минимальные по сравнению с другими возрастными периодами показатели содержания серы, численной и объёмной плотности хондроцитов суставного хряща, но максимальную площадь хондроцитов его поверхностной зоны. По сравнению с двухлетним возрастом в этот период значительно увеличены доля пустых лакун и доля изогенных групп, содержание кальция. В возрасте 8 лет площадь хондроцитов промежуточной зоны достигала максимума и по сравнению с двухлетним возрастом на 13,5% увеличено содержание серы, но содержание кальция возрастало на 173%. В отличие от возрастных изменений, при биомоделировании остеоартроза с редуцированным кровоснабжением деградация хряща приобретала ускоренный характер, а компенсаторно-приспособительные изменения были слабо выражены. Перевязка бедренной артерии и иммобилизация коленного сустава в разработанной нами экспериментальной модели остеоартроза приводят к гиповаскуляризации и частичной потере иннервации субсиновиального слоя; изменения синовиальной оболочки свидетельствуют о синовите значительной степени выраженности; изменения суставного хряща включают деструктивнопролиферативную фазу и фазу глубокой деградации хряща. Необходимо отметить, что в данных условиях эксперимента наиболее уязвимым оказались хондроциты промежуточной зоны, которые равноудалены от васкулярного и синовиального факторов питания (около 50% клеток в состоянии деструкции). Полученные результаты оценки морфофункционального состояния суставного хряща и субхондральной кости показали, что разработанная экспериментальная 262 модель позволяет получить гонартроз, патогенетически основное место в развитии которого, занимает фактор изменений режима функциональных нагрузок и кровоснабжения сустава, определяющие диффузное питание хряща. При данном патологическом процессе собственные регенераторные возможности суставного хряща подавлены и его восстановление невозможно без дальнейшего потенцирования внешних по отношению к хрящу механизмов. Разработанная в эксперименте модель дегенеративно-дистрофических изменений в эпифизах костей коленного сустава может быть использована для испытания средств профилактики и методов лечения гонартроза и остеопороза. Анализ качественных и количественных характеристик позволил выявить неблагоприятное для функциональной реабилитации состояние суставного хряща при метадиафизарном удлинении голени на 15% исходной длины. По нескольким параметрам это состояние было приближено к индуцированному остеоартрозу несмотря на то, что применялся оптимальный темп (1 мм в день) и дробный режим дистракции – разделение суточного удлинения на 4 приёма. Несмотря на то, что в сериях с моделированием остеоартроза и при метадиафизарном удлинении васкуляризация синовиальной оболочки менялась разнонаправлено, в обеих сериях опыта выявлен синовит, что также подтверждает риск развития остеоартроза при метадиафизарном удлинении голени. В отличие от модели остеоартроза, при моделировании удлинения голени экспериментальных животных наибольшие структурные преобразования развиваются в поверхностной и глубокой зонах нагружаемых участков хряща коленного сустава, деструктивные изменения и гибель хондроцитов выражены в меньшей степени. Регенерация суставного хряща в условиях удлинения конечности осуществляется за счет собственных возможностей хондроцитов, пролиферирующих преимущественно в верхних слоях промежуточной зоны, а также очагами в поверхностной и глубокой зонах. Выраженность деструктивных изменений и полноценность регенерации при диафизарном удлинении существенно зависели от режима дистракции. При удлинении по 1 мм в день за 4 приема на этапе дистракции была выражена 263 деструктивно-пролиферативная реакция суставного хряща. Через 30 суток после снятия аппарата гибель хондроцитов продолжалась, а пролиферативная реакция затухала. Восстановления морфометрических характеристик хряща и содержания серы не происходило к концу эксперимента. Увеличение дробности и уменьшение величины разового удлинения при ручной дистракции с темпом 1 мм за 8 приемов позволили снизить травматизацию суставного хряща. В этой серии через 30 суток после снятия аппарата гибель хондроцитов прекращается, а пролиферация усиливается, толщина хряща приближается к норме, происходит восстановление поверхностной зоны. Данные электронно-зондового микроанализа (содержание кальция и серы) выявили преимущества режима «1 мм за 60 приемов» по сравнению с «1 мм за 8 приемов» в плане восстановления метаболических показателей. Режим высокодробной дистракции «1 мм за 60 приемов» создавал возможности полноценной репарации хряща. Однако этот эффект достигался только при проведении автодистракции в дневное время суток. Ночная дистракция при таком же темпе и ритме (1 мм за 60 приёмов) характеризуется более выраженной клеточной гибелью и большей интенсивностью восстановительных процессов. При таком же шаге высокодробной автоматической автодистракции (0,017 мм) были проведены эксперименты с увеличенным суточным темпом (3 мм в сутки за 180 включений автомата). В этой серии в конце опыта не восстанавливалась структура суставной поверхности и толщина хряща, однако динамика количественных параметров указывала на усиление и биосинтетической, и пролиферативной активности клеток, что свидетельствовало о возможности дальнейшей реституции. Существенно также то, что автодистракция с темпом 3 мм по сравнению с ручной дистракцией «1 мм за 4 приема» являлась менее травматичной для суставного хряща и обеспечивала высокую эффективность адаптационных реакций, направленных на восстановление его структуры; при этом значительно 264 (на 18 суток) за счёт ускоренного темпа сокращался период пребывания конечности в аппарате. Снижение дробности и увеличение шага дистракции с 0,017 до 0,025 мм при режиме 3 мм за 120 приемов оказалось значимым и неблагоприятным для восстановления суставного хряща. Таким образом, наиболее перспективным в плане профилактики остеоартроза у пациентов, которым показано оперативное удлинение конечности, представляется применение режимов дистракции «1 мм за 8 приемов» и «1 мм за 60 приёмов», осуществляемой в дневное время суток. Представляется целесообразным продолжение исследований с целью поиска оптимального режима высокодробной дистракции с повышенным темпом. В процессе проведения исследований нами была разработана методология количественного исследования суставного хряща на органном, тканевом и клеточном уровнях структурной организации. Она расширяет возможности гистоморфометрических исследований, повышает их точность, эффективность, обеспечивает воспроизводимость получаемых данных. 265 Выводы. 1. Период бурного роста у собак (от 6 до 10 мес. постнатальной жизни) характеризуется очаговыми нарушениями гомогенности межклеточного вещества поверхностной зоны суставного хряща, компенсированным усилением биосинтетической и пролиферативной активности хондроцитов, что доказывается увеличением объёма межклеточного вещества в расчёте на одну клетку (на 45,4%) и существенным возрастанием доли изогенных групп (на 80,5%). 2. Выраженные признаки инволютивных преобразований суставного хряща, выявленные в 5 лет постнатальной жизни собак, включают гипертрофию хондроцитов поверхностной зоны, выраженные признаки гибели хондроцитов и снижения их биосинтетической активности, компенсированные усиленной пролиферативной активностью. В возрасте 8 лет развиваются признаки гипертрофии хондроцитов промежуточной зоны, по сравнению с пятилетним возрастом незначительно усиливается биосинтетическая активность хондроцитов, но нарастают признаки кальцификации хряща. Наиболее выраженные изменения сосудов и особенно нервов синовиальной оболочки обнаружены в возрасте 5 лет. 3. изученной Перевязка бедренной артерии и иммобилизация коленного сустава в нами экспериментальной модели остеоартроза приводят к гиповаскуляризации и частичной потере иннервации субсиновиального слоя; изменения синовиальной оболочки свидетельствуют о синовите значительной степени выраженности; изменения суставного хряща включают деструктивнопролиферативную фазу и фазу глубокой деградации хряща. 4. При диафизарном удлинении конечности в ручном режиме (1 мм за 4 приема) на этапе дистракции выражена деструктивно-пролиферативная реакция суставного хряща. Через 30 суток после снятия аппарата гибель хондроцитов продолжается, а пролиферативная реакция затухает. Восстановления морфометрических характеристик хряща и содержания серы не происходит. 5. Увеличение дробности и уменьшение величины разового удлинения при ручной дистракции с темпом 1 мм за 8 приемов, позволяют снизить 266 травматизацию суставного хряща. Через 30 суток после снятия аппарата гибель хондроцитов прекращается, пролиферация усиливается, толщина хряща приближается к норме. 6. При автодистракции с темпом 1 мм за 60 приемов деструктивно- пролиферативная реакция на этапе дистракции выражена меньше, чем при режиме 1 мм за 4 приема. Через 30 суток после снятия аппарата гибель хондроцитов прекращается, пролиферация усиливается, морфометрические параметры приближаются к норме, увеличение процентного содержания серы более выражено, чем при режиме 1 мм за 8 приемов. 7. По результатам компьютерной колориметрии получены четкие количественные критерии, позволяющие обнаруживать метахромазию, определять ее тип (β или γ) и интенсивность. Наиболее интенсивная γ - МТХ выявлена на этапе фиксации конечности в аппарате в поверхностной зоне суставного хряща, что ассоциировано с разволокнением её коллагенового каркаса. Количественное исследование метахромазии позволило подтвердить более щадящий характер высокодробной автоматической дистракции «1 мм за 60 приемов» по сравнению с ручной «1 мм за 8 приемов». 8. Изменения гиалинового суставного хряща при высокодробной дистракции в режиме «1 мм за 60 приёмов» наиболее приближены к процессу интенсивного естественного роста по сравнению с другими изученными режимами. 9. Сопоставление дневного и ночного режима автодистракции в режиме «1 мм за 60 приёмов», свидетельствует о преимуществах первого. В обеих сериях опытов через 30 суток после снятия аппарата достигнута реституция структуры суставной поверхности. Однако при ночном режиме в конце эксперимента выявлены признаки снижения пролиферативной активности, а в промежуточной и глубокой зонах дифференцировки - признаки хондроцитов. постпролиферативной Динамика метаболических терминальной показателей (содержание серы и кальция) в суставном хряще также указывает на более 267 благоприятный для структурно-функционального восстановления сустава режим дневной автодистракции по сравнению с ночной. 10. Автодистракция с темпом 3 мм за 180 приемов по сравнению с ручной дистракцией «1 мм за 4 приема» является менее травматичной для суставного хряща и обеспечивает высокую эффективность адаптационных реакций, направленных на восстановление его структуры; при этом значительно (на 18 суток) сокращается период пребывания конечности в аппарате. 11. Сопоставление морфометрических параметров суставного хряща в сериях «3 мм за 120 приёмов» и «3 мм за 180 приёмов» свидетельствует о большей травматичности режима 3 мм за 120 приёмов: более выражено уменьшение толщины хряща и особенно численной плотности изогенных групп. Снижение дробности и увеличение шага дистракции с 0,017 до 0,025 мм значимо и неблагоприятно для восстановления суставного хряща в данных условиях эксперимента. 12. В отличие от модели остеоартроза, при моделировании диафизарного удлинения голени экспериментальных животных наибольшие структурные преобразования развиваются в поверхностной и глубокой зонах нагружаемых участков хряща коленного сустава, деструктивные изменения и гибель хондроцитов выражены в меньшей степени, в промежуточной зоне преобладают функционально активные хондроциты. 13. Метадиафизарное удлинение голени по сравнению с диафизарным является менее щадящим по отношению к суставному хрящу и создаёт менее благоприятные условия для восстановления его морфофункциональных характеристик: несмотря на лучшую сохранность поверхностной зоны к концу периода дистракции, в период фиксации и после снятия аппарата нарушается жизнеспособность хондроцитов промежуточной и глубокой зон, что приводит к формированию бесклеточных полей и создаёт высокий риск прогрессирования деградации хряща (развития остеоартроза). 14. Состояние синовиальной оболочки коленного сустава при удлинении голени существенно зависит от методики удлинения и отражает степень ее 268 травматичности. При остеотомии на уровне метадиафиза и ручной дистракции «1 мм за 4 приёма» отмечены гиперваскуляризация, в нервах реактивнодеструктивные изменения с тенденцией к регенерации, как и при остеоартрозе развивается выраженный синовит. При остеоклазии на уровне середины диафиза и автодистракции «3 мм за 120 приёмов» выявлен синовит умеренной и слабой степени выраженности на фоне прогрессирующих деструктивных изменений сосудов и нервов. 269 Практические рекомендации по использованию научных выводов: 1. Полученные данные о возрастных изменениях суставного хряща и синовиальной оболочки могут быть использованы в учебном процессе на кафедрах гистологии и травматологии-ортопедии. 2. Данные о структурной реорганизации суставного хряща и синовиальной оболочки при моделировании остеоартроза являются базовыми в разработке и доклинических испытаниях новых методов лечения заболеваний суставов. 3. Данные о изменениях деструктивно-пролиферативных суставного биомоделировании хряща ортопедического и адаптационно-пластических экспериментальных удлинения животных конечностей при являются теоретической основой для совершенствования известных и разработки новых технологий дистракционного остеосинтеза. 270 Список используемой литературы 1. Автандилов, Г.Г. Системная стереометрия в изучении патологического процесса / Г.Г. Автандилов, Н.И. Яблучанский, В.Г. Губенко. М.: Медицина, 1981. - 189 с. 2. Автандилов, Г.Г. Системный стереометрический анализ ультраструктур клеток / Г.Г. Автандилов, В.П. Невзоров, О.Ф. Невзорова. – Кишинев: Штинца, 1984. - 168 с. 3. Автандилов, Г.Г. Медицинская морфометрия: Руководство. / Г.Г. Автандилов. – М.: Медицина, 1990. – 384 с. 4. Авцын, А.П. Принципы и методы гисто- цитохимического анализа в патологии / А.П. Авцын, А.И. Струков, Б.Б. Фукс. - Л.: Медицина, 1971. - 367 с. 5. Алексеева, Л.И. Субхондральная кость при остеоартрозе: новые возможности терапии / Л.И. Алексеева, Е.М. Зайцева // РМЖ. - 2004. - Том 12. №20. - С. 1133-1136. 6. Алексеева, Л.И. Роль субхондральной кости при остеоартрозе / Л.И. Алексеева, Е.М. Зайцева // Научно-практическая ревматология. - 2009. - №4. - С. 41-48. 7. Аранович, A.M. Ошибки и осложнения при удлинении голени у больных ахондроплазией / А.М. Аранович, Е.В. Динидиберя, О.В. Климов, К.И. Новиков // Травматология и ортопедия России. - 2005. - №1. - С. 36-37. 8. Асонова, С.Н. Использование метода стереологического анализа для исследования тканевых и ультраструктурных характеристик соединительной ткани / С.Н. Асонова // Значение открытых Г.А. Илизаровым общебиологических закономерностей в регенерации тканей. Сборник научных трудов. - Курган, 1988. - Вып. 13. - С. 50-55. 9. Асонова, С.Н. Способ количественной морфологической оценки действия БАВ на суставной хрящ / С.Н. Асонова, К.С. Десятниченко, Г.Н. Филимонова, С.Н. Лунева, М.А. Ковинька // Современные проблеммы медицины и биологии: - Материалы 29 обл. науч.-практ. конф. - Курган, 1997. - С. 200-201. 271 10. Ахмедов, Ш.М. Морфометрические показатели коленного сустава человека в подростковом периоде / Ш.М. Ахмедов, Ш.Ч. Бердиев, С.Т. Имомов, А. Ортиков // Материалы IV конгресса международной ассоциации морфологов. – Морфология. - 2002. - № 2-3. - С. 14. 11. Ахмедов, Ш.М. Гистологические показатели суставного хряща в пожилом и старческом возрасте / Ш.М. Ахмедов, Н.Х. Шамирзаев, А. Мухамаджанов, А.И. Ишанкулов / Материалы IV конгресса международной ассоциации морфологов. – Морфология. - 2002. - № 2-3. - С. 15. 12. Бахлыков, Ю.Н. Петровская Н.В. Гистологические изменения в суставном хряще и эпифизарной пластинке при сдавливании и обездвиживании коленного сустава / Ю.Н. Бахлыков, Н.В. Петровская // Лечение ортопедотравматологических больных в сационаре и поликлинике методом чрескостного остеосинтеза, разработанным в КНИИЭКОТ: Тез.докл. Всесоюзн. Научно-практ. конф. - Курган, 1982. - С. 158-161. 13. Беллендир, Э.Н. Экспериментально-морфологические особенности перихондриального хондрогенеза / Э.Н. Беллендир, Б.М. Ариэль // Морфология. 2005. - №3. - С. 63-67. 14. Белоусов, Л.В. Механические напряжения как факторы авторегуляции морфогенеза / Л.В. Белоусов // Онтогенез. – 1989. – Т. 20. - №6. – С. 626-636. 15. Борисевич, А.И., Пренатальный гистогенез межклеточного вещества хрящевой ткани / А.И. Борисевич, Н.В.Дедух, И.П. Комарова // Закономерности морфогенеза опорных структур позвоночника и конечностей на различных этапах онтогенеза. – Ярославь, 1985. – С. 3-14. 16. Бородин, микроциркуляции и Ю.И. Морфологические лимфатического дренажа характеристики в синовиальной состояния оболочке коленного сустава в норме и при патологии / Ю.И. Бородин, М.С. Любарский, Н.П. Бгатова, Н.Р. Мустафаев, Е.Ю. Дремов // Морфология. - 2008. - Т.133. - №1. С. 51-55. 272 17. Буданцев, А.Ю., Компьютерная трехмерная реконструкция биологических объектов с использованием серийных срезов / А.Ю. Буданцев, А.Р. Айвозян // Морфология. – 2005. - №1. – С. 72-76. 18. Вагапова, В.Ш. Части внутренней оболочки суставов / В.Ш. Вагапова // Морфология. – 2000. - №3. – С. 29. 19. Вагапова, В.Ш. Развитие суставов в онтогенезе / В.Ш. Вагапова // Морфология. - 2002. - № 2-3. С. 29. 20. Вейбель, Э. Морфометрия легких человека. Пер. с англ. / Э. Вейбель. – М.: Медицина, 1970. – 175 с. 21. Виноградова, Т.П. Регенерация и пересадка костей / Т.П. Виноградова, Г.И. Лаврищева. – М.: Медицина, 1974. – (С. 142-187) 246 с. 22. Виноградова, Е.В. Структурно-функциональные изменения хрящевой ткани человека при старении / Е.В. Виноградова / Возрастные, адаптивные и патологические процессы в опорно-двигательном аппарате: Тез. докл. VII школы по биологии мышц. – Харьков, 1988. – С. 179-180. 23. Виноградова, Е.В. Механизмы деструкции и регенерации хряща коленного сустава при остеоартрозе / Е.В. Виноградова // Ортопедия, травматология и протезирование. - 2000. - № 2. - С.97-98. 24. Волков, М.В. Восстановление формы и функции суставов и костей / М.В. Волков, О.В. Оганесян. – М.: Медицина, 1986. – 256 с. 25. Волошин, Н.А. Суставная поверхность: противоречия, факты, гипотезы / Н.А. Волошин, Е.А. Григорьева // Зб. матер. наук.-практ. конф.: Морфологiчний стан тканини i органiв систем органiзму в нормi та патологii – Тернопiль: Укрмедкнига. - 2009. - С.26-28. 26. Волошин, Н.А. Реакция покровного синовиального слоя суставного хряща потомства на введение гидрокортизона беременным / Н.А. Волошин, Е.А. Григорьева // Вiсник морфологii. - 2010. - №16(1). - С. 23-28. 27. Гайдышев, И.П. Анализ и обработка справочник / И.П. Гайдышев. – СПб.: Питер, 2001. – 752 с. данных: специальный 273 28. Гистология / Под ред.В.Г. Елисеева. – Издат. Медицинской литературы. Москва, 1963. – 673 с. 29. Гистология / А. Хэм, Д. Кормак. – М.: Мир, Т. 3, 1983. – 293 с. 30. Гистология. Введение в патологию / Под ред. Э.Г. Улумбекова и Ю.А. Челышева. – М.: Геотар, 1998. – 960 с. 31. Гонгадзе, Л.Р. Базофильная линия суставного хряща в норме и при некоторых патологических состояниях /Л.Р. Гонгадзе // Архив анат. - 1987. - № 4. - С. 52-57. 32. Гонгадзе, Л.Р. Значение остеохондрального соединения и базофильной линии в деструкции суставного хряща / Л.Р. Гонгадзе, А.Г. Гиоргадзе // Симпозиум ESOA «Деструкция суставов», 16-й: Тезисы. – Сочи, 1987. – С. 46-46. 33. Грачева, Л.И. Комплексное исследование хрящевой ткани при иммобилизации сустава / Л.И. Грачева, С.Н. Асонова, А.А. Утенькин, С.Я. Звенко // Материалы школы "Биология опорно-двигательного аппарата". - Харьков, 1992.- С. 55-56. 34. Громцева, К.Е. Образование и дифференцировка основного вещества гиалинового хряща человека / К.Е. Громцева // ДАН СССР. - 1950. - LXX. - Вып. 2. - С. 299-301. 35. Груздев, А.Д. Применение стереологических методов в цитологии / А.Д. Груздев // Сб. научн. тр. НИИ цитологии СО АН СССР - Новосибирск, 1974. - 81 с. 36. Давыдов, В.Б. Методы экспериментального моделирования остеоартрозов у мелких экспериментальных животных / В.Б. Давыдов // 2008. Режим доступа: http://www.allvet.ru/modules/articles/article.php?id=31 37. Данилов, Р.К. Экспериментально-гистологический анализ гистогенеза и регенерации тканей / Р.К. Данилов, Т.Г. Боровая, Н.Д. Клочков // Морфология. – 2000. - №4 – С. 7-16. 274 38. Данилов, Р.К. Гистологические основы регенерации тканей опорно- двигательного аппарата / Р.К. Данилов, В.Г. Гололобов, И.А. Одинцова, Х.Х. Мурзабаев // Ортопедия, травматология и протезирование. – 2000. - №2. – С. 102. 39. Данилов, Р.К. Гистология человека в мультимедиа / Р.К. Данилов, А.А. Клишов, Т.Г. Боровая. – СПб.: ЭЛБИ-СПб., 2004. – 362 с. 40. Дедух, Н.В. Морфологические аспекты воздействия гормонов на суставной хрящ в онтогенезе: автореф. дис. …д-ра биол. наук. 16.00.02. / Дедух Нинель Васильевна. - М., 1988. – 30с. 41. Дедух, Н.В. Возрастные изменения межклеточного вещества гиалиновой и коллагеноволокнистой хрящевой ткани человека / Н.В. Дедух, С.В. Малышкина, М. Керн, Е.Я. Панков // Арх. анатомии, гистол. и эмбриол. - 1988. №4. - С. 35-40. 42. Дедух, Н.В. Скелетные ткани // Руководство по гистологии, т. 1 / Н.В. Дедух, Е.Я. Панков; под общ. Ред. Р.К. Данилов – С-Пб.: СпецЛит, 2001.- 496 с. 43. Дедух, Н.В. Вплив комбінації глюкозаміну гідрохлориду з парацетамолом на морфологію суглобового хряща експериментальних щурів з кортикостероїдною дистрофією / Н.В. Дедух, Л.М. Бенгус, В.О. Туляков, І.О. Батура // Клінічна фармація. – 2011. – Т. 15. - №1. – С. 50– 55. 44. Дедух, Н.В. Морфология суставного хряща крыс с кортикостероидной дистрофией после лечения комбинацией глюкозамина гидрохлорида с парацетамолом / Н.В. Дедух, Л.М. Бенгус, В.А. Туляков, И.А. Батура // Вісник проблем біології і медицини. – 2011. – .Вып. 2. – Т.1. – С. 291 45. Денисов-Никольский, Ю.И. Актуальные проблемы теоретической и клинической остеоартрологии / Ю.И. Денисов-Никольский, С.П. Миронов, Н.П. Омельяненко. - Москва: «Типография «Новости». - 2005. — 87,100 с. 46. Деревянко, И.В. Морфофункциональная характеристика гиалинового хряща коленного сустава в норме и при хондропластике его экспериментальных повреждений: автореф. дис… канд. мед. наук: 14.00.02 / Деревянко Игорь Валентинович. – Волгоград, 2004. – 16 с. 275 47. Десятниченко, К.С. О механизме патологического обызвествления суставного хряща при развитии дегенеративно-дистрофических изменений в тканях синовиальной среды / К.С. Десятниченко, С.Н. Лунева, Е.Л. Матвеева // Гений ортопедии. – 1999. - №2. – С. 24-27. 48. Дьячкова, Г.В. Мышечно-фасциальный аппарат голени при удлинении ее по методу Илизарова в эксперименте / Г.В. Дьячкова // Лечение ортопедотравматологических больных в стационаре и поликлинике методом чрескостного остеосинтеза, разработанным в КНИИЭКОТ: Тез. докл. Всесоюз. науч.-практ. конф. – Курган, 1982. – Ч. 11. – С. 176-179. 49. Дьячкова, Г.В. Десять лет метода Илизарова в США / Г.В. Дьячкова // Гений ортопедии. – 1996. –N 2-3 – С. 19-22. 50. Дуляпин, В. А. Структура синовиальной оболочки на различных стадиях остеоартроза / В.А. Дуляпин // Ревматология. 1983. - № 1. -С. 19-22. 76. 51. Еникеев, Р.И. Морфологические, структурные и гистохимические особенности гиалинового хряща коленного сустава человека в норме / Р.И. Еникеев, О.А. Складин // Микроциркуляторное русло соединительноткан. образ. Уфа, 1988. - С. 26-31. 52. Ермак, Е.М. Ультразвуковые критерии оценки структуры суставного хряща и субхондральной кости / Е.М. Ермак // Ультразвуковая и функциональная диагностика. - 2005. - №5. - С. 102-114. 53. Ерофеев, С.А. Удлинение голени автоматическими дистракторами по Илизарову / С.А. Ерофеев // Материалы ХХV юбилейной научно-практической конференции врачей Курганской области. – Курган, 1992. – С. 22-24. 54. Зайдман, А.М. Хондрогематический барьер - регулятор последовательности остеогенеза губчатого вещества в эмбриогенезе: [Тез. докл.] 3 Конгр. Междунар. ассоц. Морфологов, Тверь, 20 - 21 июня. 1996 / А.М. Зайдман // Морфология. - 1996. – Т.109.- № 2. - С. 53. 55. Зайдман, А.М. Структурно-функциональные особенности пластинки роста тела позвонка человека в критические периоды роста / А.М. Зайдман, А.В. Корель // Хирургия позвоночника. – 2004. № 1. С. 113-120. 276 56. Зирне, Р.А. Динамика ультраструктуры хондрогенной ткани в процессе ее развития: / Р.А.Зирне, Т.В. Аршавская // Атлас Латв. НИИ эксперим. и клинич. медицины. - Рига: Зинатне, 1990. - 111,[2] с.:ил.; 24 см. 57. Зирне, Р.А. Гистологическая, гистохимическая и ультраструктурная характеристика индуцированного эктопического хондрогенеза / Р.А.Зирне, Т.В. Аршавская // Морфология. - 1995. - т.108. - № 1. - С. 39-43. 58. Изизаров, Г.А. Пат. 4615338 США МКИ4 61 Г 5/04 Автоматический компрессионно-дистракционный аппарат / Г.А. Илизаров, А.П. Предеин, В.М. Быков (СССР). – Публ. 07.10.86; Т. 1071; №1. Б. Изобрет. стран мира. – М., вып. 14, №15. С. 73. 59. Илизаров, Г.А. Возможности автоматического управления процессом дистракции / Г.А. Илизаров, И.А. Катаев, А.А. Шрейнер и др. // Лечение ортопед.травмотол. больных в стационаре и поликлинике: Тез. докл. Всесоюз. конф. Курган, 1982. - Ч. 2. - С. 21-23. 60. Илизаров, Г.А. Теоретические и практические аспекты удлинения конечностей методом чрескостного остеосинтеза / Г.А. Илизаров, В.И. Шевцов, В.И. Калякина и др. // Пленум науч. совета по травмотол. и ортопед. АМН СССР: Тез. докл. - Пермь, 1982. - С. 33-36. 61. Илизаров, Г.А. Новый метод флексионной остеоклазии (экспериментальное исследование) / Г.А. Илизаров, А.А. Шрейнер // Ортопедия травматология. – 1979. - № 1. – С. 9-14. 62. Имерлишвили, суставного хряща И.А. Экспериментальное изучение регенерации / И.А. Имерлишвили // Арх. анатомии, гистологии и эмбриологии. – 1957. - №2. - С. 58-71. 63. Калякина, В.И. Клинико-физиологические и морфологические характеристики адаптивной перестройки в мягкотканных структурах удлиняемой конечности / В.И. Калякина, А.П. Шеин, Н.С. Шеховцова, Т.С. Беркуцкая, А.Б. Кузнецова // «Значение открытых Г.А. Илизаровым общебиологических закономерностей в регенерации тканей». Сборник научных трудов. - Курган, 1988. - Вып. 13. - С. 63-70. 277 64. Каплунов, О.А. Косметическая коррекция формы и длины ног / О.А. Каплунов, А.Г. Каплунов, В.И. Шевцов. - М. : ГЭОТАР_Медиа; 2010. - 160 с. 65. Кобелев, телеморфологии: А.В. Управление проблемы получения качеством в репрезентативной количественной выборки для морфометрии / А.В. Кобелев, Т.Н. Варсегова, Т.А. Ступина, И.В. Борисова // Фундаментальные и прикладные проблемы гистологии. Гистогенез и регенерация тканей: материалы гистологической конференции. – СПб, 2004. – С.151-152. 66. Кобелев, А.В. Управление качеством в количественной телеморфологии: технологические проблемы подготовки микропрепаратов / А.В. Кобелев, Т.Н. Варсегова, Т.А. Ступина, И.В. Борисова // Фундаментальные и прикладные проблемы гистологии. Гистогенез и регенерация тканей: материалы гистологической конференции. – СПб, 2004. – С.150-151. 67. Коваленко, В.Н., Борткевич О.Н. Остеоартроз. Практическое руководство / В.Н. Коваленко, О.Н. Борткевич. - К.: Морион, 2005. - 592 с. 68. Ковалев, Г.А. Технология моделирования остеоартроза крупных суставов / Г.А. Ковалев, Б.П. Введенский, Б.П. Сандомирский // Биотехнология. – 2010. - Т.3. № 4. - С.37-43. 69. Кожанова, Т.Г. Структурно-функциональная реорганизация синовиальной оболочки и хряща коленного сустава при метаболическом синдроме / Т.Г. Кожанова // Морфология. - 2008. - n. 134, № 5. - с.74-75. 70. Кононский, А.И. Гистохимия / А.И. Кононский. - Киев, “Вища школа”, 1976. - 280 с. 71. Копьева, Т.Н. Морфология суставного хряща при остеоартрозе / Т.Н. Копьева, О.Б. Бельская, М.Г. Астапенко, А.Г. Арутюнов // Архив патологии. 1986. - №12. - С. 40-46. 72. Кормильченко, В.В. Количественные гистоморфометрические характеристики изменений суставного хряща головки бедренной кости у пожилых людей и при коксартрозе / В.В. Кормильченко, Л.О. Анисимова, Г.И. Нетылько // 13 научно-практическая конференция SICOT: Тез. докл. – СПб., 2002. – С.69. 278 73. Котельников, М.Г. Регенераторные процессы при внутрисуставных повреждениях коленного сустава и воздействии гипергравитации / М.Г. Котельников // Морфология. - 2003. - № 5. - С. 56-57. 74. Лаврищева, Г.И. Морфология и ультраструктура регенератора при повреждении суставного хряща. - В кн.: Повреждения и заболевания костей и суставов / Г.И.Лаврищева, Л.Н.Михайлова. - Москва, 1981. - С. 79-85. 75. Лаврищева, Г.И. Об оптимальных условиях репаративной регенерации опорных органов / Г.И. Лаврищева, Л.Н. Михайлова, Д.И. ЧеркесЗаде, Г.А. Оноприенко // Гений ортопедии. - 2002.- №1. - С. 120-125. 76. Лаврищева, Г.И. Морфологические и клинические аспекты репаративной регенерации опорных органов и тканей / Г.И. Лаврищева, Г.А. Оноприенко. - М.: Медицина, 1996. - С. 144-166. 77. Левенец, В.Н. Деформирующий гонартроз (некоторые вопросы патогенеза) / В.Н. Левенец, В.В. Пляцко // Вестник РАМН. - 1992. - №6. - С. 22-24. 78. Леонова, Н.М. Морфологические изменения при гонартрозе у лиц пожилого и старческого возраста / Н.М. Леонова, Н.И.Гапонова, Е.В. Виноградова, A.B. Королев // Клин, геронтол. – 2003. - №6. - С 14 - 18. 79. Лунева, С.Н. Биохимические изменения в тканях суставов при дегенеративно-дистрофических заболеваниях и способы их направленной биологической коррекции: автореф. дис… д-ра биол. наук: 03.00.04; 03.00.13/ Лунева Светлана Николаевна. – Тюмень, 2003. – 45 с. 80. Любарский, М.С. Нарушения морфологии структурных компонентов сустава при деформирующем остеоартрозе / М.С. Любарский, Н.П. Бгатова, Н.Р. Мустафаев, Е.Ю. Дремов // Успехи современного естествознания. – 2006. – № 5 – С. 63-63. 81. Мажуга, П.М. Источники трофики и структурного самовосполнения суставного хряща / П.М. Мажуга // Морфология. – 1999. - № 1. – С. 43-50. 82. Макушин, В.Д. Гонартроз (вопросы патогенеза и классификации) / В.Д. Макушин, О.К. Чегуров // Гений ортопедии. – 2005. - №2. – С. 19-22. 279 83. коленного Маланин, Д.А. Пластика полнослойных дефектов покровного хряща сустава цилиндрическими костно-хрящевыми ауто- и аллотрансплантатами малого размера (эксперимнтальное исследование) / Д.А. Маланин, В.Б. Писарев, Л.Л. Черезов, В.Г. Шилов, А.М. Шауки Мохамад // Вестник травматологии и ортопедии. - 2000. - № 2. – С. 16-21. 84. Маланин, Д.А. Экспериментальные аспекты изучения хондрогенного потенциала мезенхимальных плюрипотентных и малодифференцированных клеток, «культивированных» in vivo / Д.А. Маланин, В.Б. Писарев, В.Г. Шилов, Г.Л. Снигур, Л.Л. Черезов, Р.А. Михайлов, И.В. Деревянко // Гений ортопедии. 2002.- №1. - С. 90-97. 85. Маркварде, М.М. Способ определения оптической плотности костной структуры зубочелюстной системы. Радиология в медицинской диагностике [современные технологии] / М.М. Маркварде, Л.В. Белодед // Материалы Международного межуниверситетского семинара по диагностической и терапевтической радиологии. Минск, 2003. С.104-106. 86. Матвеева, Е.Л. Изменения показателей углеводного компонента протеогликанов тканей коленного сустава при удлинении голени у собак / Е.Л. Матвеева, Т.В. Русова, С.А. Ерофеев, А.А. Шрейнер // Гений ортопедии. - 1997. № 1. - С. 71-73. 87. Матвеева, Е.Л. Изменение метаболизма протеогликанов в синовиальных тканях коленного сустава собак в разных биомеханических условиях / Е.Л. Матвеева, Т.В. Русова, В.Д. Макушин // Гений ортопедии. – 1997. - №3. – С. 41-47. 88. Мендоса, С.Л. Философия старения суставов / С.Л. Мендоса, В.М. Прохорова // Материалы десятого Московского международного ветеринарного конгресса. – Москва, 2002. - С. 50-51. 89. Миронов, С. П. Морфология тканевых компонентов тазобедренного сустава у экспериментальных животных при моделировании остеоартроза / С. П. Миронов, Н.П. Омельяненко, К.М. Шерепо, И.Н. Карпов, Л.А. Семенова, А.П. 280 Курпяков // Вестник травматологии и ортопедии им. Н.Н. Приорова. - 2006. - N1. С. 57-63. 90. Модяев, В.П. Строение и функция волокнистой стромы суставного хряща / В.п. Модяев // Арх. анатомии, гистологии и эмбриологии. - 1980. - Т.79. Вып. 9. - С. 50-55. 91. Модяев, В.П. Некоторые особенности репродукции хондроцитов в суставном хряще. – В кн.: Физиология и патология соединительной ткани / В.П. Модяев. - Новосибирск, 1980. т. 1. - С. 149-150. 92. Модяев, В.П. Морфология суставного хряща в норме и после местного воздействия ионизирующей радиации: автореф. дис. …д-ра мед. наук: 14.00.15 / Модяев Виктор Павлович. - М., 1983. – 36 с. 93. Моисеев, В.С. Остеоартроз: спорные вопросы лечения / В.С. Моисеев // Клиничеcкая фаpмакология и теpапия. – 1998. - Т. 7, № 2. - С. 86-87. 94. Мяделец, О.Д. Основы цитологии, эмбриологии и общей гистологии / О.Д. Мяделец. – М.: Медицинская книга, Н. Новгород: Изд-во НГМА, 2002. – 367 с. 95. Насонова, В.А. Остеоартроз коленного сустава: причины развития, диагностика и профилактика / В.А. Насонова // Ревматология. – 2003. – Т.5. - №2. - Режим доступа: /media/consilium/03_02/90.shtml :: Sunday, 25-May-2003. 96. Некроз, апоптоз, атрофия. Режим доступа: http://www.pathology.dn.ua/Lectures/Necrosis.shtml 97. Непомнящих, Л.М. Морфометрия и стереология гипертрофии сердца / Л.М. Непомнящих, Е.Л. Лушникова, Г.И. Непомнящих. - Н.: Наука, 1986. - 304 с. 98. Никитюк, Б.А., Митрофаненко В.П. Деструктивные изменения суставов в связи с возрастом и механическими перегрузками / Б.А. Никитюк, В.П. Митрофаненко // Тезизы докл. XVI Симпозиума Европейского общества остеоартрологов. Сочи, 1987. – С. 5-109. 99. Новиков, Д.А., Новочадов В.В. Статистические методы в медико- биологическом эксперименте (типовые случаи) / Д.А. Новиков, В.В. Новочадов. Волгоград: Издательство ВолГМУ, 2005. – 84 с. 281 100. Омельяненко, Н.П. П.М. Морфологические особенности пограничных структур суставного хряща / Н.П. Омельяненко, П.М. Ицков // Морфология. 2002. - № 2-3. - С. 117. 101. Павлова, В.Н. Синовиальная среда суставов / В.Н. Павлова. – М.: Медицина, 1980. – 293 с. 102. Павлова, В.Н. Компоненты внутренней среды суставов и их функциональное взаимодействие / В.Н. Павлова // Успехи соврем. биол. – 1989. – Т. 107. Вып. 2. – С. 238-248. 103. Павлова, В.Н. Хрящ / В.Н. Павлова, Т.Н. Копьева, Л.И. Слуцкий, Г.Г. Павлов. - М.: Медицина, 1988. - 320 с. 104. Павлова, В.Н. Сустав: морфология, клиника, диагностика, лечение / под. ред. В.Н. Павловой, Г.Г. Павлова, Н.А. Шостак, Л.И. Слуцкого. - М.: ООО «Издательство «Медицинское информационное агентство», 2011. - 552с. 105. Петровская, Н.В. Гистологические изменения структур переднего фасциального пространства голени при её удлинении на уровне верхней трети / Н.В. Петровская, Н.А. Щудло, И.В. Борисова, М.А. Степанов // Гений ортопедии. – 2012. - №2. – С. 135-139. 106. Пирс, Э. Гистохимия теоретическая и прикладная / Э.Пирс. - М., Издво иностр. лит-ры, 1962. – 964 с. 107. Помогайбо, Г.Г. Морфологические особенности развития суставного хряща и зоны роста в лопатке и тазовой кости при дозированной физической нагрузке / Г.Г Помогайбо // Тезисы докладов областной конференции «Стресс и патология опорно-двигательного аппарата». Харьков, 1989. – С. 62-63. 108. Попков, А.В. Биохимические изменения структуры суставного хряща в условиях последовательного дистракционно компрессионного остеосинтеза / А.В. Попков, Е.Л. Матвеева, С.Н. Лунева, С.А. Ерофеев, Д.А. Попков // Гений ортопедии. – 2001. - №3. – С. 53-56. 109. Попков, А.В. Особенности функционального восстановления после оперативного лечения детей с врожденным укорочением нижних конечностей / А.В. Попков, Д.А. Попков // Гений ортопедии. – 2008. №1. С. 19-26. 282 110. Портус, Р.М. Динамика изменений синтеза гликогена хондроцитами суставного хряща в условиях биостимуляции / Р.М. Портус, Т.Н. Силина, Н.М. Подлесный // Морфология. – 1993. - №9-10. С. 134-135. 111. Постников, С.С. Сравнительный морфологический анализ состояния суставного хряща, эпифизарной пластинки, губчатой кости и синовиальной оболочки коленного сустава у детей, получавших и не получавших ципрофлоксацин / С.С. Постников, В.П. Нажимов, С.Ю. Семыкин, Н.И. Капранов // Антибиотики и химиотерапия. - 2000. - N11. - С. 9-13. 112. Ревенко, Е.Б. Аллотрансплантация свежевыделенных и криоконсервированных мезенхимальных эмбриональных клеток, стимулирующая репаративную регенерацию хряща крыс / Е.Б. Ревенко, В.А. Бабалян, Н.И. Горголь, Н.А. Волкова, А.Ю. Петренко // Пробл. криобиол. – 2003. - №1. – С. 7-15. 113. Редько, К.Г. Количественная морфометрия в диагностике ранних стадий остеоартроза (эксп. исследование) / К.Г. Редько, Л.О. Анисимова, Г.И. Нетылько // 13 научно-практическая конференция SICOT: Тез. докл. – СПб., 2002. – С.130. 114. Рост и развитие щенка. Режим доступа: leokiy.narod.ru›PappyRost.htm. 115. Саркисов, Д.С. Микроскопическая техника: Руководство / Под ред. Д.С. Саркисова и Ю.Л. Перова. – М.: Медицина, 1996. – 544 с. 116. Семченко, В.В. Международная гистологическая номенклатура (на латинском, русском и английском языках) / Под ред.Семченко В.В., Р.П. Самусева, М.В. Моисеева, З.Л. Колосовой. – Омск: Омская медицинская академия, 1999. – 156 с. 117. Серов, В.В. Соединительная ткань (функциональная морфология и общая патология) / В.В. Серов, А.Б. Шехтер. – М.: Медицина, 1981. – 312 с. 118. Слесаренко, Н.А. Метаболические свойства суставного хряща / Н.А. Слесаренко // Ортопедия, травматология и протезирование. - 1994. - №4. - С. 90. 119. Слесаренко, Н.А. Структурно-метаболические основы изменений суставного хряща в условиях гипокенизии / Н.А. Слесаренко, Ф.С. Барер, Е.Л. 283 Колесникова // Матерималы областной конференции «Стресс и патология опорнодвигательного аппарата». Харьков, 1989. – С. 41-42. 120. Слуцкий, Л.И. Современные представления о коллагеновых компонентах хрящевой ткани (обзор) / Л.И. Слуцкий // Вопр. мед. химии. – 1985. №3. – С. 10-17. 121. Старцева, И.А. Морфологические изменения в коленном суставе при удлинении голени в эксперименте / И.А. Старцева, Е.Т. Никитенко // В кн.: Заболевания и повреждения суставов. – Свердловск, 1973. – Т.12. – С. 104-108. 122. Старцева, И.А. Зависимость изменений в коленном суставе от уровня остеотомии большеберцовой кости при удлинении голени в эксперименте / И.А. Старцева, Е.Т. Никитенко // Ортопед., травматол. – 1978. - №5. – С. 11-15. 123. Стецула, В.И. Биомеханика и системная организация аппарата движения / В.И. Стецула, А.Т. Бруско // Мед. биомеханика: тез.докл.междунар.конф. «Достижения биомеханики в медицине». – Т.3. – Рига, 1986. – С. 314-319. 124. Стецула, В.И. Основы управляемого чрескостного остеосинтеза /В.И. Стецула, В.В. Веклич. – М.: Медицина, 2003. – 224 с. 125. Стецула, В.И. Биологические аспекты удлинения конечностей / В.И. Стецула, Г.И. Лаврищева, В.П. Штин, Л.Н. Михайлова // Ортопедия, травматология и протезирование - М.: Медицина, 1984. - №9. - С. 21-26. 126. Ступина, Т.А. Количественные характеристики адаптивной перестройки хондроцитов суставного хряща наружного мыщелка бедра на этапах удлинения голеней собак / Т. А.Ступина, М. М. Щудло // Травма. - 2006. - Т. 7, № 2. - C. 148-152. 127. Тыщенко, О.Б. Применение средств ввода изображений и распознавания текстов в учебном процессе / О.Б. Тыщенко // Информатика и образование. – 1999. - № 10. Режим доступа: 256.ru›publish/publ-autor.php 128. Уикли, Б. Электронная микроскопия для начинающих / Б. Уикли. - М.: Мир, 1975. - 324 с. 284 129. Фаллер, Д.М. Молекулярная биология клетки / Д.М. Фаллер, Д. Шилдс. — М.: «БИНОМ», 2006. — 256 с. 130. Фриденштейн, А.Я. Индукция костной ткани и остеогенные клеткипредшественники / А.Я. Фриденштейн, К.С. Лалыкина – М.: Медицина, 1973. – 224 с. 131. Цветкова, Е.С. Современная терапия остеоартроза - патогенетическое обоснование // Терапевтический архив. – 2004. - № 5. - С. 77-79. 132. Цончев, В.Т. В кн.: Ревматология / В.Т. Цончев, Т.Филосов. - София, 1965, С.3 133. Цурко, В. В. Остеоартроз: проблема гериатрии / В.В. Цурко. М.: Ньюдиамед, 2004. - 136 с. 134. Череповский, А.В. Активность нитроксидсинтазы как маркер дисметаболии хряща в эксперименте / А.В. Череповский, А.И. Дубиков, С.В. Никулин, Л.А. Белоголовых, Е.Э. Медведь // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2004. - №5. - С. 589-592. 135. Чичасова, Н.В. Проблема боли при остеоартрозе / Н.В. Чичасова // Лечащий врач. - 2007. - №2. – Режим доступа: paininfo.ru›articles/lvrach/2094.html 136. Шевцов, В.И. Моделирование суставной патологии путем иммобилизации суставов аппаратом Илизарова / В.И. Шевцов, С.Н. Асонова, Л.И. Грачева // Современные аспекты травматологии и ортопедии: Материалы науч.практ. конф. - Казань, 1994. - С. 35-36. 137. Шевцов, В.И. Автоматический дистракционный остеосинтез / В.И. Шевцов, А.В. Попков, С.А. Ерофеев, А.М. Чиркова // Анналы травматологии и ортопедии. – 1995. - N 1. – С. 44-47. 138. Шевцов, В.И. Биохимические и биомеханические изменения суставного хряща при многоэтапном удлинении конечности у собак / В.И. Шевцов, К.С. Десятниченко, С.Н. Лунева и др. / Тез. докл. на межд. науч.практич. конф. // Гений ортопедии. - 1996.- № 2-3. - С. 147. 139. Шевцов, В.И. Теоретические предпосылки и практические последствия увеличения длины нижних конечностей у больных с ахондроплазией 285 / В.И. Шевцов, Т.И. Меньщикова, В.А. Щуров // Российский журнал биомеханики. – 2000. – Т. 4. - №3. – С. 74-79. 140. Шевцов, В.И. Оперативное удлинение нижних конечностей / В.И. Шевцов, А.В. Попков. – М.: Медицина, 1998. – 192 с. 141. Шевцов, В.И. Удлинение нижних конечностей в автоматическом режиме / В.И. Шевцов, А.В. Попков, Д.А. Попков, С.О. Мурадисинов // Гений ортопедии. – 1999. - №3. – С. 20-24. 142. Шевцов, В.И. Удлинение нижних конечностей, как единственный оптимальный способ увеличения роста у детей и подростков при ахондроплазии / В.И. Шевцов, К.И. Новиков, А.М. Аранович // Гений ортопедии. – 2004. - №.1. – С. 150-155. 143. Шевцов, В.И. Косметическая ортопедия: удлинение и коррекция конечностей / В.И. Шевцов, А.М. Аранович, К.И. Новиков, О.В. Климов // Гений ортопедии. - 2008. - №4. - С. 69-73. 144. Шрейнер, А.А. Теоретические аспекты дистракционного остеосинтеза. Значение режима дистракции / А.А. Шрейнер, С.А. Ерофеев, М.М. Щудло, А.М. Чиркова, Н.Р. Карымов // Гений ортопедии. – 1999. - №2. – С. 13-17. 145. Шубич, М.Г. Гликопротеины и протеогликаны. Принципы их гистохимического анализа / М.Г. Шубич, Г.М. Могильная // Арх. анат. - 1979. - № 8. - С. 92- 99. 146. Щудло, М.М. - Целлоидинирование полутонких срезов большой площади для предупреждения образования складок при окраске / М.М. Щудло // Архив патологии. - 1982. - Т.ХLIV. - № 11. - С. 66-67. 147. Щудло, М.М. Проблемма эффекта Холмса в количественной телепатологии / М.М. Щудло, Н.А. Щудло, Т.Н. Варсегова, Т.А. Ступина, И.В. Борисова, С.В. Гордичук, Л.В. Воинкова, А.В. Кобелев // Известия Челябинского научного центра. - 2003. - Вып. 1 (18). – С. 1-5. 148. Щудло, М.М. Экспериментально-гистологическое исследование суставного хряща наружного мыщелка бедра при удлинении голени собак / М.М. Щудло, Т.А. Ступина, С.А. Ерофеев // Морфология. - 2005.- №5.- С. 67-71. 286 149. Щудло, М.М. Реакция нервов на растяжение и их структурная адаптация к удлинению конечности / М.М. Щудло, Н.А. Щудло, Т.Н. Варсегова, И.В. Борисова // Гений ортопедии. - 2009. - №4. - С. 48-55. 150. Щуров, В.А. Влияние ранних активных движений на темпы восстановления функции коленного сустава после оперативного удлинения бедра / В.А. Щуров, Д.А. Попков, О.В. Лаптев // Гений ортопедии. – 2004. - №1. – С. 3035. 151. Эйсмонт, О.Л. Современные возможности и перспективы хирургического лечения повреждений и заболеваний хряща / П.Г. Скакун, А.В. Борисов, В.А. Букач, Б.В. Малюк, Д.В. Букач, А.М. Пипкин, А.С. Пересада // Мед. новости. - 2008. - №7. - С.12-19. 152. Юсупов, Р.М. Телемедицина. Новые информационные технологии на пороге XXI века. / Под редакцией Р.М. Юсупова, Р.И. Полонникова. - СПб.: "Анатолия", 1998. - 489 с. 153. Aherne, W.A. Morphometry / W.A. Aherne, M.S. Dunnil. - London: Edward Arnold, 1982. - 205 p. 154. Adams, C.S. The fate of the terminally differentiated chondrocyte: evidence for microenvironmental regulation of chondrocyte apoptosis / C.S. Adams, I.M. Shapiro // Critical Reviews in Oral Biology and Medicine. – 2002. - Vol. 13(6). P. 465-73. 155. Almonte-Becerril, M. Cell death of chondrocytes is a combination between apoptosis and autophagy during the pathogenesis of osteoarthritis within an experimental model / M. Almonte-Becerril, F. Navarro-Garcia, A. Gonzalez-Robles // Apoptosis. – 2010. – Vol. 15. – N 5. – P. 631– 638. 156. Alsalameh, S. Identification of mesenchymal progenitor cells in normal and osteoarthritic human articular cartilage/ S. Alsalameh, R. Amin, T. Gemba, M. Lotz // Arthritis Rheum. – 2004. - Vol.50. – Р. 1522–32. 157. Altman, R.D. The syndrome of osteoarthritis. / R.D. Altman // Rheumatol. - 1997. - Vol.24. – Р. 766-767. 287 158. Archer, C.W. Phenotypic modulation in sub-populations of human articular chondrocytes in vitro / C.W. Archer, J. McDowell, M.T. Bayliss, M.D. Stephens, G..Bently // Cell Sci. - 1990. - Vol. 97. – Р. 361–70. 159. Archer, C.W. The Cellular basis of joint formation: Internat. Conf. “Mechanisms of devel op. ontogenetic and phul ogen. Aspects” / C.W. Archer // Ontogenez. - 1994. - Vol. 25. - №4. - Р. 14. 160. Beresford, W.A. Cartilage. “Chondroid Bone, Seconodary Cartilage, and Metaplasia” / W.A. Beresford // The Quartely Review of Biology. – 1981. - Vol.56. №4. P. 471. 161. Blanco, F.J. Measurement of depth-dependence and anisotropy of ultrasound speed of bovine articular cartilage in vitro / F.J. Blanco, R. Guitian, E. Vaguez-Martul, F.J. De Toro, F. Galdo // Ultrasound Med Biol. - 2004. Vol.30. – Р. 953–961. 162. Blanco, F.J. Mitochondrial dysfunction in osteoarthritis / F.J. Blanco, M.J. López-Armada, E. Maneiro // Mitochondrion. – 2004. - Sep;4(5-6). – Р. 715-28. 163. Boehringer, R. Информацион. технологии. - 2005. – Режим доступа: http://filebox.vt.edu/users/rboehrin/Introduction/StereologyGlossary.htm. 30 Oct 164. Brommer, H. Functional adaptation of articular cartilage from birth to maturity under the influence of loading: a biomechanical analysis / Н. Brommer, Р.А. Brama, M.S. Laasanen, H.J. Helminen, P.R. van Weeren, J.S. Jurvelin // Equine Vet J. 2005. - Mar;37(2). – Р. 148-54. 165. Buckwalter, J.A. Articular Cartilage: Degeneration and osteoarthritis, repair, regeneration, and transplantation / J.A. Buckwalter, H.J. Mankin // Instr Course Lect. - 1998. - Vol.47. - Р. 487-504. 166. Buckwalter, J.A. Structural changes in reassembled growth plate aggregates / J.A. Buckwalter, L. Rosenbrg // J Orthop Res. – 1986. – 4(1). – Р. 1-9. 167. Cai, G. The effect of tibial diaphyseal lengthening on the longitudinal growth of the tibia / G. Cai, L. Yang, M. Saleh, L. Coulton // J. Pediatr. Orthop. B. – 2007. - Vol.6. - Р. 403-407. 288 168. Cancedda, F.D. Hyprlophic chondrocytes undergo further differentiation in culture / F.D. Cancedda, C. Gentili, P. Manduca, R. Cancedda // J. Cell Biol. – 1992. – Vol.117. - №2. – Р. 427-435. 169. Candolin, T. Surface Changes in the Articular Cartilage of Rabbit Knee during Immobilization. A Scanning Electron Microscopic Study of Experimental Osteoarthritis / T. Candolin, T. Videman // Acta path. microbiol. scand. sect. Pathology. - 1980. - Vol. 88. - Р. 291-297. 170. Caplan, A. I. Cartilage / A.I. Caplan // J. “Sci. Amer.” - 1984. - Vol. 251. №4. - C. 82-90. 171. Caplan, A.I. Overview: Principles of cartilage repair and regeneration / A.I. Caplan, M. Elyaderani, Y. Mochizuki, S. Wakitani, V.M. Goldberg // Clin. Orthop. 1997. - Vol. 342. - Р. 254-269. 172. Caterson, B. Monoclonal antibodies as probes for determining the microheterogeneity of the linc proteins of cartilage proteoglycan / B. Caterson, J.R. Baker, J.E. Christner, Y. Lee, M. Lentz // J. Biol. Chem. – 1985. - Vol. 260(20). - Р. 11348-56. 173. Cao, E.X. Dendritic cells of synovium in Experimental model of osteoarthritis of rabbits / E.X. Cao, Y. Meng, H. Qi, Y. Du, G. Xu, J.Z. Bi // Cell Physiol. Biochem. - 2012.- V.30.- P.23-32. 174. Cheung, H.S. Phosphocitrate blocks nitric oxideinduced calcification of cartilage and chondrocyte-derived apoptotic bodies / H.S. Cheung, L.M. Ryan // Osteoarthrit. And Cartilage. – 1999. - Vol. 7. - №4. - Р. 409-412. 175. Clarke, I.C. Articular cartilage: a review and scanning electron microscope study. I. The interterritorial fibrillar architec ture / I.C. Clarke // J. Bone Jt. Surg. - 1971. - Vol. 53-B. - №3. - Р. 732-750. 176. Clark, J.M. The organization of collagen fibrils in the superficial zone of articular cartilage / J.M. Clark // J. Anatomy. - 1990. - V.171. - P. 117-130. 177. Cohen, H. Storing live embryonic and adult human cartilage grafts for transplantation using a joint simulating device / Cohen Нan, Robinson Dror, Cohen Nir, Nevo Zvi // Biomaterials. – 2000. – Vol. 21. - № 21. – Р. 2117-2123. 289 178. Comacho, N.P. Mendelsohn R. FTIR microscopic imaging of collagen and proteoglycan in bovine cartilage / N.P. Comacho, P. West, P.A. Torzilli // Biopolymers (Biospectroscopy) – 2001. - Vol.62. – Р. 1–8. 179. Crelin, E.S. Mitosis of chondrocytes induced in the knee joint articular cartilage of adult rabbits / E.S. Crelin, W.О. Southwick // JOURNAL OF BIOLOGY AND MEDICINE - 1960. - V.33, December. - P. 243-245. 180. Darling, E.M. Rapid phenotypic changes in passaged articular chondrocyte subpopulations / E.M. Darling, K.A. Athanasiou // J Orthop Res. – 2005. - Vol.23. Р. 425–32. 181. Di Micco, M.A. Integrative articular cartilage repair: dependence on developmental stage and collagen metabolism / M.A. Di Micco, S.N. Waters, W.H. Akeson, R.L. Sah // Osteoarthritis Cartilage. – 2002. - № 10. – Р. 218-225. 182. Dounchis, J.S. Cartilage repair with autogenic perichondrium cell and polylactic acid grafts / J.S. Dounchis // Clin. Orthoped. Rel. Res. – 2001. - № 377. - Р. 248-266. 183. Driscoll, S.W. The role periosteum in cartilage repair / S.W. Driscoll, J.S. Fitzsimmons // Clin Orthop. Relat Res. – 2001. - Vol. 391. - Р. 190-207. 184. Eckstein, F. In vivo morphometry and functional analysis of human articular cartilage with quantitative magnetic resonance imaging--from image to data, from data to theory / F.Eckstein, M. Reiser, K.H. Englmeier, R. Putz // Anat Embryol (Berl). – 2001. - Mar;203 (3). – Р. 147-73. 185. Elder, S.H. Effect of compressive loading on chondrocyte differentiation in agarose cultures of chick limb-bud cells / S.H. Elder, J.H. Kimura, L.J. Soslowsky, M. Lavagnino, S.A. Goldstein // J Orthop Res. – 2000. - №18. – Р. 78-86. 186. Eyre, D.R. Articular cartilage and changes in Arthritis: Collagen of articular cartilage / D.R. Eyre // Arthritis Res. – 2002. - Vol. 4(1). - Р. 30–35. 187. Edwards, G.O. Modelling condensation and initiation of chondrogenesis in chick wing bud mesenchymal cells levitated in an ultrasound trap. / G.O. Edwards, W.T. Coakley, J.R. Ralphs, C.W. Archer // European Cells and Materials. - 2010. Vol.14. – Р.1-12. 290 188. Findlay, D.M. Vascular pathology and osteoarthritis / D.M. Findlay // Rheumatology. - 2007. - Vol. 46 - №12 - P. 1763–1768. 189. Fink, B. The effect of tibial lengthening using the Ilizarov method on the cartilage and the menisci of the knee joint / B. Fink, G. Schwinger, J. Singer, M. Sager, C. Wilke, S. Braunstein // J Orthop Res. – 2001 - Jul;19(4). - Р. 665-670. 190. Furukawa Katsuko, S. Rapid and large – scale formation of chondrocyte aggregates by rotational culture / Furukawa Katsuko S., Suenaga Hideyuki, Toita Kenshi, Numata Akiko, Tanaka Juzo, Ushida Takashi, Sakai Yasuyuki, Tateishi Tetsuya // Cell Transplant. – 2003. - Vol. 12. - №5. – P. 475-479. 191. Gang, C. Тhe effect of diaphyseal lengthening on the tibial growth plate / C. Gang, L. Coulton, Y. Lang, M.Saleh // J Bone Joint Surg Br. – 2005 – P. 87:316 192. Ghosh, P. Vascular mechanisms in osteoarthritis. Best Practice and Research / P. Ghosh, P.A. Cheras // Clinical Rheumatology. - 2001. - Vol. 15. № 5. - Р. 693–709. 193. Gilles, L.G.F. The surface lamina of the articular cartilage of human zygpophyseal joints / L.G.F. Gilles // The Anatomical Record. - 1991. - V.233. Is3. - P. 350-356. 194. Gilmore Ruth, S.C. A histological study of human femoral condular articular cartilage / S.C. Gilmore Ruth, A.J. Palfrey // J. Anat. – 1987. - Vol. 155. – Р. 77-85. 195. Gilmore Ruth, S.C. Chondrocyte distribution in the cartilage of human femoral condules / S.C. Gilmore Ruth, A.J. Palfrey // J. Anat. – 1988. – Vol. 157. – Р. 23-31. 196. Goldring, M.B. Update on the biology of the chondrocyte and new approaches to treating cartilage diseases / M.B. Goldring // Best Pract Res Clin Rheumatol. – 2006. - Vol.20. – Р. 1003–25. 197. Goranov, N.V. Experimental osteoarthritis models in veterinary medicine – relevance, potential and challenges / M.B. Goldring // Bulgarian J. of Veterinary medicine. – 2011. Vol.14. № 4 – Р. 191−200. 291 198. Grogan, S.P. Joint aging and chondrocyte cell death / S.P. Grogan, D.D. D’Lima // Int J Clin Rheumtol. – 2010. - April; 5(2). – Р. 199–214. 199. Guilak, F. Zonal uniformity in mechanical properties of the chondrocyte pericellular matrix: micropipette aspiration of canine chondrons isolated by cartilage homogenization / F. Guilak, L.G. Alexopoulos, M.A. Haidar, H.P. Ting-Beall, L.A. Setton // Annals of Biomedical Engineering. - 2005. - Vol.33. – Р. 1312–1318. 200. Gwynn, A.P. Freeze substitution of rabbit tibial articular cartilage revelas that radial zone collagen fibres are tubules / A.P. Gwynn, S. Wade, M.J. Kaab, G.R.H. Owen, R.G. Richards // J. Microscopy. – 2000. - Vol. 197(2). – Р. 159-172. 201. Hamerman, D. The biologi of osteoarthritis / D. Hamerman, M. Schubert // N. Engl J. Med. – 1989. – Vol. 320(20). - Р. 1322-30. 202. Hashimoto, S. Chondrocyte-derived apoptotic bodies and calcification of articular cartilage / S. Hashimoto, R.L. Ochs, F. Rosen // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. - V. 95. N 6. - P. 3094-3099. 203. Haeghen, Y.V. Consistent Cutaneous Imaging with Commercial Digital Cameras / Y.V. Haeghen, J.M. Naeyaert // Arch. Dermatol. - 2006 - V. 142, №1. - Р. 42-46. 204. Herzenberg, J.E. Knee range of motion in isolated femoral lengthening / J.E. Herzenberg, L.L. Scheufele, D. Paley, R. Bechtel, S. Tepper // Clin Orthop Relat Res. – 1994. - Apr;(301). - Р. 49-54. 205. Hesse, J. Zur Regenerations fahig keit von Gelenkknorpel / J. Hesse // Anat. Anz. – 1989. – Vol. 168. №1. - Р.64. 206. Hudelmaier, M. Age-related changes in the morphology and deformational behavior of knee joint cartilage / M. Hudelmaier, C. Glaser, J. Hohe, K.H. Englmeier, M. Reiser, R. Putz, F. Eckstein // Arthritis Rheum. – 2001. - №44(11). – Р. 2556-61. 207. Hudelmaier, M. Correlation of knee-joint cartilage morphology with muscle cross-sectional areas vs. anthropometric variables / M. Hudelmaier, C. Glaser, K.H. Englmeier, M. Reiser, R. Putz, F. Eckstein// Anat Rec A Discov Mol Cell Evol Biol. – 2003. - Feb;270(2). - Р. 175-84. 292 208. Hunziker, E.B. Quantitative structural organization of normal adult human articular cartilage / E.B. Hunziker, T.M. Quinn, H-J. Hauselmann // Osteoarthritis and Cartilage. - 2002.- V. 10.- P. 564–572. 209. Ischikawa, Y. Effects of calcitonin and parathyroid hormone on calcification of primary cultures of chicken growth plate chondrocytes / Y. Ischikawa, L.N.Y. Wu, B.R. Genge // J Bone Miher Res. – 1997. – №12(3). – P. 356. 210. Kapitonova, M.Y. Ultrastructural characteristics of synovial effusion cells in some arthropathies / M.Y. Kapitonova, M. Othman // Malays J. Pathology. - 2004. №2 – Р. 73-87. 211. Kawcak, C.E. The role of subchondral bone in joint disease: A review / C.E. Kawcak, C.W. McIlwraith, R.W. Norrdin, R.D. Park, S.D. James // Equine Vet. J. - 2001. - Vol.33. – Р. 120-126. 212. Krenn, V. Synovitis score: discrimination between chronic low-grade and high-grade synovitis / V. Krenn, L. Morawietz, G-R. Burmester, R.W. Kinne, U. Mueller-Ladner, B. Muller, T. Haupl // Histopathology. - 2006. - Vol. 49. Р. 358–364. 213. Kusuzaki, К. Acridine orange induces binucleation in chondrocytes / K. Kusuzaki, H. Takeshita, H. Murata, S. Hashiguchi, T. Nozaki, K. Emoto, T. Ashihara and Y. Hirasawa // Osteoarthritis and Cartilage. - 2001. – Vol. 9. Issue 2. February. – P. 147-151. 214. Lambert, G.M. Collagenous network in cartilage of human femoral condyles. A light microscopic and scanning electron study / G.M. Lambert, R.S.B. Liem, P. Havinga, G. Boering, J. Korst // Acta Anat. – 1986. – Vol. 126. – Р. 41-47. 215. Lajeunesse, D. The role of bone in the treatment of osteoarthritis / D. Lajeunesse // Osteoarthritis Cartilage. – 2004. - Vol.12. – Р. 34-38. 216. Lietman, S.A. The Temporal Sequence of Spontaneous Repair of Osteochondral Defects in the Knees of Rabbits is Dependent on the Geometry of the Defect / S.A. Lietman, S. Miyamoto, P.R. Brown, N. Inoue, A.H. Reddi // J. Bone Joint Surg. Br. - 2002. - Vol. 84. № 4. - P. 600-606. 217. Little, C.B. Animal models of osteoarthritis / C.B. Little, M.M. Smith // Current Rheumatology Reviews. - 2008. - №4.- Р. 1-8. 293 218. Lucchinetti, E. Cartilage viability after repetitive loading: a preliminary report / E. Lucchinetti, C.S. Adams, W.E. Jr. Horton, P.A. Torzilli // Osteoarthritis and Cartilage. – 2002. - Vol.10(1). Р. 71-81. 219. Ljung, A. Characterisation of cell in regenerating cartilage from autotransplantated perichondrium. Immunohistochemical expression of smooth-muscle achtin, desmin, vimentin and Ki-76 / A. Ljung, L. Ohlsen, B. Widenfalk, B. Gerdin // Scand. J. Plast Reconstr. Surg. Hand Surg. - 1999. - Vol. 33. - №3. - Р. 257-266. 220. Mainil-Varlet, P. Histological Assessment of Cartilage Repair : A Report by the Histology Endpoint Committee of the International Cartilage Repair Society (ICRS) / P. Mainil-Varlet, T. Aigner, M. Brittberg, P. Bullough, A. Hollander, E. Hunziker, R. Kandel, S. Nehrer, K. Pritzker, S. Roberts, E. Stauffer // J Bone Joint Surg Am. – 2003. - Apr 01;85(suppl 2). Р. 45-57. 221. Maffulli, N. Changes in knee motion following femoral and tibial lengthening using the Ilizarov apparatus: a cohort study / N. Maffulli, U. Nele, L. Matarazzo // J Orthop Sci. – 2001. - Vol. 6(4). – Р. 333-338. 222. Matsui, H. Cartilage and subchondral bone interaction in osteoarthrosis of human knee joint: a histological and histomorphometric study / H. Matsui, M. Shimizu, H. Tsuji // Microsc. Res. Tech. — 1997. - V37. — Р.333-42. 223. Mankin, H.J. Localization of Tritiated Thymidine in Articular Cartilage of Rabbits / H.J. Mankin // J Bone Joint Surg Am. - 1963. - Vol.45. - Р. 529-540. 224. Mankin, H.I. Biochemical and metabolic abnormalities in articular cartilage from osteoarthritic human hips. III. Distribution and metabolism of amino sugarcontaining macromolecules / H.I. Mankin, M.E. Johnson, L. Lippiello // J. Bone Joint Surg Am. - 1981. - Vol. 63(1). - Р. 131-139. 225. Mankin, H.J. The response of articular cartilage to mechanical injury / H.J. Mankin // J Bone Joint Surg. – 1982. - 64A. - Р. 460-466. 226. Maroudas, A. Further studies on the composition of human femoral head cartilage / A. Maroudas, M. Bayliss, M.F. Venn // Ann. Rheum. Dis. - 1980. - Vol. 39. №5. - P. 514-523. 294 227. Martha, L.G. Growth of Cartilage In Vitro: The Role of Mechanical Factors / L.G. Martha, J.W. Kieckhefer, G.A. Minerva // J. Rehab. Res. Develop. – 1991. – №28. - I. – 63-64. 228. Mitchell, N. The resurfacing of abult rabbit articular cartilage by multiple perforations through the subchondral bone / N. Mitchell, N. Shepard // J. Bone Joint Surg Am. – 1976. - Vol. 58(2). – P. 230-233. 229. Meaney, M.F. Increased accuracy and precision in screening for urinary mucopolysaccharides / M.F. Meaney // N. Z. J. Med. Lab. Technol. - 1974. - Vol.28. (2). - P. 29-34. 230. Mohr, W. On the morphology of normal joint cartilage / W. Mohr // J. Clin. Chem and Clin. Biochem. - 1986. - Vol. 24. – Р. 915-918. 231. Mrosek, E.H. Subchondral bone trauma causes cartilage matrix degeneration: an immunohistochemical analysis in a canine model / E.H. Mrosek, A. Lahm, C. Erggelet, M. Uhl, H. Kurz, B. Eissner, J.C. Schagemann // Osteoarthritis Cartilage. – 2006. - Feb;14(2). - Р. 171-8. 232. Nakamura, E. Knee articular cartilage injury in leg lengthening. Histological studies in rabbits / E. Nakamura, H. Mizuta, A. Sei, K. Takagi // Acta Orthop Scand. – 1993. - Aug;64(4). - Р. 437-440. 233. Nakamura, E. Knee cartilage injury after tibial lengthening. Radiographic and histological studies in rabbits after 3-6 months / E. Nakamura, H. Mizuta, K. Takagi // Acta Orthop Scand. – 1995. - Aug;66(4). – Р. 313-316. 234. Newman, A.P. Articular Cartilage Repair. Current concept / A.P. Newman //American J. of Sports Med. – 1998. - 26(2). – P. 309-324. 235. Nishimura, K. Chondroprogenitor cells of synovial tissue / K. Nishimura, L.A. Solchaga, A.I. Caplan, J.U. Yoo, V.M. Goldberg, B. Johnstone // Arthritis Rheum. – 1999. - Vol. 42. - Р. 2631-2637. 236. Notoya, K. The Induction of Cell Death in Human Osteoarthritis Chondrocytes by Nitric Oxide Is Related to the Production of Prostaglandin E2 Via the Induction of Cyclooxygenase-2 / K. Notoya, D.V. Jovanovic, P. Reboul, J. Martel- 295 Pelletier, F. Mineau, J.P. Pelletier // The Journal of Immunology. – 2000. - Vol. 165. №6. Р. 3402-3410. 237. Ochi, M. Articular cartilage repair using tissue engeneering technigue – novel approach with minimallu invasive procedure / M. Ochi et al. // Artig. - 2004. V28. №1. - P. 28-32. 238. Oreffo, R.O.C. Future potential for using osteogenic stem cells and biomaterials in orthopedics / R.O.C. Oreffo, J.T. Triffitt // Bone. - 1999. - V.25. №2. P. 5-9. 239. Pacifici, M. Mechanisms of synovial joint and articular cartilage formation: recent advances, but many lingering mysteries / М. Pacifici, Е. Koyama, М. Iwamoto // Birth Defects Res C Embryo Today. – 2005. - Sep;75(3). - Р. 237-48. 240. Palmoski, M.J. Effects of static and cyclic compressive loading on articular cartilage plugs in vitro / M.J. Palmoski, K.D. Brandt // Arthr. Rheum. - 1984. - Vol. 27(6) - Р. 675-681. 241. Pastoureau, P.C. Cartilage, bone and synovial histomorphometry in animal models of osteoarthritis. / Р.С. Pastoureau, Е.В. Hunziker, J.P.Pelletier // Osteoarthritis Cartilage. – 2010. - Oct;18 - S.106-12. 242. Paukkonen, K. Morphometry of Articular Cartilage: A Stereological Method Using Light Microscopy / K. Paukkonen, K. Selkainaho, J. Jurvelin, J. Helminen Heikki // The Anatomical Record. – 1984. - Vol. 210. - №4. – Р. 675-682. 243. Paukkonen, K. Rough endoplasmic reticulum and fine intracytoplasmic filaments in articular cartilage chondrocytes of young rabbits; a stereological morphometric study transmission electron microscopy / K. Paukkonen, J. Helminen Heikki // J. Anat. - 1987. - Vol. 152. - Р. 47-54. 244. Pelletier, J.P. Osteoarthritis, an inflammatory disease: potential implication for the selection of new therapeutic targets / J.P. Pelletier, J. Martel- Pelletier, S.B. Abramson //Arthritic Rheum. - 2001.- V.44.- P.1237-1247. 245. Pilin, A. Changes in colour of different human tissues as a marker of age / A. Pilin, А. Pudil, V. Bencko // Int. J. Legal Med. - 2007. - Vol. (2). – Р. 158-162. 296 246. Poole, A.R. Composition and structure of articular cartilage: a template for tissue repair / A.R. Poole, T. Kojima, T. Yasuda, F. Mwale, M. Kobayashi, S. Laverty // Clin Orthop Relat Res. – 2001. – 391 Suppl. - S26–33. 247. Poole, A. Articular cartilage chondrons: form, function and failure / A Poole, C. Review. // J Anat. – 1997. - July; 191. - (Pt 1). - Р. 1–13. 248. Pritzker, K.P.H. Osteoarthritis cartilage histopathology: grading and staging / K.P.H. Pritzker, S. Gay, S.A. Jimenez, K. Ostergaard, J.P. Pelletier, P.A. Revell, D. Salter, F.R.C. Path, W.B. Berg // Osteoarthritis and Cartilage. - 2006. Vol.14 - Р. 13-29. 249. Quinn, T.M. Variation of cell and matrix morphologies in articular cartilage among locations in the adult human knee / Т.М. Quinn, Е.В. Hunziker, H.J. Häuselmann// Osteoarthritis Cartilage. – 2005. - Aug;13(8). – Р. 672-8. 250. Roach, H.I. Osteogenic differentiation of hypertrophic chondrocytes involves asymmetric cell divisions and apoptosis / H.I. Roach, J. Erenpreisa, T. Aigner // J. Cell. Biol. - 1995. - Vol. 131. - № 2. - Р. 483 - 494. 251. Roach, H.I. Chondroptosis: a variant of apoptotic cell death in chondrocytes? / H.I. Roach, T. Aigner, J.B. KouriRoach HI, Aigner T, Kouri JB. // Apoptosis. – 2004. - May;9(3). - Р. 265-77. 252. Rodrigo, J.J. Effects of human knee synovial fluid on chondrogenesis in vitro / J.J. Rodrigo, J.R. Steadman, G. Syftestad, H. Benton, J.G. Silliman // Am. J. Knee Surg. - 1995. Vol.8. – Р. 124–129. 253. Sandell, L.J. Articular cartilage and changes in arthritis. An introduction: cell biology of osteoarthritis / L.J. Sandell, T. Aigner // Arthritis research. - 2001. - V.3. №2. - Р. 342-347. 254. Shapiro, F. Cell origin and differentiation in repair of full thickness defects of articular cartilage / F. Shapiro, S. Koid, M.J. Glimcher // J. Bone Joint Surg. – 1993. Vol. 75A. - Р. 532-553. 255. Sellam, J. The role of synovitis in pathophysiology and clinical symptoms of osteoarthritis / J. Sellam, F. Berenbaum // Nature Reviews Rheumatology. - 2010. Vol.6 - Р. 625-635. 297 256. Stanescu, R. Homozygous achondroplasia: morphologic and biochemical study of cartilage / R. Stanescu, V. Stanescu, P. Maroteaux // Am. J. Med. Genet. 1990. - Vol. 37. - № 3. - P. 412-421. 257. Stanitski, D.F. The effect of limb lengthening on articular cartilage. An experimental study / D.F. Stanitski // Clin Orthop Relat Res. – 1994. - Apr;(301). - Р. 68-72. 258. Stanitski, D.F. The effect of femoral lengthening on knee articular cartilage: the role of apparatus extension across the joint / D.F. Stanitski, K. Rossman, M. Torosian // J Pediatr Orthop. – 1996. - Mar-Apr;16(2). - Р. 151-154. 259. Steen, H. Biomechanical factors in the metaphyseal- and diaphyseallengthening osteotomy. An experimental and theoretic analysis in the ovine tibia / H. Steen, T.O. Fjeld, J.A. Miller, P. Ludvigsen // Clin Orthop Relat Res. – 1990. - Vol. 259. – Р. 282-94. 260. Stockwell, R.A. Glycosaminoglycan content and cell density rabbit articular cartilage in experimental lipoarthrosis / R.A. Stockwell, R. Sprinz, // J. Anat. – 1981. – Vol. 133(2). – P. 309-315. 261. Stott, N. Successive formative stages of precarilaginous mesenchymal condensations in vitro / N. Stott, T.-X. Susan Jiang, C.M. Chuong // J. Cell. Physiol. – 1999. – Vol. 180. - №3. - Р. 314-324. 262. Su San Mok. Aggrecan Synthesized by Mature Bovine Chondrocytes Suspended / Su San Mok, Koichi Masuda, J. Hans Häuselmann, В. Margaret Aydelotte, J.-М. Eugene, А. Thonar // Alginate Journal of Biological Chemistry. – 1994. - Vol. 269. - №. 52. - Р. 33021-33027. 263. Takahashi, I. Agerelated changes in the expression of gelatinase and tissue inhibitor of metalloproteinase genes in mandibular condylar, growth plate, and articular cartilage in rats / I. Takahashi, K. Onodera, J.W. Bae // J. Mol. Histology. - 2005. Vol.5. - Р. 355-366. 264. Tagil, M. Cartilage induction by controlled mechanical stimulation in vivo / M. Tagil, P. Aspenberg // J Orthop Res. – 1999. - Vol.17. – Р. 200-204. 298 265. Tammi, M. Proteoglycan alterations in rabbit knee articular cartilage following physical exercise and immobilization / M. Tammi, A.M. Saamanen, A. Jauhiainen // Connect. Tiss. Res. - 1983. - Vol. 11. - Р. 45-55. 266. Teshima, R. Immunohistochemical collagen analysis of the most superficial layer in adult articular cartilage / R. Teshima, M. Ono, Y. Yamashita // J. Orthop. Sci. - 2004. - V.9(3). - P. 270-273. 267. Tiwari, N. Imaging of normal and pathologic joint synovium using nonlinear optical microscopy as a potential diagnostic tool / N. Tiwari, S. Chabra, S. Mehdi, P. Sweet, T.B. Krasieva, R. Pool, B. Andrews, G.M. Peavy // J. of Biomed. Optics. - 2010. - Vol. 15. - №5. - P. 056001- 10. 268. Trias, A. Effect of peristent pressure on the articular cartilage / A. Trias // Journal Bone a Jt. Surg. - 1971. - Vol.2. - Р. 376-386. 269. Troyer, H. The effect of short-term immobilization on the rabbit knee joint cartilage / H. Troyer // Clin. Orthop. – 1975. - №107. – Р. 249 – 257. 270. Ts’ao, C.-H. Myointimal cells as a possible source of replacement for endothelial cells in the rabbit / C.-H. Ts’ao // Circulation Research. – 1968. - Vol.23. Р. 671-682. 271. Vignon, E. Microdurimetric and biochemical studi of human articular cartilage. Comparison of different joints / E.Vignon, M. Arlot, D. Hartman, D. Noyer // Rev Rhum Mal Osteoartic. - 1980. - Vol.47(12). - P. 715-718. 272. Watt, I. Arthritis. Radiologic and pathologo-anatomical comparisons / I. Watt // Eur. Radiol. - 2000. - 10 (Suppl.2) - P.297-311. 273. Wayne, J.S. Long-term survival of regenerated cartilage on a large joint surface / J.S. Wayne, C.L. McDowell, M.C. Willis // Journal of Rehabilitation Research and Development – 2001. - Vol.38. - №2, March/April http://www.vard.org/jour/01/38/2/wayne382.htm 274. Wang, D.W. Influence of oxygen on the proliferation and metabolism of adipose derived abult stem cells / D.W. Wang, B. Fermor, J.M. Gimble, H.A. Awad, F. Guilak // J Cell Physiol. – 2005. – V. 204(1). – P. 184-191. 299 275. Wang, L. Effects of ageing on the biomechanical properties of rat articular cartilage / L. Wang, D.N. Kalu, J. Banu et al. // Proc. Inst. Mech. Eng. - 2006. - V. 220. №4. - P. 573-578. 276. Wezeman, F.H. Introdurton to histology and nisteehemistm of cartilage Historical and contemporary aspects jf cartilage derelopment and structure / F.H. Wezeman // Microsc. Res. And Techn.- 1998.- Vol.43. - №2. - Р. 89-90. 277. Wiltberger, H. Ultrastructure of canine articular cartilage: comparison of normal and degenerative (osteoarthritic) hip joints / H. Wiltberger, G. Lust // Am. I. Vet. Res. - 1975. - Vol.365. - Р. 727-740. 278. Wong, M. Zone-specific cell biosynthetic activity in mature bovine articular cartilage: a new method using confocal microscopy stereology and quantitative autoradiography / M. Wong, P. Wuethrich, P. Eggli, E. Hunziker // J Orthop Res. – 1996. - Vol.14. – Р. 424–32. 279. Yang, L. Knee joint reaction force during tibial diaphyseal lengthening: a study on a rabbit model / L. Yang, G. Cai, L. Coulton, M. Saleh // J Biomech. – 2004. Jul;37(7). - Р. 1053-1059. 280. Yoshioka, Chihiro. Electron microscopic observations on the fate of hypertrophic chondrocytes in condylar cartilage of rat mandible / Yoshioka, Chihiro, Yagi Toshio // J. Craniofacial Gen. And Dev. Biol. – 1988. – Vol. 8. - №3. - P. 253-264. 281. Zhang, X. Estimation of saturated pixel values in digital color imaging / X. Zhang, D.H. Brainard // J. Opt. Soc. Am. A. Opt. Image Sci. Vis. - 2004.- V. 21, №12.P. 2301–2310. 282. Zuscik, M.J. Regulation of chondrogenesis and chondrocyte differentiation by stress / M.J. Zuscik, M.J. Hilton, X. Zhang, Di Chen, R.J. Keefe // J Clin Invest. – 2008. - Vol.118(2). – Р. 429–438. 300 Приложение. Таблица 1 - Сводные данные о контрольной серии (интактные собаки) №п.п 1 2 3 4 5 6 7 № собаки 5006 5304 5001 1407 5009 5606 5023 Возраст 1,5-2 года 1,5-2 года 1,5-2 года 1,5-2 года 1,5-2 года 1,5-2 года 1,5-2 года Таблица 2 - Сводные данные по изучению гистоморфометрических характеристик суставного хряща интактных собак в разные возрастные периоды №п.п 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 № собаки 4175 4176 1390 1391 4172 4173 4241 4201 4200 5221 5234 4236 4245 4256 4268 4267 4307 4202 Возраст 2 месяца 2 месяца 2 месяца 2 месяца 4 месяца 4 месяца 4 месяца 4 месяца 6 месяцев 6 месяцев 10 месяцев 10 месяцев 10 месяцев 10 месяцев 5 лет 5 лет 8 лет 8 лет 301 Таблица 3 - Сводные данные об экспериментах по изучению структурной реорганизации суставного хряща при моделировании остеоартроза в эксперименте №п.п № собаки 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 4779 4797 4684 4785 4806 4265 4717 4732 4793 4869 4868 4641 4763 5164 4724 4849 5026 5129 5227 4840 Период иммобилизации (сутки) 28 28 28 28 28 40 40 40 28 28 28 28 28 28 28 28 28 28 28 28 Период после окончания иммобилизации 14 суток 14 суток 14 суток 28 суток 28 суток 28 суток 90 суток 90 суток 1 год 1 год 1 год 3 года 302 Таблица 4 - Сводные данные об экспериментах по изучению структурной реорганизации суставного хряща при диафизарном удлинении голени с различной дробностью дистракции в ручном режиме №п.п 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 № собаки Сроки этапов эксперимента Дистракция Фиксация Без аппарата 1 мм за 4 приема с 8.00 до 20.00 – ручные подкрутки 4734 28 4634 28 4732 28 4826 28 4786 28 4666 28 4226 28 35 4336 28 30 4859 28 30 4568 28 30 4530 28 30 4760 28 30 4551 28 30 28 4405 28 30 30 4284 28 30 33 4286 28 30 32 4510 28 30 30 2466 28 30 30 1 мм за 8 приемов с 8.00 до 20.00 – ручные подкрутки 2182 28 0919 28 1004 28 0923 28 30 0942 28 30 1106 28 30 1032 28 30 2160 28 30 30 1037 28 30 32 0932 28 30 30 303 Таблица 5 - Сводные данные об экспериментах по изучению структурной реорганизации суставного хряща при диафизарном удлинении голени с темпом 1 мм за 60 приемов (автодистракция), осуществляемом в дневное и ночное время №п.п № собаки Сроки этапов эксперимента Дистракция Фиксация Без аппарата Автодистракция 1 мм за 60 приемов в дневное время с 8.00 до 20.00 1 2084 28 2 2418 28 3 2516 28 4 2211 28 5 1208 28 6 5505 28 30 7 5605 28 30 8 2096 28 30 9 1352 28 30 30 10 5507 28 30 30 11 2128 28 30 30 12 2133 28 30 30 Автодистракция 1 мм за 60 приемов в ночное время с 20.00 до 8.00 1 2077Д 28 2 2073Д 28 3 2205Д 28 4 2048Д 28 5 2061Ф 28 30 6 2003Ф 28 30 7 2210Ф 28 30 8 1380БА 28 30 30 9 2156БА 28 30 30 10 2139БА 28 30 30 304 Таблица 6 - Сводные данные об экспериментах по изучению структурной реорганизации суставного хряща при диафизарном удлинении голени с темпом 3 мм за 120 и 180 приемов (автодистракция) №п.п 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 1 2 3 4 5 6 7 8 9 № собаки Сроки этапов эксперимента Дистракция Фиксация Без аппарата 3 мм за 120 приемов круглосуточно - автодистракция 5102 10 5071 10 5270 10 4994 10 5049 10 5266 10 5103 10 5019 10 30 4976 10 30 4933 10 28 5089 10 30 30 4979 10 30 32 4921 10 30 30 4969 10 30 30 3 мм за 180 приемов круглосуточно - автодистракция 2570 10 2630 10 2581 10 2599 10 30 2564 10 31 2543 10 31 2494 10 32 30 2320 10 30 30 2643 10 31 30 Таблица 7 - Сводные данные об экспериментах по изучению структурной реорганизации суставного хряща при метадиафизарном удлинении голени с темпом 1 мм за 4 приема №п.п № собаки 1 2 3 4 5 6 5027 5128 5143 5075 5076 5151 Сроки этапов эксперимента Дистракция Фиксация Без аппарата 28 28 28 28 35 30 28 30 30 28 35 30 305 Таблица 8 - Выявление различий между параметрами серий «1/4» и «1/8» (р – значение) Параметры Дистракция Фиксация Без аппарата I II III I II III I II III VVch NAch Sch 0,081 0,0073 0,0075 0,0061 0,0091 0,0091 0,011 0,03 0,0076 0,00063 0,0075 0,0034 5,73Е-05 0,54 0,11 4,56Е-05 0,007 0,09 0,0083 0,00022 0,0069 2Е-06 0,0028 0,27 0,00038 0,00081 0,21 h 3Е-11 0,01716 5,63Е-09 Примечание: I – поверхностная, II – промежуточная, III – глубокая зоны хряща. Для параметра h хряща использовали критерий Стьюдента, для параметров VVch, NAch, Sch – критерий Вилкоксона. Жирным шрифтом выделены недостоверные отличия при р>0,05. Таблица 9 - Выявление различий между параметрами серий «1/4» и «1/60» (р – значение) Параметры Дистракция Фиксация Без аппарата I II III I II III I II III VVch NAch Sch h 0,0094 0,0047 0,0098 0,0145 0,037 0,035 0,0148 0,00057 0,55 0,0041 0,043 0,044 2,12Е-05 0,0093 0,013 3,33Е-05 0,047 0,0163 0,191 7,8Е-06 0,019 4,33Е-05 0,00061 0,0232 1,71Е-06 6,7Е-06 0,073 2,16Е-08 0,001337 7,33Е-08 Примечание: I – поверхностная, II – промежуточная, III – глубокая зоны хряща. Для параметра h хряща использовали критерий Стьюдента, для параметров VVch, NAch, Sch – критерий Вилкоксона. Жирным шрифтом выделены недостоверные отличия при р>0,05. Таблица 10 - Выявление различий между параметрами серий «1/4» и «3/180» (р – значение) Параметры Дистракция Фиксация Без аппарата I II III I II III I II III VVch NAch Sch h 0,01904 8,71Е-05 0,0024 0,00043 0,04732 0,002191 0,01697 0,0321 0,00809 0,0124 0,00677 0,00075 1,08Е-06 0,005151 0,00797 0,00865 0,01204 0,0192 0,00035 0,4724 0,0082 2,65Е-05 0,217 0,6894 0,0627 0,00988 0,0045 1,58Е-07 0,4345 9,84Е-06 Примечание: I – поверхностная, II – промежуточная, III – глубокая зоны хряща. Для параметра h хряща использовали критерий Стьюдента, для параметров VVch, NAch, Sch – критерий Вилкоксона. Жирным шрифтом выделены недостоверные отличия при р>0,05. 306 Таблица 11 - Выявление различий между параметрами серий «1/8» и «1/60» (р – значение) Параметры Дистракция Фиксация Без аппарата I II III I II III I II III VVch (%,М m) 0,0099 0,042 0,98 0,041 0,016 0,47 0,184 0,613 0,989 NAch (M m) 0,62 0,0091 0,65 0,0088 0,0021 0,035 0,0088 0,112 0,337 Sch (M m) 0,021 0,00022 0,91 0,43 0,11 0,51 0,316 0,039 0,561 h (мкм, M m) 0,4042 2,48Е-07 0,0303 Примечание: I – поверхностная, II – промежуточная, III – глубокая зоны хряща. Для параметра h хряща использовали критерий Стьюдента, для параметров VVch, NAch, Sch – критерий Вилкоксона. Жирным шрифтом выделены недостоверные отличия при р>0,05. Таблица 12 - Выявление различий между параметрами серий «1/8» и «3/180» (р – значение) Параметры Дистракция Фиксация Без аппарата I II III I II III I II III VVch NAch Sch 0,1606 0,00104 0,00122 0,0066 3,91Е-06 2,79Е-05 0,6466 0,3663 0,7175 0,194618 0,6718 0,0004427 0,00723 0,00138 0,0445 0,002121 0,01175 0,023601 2,099Е-05 0,00065 0,5823 0,8309 0,0422 0,0391 0,002218 0,01149 0,00947 h 0,4012 0,1109 2,97Е-07 Примечание: I – поверхностная, II – промежуточная, III – глубокая зоны хряща. Для параметра h хряща использовали критерий Стьюдента, для параметров VVch, NAch, Sch – критерий Вилкоксона. Жирным шрифтом выделены недостоверные отличия при р>0,05. Таблица 13 - Выявление различий между параметрами серий «1/60» и «3/180» (р – значение) Параметры Дистракция Фиксация Без аппарата I II III I II III I II III VVch NAch Sch 0,0593 2,138Е-05 0,000686 0,9649 0,001164 0,011229 0,00349 0,06092 0,0074 0,3791 0,4695 0,00584 0,9293 0,63362 0,33066 0,01992 0,00279 9,92Е-05 0,00801 6,25Е-07 0,2184 0,5483 0,00318 0,0402 1,86Е-07 2Е-07 0,00293 h 0,3934 0,04494 5,56Е-06 Примечание: I – поверхностная, II – промежуточная, III – глубокая зоны хряща. Для параметра h хряща использовали критерий Стьюдента, для параметров VVch, NAch, Sch – критерий Вилкоксона. Жирным шрифтом выделены недостоверные отличия при р>0,05. 307 Д28 – дистракция 28 суток, БА30 – без аппарата 30 суток. Рис.1. Толщина (мкм) суставного хряща мыщелков бедра на этапах эксперимента. А Б Рис.2. Численная (А) и объемная, в % (Б) плотности хондроцитов суставного хряща мыщелков бедра на этапах эксперимента. 308 Рис.3. Содержание серы (вес.%) в суставном хряще мыщелков бедра на этапах эксперимента. А Б Рис.4. Количество изогенных групп (А) и пустых лакун (Б) в суставном хряще мыщелков бедра на этапах эксперимента, в %. 309 Таблица 14 - Качественные характеристики суставного хряща мыщелков бедра на этапах эксперимента Базофильная линия (БЛ) Хондроциты (Хц) Межклеточное вещество (МКВ) Суставная поверхность Харак теристи ки Интактный хрящ 2 года 5 лет Не разволокне на Разволокнена Гомогенно во всех зонах, интенсивн ость ШИКреакции и реакции на сГАГ увеличива лась от ПЗ к ГЗ. Хц во всех зонах имели нормально е строение. Демаскировка коллагеновых волокон в ПЗ. Реакция на сГАГ существенно ослаблена. Очаговоая МТХ и ШИК-реакция. Незначительное уменьшение толщины хряща. Основная часть ХЦ в состоянии деструкции, особенно в ПрЗ. Нарушение цитоархитектони ки ГЗ. Не нарушена, имела четкие контуры. Контуры БЛ не четкие, проникновение сосудов в хрящ. МОА Разволокнена, очаги разволокнения захватывали ПрЗ. Дефекты поверхности с потерей матрикса в поверхностной зоне. Нарушена гомогенность МКВ ПЗ. Реакция на сГАГ существенно ослаблена. Существенно снижена толщина хряща. Основная часть Хц в состоянии гибели и деструкции. Увеличение пустых лакун, изогенных групп. Нарушение цитоархитектоник и ГЗ. Неравномерное окрашивание, фрагментация, проникновение костномозгового паннуса. Удлинение. 30 суток без аппарата 1 мм за 4 приема 1 мм за 60 приемов Сохранялись Очаги очаги разволокнения разволокнения. отсутствовали. Нарушена гомогенность МКВ ПЗ. Толщина хряща не достигала интактной нормы. Восстановлена гомогенность МКВ ПЗ, увеличение интенсивности реакции на сГАГ. Увеличение толщины хряща до интактной нормы. Увеличивалось число секреторноактивных клеток, которые характеризовал ись выраженной гипертрофией. Восстановление цитоархитектон ики ГЗ. В ПЗ клеточная плотность повышена. В ПрЗ и ГЗ наряду с функционально активными клетками отмечены Хц в состоянии деструкции, пустые лакуны. В части наблюдений восстановлена цитоархитектоник а ГЗ. Контуры БЛ не Целостность четкие, БЛ не проникновения нарушена. сосудов в хрящ не выявлено. Обозначения: ПЗ – поверхностная зона, ПрЗ – средняя зона, ГЗ – глубокая зона, МОА – модель остеоартроза, сГАГ – сульфатированные гликозаминогликаны.
