Документ 2299050
реклама
предотвращения и диагностики различных заболеваний и нарушений. Использование сывороточных антител человека и моноклональных антител животных в терапии ограничено, что связано либо с их поликлональным характером, либо с чужеродностью таких антител для человека. Широкое развитие получили различные варианты рекомбинантных (искусственных) антител, таких как химерные, гуманизированные и полноразмерные человеческие антитела. Такие антитела конструируют генно-инженерными методами и получают биотехнологически в культурах клеток, контролируя их свойства и обеспечивая однородность от партии к партии. Благодаря возможности изменять и добавлять функциональные участки в молекуле антитела, технология создания рекомбинантных антител позволяет получать биомолекулы, специализированные для решения конкретной задачи. Таким образом, создание гуманизированных протективных антител к вирусным инфекционным агентам и вирусу клещевого энцефалита в частности является одним из приоритетных направлений современной биоинженерии. Новизна исследований и полученных результатов. В настоящее время создан ряд рекомбинантных антител для специфической терапии и профилактики различных вирусных инфекций. Разрабатываются такие антитела и для применения при флавивирусных инфекциях, вызванных вирусом западного Нила, вируса лихорадки Денге, тип 2, вируса желтой лихорадки и вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей. Коммерчески доступные рекомбинантные антитела для экстренной профилактики и лечения клещевого энцефалита пока отсутствуют, и поиск путей создания соискателем таких антител, получаемых в культурах клеток в стандартных условиях, несомненно, является актуальной задачей. Одним из результатов работы соискателя стало создание кассетных плазмидных векторов для удобного клонирования последовательностей вариабельных доменов с целью получения полноразмерных рекомбинантных антител. С помощью этих кассетных плазмид наряду с антителами против вируса клещевого энцефалита получены полноразмерные человеческие антитела против ортопоксвирусов, ДНК-гидролизующие полноразмерные антитела, а также антитела против интерлейкина-18. Это в свою очередь говорит не только о решении частной проблемы (производство аналога противовирусного иммуноглобулина) а о создании соискателем уже сформированной научнотехнической платформы по созданию гуманизированных антител с заранее заданными и прогнозируемыми свойствами. Созданное и исследованное в данной работе антитело является перспективным кандидатом для создания профилактических и терапевтических препаратов против ВКЭ. В настоящее время идут доклинические испытания антитела ch14D5a, в ходе которых предполагается выяснить эффективность антитела при профилактической и терапевтической схемах введения, фармакокинетические и фармакодинамические параметры, а также выявить наличие либо отсутствие острой и хронической токсичности. Если эти характеристики будут соответствовать требованиям для лекарственных средств, то можно ожидать появления новых препаратов против ВКЭ на основе антитела ch14D5a и его производных. Таким образом, в представленной работе впервые отражено конструирование химерного антитела, способное защищать от сотен летальных доз вируса клещевого энцефалита на мышиной модели. Показано, что структурная организация сконструированного химерного антитела, включая тип гликозилирования, соответствует характеристикам рекомбинантных антител, получаемых в культуре клеток хомяка и применяемых в настоящее время в терапии. Использованная соискателем гибридомная линия клеток 14D5 продуцирует протективные антитела против вируса клещевого энцефалита с двумя типами вариабельных последовательности семействам доменов аминокислотных VL-генов мыши. лёгкой остатков Плазмидные цепи, и отличающимися относящимися векторы, к по разным сконструированные соискателем, позволяют ускорить процесс получения новых полноразмерных антител с константными доменами иммуноглобулинов человека в эукориотических клетках по сравнению с ранее известными плазмидами. В представленной работе установлено, что гибридома 14D5 продуцирует антитела против вируса клещевого энцефалита с VH-доменами, принадлежащими к семейству IGHV1 антител мыши, и с двумя типами VL-доменов, принадлежащих к семействам IGKV10 и IGKV6. Сконструированные кассетные векторные плазмиды pCH2 и pCL2 позволяют осуществлять экспрессию генов полноразмерных антител с константными доменами иммуноглобулинов человека в эукариотических клетках; на основе этих плазмид сконструированы плазмиды pCH2-14D5, pCL214D5a и pCL2-14D5b, которые несут гены, кодирующие тяжёлую и лёгкую цепи химерных антител ch14D5a и ch14D5b. Кроме того показано, что молекулярная масса, число лёгких и тяжёлых цепей, а также степень и тип гликозилирования соответствуют характеристикам рекомбинантных антител, получаемых в клетках CHO. Диссертационная работа Байкова Ивана Константиновича представлена на 157 станицах, состоит из введения, обзора литературы, главы материалов и методов, а также главы собственных исследований, содержащая 10 подглав, главы результатов с обсуждениями, выводов, списка публикаций автора по теме диссертационной работы, списка использованных сокращений, списка литературы, приложения и благодарностей автора. В своем литературном обзоре соискатель ссылается на 305 источников, из которых русскоязычных всего 16. Первая часть посвящена описанию структурнофункциональной организации природных антител. Вторая подглава обзора охватывает проблему характеристики получения химерных антител, рекомбинантных широко антител. раскрываются их Приводятся свойства и особенности, приводится описание уже одобренных и успешно используемых для лечения различных заболеваний. Отдельный акцент ставится на проблемы по созданию гуманизированных антител и трудностей их конструирования по сравнению с химерными. Из этого автор логически переходит к описанию полноразмерных антител человека, получаемых сегодня гибридомными технологиями и проявляющими наименьшие иммуногенные и побочные свойства. Следующая глава обзора описывает процессы получения рекомбинантных антител, этапы процесса разработки и производства полноразмерных рекомбинантных антител, а также их выделению очистке. Очень подробно описываются сорбенты для хроматографии и их свойства. Заключительная, четвертая, часть обзора собственно посвящена вирусу клещевого энцефалита. Описывается его таксономическая принадлежность и строение вириона. Очень подробно рассматривается его жизненный цикл, структура и функции поверхностного гликопротеина Е. Способам профилактики и лечения вирусного клещевого энцефалита предшествуют разделы, посвященные исследованиям механизмов нейтрализации флавивирусов антителами, описанию уже имеющихся моноклональных антител против вируса клещевого энцефалита и других флавивирусов. Заключительный раздел, посвященный разработке терапевтических антител против вируса клещевого энцефалита и других флавивирусов указывает на перспективность разработки препаратов на основе иммуноглобулинов для терапии подобных инфекций. Глава Материалы и методы в полной мере отражает набор используемых в работе реактивов, их квалификации и производителях. Обращает на себя внимание как очень удачно сведены в один раздел прописи всех используемых в работе растворов и сред. Глава результатов собственных исследований представлена десятью разделами. Нет необходимости перечислять их все, однако следует заметить, что как и экспериментальная часть в этом разделе прослеживается четкая логическая цепочка от раздела к разделу. Отдельно следует отметить раздел, посвященный конструированию плазмидных векторов для экспрессии антител. Это, несомненно, указывает на профессионализм соискателя как исследователя не только теоретического рода, но и прикладного. По всей вероятности, один только вышеозначенный раздел может претендовать на отдельную диссертационную работу. В целом, оформление диссертационной работы Байкова И.К. не вызывает вопросов. Текст, орфография и пунктуация выверены. Однако не совсем ясны мотивы, по которым cписок использованных сокращений вынесен практически в самый конец работы. Для удобства следовало привести список сокращений в начале. Недостатки в работе, к сожалению, имеются: 1. В тексте диссертации всего дважды упоминается модельный штамм вируса клещевого энцефалита «Абсеттаров». Ни его принадлежность к субтипу, никаких других характеристик не указано. А ведь на этом штамме проводятся все модельные эксперименты. Не указаны мотивы, по которым был выбран именно этот штамм. 2. Логически вытекающий из первого вопрос, почему не были проведены исследования рекомбинантных антител на мышах хотя бы в одной повторности с штаммами, принадлежащими к западному, дальневосточному и сибирскому субтипу. 3. В тексте диссертации «Соотношение этих цепей в очищенном препарате МКА 14D5, оцененное по масс-спектрам, составило приблизительно 1: 3.», но совершенно непонятно откуда взялись эти цифры. Приходится гадать что имелось в виду: окраска белка в геле и денситометрия, а далее триптический гидролиз и снятие спектров - тогда вопрос снимается. Если же просто по интенсивности пика (ионного тока) на масс-спектрограмме, то поскольку масс-спектрометрия на сегодняшний день является неколичественным методом, следует воздержаться от подобного рода утверждений. Тем не менее, объем выполненных исследований вполне достаточен для кандидатской диссертации. Выводы написаны понятным языком, базируются на полученных автором экспериментальных результатах и обоснованы. Автореферат в полном объеме отражает материал диссертационной работы. Выносимые на защиту положения сформулированы четко и кратко. Результаты работы отражены в четырех статьях и были представлены на российских и международных конференциях. Результаты работы защищены патентом РФ. В целом, хочется отметить высочайший уровень работы, особенно ее экспериментальную часть. Созданное и исследованное в данной работе антитело ch14D5a является перспективным кандидатом для создания профилактических и терапевтических препаратов против вируса клещевого энцефалита. Ввиду того, что сегодня подобные препараты очень востребованы, то разработанная в ходе исследования платформа может с успехом использоваться для создания других потенциальных терапевтических средств, особенно против социально-значимых, таких как ВИЧ, вирусные гепатиты. Диссертационная работа Байкова Ивана Константиновича является законченным исследованием и соответствует требованиям п. 9 Положения о присуждении ученых степеней, утвержденного постановлением Правительства Российской Федерации от 24 сентября 2013 г. № 842, а ее автор Байков И.К. заслуживает присуждения ученой степени кандидата наук по специальности 03.01.04 – биохимия. Диссертационная работа Байкова И.К. обсуждена и поддержана на заседании научного семинара лаборатории аналитической биоорганической химии Лимнологического института СО РАН. Доктор биологических наук, профессор Заведующий лабораторией аналитической биоорганической химии Федерального государственного
