Основные понятия серологической диагностики методом

Основные понятия
серологической диагностики
методом иммуноферментного
анализа
Внс ЛБИ ЗАО «Вектор-Бест»
Кротова В.А.
ИФА в цифрах
• Количество белка, засорбированного на
планшете – 0,00132-(0,00528) мг, Spl =147.87
см2 Sl =1.54 см2 , в одной лунке содержится
6,76*10-9 (5,5*10-8) грамм белка.
• Рабочее количество конъюгата – в 1 мл
рабочего раствора может содержаться
5*10-9 гр. – 8,5*10-7 гр.
• **10-6-микрограмм, 10-9-нанограмм**.
14.03.2013
в.н.с. ЛБИ Кротова В.А.
2
ИФА в цифрах
• Содержание различных классов
иммуноглобулинов в исследуемом образце
сыворотки крови (10 мкл):
– IgA -4.0-35.0*10-6 гр. в 10 мкл,
– IgG -65.0-160.0*10-6 гр. в 10 мкл,
– IgM- 5.0-30.0*10-6 гр. в 10 мкл.
• ** 10-6-микрограмм**
14.03.2013
в.н.с. ЛБИ Кротова В.А.
3
Иммуноферментный анализ это • Возможность осуществления контроля
исполнения исследования;
• Возможность автоматизации процесса
исследования;
• Возможность документирования и архивации
результатов исследования.
Функции антител:
IgM
• IgM – антитела ранней стадии.
Биологическая функция – лизис
бактерий вместе с системой
комплимента (преимущественно
грамотрицательные бактерии)
• Если концентрация антигена мала,
IgM могут не нарабатываться.
14.03.2013
в.н.с. ЛБИ Кротова В.А.
5
IgG
• IgG – нейтрализация токсинов и антигенов
(бактериальных, вирусных).
• Опсонизация возбудителя –
• IgG2, IgG4–слабые опсонины (Th2), IgG1, IgG3–
сильные опсонины (Th1).
• В зависимости от выбора антигена, также
могут быть более ранними или более
поздними.
• Авидность – в том числе и временная
характеристика антител.
14.03.2013
в.н.с. ЛБИ Кротова В.А.
6
IgA
• IgA – ингибиция взаимодействия возбудителя
с клетками слизистых (эпителия дыхательных
путей, урогенитального и желудочнокишечного тракта). (Опсонизация – в меньшей
степени)
• Не несут смысловой нагрузки о времени
появления антигена.
• «Производятся» в организме независимо от
«IgM-IgG».
• У детей до 5 лет практически не
обнаруживаются.
14.03.2013
в.н.с. ЛБИ Кротова В.А.
7
схема синтеза IgA
О чём нужно помнить?
• В зависимости от биологических свойств
специфических белков – протеазы, белки
наружных мембран, порины,
внутриклеточные белки, токсины,
шапероны – временнáя (и не только)
характеристика антительного ответа на
различные специфические белки будет
различной.
14.03.2013
в.н.с. ЛБИ Кротова В.А.
9
О чём нужно помнить -2?
1.
ИППП – заболевания слизистых – IgA, IgG, IgM
2.
Возможность отсутствия IgA ( 1:500 – 1:800)
3.
Антительный ответ: а) развитие серорезистентности; б)
развитие иммунного ответа с негативацией через 6-12 мес.
(при правильном лечении).
4.
Различия в антительном ответе у мужчин и женщин
(анатомические, гормональные и иммунологические различия)
5.
Волнообразное содержание антител к условным патогенам у
женщин на фоне гормонального цикла.
6.
Разница между антительным ответом против вирусов и против
бактерий (микроорганизмов).
14.03.2013
в.н.с. ЛБИ Кротова В.А.
11
• Условно патогенная флора
урогенитального тракта
• С одной стороны - микоплазмы наиболее
часто обнаруживают в составе нормальной
микрофлоры урогенитального тракта
человека.
• С другой стороны - микоплазмы могут
быть вовлечены в воспалительный процесс
при урогенитальных заболеваниях и
обладают патогенетическим потенциалом.
14.03.2013
в.н.с. ЛБИ Кротова В.А.
12
M. hominis
Урогенитальные
микоплазмы
U. urealyticum
(parvum)
M. genitalium
Семейство
микоплазм
Микоплазмы
дыхательной
системы
M. pneumoniae
14.03.2013
в.н.с. ЛБИ Кротова В.А.
13
Семейство
патогенность
Безусловные
патогенные
Mycoplasmataceae
М. pneumoniae
M. genitalium
Условно-патогенные
14.03.2013
представители
в.н.с. ЛБИ Кротова В.А.
Mycoplasma spp,
U. urealyticum
14
Микоплазмы:
1. контаминируют культуры клеток,
2. вызывают заболевания растений,
животных, человека,
3.оказывают влияние на размножение
ряда вирусов, в том числе ВИЧ и
ряда онкогенных,
4.сами способны вызывать
иммунодефицитное состояние.
Микоплазмы - мембранные паразиты
(Отличительные особенности микоплазм)
•
•
•
•
•
малый размер клетки, малый размер генома (1/16 генома
E.coli); низкое соотношение ГЦ пар в ДНК (25-30%) минимальное
количество органелл – 3-слойная мембрана, нуклеоид, рибосомы
Зависимость микоплазм от стеролов (холистерина и его
производных) и жирных кислот;
У микоплазм холистерин доминирует среди липидов, стабилизируя
плазматическую и ограничивающую мембраны. В инфицированных
тканях микоплазмы добывают стеролы непосредственно из
клеточных мембран, внедряясь в структуру или даже сливаясь с
ними;
отсутствие ригидной клеточной стенки и её предшественников
(способность проходить через поры с диаметром 0,22 мкм);
резистентность к агентам, подавляющим синтез клеточной стенки
(пенициллин и его синтетические производные).
Установлена взаимосвязь между микоплазменной
инфекцией (M. hominis,U. urealyticum), выявленной у
матери во время беременности в генитальном тракте и:
1. пониженной массой тела новорождённого,
2. преждевременными родами или поздним абортом
(преждевременный разрыв плодных оболочек),
3. инфекционной патологией респираторного тракта
новорождённого,
4. возможностью вызвать внутриутробную инфекцию
плода, в том числе и генерализованную (U.
urealyticum, M. genitalium , M. hominis,).
14.03.2013
в.н.с. ЛБИ Кротова В.А.
17
Факторы патогенности
• Доступ к мембранным фосфолипидам,
стеролам (холестерину, стероловым
гормонам);
• Повреждающий эффект за счёт Н2О2 и
супероксид радикала – О2• Повреждение клеточных мембран
нарушение энергозависимых функций
эпителия
обездвиживание ресничек
• Снижение мукоцилиарного транспорта
в мембране
человеческих клеток
продуцирует
U.urealyticum
Культивирование
на средах
Серологичес
кие методы
(ИФА)
Метод ПЦР
20
Алгоритм поиска причины
• На первом месте всегда стоят
безусловные патогены –
• Диагностика – приоритет выявления
возбудителя.
• На втором месте – условнопатогенная флора урогенитального
тракта, как возможная причина (при
определённых условиях)
Антигенные методы
(количественный вариант!!!)
• Бактериология, представленная
бактериоскопией и культуральным
методами – настоящий антигенный
комплекс выявления живого
возбудителя заболевания.
• Методы амплификации нуклеиновых
кислот – «косвенные» антигенные
методы:
– Амплификация
– Амплификация
ДНК,
РНК.
Серологические исследования
• По отношению к безусловным
патогенам – поиск положительных
результатов,
• В группе условно-патогенных
возбудителей – большее внимание к
отрицательным результатам.
Причины несовпадения
• Недостаточное количество искомого
вещества (ДНК) для ПЦР, в то
время как этого количества вполне
достаточно для культурального
роста.
• Искомая цель для амплификации не
имеет высокой степени
специфичности. (Отсутствие
стандартов для ПЦР)
• Культуральный метод – используется среда SP4, время
культивирования – 50 дней!
• PCR (ПЦР) – возможно использовать:
– 16S rRNA,
– MgPa 1-3 в качестве генетической цели
(чувствительность 103-105 генокопий).
– TaqMan количественный вариант ПЦР показывает
более высокую чувствительность – 10-103 генокопий.
• Серологический метод – в настоящее время
используется МИФ и LAMP-ELISA, определяются IgG,
IgA, IgM.
Jorgen Skov Jensen, диссертационная работа, Danish Medical Bulletin
2006, v53.
14.03.2013
в.н.с. ЛБИ Кротова В.А.
25
•
Культуральный метод – использование жидких сред,
желательно количественное определение выявляемого
микроорганизма (M.hominis, U. urealyticum);
•
ПЦР – 16S rRNA, MBA - в качестве генетической цели.
(Также - количественное определение).
•
Серологический метод – использование метода ИФА, как
обладающего наибольшей чувствительностью и специфичностью
при использовании в качестве антигенов рекомбинантных
высоко специфических белков разных микоплазм только
началось. Происходит накопление информации по данному
вопросу.
14.03.2013
в.н.с. ЛБИ Кротова В.А.
26
• «Подростки (15-17 лет)» - 393 подростка,
юноши и девушки, ученики старших
классов Кировского р-на г. Новосибирска
(2005);
• «Дети» - 558 детей в возрасте от 6 мес.
до 16 лет, обратившихся в МУЗ ДКБСП №3 и
1-ую Городскую клиническую больницы г.
Новосибирска с различными заболеваниями
и травмами, в осенний и весенний
периоды.
14.03.2013
в.н.с. ЛБИ Кротова В.А.
27
45,00%
40,00%
41,70%
35,00%
30,00%
25,00%
26,50%
20,00%
26,30%
19,89%
15,00%
14,20%
12,42%
10,00%
7,30%
3,20%
5,00%
0,00%
дети до 5 лет
дети 5- 10 лет
дети старше 10 Школьники 15лет
17 лет
M.hominis
14.03.2013
в.н.с. ЛБИ Кротова В.А.
U.urealyticum
28
70%
54%
60%
51%
50%
40%
33%
33%
43%
32%
28%
30%
21%
20%
14%
10%
7%
0%
0%
до 5 лет
14.03.2013
до 10 лет
в.н.с. ЛБИ Кротова В.А.
старше 10 лет
суммарно
другое
ГЭ
БЛЗ
суммарно
другое
ГЭ
БЛЗ
суммарно
ГЭ
другое
-10%
БЛЗ
0%
Ряд1
29
14.03.2013
в.н.с. ЛБИ Кротова В.А.
30
Возможные показания для терапии
заболеваний, вызванных урогенитальными
микоплазмами
• Наличие инфекционно-воспалительных
процессов в МПС при исключении другой
этиологии;
• Предстоящие оперативные или инвазивные
манипуляции (роды, аборт, введение ВМС и
т.п.);
• Бесплодие ( других причин кроме
микоплазменной инфекции не установлено);
• У беременных – осложнённый акушерскогинекологический анамнез и осложнённое
течение настоящей беременности.
14.03.2013
в.н.с. ЛБИ Кротова В.А.
32
14.03.2013
в.н.с. ЛБИ Кротова В.А.
33
Благодарность
• Решетникову О.В., д.м.н., в.н.с.
г.Новосибирск, НИИ терапии;
• Хаснулину В.И., д.м.н., проф., г.
Новосибирск, ИКЭМ;
• Юрьеву С.Ю, д.м.н., директору
«Центра перинатальных инфекций» г.
Томска;
• Субботиной Т.С., зав. жен.
консультацией р/д №7 Первомайского
р-на г. Новосибирска.