разработка и изучение рекомбинантных антител против вируса
advertisement
На правах рукописи БАЙКОВ ИВАН КОНСТАНТИНОВИЧ РАЗРАБОТКА И ИЗУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ АНТИТЕЛ ПРОТИВ ВИРУСА КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА 03.01.04 – биохимия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Новосибирск – 2015 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН Научный руководитель: д.б.н., доцент Тикунова Нина Викторовна Официальные оппоненты: Габибов Александр Габибович, д.х.н., профессор, член-корр. РАН Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН, зам. директора по научной работе Локтев Валерий Борисович, д.б.н., профессор Федеральное бюджетное учреждение науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор», заведующий отделом молекулярной вирусологии флавивирусов и вирусных гепатитов Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное Лимнологический институт СО РАН учреждение науки Защита состоится «23» октября 2015 года в 10:00 часов на заседании диссертационного совета Д 003.045.01 на базе Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН по адресу 630090, г. Новосибирск, пр. Ак. Лаврентьева, 8 С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН и на сайте www.niboch.nsc.ru Автореферат разослан «____» ___________ 2015 г. Ученый секретарь диссертационного совета, к.х.н., доцент Коваль В. В. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Антитела (иммуноглобулины) – гликопротеины сыворотки крови, которые образуются клетками иммунной системы в ходе иммунного ответа на чужеродные для организма соединения, называемые антигенами, и необходимы для их нейтрализации и деградации. В настоящее время антитела и их производные широко используются в медицине для лечения, предотвращения и диагностики различных заболеваний и нарушений. Использование сывороточных антител человека и моноклональных антител животных в терапии ограничено, что связано либо с их поликлональным характером, либо с чужеродностью таких антител для человека. Широкое развитие получили различные варианты рекомбинантных (искусственных) антител, таких как химерные, гуманизированные и полноразмерные человеческие антитела. Такие антитела конструируют генно-инженерными методами и получают биотехнологически в культурах клеток, контролируя их свойства и обеспечивая однородность от партии к партии. Благодаря возможности изменять и добавлять функциональные участки в молекуле антитела, технология создания рекомбинантных антител позволяет получать биомолекулы, специализированные для решения конкретной задачи. В результате, рекомбинантные антитела являются активным компонентом многих современных противораковых и противовирусных препаратов, а также препаратов для лечения аутоиммунных заболеваний (Nelson A. L. et al., 2010). Одной из проблем здравоохранения Российской Федерации, ряда европейских стран, а также северного Казахстана, Монголии и Китая является клещевой энцефалит, вызываемый вирусом клещевого энцефалита (ВКЭ) (Suss J., 2010). Ежегодно в мире клещевым энцефалитом заболевают по разным оценкам от 6 до 12 тысяч человек, при этом более половины случаев приходится на территорию Российской Федерации (Lindquist L. et al., 2008). В России и Казахстане для профилактики и этиотропной терапии клещевого энцефалита применяют «Иммуноглобулин человека против клещевого энцефалита» (ФГУП «НПО «Микроген», Россия), получаемый из плазмы крови доноров, проживающих в природных очагах заболевания (Пеньевская Н. А. и др., 2010) Дефицит и высокая стоимость данного препарата, а также возможный биологический риск при его применении приводят к необходимости поиска альтернативных терапевтических средств. В качестве альтернативы могут быть использованы рекомбинантные полноразмерные антитела, такие как химерные или гуманизированные варианты мышиных антител против вируса клещевого энцефалита. Цель данной работы – создание протективного химерного антитела против гликопротеина Е вируса клещевого энцефалита и изучение его иммунохимических и противовирусных свойств. В соответствии с поставленной целью было необходимо решить следующие задачи: 1) клонировать гены гибридомной линии клеток, кодирующие вариабельные домены протективного моноклонального антитела против вируса клещевого энцефалита; 2) сконструировать кассетные векторные плазмиды для экспрессии генов, кодирующих полноразмерные антитела с константными доменами иммуноглобулинов человека, в эукариотических клетках и получить на их основе плазмиды с генами лёгкой и тяжёлой цепей химерного антитела против ВКЭ; 1 3) провести очистку химерного антитела, наработанного путём транзиентной экспрессии в эукариотических клетках, и исследовать его структурные характеристики: молекулярную массу, число лёгких и тяжёлых цепей, степень и тип гликозилирования; 4) определить сродство химерного антитела к белку Е вируса клещевого энцефалита и исследовать противовирусные свойства этого антитела по отношению к вирусу клещевого энцефалита. Научная новизна работы. В настоящей работе впервые было сконструировано химерное антитело, способное защищать мышей от введения сотен летальных доз ВКЭ. Определены нуклеотидные последовательности участков, кодирующих вариабельные домены ряда перспективных мышиных моноклональных антител (МКА) против ВКЭ. Полученные последовательности депонированы в базу данных GenBank. Показано, что введение химерного антитела ch14D5a в субнейтрализующей дозировке не вызывает антителозависимого усиления инфекции на мышиной модели клещевого энцефалита. Основные научные положения, выносимые на защиту. 1. Впервые сконструировано химерное антитело, способное защищать мышей от введения сотен летальных доз ВКЭ. 2. Структурная организация сконструированного химерного антитела, включая тип гликозилирования, соответствует характеристикам рекомбинантных антител, получаемых в клетках CHO и применяемых в терапии. 3. Гибридомная линия клеток 14D5 продуцирует протективные антитела против ВКЭ с двумя типами вариабельных доменов лёгкой цепи, отличающимися по последовательности а.к.о. и относящимися к разным семействам VL-генов мыши. 4. Сконструированные плазмиды pCH2 и pCL2 позволяют ускорить процесс получения новых полноразмерных антител с константными доменами иммуноглобулинов человека в эукариотических клетках по сравнению с предыдущими плазмидами pCH и pCL. Практическая и теоретическая значимость работы. Получено химерное антитело ch14D5a против ВКЭ, которое обладает терапевтическим потенциалом и может быть использовано для создания новых эффективных средств профилактики и лечения клещевого энцефалита, отвечающих современным стандартам. Сконструированы плазмидные шаттл-векторы pCH2 и pCL2, предназначенные для экспрессии в эукариотических клетках генов тяжёлых и легких цепей полноразмерных рекомбинантных антител, содержащих константные домены иммуноглобулинов IgG1/каппа человека. Эти плазмиды могут быть использованы для получения различных полноразмерных антител, в частности с их помощью были получены полноразмерные человеческие антитела против ортопоксвирусов (Khlusevich Y. A. et al., 2014; Байков И. К. и др., 2013), ДНК-гидролизующие полноразмерные антитела (Morozova V. V. et al., 2013), а также антитела против интерлейкина-18 (данные не опубликованы). Сконструированы плазмиды pCH2-14D5 и pCL2-14D5a, кодирующие цепи химерного антитела против ВКЭ. С помощью этих плазмид возможно получение вариантов антитела ch14D5a в экспрессионных системах, отличных от клеток CHO, например, для получения различных гликоформ этого антитела. 2 Полученные в данной работе нуклеотидные последовательности, кодирующие вариабельные домены некоторых наиболее перспективных МКА против ВКЭ, могут быть использованы для анализа и сравнения с последовательностями других антител. Для антитела ch14D5a определены иммунохимические и противовирусные свойства, такие как сродство к белку Е ВКЭ, индекс нейтрализации (IC50) и протективная активность на мышиной модели ВКЭ. Эти данные могут быть использованы для анализа и сопоставления со свойствами других антител против ВКЭ. Апробация работы и публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи, из них 2 статьи в журналах из списка ВАК и 2 в рецензируемых зарубежных журналах. Кроме этого получен патент РФ. Материалы диссертации были также представлены на различных Российских и зарубежных конференциях: XLVI и XLIХ Международная научная студенческая конференция «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, Россия, 2008 и 2011); МЭСК–2008 – XIII Международная экологическая студенческая конференция «Экология России и сопредельных территорий. Экологический катализ» (Новосибирск, Россия, 2008); IV и V Российские симпозиумы «Белки и пептиды» (Казань, Россия, 2009 и Петрозаводск, Россия, 2011); Научная конференция «Медицинская геномика и протеомика» (Новосибирск, Россия, 2009); ХХII зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». (Москва, Россия, 2010); Международные научные конференции «Клещевой энцефалит и другие инфекции, переносимые клещами» (Иркутск, 2012) и «Фундаментальные науки - медицине» (Новосибирск, 2012); 38th FEBS Congress (Санкт-Петербург, 2013); Научнопрактическая конференция «Диагностика и профилактика инфекционных болезней» (Новосибирск, 2013); “17th Annual Meeting of the European Society for Clinical Virology” (Прага, Чехия, 2014); “3rd Antivirals Congress” (Амстердам, Нидерланды, 2014). Вклад автора. Большинство экспериментов и анализ полученных данных сделаны лично автором. Автор благодарен коллегам, которые помогли выполнить некоторые эксперименты, без которых работа была бы неполной. В частности, протективная активность антител была исследована в НПО «Микроген», г. Томск. Изучение вируснейтрализующей активности in vitro выполняли совместно с к. б. н. А. Б. Рыжиковым, ФБУН ГНЦ ВБ “Вектор”. Некоторые стадии при создании генетических конструкций, кодирующих химерное антитело, выполнены при содействии И.Н. Бабкиной. Трансфекцию и культивирование эукариотических клеток для наработки химерных антител осуществлял А. Л. Матвеев. При секвенировании ДНК капиллярный электрофорез подготовленных проб выполняли сотрудники Центра коллективного пользования “Геномика” СО РАН. В масс-спектрометрических исследованиях определение масс-спектров подготовленных образцов выполнено сотрудниками Центра масс-спектрометрического анализа ИХБФМ СО РАН либо сотрудником Лимнологического института СО РАН И. Г. Кондратовым. Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов работы, их обсуждения, заключения, выводов, списка литературы и приложений. Работа изложена на 157 страницах, содержит 43 рисунка, 6 таблиц и 7 приложений. Список литературы состоит из 305 источников. 3 СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Оценка протективной активности мышиных моноклональных антител против ВКЭ in vivo с целью выбора прототипного антитела При создании химерного антитела против ВКЭ необходимо выбрать в качестве источника вариабельных доменов антитело, обладающее наибольшей противовирусной активностью. Ранее в ИХБФМ СО РАН (НИБХ СО АН) была получена панель мышиных МКА, специфичных к поверхностному гликопротеину Е ВКЭ (Матвеев Л. Э. и др., 1989), и было показано, что некоторые из этих антител способны ингибировать инфекционность ВКЭ in vitro (Tsekhanovskaya N. A. et al., 1993). В настоящей работе протективную активность трёх высокоаффинных вируснейтрализующих антител 14D5, 13D6 и 1B1 исследовали на периферической мышиной модели ВКЭ (Тимофеев А. В. и др., 2001). Животных инфицировали приблизительно 500 ЛД50 вируса, препараты антител в дозировке 150 мкг/мышь вводили внутривенно через 24 ч после инфицирования. В результате эксперимента было установлено, что выживаемость мышей в случае введения антитела 14D5 выше по сравнению с антителами 1B1 и 13D6 (Рисунок 1). На основании этого МКА 14D5 было выбрано в качестве прототипа для создания химерного антитела против ВКЭ. Рисунок 1. Протективная активность МКА против ВКЭ in vivo. Мышам вводили по 150 мкг указанных МКА внутривенно через 24 ч после инфицирования 500 ЛД50 ВКЭ. * p<0,05; ** p<0,005 (логранговый критерий). 2. Получение ДНК-фрагментов, кодирующих вариабельные домены МКА 14D5, 1B1 и 13D6, и определение нуклеотидных последовательностей этих фрагментов Из гибридомных клеток линии 14D5, продуцирующих МКА 14D5, была выделена РНК, которую использовали для синтеза фрагментов кДНК, кодирующих вариабельные домены антитела. Для синтеза ПЦР-фрагментов, кодирующих VH- и 4 VL-домены, использовали праймеры, соответствующие началу каркасных областей Vгенов, и праймеры, комплементарные началу генов, кодирующих константные домены IgG1/kappa-антител мыши. В результате ПЦР для тяжёлой цепи синтезировался один ДНК-фрагмент VH14D5, а для лёгкой цепи образовалось три фрагмента VL14D5a, VL14D5b и VL14D5c с различной электрофоретической подвижностью (Рисунок 2). Рисунок 2. Электрофореграмма в 6% ПААГ ПЦРфрагментов, полученных с кДНК гибридомных клеток линии 14D5. М – плазмидная ДНК pQpE, гидролизованная эндонуклеазой HaeIII. Каждый из полученных ПЦР-фрагментов встроили в плазмиду pUC19 по сайтам эндонуклеаз рестрикции EcoRI и HindIII; плазмиды обозначили pUC19-VH14D5, pUC19-VL-14D5a, pUC19-VL-14D5b и pUC19-VL-14D5c. После этого были определены нуклеотидные последовательности встроенных участков для нескольких клонов каждой из полученных плазмид. Анализ последовательностей с помощью базы данных IMGT/V-QUEST (http://www.imgt.org) выявил, что последовательность фрагмента VH14D5 относится к семейству IGHV1 антител мыши, VL14D5a – к семейству IGKV10, а VL14D5b – к семейству IGKV6, согласно классификации IMGT. Последовательность фрагмента VL14D5c содержит V-участок (нуклеотиды 1 – 296), идентичный зародышевому гену IGKV3-5, однако вместо J-сегмента присутствует вставка участка генома (нуклеотиды 297 – 360), которая приводит к сдвигу рамки трансляции, что препятствует образованию легких цепей с константным доменом. Аналогичным образом были определены нуклеотидные последовательности фрагментов, кодирующих антитела 1B1 и 13D6. Как и в случае гибридомы 14D5, для тяжёлых цепей антител 1B1 и 13D6 было получено по одному ДНК-фрагменту, тогда как для лёгких цепей в результате ПЦР образовалось несколько фрагментов с различной электрофоретической подвижностью. В результате секвенирования было установлено, что последовательности фрагментов VH1B1 и VH13D6 относятся к семейству IGHV1 антител мыши, VL1B1a и VL13D6a – к семейству IGKV10. Нуклеотидные последовательности ДНК-фрагментов VL1B1b и VL13D6b оказались идентичны нуклеотидной последовательности фрагмента VL14D5b. Сравнение последовательностей а.к.о. вариабельных доменов мышиных антител 14D5, 1B1 и 13D6, а также некоторых других антител против ВКЭ (Байков И. К. и др., 2012) показало, что VH-последовательности антител 14D5, 1B1 и 13D6 выделяются в одну группу, а VH-последовательности антител 10С2 и 14D2 образуют другую группу. Это хорошо согласуется с данными эпитопного картирования, проведённого для этих антител, а также с их противовирусными свойствами (Tsekhanovskaya N. A. et al., 1993). VL-последовательности VL14D5a, VL1B1, VL13D6a 5 и VL14D2 образуют одну группу, VL-последовательности VL14D5b и VL13D6 образуют другую группу. Отдельно от них отстоит последовательность VL10C2. Сравнение с последовательностями антител E6B и 4.2 (Jiang W. et al., 1994; Тикунова НВ и др., 1999) не выявило значительной гомологии. 3. Электрофоретический и масс-спектрометрический анализ образца МКА 14D5 Чтобы определить, какие именно лёгкие цепи содержатся в молекулах антитела, секретируемого гибридомой 14D5, провели электрофоретическое разделение образца МКА 14D5 с последующим масс-спектрометрическим анализом легких и тяжёлых цепей отдельно. В результате этого было установлено, что препарат МКА 14D5 содержит молекулы IgG c лёгкими цепями двух типов: light_14D5a и light_14D5b, соответствующими последовательностям VL14D5a и VL14D5b (Рисунок 3). Пиков, соответствующих неполной лёгкой цепи light_14D5c, не было обнаружено в спектре. Исходя из соотношения высот пиков, соответствующих пептиду LLIYYTSR ([M+H+]=1028,6) цепи light_14D5a и пептиду LLIYSASYR ([M+H+]=1085,6) цепи light_14D5b, можно предположить, что соотношение лёгких цепей light_14D5a и light_14D5b в препарате МКА 14D5 составляет приблизительно 1:3. Для мышиных гибридомных линий клеток описаны случаи секреции двух различных лёгких цепей одновременно (Köhler G. et al., 1976; Zack D. J. et al., 1995). На основании результатов сравнения полученных последовательностей VL14D5a и VL14D5b с известными последовательностями мышиных антител и антител, секретируемых миеломами, не удалось однозначно определить, какая из цепей light_14D5a или light_14D5b вносит больший вклад в сродство МКА 14D5 к гликопротеину Е ВКЭ. Поэтому было решено получить два химерных антитела ch14D5a и ch14D5b с одинаковыми тяжелыми и разными лёгкими цепями. Рисунок 3. MALDI-TOF масс-спектр триптических фрагментов лёгких цепей антитела 14D5, снятый в рефлективном положительном режиме с использованием матрицы DHB. Пики, отмеченные ▲, соответствуют цепи light_14D5a, тогда как пики, отмеченные , соответствуют цепи light_14D5b. Пики, отмеченные соответствуют константному домену каппа-цепей мышиных антител. 6 4. Конструирование кассетных плазмидных ДНК для экспрессии полноразмерных рекомбинантных антител с константной частью иммуноглобулинов человека IgG1/каппа Для транзиентной экспрессии полноразмерных антител в клетках млекопитающих ранее использовали плазмиды pCH и pCL, содержащие гены тяжёлой цепи с константной частью IgG1 человека и лёгкой цепи с константной частью каппа-цепей антител человека, соответственно (патент РФ № 2285043). Эти плазмиды сконструированы на основе коммерческого вектора pcDNA3.1(+) (Invitrogen), гены тяжёлой и лёгкой цепей находятся в них под контролем цитомегаловирусного промотора и содержат последовательность сигнала полиаденилирования гена бычьего гормона роста. Обе плазмиды содержат в качестве селективного маркера ген аминогликозид 3’-фосфотрансферазы, обеспечивающий устойчивость к генетицину. В данной работе на основе плазмид pCH1 и pCL1 были получены кассетные плазмидные ДНК pCH2 и pCL2, в которых можно заменять V-гены, получая при этом новые антитела с различной специфичностью. Кроме того в плазмиде, кодирующей лёгкую цепь, был заменён ген устойчивости к антибиотику. Это позволяет осуществлять независимый селективный отбор клонов по каждой из плазмид, что необходимо при получении клеточного клона, стабильно секретирующего антитело. На первой стадии в плазмиде pCL1 ген Neo, обеспечивающий устойчивость к генетицину, заменили на ген hygroB, кодирующий гигромицин Б-киназу и обеспечивающий устойчивость к гигромицину Б. Для этого плазмиду pCL1 гидролизовали эндонуклеазами рестрикции NheI и ApaI, после чего фрагмент light1_NA, содержащий ген лёгкой цепи, встроили в гидролизованную теми же эндонуклеазами рестрикции плазмиду pcDNA3.1/Hygro(+) (Invitrogen), содержащую ген устойчивости к гигромицину Б. В результате была получена плазмида pCL1/hygro, несущая ген устойчивости к гигромицину Б. Далее в плазмиды pCH1 и pCL1/hygro сайт-направленным мутагенезом были введены дополнительные уникальные сайты гидролиза эндонуклеазами рестрикции в 5'- и 3'-концевые области VH- и VL-участков. Сайты были подобраны таким образом, чтобы они редко встречались в VH- и VL-последовательностях антител человека и мыши, а также чтобы их введение минимально изменяло консервативную аминокислотную последовательность N- и С-концов вариабельных доменов антител. В результате анализа последовательностей вариабельных доменов мышиных и человеческих антител с помощью базы данных Abysis (www.bioinf.org.uk/abysis/) были выбраны сайты эндонуклеаз XhoI и Acc65I (KpnI) для плазмиды pCH1 и сайты эндонуклеаз EcoRV и HindIII для плазмиды pCL1/hygro. Для конструирования кассетного вектора pCL2 на основе плазмиды pCL1/hygro из этой плазмиды предварительно удалили некодирующий участок полилинкера с 1640 п.н. по 1681 п.н., содержащий сайт HindIII, с образованием промежуточной плазмиды pCLm1. Затем удалили участок с 1301 п.н. по 1312 п.н. длиной 12 п.н., кодирующий неестественную для иммуноглобулинов вставку Ala-Leu-Gly-Arg между VL- и CL-доменами, с образованием ДНК-фрагмента light_delta. Далее методом мегапраймера (Giebel L. B. et al., 1990; Ke S. H. et al., 1997) последовательно вводили сайты эндонуклеаз рестрикции EcoRV и HindIII, в результате чего получили плазмиду pCLm2, содержащую сайты EcoRV и HindIII в положениях 977 п.н. и 1283 п.н. Полученную плазмиду pCLm2 обрабатывали эндонуклеазами рестрикции EcoRV и HindIII и объединяли в реакции лигирования с двуцепочечным олигонуклеотидным 7 коннектором, образованном олигонуклеотидами Lconn_dir и Lconn_rev. В результате получили плазмиду pCL2 (Рисунок 4), обеспечивающую удобное клонирование генов, кодирующих VL-домены различных антител. Для конструирования кассетного вектора pCH2 на основе плазмиды pCH1 из этой плазмиды предварительно удалили некодирующий участок с 2346 п.н. по 2497 п.н., содержащий сайт XhoI, с образованием промежуточной плазмиды pCHm1. Затем методом мегапраймера последовательно вводили сайты эндонуклеаз рестрикции XhoI и Acc65I, в результате чего получили промежуточную плазмиду pCHm2, содержащую сайты XhoI и Acc65I в положениях 999 п.н. и 1311 п.н., соответственно. Плазмиду pCHm2 обрабатывали эндонуклеазами рестрикции XhoI и Acc65I и объединяли в реакции лигирования с двуцепочечным олигонуклеотидным коннектором Hconn, образованном олигонуклеотидами Hconn_dir и Hconn_rev. В результате получили плазмиду pCH2 (Рисунок 4), обеспечивающую удобное клонирование генов, кодирующих VH-домены различных антител. Кассетные векторные плазмиды pCH2 и pCL2 удобны для клонирования последовательностей вариабельных доменов с целью получения полноразмерных рекомбинантных антител. Кроме данной работы эти плазмиды также использовали для получения полноразмерных человеческих антител против ортопоксвирусов (Байков И. К. и др., 2013; Khlusevich Y. A. et al., 2014), ДНК-гидролизующих полноразмерных антител (Morozova V. V. et al., 2013), а также антител против интерлейкина-18. pCMV R Amp pCMV signal sequence R Amp signa sequence EcoRV, HindIII XhoI, Acc65I human kappa constant human IgG1 constant pCL2 pCH2 HygroBR NeoR Рисунок 4. Схема кассетных векторных плазмид pCH2 и pCL2. 5. Конструирование плазмидных ДНК для экспрессии химерных антител на основе МКА 14D5 Кассетные векторные плазмиды pCH2 и pCL2 были использованы при конструировании плазмид для экспрессии химерных антител против ВКЭ на основе фрагментов ДНК VH14D5, VL14D5a и VL14D5b.ДНК-фрагмент VH14D5, кодирующий VH-домен мышиного МКА 14D5, был получен в результате ПЦР с плазмиды pUC19VH-14D5 с использованием праймеров VH_dir_XhoI и VH_rev_Acc65I и встроен в плазмиду pCH2 по сайтам эндонуклеаз XhoI и Acc65I. ДНК-фрагменты VL14D5a и VL14D5b, кодирующие VL-домены мышиного МКА 14D5, были получены в результате ПЦР с плазмид pUC19-VL-14D5a и pUC19-VL-14D5b с использованием праймеров VL_dir_EcoRV и VL_rev_HindIII и встроены в плазмиду pCL2 по сайтам эндонуклеаз EcoRV и HindIII. В результате были получены плазмидные ДНК pCH214D5, pCL2-14D5a и pCL2-14D5b (Рисунок 5). 8 pCMV R Amp pCMV signal sequence R Amp EcoRV XhoI pCH2-14D5 signa sequence VH14D5 VL14D5a Acc65I HindIII pCL2-14D5a human IgG1 constant human kappa constant HygroBR NeoR Рисунок 5. Схема плазмид pCH2-14D5 и pCL2-14D5a. Схема плазмиды pCL214D5b аналогична схеме плазмиды pCL2-14D5a. Оптическая плотность, mAU 6. Наработка и очистка химерных антител ch14D5a и ch14D5b Антитела ch14D5a и ch14D5b получали в результате транзиентной экспрессии генов лёгкой и тяжёлой цепей антитела в линии эукариотических клеток CHO-K1. Клетки ко-трансфицировали соответственно плазмидами pCH2-14D5 + pCL2-14D5a, а также pCH2-14D5 + pCL2-14D5b с использованием реагента “Lipofectamine 2000” (Life Technologies) согласно методике, рекомендованной производителем. Культуральную жидкость заменяли каждые сутки свежей средой DMEM F12 advanced (Gibco) с 2% фетальной сывороткой быка с пониженным содержанием иммуноглобулинов (Life technologies) в течение 7 дней. Собранную культуральную жидкость объемом 600 мл осветляли центрифугированием и фильтрацией, после чего выделяли антитело хроматографией на белок А-сефарозе (Рисунок 6). 2,0 pH 5,0 1,0 Рисунок 6. Очистка антитела ch14D5a аффинной хроматографией на белок А-сефарозе pH 3,0 Элюция химерного антитела Элюция антител быка 0,0 5 10 15 20 30 25 35 40 Время, мин Поскольку кроме целевого химерного антитела культуральная жидкость также содержала иммуноглобулины из фетальной сыворотки быка, стандартная методика (Antibody purification handbook, 2001) была модифицирована. При отработке методики хроматографического выделения было установлено, что иммуноглобулины быка полностью элюируются 0,1М цитратным буфером с pH 5,0, а целевое антитело смывается аналогичным буфером с pH 3,0. Поэтому к стандартной методике была добавлена стадия элюции иммуноглобулинов быка 0,1М цитратным буфером с pH 5,0. После аффинной хроматографии раствор химерного антитела нейтрализовали и осуществляли дополнительную очистку от клеточных белков и ДНК анионообменной 9 хроматографией в проточном режиме. Химерное антитело ch14D5b было очищено аналогично. Выход обоих антител составил 0,4 – 0,6 мг с литра полученной культуральной жидкости. Электрофорезом в невосстанавливающих условиях было показано, что исследованные образцы антител ch14D5a и ch14D5b содержат белки с высокой молекулярной массой и не содержат отдельно лёгких или тяжёлых цепей либо их фрагментов (Рисунок 7). В восстанавливающих условиях антитела разделяются на лёгкие и тяжёлые цепи с молекулярной массой 25 кДа и 50 кДа, соответственно (Рисунок 7). нативные химерные антитела 250 кДа 150 кДа 50 кДа тяжелые цепи антител 25 кДа легкие цепи антител M 1 2 3 4 Рисунок 7. Электрофореграмма очищенного антитела ch14D5a в 12% ДСН-ПААГ в восстанавливающих (дорожка 1) и невосстанавливающих (дорожка 3) условиях, и очищенного антитела ch14D5b в восстанавливающих (дорожка 2) и невосстанавливающих (дорожка 4) условиях. M – белковый маркер молекулярных масс. Поскольку моноклональные антитела склонны к агрегации (Remmele R. L. et al., 2006; Deperalta G. et al., 2013), высокоэффективной гель-фильтрацией было проверено наличие ди- и олигомеров в образцах антител (Рисунок 8). Было установлено, что время выхода основного пика антител согласно калибровочной хроматограмме соответствует молекулярной массе около 100 кДа и хорошо согласуется с опубликованными хроматографическими профилями препаратов моноклональных антител, содержащих преимущественно мономерную форму (Remmele R. L. et al., 2006; Deperalta G. et al., 2013). Примесь димерной и тримерной форм (пики с объёмом элюции Ve = 5,2 и 6,1 мл) составила менее процента. Для подтверждения того, что полученные химерные антитела содержат константные части иммуноглобулинов человека класса IgG1, был проведён вестернблот анализ образцов антител ch14D5a и ch14D5b с использованием моноклонального иммуноконъюгата против Fc-фрагмента антител IgG1 человека и поликлонального иммуноконъюгата против антител человека. В качестве отрицательного контроля использовали мышиное МКА 14D5. Анализ подтвердил принадлежность константных участков химерных антител к человеческим иммуноглобулинам (Рисунок 9). 10 Кональбумин, 75кДа Альдолаза, 158 кДа Овальбумин, 44кДа Ферритин, 440 кДа Тиреоглобулин, 669 кДа ch14D5a Рисунок 8. Хроматографический анализ образца антитела ch14D5a высокоэффективной гель-фильтрацией. Хроматограмма антитела ch14D5a вместе с хроматограммой калибровочных белков. 150 кДа 55 кДа 25 кДа M 1 2 3 4 Рисунок 9. Вестерн-блот анализ антител ch14D5a и ch14D5b, разделённых электрофорезом в восстанавливающих условиях. тяжелые цепи Химерные антитела ch14D5a антител (дорожка 1) и ch14D5b (дорожка 3), проявленные иммуноконъюгатом моноклонального антитела мыши против Fc-фрагмента антител IgG1 легкие цепи человека; химерные антитела антител ch14D5a (дорожка 2) и ch14D5b (дорожка 4), проявленные иммуноконъюгатом поликлональных антител козы против антител IgG человека. 7. Масс-спектрометрический анализ химерных антител ch14D5a и ch14D5b. Анализ типа гликозилирования у полученных антител. Структуру антител ch14D5a и ch14D5b дополнительно подтверждали массспектрометрическим анализом продуктов гидролиза антител трипсином (Рисунок 10). Спектр лёгкой цепи антитела ch14D5a содержит пик 1028,6, соответствующий пептиду LLIYYTSR, а спектр лёгкой цепи антитела ch14D5b содержит пик 1085,6, соответствующий пептиду LLIYSASYR. Покрытие составило около 80% для антитела ch14D5a и около 60% для антитела ch14D5b. Кроме того было показано, что N-концы тяжёлых и легких цепей антител ch14D5a и ch14D5b не содержат лидерных пептидов, что подтверждается наличием в спектрах пиков 1926,05, 1863,91 и 1058,53 (Рисунок 11). Отсутствие лидерных пептидов на N-концах цепей свидетельствует о правильном процессинге полученных антител. 11 А) ▲ ▲ Б) ▲ ▲ ▲▲ В) Рисунок 10. MALDI-TOF масс-спектр триптических гидролизатов тяжёлой цепи антитела ch14D5a (А) и лёгких цепей антител ch14D5a (Б) и ch14D5b (В) в положительном режиме с использованием DHB-матрицы. Пики, отмеченные ▲, соответствуют вариабельному домену VL14D5a, пики, отмеченные , соответствуют вариабельному домену VL14D5b. Пики, отмеченные , соответствуют константному домену легких цепей каппа-типа антител человека. Отмеченные пики соответствуют вариабельному домену VH14D5, отмеченные пики соответствуют константному домену антител IgG1 человека. 12 А) MAWVWTLLFLMAAAQSAQAEVQLLESGAELAKPGASVK… 1926,05 4016,10 Б) MKSQTQVFVFLLLCVSGAHGDIVMTQSPSSLSASLGDR… 1863,91 3750,88 В) MKSQTQVFVFLLLCVSGAHGDIVMTQSHK… 1058,53 2945,50 Рисунок 11. Пептиды, которые должны образоваться при полном гидролизе трипсином N-концевого участка А) тяжёлой цепи антител ch14D5a и ch14D5b; Б) лёгкой цепи антитела ch14D5a; В) лёгкой цепи антитела ch14D5b. Серым цветом обозначен соответствующий лидерный пептид. Приведены моноизотопные массы. Поскольку терапевтические свойства антител существенно зависят от типа и степени гликозилирования (Jefferis R. et al., 2009; Abès R. et al., 2010), для антител ch14D5a и ch14D5b был изучен профиль гликозилирования. Для этого антитела дегликозилировали N-гликозидазой F, после чего электрофоретически разделяли на тяжёлые и легкие цепи (Рисунок 12). Рисунок 12. полиакриламидный 116 кДа 12% тяжелые цепи в 66 кДа гель-электрофорез антитела восстанавливающих 45 кДа условиях 35 кДа дегликозилированного N-гликозидаза F антитела ch14D5a (дорожка легкие цепи антитела антитела ch14D5a, 25 кДа 2), выдержанного в реакционном буфере, но без 18 кДа добавления фермента 14 кДа (дорожка 1) и интактного антитела ch14D5a (дорожка 1 2 3). M – белковый маркер 3 M молекулярных масс. Увеличение подвижности тяжёлых цепей дегликозилированного антитела по сравнению с контролем свидетельствует о том, что обе тяжёлых цепи антитела Nгликозилированы. Легкие и тяжёлые цепи дегликозилированного антитела гидролизовали поотдельности трипсином с последующим масс-спектрометрическим анализом, полученные спектры сравнили со спектрами лёгкой и тяжёлой цепей интактного антитела ch14D5a (Рисунок 13). В спектрах лёгких цепей не было выявлено существенных отличий, поэтому можно считать, что N-гликозилирование лёгких цепей отсутствует, что нормально для подавляющего большинства антител. 13 В спектрах тяжёлых цепей было обнаружено несколько пиков, для которых отношение массы к заряду m/z изменилось при дегликозилировании (Таблица 1). Значения сдвигов в спектрах составили (2405,93 – 1189,51) = 1216,42; (2634,07 – 1189,51) = 1444,56; (2796,15 – 1189,51) = 1606,64 и (2958,23 – 1189,51) = 1768,72. Эти данные не несут полной информации о структуре гликозидных остатков, однако полностью согласуются с установленными ранее значениями для антител, секретируемых клетками CHO (Routier F. H., 1997; van Berkel P. H. et al., 2009), и позволяют предположить, что полученные химерные антитела находятся в гликоформах G0F, G1F, G2F и, возможно, MAN5. • 1190.52 2405.93 • • 2634.07 2796.15 • 2958.23 • Рисунок 13. Сравнение масс-спектров триптических фрагментов тяжёлой цепи антитела ch14D5a до и после дегликозилирования. Верхние половины каждого фрагмента содержат спектры, соответствующие интактному антителу (оранжевый) и антителу, инкубированному в буфере без добавления N-гликозидазы (синий). Нижние половины – дегликозилированному антителу (зелёный). Спектры получены в положительном линейном режиме. 14 Таблица 1. Экспериментально установленные значения m/z в спектрах триптических фрагментов тяжёлых цепей, полученных из интактного антитела ch14D5a, а также инкубированных в реакционном буфере с добавлением N-гликозидазы F и без неё. Пептид EEQYNSTYR EEQYDSTYR EEQYN(G0F)STYR EEQYN(G1F)STYR EEQYN(G2F)STYR EEQYN(MAN5)STYR Моноизотопная масса [M+H]+ (m/z при z=1) 1189,51 1190,52 2634,07 2796,15 2958,23 2405,93 ch14D5a интактный – – + + + + ch14D5a инкубирован в буфере – – + + + + ch14D5a обработан Nгликозидазой F – + – – – – Аппарат N-гликозилирования клеток человека и хомячка содержит некоторые различия, что может вызывать вопросы о применимости антител, полученных в клетках CHO, для лечения людей. Однако различия эти незначительны и в целом профиль гликозилирования антител, полученных в клетках CHO, очень близок профилю гликозилирования человеческих антител (Routier F. H. et al., 1997; Raju T. S., 2003; Jefferis R., 2005), что позволяет их успешно использовать в терапии. Полученные результаты подтверждают, что антитела ch14D5a и ch14D5b полностью гликозилированы по обеим тяжёлым цепям, при этом гликозилированный аминокислотный остаток расположен в пептиде EEQYNSTYR и с высокой долей вероятности соответствует остатку Asn297, который консервативно гликозилирован в иммуноглобулинах IgG1 человека (Raju T. S., 2003; Shade K. C. et al., 2013). Установлено, что образцы антител содержат несколько гликоформ, которые соответствуют гликоформам антител, секретируемых клетками CHO и используемыми в терапии (Routier F. H., 1997; Raju T. S., 2003; Jefferis R., 2009). 8. Определение иммунохимических свойств антител ch14D5a и ch14D5b Сродство антител ch14D5a и ch14D5b к белку Е ВКЭ оценили методом твёрдофазного ИФА. Комплексы антител с белком Е выявляли иммуноконъюгатом моноклонального антитела мыши против Fc-фрагмента антител IgG1 человека (Sigma). Анализ связывания антител ch14D5a и ch14D5b с белком Е ВКЭ показал, что сродство антитела ch14D5a к белку Е ВКЭ (около 10-10 М) значительно выше, чем сродство антитела ch14D5b к этому же белку (около 10-7 М). Кроме того, сродство антитела ch14D5a к белку Е ВКЭ оказалось выше, чем сродство исходного МКА 14D5 (около 10-9 М). Константы аффинности химерных антител ch14D5a и ch14D5b, а также МКА 14D5 по отношению к белку Е ВКЭ были определены на оптическом биосенсоре ProteOn XPR 36 (Bio-Rad) (Рисунок 14). Для химерных антител ch14D5a и ch14D5b значения констант скорости ассоциации и диссоциации, а также равновесной константы аффинности были вычислены с использованием модели односайтового связывания (Таблица 2). 15 700 600 600 A) Сигнал, RU Сигнал, RU 500 400 400 300 300 200 200 100 100 0 0 Б) 500 500 1000 1500 Время, сек 2000 2500 0 0 500 1000 1500 Время, сек 2000 2500 Рисунок 14. Связывание антител ch14D5a (А) и МКА 14D5 (Б) в концентрациях 3,12, 6,25, 12,5, 25 и 50 нМ с рекомбинантным белком Е, иммобилизованным на поверхность чипа GLC (Bio-Rad). Пунктиром показаны результаты общего кинетического анализа данных с использованием модели односайтового связывания (А) и модели односайтового связывания с гетерогенным аналитом (Б). Интересно отметить, что в случае антител ch14D5a и ch14D5b вклад легкой цепи в их аффинность оказался существенным, поскольку сродство антитела ch14D5a к белку Е ВКЭ (2,6 × 1010 M-1) оказалось на три порядка выше по сравнению со сродством антитела ch14D5b к тому же белку (1,0 × 107 М-1). С помощью простой модели односайтового связывания не удалось аппроксимировать данные связывания МКА 14D5, содержащего различные лёгкие цепи, с белком Е. Однако использование модели гетерогенного аналита позволило определить параметры взаимодействия (Таблица 2). МКА 14D5 показало промежуточную аффинность, что может объясняться присутствием в образце высокосредне- и низкоаффинных молекул антитела, имеющих соответственно две цепи light_14D5a либо по одной цепи light_14D5a и light_14D5b либо две цепи light_14D5b. Поскольку антитело ch14D5a проявило значительно большее сродство к рекомбинантному белку Е по сравнению с антителом ch14D5b, дальнейшие эксперименты по изучению противовирусных свойств проводили только с антителом ch14D5a. Таблица 2. Кинетические параметры и константы аффинности для взаимодействия антител с рекомбинантным белком Е ВКЭ. Константа скорости Равновесная Константа скорости –1 – Антитело ассоциации ka, (M s константа ассоциации диссоциации kd, (s–1) 1 ) KA, (M–1) ch14D5a 4,99±0,55* × 10–6 1,30±0,01 × 105 2,6±0,6 × 1010 ch14D5b 2,11±0,03 × 10–3 2,10±0,01 × 104 1,0±0,1 × 107 МКА 1,24±0,05 × 10–4 1,05±0,01 × 104 8,5±0,1 × 107 14D5** 3,21±0,06 × 10–3 1,57±0,01 × 104 4,9±0,1 × 106 * Среднее ± стандартная ошибка среднего; ** Представлены данные для высоко- и низкоаффинных антигенсвязывающих сайтов МКА 14D5. 16 9. Нейтрализация инфекционности ВКЭ антителом ch14D5а и МКА 14D5 in vitro Вируснейтрализующая активность последовательных разведений антитела ch14D5a и МКА 14D5 по отношению к ВКЭ, штамм 205, была определена в реакции ингибирования фокусообразования на культуре клеток Vero E6. Оба антитела оказались способны нейтрализовать инфекционность ВКЭ, при этом индекс нейтрализации IC50 при 50% ингибировании инфекционности вируса для антитела ch14D5a и МКА 14D5 составил 0,043±0,028 мкг/мл и 0,50±0,14 мкг/мл соответственно. Вероятно, более высокая вируснейтрализующая активность антитела ch14D5a по сравнению с МКА 14D5 объясняется тем, что гибридомная линия клеток 14D5 синтезирует два вида лёгких цепей – light_14D5a и light_14D5b (La и Lb) с приблизительным соотношением 1 : 3. Предполагая, что характер объединения лёгких цепей с тяжелыми является случайным, можно ожидать наличие иммуноглобулиновых молекул вида LaHHLa (высокоаффинное антитело, содержание около 6%), LaHHLb (промежуточная аффинность, содержание около 38%) и LbHHLb (низкоаффинное антитело, содержание около 56%) в препарате МКА 14D5, в то время как препарат ch14D5a содержит только высокоаффинное антитело. 10. Протективная активность антитела ch14D5a против ВКЭ in vivo Для определения протективных свойств химерного антитела ch14D5 были использованы мыши линии BALB/c массой 10 грамм. Животным парентерально вводили 240 ЛД50 вируса клещевого энцефалита штамм «Абсеттаров», а препараты антител вводили внутривенно через 24 ч после заражения. Параллельно с антителом ch14D5a были протестированы МКА 14D5 и иммуноглобулин человека против клещевого энцефалита с титром 1:160 (НПО «Микроген»). Согласно результатам эксперимента (Рисунок 15), химерное антитело ch14D5 продемонстрировало более высокую протективную активность по сравнению с другими препаратами антител. Оно обеспечило 100% уровень протекции в дозировках 80 мкг/мышь и 10 мкг/мышь, в то время как МКА 14D5 обеспечило 70% уровень протекции лишь в дозировке 80 мкг/мышь и не обеспечило защиту мышей будучи использованным в дозировке 10 мкг/мышь. Кроме того, протективная активность антитела ch14D5a оказалась выше по сравнению с активностью иммуноглобулина человека против клещевого энцефалита, который используется для профилактики и лечения ВКЭ. Существуют опасения, что введение терапевтических антител, обеспечивающее пассивную иммунизацию, способно вызвать антителозависимое усиление инфекции (antibody-dependent enhancement, ADE) (Aebi C. et al., 1994; Kluger G. et al., 1995). Полагают, что ADE связан с суб-нейтрализующей концентрацией протективных либо наличием непротективных антител в препарате (Bröker M. et al., 2008; Huisman W. et al., 2009). Чтобы оценить, способно ли антитело ch14D5a вызывать антителозависимое усиление инфекции, была исследована субнейтрализующая дозировка 0,5 мкг/мышь. Введение мышам антитела ch14D5a в этой дозировке не защищало животных от летальных доз ВКЭ, но и не уменьшало среднюю продолжительность жизни мышей, которая составила 8,3±1,0 дней по сравнению с 7,7±0,7 дней для нелеченых животных. Согласно логранговому критерию, достоверного различия не обнаружено (p = 0,095) (Рисунок 15). Поэтому в данном случае антителозависимое усиление инфекции при введении субнейтрализующей дозы антитела ch14D5a отсутствовало. 17 ch14D5a 10 мкг и 80 мкг МКА 14D5 80 мкг МКА 14D5 10 мкг Рисунок 15. Протективная активность антитела ch14D5a и МКА 14D5, а также сывороточного иммуноглобулина человека против ВКЭ in vivo. Мышам вводили указанные количества антител внутривенно через 24 ч после инфицирования 240 ЛД50 ВКЭ. * p=0,067 (логранговый критерий). 11. Оценка степени гуманизации химерного антитела ch14D5a При разработке рекомбинантных терапевтических средств важна степень гуманизации белковых молекул. Для антитела ch14D5a степень гуманизации оценивали по частоте встречаемости данного а.к.о. в данной позиции с помощью базы данных Abysis (http://www.bioinf.org.uk/abysis/). Антитело ch14D5a состоит из 1320 а. к. о., из них 24 нехарактерны для позиций, в которых они находятся. Оцененная таким образом степень гуманизации антитела составляет (1320 - 24) / 1320 = 0,982 или 98,2 %. Таким образом, созданное и исследованное в данной работе антитело ch14D5a является перспективным кандидатом для создания профилактических и терапевтических препаратов против ВКЭ: оно обладает высоким сродством к антигену, а также высокой противовирусной активностью в экспериментах in vitro и in vivo. В настоящее время идут доклинические испытания антитела ch14D5a, в ходе которых предполагается выяснить эффективность антитела при профилактической и терапевтической схемах введения, фармакокинетические и фармакодинамические параметры, а также выявить наличие либо отсутствие острой и хронической токсичности. Если эти характеристики будут соответствовать требованиям для лекарственных средств, то можно ожидать появления новых препаратов против ВКЭ на основе антитела ch14D5a и его производных. 18 ВЫВОДЫ 1. Установлено, что гибридома 14D5 продуцирует антитела против ВКЭ с VHдоменами, принадлежащими к семейству IGHV1 антител мыши, и с двумя типами VL-доменов, принадлежащих к семействам IGKV10 и IGKV6. 2. Сконструированы кассетные векторные плазмиды pCH2 и pCL2, позволяющие осуществлять экспрессию генов полноразмерных антител с константными доменами иммуноглобулинов человека в эукариотических клетках; на основе этих плазмид сконструированы плазмиды pCH2-14D5, pCL2-14D5a и pCL214D5b, которые несут гены, кодирующие тяжёлую и лёгкую цепи химерных антител ch14D5a и ch14D5b. 3. Получены образцы очищенных химерных антител ch14D5a и ch14D5b, и показано, что их молекулярная масса, число лёгких и тяжёлых цепей, а также степень и тип гликозилирования соответствуют характеристикам рекомбинантных антител, получаемых в клетках CHO. 4. Определены значения констант аффинности химерных антител ch14D5a и ch14D5b к белку Е ВКЭ, которые составили 2,6•1010 М-1 и 1,0•107 М-1, соответственно, и показано, что химерное антитело ch14D5a в дозировке 1 мг/кг веса мыши обеспечило 100% защиту мышей, предварительно инфицированных 240 ЛД50 ВКЭ. Основные результаты диссертации опубликованы в следующих работах: 1. Baykov I. K., Matveev A. L., Stronin O. V., Ryzhikov A. B., Matveev L. E., Kasakin M. F., Richter V. A., Tikunova N. V. A protective chimeric antibody to tick-borne encephalitis virus // Vaccine. – 2014. – V. 32. – Issue 29. – P. 3589–3594. doi: 10.1016/j.vaccine.2014.05.012. 2. Байков И. К., Хлусевич Я. А., Матвеев А. Л., Бабкина И. Н., Тикунова Н. В. Конструирование кассетных векторных плазмид для получения полноразмерных рекомбинантных антител // Вестник НГУ. Серия: Биология, клиническая медицина. – 2013. – Т. 11. – № 3. – С. 56–64. 3. Байков И. К., Матвеев Л. Э., Матвеев А. Л., Тикунова Н. В. Сравнительный анализ вариабельных доменов моноклональных антител против вируса клещевого энцефалита // Сибирский медицинский журнал. – 2012. – Т. 111. – № 4. – С. 30–33. 4. Levanov L. N., Matveev L. E., Goncharova E. P., Lebedev L. R., Ryzhikov A. B., Yun T. E., Batanova T. A., Shvalov A. N., Baykov I. K., Shingarova L. N., Kirpichnikov M. P., Tikunova N. V. Chimeric antibodies against tick-borne encephalitis virus // Vaccine. – 2010. – V. 28. – Issue 32. – P. 5265–5271. 5. Патент РФ № 2550252 C1 от 15.11.2013. Рекомбинантная плазмидная ДНК pCLm4/hygro-14D5, кодирующая полипептид со свойствами легкой цепи химерного антитела против вируса клещевого энцефалита, и рекомбинантная плазмидная ДНК pCHm2-14D5, кодирующая полипептид со свойствами тяжелой цепи химерного антитела против вируса клещевого энцефалита, химерное антитело, обеспечивающее экстренную профилактику клещевого энцефалита у мышей. Тикунова Н. В., Байков И. К., Матвеев Л. Э., Бабкина И. Н., Матвеев Л. Э., Рихтер В. А. 19 Подписано в печать 18.08.2015 г. Формат 60х84/16 Усл. п. л. 1,16 Тираж 100 экз. Заказ № 0818 Отпечатано в типографии ООО «Параллель» 630090, г. Новосибирск, ул. Институтская, 4/1 Тел. 8 (383) 330-26-98 20
