Выполнение работ по комплексной программе «БИО-2020

ВЫПОЛНЕНИЕ РАБОТ ПО
КОМПЛЕКСНОЙ ПРОГРАММЕ «БИО-2020»
Начальник Отдела лесной генетики
канд. биол. наук, ст. научн. сотр.
Шишкина О.К.
ПРОБЛЕМЫ
Отсутствие знаний о внутривидовой дифференциации основных
лесообразователей не позволяет организовать систему мероприятия по
сохранению биологического разнообразия и генетических ресурсов лесов, а
также повысить эффективность мер по воспроизводству лесов
Отсутствие системы контроля за оборотом репродуктивного материала
лесных растений влечет снижение продуктивности и качества создаваемых
насаждений
Изменение федерального законодательства в части государственного
регулирования оборота круглых лесоматериалов (ФЗ №415 от 28 декабря
2013 г.) требует разработки мер строго инструментального контроля
происхождения древесины
Фитосанитарный контроль состояния лесных питомников не эффективен
ввиду отсутствия единой базы данных о фитопатогенах лесных растений, что
создает опасность развития очагов болезней в создаваемых лесных насаждениях
05.02.2015
2
Актуальность
Пожары, болезни,
ветровал,
загрязнение окружающей
среды
Сплошные
лесосечные рубки
Широкомасштабное
применение
индивидуального отбора в
селекции
Снижение генетического разнообразия лесов
Последняя возможность изучения популяционной
структуры лесов России!
Единая система
выбора генетических
маркеров
Единая система
отбора проб
Единые критерии выделения
внутривидовых таксонов
Анатолий Иванович Видякин
05.02.2015
Доктор биологических наук. Институт биологии
Коми научного центра Уральского отделения РАН 3
3
ПЛАН МЕРОПРИЯТИЙ («ДОРОЖНАЯ КАРТА»)
«РАЗВИТИЕ БИОТЕХНОЛОГИЙ И ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ»
(УТВ. РАСПОРЯЖЕНИЕМ ПРАВИТЕЛЬСТВА РФ
ОТ 18 ИЮЛЯ 2013 Г. N 1247-Р)
Пункт Плана мероприятий 59. «Создание сети лабораторий анализа
ДНК в целях:
- мониторинга состояния лесных генетических ресурсов,
- контроля за оборотом репродуктивного материала лесных растений
при воспроизводстве лесов,
- оценки фитосанитарного состояния лесных питомников,
- контроля законности происхождения древесины»
Ответственные: Рослесхоз, Минприроды России, Российская
академия наук
Фактическая реализация: Федеральное бюджетное учреждение
«Российский центр защиты леса» (ФБУ «Рослесозащита»)
05.02.2015
4
СХЕМА РАЗВИТИЯ ДНК – ЛАБОРАТОРИЙ В СОСТАВЕ
БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ КЛАСТЕРОВ
05.02.2015
5
СХЕМА РАЗВИТИЯ ДНК – ЛАБОРАТОРИЙ В СОСТАВЕ
БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ КЛАСТЕРОВ
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ПРИ РАЗРАБОТКЕ И АПРОБАЦИИ НОВЫХ МЕТОДОВ
И ТЕХНОЛОГИЙ, ГЕНЕТИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ
Биотехнологическая лаборатория,
лаборатория ДНК анализа
Биотехнологическая лаборатория,
лаборатория ДНК анализа
ТЕХНОЛОГИИ
Лесной селекционно-семеноводческий центр
МАССОВОЕ ПРОИЗВОДСТВО
И ПОСТАВКА
ВЫСОКОКАЧЕСТВЕННОЙ
И СЕРТИФИЦИРОВАННОЙ
ПРОДУКЦИИ
(СЕМЕНА, ПОСАДОЧНЫЙ
МАТЕРИАЛ)
ИНВЕСТИЦИИ
Бизнес –партнер (потребитель продукции
кластера) - инвестор
05.02.2015
Ключевые факторы успеха:
1. Интенсивность НИОКР;
2. Доступность и качество человеческих
ресурсов;
3. Эффективность процесса
коммерциализации и передачи технологий;
4. Доступность адекватных финансовых
ресурсов;
5. Доступность и качество
инфраструктуры;
6. Доступность и качество сети
поставщиков.
6
Отбор образцов генетического материала по Центральному
Федеральному округу и Красноярскому краю
Для сбора образцов по 5 основным
лесообразующим
породам
(сосна,
ель,
лиственница, кедр и дуб) на территорию РФ
наложена сеть квадратов 100х100 км.
Отбор производился в точках пересечения
квадратов или близко к ним.
7
Фактические места отбора образцов по состоянию на 2014 год
(40 тыс. образцов).
8
Мониторинг генетического разнообразия лесных ресурсов
Гетерозигота
Гомозигота
Определение гомо- и гетерозиготности растений
9
УРОВЕНЬ ГЕТЕРОЗИГОТНОСТИ НАСАЖДЕНИЙ РФ
(20 тыс. образцов)
№
п/п
Порода
Локусы ДНК
Уровень гетерозиготности
(%)
ЦФО
СФО
1
Сосна обыкновенная
PtTX3013
PtTX2123
Высокий
(50-90%)
Высокий
(50-90%)
2
Ель европейская
SpAGG3
SpAC1F7
Высокий
(50-90%)
-
3
Ель сибирская
-
4
Сосна кедровая
Pc1b, Pc18, Pc35
-
Средний
(35-50%)
5
Лиственница сибирская
bcLK066, bcLK224,
bcLK232, bcLK260
-
Низкий
(10-30%)
Локусы не отобраны
10
КОНТРОЛЬ ЗА ОБОРОТОМ РЕПРОДУКТИВНОГО
МАТЕРИАЛА ЛЕСНЫХ РАСТЕНИЙ ПРИ ВОСПРОИЗВОДСТВЕ
ЛЕСОВ И ЗАКОННОСТИ ПРОИСХОЖДЕНИЯ ДРЕВЕСИНЫ»
Компьютерная программа для
определения границ популяций основных лесообразующих пород по
миотипам растений, выявленных методами ДНК-анализа
Описание программы:
- централизированное облачное хранилище исходных данных получаемых в
сети лабораторий а также результатов обработки данных;
- централизированную облачную платформу для исполнения обработки и
анализа результатов;
- набор модулей для обработки и анализа специфических данных
экспериментов с возможностью исполнения в централизированной облачной
платформе;
- систему автоматического сбора и передачи данных с рабочих станций в
хранилище;
- систему интерактивного доступа.
11
Предварительные данные о различии митотипов в лесных
насаждениях
Объекты исследования 2014 г. - насаждения сосны обыкновенной,
ели европейской и сибирской в ЦФО и Красноярском крае.
Для оценки разнообразия митотипов хвойных растений по
литературным данным были отобраны локусы митохондриальной ДНК
mh09, nad3 (intron1), nad3-rps12 и nad1 (intronB/C).
Для дальнейших исследований отобраны mh09 и nad3 (intron1).
12
Распределение митотипов в
естественных насаждениях
сосны обыкновенной
Сравнение произведено по
сочетанию 2-х
митохондриальных генов
сосны обыкновенной nad3
(intron1) (МВ 55-75) и mh09
(МВ 165-215) в зависимости
от места сбора и
удаленности от культур
посадки 1973-1975 гг.
Выборка случайная, 100 растений, сбор произведен
зарастающих сосной
бывших сельхозугодьях
Московской и Владимирской областях.
на
в
13
Оценка генетического и
географического
происхождения семян сосны
обыкновенной по локусам мт
ДНК nad3 (intron1) и mh09
Оценка различий мтДНК в популяциях сосны
обыкновенной
Московской,
Воронежской,
Орловской, Липецкой, Тульской, Смоленской,
Вологодской,
Новгородской,
Псковской,
Белгородской, Курской, Архангельской, Саратовской,
Ульяновской областей, Башкортостана, Чувашии и
Алтайского края (17 точек отбора по сети 100х100 км) по
локусам 365 и 554 (дизайн праймеров ИЛ НАН Беларуси)
14
В популяциях сосны выявлено 25 митотипов в 17 точках отбора образцов
Название локуса
Ель европейская и сибирская:
Сделан анализ мтДНК образцов
ели с 20 точек отбора по 15 локусам
(литературные данные).
Локусы мтДНК, отвечающие
требованиям составления карт
изменчивости митотипов пока не
найдены.
mt15-D02
Последовательности праймеров
F: 5`-tat-ctg-act-tgc-ctt-atc-3`
R: 5`- atc-cga-ata-cat-aca-cc-3`
nad1
F: 5’-ctc-tcc-ctc-acc-cat-atg-atg-3’
R: 5’-aga-tcc-cca-tat-att-ccc-gg- 3’
nad1 intron 2
F:5`- ctc-tcc-ctc-acc-cat- atg-atg-3`
R:5`- aca-aag-ccc-ctt-tga-ggg-3`
nad5
5'-agt-cca-ata-ggg-aca-gca-c-3'
5'-acc-cga-cga-taa-cta-gct-tc-3'
nad1
intron b/c
F: 5`-gca-tta-cga-tct-gca-gct-ca-3`
R:5`- gga-gct-cga-tag-ttt-ctg-c-3`
mt15-D02
F: 5′-tat-ctg-act-tgc-ctt-atc-3′
R: 5′-atc-cga-ata-cat-aca-cc-3′
mt23-D02
F: 5′-cac-cct-tgg-gta-gac-tgg-3′
R: 5′-ggt-tca-cgc-agt-gct-tct-3′
mt1H01
F: 5′-aag-atg-gat-cgc-cct-tac-gc-3′
R: 5′-gag-gag-gag-gct-tcg-tcg-tc-3′
mh05
5'-ggg-agt-cag-cga-aag-aag-taa-g-3'
5'-agtctcagagccagaagcag-3'
mh35
5'-cga-tga-cat-ctc-tta-gct-tcc-3'
5'-tgg-gga-ata-gga-ttc-ggg-taa-g-3'
mh02
5'-ttt-tag-ggc-cat-ttg-cct-gc-3'
5'-tct-atg-gac-aag-agc-ccg-acc-t-3'
mh33'
5'-cga-agg-aag-gaa-tga-agg-tg-3'
5'-gct-ctt-aag-tgc-tgg-ttg-atg-3'
mh38
5'-ccg-tcc-cct-atc-cat-caa-ac-3'
5'-ccc-tga-gcg-aga-ttg-aat-tag-3'
nad7/1-2
5'-acc-tca-aca-tcc-tgc-tgc-tc-3'
5'-cga-tca-gaa-taa-ggt-aaa-gc-3'
mh44
5'-atg-act-gga-aga-att-gct-cac-3'
5'-ttc-act-tga-tac-tca-ccc-cc-3'
Требования к изучаемым локусам мт ДНК для митотипорования: получение в результате ПЦР одного
продукта (ампликона), длина ампликона должна находиться в пределах 300-500 пар нуклеотидов, проведение
ПЦР в один раунд, полиморфизм локусов должен быть связан с изменением длины цепи ДНК, а не с заменой
нуклеотидов, и т.п.
15
ОЦЕНКА ФИТОСАНИТАРНОГО СОСТОЯНИЯ ЛЕСНЫХ
ПИТОМНИКОВ
Для обследования питомников в ФБУ «Рослесозащита» разработана методика
определения инфекции с использованием ДНК-анализа фитопатогенов как экспрессметода.
У разработанной методики, кроме очень значительного сокращения сроков
исследования, есть еще одно неоспоримое преимущество перед всеми остальными
методами анализа. ДНК-анализ позволяет выделить доминантный патоген, который
является действительной причиной заболевания, независимо от сопутствующей
микрофлоры. Причем патоген может быть определен даже без внешних проявлений
на любой стадии развития болезни и количественно. Определение проводится по
локусу ITS рибосомальной ДНК грибов.
К настоящему времени отобраны образцы с 8-ми питомников Московской
области (361,85 га) и 7-ми питомников Воронежской (1,8 га), Липецкой (42,6 га) и
Курской (42,6 га) областей. Также отобраны образцы 19 питомников Красноярского
края (368,17 га) и 34 питомников Алтайского края (618,76 га).
Всего в 2014 году обследовано 1409,5 га питомников
16
ВАЖНО !
Кладоспориоз
Склерофомоз
Бурое шютте
Альтернариоз
Традиционные методы:
- Срок – 2-3 недели.
- Влажная камера или посев на искусственные
питательные среды.
- Микроскопирование – может не быть
спороношения.
- На искусственных питательных средах – рост
сопутствующей микрофлоры.
- Точность определения до вида – низкая.
- Количественно – сложно.
Фомоз
ДНК -анализ
Срок – 2-3 дня
Выделение и анализ ДНК.
Точность определения до вида -100%.
Количественно – 2 дня.
Определение доминантного патогена,
вызывающего заболевание .
Ранняя диагностика.
Основное заболевание сеянцев в питомниках не фузариоз, как считалось
ранее, а фомоз !
17
Общий
перечень основных патогенов, распространенных на
пораженных сеянцах и саженцах в лесных питомниках Московской,
Воронежской, Курской и Липецкой областей и Красноярского края
№ п/п
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Заболевание
Кладоспориоз
Альтернариоз
Фомоз
Шютте бурое
Шютте обыкновенное
Шютте подобное (ели)
Ризоктониоз (парша)
Склерофомоз
Патогенез хвои
05.02.2015
Возбудитель
Cladosporium sp.
Alternaria alternatа
Phoma sp.(macrostoma, pomorum)
Rhizosphaera kalkhoffii
Lophodermium seditiosum
ели - Rhizosphaera macrospora
Ceuthospora pinastri
Rhizoctonia sp.
Sydowia polyspora
Pladicium lateum
Встречаемость (%)
54,0
41,0
40,0
13,0
2,0
2,0
2,0
0,6
0,1
18
Распределение патогенов в возрастных группах сеянцев и саженцев в
питомниках Московской области.
90
80
Кладоспориоз
70
Альтернариоз
60
Фомоз
50
Шютте бурое
40
Шютте обыкновенное
30
Шютте подобное
20
Ризоктониоз
10
Склерофомоз
0
1 год
05.02.2015
2 года
3 года
4 года
19
Распределение основных патогенов в возрастных группах сеянцев и
саженцев в питомниках Московской области.
05.02.2015
20
Сравнительный анализ частоты встречаемости заболеваний сеянцев
в питомниках Европейской части РФ и Западной Сибири.
70
60
Кладоспориоз
50
Альтернариоз
40
Фомоз
Шютте обыкновенное
30
Шютте бурое
Ризоктониоз
20
Склерофомоз
10
0
Европейская часть
05.02.2015
Западная Сибирь
21
Cladosporium sp.
Alternaria alternatа
Phoma macrostoma
Rhizosphaera kalkhoffii
Наблюдается наличие нескольких патогенов одновременно
22
Определение микоризообразователей на корнях здоровых сеянцев
W. mikolae изолят 1
W. mikolae изолят 2
Наличие изолятов Wilcoxina
mikolae на корнях здоровых
сеянцев
1 год
2 года
3 года
ели
европейской
разного возраста:
слева направо –
1 год (образцы 1-4),
2 года (образцы 5-10),
3 года (образцы 11-16).
05.02.2015
23
Спасибо за внимание