Экспрессные мультипараметрические тест‐системы для

Экспрессные мультипараметрические тест‐системы для одновременного выявления нескольких патогенов картофеля с использованием иммунохроматографического анализа
Институт биохимии им. А.Н. Баха, ФИЦ Биотехнологии РАН
Возбудители болезней картофеля (вирусные и бактериальные)
•S‐вирус картофеля (SВК)
•А‐вирус картофеля (АВК)
•Х‐вирус картофеля (ХВК)
•Обычный штамм Y‐вируса картофеля (YOВК)
•М‐вирус картофеля (МВК)
•Некротический штамм Y‐вируса картофеля (YN ВК)
•Вирус скручивания листьев картофеля (ВСЛК)
•Clavibacter michiganense subsp. sepedonicus (Сms)
•Pectobacterium atrosepticum
•Dickeya spp.
Потери урожая до 80%
Актуальность быстрой и высокочувствительной диагностики ГОСТ Р 55329‐2012 «Картофель семенной. Приемка и методы анализа»
Дата введения: 01.01.2014
Иммунохроматографический анализ:
10‐50 нг/см3 для вирусов
104‐105 клеток/см3 для возбудителей бактериоза
Иммунохроматографический анализ
Иммунохроматографический анализ для выявления нескольких фитопатогенов
Основные требования к современным аналитическим методам
• Чувствительность
• Специфичность
• Простота проведения
• Экспрессность
• Визуальная оценка результатов
• Высокая производительность
• Количественная оценка результатов
ЦЕЛЬ: Разработка экспрессных тест‐систем для одновременного выявления нескольких патогенов картофеля с использованием иммунохроматографического анализа
Иммунохроматографическая тест‐система
Полосочный формат
ТЕОРИЯ
Характеристика взаимодействия
антител с фитопатогеном
Равновесные константы
взаимодействия
Кинетические константы
взаимодействия
Единичные взаимодействия
Характеристика взаимодействия
антител на поверхности НКЗ
Константы взаимодействия
молекул с поверхностью НКЗ
Гидродинамические условия,
в которых взаимодействуют
иммунореагенты
ПРАКТИКА
Размеры наночастиц
синтезируемого коллоидного
золота
Соотношение антитело/наночастица
в конъюгате
Использование одного или
нескольких типов антител
для синтеза конъюгата
Способ иммобилизации
антител на поверхности НКЗ
Тип мембраны
Способ иммобилизации
антител на мембране
Параметры мембран
Условия проведения взаимодействий
Тип растительного матрикса
Тип экстрагирующего буфера
Синтез и характеристика наночастиц коллоидного золота (НКЗ)
и конъюгатов антител с НКЗ
 синтез и характеристика размера наночастиц
 определение условий иммобилизации антител на поверхности НКЗ
Фотография препарата НКЗ
 определение концентрации антител для иммобилизации на поверхности НКЗ
Оптимизация условий нанесения иммунореагентов
на мембранные носители
Оптимизация концентрации антител, иммобилизуемых в контрольной зоне
 оптимизация рабочей мембраны
 оптимизация оптической плотности конъюгата антител с коллоидным золотом
 оптимизация концентрации иммобилизованных антител
 оптимизация буфера для иммобилизации антител
Иммунохроматографическое определение ХВК в листовых экстрактах, градуировочная кривая
3000 нг/мл
1000 нг/мл
300 нг/мл
100 нг/мл
30 нг/мл
10 нг/мл
фон
Иммунохроматографическое определение ХВК в листовых экстрактах, реальные пробы
Картофель, листья, сорт 17
Разбавление, раз
Интенсивность окрашивания А.З., отн. ед.
Концентрация, мкг/мл
Картофель, листья, сорт Варнас
0 3 10
0 3
73,7 93,8 50,5
0 0
1,4
0 0
Картофель, листья, сорт Якутянка
0 3 10
76,5 74,8 40,8
0,9
Иммунохроматографическое определение МВК в листовых экстрактах, градуировочная кривая
3000 нг/мл
1000 нг/мл
300 нг/мл
100 нг/мл
30 нг/мл
10 нг/мл
фон
Иммунохроматографическое определение МВК в листовых экстрактах, реальные пробы
Картофель, листья, М‐24
Разбавление, раз
Интенсивность окрашивания А.З., отн. ед.
Концентрация, мкг/мл
0 3 10 30 100
Картофель, листья, М‐56
0 3 10 30
67,9 60,7 45,3 33,1 9,2
56,0 44,5 29,1 16,3
4,5
2,4
Иммунохроматографическое определение
Pectobacterium atrosepticum
в клубневых экстрактах, градуировочная кривая
108 кл./мл
107 кл./мл
106 кл./мл
105 кл./мл
104 кл./мл
103 кл./мл
фон
Иммунохроматографическое определение
Clavibacter michiganense subsp. sepedonicus
в клубневых экстрактах, градуировочная кривая
108 кл./мл
107 кл./мл
106 кл./мл
105 кл./мл
104 кл./мл
103 кл./мл
фон
Мультипараметрические тест‐системы в полосочном формате
700 нг/мл
100 нг/мл
500 нг/мл
70 нг/мл
300 нг/мл
30 нг/мл
К.З.
А.З.
ХВК
YВК
MВК
Иммунохроматографическая тест‐система
Точечный формат
Монопараметрические тест‐системы в точечном формате
на примере определения Х‐вируса картофеля
К.З.
500 нг/мл
А.З.
100 нг/мл
50 нг/мл
10 нг/мл
1 нг/мл
Мультипараметрическая тест‐система
в точечном формате
Контрольная зона
XВК
YВК
SВК
MВК
Аналитическая
зона
Разработка мультипараметрических тест‐систем
в точечном формате
для детекции восьми патогенов
0,3 mm
4 mm
Данный формат анализа позволяет обнаружить одновременно до восьми патогенов в пробе
в нанограммовых концентрациях
Одновременная детекция шести фитопатогенов в растительном экстракте
Фитопатогены: XВК, ВСЛК, МВК, Cms, YOВК, YNВК
Время анализа – 15 мин
ОТ РАЗРАБОТКИ ТЕСТ‐СИСТЕМ ДО ПРОИЗВОДСТВА
I. АПРОБАЦИЯ
Пределы обнаружения
вирусных и бактериальных патогенов картофеля
ПРЕДЕЛ ОБНАРУЖЕНИЯ
ОПРЕДЕЛЯЕМЫЙ ПАТОГЕН
ГОСТ Р 55329‐2012 Иммунохроматографические
тест‐системы
Х‐вирус картофеля
10‐50 нг/мл
Соответствует (10 нг/мл)
S‐вирус картофеля 10‐50 нг/мл
Соответствует (50 нг/мл)
М‐вирус картофеля 10‐50 нг/мл
Соответствует (10 нг/мл)
Обычный штамм Y‐вируса картофеля 10‐50 нг/мл
Соответствует (10 нг/мл)
Некротический штамм
Y‐вируса картофеля 10‐50 нг/мл
Соответствует (50 нг/мл)
Вирус скручивания листьев картофеля 10‐50 нг/мл
Соответствует (50 нг/мл)
Clavibacter michiganense
subsp. sepedonicus
104‐105 клеток/мл Соответствует (104 клеток/мл)
Pectobacterium atrosepticum
104‐105 клеток/мл Соответствует (105 клеток/мл)
Dickeya spp.
104‐105 клеток/мл Соответствует (5х104 клеток/мл)
ОТ РАЗРАБОТКИ ТЕСТ‐СИСТЕМ ДО ПРОИЗВОДСТА
II. ПРОИЗВОДСТВО
Приготовление экстракта и проведение анализа
5 шагов = 10‐15 минут
Подготовка пробы
Анализ
Регистрация результата
Регистрация результатов анализа
Портативные видеоцифровые детекторы
для документирования и количественной оценки результатов
Области применения
 Полевой мониторинг пораженности растений
ГОСТ Р 55329‐2012  Контроль семенного и посадочного материала
 Карантинный анализ импортируемого материала
Сафенкова И.В., Панферов В.Г., Бызова Н.А., Жердев А.В., Дзантиев Б.Б.
Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН
Варицев Ю.А., Зайцев И.А.
ВНИИ картофельного хозяйства им. А.Г. Лорха
Тел. (495)954-28-04,
e-mail [email protected]