На правах рукописи ДУПЛИК Надежда Владленовна

На правах рукописи
ДУПЛИК
Надежда Владленовна
ПОВЕРХНОСТНЫЕ СЕРИНОВЫЕ ПРОТЕАЗЫ SCPB И CSPA В
КАЧЕСТВЕ КАНДИДАТОВ ДЛЯ СОЗДАНИЯ ВАКЦИН
ПРОТИВ STREPTOCOCCUS AGALACTIAE
03.02.03 – Микробиология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург
2011
Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских
наук Научно-исследовательском институте экспериментальной
медицины Северо-Западного отделения Российской академии
медицинских наук (НИИЭМ СЗО РАМН).
Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор
СУВОРОВ Александр Николаевич
Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор
КОРОЛЮК Александр Михайлович,
доктор биологических наук
МОКРОУСОВ Игорь Владиславович
Ведущее учреждение: Федеральное государственное унитарное
предприятие «Государственный научно-исследовательский институт
особо чистых биопрепаратов» ФМБА России
Защита диссертации состоится " " __________ 2011 г. в ____ часов на
заседании Диссертационного совета ДМ 001.022.01 в Учреждении
Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском
институте экспериментальной медицины Северо-Западного отделения
Российской академии медицинских наук по адресу: 197376, СанктПетербург, ул. акад. Павлова, 12.
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке НИИЭМ
СЗО РАМН.
Автореферат разослан _______________ 2011 г.
Ученый секретарь
Диссертационного Совета
доктор биологических наук
Нежинская Г.И.
2
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность работы. Патогенные стрептококки относятся к наиболее
распространенным возбудителям бактериальных инфекций человека. В
последние десятилетия заболевания, вызываемые стрептококками серогруппы
В (СГВ) или Streptococcus agalactiae, в большинстве стран мира
рассматриваются в качестве важной социально-экономической и медицинской
проблемы. Известно, что СГВ является естественным обитателем прямой
кишки человека, способного вызывать инфекции уро-генитальной системы у
женщин. Наряду с этим, СГВ может вызывать различные патологии
беременности, в том числе выкидыши, внутриутробное поражение плода,
преждевременные роды. СГВ могут вызывать серьезные инфекции у
новорожденных, такие как сепсис, пневмония и менингит. Особо опасны
инфекции, вызываемые СГВ у детей не старше десяти дней, протекающие в
форме молниеносного сепсиса и приводящие к смертности в высоком проценте
случаев.
Заболевания, вызываемые СГВ, как правило, лечат антибиотиками
[Страчунский Л.С. 2002, Поляк М.С. 2003]. Препаратами выбора при лечении
СГВ
инфекций
являются
антибиотики
бета-лактамного
ряда
(бензилпенициллин, ампициллин [Семина Н.А. 2004], ампициллин в
комбинации с сульбактамом [Бурбелло А.Т. 2003]); макролиды (эритромицин,
кларитромицин, рокситромицин, азитромицин) и ванкомицин [Зуева Л.П.
2004].
В целях профилактики инфекций, вызванных СГВ, используют такие
антибиотики, как бензатин бензилпенициллин, эритромицин и ампициллин с
сульбактамом [Бурбелло А.Т. 2003].
Антибиотики, широко применяемые для профилактики и лечения,
нередко оказываются неэффективными в силу увеличения числа
антибиотикоустойчивых штаммов. Другим недостатком антибиотикотерапии
является возникновение побочных эффектов для здоровья людей. К ним
относятся аллергические реакции, негативное воздействие на центральную
нервную и сердечно-сосудистую системы, и на некоторые внутренние органы
человека. Кроме того, применение антибиотиков может приводить к
нарушению микробиоценоза организма, что приводит к дисбиозам и, как
следствие, к уменьшению устойчивости организма к другим инфекционным
агентам, в первую очередь микоплазмам, хламидиям и грибам рода Candida.
В этой связи очевидна необходимость поиска новых средств и способов
профилактики, в том числе специфической профилактики инфекций,
вызываемых СГВ, посредством создания вакцинных препаратов.
В настоящее время большое число лабораторий мира работает над
созданием вакцины против СГВ. Основными аргументами в пользу
3
целесообразности создания такой вакцины, помимо низкой эффективности
антибиотиков или невозможности их применения для профилактики, является
возможность четкого выделения основных контингентов лиц, подлежащих
вакцинации. В первую очередь – это носительницы СГВ с осложненной первой
беременностью, планирующие рождение второго ребенка, а также здоровые
женщины – будущие матери, нуждающиеся в профилактике СГВ инфекций.
Потенциально объектами для иммунизации могут рассматриваться лица
пожилого возраста, учитывая высокий уровень СГВ заболеваний в этой
возрастной группе.
Одним из новых направлений при создании вакцин является
использование в качестве её компонентов рекомбинантных полипептидов,
полученных на основе поверхностных белковых факторов патогенности СГВ.
Выбор рекомбинантного полипептида или оптимальной комбинации
полипептидов при создании вакцины должен определяться рядом условий, в
число которых входят распространенность, консервативность, иммуногенность
и протективность исходных поверхностных белков СГВ, на основе которых
конструируются рекомбинантные полипептиды.
Среди поверхностных белковых факторов патогенности СГВ
перспективными кандидатами для создания вакцины рассматриваются и
сериновые протеазы. Последние способствуют выживанию СГВ в организме
хозяина, так как они участвуют в расщеплении белков в качестве источников
энергии или с целью подавления иммунных реакций организма. Важной
особенностью некоторых сериновых протеаз является их способность
расщеплять хемоаттрактанты. Так, например, С5а пептидаза, или ScpB,
специфически
расщепляет
С5а
компонент
комплемента
человека,
мобилизующий полиморфноядерные лейкоциты; а протеаза CspA гидролизует
ряд хемокинов CXC семейства, а именно GRO-alpha, GRO-beta, GRO-gamma,
пептид,
активирующий
нейтрофилы
(NAP-2),
и
гранулоцитарный
хемотаксический белок 2 (GCP-2). С5а компонент комплемента и
перечисленные хемокины обладают свойствами анафилотоксинов и
стимулируют привлечение в очаг инфекции полиморфноядерных лейкоцитов и
макрофагов, поэтому их инактивация способствует подавлению факторов
врожденного иммунитета. Указанные свойства сериновых протеаз ScpB и CspA
указывают на их физиологическую значимость для СГВ.
В силу изложенного, получение иммуногенных и протективных
рекомбинантных полипептидов на основе С5а пептидазы и протеазы CspA
позволит использовать их в качестве компонентов при создании вакцинного
препарата против СГВ.
Все вышесказанное определило цели и задачи настоящего исследования.
4
Цель исследования – получение рекомбинантных полипептидов на
основе сериновых протеаз S. agalactiae С5а пептидазы и протеазы CspA для
вакцинной профилактики заболеваний, вызываемых стрептококками группы В.
Для этого планировалось выполнить следующие задачи:
1.
Анализ вторичной структуры С5а пептидазы и протеазы CspA для
выявления потенциально иммуногенных участков данных белков.
2.
Изучение распространенности и консервативности гена cspA,
кодирующего протеазу CspA, в штаммах СГВ.
3.
Получение очищенных препаратов рекомбинантных полипептидов
на основе С5а пептидазы и протеазы CspA.
4.
Изучение иммуногенности рекомбинантных полипептидов и
протективные свойств антител, полученных к рекомбинантным полипептидам,
в опытах in vivo и in vitro.
5.
Изучение вклада различных частей С5а пептидазы и протеазы CspA
в индукцию гуморального иммунного ответа в организме человека.
6.
Исследование токсичности рекомбинантных полипептидов в
опытах in vivo.
Научная новизна работы.
1. Впервые продемонстрирована распространенность гена cspA,
кодирующего сериновую протеазу CspA среди штаммов СГВ различных
серотипов. Доказана консервативность участков гена cspA, кодирующих Nтерминальную и С-терминальную части протеазы CspA.
2. Просеквенированные фрагменты гена cspA десяти штаммов СГВ
различных серотипов депонированы в банк данных GenBank NCBI и им
присвоены следующие номера: HQ849568, HQ849569, HQ849570, HQ849571,
HQ849572, HQ849573, HQ849574, HQ849575, HQ849576 и HQ849577.
3. Впервые изучен вклад различных участков С5а пептидазы и протеазы
CspA в формирование протективного иммунитета к стрептококку группы В и
показано, что наличие во вторичной структуре полипептида α-спиральных
структур способствует повышению иммуногенности и протективности.
4. Впервые проклонированы определенные фрагменты генов,
кодирующие различные участки на С5а пептидазе и протеазе CspA, и получены
соответствующие им рекомбинантные полипептиды Pb1a, Pb3a, Pb4a, Csp2 и
Csp3.
5. Впервые продемонстрировано, что полипептиды малых размеров (73 ÷
85 аминокислотных остатков) на основе С5а пептидазы и протеазы CspA
способны индуцировать синтез специфических антител с протективными
свойствами не только против S. agalactiae, но и против S. pyogenes.
5
Теоретическая значимость работы.
Продемонстрирована распространенность гена cspA, кодирующего
поверхностную сериновую протеазу CspA, как в референс-штаммах, так и в
клинических изолятах СГВ различных серотипов. Доказана консервативность
фрагментов гена cspA, кодирующих N-терминальную и С-терминальную части
протеазы CspA, в штаммах СГВ различных серотипов. Изучен вклад различных
частей С5а пептидазы и протеазы CspA в формировании гуморального
иммунного ответа к СГВ. Показано, что индукция синтеза специфических и
протективных антител зависит от процентного содержания α-спиральных
структур в молекуле белка.
Практическая значимость работы.
Созданы штаммы-продуценты E. coli рекомбинантных полипептидов на
основе С5а пептидазы (Pb1a, Pb3a и Pb4a) и протеазы CspA (Csp2 и Csp3).
Доказано, что высокоочищенные рекомбинантные полипептиды Pb1a, Pb3a и
Csp3 обладают иммуногенностью и способностью формировать образование
протективных антител к СГВ. Рекомбинантные полипептиды Pb3a и Csp3
рассматриваются как перспективные компоненты вакцины против СГВ.
Основные положения, выносимые на защиту:
1.
Ген cspA, кодирующий протеазу CspA, присутствует во всех
референс-штаммах и клинических изолятах СГВ; степень гомологии
фрагментов гена cspA (csp2 и csp3) в различных штаммах – 98÷100%.
2.
Проклонированы фрагменты гена С5а пептидазы и протеазы CspA,
которые кодируют рекомбинантные полипептиды Pb1a, Pb3a, Pb4a, Csp2 и
Csp3.
3.
Участки С5а пептидазы на N-терминальном конце с 96 по 169
аминокислотный остаток и в центральной области с 496 по 570
аминокислотный остаток, а также участок с 1247 по 1332 аминокислотный
остаток на С-терминальном конце протеазы CspA, содержат детерминанты,
отвечающие
за
индукцию
специфических
антител,
эффективно
опсонизирующих СГВ.
4.
Рекомбинантные полипептиды Pb3a и Csp3, содержащие высокий
процент α-спиральных структур, обладают высокой иммуногенностью, а
антитела, полученные к ним, проявляют протективную и опсонизирующую
активность in vitro и in vivo.
5.
Рекомбинантные полипептиды Pb3a и Csp3 на основе С5а
пептидазы и протеазы CspA, соответственно, могут быть рекомендованы для
дальнейшего использования при создании вакцин против СГВ.
6
Личный вклад автора в проведенное исследование.
Личный вклад автора заключался в самостоятельном формулировании
задач работы, проведении микробиологических, молекулярно-генетических,
биохимических, иммунологических исследований, а также в статистической
обработке и анализе полученных данных, обобщении и интерпретации
результатов.
Апробация работы.
По теме диссертации опубликовано 16 научных работ, в том числе один
патент и четыре статьи в изданиях, рекомендованных ВАК России. Материалы
исследований были представлены на нескольких отечественных и
международных научных конференциях и симпозиумах (на Научнопрактической конференции молодых ученых и специалистов «Актуальные
вопросы клинической и экспериментальной медицины», г. Санкт-Петербург,
Россия, 2007; 11-ой Международной школе-конференции молодых ученых
«Биология – наука XXI века», г. Пущино, Россия, 2007; «XVII международном
симпозиуме по стрептококкам и стрептококковым заболеваниям им.
Ленсфильд», г. Порто Хели, Греция, 2008; 3-м Конгрессе европейских
микробиологов, г. Гетерборг, Швеция, 2009; III Международном молодежном
медицинском Конгрессе «Санкт-Петербургские научные чтения-2009», г.
Санкт-Петербург, Россия, 2009; 20-ом Европейском конгрессе по клинической
микробиологии и инфекционным заболеваниям «20th ECCMID», г. Вена,
Австрия, 2010; на конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской
науки третьего тысячелетия», г. Санкт-Петербург, Россия, 2010).
Структура и объем диссертации.
Диссертационная работа изложена на 153 страницах и включает:
введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных
исследований и их обсуждение, общее заключение, выводы, список
литературы. Работа проиллюстрирована 28 рисунками и 16 таблицами. Список
литературы включает 179 источников, из них 12 отечественных и 167
зарубежных.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В работе использовали штаммы Streptococcus agalactiae различных
серотипов, референс штамм Streptococcus pyogenes М1 серотипа SF370 и штамм
Escherichia coli М15 из микробиологической коллекции Национального центра
ВОЗ по изучению стрептококков и стрептококковых заболеваний (СанктПетербург, Россия). Для культивирования стрептококков использовали среду
7
THB (Todd Hewitt Broth, Difco, США). Для культивирования E. coli
использовали среду BHI (Brain Heart Infusion Broth, Gibco, США) с
добавлением канамицина до конечной концентрации 25 мкг/мл. В ходе
получения рекомбинантных полипептидов трансформанты E. coli выращивали
на среде Terrific Broth с добавлением ампициллина (100 мкг/мл) и канамицина
(25 мкг/мл).
Для выделения хромосомной ДНК клетки лизировали добавлением
лизоцима в концентрации 1 мг/мл, ЭДТА до концентрации 10 мM, SDS до
конечной концентрации 1% и РНК-зы до концентрации 20 мкг/мл.
Депротеинизацию ДНК выполняли с помощью протеиназы К (0,5 мг/мл).
Окончательную очистку ДНК от белков, углеводов и липидов осуществляли
обработкой фенолом, смесью фенола с хлороформом (1:1) и хлороформом, а
затем экстрагировали этанолом.
Выделение плазмидной ДНК осуществляли с использованием
коммерческого набора "QIAprep Spin Miniprep Kit" (Qiagen, США) согласно
прилагаемой инструкции.
Электрофорез ДНК проводили в 1% агарозном геле в горизонтальном
аппарате «Hoefer HE 33» (Pharmacia, Швеция). Для расчета молекулярных масс
исследуемых фрагментов ДНК использовали ДНК-маркер 100 п.н. (Сибэнзим,
Россия).
Выделение ДНК из агарозного геля осуществляли с использованием
коммерческого набора "QIAquick Gel Extraction Kit" (Qiagen, США) согласно
прилагаемой инструкции.
Полимеразную цепную реакцию проводили на термоциклере с активным
регулированием «Терцик» (ДНК-Технология, Россия).
Секвенирование проводили на секвенаторе Beckman CEQ 2000 (Beckman
Coulter, США) согласно протоколу фирмы.
Рестрикцию ПЦР-продуктов проводили эндонуклеазами фирмы Fermentas
(США) согласно протоколу фирмы.
Лигирование фрагмента ДНК и ДНК-плазмиды pQE проводили с
использованием лигазы, выделенной из фага Т4 (Медиген, Россия), согласно
протоколу фирмы.
Трансформацию клеток E. coli М15 проводили по Darget (1979).
Выделение рекомбинантных полипептидов из культуры штаммапродуцента E. сoli М15 проводили трехкратным разрушением клеток
ультразвуком по 20 секунд (с перерывом в 40 сек) в ультразвуковом
дезинтеграторе (УЗДН-1У4.2, Россия). Лизат клеток центрифугировали при
13400 об/мин в течение 20 мин. Надосадочную жидкость пропускали через 0,2
мкм фильтры (Millipore, США). Очистку рекомбинантных полипептидов
осуществляли методом аффинной хроматографии на колонке с Ni-сефарозой
(Amersham, США), согласно протоколу фирмы.
8
SDS-электрофорез полипептидов проводили в 14% полиакриламидном
геле (PAGE) в вертикальном пластинчатом аппарате Mini-PROTEAN II (BioRad,
США). Молекулярную массу (М.М.) рекомбинантных полипептидов оценивали
в SDS-PAGE, сравнивая их подвижность с подвижностью белков с известными
молекулярными массами (М.М. = 10 ÷ 250 кДа, «Precision Plus Protein
Standards», Bio-Rad, США) на одной и той же пластинке геля. Количественное
определение белка в растворах проводили по методу Лоури (1982).
Гуморальный иммунный ответ к рекомбинантным полипептидам изучали
на беспородных белых мышах (самцах массой 16 ÷ 18 г) и кроликах,
полученных из питомника «Рапполово», РАМН. Иммунизацию проводили
двукратно и подкожно с гидроокисью алюминия в качестве адъюванта (Pierce,
США). В эксперименте использовали по тридцать мышей и по три кролика,
которым вводили по 0,2 мл и по 0,5 мл каждого полипептида с адъювантом в
соотношении объемов 1:1, соответственно. Для мышей конечная концентрация
полипептида при 1-ой инъекции составляла 100 мкг/мл и при второй инъекции 50 мкг/мл; инъекции проводили на 1-й и 20-й дни, соответственно. Для
кроликов в 1-ой инъекции конечная концентрация полипептида была 240
мкг/мл и 120 мкг/мл во второй инъекции, которые делали на 0 и 22 дни,
соответственно. Наличие сывороточных специфических IgG антител к
полипептидам определяли, используя пул сывороток от 3-х животных методом
иммуноферментного анализа, как описано у Меринговой (1986). Для детекции
IgG антител использовали белок А стафилококка, ковалентно связанный с
пероксидазой хрена, в концентрации 10-7 моль/л.
Для визуализации реакции использовали о-фенилендиамин в
концентрации 0,5 мкг/мл в 150 мМ фосфатно–цитратном буфере (рН = 5,0) с
добавлением 30% перекиси водорода. Реакцию регистрировали при длине
волны 492 нм с помощью прибора Anthos 2010 (Anthos, Австрия).
Опсонизирующую активность антител к полипептидам изучали на
суточном монослое мышиных перитонеальных макрофагов, как описано у
Грабовской (2007). Стрептококковую суспензию в концентрации 1×107 КОЕ/мл
после предварительной инкубации (при 370С, 30 мин, 5% СО2) с сыворотками
(в разведении 1:50) добавляли к макрофагам (при 370С, 30 мин, 5% СО2). При
микроскопии окрашенного монослоя макрофагов исследовали не менее 100
макрофагов в каждой из трех параллельных пробах. Статистическую обработку
результатов проводили по методу Стьюдента-Фишера.
Исследование протективных свойств антител к полипептидам проводили
в опытах генерализованной СГВ инфекции мышей. Мышам предварительно
подкожно вводили физиологический раствор (рН = 7,4 (PBS)) или исследуемый
полипептид (контрольная и опытные группы, соответственно) по схеме
иммунизации, как описано выше. В эксперименте использовали по 30 мышей
(самцов массой 16 ÷ 18 г) в контрольной и опытных группах. Всем группам
9
мышей внутрибрюшинно вводили СГВ штамм 5/70 Iac серотипа в дозе LD50 =
5,0×109 КОЕ/мл. Оценку протективности мышиных антител к полипептидам
проводили путем определения количества СГВ в селезенке на разных сроках
развития инфекции (по 3 мыши на каждый срок), высевая на чашки с кровяным
агаром серию десятикратных разведений каждого гомогената селезенки, как
описано у Грабовской (2007).
ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ
Компьютерный анализ первичной и вторичной структур С5а пептидазы и
протеазы CspA
Начальным этапом создания рекомбинантных полипептидов стал анализ
аминокислотных последовательностей белков С5а пептидазы и протеазы CspA
СГВ штамма 78-471 серотипа II с использованием данных «GenBank NCBI» и
программ «ExPASy». При выборе фрагментов на аминокислотных
последовательностях белков учитывали следующие критерии: положение
фрагментов на аминокислотной последовательности, отсутствие активного
центра белка, α-спиральность фрагмента и наличие гипотетических антигенных
детерминант.
Проведенный компьютерный анализ первичной и вторичной
аминокислотных структур позволил выбрать три фрагмента на аминокислотной
последовательности С5а пептидазы и два фрагмента на аминокислотной
последовательности протеазы CspA с целью получения рекомбинантных
полипептидов, содержащих эти участки. Выбранные фрагменты белков
содержали различный процент α-спиральных структур. На N-терминальном
конце ScpB выбран фрагмент Pb1a, содержащий 28% α-спиральных структур; в
центральной области молекулы выбран фрагмент Pb3a с содержанием αспиральных структур – 41%; на С-терминальном участке, непосредственно
прилегающем к клеточной стенке, выбран фрагмент Pb4a с содержанием αспиральных структур – 19%. На С-терминальном конце молекулы протеазы
CspA выбран фрагмент Csp3, содержащий 69% α-спиральных структур. Для
сравнительного
исследования
влияния
α-спиральных
структур
на
иммуногенность и протективность полипептида выбрали второй фрагмент Csp2
с меньшим содержанием α-спиральных структур (17%), но большего размера,
что гарантировало содержание одной и более антигенных детерминант. С
целью изучения антигенных свойств протеазы CspA фрагмент Csp2 выбран так,
чтобы ему соответствовала большая часть N-терминального конца молекулы.
10
Анализ штаммов стрептококков группы В на присутствие гена cspA
Для исследования распространенности гена cspA была изучена коллекция,
состоящая из 85 штаммов СГВ различных серотипов. Были исследованы
референс штаммы из Чехии (10 штаммов) и клинические изоляты из России (20
штаммов), Китая (33 штамма), Швеции (10 штаммов) и США (12 штаммов).
Все штаммы СГВ, составившие коллекцию, анализировали на
присутствие в их хромосомной ДНК гена cspA с помощью метода
полимеразной цепной реакции (ПЦР).
943п.н
1
2
3 4
5
6
7
8
9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Рисунок 1. Электрофорез продуктов ПЦР, полученных в результате амплификации
ДНК, выделенной из различных штаммов СГВ.
1 – ДНК-маркер (100÷1000 п.н. + 1500 п.н.);
2-19 – продукт ПЦР ДНК, выделенной из различных штаммов;
20 – отрицательный контроль.
Проведенный анализ показал образование ПЦР-продукта (943 п.н.) во
всех исследованнных образцах. Эти эксперименты доказали, что ген cspA
присутствует во всех исследованных штаммах СГВ (Рис. 1). Наличие гена cspA
во всех исследованных образцах ДНК СГВ свидетельствало о том, что данный
ген широко распространен среди штаммов СГВ различных серотипов.
Распространенность данного гена среди штаммов СГВ указывает на высокую
вероятность того, что вакцина, включающая протеазу CspA, кодируемую геном
cspA, будет вызывать образование антител, распознающих эпитопы на
молекуле
протеазы
CspA
всех
серотипов
СГВ.
Следовательно,
продемонстрированная распространенность гена cspA, кодирующего
поверхностную сериновую протеазу CspA СГВ, доказывает целесообразность
получения рекомбинантных полипептидов на основе этой протеазы, с целью их
использования в качестве компонентов вакцины против СГВ.
Изучение гомологии фрагментов гена cspA: csp2 и csp3 среди СГВ
различных серотипов
Для изучения гомологии фрагментов csp2 и csp3 провели секвенирование
этих фрагментов, полученных на матрицах ДНК, выделенных из десяти
штаммов СГВ с последующим сравнительным анализом полученных
11
нуклеотидных последовательностей с помощью пакета компьютерных
программ «BLAST».
В результате секвенирования фрагментов csp2 и csp3 десяти штаммов
СГВ: 090R (серотипа Ia), 1/82 (IV), 1/92 (VIII), 2/86 (VI), 4/89 (VII), 8/66 (Ia),
10/84 (V), 13/63 (III), 59/59 (Iab) и 60/59 (II) получены нуклеотидные
последовательности, соответствующие данным фрагментам. Полученные
нуклеотидные последовательности фрагментов гена cspA были депонированы в
банк данных GenBank NCBI и им присвоены следующие номера: HQ849568,
HQ849569, HQ849570, HQ849571, HQ849572, HQ849573, HQ849574, HQ849575,
HQ849576 и HQ849577.
Нуклеотидные последовательности фрагментов csp2 и csp3 из
исследуемых штаммов СГВ различных серотипов сравнивали между собой и с
полногеномными последовательностями трех штаммов СГВ, имеющихся в базе
данных «GenBank NCBI». Проведенный сравнительный анализ фрагментов
csp2 и csp3 показал высокую степень гомологии (98-100%) этих фрагментов в
штаммах СГВ различных серотипов, что доказывает консервативность
исследуемых фрагментов. Полученный результат позволяет рассматривать
рекомбинантные полипептиды Csp2 и Csp3, кодируемые фрагментами csp2 и
csp3, перспективными для использования в качестве компонентов вакцины
против СГВ.
Получение рекомбинантных полипептидов Pb1a, Pb3a, Pb4a, Csp2 и Csp3
Для получения рекомбинантных полипептидов, соответствующих
выбранным
фрагментам
на
аминокислотных
последовательностях
полноразмерных белков С5а пептидазы и протеазы CspA, провели
клонирование pb1a, pb3a, pb4a, csp2 и csp3 в систему экспрессионных векторов
pQE. С помощью полимеразной цепной реакции получили необходимые
фрагменты: pb1a (251 п.н.), pb3a (196 п.н.), pb4a (255 п.н.), csp2 (1524 п.н.) и
csp3 (260 п.н.). Фрагменты pb1a, pb3a, pb4a, csp2 и csp3 были встроены в
экспрессионный вектор pQE с последующей трансформацией в E. сoli M15.
Рекомбинантные полипептиды Pb1a, Pb3a, Pb4a, Csp2 и Csp3 выделили и
очистили с помощью аффинной хроматографии на Ni-сефарозе. Таким образом,
получили пять хроматографически очищенных рекомбинантных полипептидов
и создали штаммы-продуценты этих полипептидов, три полипептида на основе
С5а пептидазы с приблизительно одинаковой молекулярной массой: Pb1a (12
кДа), Pb3a (11 кДа) и Pb4a (18 кДа), но разным процентным содержанием αспиралей и два полипептида – на основе протеазы CspA: Csp2 (44 кДа) и Csp3
(12 кДа) (Рис. 2). Необходимо подчеркнуть, что молекулярная масса Csp3 в 3.5
раза меньше Csp2, а процентное содержание α-спиралей в 4 раза больше в Csp3
по сравнению с Csp2.
12
А)
75 кДа
75 кДа
50 кДа
37 кДа
37 кДа
25 кДа
25 кДа
Б)
50 кДа
20 кДа
18 кДа
44 кДа
20 кДа
15 кДа
15 кДа
12 кДа
10 кДа
11 кДа
1
2
3
4
12 кДа
10 кДа
1
2
3
Рисунок 2. 14% SDS-PAGE очищенных рекомбинантных полипептидов: А) Pb1a,
Pb3a, Pb4a; Б) Csp2, Csp3.
1 – маркер М.М.;
2 – препарат Pb1a (А) и препарат Csp2 (Б);
3 – препарат Pb3a (А) и препарат Csp3 (Б);
4 – препарат Pb4a.
Изучение индукции специфических антител в крови лабораторных
животных на введение рекомбинантных полипептидов Pb1a, Pb3a, Pb4a,
Csp2 и Csp3
Для оценки иммуногенности рекомбинантных полипептидов Pb1a, Pb3a,
Pb4a, Csp2 и Csp3 провели иммунизацию лабораторных животных (мышей и
кроликов) каждым полипептидом в отдельности с гидроокисью алюминия в
качестве адъюванта.
Результаты иммунизации показали наличие выраженного гуморального
иммунного ответа на введение рекомбинантных полипептидов Pb1a и Pb3a.
Наличие антител выявляли уже после первичного введения Pb1 и Pb3a.
Повторное введение полипептидов резко усиливало выработку специфических
антител. Полипептид Pb3a характеризовался более высокой иммуногенностью
по сравнению с Pb1a как при нарастании титра, так и при достижении
максимальных значений.
Полипептид Pb4a не проявил иммуногенной
активности (максимальное значение титра мышиных анти-Pb4a антител –
1:200). Максимальные значения титров мышиных антител к полипептидам Pb1a
(1:12,8х103) и Pb3a (1:25,6х103) наблюдали на 40 день от начала иммунизации.
По мере снижения титра антител после иммунизации лабораторных мышей
отмечалась более длительная циркуляция анти-Pb3a антител по сравнению с
13
анти-Pb1a антителами, что также подтверждает более высокую иммуногенность
Pb3a. При подкожной иммунизации кроликов рекомбинантный полипептид
Pb3a вызывал более быстрое нарастание титра антител с максимумом на 63
день (1:1,6х105) по сравнению с Pb1a (max = 1:0,4х105).
Результаты эксперимента по иммунизации лабораторных животных
позволили сделать вывод, что антигенные детерминанты, отвечающие за
развитие гуморального иммунного ответа, располагаются преимущественно в
центральной и N-терминальной частях молекулы С5а пептидазы.
Результаты иммунизации лабораторных мышей рекомбинантными
полипептидами на основе протеазы CspA показали наличие выраженного
гуморального иммунного ответа на введение обоих полипептидов Csp2 и Csp3.
Максимальное значение титра мышиных анти-Csp2 антител (1:12,8х103) на 40
день от начала иммунизации было сопоставимо с максимумом титра анти-Csp3
антител (1:12,8х103). Тем не менее, отмечалось более медленное снижение
титра мышиных анти-Csp3 антител по сравнению с анти-Csp2 антителами.
При иммунизации лабораторных кроликов титры антител к обоим
полипептидам были достаточно близкими, а именно 1:1,0х105 для Csp2 и
1:0,8х105 для Csp3, что свидетельствует об одинаковой иммуногенной
активности этих полипептидов.
Анализ результатов исследований по иммунизации лабораторных
животных полипептидами Csp2 и Csp3, позволил утверждать, что Nтерминальная и С-терминальная части CspA протеазы содержат детерминанты,
ответственные за индукцию гуморального иммунного ответа. Одинаковая
иммуногенность Csp3 с Csp2 может быть связана с его α-спиральной
структурой. Так, Csp3 содержит 69% α-спиралей при молекулярной массе 12
кДа, а Csp2 с молекулярной массой 42 кДа содержит 17% α-спиралей.
В ходе экспериментов по иммунизации лабораторных животных была
продемонстрирована одинаковая иммуногенность полипептидов Csp2 и Csp3;
самым иммуногенным оказался полипептид Pb3a, полипептид Pb4a оказался не
иммуногенным. Таким образом, в представленной диссертационной работе
показано, что процентное содержание α-спиральных структур в молекуле
полипептида, использованного для вакцинации, существенно влияет на уровень
выработки специфических иммуноглобулинов. Более того, впервые изучены
иммуногенные свойства различных участков С5а пептидазы и протеазы CspA.
Определение специфических антител к рекомбинантным полипептидам
Pb1a, Pb3a, Pb4a, Csp2 и Csp3 в сыворотках от женщин-носительниц СГВ
Для получения дополнительных доказательств участия поверхностных
белков СГВ С5а пептидазы и протеазы CspA в развитии патологического
процесса были исследованы сыворотки от женщин-носительниц СГВ на
14
наличие специфических антител к рекомбинантным полипептидам Pb1a, Pb3a,
Pb4a, и Csp2, Csp3 (Рис. 3). Сыворотки были любезно предоставлены из НИИ
акушерства и гинекологии имени Д.О. Отта СЗО РАМН (г. Санкт-Петербург).
анти-Pb1a
анти-Pb3a
анти-Pb4a
анти-Csp2
анти-Csp3
Титр IgG, x10-3
30
25
20
15
10
5
0
анти-Pb1a
анти-Pb3a
анти-Pb4a анти-Csp2 анти-Csp3
Рисунок 3. Титр специфических антител в сыворотках от женщин-носительниц СГВ к
рекомбинантным полипептидам Pb1a, Pb3a, Pb4a, Csp2 и Csp3 (∆р<0,05).
Результаты тестирования показали, что в большинстве сывороток
женщин-носительниц СГВ были обнаружены антитела к Pb1a, Pb3a, Csp2 и
Csp3, кроме Pb4a (Рис. 3). Такой результат можно объяснить тем, что область
на аминокислотной последовательности полноразмерной С5а пептидазы,
гомологичная Pb4a, располагается рядом с клеточной стенкой бактерии. В
результате при формировании гуморального иммунного ответа на СГВ синтеза
специфических антител к данной области поверхностной сериновой протеазы
ScpB практически не происходит или же синтезируемые антитела просто не
могут связаться с этой труднодоступной областью.
Таким образом, было продемонстрировано, что в организме человека в
ходе формирования гуморального иммунного ответа на СГВ инфекцию
индуцируются специфические антитела к различным участкам молекул С5а
пептидазы и протеазы CspA.
Так как рекомбинантный полипептид Pb4a оказался не иммуногенным, то
дальнейшие исследования с ним не проводились.
Изучение опсонизирующей активности мышиных анти-Pb1a, анти-Pb3a,
анти-Csp2 и анти-Csp3 антител in vitro
Опсонизирующую активность антител, стимулированных введением
рекомбинантных полипептидов, изучали на монослое мышиных макрофагов,
преинкубированных в присутствии суспензии стрептококков, заранее
обработанных контрольными и опытными
иммунными (от ранее
15
проиммунизированных лабораторных животных) сыворотками. В качестве
контроля использовали сыворотку неиммунизированных животных той же
линии. Подсчитывали процентную долю макрофагов, с захваченными
стрептококками, и среднее число кокков на одну клетку. Степень опсонизации
оценивали по фагоцитарному индексу, который представляет собой
произведение обоих показателей.
анти-Csp3
анти-Pb1a
анти-Pb3a
7
6
5
4
3
2
1
(S
F3
70
)
СГ
А
V
СГ
В
М
1
(1
0/
84
)
)
(1
/9
2
IV
СГ
В
СГ
В
60
/5
9
II
(
СГ
В
III
(5
5/
81
)
0
)
Кратность увеличения ФИ
анти-Csp2
Рисунок 4. Кратность увеличения фагоцитарного индекса при обработке
стрептококков сыворотками, полученными после иммунизации мышей рекомбинантными
полипептидами (∆р<0,05).
Кратность увеличения фагоцитарного индекса при обработке
стрептококков иммунной мышиной сывороткой по сравнению с фагоцитарным
индексом
при
обработке
стрептококков
нормальной
сывороткой
свидетельствовала о опсонизирующей активности антител, полученных к
рекомбинантным полипептидам (Рис. 4). Исследование, проведенное с
различными серотипами СГВ и одним из М серотипов СГА показали, что
наибольшей опсонизирующей активностью обладают антитела к полипептидам
Pb1a, Pb3a и Csp3 (Рис. 4). Антитела к полпептиду Csp2 достоверно
опсонизировали только стрептококки группы В серотипа IV и стрептококки
группы А.
Изучение протективных свойств анти-Pb1a, анти-Pb3a, анти-Csp2 и антиCsp3 антител на мышах, инфицированных СГВ
Протективную активность антител, полученных после иммунизации
рекомбинантными полипептидами Pb1a, Pb3a, Csp2 и Csp3, также изучили на
мышиной модели генерализованной инфекции. Лабораторных мышей
предварительно иммунизировали подкожно одним из исследуемых
рекомбинантных полипептидов (опытные группы). Контрольной группе
16
животных подкожно вводили PBS с гидроокисью алюминия в качестве
адъюванта. На сроке максимальной выработки специфических антител мышам
внутрибрюшинно вводили сублетальную дозу СГВ (штамм 5/70 серотипа Iac,
LD50= 7,1×107 КОЕ/мл) для индукции генерализованной инфекции. Динамику
развития инфекции, вызванной СГВ, определяли на разных сроках от начала
заражения путем высева стрептококков из гомогенатов селезенок на среду с
кровяным агаром (Рис. 5).
Среднее кол-во СГВ в селезенке
мышей, КОЕх10-7
Контроль
Pb1a
Pb3a
Csp2
Csp3
12
10
8
6
4
2
0
1
2
3
4
Время после заражения, часы
Рисунок 5. Динамика развития инфекции, вызванной СГВ Iac серотипа (5/70), в
селезенках мышей, предварительно иммунизированных рекомбинантными полипептидами
Pb1a, Pb3a, Csp2 и Csp3 (∆р<0,05).
Результаты, полученные в ходе экспериментов по исследованию
протективной активности антител in vivo, свидетельствовали о том, что
циркулирующие в организме мышей анти-Pb1а, анти-Pb3а и анти-Csp3
антитела эффективно вовлекаются в процесс элиминации стрептококков из
макроорганизма при развитии генерализованной инфекции. Эксперименты in
vivo полностью подтвердили результаты опсонофагоцитарного теста, в котором
протективная активность анти-Pb1а, анти-Pb3а и анти-Csp3 антител была
доказана на примере усиления фагоцитирующей способности макрофагов.
Антитела, синтезируемые в организме лабораторных мышей при введении
рекомбинантного полипептида Csp2, не обладали протективной активностью,
что было подтверждено в экспериментах in vivo и in vitro. Таким образом,
среди антител, синтезируемых ко всем полипептидам, только антитела к
рекомбинантному полипептиду Csp2, содержащему наименьшее количество αспиралей (17%), не оказались протективными. Полученные данные
свидетельствуют о влиянии вторичной структуры полипептида на
протективные свойства синтезируемых антител.
17
Исследование токсичности рекомбинантных полипептидов Pb3a и Csp3
Среди требований, предъявляемых к компонентам вакцин, безопасность
вводимого препарата занимает одно из основных мест. Поэтому, необходимо
было изучить токсичность рекомбинантных полипептидов Pb3a и Csp3.
Для исследования токсичности полученных полипептидов двум группам
мышей внутрибрюшинно вводили десятикратные дозы (по сравнению с
профилактической дозой) Pb3a и Csp3. Контрольной группе мышей вводили
PBS. Массу тела, а также ряд показателей, характеризующих жизненную
активность мышей, определяли в течение 14 дней. После введения
полипептидов наблюдалось постоянное и равномерное нарастание веса
животных и не отмечались какие-либо отклонения по сравнению с контрольной
группой мышей. Таким образом, эксперименты подтвердили безопасность Pb3а
и Csp3 полипептидов для организма животных.
ВЫВОДЫ
1. Ген cspA, кодирующий сериновую протеазу CspA, присутствует во всех
исследованных штаммах СГВ; фрагменты csp2 и csp3, кодирующие N и
C-терминальные участки CspA, имеют высокую степень гомологии (98100%) среди СГВ различных серотипов.
2. Получены, выделены и очищены рекомбинантные полипептиды Pb1a,
Pb3a и Pb4a на основе С5а пептидазы и Csp2, Csp3 на основе протеазы
CspA, и созданы штаммы-продуценты этих полипептидов.
3. На модели лабораторных животных продемонстрировано, что
рекомбинантные полипептиды Pb1a, Pb3a и Csp3 содержат антигенные
детерминанты, ответственные за индукцию специфических антител,
опсонизирующих СГВ и СГА; рекомбинантный полипептид Csp2 не
индуцирует антител, опсонизирующих СГВ.
4. Установлено, что участки С5а пептидазы и сериновой протеазы CspA с
большим содержанием
α-спиральных структур (Pb3a и Csp3,
соответственно) являются наиболее выраженными индукторами
гуморального иммунного ответа.
5. Продемонстрировано, что в организме человека в ходе формирования
гуморального иммунного ответа на СГВ инфекцию индуцируются
специфические антитела ко всем исследованным пептидам на основе
молекул С5а пептидазы и протеазы CspA.
6. Два рекомбинантных полипептида на основе С5а пептидазы и протеазы
CspA,
обладающие
выраженной
α-спирализованностью
и
обеспечивающие выработку протективных антител (Pb3a и Csp3,
18
соответственно) могут быть рекомендованы в качестве компонентов
вакцин против СГВ.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
Патент РФ:
Патент РФ на изобретение № 2378374: «Рекомбинантная ДНК,
обеспечивающая получение рекомбинантного белка РВ1, обладающего
протективными свойствами в отношении Streptococcus pyogenes и Streptococcus
agalactiae». Авторы изобретения: Королева И.В., Дуплик Н.В., Суворов А.Н.
2008г.
1.
2.
3.
4.
Статьи:
Дуплик Н.В., Королева И.В., Суворов А.Н. Клонирование, экспрессия и
изучение иммунологических свойств рекомбинантного полипептида на
основе С5а пептидазы стрептококков группы В // Медицинская
иммунология. 2009. Т. 11. № 1. С. 7–14.
Суворов А.Н., Грабовская К.Б., Леонтьева Г.Ф., Мерингова Л.Ф.,
Королева И.В., Дуплик Н.В., Тотолян А.А.. Рекомбинантные фрагменты
консервативных белков стрептококков группы В как основа
специфической вакцины // ЖМЭИ. 2010. №2, С. 44-50.
Суворов А.Н., Леонтьева Г.Ф., Ермоленко Е.И., Грабовская К.Б.,
Мерингова Л.Ф., Королева И.В., Дуплик Н.В., Гупалова Т.В., Коржуева
А.С., Елисеев Е.В., Бочкарева А.Н., А.А. Тотолян. Рекомбинантные
вакцины и пробиотики как возможные средства защиты от
стрептококковых заболеваний // Медицинский академический журнал.
2010. Т. 10, № 2, С: 32-39.
Дуплик Н.В., Королева И.В., Грабовская К.Б., Суворов А.Н.
Рекомбинантные полипептиды на основе С5а пептидазы как
потенциальные компоненты вакцин против стрептококка группы В //
Медицинская иммунология. 2011. Т. 13, № 1. С. 41-48.
Тезисы:
1. Duplik N.V., Koroleva I.V., Suvorov A.N. The study of immunological
properties of recombinant protein SCPB1 as potential vaccine component
against Streptococcus agalactiae // European Journal of Medical Research. V.
12. № 4. 2008. P: 55-56.
2. Duplik N, Koroleva I, Suvorov A. Development of C5a peptidase and CspA
based recombinant polypeptides as vaccine components against group B
streptococci // Clinical Microbiology and Infection. 2010. V. 16. Suppl. № 2,
P: S34.
3. Suvorov A.N., Leontieva G.F., Grudinin M., Stukova M., Shaldzhyan A.,
Romanko E., Grabovskaya K., Meringova L., Koroleva I., Duplik N., Korjueva
A., Gupalova T., Totolian A., Kiselev O. Recombinant group B streptococcal
peptides as protection against broad range of pathogens // Clinical
Microbiology and Infection. 2010. V. 16. Suppl. № 2, P: S600.
19
4. Дуплик Н.В., Королева И.В., Суворов А.Н. Получение рекомбинантного
полипептида SCPB1 в качестве возможного компонента вакцины против
стрептококков группы В // Сборник тезисов научно-практической
конференции молодых ученых и специалистов «Актуальные вопросы
клинической и экспериментальной медицины». МАПО, г. С-Пб, Россия,
2007. С: 68-69.
5. Дуплик Н.В., Королева И.В., Суворов А.Н. Изучение иммунного ответа
рекомбинантных белков с целью дальнейшего их применения для
создания вакцины против стрептококков группы В // Сборник тезисов 11ой Международной школы-конференции молодых ученых «Биология –
наука XXI века». г. Пущино, Россия, 2007. С: 198.
6. Duplik N., Koroleva I., Berlov M., Suvorov A. Differences in GAS C5apeptidase result in unequal susceptibility to certan human proteases // Abstract
book. XVII Lancefield – international symposium on Streptococci and
streptococcal diseases. Porto Heli, Greece. 2008. P: 245.
7. Дуплик Н.В. Получение и изучение рекомбинантных полипептидов на
основе С5а пептидазы с целью использования в качестве компонентов
вакцины против стрептококков группы В. Тринадцатая СанктПетербургская ассамблея молодых ученых и специалистов. Аннотации
научных работ победителей конкурса грантов Санкт-Петербурга 2008
года для студентов, аспирантов, молодых ученых и молодых кандидатов
наук. – СПб.: Фонд «ГАУДЕАМУС», 2008. С: 34.
8. Leontieva G., Grabovskaya K., Meringova L., Koroleva I., Gupalova T.,
Ditina M., Korjueva A., Duplick N., Totolian A., Suvorov A. Streptococcal
recombinant peptide vaccine as an alternative to conjugate vaccine
development // Abstract book. Larnaca, Cyprus, 2009. P: 5.
9. Duplik N.V., Koroleva I.V. and Suvorov A.N. New С5a peptidase based
recombinant polypeptides as potential vaccine candidates against
Streptococcus agalactiae // Abstract book. 3d FEMS 3d Congress of European
Microbiologists. Gothenburg, Sweden, 2009. Р: 125.
10. Дуплик Н.В., Королева И.В., Суворов А.Н. Создание новых
полипептидных компонентов вакцин против Streptococcus agalactiae на
основе поверхностных сериновых протеаз // III Международный
молодежный медицинский Конгресс “Санкт-Петербургские научные
чтения-2009”, 2009. С: 113.
11. Koroleva I., Duplik N., Suvorov A. Certain parts of CspA molecule possess
immunogenic and protective properties that may be useful in vaccine
development against GBS // Current advances in the diagnosis, management
and treatment of neonatal group B streptococcal infections. London, United
Kingdom, 2010. Р: 68.
20
Для заметок
21
Для заметок
22