Клиниколабораторное значение молекулярногенетических методов в диагностике аденовирусной инфекции ИНФЕКТОЛОГИЯ

Иммунопатология, аллергология, инфектология
Immunopathology, allergology, infectology
2011, №3:6772
ИНФЕКТОЛОГИЯ
Клиниколабораторное значение молекулярногенетических методов
в диагностике аденовирусной инфекции
А.М. Хныков, Г.В. Семейко, В.М. Семенов, Е.О. Самойлович
УО «Витебский государственный медицинский университет», г. Витебск, Беларусь
ГУ «РНПЦ Эпидемиологии и Микробиологии», г. Минск, Беларусь
Cliniclaboratory value of moleculargenetic methods in diagnostics of
adenovirus infection
A.M. Khnykov, G.V. Semeyko, V.M. Semenov, E.O. Samoylovich
Vitebsk State Medical University, Vitebsk, Belarus
Republican Scientific Center of Epidemiology and Microbiology, Minsk, Belarus
Аннотация
Summary
Цель данного исследования явилось получить изоляты
аденовирусов с последующим анализом полиморфизма
длин рестрикционных фрагментов, предварительно амп
лифицированного в ПЦР (ПЦРПДРФ анализ). Аденови
русы выделяли в культуре клеток Нер2 с из носоглоточ
ных смывов, фекалий пациентов. Выделили 13 изолятов
аденовируса, ПЦРПДРФ анализ подтвердил циркуляцию
аденовирусов с генотипом B1, B2, A, F на территории Ви
тебской области.
The aim of research was to receive isolates of adenoviruses
with the subsequent analysis of polymorphism of lengths
restriction fragments, preliminary amplificated by PCR (the
PCRRFLP analysis). Adenoviruses allocated in culture of
Нер2 cell lines with from swabs, stool of patients. Have
allocated 13 adenovirus isolates, the PCRRFLP analysis has
confirmed circulation of adenoviruses with genotype B1, B2,
A, F in territory of Vitebsk region.
Ключевые слова
Key words
Изолят, монослой, полимеразноцепная реакция (ПЦР),
полиморфизм длин рестрикции фрагмента (ПДРФ), кле
точная линия Hep2C, L20B.
Isolate, monolayer, polymerasechain reaction, restriction
fragment length polymorphism, cells line Hep2C, L20B.
Аденовирусная инфекция представляет
одну из значимых проблем в инфекционной
патологии. Аденовирусы являются наиболее
распространенными патогенами в структуре
ОРИ, вызывают высокую заболеваемость и
смертность у детей [1]. Показатель смертности
у детей старше 5 лет от ОРИ по статистическим
данным варьирует и составляет как от 1 до 3 %,
так и от 10 до 25% [2]. Первоначальным воз#
будителем конъюнктивита во всем мире от 15
до 70 % является аденовирус [3]. Аденовирус#
ная инфекция вызывает пневмонию у детей в
возрасте менее 5 лет, что составляет от 4 до 11%
[4]. Трансплантация органов или красного ко#
стного мозга у пациентов способствует заболе#
ваемости аденовирусом от 20 до 89% , что уве#
личивает риск смертности до 50% [5].
Циркуляция аденовирусов человека имеет
широкие масштабы, что подтверждает зани#
маемое аденовирусами третье место после
гриппа и респираторно#синцитиальной ин#
фекции в эпидемиологической структуре ос#
трых респираторных вирусных инфекций
(около 9%) [6]. В отличие от эпидемий грип#
па, имеющих довольно строгую сезонность,
аденовирусная инфекция регистрируется на
Иммунопатология, Аллергология, Инфектология 2011 N°3
67
А.М. Хныков, Г.В. Семейко, В.М. Семенов и др.
протяжении всего года с наибольшим пораже#
нием детских групп населения [7].
Современные диагностические подходы для
подтверждения аденовирусной инфекции реа#
лизуются по двум основным направлениям,
первое из которых связано с совершенствова#
нием иммунологических тестов детекции ви#
русных антигенов или антител, а другое # с
выявлением специфических последовательно#
стей вирусного генома в материалах, получен#
ных от больных.
Референс#методы в данной группе диагно#
стических мероприятий # вирусологические
методики, включающие в себя мультиплика#
цию в культуре клеточных линий аденовиру#
сов, выделенных из содержимого носоглоточно#
го секрета, мокроты, фекалий, отделяемого из
конъюнктивы.
Выделенные в культуре клеток изоляты под#
вергают ПЦР#типированию, амплификация ва#
риабельного участка генома аденовируса осу#
ществляется с помощью специфических
праймеров. Далее проводится анализ поли#
морфизма длин рестрикционных фрагментов
(ПДРФ) амплифицированного участка гено#
ма (ПЦР#ПДРФ анализ).
ДНК#маркеры позволяют решить пробле#
му насыщения генома маркерами и исследо#
вать практически любые участки ДНК. Кроме
того, эта маркерная система дает возмож#
ность использовать для анализа лабораторно
адаптированные биологические материалы
(носоглоточные смывы, ликвор, фекалии).
(табл. 1).
ДНК6маркеры на основе анализа
рестрикционного полиморфизма
Открытие и выделение рестрицирующих эн#
донуклеаз (рестриктаз) [8], расщепляющих
ДНК в участках со строго определенной после#
довательностью, позволило разработать марке#
ры на основе анализа рестрикционного поли#
морфизма ДНК. Полиморфизм длин рестрик#
ционных фрагментов (ПДРФ, англ. RFLP #
Restriction Fragment Length Polymorphism).
Впервые ПДРФ был использован как генети#
ческий маркер в 1974 г при идентификации
термо#чувствительной мутации в геноме аде#
новируса [9]. Однако широкое применение
вариантов полиморфизма ДНК в качестве ге#
нетических маркеров началось с 1980 г. после
выхода основополагающей работы Ботштей#
на с соавт. [10], в которой были изучены свой#
ства ПДРФ как генетического маркера, дано
теоретическое обоснование его использова#
ния и предложен метод оценки уровня ин#
формативности. Самими авторами метод
был с успехом применен для картирования
генома человека. ПДРФ используют для ана#
лиза полиморфизма конкретных локусов (ге#
нов). Способ анализа ПДРФ сводится к обра#
ботке ДНК рестриктазами с последующим
электрофоретическим разделением получен#
ной смеси и определением длин рестрикцион#
ных фрагментов после слот#гибридизации со
специфическим меченым зондом. Так как ре#
стрицирующие эндонуклеазы имеют строго
специфические места расщепления, то гене#
тические различия в нуклеотидной последова#
тельности ДНК между индивидуумами (т.е.
полиморфизм на уровне ДНК) приведут к
различному распределению сайтов рестрик#
ции вдоль соответствующих молекул ДНК и
получению продуктов рестрикции # в кото#
рых длина гомологичных фрагментов будет
различаться. Таким образом, полиморфизм
ДНК будет тестироваться как ПДРФ [11, 12].
В большинстве клинических случаев аденови#
русной инфекции, идентификация изолята
подрода (подгруппы) аденовируса столь же
информативна, как более тонкая идентифи#
кация серотипированием. Существует метод
Таблица 1. Свойства ДНКмаркеров
Полезные свойства
Методическое удобство
68
Возможность тестирования любых последовательностей генома
Повсеместность распространения
Стабильность наследования
Информативность о природе генетических изменений
Возможность проведения ретроспективных исследований
Возможность определения в любых тканях
Длительность хранения образцов ДНК
Immunopathology, Allergology, Infectology 2011 N°3
Инфектология: Клинико6лабораторное значение молекулярно6генетических методов в диагностике аденовирусной инфекции
ПЦР, который позволяет идентифицировать
изоляты аденовирусов человека как подроды A,
B:1, B:2, C, D, E, или F. Метод основан на простой
(негнездовой) ПЦР, используя праймеры, кото#
рые связываются с РНК#кодирующими генома#
ми вирусных антигенов аденовирусов. PCR по#
зволяет амплифицировать ДНК от всех ранее
известных опытных образцов 49 человеческих
серотипов аденовируса. Таким образом, суще#
ствуют различия в длинах кодирующих РНК
областей у аденовирусов различных подродов
и есть возможность дифференцировать неко#
торые подроды согласно размеру продукта
ПЦР путем электрофореза.Это формирует
основу для классификации по принадлежно#
сти аденовируса к подроду В:1 С, D, или Е; или
подроду A, B:2 или F. Идентификация подрода
подтверждается путем одноступенчатой рест#
рикцией ферментами и гель#электрофорезом.
Метод может служить как средство для быст#
рой идентификации в лабораторных условиях
по цитопатическому эффекту в культуре кле#
ток Hep#2с или L#20B с одновременной иденти#
фикацией подрода изолята.
Аденовирусы человека разделяются на раз#
ные подроды и характеризуются разной степе#
нью патогенности, течением инфекционного
процесса. Культивирование в тканевых куль#
турах выделяет аденовирусы от других виру#
сов циклом репродукции, а также положи#
тельным либо отрицательным цитопатичес#
ким действием (ЦПД).
В настоящее время аденовирусы представ#
лены широким рядом изучения по генотипу и
серотипу (Табл.2), а также клинической клас#
сификацией по заболеваемости в зависимости
от серотипа вируса (Табл. 3).
Из выше приведенной Табл. 2 следует, что из
известных серотипов аденовирусов человека
лишь у половины выявлена явная связь между
серотипом и вызываемым им заболеванием.
«Золотым стандартом» для данной группы
диагностических мероприятий является мето#
дика, направленная на мультипликацию в куль#
туре клеточных линий аденовирусов, выделен#
ных из содержимого носоглоточного секрета,
мокроты, фекалий, отделяемого из конъюнкти#
вы [13, 14]. Для полного понимания всех осо#
Таблица 2. Вирусологическая классификация аденовирусов
Генотип
Серотип
A
В
С
D
E
F
12,18, 31
3, 7, 11, 14, 16, 21, 34, 35, 50
1,2, 5,6
8#10, 13, 15, 17, 19, 20, 22#30, 32, 33, 36#39, 43#49, 51
4
40,41
Таблица 3. Клиническая классификация аденовирусов
Заболевание
Серотип
Фарингит
Фарингоконъюктивальная лихорадка
Острые респираторные заболевания
Коклюш#подобный синдром
Пневмония
Эпидемический кератоконъюктивит
Острый геморрагический цистит
Гастроэнтерит
Менингит, энцефалит
Миокардит, перикардит
Диссеминированные инфекции
1,2,3,5,6,7
3, 7, 14
3, 4, 7, 11,21
5
1#5, 7, 21
8,19, 37,
11,21
40,41
3, 5, 6, 7, 12
1#3, 7, 21
Все
Иммунопатология, Аллергология, Инфектология 2011 N°3
69
А.М. Хныков, Г.В. Семейко, В.М. Семенов и др.
бенностей выполнения данного стандарта диаг#
ностики следует проследить все этапы выделе#
ния аденовирусов.
Начальным этапом является взятие биоло#
гического материала у больных. В клинической
практике наиболее распространен забор но#
соглоточных смывов и фекалий, реже – спин#
номозговая жидкость, ткань удаленных мин#
далин. Носоглоточные смывы берутся в пер#
вые 3#4 суток острого периода заболевания
из средних носовых ходов, дужек миндалин
сухими ватными палочками соответствующе#
го носовым ходам диаметра с последующим
погружением в транспортную среду (0,9%
физиологический раствор, среда Хенкса).
Важным условием является соскоб поражен#
ного эпителия носоглотки, миндалин с недо#
пущением попадания слизи в среду. Правиль#
ное соблюдение всех условий взятия смыва
предопределяет дальнейший успех выделения
аденовирусов. Фекалии забираются у боль#
ных в течении 3#13 суток от заболевания, т.к.
аденовирус выделяется длительное время при
нахождении больного в стационаре.
Второй этап диагностики включает в себя
обработку полученного материала с последую#
щим пассажем на культуру клеток. Обработка
состоит из центрифугирования и отделения на#
досадочной жидкости.
Не менее необходимым условием является
качество монослоя культуры клеток. В настоя#
щее время применяются линии клеток Нер#2с,
L#20B и А549. Клеточная линия Hep#2c приме#
няется во всем мире на протяжении около 30
лет для идентификации изолятов аденовирусов.
Препарат культуры линии клеток Hep#2c – это
продукт, получаемый из эпителиальной карци#
номы человека.
Что касается клеточной линии L#20B, то дан#
ная культура применяется сравнительно недав#
но в вирусологической практике. L#20B в основ#
ном применяется для выделения полиовирусов,
но также чувствительна к аденовирусам. Благо#
даря программе Всемирной Организации
Здравоохранения по ликвидации и вакциноп#
рофилактике полиомиелита, стало возмож#
ным использовать клеточную линию L#20B
для идентификации аденовирусов.
До настоящего времени на территории
республики Беларусь исследование аденови#
русов с использованием ПЦР#ПДРФ анализа
не проводилось.
Целью данного исследования явилось полу#
чить изоляты аденовирусов с последующим
70
анализом полиморфизма длин рестрикцион#
ных фрагментов (ПДРФ).
Материалы и методы
Под наблюдением находилось 60 стацио#
нарных больных с клиническими проявлени#
ями средней степени тяжести фаринготонзи#
лита, ринофрингита, кишечного синдрома
на базе Витебской областной клинической
инфекционной больницы. Носоглоточные
смывы и фекалии забирали у больных в пер#
вые 3 суток с момента поступления в стацио#
нар. Основными критериями по клинике яви#
лись наличие общеинтоксикационного, тон#
зилярного, кишечного синдромов, лимфоа#
денопатии, гепатоспленомегалии. Получен#
ный материал обрабатывали в лабораторных
условиях путем центрифугирования с полу#
чением надосадочного компонента. Обрабо#
танный материал объемом 0,2 мл экстракта
вносили в пробирки с монослоем Нер#2 кле#
ток в наклонном положении 30 град. с поме#
щением в термостат при 36оС. Монослой про#
веряли ежедневно на признаки дегенерации в
течение 7#10 дней. Все изоляты с ЦПД до 75%
монослоя сохраняли при температуре #20 оС
для дальнейшего исследования. Допускались
к дальнейшему анализу изоляты с круглокле#
точной дистрофией монослоя для морфоло#
гического разделения ЦПД другими возмож#
ными вирусами.
Отобранные изоляты исследовались в ПЦР
диагностике по количественному определе#
нию ДНК аденовируса. ПЦР состояла в сред#
нем из 25 циклов. Денатурацию протекала
при температуре 95#960С в течение 1,5#2 мин,
отжиг при т#ре 68#700С в течение 2 мин, элон#
гация цепочки ДНК при т#ре 70#72 0С в тече#
ние 7#10 мин. Выделенную ДНК подвергали
электрофорезу в агарозном геле с последую#
щей идентификацией продуктов ПЦР.
ПЦР#типирование проводили классичес#
ким вариантом RFLP#анализа. Амплифика#
цию вариабельного участка генома аденови#
руса осуществляли с помощью специфичес#
ких праймеров VA3a [5’#CGG T[G/C]A GGC
G[T/C]G CGC AGT C#3’], VA3b (5’#CGG TAA
GAC GGG CGC AAT C3’) VA6 [5’#CGC AGC
AC[C/G/T/A] GGA TGC ATC T#3’] при темпе#
ратуре отжига 45°С. ПЦР#ПДРФ анализ полу#
ченных изолятов проводили рестрикцион#
ным методом, используя 2#х ступенчатый ал#
горитм обработки амплифицированных
продуктов рестриктазами (Ava I, Sfu I, Taq I).
Immunopathology, Allergology, Infectology 2011 N°3
Инфектология: Клинико6лабораторное значение молекулярно6генетических методов в диагностике аденовирусной инфекции
Идентификацию характерных электрофоре#
тических участков осуществляли с помощью
DNA#маркера молекулярного веса (Sigma) в
диапазоне 240#520 bp.
Результаты и обсуждение
Исследование 36 носоглоточных смывов и
24 образцов фекалий у больных аденовирус#
ной инфекции выявило разницу по выделяе#
мости изолятов, наличие микст#форм. Выделе#
ние аденовируса из носоглоточных смывов дало
13 изолятов с ЦПД 60#75% , из фекалий образ#
цов после обработки в культуре и ПЦР#иссле#
дования выделили 5 изолятов вирусов Coxacie
B, 1 кишечный изолят был идентифицирован
при культивировании как неполиовирус.
Результатом проведенного нами анализа
явилось установление циркуляции на терри#
тории Витебской области четырех генотипов
аденовирусов (В1, В2, А, и F) (Рис.1). Генотип
В1 включал в себя серотипы 3, 7, 16, 21, обна#
руживался в г. Витебске и вызывал заболева#
ния с поражением верхних дыхательных пу#
тей. Генотип с генетической субъединицей В2
(серотипы 11, 14, 34, 35), вызывал заболева#
ния, которые характеризовались наличием
тонзиллярного синдрома. Появление кишеч#
ного синдрома при аденовирусной инфекции
указывало на генотип F (серотипы 40,41).
Заключение
Представленный анализ изолятов аденовиру#
сов подтверждает циркуляцию наиболее пато#
генных серотипов на территории Витебской
области и, что не исключено, других регионов
Республики Беларусь.
Преобладание диагностики аденовирусной
инфекции методом флюоресценции антител
из носоглоточных смывов согласно протоко#
лу обследования не имеет специфичности, не
дает возможности определения генетических
вариантов. Не менее искажающим фактором
является гипердиагностика в инфекционных
стационарах аденовирусной инфекции по
клинической картине заболевания, наличие
микст#форм острых вирусных респираторных
заболеваний. Улучшить данную ситуацию по#
зволяют экспресс#методы диагностики с ис#
пользованием моноклональных антител к
аденовирусу определенного серотипа на им#
мунохроматографических тест#полосках из
стула больных.
Рис. 1. Профиль ПЦР и полиморфизма длин фрагмента рестрикции полученных изолятов аденовирусов (нега
тив).
Иммунопатология, Аллергология, Инфектология 2011 N°3
71
А.М. Хныков, Г.В. Семейко, В.М. Семенов и др.
Литература
1. Dora P Rosete, Maria Eugenia Manjarrez, Blanca L Barron/
Laboratorio de Virologia, Escuela Nacional de Ciencias Biologicas,
Instituto Politecnico Nacional, Carpio y Plan de Ayala s/n,
11340 Mexico D.F.: 195#200.
ная диагностика инфекционных болезней».#Беларусь,
Минск, 2007: 158.
2 . Weissenbacher MC, Avila M 1999. Viruses as the cause
of upper a nd lower ARI in children: General
characteristics and diagnosis. In Y Benguigui, FJ Lopez#
Antunano, G Schmunis, J Yunes, Respiratory infections
in children, Pan Americ an Health Organization,
Washington DC: 87#104.
8. Arber W. Science 1979; V. 205: 361.
3. Chang C.H., Sheu M.M., Chern C.L. et al. Southern Taiwan.
Jap. J. Opthal., 2001: 160#166.
11. Алтухов Ю.П., Салменкова Е.А. Генетика 2002; Т. 98, №
9: 1173.
4. Cherry J.D. Adenoviral infections. In: Feigin RD, Cherry JD,
eds. Textbook of Pediatric Infectious Diseases. 4th ed.
Philadelphia: WB Saunders; 1998; 1666: 84.
12. Сулимова Г.Е. Усп. Соврем. Генетики 1993; Вып.18: 3.
5. Blood 2002; 100; 1619: 27.
6. Амосова И.В. Сравнительный анализ результатов ди#
агностики гастроэнтеритов аденовирусной этиологии с
использованием методов электронной микроскопии, им#
муноферментного анализа и ПЦР. Материалы Междуна#
родной научно#практической конференции «Молекуляр#
7. Покровский В.И. Инфекционные болезни и эпидеми#
ология 2007: 362#363.
9. Grodzicker T., Williams J., Sharp P., Sambrook J. Cold
Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 1974; V.39: 439.
10. Вotstein D., White R.L., Skolnick M., Davis R.V. Amer. J.
Hum. Genet. 1980; V.32: 314.
13. Dora P. Rosete, Marнa Eugenia Manjarrez, Blanca L. Barrуn.
Adenoviruses C in non#hospitalized Mexican children older than
five years of age with acute respiratory infection. Inst. Oswaldo
Cruz, Rio de Janeiro 2008; Vol. 103(2): 195#200.
14. Kidd AH, Jonsson M, Garwics D, Kjon AE, Wermenbol AG,
Verweij MW, De Jong JC Rapid subgenus identification of hu#
man adenovirus isolates by a general PCR. J. Clin. Microbiol.
1996; 34 : 622#627.
Сведения об авторах
1. Хныков Алексей Михайлович – аспирант кафедры инфекционных болезней ВГМУ,
г. Витебск, пр6т Фрунзе, 73, 210009
e6mail: 99145@inbox.ru, тел. 860296366667694
2. Семейко Галина Викторовна – кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории иммунопрофилактики ГУ «РНПЦ эпидемиологии и
микробиологии», г. Минск, ул. Филимонова,23
e6mail: g6semeiko@yandex.ru. тел. 8(017)267670697
3. Самойлович Елена Олеговна 6 кандидат биологических наук, доцент, заведующая лаборатории иммунопрофилактики ГУ «РНПЦ эпидемиологии и микроби6
ологии», г. Минск, ул. Филимонова, 23
e6mail: esamoilovich@gmail.com тел. 8(017)267670697
4. Семенов Валерий Михайлович – доктор медицинских наук, профессор, декан лечебно6профилактического факультета УО ВГМУ, г.Витебск, пр6т Фрунзе,
27.
e6mail: vmsemenov@mail.ru
Поступила 31.08.2011 г.
72
Immunopathology, Allergology, Infectology 2011 N°3