специфические антитела в препаратах крови, обработанных
advertisement
На правах рукописи АТАНГУЛОВА РАМИЛЯ ГАЙСАРОВНА СПЕЦИФИЧЕСКИЕ АНТИТЕЛА В ПРЕПАРАТАХ КРОВИ, ОБРАБОТАННЫХ КРИОРАДИАЦИОННЫМ МЕТОДОМ 14.00.36 - аллергология и иммунология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Уфа 2004 Работа выполнена в лаборатории препаратов крови филиала ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ «Иммунопрепарат» Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Нигматуллин Тимирбек Газизович Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Маннапова Рамзия Тимергалиевна доктор медицинских наук Азнабаева Лилия Фаритовна Ведущее учреждение: Казанская государственная медицинская академия Защита диссертации состоится 2004 г. на заседании Регионального диссертационного совета КМ 002.124.01. при Президиуме Академии наук Республики Башкортостан по адресу: 450014, г. Уфа, ул. Новороссийская, 105. С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке филиала ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ «Иммунопрепарат» по адресу: 450014, г. Уфа, ул. Новороссийская, 105, Автореферат разослан Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук 2004 года К. А. Лукманова ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Применение в клинической практике иммунных препаратов направленного действия в настоящее время становится основным этапом развития трансфузиологии и службы крови [В. А. Пшеничное,1992; Е . В . Селиванов, 1999; В. В. Анастасиев, 2000]. Увеличение объема выпуска препаратов крови достигается главным образом за счёт увеличения объема перерабатываемого сырья, роста трудовых и "материальных затрат и в значительно меньшей степени за счет совершенствования технологического процесса, повышения качества готовой продукции [В.Н. Шабалин, 1982]. Разработка и совершенствование технологий производства высокоэффективных препаратов из плазмы донорской крови, обеспечивающих, вирусную безопасность и сохранение биологической активности является актуальной задачей [В. Horovitz. 1988, 1993; Т. Novak, 1992; F. Gao, 1993; D. Josic et al.,.1997; X. Шторх, 1997; M.M. Алсынбаев и др., 1998; Ю.Л. Тюрикова, 1999; Н.В.Зубкова и др., 2001, 2002]. Одним из перспективных методов обеспечения вирусной безопасности донорской плазмы крови и ее препаратов считается способ криорадиационной обработки с программируемым замораживанием [Патент РФ 2000109454/13]. Данная работа является. фрагментом исследований, проведенных подпрограмме Международного, научно-технического центра и Консорциума наук о плазме (США) «Разработка метода и основ технологии инактивации вирусов путем радиационной обработки программно-замороженных препаратов крови» Влияние гамма-облучения с программируемым замораживанием на структуру и свойства белков более подробно освещено в исследованиях донорской плазмы крови и ее препаратов: альбумина, концентрата фактора VIII, человеческого лейкоцитарного интерферона [ А Х Купцов, В.И. Трофимов и др., 1985; Т.Г. Нигматуллин и др., 1995; В.Ф. Кулагин и др., 1995; В.И. Трофимов, 1995]. В работах Р.Ф. Шангареевой с соавт. (2001) были определены основные подходы для отработки режима гамма-облучения, позволяющие сохранить нативность и физико-химические свойства белков плазмы крови. Было показано, что замораживание плазмы по специальной программе до температуры (-78) С с последующей радиационной обработкой в дозах 35 и 50 кГр, обеспечивающих надежную инактивацию всех возможных вирусов-контаминантов. не приводит к значительным изменениям ее основных альбумина, иммуноглобулинов G и А, церулоплазмина, липопротеидов высокой и низкой плотности. Установлено, что оптимальной дозой криорадиационной обработки плазмы донорской крови, при которой происходит наименьшее изменение основного белкового состава, является доза 35 кГр. Таким образом, влияние криорадиационной обработки на белковый состав донорской плазмы в основном изучен. Тем не менее, иммунобиологические свойства иммуноглобулина G после криорадиационной обработки оставались не исследованными. Препараты иммуноглобулинов из крови человека и животных широко используются в медицине. Действующим началом препаратов иммуноглобулинов являются специфические антитела. Поэтому изучение влияния криорадиационной обработки на титры специфических антител, а также физико-химические свойства препаратов иммуноглобулинов представляет значительный , научный и практический интерес. Цель исследования. Оценить влияние криорадиационной обработки донорской плазмы крови и препаратов иммуноглобулинов на иммунобиологические свойства антител lgG класса. Задачи исследования. 1. Изучить влияние криорадиационной обработки в дозах 5-50 кГр на титры антител к вирусным и бактериальным антигенам в донорской плазме крови и препаратах иммуноглобулинов человека нормального и специфических. 2. Определить влияние криорадиационной обработки на протективные вируснейтрализующие титры антител в реакции биологической, нейтрализации на животных (in vivo). 3. Исследовать функциональные свойства авидность и аффинность специфических антител в донорcкой плазме и препаратах иммуноглобулинов, обработанных криорадиационным методом 4. Изучить влияние различных доз криорадиационной обработки на основные физико-химические свойства препаратов иммуноглобулинов 5. Установить оптимальные дозы криорадиационной обработки, при которых физико-химические свойства молекул IgG соответствуют критериям качества препаратов иммуноглобулинов для внутримышечного применения Научная новизна. Впервые: - установлено, что в результате криорадиационной обработки плазмы донорской крови и препаратов иммуноглобулинов в дозах 5-50. кГр статистически достоверно и дозозависимо повышаются (в 1.2-4.6 .раза) титры специфических антител к ряду вирусных и бактериальных антигенов; -показано, что в, результате криорадиационной обработки происходит повышение (в 1,3-4,6 раза) вируснейтрализующих титров антирабических антител в реакции биологической нейтрализации на животных; -выявлена тенденция к повышению авидности и аффинности антител в донорской плазме и препаратах иммуноглобулинов, обработанных криорадиационным методом, установлена сильная корреляция между относительной аффинностью и титрами антител (к вирусу ГЛПС и коклюшному токсину); - обнаружена корреляционная зависимость между содержанием димеров в препаратах иммуноглобулина человека нормального и титрами антител к вирусу клещевого энцефалита; -установлено, что криорадиационная обработка не приводит к значительным изменениям молекулярных параметров препаратов иммуноглобулинов, выходящих за пределы требований к качеству иммуноглобулинов для внутримышечного применения. Научно-практическая значимость работы. По материалам исследования получена приоритетная справка №2003123647 на изобретение «Способ повышения специфической активности антител IgG класса». Полученные результаты являются основой для создания технологии, направленной на повышение специфической активности препаратов иммуноглобулинов и антитоксических сывороток в производстве соответствующих препаратов крови. Установленная высокая корреляция между аффинностью и титрами антител позволяют рекомендовать метод криорадиационной обработки для повышения функциональной активности антител с дальнейшим использованием в качестве иммунохимических реагентов дианостических тест-систем, а также для производства специфических иммуноглобулинов, применяемых по жизненным показаниям. Результаты проведенного исследования могут служить основанием для предложения практических рекомендаций при использовании метода криорадиационной инактивации вирусов готовых препаратов иммуноглобулинов и методов контроля возможных изменений антител в процессе инактивации вирусов. Основные положения, выносимые на защиту. 1. Криорадиационная обработка донорской плазмы й~ препаратов иммуноглобулинов в дозах 5-50 кГр сопровождается повышением титров антител к ряду вирусных и бактериальных антигенов (в 1,2-4,6 раза), при этом уровень повышения титров антител коррелирует с дозой гамма-облучения. 2. Криорадиационная обработка препаратов антирабического иммуноглобулина в дозах 5-50 кГр приводит к повышению (в 1,3-4,6 раза) протективных вируснейтрализующих титров антирабических антител. 3. Молекулярные параметры препаратов иммуноглобулинов, обработанных криорадиационным методом, соответствуют требованиям, предъявляемым к качеству иммуноглобулинов для внутримышечного применения. Повышенный уровень титров специфических антител в процессе хранения после криорадиационной обработки сохраняется в течение 1,5 лет (срок Наблюдения). Апробация работы. Основные результаты исследований были представлены на IV международном съезде по радиационным исследованиям (Москва, .2001), 7-ой Пущинской школе-конференции молоды ученых (Пущино, 2003), Всероссийской научной конференции, посвященной 105-летию Пермского НПО «Биомед» (Пермь, 2003), научно-практической конференции «Биохимия:'от исследования молекулярных механизмов - до "внедрения в клиническую практику и производство» (Оренбург, 2003), II конкурсе научных работ молодых ученых и аспирантов АН РБ и УНЦ РАН (Уфа, 2003), Ученых Советах ГУП «ИммунопрепараТ» (Уфа, 2003, 2004). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 научных статей, принята заявка на изобретение Федеральным Институтом Патентной Собственности. Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных йсследований (5 глав), заключения и выводов. Материал изложен на 139 страницахдекста, содержит 20 рисунков и 23 - таблицы. Библиографический список включает 229 источников (87 отечественных и 142 иностранных). МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ При выполнении работы использовали плазму донорской крови, полученную в донорском пункте ГУП «Иммунопрепарат». Применяли как плазму отдельных доноров (от 23 доноров), так'и объединенную донорскую плазму крови от 100-300 доноров (10 партий) Также исследовали 36 серий препаратов иммуноглобулинов: иммуноглобулины человека нормального и специфические (антирабический лошадиный, антистафилококковый, против вируса клещевого энцефалита, анти-ГЛПС, антицитомегаловирусный) производства ГУП «Иммунопрепарат» и антирабический лошадиный иммуноглобулин производства ЗАО «Биолек» (г. Харьков, Украина) Образцы плазмы крови объемом 300-400 мл в гемаконах и препараты иммуноглобулинов в пластиковых пробирках объемом 1-5 мл замораживали со скоростью (0,2-2,0) °С/мин до температуры не менее (-78) °С. Для замораживания образцов применяли низкотемпературные морозильные камеры MDF-792 (Япония) и сухой лед Контролем служили образцы, замороженные до температуры (-78) °С, но не подвергавшиеся радиационному воздействию. Далее осуществляли обработку замороженных образцов гамма-излучением в дозах 5, 15, 25, 35 и 50 кГр. Гамма-облучение замороженных образцов донорской плазмы крови и препаратов иммуноглобулинов проводили на изотопной установке РЦ-100М с мощностью поглощенной дозы 60110 Гр/мин в НТЦ «Лекбиотех» (г. Москва). Для обеспечения гаммаобработки объектов в установке использовали изотоп 60Со. Размораживание образцов осуществляли в термостатах с водой при температуре (37±1) °С до температуры 10 °С. Антитела IgG класса к цитомегаловирусу, вирусам бешенства, ГЛПС, гепатита А, В, кори, паротита, клещевого энцефалита, микобактериям туберкулеза, экзотоксину коклюшного микроба в донорской плазме крови и препаратах иммуноглобулинов исследовали методом непрямого твердофазного иммуноферментного анализа. Результаты иммуноферментного анализа регистрировали с помощью спектрофотометра «DYNATECH MR 5000» (Швеция), измеряя оптическую плотность при длине волны 450 и 490 нм. Применяли коммерческие тест-системы фирм ТОО Биотехнологическая компания «Биосервис» (г. Москва), тест-системы ЗАО «ВекторБест», (г. Новосибирск), тест-системы для выявления антирабических антител (ВНИВИ, г. Казань), тест-системы для выявления антител к экзотоксину коклюшного микроба производства ГУП «Иммунопрепарат» (ФС 42-3711-99), а также экспериментальную тест-систему для выявления антител против нуклеокапсидного антигена вируса ГЛПС (ГУП «Иммунопрепарат»). Оценку специфической активности антистафилококкового иммуноглобулина производили путем определения антиальфастафилолизина в реакции нейтрализации гемолитических свойств стафилококкового альфатоксина специфическими антителами согласно «Методическим указаниям по определению антиальфастафилолизина в сывороточных препаратах крови человека и животных» (Москва, 1984). Протективную активность антирабического лошадиного иммуноглобулина изучали согласно ФС .42-412ВС-93 в реакции биологической нейтрализации на белых лабораторных мышах. Для опытов использовали 1270 белых мышей, массой (11+2) г, полученных из питомника лабораторных животных ГУП «Иммунопрепарат». Применяли вирус бешенства (штамм CVS) с предварительно установленной дозой, предоставленный цехом культуральной антирабической вакцины ГУП «Иммунопрепарат». Исследуемые образцы и стандартный образец антирабического иммуноглобулина разводили физиологическим раствором 1:250, 1:1250, 1:6250, 1:31250, разливали в пробирки по 1 мл. В каждую пробирку добавляли по 1 мл разведенного вируса содержащего вирус в пределах (100-1000) LD50. Все пробы выдерживали в течение 1 часа при. температуре 37 °С. Затем содержимое из каждой пробирки вводили по 0,03 мл интрацеребрально мышам, на каждое разведение использовали 5 мышей. Наблюдение за животными вели в течение 14 суток. Мышей, погибших в течение первых 5 суток, из опыта исключали. Анализ результатов и расчет титра иммуноглобулина проводили по методу Reed и Muench [Методы исследований по бешенству, ВОЗ, 1975]. Исследование авидности донорской плазмы и препаратов иммуноглобулина проводили методом иммуноферментного анализа с использованием мочевины. Для проведения анализа применяли коммерческую иммуноферментную тест-систему для определения низкоавидных антител к цитомегаловирусной инфекции «ЦМВДиагност» (ТОО Биотехнологическая компания «Биосервис» г. Москва). Индекс авидности (ИА) антител рассчитывали по следующей формуле и выражали в процентах: ОП в лунках, не обработанных мочевиной где ОП - оптическая плотность исследуемого образца при длине волны 490 им. Вычисление относительной аффинной величины RHAV (Relative High Affinity Vallue) в донорской плазме и препаратах иммуноглобулина проводили также в иммуноферментном анализе по методу R.W. Luxton и E.J. Tomphson, (1990). Метод заключается в применении в твердофазном иммуноферментном анализе по определению титров антител IgG класса тиоцианата натрия (NaSCN). Особенностью этого анализа является внесение в лунки после удаления исследуемых образцов растворов NaSCN возрастающей концентрации. Этот реагент, изменяя рН и ионную силу, разрушает комплекс антиген-антитело. Затем с помощью коньюгата проявляли реакцию и вычисляли значение RHAV по формуле: где А1-А4 - процент антител, оставшихся в лунках после внесения соответствующей концентрации NaSCN (рассчитали относительно контрольной лунки, куда NaSCN не вносили), а цифры соответствуют концентрации NaSCN. Определение молекулярного состава проводили методом гельпроникающей жидкостной хроматографии низкого давления согласно методике, изложенной в ФС-42-3874-99 «Физико-химические, химические, физические и иммунохимические методы контроля медицинских иммунобиологических препаратов». В этих целях использовали автоматическую- систему фирмы «LKB-Фармация» (Швеция). Препараты иммуноглобулинов наносили на хроматографическую колонку размером 25X1000 мм. В качестве носителя использовали ультрагель АсА-34. Для исследования электрофоретической картины иммуноглобулинов G использовали метод диск-электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГе) в денатурирующих условиях [Л.А. Остерман, 1981] на аппарате для вертикального электрофореза фирмы «LKBФармация» (Швеция). Электрофорез препаратов иммуноглобулинов на пленках из ацетата целлюлозы проводили на оборудовании НТЦ «Астра» (г. Уфа) с последующей обработкой полученных данных компьютерной программой. Для статистической обработки результатов исследований применяли стандартный пакет прикладных статистических программ «Statistica 5.7», «Excel 4.0». Вычисляли средние значения со стандартным отклонением (M±SD), средние величины сравнивали с использованием t-критерия Стьюдента. На диаграммах значения контроля принимали за «0». Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез считали равным 0,05. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Первоначальные исследования показали, что после криорадиационной обработки донорской плазмы и препаратов иммуноглобулинов в дозах 35 и 50 кГр титры антител к вирусам бешенства, гепатита А, цитомегаловирусу, экзотоксину коклюшного микроба повысились в значительной степени. индивидуальная плазма объединенная плазма Рисунок 1. Влияние криорадиационной обработки на титры антицитомегаловирусных антител в индивидуальной плазме, объединенной плазме и препаратах иммуноглобулина человека нормального (* - Р<0,05). Как следует из рисунка 1, наибольшее повышение титров антицитомегаловирусных антител происходит в индивидуальной донорской плазме на 362-402 %, затем в объединенной донорской плазме На 114-204 % и в препаратах иммуноглобулина человека нормального на 135-154 % по сравнению с контролем. v o . в дальнейшем для более детального изучения этого явления применили криорадиационную обработку в диапазоне доз облучения от 5 до 50 кГр. В результате установили достоверное повышение титров антител при всех испытанных дозах облучения к цитомегаловирусу, вирусам бешенства, гепатита А, клещевого энцефалита, ГЛПС, паротита, кори, а также микобактериям туберкулеза и экзотоксину коклюшного микроба Рисунок 2. Влияние криорадиационной обработки на титры антител к вирусу гепатита А в индивидуальной плазме, объединенной плазме и препаратах иммуноглобулина человека нормального (Р<0,05) Как видно из рисунка 2, повышение титров антител к вирусу гепатита А происходит при всех дозах облучения в индивидуальной, объединенной плазме и препаратах иммуноглобулинов. Увеличение титров специфических антител наблюдали в различной степени: в большей степени в индивидуальной донорской плазме и в меньшей степени в объединенной донорской плазме и препаратах иммуноглобулина. В то же время увеличение титров антител в препаратах иммуноглобулина человека нормального более значительно, чем в специфических препаратах иммуноглобулина. Так, в результате криорадиационной обработки препаратов антицитомегаловирусного иммуноглобулина повышение антицитомегаловирусных антител отметили на 53-88 %, а в препаратах иммуноглобулина человека нормального на 36-154 %. Титры антител к вирусу клещевого энцефалита в препаратах специфического противоклещевого иммуноглобулина в результате криорадиационной обработки изменились незначительно в пределах от (-13) до (+9) %, тогда как в препаратах иммуноглобулина человека нормального повысились на 19-154 %. Титры антител к вирусу ГЛПС в анти ГЛПС-иммуноглобулине повысились всего на 5-33 %. Увеличение титров антител к микобактериям туберкулеза в препаратах иммуноглобулина человека нормального отметили на 48-166 %, к вирусу кори на 5-56 %, а к вирусу паротита на 17-87 %. Повышение титров антител к вирусу гепатита А в индивидуальной донорской плазме происходит на 21-236 %, в объединенной донорской плазме на 25-57 %, а в препаратах иммуноглобулина человека нормального на 28-88 %. При сравнении исходных титров исследуемых образцов отметили, что повышение титров специфических антител зависит от исходного уровня антител: чем ниже титр антител исследуемого образца, тем большее повышение титров антител после криорадиационной обработки наблюдается. С целью подтверждения зависимости титров антител при криорадиационной обработке от исходного уровня антител в исследуемом образце, провели обработку индивидуальной донорской плазмы с исходным низким, средним и высоким титром антицитомегаловирусных антител. Полученные данные показали, что в индивидуальной плазме с исходным высоким уровнем антител изменения были практически не существенны в пределах от (-4,5) до (+7,9) %, а в индивидуальной плазме с исходным средним и низким титром антител повышение было в значительной степени (Р<0,05). Наибольшее повышение титров антител наблюдали в индивидуальной донорской плазме с исходным низким титром антител от 11 до 134%. Анализ повышения титров специфических антител в результате криорадиационной обработки показал корреляционную зависимость от дозы гамма-облучения. Коэффициент корреляции Пирсона (г), определяющий связь между дозой облучения и титрами антител к цитомегаловирусу, вирусам гепатита А, кори, паротита, клещевого энцефалита, ГЛПС, микобактериям туберкулеза и экзотоксину коклюшного микроба составил более 0,9 при уровне вероятности Р<0,05, то есть является достоверным. Рисунок 3. Влияние дозы облучения на титры антител к вирусу гепатита А в индивидуальной плазме Как следует из рисунка 3, повышение титров антител к вирусу гепатита А в индивидуальной плазме имеет линейную зависимость «доза-эффект» (г=0,92 при Р<0,01). Криорадиационная обработка препаратов иммуноглобулина человека нормального показала отсутствие значительных изменений титров антител к вирусу краснухи. Незначительно изменились также титры антител к вирусу гепатита В в индивидуальной и объединенной донорской плазме. В объединенной донорской плазме с исходным высоким титром антител к вирусу гепатита В и препаратах иммуноглобулина при дозах облучения 5-25 кГр отклонения от контроля были незначительные, однако при дозах 35 и 50 кГр отметили значительное понижение титров антител на 38-49 %. Титры антистафилококковых антител в препаратах иммуноглобулина человека нормального и препаратах антистафилококкового иммуноглобулина после криорадиационной обработки практически не изменились. Следовательно, в результате криорадиационной обработки повышение титров специфических антител происходит в зависимости от специфичности антител: к определенным антигенам отмечали значительное повышение титров антител, а к другим - повышения титров антител не отмечали, что, вероятно, связано с иммунохимическими свойствами антител. Одним из критериев оценки протективных свойств препаратов иммуноглобулинов является определение уровня нейтрализующих антител. Поэтому для подтверждения данных, полученных методом иммуноферментного анализа (таблица 1), изучили титры нейтрализующих антител. Протективную активность препаратов иммуноглобулина исследовали в реакции биологической нейтрализации вируса бешенства антирабическим иммуноглобулином (таблица 2). Таблица 1 Титры специфических антител в препаратах антирабического иммуноглобулина, обработанных криорадиационным методом Как следует из таблицы 2, титры протективных нейтрализующих антирабических антител повысились после криорадиационной обработки в 1,3-4,6 раза. Наибольшее повышение титров антирабических антител происходит при дозе 35 кГр. Таким образом, в результате криорадиационной обработки значительно повышаются титры вируснейтрализующих антирабических антител. В литературе встречаются сообщения о подобном повышении титров антител в результате физического воздействия. Так, воздействие ультрафиолетового света на плазму усиливает протективную активность естественных антиэндотоксиновых антител при перитонитах [А.В. Аполлонии и др., 1994]. При ультрафиолетовом облучении плазмы происходит повышение титров антиэритроцитарных антител в 1,6-2,1 раза, титров антистафилококковых антител IgG класса в 2-16 раз и IgM антител в 2-4 раза [К.А. Самойлова и др., 1986]. Изучили также влияние криорадиационной обработки на титры специфических антител при хранении. Исследования показали, что после хранения при температуре (-78) 'С в течение 6, 9 и 18 месяцев повышенные титры антител к цитомегаловирусу в донорской плазме и препаратах иммуноглобулинов существенно не изменились. Проведение теста на ускоренное старение в отношении препаратов иммуноглобулинов (37 'С, 4 недели) по Европейской Фармакопее (2000) также подтвердило, что повышенный уровень титров антител к вирусам гепатита А, клещевого энцефалита, кори и микобактериям туберкулеза сохраняется, а наблюдаемые изменения не превышают 17 %. Титры антистафилококковых антител в препаратах иммуноглобулина человека нормального и антистафилококкового иммуноглобулина после криорадиационной обработки при хранении 6 мес. при температуре (6±4) 'С практически не изменились. Как свидетельствуют литературные данные, повышение нейтрализующих титров антител происходит вследствие повышения аффинности или авидности антител [Р.В. Петров и др., 1997, E.D. Getzoff et al., 1988, J. Drescher и R. Aron, 1999; W.P. Yang et al., 1995, H. Rollag, 1998; S. Romero-Steiner et al., 1999]. Поэтому следующим этапом исследований было изучение функциональных свойств антител авидности и аффинности. Полученные результаты представлены в таблицах 3, 4 и 5. Таблица 3 Относительная аффинная величина (RHAV) lgG-антителк экзотоксину коклюшного микроба в индивидуальной донорской плазме Результаты опытов показали тенденцию к увеличению индекса авидности и относительной аффинной величины специфических антител после криорадиационной обработки донорской плазмы и препаратов иммуноглобулинов. Как следует из таблиц 3 и 4, повышение аффинности противококлюшных антитоксических антител и антиГЛПС-антител происходит при всех дозах облучения. Кроме того, выявили достоверную высокую корреляционную связь между относительной аффинностью антител к вирусу ГЛПС (г=0,99 при Р<0,01), коклюшному экзотоксину (г=0,91 при Р<0,01) и титрами соответствующих антител. Таблица 5 Индекс авидности анти-ЦМВ-антител в препарате антицитомегаловирусного иммуноглобулина «Меговир» Как следует из таблицы 5, индекс авидности высокоавидного антицитомегаловирусного препарата «Меговир» повысился при дозах 5 и 15 кГр; а при дозах 25, 35 и 50 кГр понизился.Корреляцию между относительной аффинностью и титром антител не выявили. Проведенные исследования позволяют предположить, что одним из механизмов увеличения титров специфических антител при криорадиационной обработке является повышение аффинности этих антител. Вероятно, повышение аффинности зависит от изначального состояния антител (уровня аффинности) в препаратах иммуноглобулинов или донорской плазме. Изменение аффинности антител является причиной повышения силы связывания антитела с антигеном и, как следствие, наблюдается повышение титра антител. То есть высоко реагирующие в ИФА образцы донорской плазмы или препаратов иммуноглобулинов по сравнению со слабо реагирующими, содержат более аффинные антитела. Криорадиационная обработка, по-видимому, не влияет в значительной степени на повышение титров высокоавидных специфических препаратов иммуноглобулинов, поскольку они содержат более аффинные антитела. Из данных литературы известно, что специфические антитела имеют определенный «порог авидности», и дальнейшее увеличение авидности не." приводит к заметным улучшениям защитных функций [J. Foote, 1995; М. Bachmann, 1997; W. Usinger, 1999], что подтверждается нашими исследованиями. Наши исследования по аффинности антител согласуются также с экспериментальными данными; полученными в результате химических модификаций моноклональных антител. В работах Я.И. Мельниковой с соавт. (1997, 2000) было показано/что разные концентрации органического растворителя по-разному действуют на аффинность антител. Некоторые* концентрации' приводят к увеличению антигенсвязывающей активности антител, причем, максимальное увеличение происходит именно с менее аффинным антителом Все эти изменения авторы связывали с тонкими конформационными изменениями отдельных участков антител. Вероятно такие же изменения происходят при криорадиационной обработке донорской плазмы и препаратов иммуноглобулина Дальнейшие исследования заключались в изучении влияния криорадиационной обработки на физико-химические свойства препаратов иммуноглобулинов. Молекулярные параметры препаратов иммуноглобулинов после криорадиационной обработки определили методом гель-фильтрации на ультрагеле АсА34. Результаты представлены в таблицах 6 и 7. Как следует из таблиц 6 и 7, во всех препаратах происходит увеличение содержания димеров. Анализ, полученных данных, показывает сильную корреляционную связь между уровнем антител к вирусу клещевого энцефалита и содержанием димеров в препаратах иммуноглобулина человека нормального (г=0,81; Р<0,05). Следовательно, причиной повышения титров некоторых специфических антител после криорадиационной обработки может быть димеризация антител. Известно, что димеризация моновалентных антительных фрагментов увеличивает, примерно в 100 раз, константы ассоциации для взаимодействия с поливалентными антигенами [P. Jekel et al., 1996]. С увеличением дозы облучения йаблюдали тенденцию к снижению количества мономерных форм. Увеличение содержания агрегатов наблюдали во всех препаратах иммуноглобулинов, но в пределах требований ФС-42-3874-99 (менее 10 %). Незначительная агрегация молекул IgG (до 3 %) после криорадиационйой обработки подтверждается и опытами, проведенными с использованием коммерческих иммуноглобулинов на жидкостном хроматографе высокого давления HPLC. Согласно требованиям ФС-42-3874-99, основная фракция мономеров вместе с димерами должна составлять не менее 85 %, полимеров не более 10 %, фрагментов не более 5 % от общего содержания белка в препарате. Следует отметить, что все указанные изменения молекулярных параметров иммуноглобулинов после криорадиационной обработки находятся в допустимых пределах, предъявляемых Фармакопейной статьей к качеству внутримышечных иммуноглобулинов. Следовательно, изменения молекулярных параметров препаратов иммуноглобулинов, обработанных криорадиационным методом в дозах 5,15,25, 35 и 50 кГр не являются существенными. Анализ электрофоретических данных препаратов иммуноглобулина методом диск-электрофореза в ПААГе не выявил значительных изменений. Полосы облученного иммуноглобулина соответствуют фракциям контрольного необлученного иммуноглобулина, и только " фракции иммуноглобулина, обработанных в дозах З5'и 50 кГр имеют более размытый вид. Как следует из таблицы 8, при электрофоретическом разделении на ацетат-Целлюлозных пластинах с увеличением дозы облучения происходит уменьшение содержания у-фракции препаратов иммуноглобулина, эти изменения носили статистически значимый характер при дозах 25, 35 и 50 кГр. По требованиям Фармакопейной статьи, содержание у-фракции должно быть не менее 97 % Общего белка. Следовательно, дозы 35 и 50 кГр более значительно влияют на содержание у-фракции препаратов иммуноглобулина а дозы 5-25-кГр являются оптимальными дозами криорадиационной обработки препаратов иммуноглобулинов Полученные нами данные, при изучении различными методами исследований (гель-хроматография, диск-электрофорез, электрофорез на ацетат-целлюлозных пластинах) свидетельствуют об отсутствии значительных изменений в конформационной структуре молекулы иммуноглобулинам препаратах иммуноглобулинов после криорадиационной обработки. Ранее в исследованиях Р.Ф. Шангареевой с соавт. (2001, 2002) было показано, что криорадиационная обработка дозами 35 и 50 кГр не оказывает значительных изменений на конформационную структуру молекулы иммуноглобулина G в донорской плазме. По данным А.Х. Купцова, В.И. Трофимова (1985) при криорадиационной обработке в дозах 35 и 50 кГр не происходит заметного нарушения молекулярной структуры альбумина.-Подобное суждение может быть верным и для молекулы IgG. Тем не менее, некоторые изменения при больших дозах облучения (35 и 50 кГр), в частности снижение содержания у-фракции и более значительное понижение титров антител к вирусу гепатита В (38-49 %) позволяют предположить, что при этих дозах происходит частичная денатурация молекулы IgG в препаратах иммуноглобулина. Таким образом, для повышения титров специфических антител целесообразно проводить криорадиационную обработку донорской плазмы, но не готовых препаратов иммуноглобулинов. Как правило, эффекты модификации структуры белков с помощью химических агентов или физических факторов представляют собой частичную или полную потерю биологической активности. Литературные данные об активации функциональных свойств белковых молекул ограничены, неизвестны иммунохимические характеристики специфических антител [М. Steward et al., 1991; D. Chargeleque, 1995]. Поэтому объем имеющихся на сегодня данных о механизмах конформационных перестроек в иммуноглобулинах, не позволяет полностью объяснить результаты наших исследований, и выяснение механизмов повышения титров антител требует дальнейших более углубленных исследований. Полученные результаты позволяют заключить, что при криорадиационной обработке донорской плазмы и препаратов иммуноглобулинов происходит значительное повышение титров специфических антител к цитомегаловирусу, к вирусам гепатита А, ГЛПС, бешенства, клещевого энцефалита, кори, паротита, микобактериям туберкулеза и коклюшному экзотоксину. При этом изученные дозы криорадиационной обработки не влияют в значительной степени на молекулярные параметры препаратов иммуноглобулинов. ВЫВОДЫ 1. 2. 3. 4. 5. 6. Криорадиационная обработка донорской плазмы и препаратов иммуноглобулинов в дозах 5-50 кГр приводит к значительному (в 1,2-4,6 раза) повышению титров антител к ряду изученных вирусных и бактериальных антигенов. Изменения титров антител зависят от дозы облучения, исходного уровня антител и специфичности антител. На модели препаратов антирабического лошадиного иммуноглобулина в реакции биологической нейтрализации показано, что после криорадиационной обработки значительно повышаются титры протективных вируснейтрализующих антител (в 1,3-4,6 раза). Криорадиационная обработка сопровождается повышением индекса авидности и относительной аффинности антител. Молекулярные параметры препаратов иммуноглобулинов после криорадиационной обработки в дозах 5-50 • кГр соответствуют требованиям Фармакопейной статьи к качеству иммуноглобулинов для внутримышечного применения. Оптимальными дозами криорадиационной обработки препаратов иммуноглобулинов для повышения титров специфических антител являются дозы 5-25 кГр. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1: Атангулова Р.Г, Алсынбаев М.М , 'Нигматуллин Т.Г., Исрафилов А.Г., Трофимов В.И, Хубатуллин Р.Г. Титр антител к цитомегаловирусу в донорской плазме после криорадиационной обработки. IV съезд по-радиационным-исследованиям // Тез. докл-М., 2001.-т.1 (секции I-V).-C.154. 2. Хубатуллин Р.Г, Алсынбаев М.М., Нигматуллин Т.Г., Трофимов В.И., Исрафилов А.Г., Атангулова Р.Г., Парамонов Д.В. Изучение сохранности иммуноглобулинов G и А* в плазме крови человека, подвергнутой обработке криорадиационным методом. IV съезд по радиационным исследованиям //Там же. - С.55. 3. Атангулова Р.Г, Шафеева Р.С., Нигматуллин Т.Г, Исрафилов А.Г. Специфическая активность антирабического иммуноглобулина после криорадиационной обработки // Актуальные вопросы вакцинно-сывороточного дела в XXI веке. Мат. Всерос. науч. конф , посвящ 105-летию Пермского НПО «Биомед». - Пермь, 2003,- С. 133-135. 4. Атангулова Р.Г, Нигматуллин Т.Г., Исрафилов А.Г. Изменение титров * антител к цитомегаловирусу в донорской плазме после криорадиационной обработки в зависимости от исходного уровня антител //Там же. - С. 125-127. 5. Атангулова Р.Г., Нигматуллин Т.Г., Исрафилов А Г. Титры антител в донорской плазме крови и препаратах иммуноглобулинов, обработанных криорадиационным методом / / 7 - а я Пущинская школа-конференция молодых ученых. - Пущино, 2003. - С. 86-87. 6. Атангулова Р.Г, Нигматуллин Т.Г., Исрафилов А.Г. Криорадиационная обработка плазмы крови и препаратов иммуноглобулинов как метод повышения активности антител к ряду вирусных и бактериальных антигенов // Мат. межрегион конф. биохимиков Урала, Западной Сибири и Поволжья «Биохимия: от исследования молекулярных механизмов - до внедрения в клиническую практику и производство». - Оренбург, 2003.-С.421-424. 7. Атангулова Р.Г, Нигматуллин Т.Г., Шафеева Р.С. Протективные свойства препаратов антирабического иммуноглобулина, обработанных криорадиационным методом // Актуальные вопросы инфекционной патологии человека, клинической и прикладной иммунологии. - Мат. Всерос. науч. конф. молодых ученых. - Уфа, 2004.-С. 128-129. Атангулова Рамиля Гайсаровна Специфические антитела в препаратах крови, обработанных криорадиационным методом Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Ответственный за выпуск Р.К. Каримова Подписано в печать 18.03.04 г. Бум. офсетная. Формат 60x84 1/16. Гарнитура «Arial Суп». Отп. на ризографе. Усл. печ. л. 1,4. Уч.-изд. л. 1,2. Тираж 100 экз. Заказ 376 РИО ФГУП сНПО «Микроген» МЗ РФ, филиал «Иммунопрепарат» 450014, г. Уфа, ул. Новороссийская, 105, тел: (3472) 213-214
