Казахский агротехнический университе им. С.Сейфуллина ЭКСКРЕТОРНО-СЕКРЕТОРНЫЙ АНТИГЕН ИЗ ЛИЧИНОК

ЭКСКРЕТОРНО-СЕКРЕТОРНЫЙ АНТИГЕН ИЗ ЛИЧИНОК
ТРИХИНЕЛЛ И ЕГО ИММУНО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА
Акибеков О.С., Лидер Л.А., Токпан С.С., Байболин Ж.С.
Казахский агротехнический университе им. С.Сейфуллина
Введение. Эффективность иммунологических реакций и тест-систем во
многом определяется диагностическими свойствами антигенов. Как известно
из литературных данных, прогресс в использовании жидких антигенов для
диагностики трихинеллеза осуществлялся постепенно и разными путями. При
трихинеллезе в сыворотках крови зараженных животных и больных людей
выявляются антитела к различным антигенным компонентам трихинелл, а
выявление сероконверсии или антител в минимальном специфическом титре
широко используется для диагностики гельминтозов [1,2,3,4,5,6]. На
начальных этапах, как правило, использовали неочищенные экстракты
мышечных личинок трихинелл, которые, однако, имея в своем составе
множество антигенных компонентов общих для нематод и других гельминтов,
являлись причиной ложноположительных реакций.
Цель работы – определение параметров культивирования трихинелл с
целью получения экскреторно-секреторного антигена (Э-С АГ) и изучение
иммунохимических свойств.
Материалы и методы. В своих исследованиях мы предприняли попытки
получения экскреторно-секреторных антигенов путем культивирования
трихинелл в питательной среде, моделируя инвазию in vitro. В процессе
исследований было апробировано 3 варианта питательных сред: среда №1 –
неполная среда RPMI-1640 (Sigma, США), среда №2 – неполная среда Игла
(Панэко, Россия), среда №3 – стерильный физиологический раствор с 10%-ной
глюкозой.
Отмытые трихинеллы в количестве 1000-5000 экз. в 50 мл питательной
среды с антибиотиками (1000 ЕД/мл пенициллина и 1 мг/мл стрептомицина)
переносили в стерильные полистироловые матрацы объемом 200 мл (NUNC,
Дания). Культуру помещали в СО2-инкубатор с заданными параметрами
температуры (37ºС) и поступлением газов (СО2- 5%) при 70% влажности для
культивирования. Через 24 часа проводили смену питательной среды для
удаления остатков крови хозяина. Отбор клеточных метаболитов проводили
через 24-48 часов культивирования.
Для определения качества использованных питательных сред
определяли максимально возможное время культивирования, при котором
сохранялась жизнеспособность трихинелл. Все использованные варианты
питательных сред позволяют достаточно продолжительный период
поддерживать жизнедеятельность трихинелл и их способность продуцировать
Э-С АГ. При этом следует отметить, что наиболее эффективны в этом
отношении все же синтетические питательные среды (RPMI-1640, Игла),
18
позволяющие до 4-х суток поддерживать жизнеспособность трихинелл
(каждое 24 часа меняли среду) в количестве достаточном для получения
целевого продукта.
Для выбора оптимальной среды для получения максимального
количества, продуцируемого трихинеллами экскреторно-секреторного
антигена проводили определение суммарного белка в культуральной
жидкости.
Все использованные варианты питательных сред позволяют
продуцировать ЭС-АГ в концентрации 335 до 400 мкг/мл. Максимальная
концентрация (400 мкг/мл на 4-е сутки) наблюдалась при использовании
синтетических питательных сред (RPMI-1640, Игла). При этом следует
отметить, что дальнейшее культивирование не увеличивало концентрацию
целевого продукта.
Количество белка в полученном Э-С АГ определяли по методу
М.Бредфорд. В результате было определено, что концентрация белка
находится в пределах 125-250 мкг/мл (нативный Э-С АГ) и 250-400 мкг/мл
(концентрированный).
Для дальнейшей очистки полученный антиген фракционировали
методом хроматографии на колонке с сефакрилом S-200. Гельфильтрацию
проводили в стандартных условиях с использованием аппарата для
хроматографии (Pharmacia). В результате фракционирования экскреторносекреторного антигена методом гельфильтрационной хроматографии были
получены
3 фракции. Концентрирование полученных фракций проводили с помощью
диализа против полиэтиленгликоля с молекулярной массой 6000 до объема
1 мл.
Путем тестирования полученных фракций в ИФА было определено, что
сероактивный компонент присутствует в первой и второй фракциях.
Определение структуры антигена и молекулярной массы белковых
фракций антигена было проведено методом вертикального электрофореза в
10%-ном полиакриламидном геле. Было обнаружено, что в составе Э-С АГ
имеются 8 белковых фракций с молекулярными массами в диапазоне 19-72
кД. Результаты проведения электрофореза обрабатывали с помощью
компьютерной программы BioCap. В дальнейшем разделенный в
полиакриламидном геле антиген переносили на нитроцеллюлозную мембрану
с помощью аппарата Semi-dryblot.
Результаты. Иммуноблотинг показал, при иммунизации экскреторносекреторным антигеном в организме животных вырабатываются
специфические антитела, взаимодействующие с антигенной детерминантой с
молекулярной массой 35 кД.
Для определения диагностической ценности Э-С
АГ проводили
непрямой ИФА, используя сыворотки крови собак и свиней, инвазированных
трихинеллами.
Для проведения ИФА объединенные 1- и 2-ю фракции очищенного Э-С
АГ в концентрации 15 мкг/мл вносили в лунки полистироловых планшет.
19
Сыворотку крови титровали, начиная с разведения 1:100. В ходе проведенного
анализа были получены результаты, согласно которым полученный
экскреторно-секреторный антиген вступает в реакцию со специфическими
антителами сывороток крови в титрах 1:3200 - 1:12800 (таблица 1).
Таблица
Результаты тестирования экскреторно-секреторного антигена
со специфическими антителами сывороток крови в ИФА
Разведение
сывороток
крови
1:100
1:200
1:400
1:800
1:1600
1:3200
1:6400
1:12800
Отрицательный
контроль
№1
№2
№3
№4
0.105
0.083
0.074
0.063
0.025
0.015
0.011
0.007
1.432
0.501
0.435
0.322
0.298
0.251
0.139
0.117
1.112
0.823
0.765
0.304
0.243
0.118
0.089
0.038
1.514
0.823
0.784
0.524
0.441
0.171
0.145
0.121
1.820
1.236
0.849
0.422
0.289
0.133
0.094
0.050
Как видно из данных таблицы, сыворотки животных вступали во
взаимодействие с антигеном в разведениях 1:3200- 1:12800.
Таким образом, в результате проведенных исследований, из проб
материала получены Э-С АГ, активно взаимодействующие со
специфическими сыворотками крови животных. Определен их состав и
изучены иммунохимические свойства.
Для получения препаратов специфических поликлональных антител, по
методу аналогов, были подобраны 2 группы кроликов (массой 3-4 кг по 3
особи в группе), которых иммунизировали полученными препаратами Э-С
АГ. Препараты вводили 3-х кратно подкожно в область спины (шерсть
предварительно выстригали) в несколько точек с интервалом в 5 дней. Для
усиления иммунного ответа организма антиген смешивали до гомогенного
состояния вначале с полным, а затем с неполным адъювантом Фрейнда.
Через 3 дня после последнего введения антигена проводили взятие
крови с целью тестирования сывороток на предмет наличия специфических
антител методом иммуноферментного анализа. Для этого лунки
полистироловых
планшетов
сенсибилизировали
антигенами,
использованными для иммунизации. В результате тестирования было
определено, что антигены обладают свойством вызывать иммунный ответ, т.е.
выработку специфических антител. Титры антител при пробном тестировании
(по данным иммуноферментного анализа) были в пределах 1:6400-1:12800.
Заключение. Отработаны параметры культивирования
Trichinella
spiralis в условиях in vitro, получены данные об антигенной структуре
20
соматического и экскреторно-секреторного антигенов личинок Trichinella
spiralis, а также изучены их иммунохимические свойства. Полученные
результаты исследований дают нам возможность продолжить работу,
направленную на получение моноклональных антител и разработку
высокочувствительной и специфичной ИФА-тест-системы для диагностики
трихинеллеза человека и животных.
Литература: 1 Gamble H.R., Bessonov A., Cuperlovic K., Gajadhar A.A.,
van Knapen F., Nockler K., Schenone H. Zhu X.// Vet. Parasitol. - 2000. - №93.- P.
393-408. 2. Schuppers M.E., Pozio, E., La Rosa G., Serrano F.J., Barrat J., Rossi,
L. // Parasitology - 2009. - №113. – Р. 527–533. 3. Takahashi Y., Mingyuan L.,
Waikagul J. // Vet. Parasitol. - 2000. - №93. – Р. 227–239. 4 Shaikenov B.S., Boev
S.N. // Wiad. Parazytol. - 1983. - №2. – Р. 595–608. 5 Merdivenci A., Aleksanyan
V., Girisken G., Perk M., 1977. J. Fac. Med. Vet. Univ. Instambul 3, 46–71. 6
Ozdemir D., Ozkan H., Akkoc N., Onen F., Gurler O., Sari I., Akar S., Birlik M.,
Kargi A., Ozer E., Pozio Е, // Pediatr. Infect. Dis. J. - 2005. - №24. – Р. 897–900.
Preparation of excretory-secretory antigen from Trichinella spiralis
larvae and investigation of it’s immune-chemical properties. Akibekov O.S.,
Lider L.A., Tokpan S.S., Baibolin Zh.S. S.Seifullin Kazakh Agrotechnical
University.
Summary.One adapted parameters of T. spiralis culture in vitro; the data on
antigenic structure of somatic and excretory-secretory T. spiralis larvae antigens
were obtained as well as their immunochemical properties were investigated. The
obtained results gave the opportunity to prepare monoclonal antibodies and to
develop the highly sensitive and specific IFA-test system for diagnosis of
Trichinella infection of a human and animals.
К ВОПРОСУ О ФАУНЕ НЕМАТОД – ВИРУСОНОСИТЕЛЕЙ
ВИНОГРАДА В АРМЕНИИ
Акопян К.В.*, Мкртчян Р.С.*, Мигунова В.Д.**, Галстян С.Х.*
*Научный центр зоологии и гидроэкологии НАН Республики Армения
**ГНУ ВНИИ гельминтологии им.К.И.Скрябина
Введение. Виноград - одна из традиционных и наиболее важных для
сельского хозяйства Армении культур. Несмотря на резкое сокращение
плантаций винограда в конце прошлого века (почти в два раза) в последнее
время виноградарство в республике получило большой размах и опять
занимает свое традиционное место в сельском хозяйстве. В настоящее время
площадь виноградников в Армении превышает 30 тыс. га. Предусмотрено
заложить около 5 – 6 тыс. га в основном за счет столовых и технических
сортов.
21