ИНСТИТУТ ЭКОЛОГИИ И ГЕНЕТИКИ МИКРООРГАНИЗМОВ УрО
advertisement
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ ЭКОЛОГИИ И ГЕНЕТИКИ МИКРООРГАНИЗМОВ УРАЛЬСКОГО ОТДЕЛЕНИЯ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК На правах рукописи СЕРЕБРЕННИКОВА Марина Константиновна БИОДЕГРАДАЦИЯ НЕФТЯНЫХ УГЛЕВОДОРОДОВ ИММОБИЛИЗОВАННЫМИ РОДОКОККАМИ В КОЛОНОЧНОМ БИОРЕАКТОРЕ 03.02.03 Микробиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, Куюкина Мария Станиславовна Пермь – 2014 2 ОГЛАВЛЕНИЕ Введение.……………………………………………………………………......... 4 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Глава 1. Биологические особенности алканотрофных родококков............. 10 1.1. Механизмы окисления алифатических углеводородов…………………. 19 1.2. Механизмы расщепления ароматических углеводородов……………… 21 1.3. Механизмы расщепления полиароматических углеводородов…………. 22 Глава 2. Иммобилизованные микроорганизмов в биотехнологических процессах.………………………………………………………………………… 27 2.1. Преимущества иммобилизованных микроорганизмов перед свободными 27 2.2. Методы оценки жизнеспособности иммобилизованных микроорганизмов ………………………………………………………………... Глава 3. Биореакторные технологии как способ 35 оптимизации биоремедиационных процессов ex situ……………………………………….. 39 3.1. Адаптация как способ повышения углеводородокисляющей активности микроорганизмов………………………………………………………………….. 51 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Глава 4. Материалы и методы исследования………………………………… 59 4.1. Бактериальные штаммы и условия их культивирования………………... 59 4.2. Исследование кинетики процесса иммобилизации родококков в биореакторе с перемешиванием и колоночного типа………………………… 59 4.3. Изучение способности бактериальных культур усваивать нефтяные углеводороды……………………………………………………………………… 64 4.4. Определение солеустойчивости бактериальных культур……………….. 65 4.5. Очистка нефтезагрязненной воды коиммобилизованными родококками в биореакторе с псевдоожиженным слоем………………………. 66 4.6. Структурный анализ нефтезагрязненной воды…………………………... 69 4.7. Определение физико-химических свойств клеток родококков…………. 71 4.7.1. Морфология клеточной поверхности……………………………… 71 3 4.7.2. Гидрофобность клеточной стенки………………………………….. 71 4.7.3. Определение электрокинетического потенциала…………………. 72 4.7.4. Эмульгирующая активность………………………………………... 72 4.7.5. Определение суммарных клеточных липидов…………………….. 73 4.7.6. Определение антибиотикочуствительности бактерий……………. 73 4.8. Определение жизнеспособности и функциональной стабильности иммобилизованных клеток……………………………………………………….. 75 4.9. Генетический анализ бактериальных штаммов………………………….. 75 4.10. Математическое моделирование процесса иммобилизации клеток родококков в колоночном биореакторе с псевдоожиженным слоем………….. 78 4.11. Статистическая обработка результатов…………………………………... 80 Глава 5. Подбор носителя для иммобилизации клеток родококков………. 81 Глава 6. Динамика процесса иммобилизация родококков в биореакторе с перемешиванием и колоночного типа……………………………………… 88 Глава 7. Биодеградация нефтяных углеводородов ассоциацией коиммобилизованных родококков в колоночном биореакторе…………... 98 Глава 8. Возможные механизмы адаптации родококков к углеводородным загрязнителям…………………………………………….. 113 Глава 9. Очистка промышленной нефтезагрязненной сточной воды в лабораторном колоночном биореакторе с иммобилизованными родококками……………………………………………………………………… 124 ЗАКЛЮЧЕНИЕ…………………………………………………………………… 128 ВЫВОДЫ………………………………………………………………………….. 132 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ………………………………………………………… 133 4 ВВЕДЕНИЕ Актуальность проблемы. Развитие нефтяной промышленности приводит к загрязнению окружающей среды нефтепродуктами, а также увеличению объема нефтесодержащих сточных вод. В связи с этим, важным направлением экологической биотехнологии является разработка эффективных и безопасных способов очистки нефтезагрязненных сред. Наиболее перспективными и экологически безопасными являются микробиологические методы, основанные на использовании углеводородокисляющих микроорганизмов, как правило, иммобилизованных на твердых носителях. Данный подход предусматривает (1) сорбцию нефтяных углеводородов материалом носителя и (2) их эффективное окисление иммобилизованными микробными клетками (Жукова, Морозов, 2010; Рымовская, Ручай, 2008; Junter et al., 2002; Martins et al., 2012). Поскольку при иммобилизации решается проблема отделения биомассы от жидкой фазы, это позволяет перейти от периодических схем очистки воды к более производительным непрерывным технологиям, предусматривающим использование проточных биореакторов (Сироткин и др., 2007; Doaa, Wafaa, 2009). Сегодня широкое применение в очистке загрязненных сточных вод получили колоночные биореакторы с псевдоожиженным слоем (fluidized-bed), заполненные дисперсным носителем с иммобилизованной микрофлорой, через который циркулирует восходящий поток жидкости (Vainberg et al., 2002; McCarty, Meyer, 2005). Использование реакторов такого типа позволяет (1) осуществлять процессы в небольших по размеру конструкциях; (2) обеспечивать равномерное распределение загрязненной жидкости между поддерживаемыми во взвешенном состоянии частицами носителя, что повышает биодоступность углеводородов для закрепленных клеток; (3) создавать оптимальные условия для адаптации микроорганизмов к органическим загрязнителям и другим факторам (Касаткин, 1973; Махлин, 2009; Shieh, Keenan, 1986; Soko´ł, Korpal, 2006; Werther, 2007). Биотехнологически перспективной группой микроорганизмов, используемой для очистки нефтезагрязненных сред, являются актинобактерии рода Rhodococcus. Обладая широким спектром метаболических возможностей и 5 уникальными ферментными комплексами, родококки являются активными биодеструкторами токсичных и труднодоступных для многих микроорганизмов углеводородов (алифатических, ароматических, поли- и гетероциклических) и их производных (гербицидов, полихлорированных бифенилов, фармполлютантов, фенолов, эстрогенов) (Ившина и др., 2006; Bell et al., 1998; Yoshimoto et al., 2004; Martínková et al., 2009; Ivshina et al., 2012). Биотехнологические преимущества родококков обусловлены такими их биологическими особенностями как типично бактериальный рост и сложный морфогенетический цикл развития, способность ассимилировать гидрофобные субстраты и синтезировать поверхностно-активные вещества (биосурфактанты), а также устойчивая активность в экстремальных условиях среды (Ившина и др., 2007; Prieto et al., 2002б; Kuyukina, Ivshina, 2010). В последнее время для расширения спектра окисляемых в процессах биоремедиации нефтяных углеводородов все чаще используются природные или искусственные ассоциации углеводородокисляющих микроорганизмов, отличающихся по спектру потребляемых субстратов (Жуков и др., 2007; Prieto et al., 2002б; Ghazali et al., 2004; Mikesková et al., 2012). При подборе бактериальных ассоциаций необходимо учитывать антагонистическую активность штаммов, их устойчивость к солям тяжелых металлов и токсикантам и функциональную стабильность в экстремальных условиях среды. Возможность использования ассоциации на основе коиммобилизованных родококков для очистки нефтезагрязненных сточных вод в биореакторе до настоящего времени не исследовалась. Цель настоящей работы – изучение процесса иммобилизации родококков на твердых носителях в колоночном биореакторе и оптимизация условий биодеградации нефтяных углеводородов. Основные задачи исследования: 1. Подобрать оптимальные условия иммобилизации клеток родококков на органических носителях в колоночном биореакторе. 2. Изучить жизнеспособность и функциональную стабильность коиммобилизованных родококков в процессе очистки нефтезагрязненной воды. 6 3. Исследовать влияние процесса адаптации родококков к повышенным концентрациям углеводородов на физико-химические свойства клеток. 4. Оценить возможность использования иммобилизованной ассоциации родококков для очистки промышленных сточных вод в биореакторе. Научная новизна. Впервые для биодеградации нефтяных углеводородов в колоночном биореакторе с псевдоожиженным слоем использована ассоциация алканотрофных родококков гидрофобизованных R. хвойных ruber и опилках. R. opacus, закрепленных Экспериментально на определены гидродинамические условия (1,2-2,0 мл/мин) в биореакторе, при которых происходит псевдоожижение частиц носителя. На основе математического моделирования подобран оптимальный скоростной режим (2,0 мл/мин) иммобилизации родококков на опилках, при котором происходит прочное закрепление клеток и достигается высокая (1,7 × 107 клеток/г носителя) концентрация биомассы в реакторе. Установлено, что родококки, адаптированные к повышенным гидрофобной концентрациям клеточной стенкой, нефтезагрязнителей, обусловленной характеризуются высоким содержанием клеточных липидов, и повышенным синтезом биосурфактантов. Выявлена прямая зависимость (R = 0,98; р < 0,05) между показателем гидрофобности клеточной стенки родококков и их электрокинетическим потенциалом. Показано, что адаптация к углеводородам в биореакторе сопровождается увеличением антибиотикоустойчивости бактериальной популяции и изменением плазмидного профиля. Так, из клеток адаптированного R. ruber выделена плазмида размером около 15 т.п.н., не выявляемая с помощью экстракционного метода в исходном штамме. Теоретическое и практическое значение работы. Полученные данные расширяют представления о процессе биодеградации углеводородных загрязнителей иммобилизованными микроорганизмами в условиях биореактора. Показано, что коиммобилизованные клетки R. ruber и R. opacus могут быть использованы для очистки загрязненной нефтяными углеводородами воды в колоночном биореакторе с псевдоожиженным слоем. При этом оценена 7 возможность оптимизации процесса деградации нефтяных углеводородов ассоциацией коиммобилизованных родококков путем подбора оптимальной скорости подачи загрязненной воды в биореактор и адаптации бактериальных культур к углеводородам. Установлено, что в процессе очистки формируется устойчивая к высоким концентрациям нефтепродуктов ассоциация иммобилизованных бактерий, способная сохранять метаболическую активность при попадании в биореактор высококонцентрированных промышленных стоков. Разработан комбинированный метод видовой дифференциации и количественной детекции жизнеспособных родококков, входящих в состав иммобилизованной ассоциации, который может применяться для мониторинга функциональной активности биокатализаторов. Показана возможность многократного использования иммобилизованных на модифицированных опилках родококков в биотехнологическом процессе очистки нефтезагрязненной воды. Основные положения, выносимые на защиту 1. Процесс иммобилизации родококков на твердых носителях целесообразно проводить в биореакторе с псевдоожиженным слоем при оптимальной скорости подачи клеточной суспензии. 2. Ассоциация коиммобилизованных R. ruber и R. opacus эффективно удаляет нефтяные углеводороды из загрязненной воды. 3. Адаптация родококков к повышенным концентрациям нефтяных углеводородов в биореакторе сопровождается изменением их физико-химических свойств и возрастанием антибиотикоустойчивости. 4. Применение родококков иммобилизованных эффективно для очистки на опилках нефтесодержащих адаптированных сточных вод в биореакторе. Апробация работы и публикации. Основные результаты исследований доложены и обсуждены на XVI и XVII Всероссийских школах-конференциях молодых ученых и студентов «Математическое моделирование в естественных науках», Пермь, 2007 и 2008; II Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспиратнов-биологов «Симбиоз-Россия 2009», Пермь, 8 2009; The XIII Annual Symposium for Biology Students of Europe, Kazan, 2009; III Всероссийском конгрессе с международным участием студентов и аспирантов биологов «Симбиоз-Россия 2010», Н. Новгород, 2010; 3-ем Байкальском Микробиологическом Симпозиуме с международным участием, Иркутск, 2011; I Всероссийской с международным участием школе-конференции молодых учёных «Современные проблемы микробиологии, иммунологии и биотехнологии», Пермь, 2011; Environmental Microbiology & Biotechnology (EMB2012), Болонья, Италия, 2012; VI Всероссийской конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой», Саратов, 2012; 17-ой международной пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века», Пущино, 2013. По теме диссертации опубликована 21 печатная работа, из них 8 статей в научных журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ. Объем и структура работы. Работа изложена на 159 страницах машинописного текста, содержит 13 таблиц и 30 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, пяти глав собственных исследований, заключения, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 221 наименование, в том числе 87 на русском и 134 на английском языках. Связь работы с крупными программами и собственный вклад автора. Работа выполнена в лаборатории алканотрофных микроорганизмов Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН и является частью исследований по теме «Изучение и сохранение функционального и видового разнообразия алканотрофных родококков in/ex situ, полезного для экзоценозов и практической деятельности человека» (номер госрегистрации 01.9.70 005279), ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» (соглашение № 8793). Исследования поддержаны грантом Российского фонда фундаментальных исследований (11-04-96045-р_урал_а), Президента РФ «Ведущие научные школы» № НШ-5589.2012.4 и Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» (12-П-4-1052). 9 Личный вклад автора состоял в планировании и проведении экспериментов, критическом анализе полученных результатов. Автор принимал участие в подготовке результатов работы к публикации и их представлении на научных конференциях. Благодарности. благодарность своему Автор выражает научному самую руководителю глубокую д.б.н. и М.С. искреннюю Куюкиной за постоянное внимание и неоценимую помощь в работе, а также чл.-корр. РАН И.Б. Ившиной и всему коллективу лаборатории алканотрофных микроорганизмов ИЭГМ УрО РАН за помощь и поддержку на всех этапах диссертационной работы. 10 Глава 1. БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ АЛКАНОТРОФНЫХ РОДОКОККОВ Актинобактерии рода Rhodococcus широко распространены в природе и выделяются из водных (грунтовых, поверхностных, сточных) и почвенных биотопов, связанных, в частности, с месторождением нефти и газа (Нестеренко и др., 1985; Ившина и др., 1987; Жуков и др., 2006; Martínková et al., 2009). Обладая уникальными биологическими свойствами и характеризуясь широкими катаболическими возможностями и уникальными ферментными системами, родококки могут деградировать разнообразные по химической структуре ксенобиотики (Bell et al. 1998; Larkin et al., 2005; Martínková et al., 2009). Эти особенности в сочетании со способностью выживать в неблагоприятных условиях среды делает представителей рода Rhodococcus перспективным при разработке биокатализаторов и биопрепаратов для биологических способов ремедиации загрязненных углеводородами объектов окружающей среды. Род Rhodococcus включает аэробные, грамположительные, неподвижные, некислотоустойчивые, неспорообразующие актинобактерии, характеризующиеся морфологическим разнообразием (Ившина и др., 1987, Finnerty, 1992; Bell et al., 1998). Характерной особенностью представителей данного рода является сложный морфогенетический цикл развития: короткие палочковидные, нитевидные или ветвящиеся клетки – рудиментарный или хорошо развитый первичный мицелий – палочковидные и кокковидные клетки (Ившина, 1997). Фрагментация клеточного мицелия способствует увеличению отношения клеточной поверхности к общему объему клетки, что, в свою очередь, повышает способность родококков поглощать трудноусваиваемый гидрофобный субстрат (Ившина и др., 2007). Трехстадийный цикл развития родококков является причиной появления разнообразных способов клеточной кооперации, выражающейся в слипании пептидогликановых слоев клеточной стенки, формировании пилевидных тяжей или шишковидных выростов на ее наружной поверхности. Это, в свою очередь, способствует установлению контакта клеток друг с другом, их удержанию 11 в колониях, адсорбции на поверхности капель гидрофобных субстратов и почвенных частиц, а также образованию на поверхности носителей биопленок, использующихся в биотехнологических процессах. Кроме того, кооперация клеток, являясь защитным механизмом, способствует их выживанию в условиях стресса (de Carvalho, Fonseca, 2005). Несмотря на то, что многие микроорганизмы способны использовать углеводороды в качестве источника углерода и энергии, имея различные ферментные системы и метаболические пути их потребления, именно актинобактерии рода Rhodococcus считаются одной из самых перспективных групп, на основе которой создаются биокатализаторы и биопрепараты, использующиеся для биодеградации высокостабильных и токсичных для многих микроорганизмов полициклических), углеводородов (алифатических, полихлорированных бифенилов, ароматических, нитроароматических соединений, а также разнообразных гетероциклических веществ, нитриламинов и гербицидов (Пирог и др., 2005а; Карпенко и др., 2006; Плотникова, 2010; Prieto et al., 2002б; Kuyukina et al., 2003; Ivshina et al., 2012). Биодеструктирующие свойства бактерий рода Rhodococcus (взаимодействие с гидрофобными субстратами и окисление их широкого спектра) обусловлены наличием липофильной клеточной стенки, которая, с одной стороны, обладает высоким сродством к углеводородам и обеспечивает взаимодействие с ними, а, с другой, выполняет барьерную функцию для крупных молекул, в том числе антибиотиков. Липофильный характер клеточной стенке родококков придают миколовые кислоты, представленные длинными цепочками α -разветвленных β-гидроксилированных жирных кислот (Коронелли, 1996; Bell et al., 1998). Так Коронелли и Калюжная (1983) показали, что при подавлении синтеза миколовых кислот бактерия теряет способность к окислению углеводородов. Благодаря миколовым жирнокислотный состав кислотам и мембранных способности липидов, родококков меняется изменять текучесть и проницаемость клеточной стенки, что, в свою очередь, приводит к приобретению устойчивости к действию химических веществ и способствует их деградации 12 (Sikkema et al., 1995; Martínková et al., 2009; de Carvalho, 2010). Кроме того, гидрофобным характером клеточной стенки Коваленко с соавт. (2003; 2006) объясняют способность родококков к необратимой адсорбции на поверхности различных носителей. Биодеструктирующие способностью свойства продуцировать родококков также связаны поверхностно-активные с их вещества (биосурфактанты), которые эмульгируют и солюбилизируют гидрофобные углеводороды, улучшая их поступление в микробные клетки, а, следовательно, увеличивают эффективность деградации (Ившина и др., 1993; Пирог и др., 2005б; Карпенко и др., 2006; Куюкина, 2006; Гоготов, Ходаков, 2008; Philp et al., 2002). Кроме того, синтезируемые родококками в углеводородов биосурфактанты проявляют свойства металлохелаторов и препятствуют поступлению тяжелых металлов внутрь продуцирующих клетки (Ившина биосурфактанты и др., 2013). родококков в Поэтому состав включение биопрепаратов, использующихся в биотехнологических процессах очистки нефтезагрязненных сред, является целесообразным. Разнообразие катаболических путей, позволяющих родококкам метаболизировать широкий круг соединений, обусловлено большим размером их генома (около 5,6-8,0 Mb), который включает плазмиды – от маленьких кольцевых до больших линейных (табл. 1), на которых расположено большое число катаболических генов, а также генов устойчивости и вирулентности (Fetzner et al., 2007; Alvarez, 2010; Larkin et al., 2010). Следует отметить, что плазмиды, связанные со свойством патогенности и вирулентности, характерны только для представителей R. equi и R. fascians, у которых также описаны плазмиды с характерными для непатогенных родококков катаболическими функциями (Takai et al., 2000; Duquesne et al., 2010). 13 Таблица 1. Характеристика плазмид актинобактерий рода Rhodococcus Штамм Плазмида pNC10 pNC20 R. corallinus В-276 Размер, п.н. 70000 85000 Форма Свойства линейная линейная Деградация трихролэтена 185000 линейная pNC40 pVAPB1593 235000 79251 линейная кольцевая R. equi pVAPAMBE116 (pVAPA116) 83100 кольцевая R. equi ATCC33701 pREAT701 80610 кольцевая R. erythropolis pBD2 210205 линейная R. erythropolis pTA421 5000 линейная Деградация бифенилов Saeki et al., 1999 Letek et al., 2008 Duquesne et al., 2010 Takai et al., 2000 Stecker et al., 2003 Fetzner et al., 2007 13 pNC30 Деградация пропилена, алкенмонооксигеназы деградации трихлорэтана Деградация трихролэтана Вирулентные свойства Деградация ароматических соединений, вирулентные свойства Вирулентные свойства Деградация изопропилбензола, бифенилов, соокисление трихлорэтана, устойчивость к мышьяку и ртути Источник 14 Продолжение табл. 1. Штамм R. erythropolis PR4 Размер, п.н. Форма Свойства pREC1 104014 кольцевая Деградация алканов, ß-окисление жирных кислот pREC2 3637 кольцевая Устойчивость к металлам pREL1 271577 линейная pFiD188 3027 линейная pLP6 650000 линейная pSP6 360000 линейная R. globerulus P6 pRHL1 1123075 линейная pRHL2 442536 линейная R. jostii RHA1 Деградация алканов, устойчивость к металлам Синтез трансмембранного гидрофобного белка, осуществляющего эффлюкс хлорамфеникола из клетки, устойчивость к кадмию, фитопатогенность Источник Fetzner et al., 2007 Fetzner et al., 2007 Деградация бифенилов Fetzner et al., 2007 Деградация бифенилов и этилбензола, тетрафталата и фталата Деградация бифенилов и этилбензола McLeod et al., 2006 14 R. fascians D188 Плазмида 15 Продолжение табл. 1. Плазмида Размер, п.н. Форма R. jostii RHA1 pRHL3 332361 линейная R. opacus 1CP p1CP 74000 линейная pKNR 111160 кольцевая pKNR01 4367 кольцевая pKNR02 2773 кольцевая pROB01 558192 линейная pROB02 244997 линейная pNU01 75000 линейная pNU02 200000300000 линейная R. opacus B4 R. opacus М213 Свойства Источник Гены деградации ароматического кольца Деградация 4-хлор-3,5трихлоркатехола, 3-хлоркатехола, малилацетатредуктаза Деградация бензола, бензоата, фенола, 4-нитрофенола, 4-гидроксибензоата, катехола Деградация протокатехола, фенилацетата, нафталина, никотина, трикарбамида McLeod et al., 2006 Fetzner et al., 2007 Na et al., 2005 Деградация гербицидов, тиоцианата Метаболизм ароматических соединений: катехол2,3-диоксигеназа Fetzner et al., 2007 15 Штамм 16 Продолжение табл. 1. Штамм Плазмида Размер, п.н. Форма Свойства Источник R. rhodochrous NCIMB13064 pRTL1 10000 кольцевая Деградация галогеналканов Kulakova et al., 1995 Lessard et al., 2004 Rhodococcus sp. B264-1 4970 кольцевая pDK1 380000 линейная pDK2 330000 линейная pDK3 750000 линейная Rhodococcus sp. NCIMB 12038 p2SL1 380000 линейная Метаболизм нафталина R. ruber P-II-123-1 pNC903 2386 кольцевая Устойчивость к канамицину Kim et al., 2002 Fetzner et al., 2007 Matsui et al., 2006 16 Rhodococcus sp. DK17 pB264 Плазмида, обладающая чувствительностью к температуре Гены кодирующие оксигеназы начального этапа расщепления и диоксигеназы метарасщепления кольца Деградация алкилбензола, тетрафталата и фталата Деградация тетрафталата и фталата 17 На обнаруженных у представителей рода Rhodococcus плазмидах расположены также гены устойчивости к антибиотикам и тяжелым металлам (Dabbs, Sole, 1988; Stecker et al., 2003). Отмечено, что плазмиды могут служить своеобразным маркером экологической приуроченности родококков и представителей других родов актинобактерий (Leahy, Colwell, 1990). Так, показано, что плазмиды резистентности к антибиотикам и тяжелым металлам часто и с высокой степенью копийности встречаются у представителей почвенных и водных биотопов загрязненных нефтью и нефтепродуктами (Ившина и др., 1981). Способность актинобактерий рода Rhodococcus приобретать новые ферментные активности и метаболические свойства, во многом объясняется высокой частотой рекомбинаций, инверсиями и дупликациями генов (van Hamme et al., 2003; van der Geize, Dijkhuizen, 2004; Larkin et al., 2006; Heuer, Smalla, 2012). Расширению деградационного потенциала и повышению адаптивных свойств родококков, способствует и то, что плазмиды биодеградации являются конъюгативными, а значит, способны к горизонтальному переносу между бактериальными клетками (Fetzner et al., 2007; Larkin et al., 2010). Последний является ключевым фактором появления новых катаболических путей, необходимых для эффективной деградации ксенобиотиков и повышения эффективности процессов очистки, а также обеспечения родококков дополнительными источниками углерода и энергии. К настоящему времени описана передача генов катаболизма галогеналканов, алкенов, бифенилов и нафталина между различными штаммами родококков (Kulakov et al., 2005). Кроме того, ключевые катаболические гены представлены в геноме родококков несколькими копиями, что также имеет немаловажное значение для поддержания катаболической активности (Larkin et al., 2010). Для представителей рода Rhodococcus характерно наличие генных кластеров, включающих хромосомы и несколько плазмид или только палазмиды, между которыми рассредоточены гены деградации, что также 18 является важным фактором катаболического разнообразия и универсальности (van der Geize, Dijkhuizen, 2004; Larkin et al., 2006). Так у штамма R. jostii RHA1 гены деградации полихлорированных бифенилов и других ароматических соединений рассредоточены между четырьмя репликонами: линейной хромосомой и тремя линейными плазмидами pRHL1, pRHL и pRHL3 (McLeod et al., 2006). Кроме того, к настоящему времени у R. jostii RHA1 описаны генные кластеры, кодирующие тауринпируватамидотрансферазы и аланиндегидрогеназы, а также гены, контролирующие катаболизм таурина, роль которых подтверждена экспериментально (Larkin et al., 2006). Генные кластеры, отвечающие за деградацию фталатов и тетрафталатов, расщепление ароматического кольца, описаны для Rhodococcus sp. DK17 (Kim et al., 2002). Большинство линейных плазмид, описанных у представителей рода Rhodococcus, связаны с генами катаболизма алканов или деградации ароматических соединений, например, нафталина, бифенилов или алкинбензолов, а также толуола (Fetzner et al., 2007; Larkin et al., 2010). Некоторые родококки (R. aetherivorans I24, R. erythropolis PR4, R. opacus MR 11, R. opacus B4), содержат как большие линейные, так и кольцевые плазмиды. Однако, следует отметить, что не всегда катаболические гены расположены на плазмидах. Так Grund с соавт. (1992) заметили, что у Rhodococcus sp. В4 гены трансформации нафталина находятся на хромосоме, а не на плазмиде. Это, в свою очередь, подтверждает значение переноса генов и генетической рекомбинации в формировании разнообразных метаболических путей у представителей данного рода. Криптические плазмиды родококков используются для создания селективных шаттл-векторов между представителями рода Rhodococcus, а также между родококками и представителями других родов бактерий (Singer, Finnerty, 1988; Matsui et al., 2006). Некоторые из них нашли свое применение в метаболической инженерии (Kostichka et al., 2003). 19 К настоящему моменту установлено, что использование плазмидсодержащих штаммов способствует интенсификации процессов очистки нефтезагрязненных сред за счет передачи плазмид и генов биодеградации, что ведет к увеличению числа клеток, содержащих плазмиды, и расширению спектра утилизируемых субстратов. 1.1. Механизмы окисления алифатических углеводородов. Окисление углеводородных субстратов происходит внутри бактериальных клеток, что определяет необходимость специфического способа их переноса в клетку (Ившина, 1987). Транспорт углеводородов у родококков идет в два этапа (Рачинский и др., 1971). На первом этапе происходит пассивная диффузия н-алканов через всю поверхность клеточной стенки до цитоплазматической мембраны, где они могут накапливаться и удерживаться без изменения структуры (Коронелли, 1996). Основную роль в поглощении жидких углеводородов на этом этапе играют образующие клеточную стенку липиды и миколовые кислоты, которые обуславливают непосредственный контакт углеводородного субстрата с клетками родококков. На втором этапе происходит активный транспорт углеводорода через цитоплазматическую мембрану с последующим их растворением в ее липидах. Ферментные системы, ответственные за окисление углеводородов, локализованы в мембранных структурах клеток или цитоплазме (Рачинский и др., 1971). К настоящему времени изучены и описаны три пути окисления алканов бактериальными клетками (Ившина, 1987; Жуков и др., 2006): (1) монотерминальное окисление метильной группы н-алкана с образованием первичного (2) спирта, субтерминальное альдегида окисление и с монокарбоновой последовательным кислоты; образованием вторичного спирта и соответствующего метилкетона и (3) дитерминальное окисление, при котором одновременно или последовательно окисляются терминальные метильные группы н-алкана с последующим образованием жирных дикарбоновых кислот, по числу атомов углерода соответствующих исходному углеводороду. Следует отметить, что актинобактерии рода 20 Rhodococcus способны окислять алканы всем вышеописанным путям, однако наиболее распространенным является монотерминальное окисление. При монотерминальном окислении концевая метильная группа посредством монооксигеназ окисляется до первичного спирта (Ившина, 1987). Ферментные системы, участвующие в оксигенировании субстрата, зависят от длины углеводородной цепи: С1-С5 алканы окисляются растворимыми или мембрансвязанными метанмонооксигеназами; С5-С16 алканы – алкангидроксилазными системами, содержащими негемовое железо или цитохром Р450 монооксигеназами; алканы, содержащие более 17 атомов углерода – диоксигеназами (Пирог и др., 2010). Окисление н-гексадекана у представителей трехкомпонентного рода Rhodococcus алкангидроксилазного происходит комплекса, с участием состоящего из растворимых НАДН- рубредоксинредуктаз и рубредоксина, а также мембрансвязанной монооксигеназы, или алкангидроксилазы. Следующий этап включает окисление образовавшегося из углеводорода первичного спирта до альдегида, а затем, под действием НАДзависимых дегидрогеназ, до соответствующей жирной кислоты (Жуков и др., 2006). Дальнейшее разложение жирных кислот протекает путем β-окисления, заключающегося в последовательном отщеплении двухуглеродных фрагментов в виде ацетата, который затем поступает в цикл трикарбоновых кислот. Кроме того, образующиеся жирные кислоты могут использоваться клеткой в качестве строительного материала. Окисление алканов за счет действия диоксигеназ может идти через стадию образования гидропероксидов до альдегидов по так называемому пути Финнерти. При этом стадия образования спиртов и кислородных радикалов, как это наблюдается при действии монооксигеназ, отсутствует. По этому механизму может осуществляться окисление н-алканов (С10-С30) и алкенов (С12-С20). Дальнейшее превращение жирных кислот, образовавшихся при окислении н-алканов, наряду с β-окислением может идти по механизму дитерминального окисления с образованием ω-оксимонокарбоновых, а затем 21 и дикарбоновых кислот (Ившина, 1987). Окисление монокарбоновой кислоты в оксимонокарбоновую идет с включением молекулярного кислорода. При последующем превращении оксигруппы ω-оксимонокарбоновой кислоты в карбоксильную группу дикарбоновой кислоты кислород воздуха в ряде обменных реакций может заменяться кислородом воды. 1.2. Механизмы расщепления ароматических углеводородов. Представители рода Rhodococcus способны деструктировать бензол и его производные (толуол, этилбензол, ксилол), полицикличные, амино-, галогени нитрозамещенные ароматические вещества, фенолсодержашие соединения, ароматические кислоты, эфиры и пестициды, а также десульфурировать нефтепродукты (van der Geize, Dijkhuizen, 2004). Способность родококков деградировать широкий круг ароматических соединений обусловлена наличием большого спектра диоксигеназ (Larkin et al., 2005). Ароматическая структура углеводородов устойчива к разрыву кольца. Аэробные микроорганизмы окисляют ароматическое кольцо до дигидроксиароматических соединений как катехол, протокатехат и гентизат, после чего следуют реакции, связанные с раскрытием ароматического кольца (Жуков и др., 2006; Martínkova et al., 2009). При этом раскрытие ароматического кольца для катехола и протокатехата, катализируемое диоксигеназами, может идти между двумя гидроксильными группами − интрадиольный путь (орто-расщепление) или рядом с одной из гидроксильных групп − экстрадиольный путь (мета-расщепление). В случае гентизата расщепление кольца происходит между карбоксильной группой и смежной гидроксильной ароматических группой. соединений гентизатдегидрогеназам, Основная принадлежит которые роль катехол-, катализируют в деградации протокатехат- и критические реакции катехолов является расщепления ароматического кольца. Конечными продуктами орто-расщепления янтарная (сукцинат) и уксусная (ацетат) кислоты, которые далее поступают в 22 мета-пути цикл Кребса. В раскрытии катехолов по могут быть задействованы два механизма (Жуков и др., 2006). Согласно первому, альдегид 2-гидроксимуконовой кислоты под действием НАД-зависимой дегидрогеназы может окисляться до соответствующей 2-гидроксимуконовой кислоты, которая под действием таутомеразы переходит в таутомерную форму. На следующих этапах происходит декарбоксилирование. В соответствии со вторым механизмом, гидролитическое расщепление альдегида 2-гидроксимуконовой кислоты может осуществляться с образованием муравьиной и 2-гидроксипентадиеновой кислоты, которая под действием гидратазы переходит в 4-гидрокси-2-оксопентановую кислоту, которую альдолазы расщепляют до ацетальдегида и пирувата. Длинные алифатические заместители ароматических соединений по механизму β -окисления расщепляются до более коротких боковых фрагментов, после чего образовавшиеся интермедиаты претерпевают расщепление ароматического кольца по одному из приведенных выше механизмов. 1.3. Механизмы расщепления полиароматических углеводородов. Полиароматические углеводороды (ПАУ) – наиболее трудноразлагаемые органические поллютанты, обладающие токсичными, канцерогенными и мутагенными свойствами (Жуков и др., 2006). Основным процессом, способствующим очистке микробиологическая сред, деградация. загрязненных Помимо ПАУ, биоремедиации, является микробные превращения ПАУ рассматривают в качестве перспективного метода синтеза изомерных дигидродигидрокси- и дигидроксифенантренов, использующиеся в синтезе антиаллергенных и антиканцерогенных препаратов (Бабошин и др., 2005). Самый простой с химической точки зрения ПАУ − нафталин, состоящий из двух конденсированных бензольных колец. Первая реакция деградации нафталина, дегидрогеназами, катализируемая приводит к нафталиндиоксигеназами образованию и цис-1,2-дигидрокси-1,2- 23 дигидронафталина (Grund et al., 1992; Martínkova et 2009), al., хотя в некоторых случаях под действием диоксигеназных систем может образовываться цис-2,3-дигидрокси-2,3-дигидронафталин (Жуков и др., 2006). Последующее образование 1,2-дигидроксинафталина происходит с участием ферментов в присутствии НАДН, что отличает нафталин диоксигеназы представителей родов Rhodococcus и Pseudomonas (Grund et al., 1992). На следующем этапе происходит раскрытие ароматического кольца по мета-пути, которое завершается образованием салицилата. Метаболическое разложение последнего идет с участие салицилат-5-гидроксилазы через гентизат или катехол. При этом в случае катехола конечным продуктами биоразложения являются ацетил- и сукцинилкофермент-А, а в случае гентизата – ацетоацетат и фумарат. При деградации фенантрена и антрацена бактериями рода Rhodococcus обнаруживается большое количество промежуточных продуктов, некоторые из которых накапливаются в среде. Так М.А. Бабошин с соавт. (2005) показали, что штамм R. rhodnii 135 способен гидроксилировать фенантрен до единственного продукта – 3-гидроксифенантрена. Позднее в работе Н.А. Леневой с соавт. (2009) было отмечено, что предварительная адаптация данного штамма монооксигеназ, в к используемому катализирующих дигидгоксилированный не ПАУ переход в повышает экспрессию 3-гидроксифенантрена орто-положении фенантрен – дигидроксифенантрен, который не подвергается дальнейшей трансформации. Эти реакции представляют интерес с точки зрения целевого получения фармакологически активных веществ. На примере адаптированных штаммов R. opacus 412 и R. rhodnii 135 описан и другой путь трансформации фенантрена (Ленева и др., 2009). Показано, что штаммы деградируют фенантрен с образованием 3,4-дидродиола с его последующим переходом в 3,4-дигидроксифенантрен, который через 7,8-бензокумарин, 1-гидрокси-2-нафтоальдегид и 1-гидрокси2-нафтойную кислоту метаболизируется до салицилата и катехола, 24 поступающего в цикл Кребса. При этом авторы отмечают, что деградация фенантрена по описанному выше механизму адаптированными клетками R. rhodnii 135 идет быстрее по сравнению с адаптированным R. opacus 412. Начальные стадии гидроксилирования метаболизма ароматического антрацена кольца с включают реакции образованием цис-1,2- дигидрокси-1,2-дигилроантрацена, который в дальнейшем окисляется до 1,2дигидроксиантрацена (Dean-Ross et al., 2001). В последующем происходит раскрытие ароматического кольца по пути мета- или орто-расщепления. При этом в случае мета-расщепления образуется нестабильное соединение цис-4-(2’-гидроксинаф-3-ил)-2-оксобут-3-еновая кислота, которая в результате спонтанного замыкания кольца преобразовывается в 6,7бензокумарин. При разрыве 1,2-дигидроксиантрацена в орто-положении образуется 3-(2-карбокисвинил)нафталин-2-карбоновая кислота. Кроме того, при идентификации продуктов трансформации антрацена штаммом R. opacus 412 показано, что параллельно с последовательным окислением антрацена до 6,7-бензокумарина идет его трансформация до антрахинона (Ленева и др., 2009). Стоит отметить, что обычно скорость биодеградации углеводородов уменьшается в ряду: нормальные алканы > простые ароматические углеводороды (бензол, толуол, бензойная кислота и др.) > разветвленные алканы > циклоалканы > изопреноиды > конденсированные полиароматические соединения. В настоящее время при использовании биологических способов очистки окружающей среды от нефти и нефтепродуктов предпочтение отдается микробным ассоциациям или адаптированным к загрязнителю микробным культурам (Пирог и др., 2005а; Жуков и др., 2007; Плешакова и др., 2007; González et al., 2001; Ghazali et al., 2004). Это объясняется тем, что микроорганизмы могут деградировать ограниченное число субстратов, а нефть представляет собой сложную смесь углеводородов, поэтому 25 наиболее полная и эффективная ее деградация происходит при использовании ассоциации микроорганизмов, имеющих разные ферментные системы. Кроме того, нефтяные углеводороды частично растворимы в воде, поэтому использование углеводородокисляющих микроорганизмов с разной степенью гидрофобности клеточной стенки будет способствовать полному разложению нефтепродуктов. Свидетельством того, что в процессе биодеградации нефтяных углеводородов микроорганизмы взаимодействуют между собой, служат наблюдения Суржко с соавт. (1995), которые показали, что эффективность деструкции нефти ассоциациями бактериальных культур на 67-69% выше, чем при использовании монокультур. При этом деградационный потенциал бактериального консорциума является синергетических взаимоотношений между результатом его установления компонентам, а не результатом суммирования их окислительных способностей. Значение каждого компонента углеводородокисляющего консорциума, используемого для деградации нефти, показано Rambeloarisoa с соавт. (1984). Так, ими установлено, что удаление какого-либо штамма из консорциума приводило к значительному снижению эффективности процесса деградации нефти. Это объясняется тем, что образуемые в ходе окисления метаболиты могут стать субстратом для развития других групп микроорганизмов, которые в последующем будут эффективно удалять оставшиеся загрязняющие вещества. Однако, Жуков с соавт. (2007) считают, что в ходе биодеградации нефти в результате кометаболизма в системе может происходить накопление промежуточных персистентных и токсичных соединений, которые будут подавлять развитие микробной популяции. В настоящее время актинобактерии рода Rhodococcus в виде монокультур (Пат. РФ 2143947; Карасева и др., 2012) или ассоциаций (Sidorov et al., 1998; Kuyukina et al., 2003; Murygina et al., 2005), а также в сочетании с представителями Acinetobacter (Пат. РФ 2193533), Arthrobacter (Пат. РФ 2365438), Mycobacterium (Пат. РФ 2053205; 2191752; 2193533), 26 Pseudomonus (Пат. РФ 2053205), а также дрожжей Candida (Пат. РФ 2023686; 2384616) используются при создания биопрепаратов, применяющихся для биоремедиации загрязненных углеводородами и нефтепродуктами водных и почвенных биотопов в различных климатических условиях, а также стоков промышленных предприятий. Входящие в состав биопрепаратов микробные ассоциации могут быть в сухом или жидком в виде («Родер», «Биопрепарат для очистки воды и почвы»), а также иммобилизованы на поверхности органических («Лессорб-био», «Нафтокс», «Эколан») или неорганических носителей (Prieto et al., 2002б; Cuenca et al., 2006). Следует отметить, что использование искусственных носителей может привести к вторичному загрязнению. Однако, при использовании органических носителей для иммобилизации микробных клеток необходимо учитывать их доступность и рентабельность получения в регионе. Разнообразие специализацией, создающихся ограниченной биопрепаратов определенным объясняется классом их узкой углеводородов (алифатические углеводороды, ароматические углеводороды) или типом загрязнителя (мазут, дизельное топливо, керосин), а также условиями, необходимыми для проведения процесса очистки с высокой эффективностью (температура, рН, влажность) (Пат. РФ 2023686; 2053205; 2384616). 27 Глава 2. ИММОБИЛИЗОВАННЫЕ МИКРООРГАНИЗМЫ В БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССАХ 2.1. Преимущества иммобилизованных микроорганизмов перед свободными. Одним из важных направлений современной экологической биотехнологии является разработка эффективных и экологически безопасных способов очистки нефтезагрязненных сточных вод. Наиболее эффективными методами являются микробиологические, основанные на использовании иммобилизованных на поверхности носителя бактериальных клеток (биокатализаторов). Данный подход совмещает в себе (1) сорбцию и концентрирование загрязняющего вещества на твердофазной подложке вблизи иммобилизованных клеток, что делает его более доступным для последующего (2) окисления бактериальными клетками, что обеспечивает эффективное удаление из сточных вод малорастворимых и гидрофобных соединений, биорезистентных, токсичных и канцерогенных веществ (Жукова, Морозов, 2010; Junter et al., 2002; Podorozhko et al., 2008; Martins et al., 2012). Кроме того, иммобилизация позволяет решить проблему отделения бактериальных клеток от очищенных сточных вод, что в свою очередь позволяет перейти от периодических схем очистки к более производительным непрерывным технологиям, предусматривающим использование проточных реакторов (Гвоздяк, 1987; Лейкин и др., 2008; Сироткин и др., иммобилизованные 2007; Doaa, Wafaa, биокатализаторы 2009). широко Именно поэтому используются в биотехнологических процессах трансформации различных групп соединений и синтеза целевых продуктов (Медведева и др., 2001; Николаев, Плакунов, 2007; Елькин и др., 2010), биоремедиации загрязненных ксенобиотиками и тяжелыми металлами объектов окружающей среды (Гвоздяк, 1987; Пирог и др., 2005а; Кобызева и др., 2009; Prieto et al., 2002 а, б; Ivshina et al., 2012), сельском хозяйстве, в пищевой, медицинской и фармацевтической отрасли для разработки лекарственных средств на основе ферментов и регуляторов 28 (Doaa, Wafaa, 2009), а также для получения экологически чистого топлива (Зайцева, Осипова, 2006). Разработка биокаталитических систем является привлекательной еще и потому, что иммобилизация не оказывает стрессорного влияния на клетки, носитель защищает их от прямого воздействия токсичных веществ и неблагоприятных факторов среды (Егоров и др., 1984; Егорова и др., 2003; Сироткин и др., 2007; Luan et al., 2006), а также повышается окислительная мощность микробных клеток и эффективность очистки сточных вод (Илялетдинов и др., 1987; Junter et al., 2002). Применение иммобилизованных клеток в биотехнологических процессах обусловлено тем, что они характеризуются большей операционной гибкостью по сравнению с аналогичными свободными формами бактерий (Cassidy et al., 1996). Кроме того, иммобилизация позволяет концентрировать большое количество биомассы, увеличивая время пребывания и предотвращая ее вынос с загрязненного участка при поступлении большого объема воды или увеличении скорости водного потока (Илялетдинов и др., 1987; Ильина и др., 2004; Hallas et al., 1992; Cassidy et al., 1996). Так при иммобилизации максимальная концентрация сухой биомассы может достигать 140 г/л, тогда как при аналогичном культивировании свободных микроорганизмов данный показатель не превышает 30 г АВС/л среды (Бирюков, Барбот, 1987). Еще одно преимущество иммобилизации заключается в том, что в ходе этого процесса устанавливается равновесие между процессами адсорбции микробных клеток на поверхности носителя и их десорбции с его поверхности (Beyenal, Lewandowski, 2004), что имеет немаловажное значение для удаления отработанной биомассы и иммобилизации новой. Вышеперечисленные преимущества позволяют экономить на использовании питательных субстратов для выращивания новых клеток, а отсутствие избыточной биомассы обеспечивает нормальный массообмен между 29 клетками и сокращает затраты на утилизацию избыточной биомассы (Li et al., 2007). Важным преимуществом иммобилизованных клеток перед свободными является сохранение их жизнеспособности и метаболической активности в течение длительного времени и при многократном использовании, что может быть объяснено стабилизацией ферментативной активности за счет сохранения нативной стерической организации полиферментных клеточных систем в ходе иммобилизации (Егоров и др., 1984; Li et al., 2006; Luan et al., 2006). Основной причиной увеличения метаболической активности является сокращение длительности лаг-фазы, предшествующей активной деградации ксенобиотиков, и изменение массообмена между клетками и средой (Кощеенко, Суходольская, 1987; Zhang et al., 1998; Prieto et al., 2002б), увеличение проницаемости клеточной стенки иммобилизованных бактерий, скорости проникновения субстратов и выхода метаболитов. Однако рядом авторов (Карпенко и др., 1980; Медведева и др., 2001) отмечено, что метаболическая активность иммобилизованных клеток не всегда выше таковой свободных микроорганизмов. Иммобилизованные микроорганизмы менее чувствительны к действию высоких концентраций токсичных соединений, антибиотиков, органических веществ, солей тяжелых металлов (Синицын и др., 1994; Смирнова и др., 2010). В ходе экспериментов Prieto с соавт. (2002б) установили, что иммобилизованные клетки R. eruthropolis более устойчивы к действию высоких концентраций фенола по сравнению со свободными. Кроме того, даже при продолжительном воздействии бензальдегида число жизнеспособных иммобилизованных Zymomonas mobilis увеличивалось по сравнению со свободными клетками (Li et al., 2006). Снижение ингибирующего действия токсических веществ может быть обусловлено образованием внеклеточного полимерного матрикса, покрывающего иммобилизованные клетки и частично сорбирующего токсины на своей поверхности (Синицын и др., 1994; Николаев, Плакунов, 2007; Смирнова и 30 др., 2010; Prieto резистентности et al., 2002б; Karunakaran et al., 2011). Повышение микроорганизмов обуславливает увеличение периода полуинактивации биокатализатора, что позволяет многократно использовать биомассу и снимает необходимость ее пополнения. Устойчивость иммобилизованных клеток можно также объяснить снижением нагрузки по органическим веществам на единицу площади поверхности прикрепленных микроорганизмов или экспрессией генов (Лейкин и др., 2009; Li et al., 2006). Это приводит к образованию специфической, качественно иной микрофлоры в составе иммобилизованного биокатализатора, способной к более полному окислению загрязняющих веществ. Иммобилизация приводит к фенотипическим и физиологическим изменениям микроорганизмов, вызванных процессом их прикрепления и замедленной скоростью роста (Кощеенко, Суходольская, 1987; Ильина и др., 2004). Смирновой с соавт. (2010) на примере интегрированных в прикрепленную биопленку Salmonella typhimurium показано образование фибрилл, способствующих установлению контакта между клетками. Планктонные формы сальмонелл также могут образовывать фибриллы, однако они не объединяют клетки в единую структуру. Другой особенностью клеток в составе биопленок является образование многочисленных протяженных мембранных структур, выполняющих барьерную функцию, обеспечивающих прочность и поддержание структурной целостности. Высокая плотность микроорганизмов закрепленных позволяет им на поверхности беспрепятственно носителя обмениваться информацией за счет переноса генов или посредством низкомолекулярных сигнальных молекул, что крайне затруднено у планктонных культур (Николаев, Плакунов, 2007; Сироткин и др., 2007). Так рядом авторов показано, что горизонтальный перенос генов между микроорганизмами в биопленках происходит интенсивнее, чем у свободных клеток. Кроме того, закрепление клеток на носителе приводит к избирательной экспрессии генов «устойчивости» и изменению активности генов, которые в свободном 31 состоянии не индуцируются. Сироткиным с соавт. (2007) показано, что контакт E. coli с носителем приводит к экспрессии 38% генов этих микроорганизмов, а Pseudomonas aeruginosa в данных условиях начинает синтезировать альгинат. Также опубликованы данные о повышении плазмидной стабильности иммобилизованных микроорганизмов, которая обусловлена тем, что плазмиды в биопленке защищены от элиминации по типу «токсин-антитоксин» (Cassidy et al., 1996). Несмотря на преимущества использования иммобилизованных клеток в биотехнологических процессах, есть факторы, ограничивающие их широкое применение (Ефременко, 2009): (1) отсутствие методов, позволяющих адекватно оценить каталитическую активность и жизнеспособность иммобилизованных бактериальных клеток, особенно при использовании микробных ассоциаций; (2) незначительное число биокатализаторов, производство которых подлежит масштабированию; (3) недостаток научных фундаментальных знаний о биокаталитических системах на основе иммобилизованных клеток и кинетических закономерностях, лежащих в основе их функционирования. В работах, посвященных изучению процесса иммобилизации, показано, что образующиеся на поверхности носителя биопленки не являются однородными (Ильина и др., 2004; Сироткин и др., 2007; Плакунов, Николаев, 2008; van Loosdrecht et al., 2002; Beyenal, Lewandowski, 2004). Большинство изученных к настоящему времени биопленок формируются на границе твердой и жидкой фаз, поэтому такая неоднородность может быть обусловлена незначительными различиями в скорости движения водного потока на разных участках поверхности, в том числе в условиях биореактора, скоростью адсорбции и десорбции клеток, а также структурой самой биопленки. Одним из ключевых структурных компонентов биопленки является матрикс – внеклеточное полимерное вещество, играющее основную роль в формировании и поддержании ее целостности, а также обеспечивающее 32 защиту бактерий от стрессовых факторов среды (Синицын и др., 1994; Prieto et al., 2002б; Николаев, Плакунов, 2007; Смирнова и др., 2010; Karunakaran et al., 2011). Матрикс представляет собой смесь углеводов, белков, нуклеиновых кислот, мембранных визикул, что обуславливает повышенное содержание данных веществ в иммобилизованных клетках по сравнению со свободными микроорганизмами (Кощеенко, Суходольская, 1987). Экзополимерные компоненты матрикса важны для образования многослойных биопленок, формирование которых связано с коадгезией клеток к ранее сорбировавшимся на поверхности носителя. При этом коагрегация дает возможность адсорбироваться микроорганизмам, не способным прикрепляться непосредственно к носителю (Николаев, Плакунов, 2007; Смирнова и др., 2010). Однако следует учитывать, что избыточность биомассы в многослойных биопленках приводит к затрудненному массообмену или полной блокировке ферментативных реакций, что, в свою очередь, препятствует длительному и эффективному использованию иммобилизованного биокатализатора. Именно поэтому монослойные бактериальные биопленки нашли широкое применение в биотехнологических процессах (Козляк и др., 1991; Eberl et al., 2000; Picioreanu et al., 2000). Одновременно с образованием биопленки в ней формируются такие специфические структуры как каналы, пустоты, выросты, которые обеспечивают доставку питательных веществ и кислорода, выведение продуктов метаболизма бактериальных клеток, а также способствуют межклеточному контакту и передаче сигналов между клетками, влияющих на эффективность работы биокатализатора (Николаев, Плакунов, 2007; Смирнова и др., 2010). При этом биопленки с меньшей пористостью имеют большее количество биомассы на единице объема, следовательно, обладают большей активностью. Характерной особенностью бактерий в биопленке является наличие мембранных пузырьков или везикул, которые приводят к лизису клеток, несущих ростовые факторы или действующих как факторы 33 вирулентности. В структуре биопленки, функционирующих клеток, кроме обнаруживаются активно покоящиеся и некультивируемые формы бактерий, что связано с действием стрессовых факторов. Способность микроорганизмов адсорбироваться на носителях зависит от таких биологических особенностей самих клеток как фаза роста, в которой бактериальные клетки отобраны для иммобилизации, степень гидрофобности клеточной стенки и электростатический заряд, подвижность, размер клеток. Немаловажное значение имеют характеристики самого носителя (свободная поверхностная энергия, электростатический заряд), а также условия иммобилизации (температура, осмолярность, рН, кислород). Следовательно, процесс иммобилизации можно контролировать и управлять им (Zeraik, Nitschke, 2010). Большое влияние на адсорбционную способность микроорганизмов оказывает фаза роста. Так, согласно Звягинцеву (1987), максимальная степень адгезии наблюдалась у штаммов, отобранных в экспоненциальной фазе роста, которая затем оставалась неизменной или уменьшалась к концу стационарной фазы. Например, штамм Escherichia coli 0157:Н7 образует биопленки лишь в условиях недостатка питательных веществ, в то время как E. coli К12 не образуют биопленки на минимальной среде, если в нее не добавить аминокислоты. Однако на способность Bacillus subtilis прикрепляться к поверхности носителя влияют не только питательные вещества, но и условия перемешивания. Представители данной группы способны образовывать биопленку в стационарных условиях на минимальной питательной среде, тогда как в условиях перемешивания в богатой питательной среде данный процесс не происходит (Li et al., 2007). Гидродинамические актинобактерий условия рода имеют Rhodococcus, значение при синтезирующих иммобилизации амфифильные поверхностно-активные вещества (Rijnaarts et al., 1993). По мнению авторов, увеличение скорости перемешивания приводит к возрастанию количества 34 пузырьков воздуха, в которые обращены гидрофобные хвосты липополисахаридов, при этом гидрофильные участки ориентируются в водную фазу, способствуя увеличению числа адсорбирующихся на носителе клеток родококков. Немаловажное значение для адсорбции микроорганизмов имеет строение клеточной стенки и наличие адгезинов и лектинов, обладающих гидрофобными свойствами, выростов на поверхности клеток (жгутиков, фибрилл, пилей), которые позволяют преодолевать поверхностное отталкивание на начальных этапах прикрепления к носителю, а также увеличивают вероятность сталкивания бактериальных клеток с частицами носителя (Козляк и др., 1991; Ильина и др., 2004; Николаев, Плакунов, 2007). Однако многие подвижные культуры не способны противодействовать силе адсорбции, поэтому, прикрепляясь к поверхности, они часто теряют подвижность, хотя некоторые клетки продолжают совершать вращательные движения и в прикрепленном состоянии (Звягинцев, 1973). Следует отметить, что активность жгутиков в процессе прикрепления зависит от фазы роста бактериальных культур. Так van Schie и Fletcher (1999) обнаружили, что полярные жгутики Desulfovibrio sp. G11 проявляют наибольшую адгезивную способность в логарифмической фазе роста, когда они подвижны. При переходе в стационарную фазу клетки теряют способность двигаться, а вместе с ней и способность прикрепляться к поверхности. На адсорбцию также влияют электростатические и гидрофобные взаимодействия между бактериальной клеткой и твердой поверхностью. Большое значение в иммобилизации играет гидрофобность микробных клеток. Показано, что бактериальные клетки, имеющие гидрофильную поверхность, труднее, чем гидрофобные закрепляются на поверхности носителя (Николаев, Плакунов, 2007). На основе иммобилизованных бактерий создаются биопрепараты и биокатализаторы, микроорганизмов состоящие (Li et al., из одной 2007). или нескольких Монобактериальные групп препараты 35 характеризуются более узкой специфичностью по отношению к индивидуальным углеводородам, более узким диапазоном рН, солености и температурного режима, от которых зависит активность микроорганизмов. В тоже время они позволяют изучить кинетические закономерности протекания биотехнологических процессов и подобрать оптимальные условия их эффективного проведения. В настоящее время широко используются биокатализаторы, созданные на основе двух и более штаммов микроорганизмов, проявляющих синергетический эффект в биотехнологических процессах (Rahman et al., 2006). Это позволяет получать целевые продукты как результат сложных многостадийных биохимических превращений исходных субстратов, а также определяет надежность эксплуатации очистных сооружений и эффективность процесса очистки сточной воды (Сироткин и др., 2007). Кроме того, использование гетерогенных биокатализаторов диктуется тем, что в их состав могут входить микроорганизмы-спутники, которые, не принимая участия в разложении веществ, синтезируют активаторы, повышают эффективность «рабочей микрофлоры» и защищают ее от воздействия стрессовых факторов (Плакунов, Николаев, 2008). Установлено, что галофильные спутники, входящие в состав биопленки и вырабатывающие осмопротекторные вещества, предохраняют негалофильные нефтеокисляющие бактерии от гиперосмотического шока. В условиях суспензионной культуры данный эффект не обнаруживался, т.к. происходило разбавление осмопротекторов большим объемом жидкости, а межклеточный матрикс затруднял диффузию выделяемых веществ за пределы биопленки. Поэтому полибактериальные препараты имеют более широкие адаптационные и экологические возможности для использования в очистке сред, загрязненных комплексными соединениями. 2.2. Методы микроорганизмов. оценки Следует жизнеспособности отметить, что, иммобилизованных несмотря на активное использование иммобилизованных биокатализаторов в биотехнологии, 36 вопрос, касающийся разработки методов контроля жизнеспособности и функциональной активности микроорганизмов, остается актуальным. Традиционные культуральные способы определения числа живых микробных клеток в биопрепаратах, основанные на высеве исследуемого образца на питательную иммобилизованных отделение от среду, не микроорганизмов, носителя, что предназначены так является как для детекции предусматривают затруднительным. их Трудность заключается в том, что ни один из используемых методов десорбции (промывание под струей воды или растворами поверхностно-активных веществ и солей, механическое отделение путем интенсивного встряхивания или при действии ультразвука) не позволяет полностью отделить клетки от носителя (Звягинцев, 1987; Коваленко и др., 1999; Prieto et al., 2002б). Кроме того, концентрированные растворы солей и органических веществ, используемые в качестве десорбентов, могут приводить к разрушению клеток или изменению их физиологической активности. Применение методов микроскопии и проточной цитометрии для прямого подсчет количества микроорганизмов не представляет трудностей для суспендированных клеток или в случае использования в качестве носителей прозрачных материалов (стекла, ионообменных смол). Однако, в связи с тем, что большинство используемых носителей не обладают прозрачностью, возникает необходимость отделения клеток от их поверхности или применение альтернативных методов оценки жизнеспособности. Надежным критерием оценки жизнеспособности иммобилизованных клеток является их метаболическая активность (Юдин, 2007). Наиболее часто используются методы, в основе которых лежит способность солей тетразолия специфически реагировать с НАД·Н и НАДФ·Н, компонентами дыхательной цепи микроорганизмов (Wrenn, Venosa, 1996). Суть данных методов заключается в том, что йодонитротетразолий, который, является активным акцептором электронов, конкурирует с кислородом в электронтранспортных цепях микробных клеток. В результате, в присутствии активно 37 респирирующих клеток происходит восстановление данного вещества до нерастворимого в воде соединения (формазана), имеющего красно- фиолетовую окраску. Данный метод успешно используется Kuyukina с соавт. (2006) для количественной оценки жизнеспособных родококков, иммобилизованных в криогеле поливинилового спирта. Однако следует учитывать, что определение метаболической активности по отдельным ферментным реакциям позволяет оценить эффективность индивидуальной ферментной системы, а не клетки в целом. Оценить жизнеспособность иммобилизованных клеток можно, применив люциферин-люциферазный метод определения количества АТФ (Ефременко, Татаринова, 2007). Данный способ является высокочувствительным, универсальным в отношении различных носителей и микроорганизмов разных систематических групп, концентрация АТФ не зависит от внутриклеточного физиологического состояния заключается клеток. в том, Основной что они недостаток не вышеописанных позволяют осуществить методов видовую дифференциацию микроорганизмов при использовании полибактериальных препаратов. Дифференцировать иммобилизованные на носителе микроорганизмы позволяет применение антител, высокоспецифичных по отношению к определенному типу иммунофлуоресцентного способа микроорганизмов. позволило Prioult Использование с соавт. (2000) дифференцированно определить число клеток лактококков и бревибактерий, иммобилизованных в гранулах каррагинанового геля. Однако данный метод не является универсальным, так как требует предварительного получения специфичных поликлональных антител для каждого определяемого типа микроорганизмов. Кроме того, зависимость флуоресцентного сигнала от физиологического состояния клетки, химического состава геля и жидкой среды, а также глубины нахождения клеток в толще геля, затрудняет количественный анализ микроорганизмов и получение воспроизводимых результатов. 38 В настоящее время наиболее быстрыми идентификации основанные на (Bell et al., 1999; микроорганизмов постановке Ahn амплифицироваться et являются полимеразной и ДНК точными методами молекулярно-генетические, al., 2005). Однако может и цепной реакции следует мертвых (ПЦР) отметить, что микроорганизмов (Nogva et al., 2003). Для исключения ложноположительного результата и дифференцирования живых клеток от мертвых, перед экстракцией ДНК тестируемый образец обрабатывают ядом топоизомеразы или ДНК-гиразы (Пат. РФ 2395583). Несмотря на то, что описанный способ позволяет детектировать живые клетки, установить количественное содержание жизнеспособных микроорганизмов невозможно без применения дорогостоящего ПЦР в реальном времени. Таким образом, разработка адекватного метода количественной детекции, сочетающегося с видовой дифференциацией живых иммобилизованных клеток, является актуальным. 39 Глава 3. БИОРЕАКТОРНЫЕ ТЕХНОЛОГИИ КАК СПОСОБ ОПТИМИЗАЦИИ БИОРЕМЕДИАЦИОННЫХ ПРОЦЕССОВ EX SITU Немаловажное значение при использовании микроорганизмов имеет установка, в которой осуществляется биотехнологический процесс с их применением. В связи с этим, большинство биотехнологических процессов в настоящее время реализуется в ферментерах или биореакторах, конструкции которых учитывают особенности протекания процессов с участием микробных клеток, создают и поддерживают оптимальные условия для эффективной работы иммобилизованных микроорганизмов, а также позволяют контролировать технологические параметры (van Hamme et al., 2003). Поэтому процессы, протекающие в биореакторах, являются потенциально высокоскоростными (Ward et al., 2003). Также биореакторные технологии позволяют концентрировать большое количество активной биомассы на носителе, что приводит к уменьшению объема используемых конструкций и сокращает их стоимость, делая доступными для потребителей. Однако, следует учитывать, что не всегда наблюдается прямая корреляция между увеличением соотношения объема носителя к объему биореактора и эффективностью процесса, что может быть связано с затрудненной аэрацией подложки и, следовательно, приводить к дополнительным энергетическим затратам (Soko´ł, Korpal, 2006). Кроме того, перспективность использования реакторных технологий обусловлена минимальным ограничением массообмена и увеличением десорбции загрязнителей из твердых субстратов (загрязненная почва, шлам), что, в свою очередь, приводит к увеличению скорости деградации поллютантов по сравнению с твердофазными системами (van Hamme et al., 2003). Широкое использование иммобилизованных микроорганизмов связано с применением реакторов различных типов (табл. 2): периодического действия, с постоянным перемешиванием, реакторов с неподвижным (packed bed) или псевдоожиженным слоем (fluidized bed) катализатора (Егоров и др., 40 Таблица 2. Биореакторы в биотехнологических процессах Тип реактора Преимущества Недостатки Примеры практического использования Типы реакторов по принципу организации процесса Периодического действия Все стадии процесса протекают последовательно; очистка продукта от среды осуществляется дополнительно, что приводит к потерям и увеличению стоимости биокатализатора. Биодесульфуризация модельной нефти адсорбированными на диатомите клетками Gordona sp. и Nocardia sp., (Chang et al., 2000). Очистка промышленных сточных вод, загрязненных фенолом, включенными в Са-альгинатные гранулы клетками P. putida (González et al., 2001). Деградация фенола в сточных водах иммобилизованными на керамике клетками R. erythropolis (Prieto et al., 2002б). Аэробная очистка грунтовых вод от 2,4,6-тринитрофенола флоккулами R. opacus JW01 (Weidhaas et al., 2007). 40 Эффективность процесса не зависит от колебаний объемов стоков, состава и концентрации загрязняющих веществ; прямой контроль скорости протекающих реакций; простота обслуживания. 41 Продолжение табл. 2. Тип реактора Непрерывного действия Недостатки Все стадии процесса протекают одновременно; относительно постоянные условия; возможность контролировать процесс; высокая производительность; механизация и простота обслуживания. Эффективность процесса зависит от колебаний объемов стоков, состава и концентрации загрязняющих веществ; возможное нарушение целостности частиц носителя. Примеры практического использования Очистка загрязненной нефтью водопроводной воды иммобилизованными на керамзите клетками R. erythropolis ЭК-1 (Пирог и др., 2005а). Очистка промышленных сточных вод, загрязненных фенолом, включенными в Са-альгинатные гранулы клетками P. putida (González et al., 2001) и иммобилизованными на керамике клетками R. erythropolis (Prieto et al., 2002б). Типы реакторов по принципу работы Простота Градиент давления; Очистка загрязненной нефтью обслуживания; высокая отсутствие эффективной водопроводной воды иммобилизованконверсия субстрата; аэрации; необходимость ными на керамзите клетками отсутствие трения дополнительного отведения R. erythropolis ЭК-1 (Пирог и др., 2005а). частиц. газов. Деградация фенола в сточных водах иммобилизованными на керамике R. erythropolis (Prieto et al., 2002б). 41 С неподвижным слоем катализатора Преимущества 42 Продолжение табл. 2. Тип реактора Преимущества Примеры практического использования Относительно невысокая скорость движения жидкости и гранул; возможное механическое повреждение частиц носителя; необходимость поддерживать режим полного вытеснения; дефлюидизация биокатализатора. Обесцвечивание сточных вод иммобилизованной на мраморной крошке ассоциацией бактерий рода Bacillus (Tony et al., 2009). Получение пенициллина клетками Penicillium chrysogenum ATCC 28089 включенными в полистирольные гранулы (Ramsay et al., 1991). Аэробная очистка фенолсодержащей сточной воды включенными в Саальгинатные гранулы клетками P. putida (González et al., 2001) и иммобилизованной на полипропилене смешанной микробной культурой (Sokół, Korpal, 2006). Деградация ароматических углеводородов свободными и иммобилизованными на вермикулите клетками Pseudomonas sp. и Staphyloccocus sp. (Taoufik et al., 2004). 42 С псевдоожиженным Хорошее слоем катализатора перемешивание и газоотведение; высокая доступность субстрата для клеток за счет межфазного контакта в системе газ-жидкостьноситель; непрерывный режим работы. Недостатки 43 Продолжение табл. 2. Тип реактора Недостатки Примеры практического использования Анаэробная очистка синтетической воды, загрязненной дизельным топливом, иммобилизованной на углеродных частицах микробной ассоциацией (Cuenca et al., 2006). Очистка сточной воды от органических красителей иммобилизованным в Caальгинатных гранулах мицелием Phanerochaete chrysosporium (Zahmatkesh et al., 2010). Получение этанола иммобилизованными дрожжами (Sheikhi et al., 2012). Высокая плотность Сложность получения Очистка синтетической сточной воды, активной биомассы; мембранных носителей содержащей мазут или смазочное масло, короткое время и их высокая стоимость; а также поверхностно-активные вещества, энергозатратность активным илом (Scholz, Fuchs, 2000). гидравлического удержания; исключение процесса. Получение карвона из карвеола ступеней отстаивания и заключенными в силиконовую мембрану фильтрации из схемы клетками R. erythropolis DCL14 очистки. (de Carvalho, da Fonseca, 2002). 43 Мембранные биореакторы Преимущества 44 Продолжение табл. 2. Тип реактора Преимущества Недостатки Примеры практического использования Очистка синтетической сточной воды, содержащей дигидрофуран, микробной ассоциацией, содержащей клетки R. ruber (Daye et al., 2003) Типы реакторов по способу перемешивания Механическое перемешивание Обрастание механических систем микроорганизмами; низкая скорость перемешивания в вязких жидкостях; разрушение частиц; энергозатратность. Плавное перемешиваНизкая скорость ние содержимого, масообмена. простота конструкций и управления, низкая энергозатратность. Получение карвона суспендированными R. erythropolis DCL14 da Fonseca, 2002). из (de карвеола клетками Carvalho, Получение карвона клетками R. erythropolis DCL14 (de Carvalho, da Fonseca, 2002). Очистка воды от красителей иммобилизованным в Ca-альгинатных гранулах мицелием Phanerochaete chrysosporium (Zahmatkesh et al., 2010). 44 Пневматическое перемешивание Хороший массообмен. 45 Продолжение табл. 2. Тип реактора Преимущества Недостатки Очистка синтетической сточной воды, содержащей мазут или смазочное масло, а также поверхностно-активные вещества, активным илом (Scholz, Fuchs, 2000). Очистка сточных вод от гидрозина и его производных клетками Achromobacter sp., Rhodococcus sp. B30 и Rhodococcus sp. J10 иммобилизованными на частицах кормового зерна (Nwankwoala et al., 2001). Деградация MTBE и BTEX иммобилизованной на активированном углероде адаптированной ассоциацией Flavobacteria-Cytophaga (Pruden et al., 2003). 45 Циркуляционное Насыщение среды Недостаточно происходит эффективное (гидродинамическое) кислородом в процессе перемешивания; перемешивание, которое перемешивание прост в эксплуатации. приводит к формированию температурных, концентрационных и рН градиентов в объеме реактора; затрудненное удаление газообразных продуктов. Примеры практического использования 46 1984; Евтушенков, Фомичев, 2002; Егорова и др., 2003). Биореакторы с адсорбированными на поверхности или включенными в частицы носителя клетками используются для получения антибиотиков (Ramsay et al., 1991), тритерпеноидных соединений (de Carvalho, da Fonseca, 2002) и этанола (Sheikhi et al., 2012), а также в процессах очистки синтетических (Scholz, Fuchs, 2000; Cuenca et al., 2006) и промышленных сточных вод, загрязненных нефтепродуктами (Nwankwoala et al., 2001; Pruden et al., 2003), фенолом (González et al., 2001; Prieto et al., 2002 а, б; Soko´ł, Korpal, 2006), ароматическими углеводородами (Pruden et al., 2003) и органическими красителями (Tony et al., 2009; Zahmatkesh et al., 2010). Среди реакторов распространение с разных получили псевдоожиженным слоем типов в последнее биореакторы (fluidized-bed) время широкое колоночного носителя, типа содержащего иммобилизованные клетки. Такие биореакторы являются разновидностью аппаратов полного вытеснения, в которых каждый предыдущий объем жидкости вытесняется последующим и не смешивается с ним. Впервые биореактор с псевдоожиженным слоем был использован Halwachs с соавт. (1977) для гидролиза трибутирата иммобилизованными липазами, что позволило ускорить процесс по сравнению с реактором с постоянным перемешиванием. Принцип работы биореактора с псевдоожиженным слоем заключается в том, что частицы носителя, увлекаемые восходящим потоком газа или жидкости, суспендируются в них (Werther, 2007). При правильно подобранном скоростном режиме частицы носителя, достигнув верхней расширяющейся части биореактора, прекращают подъем и вновь возвращаются в колонку, что позволяет удерживать их в рабочей зоне реактора, несмотря на непрерывное прокачивание среды. Основанием для использования в биотехнологических процессах реакторов с псевдоожиженным слоем послужило, прежде всего, отсутствие ограничений, накладываемых на размеры частиц носителя при 47 использовании биореакторов с неподвижным слоем (Махлин, 2009). Уменьшение размеров частиц материала носителя приводит к увеличению межфазного контакта, а также снижению внутридиффузного сопротивления при взаимодействии между фазами (Касаткин, 1973; Werther, 2007). Кроме того, псевдоожижение позволяет предотвращать «засорение» рабочей зоны реактора, которое может возникнуть в неподвижном слое при использовании носителей с развитой площадью поверхности или активном росте микробных клеток, и, как следствие, избегать значительных перепадов давления по всей ее высоте и равномерно распределять жидкость между частицами с иммобилизованными клетками (Soko´ł, Korpal, 2006). В то же время, контролируемый рост клеток в реакторе данного типа позволяет без прерывания его микроорганизмами работы и пополнять поддерживать псевдоожиженный необходимый уровень слой активной иммобилизованной биомассы. Кроме того, «засорения» рабочей зоны позволяет избежать еще и то, что частицы носителя с избыточным количеством адсорбированных клеток чаще всего концентрируются в верхней части биореактора и со временем могут выноситься из него с потоком жидкости (Shieh, Keenan, 1986; Soko´ł, Halfani, 1999). Следует также отметить, что при прочих равных условиях за счет перемешивания материала носителя интенсивность массопереноса в псевдоожиженном слое выше, чем в неподвижном слое биокатализатора. Это приводит увеличению к их возрастанию скорости производительности. протекающих Помимо этого, процессов и интенсивное перемешивание твердой фазы приводит к тому, что во всем объеме реактора создается изотермический температурный режим, что облегчает проведение в псевдоожиженном слое зависимых от температуры процессов (Махлин, 2009; Werther, 2007). В реакторах с неподвижным слоем носителя трудно добиться хорошей аэрации и предупредить избыточное накопление газов в верхней части. Решить данную проблему также позволяет использование биореакторов 48 с псевдоожиженным слоем (Махлин, 2009). Однако, следует учесть, что в реакторах такого типа перенос газа к закрепленным на носителе клеткам также может быть ограничен избыточным числом иммобилизованных клеток, образующимися агломератами частиц или крупными пузырьками газа, а также высотой рабочей зоны реактора (Soko´ł, Korpal, 2006; Rajasimman, Karthikeyan, 2009). Наличие крупных пузырьков газа внутри биореактора нежелательно еще и потому, что они могут приводить к дополнительному движению частиц носителя, вызывая их механическое истирание и эрозию внутренних конструкций установки (Werther, 2007). Кроме того, при проведении гетерогенных каталитических процессов крупные пузырьки могут ограничивать мессоперенос веществ к псевдоожиженному слою. Важной технической характеристикой, влияющей на эффективность работы биореактора, является время гидравлического пребывания загрязняющего вещества, которое зависит от скорости его подачи в биореактор и концентрации закрепленных на носителе клеток (Martinov et al., 2010). При этом снижение скорости подачи жидкости приводит к увеличению времени гидравлического удержания загрязнителя, а, следовательно, и уменьшению содержания загрязняющих веществ на выходе из биореактора за более короткий промежуток времени (Cuenca et al., 2006). Однако за счет достижения значительной концентрации биомассы на носителе эффективность биотехнологического процесса может быть высокой даже в случае снижения времени гидравлического удержания. Еще с одним преимуществом псевдоожиженным слоем является использования возможность биореактора устранения из технологической цепочки вторичных отстойников, наличие которых необходимо для отделения биомассы от реакционной среды (Shieh, Keenan, 1986; Soko´ł, Halfani, 1999). Следует отметить, что возможность использования биореакторов в конкретных биотехнологических процессах изучается поэтапно, начиная 49 с лабораторных, затем в пилотных или опытно-промышленных и промышленных установках (Егоров и др., 1987; Евтушенков, Фомичев, 2002). На каждом их перечисленных этапов решаются конкретные задачи, связанные с отработкой производственного режима и его оптимизацией. Так, использование лабораторных биореакторов позволяет решать следующие задачи: (1) кинетические, связанные с определением эффективности деградации субстратов и образования целевого продукта; (2) массообменные, предусматривающие расчет коэффициентов массопередачи, скорости поступления в среду и отведения образующихся газообразных продуктов; (3) определение коэффициентов, связывающих утилизируемые субстраты с получаемыми побочными и целевыми продуктами реакций (Евтушенков, Фомичев, 2002). В то же время, пилотные установки используются для апробации наиболее целесообразных технологий и масштабирования промышленных процессов, в связи с чем на данном этапе обычно применяют тот тип аппарата, который в дальнейшем будет использован в промышленном масштабе. Так, Пирог с соавт. (2005а) изучали процесс очистки нефтезагрязненной воды иммобилизованными на керамзите клетками R. erythropolis ЭК-1 в лабораторном биореакторе, рабочие параметры которого рассчитывали, исходя из размеров промышленной установки по очистке воды от нефтепродуктов, с целью повышения ее производительности при высокой скорости потока (0,68 л/мин). Показано, что эффективность очистки воды при изучаемой скорости ее пропускания через биореактор с иммобилизованными родококками в оптимально подобранных условиях (низкая аэрация − до 0,1 л/л в мин, периодическое внесение 0,01% диаммонийфосфата) составляет 99,5-99,8%. Однако, следует помнить, что даже при соблюдении одинаковых условий (тип реактора, температура, рН, скорость перемешивания) уровень и скорость синтеза целевого продукта при масштабировании могут существенно различаться. Так Taoufik с соавт. (2004) показали, что при переходе от лабораторного биореактора к аппарату полупромышленного 50 типа втрое увеличивается удельная скорость окисления бензола и толуола, что позволяет сократить время обработки загрязненной данными углеводородами воды с сохранением высокой (около 100%) эффективности осуществляемого процесса. Возможность использования иммобилизованных актинобактерий рода Rhodococcus, а также микробных ассоциаций с их участием изучается в лабораторных (Китова и др., 2004; Пирог и др., 2005а; Tartakovsky et al., 2001; Prieto et al., 2002 а, б) и пилотных установках (Kuyukina et al., 2003; Safonova et al., 2004). Так Китовой с соавт. (2004) на основе включенных в агаровый гель клеток R. erythropolis HL PM-1 разработан биокатализатор, который применяется для деградации 2,4-динитрофенола в условиях лабораторного колоночного биореактора с сохранением высокой производительности (0,45 нмоль/мин·мг клеток) в течение двух недель. Клетки R. erythropolis керамических частиц, UPV-1, адсорбированные используются для на очистки поверхности синтетических и промышленных фенол- и формальдегид содержащих сточных вод в лабораторных биореакторах с плотноуложенными или перемешивающимися восходящим потоком воздуха частицами носителя (Prieto et al., 2002 а, б). При этом показано, что иммобилизация, а также адаптация родококков к деградируемым загрязнителям повышает устойчивость клеток к их высоким концентрациям, а также сопровождается сокращением лаг-фазы роста и увеличением каталитической активности бактерий. В исследованиях de Carvalho и da Fonseca (2002) обнаружено, что тип используемого лабораторного биореактора оказывает влияние на процесс образования карвона свободными и иммобилизованными клетками R. erythropolis DCL14. Показано, что для биотрансформации карвеола целесообразно использовать биореакторы с механическим или воздушным перемешиванием. Так, максимальная удельная скорость (1,69 мг/ч) образования целевого соединения за минимальный промежуток времени 51 (19,4 ч) достигается в биореакторе с механическим перемешиванием, а наибольшая производительность (0,164 мг карвона/ч·мл) отмечена при использовании адаптированных в присутствии н-додекана клеток родококков в колоночном биореакторе с пневматическим перемешиванием. В то же время, высокая производительность мембранных биореакторов сохраняется в течение первых 24 ч, а затем с течение времени, происходит адгезия клеток, и образующаяся биопленка препятствует переходу карвеола из органической фазы в водную. Следует отметить, что внесение лабораторных культур родококков ни всегда способствуют повышению эффективности очистки загрязненной воды. Так, проведенные Tartakovsky с соавт. (2001) исследования показали, что эффективность удаления смеси полихлорированных бифенилов из воды иммобилизованными в гранулах активного ила клетками Rhodococcus sp. M5 была сопоставима с таковой (16 и 19% соответственно) в биореакторе, содержащем лишь природный активный ил. В тоже время, иммобилизованный на различных носителях консорциум, состоящий из нескольких штаммов водорослей и бактерий, в том числе Rhodococcus sp. Ac-1267, способствовал эффективному удалению нефти (96%), фенола (85%) анионных поверхностно-активных веществ (72%), а также тяжелых металлов (62-90%) при очистке пруда, загрязненного промышленными стоками, в пилотных экспериментах (Safonova et al., 2004). 3.1. Адаптация как способ повышения углеводородокисляющей активности микроорганизмов. Многие компоненты нефти даже в низких концентрациях являются токсичными для микробных клеток, другие, ввиду своей низкой растворимости в воде, – малодоступными, что может сильно затруднить процесс их биодеградации. Кроме того, углеводородные компоненты нефти могут оказывать неблагоприятное действие на функциональную активность микроорганизмов, которая может выражаться в подавлении клеточного дыхания и роста, снижении жизнеспособности или даже лизисе. Токсическое действие углеводородов связано, прежде всего, 52 с их концентрацией в клеточной мембране, которая зависит от их растворимости в воде (de Carvalho, 2010). При этом более гидрофобные соединения, накапливаясь в клеточной стенке, из-за низкой растворимости в воде могут не оказывать токсического действия, соответственно, хорошо растворимые в воде компоненты по мере увеличения содержания начинают оказывать токсическое действие на клетку. В связи с этим, устойчивые, а также способные адаптироваться к углеводородам бактериальные штаммы находит широкое использование в процессах биотрансформации и биодеградации углеводородных ксенобиотиков. Одним сохранение из наиболее жизнеспособных эффективных приемов, микроорганизмов в обеспечивающих биотехнологических процессах, является их иммобилизация на поверхности носителя или образование гранул, повышающие защищенность клеток к действию неблагоприятных факторов среды (Николаев, 2004; Donlan, 2002; Prieto et al., 2002а, б). Формирование последних обусловлено синтезом экзополимерных веществ, которые связывают клетки в глобулы и предотвращают их повреждение, ограничивая доступ токсических веществ (Qureshi et al., 2005). При этом немаловажное значение имеет устойчивость самих образующих биопленку бактериальных клеток к действию органических загрязнителей. Поэтому использование адаптированной к химическому загрязнению иммобилизованной микрофлоры также является актуальным. В широком смысле под адаптацией (от лат. adaptatio – приспособление) понимают совокупность физиологических, биохимических, морфологических и поведенческих реакций организма, направленных на изменение скорости роста, метаболизма, жизнеспособности и генетически присущих организму (Николаев, 2004). Под адаптацией к каким-либо экстремальным условиям среды, например к повышенным концентрациям углеводородов, понимают также совокупность специфических морфологических, физиолого-биохимических и поведенческих реакций, развивающихся у микроорганизмов в ответ на присутствие данных 53 углеводородов и выражающихся в повышении биодеградационного потенциала (Leahy, Colwell, 1990). В связи с этим для деградации сложных углеводородных субстратов перспективным микроорганизмов-деструкторов, выделенных является из использование нефтепромысловых и нефтезагрязненных местообитаний. Они уже адаптированы к компонентам нефти и способны лучше деградировать сложные углеводородные субстраты по сравнению с культурами, выделенными из незагрязненных источников (Walker, Colwell, 1976). Как правило, проводят адаптацию микроорганизмов к соединениям, для деградации которых они будут использованы. Однако известно, что появление устойчивости у микроорганизма к действию какого-либо фактора, может сопровождаться повышением его резистентности к еще одному или нескольким факторам. Такой тип адаптации называется кросс-адаптацией (Yeom, Yoo, 2002). Например, адаптация клеток Alcaligenes xylosoxidans Y234 к толуолу и бензолу приводит к интенсификации скорости деградации данных соединений. При этом отмечено, что использование клеток, адаптированных к бензолу, способствует увеличению скорости деградации не только бензола от 1,53 до 2,25мг/ч, а также толуола (1,05 мг/ч и 2,72 мг/ч для толуол- и бензоладаптированных клеток соответственно) и м-ксилола. Это обусловлено тем, что при выращивании культуры в присутствии бензола повышался уровень индукции катехол-1,2-диокисгеназ, определяющих скорость совокупной реакции. Полученные в данном исследовании результаты имеют практическое значение, т.к. известно, что каждое из вышеупомянутых соединений хорошо растворимо в воде, обладает высокой токсичностью и различной устойчивостью к микробному окислению. При этом Littlejohns и Daugulis (2008) показали, что присутствие одного из ароматических углеводородов может оказывать влияние на биодеградацию другого. В настоящее время механизмы адаптации грамположительных бактерий к ксенобиотикам изучены недостаточно, однако предполагают, что 54 они должны быть сходи с таковыми для протеобактерий, у которых они хорошо описаны. Следует отметить, что за счет наличия наружной мембраны, выполняющей барьерную функцию, грамотрицательные бактерии более устойчивы к гидрофобным органическим веществам, чем фирмикуты. Барьерная же функция у нокардиоформных актинобактерий, таких как Mycobacterium, Nocardia, Corynebacterium и Rhodococcus, связана с входящими в состав клеточной стенки миколовыми кислотами (Нестеренко и др., 1985; Ившина и др., 1987). Адаптация микроорганизмов к углеводородам может заключаться в следующем: (1) изменении химического состава клеточных мембран, который оказывает влияние на сродство к субстрату и уровень его проницаемости; (2) изменении активности ферментов, участвующих в деградации и детоксикации ксенобиотиков; (3) генетические изменения, обуславливающие появление новых метаболических путей; (4) увеличение численности популяции организмов, способных катализировать направленную трансформацию и деградацию (van der Meer et al., 1992; Sikkema et al., 1995; de Carvalho, 2010). Основной механизм, позволяющий бактериям сохранять свои биологические функции при действии токсических веществ, заключается в изменении жирнокислотного состава мембранных липидов (Куюкина и др., 2000; Sikkema et al., 1995; Tsiko et al., 1999; Ramos et al., 2002; de Carvalho, 2010). Известно, что по их содержанию можно судить о текучести мембраны, с которой связана ее проницаемость для различных соединений. Показано, что модификация состава жирных кислот может быть обусловлена цис/транс изомеризацией, изменением соотношения их насыщенных и ненасыщенных форм, а также составом полярных головок фосфолипидов. Так, в ходе исследований de Carvalho и da Fonseca (2007) установили, что адаптация клеток R. erythropolis к толуолу обусловлена увеличением содержания изоразветвленных насыщенных жирных кислот, которое сопровождается снижением текучести и пластичности клеточных мембран. В работе Куюкиной с соавт. (2000) показано, что культивирование родококков 55 в присутствии углеводородных субстратов способствует развитию у данных представителей неспецифической устойчивости к антибиотикам гидрофобного характера. По мнению авторов, это обусловлено повышением барьерной функции клеточной оболочки в результате снижения ее проницаемости для антибиотических веществ за счет происходящих качественных (появление в составе нейтрального фосфолипида кардиолипина и фосфитидилглицерина) и количественных (повышение содержания клеточных липидов, насыщенных прямоцепочечных жирных кислот типа С16:0, С18:0 и С21:0) изменений в клеточной стенке при выращивании родококков на углеводородах. Увеличение содержания насыщенных жирных кислот от 69% в исходных до 74% в адаптированных клетках Clostridium tyrobutyricum позволило снизить их чувствительность к повышенным концентрациям бутирата, а также увеличить активность участвующих в образовании данного соединения ферментов (Zhu, Yang, 2003). На примере R. opacus GM-14 была показана (Tsiko et al., 1999) прямая корреляционная зависимость между концентрацией вносимых в среду токсичных источников углерода и энергии и уровнем 10-метилзамещенных жирных кислот в изо-конфигурации, что также свидетельствует об их участии в процессе адаптации. Являясь показателем адаптированности клеток к действию химических веществ, соотношение числа насыщенных и ненасыщенных жирных кислот в мембране также определяет степень гидрофобности клетки, от которой зависит не только жизнеспособность микроорганизмов в присутствии органических веществ, но и их адгезивные свойства при контакте с жидкими субстратами или твердой поверхностью, а также клеток между собой (de Carvalho, da Fonseca, 2007; de Carvalho et al., 2009). Так, введение в систему растворитель-вода таких терпенов как карвеол и карвон (250 ммоль) сопровождалось уменьшением коэффициента ненасыщенности жирных кислот, который указывает на снижение числа двойных связей в увеличивающейся углеродной цепи, и приводит к потере 35 и 5% 56 жизнеспособных клеток R. erythropolis (de Carvalho, da Fonseca, 2007). Кроме того, внесение данной концентрации терпенов в биореактор приводило диспергированию ранее агрегированных клеток родококков с последующим сокращением толщины образуемой ими биопленки в мембранном биореакторе. Изменение состава жирных кислот является не только результатом их модификаций, но и связано с синтезом новых липидов в процессе культивирования микробных клеток в присутствии соответствующих субстратов (de Carvalho et al., 2009). Так, Whyte с соавт. (1999) показали, что при выращивании клеток Rhodococcus sp. Q15 в присутствии гексадекана в составе клеточных липидов обнаруживается небольшое количество жирных кислот типа С18:0 и значительное содержание типа С16:0 и С14:0. При этом использование в качестве источника углерода и энергии дизельного топлива приводило что к отражает увеличению сложность разнообразия химического жирнокислотного состава данного состава, субстрата. Культивирование родококков на углеводородных субстратах приводит к удлинению углеродной цепочки в молекулах жирных кислот, способствуя снижению проницаемости клеточной оболочки для антибиотических веществ, повышая антибиотикорезистентность родококков, выращенных в присутствии углеводородов (Ившина и др., 1990; Куюкина и др., 2000). Немаловажное значение в процессе адаптации микроорганизмов к загрязнению окружающей среды принадлежит плазмидам, на которых расположены гены, контролирующие деградацию ароматических и других органических соединений, а также определяющие устойчивость к антибиотикам и тяжелым металлам (Dabbs, Sole, 1988; Stecker et al., 2003; Fetzner et al., 2007; Alvarez, 2010; Larkin et al., 2010). В исследованиях Begbie с соавт. (2005) показано, что при длительном воздействии ингибирующего фактора копийность плазмид, несущих гены устойчивости бактерий к его действию, увеличивается. Плазмиды биодеградации являются конъюгативными, поэтому, передаваясь внутри и между микробными 57 популяциями, они способствуют распространению признаков среди микроорганизмов, приобретению новых или расширению имеющихся катаболических свойств (Leahy, Colwell, 1990; van der Meer et al., 1992; Ветрова и др., 2007). González с соавт. (2001) показали, что предварительная адаптация иммобилизованных в Са-альгинатных гранулах клеток Pseudomonas putida ATCC 17484 к высоким концентрациям фенола в условиях биореактора с псевдоожиженным слоем позволяла сократить продолжительность лагфазы в 1,3 раза. Кроме того, доказано, что при каждом последующем внесении новой порции загрязняющего вещества время, предшествующее началу его деградации, значительно сокращается, а деградирующая способность адаптированной популяции возрастает. Биотрансформация карвеола адаптированными к нему в присутствии н-додекана клетками R. erythropolis DCL14 происходит в 8,3 раза быстрее, чем нативными бактериями (de Carvalho, da Fonseca, 2005). Однако, следует помнить, что сокращение продолжительности адаптационного периода может привести к снижению числа активной биомассы при попадании в систему, а, следовательно, и эффективности биотехнологического процесса. Адаптация приводит к появлению свойств, которые не характерны для неадаптированных культур. Так, в ходе проведенных Леневой с соавт. (2009) исследований показано, что адаптированные к фенантрену клетки R. opacus 412 и R. rhodnii 135 приобретают способности расти на данном углеводороде при его использовании в качестве единственного источника углерода и энергии, в отличие от неадаптированных культур, которые осуществляют лишь частичную его трансформацию. Отсутствие роста неадаптированных клеток связывают с токсичностью накапливающихся первичных метаболитов разложения фенантрена, которые отсутствуют в среде при использовании адаптированных клеток, что свидетельствует об ускорении каталитических реакций в результате активизации соответствующих ферментов при адаптации. Ускорение процесса деградации 58 ароматических соединений было отмечено также в случае использования Alcaligenes xylosoxidans Y234, предварительное выращивание которого в их присутствии способствовало активизации катехолдиоксигеназ (Yeom, Yoo, 2002). Ившиной с соавт. (1990) показано, что выращивание родококков в присутствии газообразных и жидких алканов сопровождается перестройкой клеточного метаболизма и увеличением активности окислительных ферментных систем, осуществляющих неспецифическую атаку на тот или иной воздействующий антибиотик, что обуславливает повышение антибиотикорезистентности родококков. Таким образом, из представленных литературных данных видно, что создание новых бактериальных ассоциаций на основе нефтеокисляющих микроорганизмов, имеющих и метаболические разнообразные специфические пути ферментные деградации системы углеводородов, и оптимизация процесса очистки нефтезагрязненных объектов, в частности сточных вод, с их использованием в условиях биореакторов является актуальным. 59 Глава 4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 4.1. Бактериальные штаммы и условия их культивирования. В работе использовали чистые культуры Rhodococcus opacus ИЭГМ 249, ИЭГМ 716Т; Rhodococcus ruber ИЭГМ 70Т, ИЭГМ 231, ИЭГМ 615, поддерживаемые алканотрофных в Региональной микроорганизмов профилированной (акроним ИЭГМ, коллекции WDCM # 768; www.iegm.ru/iegmcol/strains). Штаммы выделены из нефтезагрязненых сред и различаются по спектру окисляемых субстратов. Родококки выращивали на плотных и в жидких питательных средах: мясопептонном бульоне (МПБ) (ФБУН ГНЦ ПМБ, Россия), питательном агаре (ПА) (ФБУН ГНЦ ПМБ, Россия), минеральной среде с добавлением в качестве источника углерода и энергии н-гексадекана (3 об.%) или модельной нефти (2 об.%) в условиях перемешивания на орбитальном шейкере Certomat IS (Sartorius, Германия) или микропланшетном шейкереинкубаторе Titramax 1000 (Heidolph-Instruments, Германия) при 28°С, 160 об./мин в течение 1-7 сут. Используемая минеральная среда RS имеет следующий состав (Catalogue of strains, 2008), г/л: KNO3 − 1,0; KH2PO4 − 2,0; K2HPO4 − 2,0; (NH4)2SO4 − 2,0; NaCl − 1,0; MgSO4 × 7H2O − 0,2; CaCl2 × 2H2O − 0,02; FeCl3 × 7H2O − 0,001. Показатели роста бактерий в процессе культивирования в жидкой среде определяли по изменению показателя оптической плотности (ОП600нм) культуры, измеренной с помощью двулучевого спектрофотометра Lambda EZ 201 (Perkin Elmer, США) или микропланшетного фотометра Multiskan Ascent (Thermo Electron Corporation, Финляндия) с программным обеспечением Ascent Software v. 2,6. (Thermo Labsystems, Финляндия). 4.2. Исследование кинетики процесса иммобилизации родококков в биореакторе с перемешиванием и колоночного типа. В качестве носителя для иммобилизации родококков использовали гидрофобизованные хвойные опилки (Podorozhko et al., 2008) с размером частиц 0,1-0,3 см, 60 а также макропористый криогель на основе поливинилового спирта (ПВС) марки 16-1 (ГОСТ 10779-78) производства ОАО «Невинномысский Азот» (Невинномысск). Перед использованием носитель на основе опилок отмывали дистиллированной водой и стерилизовали автоклавированием (121°С; 15 мин). Для иммобилизации использовали клетки родококков, выращенные в МПБ либо в гексадекансодержащей среде RS до экспоненциальной фазы. Для удаления остаточного субстрата клеточную суспензию центрифугировали при 3000 об. в течение 15 мин. Осажденную биомассу трижды отмывали натрий-фосфатным буфером (рН 7,0) следующего состава, г/л: Na2HPO4 – 3,53; KH2PO4 – 3,39 (Досон и др., 1991) и ресуспендировали в этом же буфере до значения ОП600нм 1,0. Иммобилизацию родококков в ПВС проводили согласно описанной методике (Kuyukina et al., 2006). Для этого суспензию R. ruber ИЭГМ 615 и R. opacus ИЭГМ 249 (2,0× 10 7 кл/мл) и раствор ПВС (120 г/л) после автоклавирования, охлажденный до 40ºС, смешивали в соотношении 1 : 2 и встряхивали с помощью Vortex FS 16 (BioSan, Латвия) в течение 2 мин. После чего 100 мкл аликвоты полученного композита раскапывали в круглодонный 96-луночный полистирольный микропланшет (Медполимер, Санкт-Петербург). Последующие этапы гранулирования, замораживания и оттаивания Перед осуществляли использованием согласно полученный указанной биокатализатор выше методике. регидратировали в 0,5%-ном растворе NaCl в течение 24 ч и помещали в биореактор. Адсорбцию родококков на опилках проводили в 250-мл колбах Эрленмейера, содержащих 100 мл бактериальной суспензии (2,0 × 10 7 кл/мл) и 2 г носителя, на орбитальном шейкере при 60; 110; 160 и 210 об./мин, который служил моделью биореактора с перемешиванием, и в лабораторном колоночном биореакторе (рис. 1), рабочие параметры которого приведены в табл. 3. Колоночный биореактор представляет собой стеклянную колонку, заполненную 2 г гидрофобизованных опилок, удерживаемых в рабочей зоне 61 за счет расположенного на входе фильтра из кварцевого стекла. Фильтр также позволяет поддерживать однородную структуру носителя без прохождения крупных воздушных пузырьков и снизить их вклад в формирование псевдоожиженного слоя. Колонка при помощи силиконовых трубок соединялась с колбой, содержащей суспензию (2,0 × 107 кл/мл; 200 мл) клеток R. ruber и R. opacus, взятых в равном соотношении (рис. 2). Жидкость подавалась в колонку с помощью перистальтического насоса через нижнее входное отверстие, орошала древесные опилки в направлении снизувверх, вытекала из колонки через верхнее выходное отверстие и возвращалась в колбу. Таким образом, биореактор являлся замкнутой циркуляционной системой с переменной скоростью потока. Таблица 3. Рабочие параметры колоночного биореактора Объем биореактора, см3 43,2 Высота рабочей зоны, см 14 Радиус рабочей зоны, см 0,7 Масса носителя, г 2,0 Размер частиц носителя, см 0,1-0,3 Концентрация частиц носителя, см3 0,1 Площадь поверхности частицы, мм2 10 Общая площадь поверхности носителя, см2 55,3 Концентрация биомассы, кл/мл 2,0 × 107 Соотношение R. ruber : R. opacus 1:1 Скорость подачи бактериальной суспензии, мл/мин 0,6; 1,2; 2,0; 2,8 62 Рис. 1. Лабораторный колоночный биореактор: 1 – подача бактериальной суспензии; 2 – стеклянный фильтр; 3 – модифицированные хвойные опилки; 4 – выход бактериальной суспензии. 63 Рис. 2. Экспериментальная установка по изучению процесса иммобилизации клеток родококков: 1 – бактериальная суспензия; 2 – перистальтический насос; 3 – колоночный биореактор. 64 Эксперименты по иммобилизации проводили при комнатной температуре в течение 7 сут в трехкратной повторности. Процесс адсорбции контролировали по измерению показателя ОП600нм клеточной суспензии. Отбор образцов (1 мл) для спектрофотометрического анализа проводили каждые 2 ч в течение первых суток и далее ежедневно, для чего осторожно отбирали жидкую фазу без присутствия частиц носителя. В качестве контроля использовали неинокулированный носитель. По окончании процесса иммобилизации носитель отмывали от непрочно прикрепленных и отмерших клеток натрий-фосфатным буфером (рН 7,0). Перед повторным использованием опилок для иммобилизации родококков проводили десорбцию бактериальных клеток натрий-фосфатным буфером в условиях, аналогичных таковым при проведении иммобилизации, и стерилизовали носитель автоклавированием. 4.3. Изучение способности бактериальных культур усваивать нефтяные углеводороды. Способность исследуемых штаммов R. ruber и R. opacus расти в присутствии различных концентраций углеводородов изучали в 96-луночных полистирольных микропланшетах (Медполимер, Санкт-Петербург) методом микроразведений в минеральной среде RS. В качестве единственного источника углерода использовали индивидуальные н-алканы (декан, ундекан, додекан, тетрадекан, гексадекан, гептадекан, нонадекан), ароматические (фенол) и полиароматические (нафталин, фенантрен и антрацен) углеводороды, а также модельную нефть. В каждую лунку 96-луночного микропланшета вносили углеводороды по 6, 12, 30, 50, 100 мкл, при этом нафталин и фенантрен предварительно растворяли в н-гексане в концентрации 5 мг/мл, а антрацен – 1 мг/мл (Wrenn, Venosa, 1996). После испарения н-гексана на стенках лунок образовывался слой полиароматических углеводородов. К углеводородам добавляли по 100 мкл суспензии (ОП600нм 1,0×107) клеток R. ruber или R. opacus в минеральной среде RS. Планшеты закрывали парафиновой пленкой и инкубировали на микропланшетном шейкере-инкубаторе Titramax 1000 65 (Heidolph-Instruments, Германия) при 28°C, 160 об./мин в течение 7 сут. После окончания инкубации в каждую лунку добавляли 50 мкл 0,2% водного раствора красителя йодонитротетразолия хлорида (ИНТ) (Sigma-Aldrich, США), который в присутствии активно респирирующих микроорганизмов восстанавливается до нерастворимого в воде красно-фиолетового формазана. Для полного восстановления красителя планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение 24 ч. Показатель ОП630нм окрашенных культур определяли с помощью микропланшетного фотометра Multiskan Ascent (Thermo Electron Corporation, Финляндия) с программным обеспечением Ascent Software v. 2,6. (Thermo Labsystems, Финляндия). В качестве контролей использовали клеточную суспензию без добавления углеводородов, а также неинокулированную среду RS с добавлением углеводородов. 4.4. Определение солеустойчивости бактериальных культур. Жизнеспособность клеток R. ruber и R. opacus в условиях разной солености среды (1-35% NaCl) изучали в 96-луночных полистирольных микропланшетах. В первые лунки вносили 200 мкл исходного раствора (35%) хлорида натрия в МПБ. Затем рабочий раствор в объеме 133 мкл переносили в следующий ряд лунок, содержащий первоначально 67 мкл МПБ, и перемешивали. Аналогичным образом готовили весь ряд разведений. Из последнего разведения удаляли 133 мкл бульона. В каждую лунку планшета вносили 10 мкл клеточной суспензии 2,0×109 кл/мл (Стандарт плотности БАК-5). Планшеты инкубировали на микропланшетном шейкереинкубаторе при 28°C, 160 об./мин в течение 5 сут. После окончания инкубации в каждую лунку добавляли 50 мкл 0,2% водного раствора ИНТ и инкубировали при комнатной температуре в течение 24 ч. Показатель ОП630нм окрашенных культур определяли с помощью микропланшетного фотометра Multiskan Ascent. В качестве контролей использовали клеточную суспензию в МПБ без добавления NaCl и неинокулированный МПБ. 66 4.5. Очистка нефтезагрязненной родококками в биореакторе Углеводородокисляющую воды с коиммобилизованными псевдоожиженным активность родококков слоем. оценивали в экспериментах по очистке модельной и промышленной нефтезагрязненной воды. Модельную нефтезагрязненную воду готовили на основе среды RS с добавлением углеводородов (хч, Реахим, Россия; HPLC grade, Sigma, США), г/л: н-декан, н-ундекан, н-додекан, н-тетрадекан – 2,25; н-гексадекан – 2,4; н-гептадекан – 2,34; н-нонадекан – 2,26; пристан – 1,61; нафталин, фенантрен и антрацен – 0,47 (Kuyukina et al., 2009а). Такая углеводородная смесь точного химического состава является удобным модельным объектом при изучении углеводородокисляющей активности микроорганизмов в отношении нефтей различного состава (Abed et al., 2006). Следует отметить, что содержание отдельных компонентов в модельной нефти соответствует усредненному составу сырой нефти. Для получения стабильной эмульсии углеводородов к воде добавляли 0,1%-ный р-р Твина 60 (“Sigma-Aldrich”, США) и обрабатывали на ультразвуковом гомогенизаторе Soniprep 150 (SANYO, Япония) при 24 кГц в течение 1 мин. Используемая в экспериментах промышленная сточная вода получена из Пермского филиала ООО «Буровая компания «Евразия». Образующаяся после завершения промывки бурового оборудования сточная вода, загрязненная углеводородами в концентрации 3,9 г/л, содержит нормальные и разветвленные алканы, азотсодержащие соединения и фенол, а также тяжелые металлы (табл. 4). Модельную либо промышленную нефтезагрязненную воду пропускали через биореактор, заполненный коиммобилизованными на опилках клетками R. ruber и R. opacus (1 : 1) со скоростью 0,6; 1,2 и 2,0 мл/мин при 28°С в течение трех недель (рис. 3). Все эксперименты проводили параллельно в трех одинаковых колонках (рис. 4), в качестве контроля использовали 67 неинокулированный носитель. Отбор образцов из биореакторов (1 мл) для определения содержания остаточных углеводородов проводили еженедельно. Адаптацию проводили с иммобилизованных использованием вышеописанного состава, родококков модельной которую к углеводородам нефтезагрязненной непрерывно пропускали воды через колоночный биореактор со скоростью 2,0 мл/мин при температуре 28°С в течение 10 сут. После окончания 1-го цикла обработки в биореактор подавали новую порцию модельной нефтезагрязненной воды, содержание углеводородов в которой превышало исходное (19 г/л) в 1,5 раза и составляло 29 г/л. Таблица 4. Состав промышленной нефтезагрязненной воды Нефтяные углеводороды % Тяжелые металлы мг/л н-алканы 52 Cr 0,04 изо-алканы 36 Mn 0,13 фенолы 3 Fe 2,44 N-содержащие 9 Co 0,01 Соли г/л Cu 0,16 фториды 0,02 Zn 0,2 хлодиры 3,0 Mo 2,74 нитраты 0,03 Hg 0,01 фосфаты 1,3 сульфаты 3,7 ХПК 10,3 NH4-N 0,05 68 5 2 3 1 4 Рис. 3. Экспериментальная установка по изучению процесса биодеградации нефтяных углеводородов иммобилизованными на хвойных опилках родококками: 1 – модельная нефтезагрязненная вода; 2 – колоночный биореактор, заполненный опилками с иммобилизованными родококками; 3 – перистальтический насос; 4 – магнитная мешалка; 5 – термостатируемая водяная баня. 69 Рис. 4. Эксперимент по очистке промышленной нефтезагрязненной воды ассоциацией иммобилизованных R. ruber и R. opacus в колоночном биореакторе с псевдоожиженным слоем. Операционную стабильность, а, следовательно, и возможность многократного использования иммобилизованных на опилках родококков, оценивали по сохранению последовательном углеводородокисляющей пропускании через биореактор активности новой при порции нефтезагрязненной воды. По завершению каждого трехнедельного цикла иммобилизованный биокатализатор промывали натрий-фосфатным буфером, который пропускали через колонку со скоростью 2,0 мл/мин в течение 2 ч. 4.6. Структурный анализ нефтезагрязненной воды. Количественное содержание углеводородов в образцах из биореактора определяли после экстракции хлороформом (х.ч., Лаверна, Москва). Для этого, к образцу 70 добавляли эквивалентное количество хлороформа, интенсивно встряхивали на Vortex FS 16 в течение 1 мин и отстаивали до расслоения жидкости, после чего количественно отбирали хлороформенную фракцию. Экстракцию углеводородов проводили три раза. Для удаления остаточной воды к объединенному экстракту добавляли безводный сульфат натрия (чда, Реахим, Пермь), экстракт фильтровали и использовали для хроматомасспектрометрии. К подготовленным для определения остаточного содержания полиароматических углеводородов (ПАУ) экстрактам, после выпаривания хлороформа, добавляли ацетонитрил (х.ч., Криохром, СанктПетербург) в объеме, равном ранее полученному экстракту. Качественный анализ предельных углеводородов в нефтезагрязненной воде проводили с использованием газового хроматографа Agilent 6890N, снабженного масс-спектрометрическим детектором Agilent MSD 5973 N (Agilent Technologies, США) и кварцевой колонкой HP-5 MS SN US 15189741 при следующих условиях хроматографирования: 80°C 2 мин, 10°C 1 мин, 300°C 5 мин, скорость потока газа 1 мл/мин, объем образца 1 мкл. ПАУ анализировали с помощью высокоэффективного жидкостного хроматографа LC Prominence (Shimadzu, Япония), оборудованного колонкой с обращено-фазовым сорбентом Discovery С18® и ультрафиолетовым детектором RF-10A XL (Shimadzu, Япония). Условия хроматографирования: 40°C, λвозб270 нм λ эмис330 нм 0-12 мин, λ возб250нм λ эмис370 нм 12-25 мин, скорость потока подвижной фазы ацетонитрил : вода (1 : 1) – 1 мл/мин, объем образца 50 мкл. При количественном определении содержания углеводородов использовали калибровочные графики между площадью пика углеводородного соединения на хроматограмме и его концентрацией в стандартном растворе. Содержание тяжелых металлов определяли методом атомно- эмиссионной спектроскопии на базе аналитической лаборатории Центра SETN университета Статклайд (Великобритания) с использованием 71 спектрометра с индуктивно- связанной плазмой (Thermo Scientific iCAP 6200 Duo View ICP Spectrometer, Thermo Fisher Scientific, Cambridge, UK). 4.7. Определение физико-химических свойств клеток родококков. Для сравнения физико-химических свойств нативных и адаптированных к углеводородам клеток родококков, частицы опилок из биореактора с закрепленными клетками после промывки буферным раствором помещали на ПА. Для выделения R. ruber и R. opacus из смешанной культуры, выросшие вокруг частицы опилок колонии штрихом рассевали по поверхности агаризованной среды и инкубировали при температуре 28°С в течение 3 сут. Выросшие индивидуальные колонии R. ruber и R. opacus использовали в последующих экспериментах. Морфология 4.7.1. клеточной поверхности. Исследование морфологии клеточной поверхности родококков проводили на базе Пермского Rhodococcus-центра государственного национального исследовательского университета. Для этого суспензию живых клеток родококков (ОП600нм 0,5-0,7) в натрий-фосфатном буфере без предварительной подготовки наносили на предметное стекло, подсушивали на воздухе при комнатной температуре и сканировали с помощью атомносилового микроскопа (АСМ) Asylum MFP-3D (Asylum Research) в полуконтактном режиме на воздухе с использованием кремниевого кантилевера АС240TS с резонансной частотой 50-90 кГц и константой жесткости 0,5-4,4 Н/м. Обработку АСМ-изображения проводили с использованием программы Igor Pro 6.22А (WaveMetrics). Гидрофобность 4.7.2. клеточной стенки. Гидрофобность бактериальных клеток определяли с помощью МАТН-теста (Microbial Adhesion to Hydrocarbons – Микробная адгезия к углеводородам) по модифицированной методике (Kuyukina et al., 2009б). В качестве гидрофобной фазы использовали модельную нефть. Выращенные в МПБ бактериальные клетки центрифугировали при 3000 об. в течение 15 мин 72 и дважды отмывали PUM-буфером следующего состава, г/л: К2НРО4 × 3Н2О – 22,2; КН2РО4 – 7,26; NH4NO3 – 1,8; МgSО4 × 7Н 2О – 0,2; рН 7,1 (Rosenberg, Rosenberg, 1981). После чего в том же самом буфере готовили суспензию клеток, соответствующую ОП600нм 0,48-0,50. К полученным суспензиям (4,8 мл) добавляли 1,2 мл модельной нефти. Содержимое пробирок встряхивали при 2400 об./мин на Vortex FS 16 в течение 2 мин. Смесь отстаивали в течение 1 сут и измеряли оптическую плотность водной фазы при 600 нм на спектрофотометре Lambda EZ 201. Адгезивную активность (%) рассчитывали по формуле: [1 – (А/А0)]×100, где А – оптическая плотность суспензии клеток после смешивания с углеводородом, А0 – оптическая плотность исходной суспензии клеток. Контролем служили бактериальные суспензии без модельной нефти, а также стерильный буфер с добавлением нефти. Эксперименты проводили в 6-кратной повторности при комнатной температуре. 4.7.3. Определение Электрокинетический электрокинетического потенциал родококков потенциала. регистрировали методом динамического светорассеяния с использованием анализатора ZetaSizer Nano ZS (Malvern Instruments, Великобритания) с программным обеспечением Malvern Zetasizer, v. 2.2 (Malvern Instruments, Великобритания). Для этого предварительно выращенные в МПБ до стационарной фазы роста нативные и адаптированные клетки отмывали и ресуспендировали в 0,1 М KNO3 (рН 7,0) до достижения ОП600нм 0,15-0,2 (спектрофотометр Lambda EZ 201). 4.7.4. Эмульгирующая активность. Для определения эмульгирующей активности микропробы использовали (Коронелли, модифицированный метод Юферова, В 1990). пробирочной градуированную микропробирку (1,5 мл) вносили по 0,5 мл дистиллированной воды и н-гексадекана, а также 0,05 мл суспензии (ОП600нм1,0) исходных и адаптированных клеток R. ruber или R. opacus. Содержимое микропробирки подвергали УЗ-обработке на ультразвуковом гомогенизаторе Soniprep 150 (SANYO, Япония) 22 кГц в течение 1 мин. Индекс эмульгирования (Е) 73 определяли через 0,1; 1 и 24 ч и рассчитывали по формуле: Е = (Н/Н0)×100, где Н – величина эмульсионного слоя, Н0 – общая высота столба жидкости в пробирке. Эксперименты проводили в трехкратной повторности. 4.7.5. Определение суммарных клеточных липидов. Суммарные клеточные липиды в нативных и адаптированных к углеводородам клетках родококков определяли гравиметрически после хлороформ-метанольной экстракции из сухой биомассы (Кейтс, 1975). Сухую биомассу (50 мг) предварительно выращенных в МПБ и отмытых клеток, суспендировали в 1 мл дистиллированной воды. К полученным суспензиям добавляли 4 мл смеси хлороформ–метанол (1 : 2) и встряхивали в течение 2 мин на Vortex FS 16 и давали отстояться в течение суток. Затем смесь центрифугировали при 3000 об. в течение 10 мин, осадок повторно экстрагировали 5 мл смеси хлороформ–метанол–вода (1 : 2 : 0,8). Супернатанты объединяли, добавляли 5 мл смеси хлороформ–вода (1 : 1) и центрифугировали. Во взвешенные круглодонные 50-мл колбы количественно переносили хлороформенный слой каждого образца, разбавляли эквивалентным количеством бензола и упаривали на роторном испарителе (Heidolph, Германия) при 60ºС. После чего колбу взвешивали до достижения постоянной массы на высокоточных аналитических весах AUW 120D (Shimadzu, Япония). Эксперименты проводили в пятикратной повторности. 4.7.6. Определение антибиотикочувствительности бактерий. Изучение чувствительности родококков к антибиотикам проводили дискодиффузионным методом на ПА с использованием стандартных индикаторных дисков, пропитанных растворами антибиотических веществ (Gouid, Bowie, 1952). Для этого отобранные в конце экспоненциальной фазы роста клетки суспендировали в 0,5%-ом растворе NaCl. Полученную суспензию, содержащую 109 кл/мл (Стандарт плотности БАК-5), объемом 0,2 мл при помощи шпателя равномерно распределяли по всей поверхности ПА, разлитого в чашки Петри по 25 мл. 74 На поверхность зараженной питательной среды раскладывали по 4 стерильных бумажных диска, пропитанных растворами антибиотических веществ, приведенных в табл. 5. Чашки инкубировали при 28°С в термостате в течение 2 сут. Степень чувствительности культур к антибиотикам определяли по диаметру зоны (в мм) отсутствия бактериального роста вокруг соответствующего диска. При диаметре зоны задержки роста свыше 25 мм культуры относили к высокочувствительным, от 16 до 25 мм – к чувствительным, от 11 до 15 мм – к малочувствительным, менее 10 мм или при отсутствии (Методические стерильной указания…, зоны 1983). вокруг диска Коэффициент – к устойчивым резистентности (К) рассчитывали как отношение числа антибиотиков, к которым исследуемый штамм устойчив, к общему числу исследуемых антибиотиков (Гостев и др., 2010). Эксперименты проводили в трехкратной повторности. Таблица 5. Используемые в работе стандартные диски с антибиотиками Антибиотик Изготовитель Ампициллин НИЦФ, С.-Петербург Гентамицин НИЦФ, С.-Петербург Канамицин НИЦФ, С.-Петербург Карбенициллин НИЦФ, С.-Петербург Линкомицин НИЦФ, С.-Петербург Налидиксовая кислота НИЦФ, С.-Петербург Неомицин НИЦФ, С.-Петербург Оксациллин НИЦФ, С.-Петербург Олеандомицин “Oxoid”, UK Стрептомицин НИЦФ, С.-Петербург Тетрациклин НИЦФ, С.-Петербург Фузидин НИЦФ, С.-Петербург Эритромицин “Oxoid”, UK 75 4.8. Определение жизнеспособности и функциональной стабильности иммобилизованных клеток. Число жизнеспособных иммобилизованных в криогеле ПВС либо на хвойных опилках родококков определяли методом окрашивания ИНТ по модифицированной методике Wrenn и Venosa (1996). К предварительно отмытым натрий-фосфатным буфером (рН 7,0) гранулам криогеля ПВС или опилкам (2 г) добавляли 25 мл 0,05% водного раствора красителя ИНТ (Sigma-Aldrich) и инкубировали в течение 24 ч при комнатной температуре. Жидкую фазу удаляли, формазан экстрагировали из носителя 20 мл 96%-го этанола (ч.д.а., Экос-1, Москва) в условиях встряхивания на орбитальном шейкере (150 об./мин, 120 мин) и измеряли ОП480нм экстракта. Количество живых иммобилизованных клеток родококков определяли по калибровочному графику (рис. 5). Функциональную стабильность используемых в ходе очистки нефтезагрязненной воды иммобилизованных клеток родококков определяли с использованием автоматизированного 6-канального респирометра замкнутого цикла Micro-Oxymax® (Columbus, США). Для этого образцы иммобилизованных в криогеле ПВС либо адсорбированных на поверхности опилок клеток родококков, взятые в равном количестве (2 гранулы и 0,2 г соответственно), до и после цикла очистки нефтезагрязненной воды в биореакторе, и неинокулированным носителем (контролем) помещали в измерительные камеры респирометра. Дыхательную активность определяли по скорости дыхания (мкл/мин), а также по общему количеству (в мкл) потребленного кислорода и выделенного углекислого газа иммобилизованными родококками в присутствии модельной нефти. Эксперименты проводили при температуре 28°С. 4.9. Генетический анализ бактериальных штаммов. Для выделения ДНК из клеток R. ruber ИЭГМ 70Т и R. opacus ИЭГМ 716Т готовили лизаты путем суспендирования единичных чистых колоний в 50 мкл 0,05М NaOH. Полученную суспензию инкубировали при температуре 95°С в течение 15 76 2 ОП480нм экстракта формазана 1,6 1,2 0,8 0,4 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 КОЕ, ×106 кл/мл Рис. 5. Калибровочный график зависимости показателя ОП480нм спиртового экстракта формазана, образующегося при окрашивании суспензии родококков с помощью ИНТ, клеток родококков, определенных высевом на ПА. от числа живых 77 мин, после чего замораживали на 15 мин замораживания-оттаивания повторяли и трижды. оттаивали. Цикл Полученные лизаты центрифугировали при 14000 об./мин в течение 2 мин с использованием микроцентрифуги MiniSpin® (Eppendorf, Германия) (Боронникова, 2007), супернатант (1 мкл) использовали для постановки полимеразной цепной реакции (ПЦР). Выделение ДНК из иммобилизованных клеток родококков проводили непосредственно из частицы носителя (окрашенной ИНТ или после экстракции красителя этанолом) с помощью коммерческого набора Soil Microbe DNA KitTM (Zymo Research, США). Для этого частицу носителя с бактериальными клетками помещали в микропробирку с металлическими бусинами, все последующие действия выполняли согласно протоколу фирмы-производителя. Выделенную ДНК (1 мкл) использовали для ПЦР, которую проводили с набором праймеров для R. ruber и R. opacus, описанными Bell с соавт. (1999) и синтезированными компанией «Синтол» (Москва): 1) специфичные для R. ruber а) Ru1 5'GTCTAATACCGGATAGGACCTCGGGA3', б) Ru2 5'TACCGTCACTTGCGCTTCGTCGGTAC3'; 2) специфичные для R. opacus а) Ro1 5' TATGACCTTCGGCTGCATGGCTGAG3', б) Ro2 5' CCGTATCGCCTGGAAGCTCGAG3'. Реакционная ПЦР-смесь объемом 25 мкл состояла из 10 мМ ПЦРбуфера для Taq-полимеразы; 2,5 мМ MgCl2 (для праймеров R. ruber) и 1,5 мМ MgCl2 (для праймеров R. opacus); 0,2 мМ смеси четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов (дНТФ) – 2,0 мкл; 0,2 мкМ прямого и обратного праймера; 0,4 ед. Taq-ДНК полимеразы; 1 мкл ДНК; деионизированной воды. Все реактивы производства «Синтол» (Россия). ПЦР проводили в программируемом термоциклере MJ MiniTM (Bio-Rad, США) при следующих температурно-временных режимах: предварительная 78 денатурация 5 мин при 95°С; 35 циклов по 30 сек при 94°С, 30 сек при 60°С (для R. ruber) или 64°С (для R. opacus), 30 сек или 1 мин при 72°С для R. ruber и R.opacus соответственно; конечная элонгация 10 мин при 72°С. Для экстракции плазмидной ДНК (пДНК) клетки предварительно десорбировали с поверхности носителя, после чего готовили клеточные лизаты с использованием коммерческого набора Zyppy™ Plasmid Miniprep Kit (Zymo Research, США) согласно протоколу от производителя. Выделение пДНК проводили при комнатной температуре. Элюированную пДНК использовали для электрофореза. Продукты ПЦР анализировали путем постановки электрофореза в 1,5%, а обнаружение пДНК – 0,8% агарозном геле (ApplyChem, BioChemica, Chemica Syntesis Service) с использованием однократного TBEбуфера следующего состава (10 × г/л): трис – 10,8 (99,8%, Sigma, США); борная кислота для электрофореза – 5,5 (Sigma, США); 0,5 М ЭДТА – 4 мл (pH 8,0) (99,4%, Sigma); дистиллированная вода, 1 л (Ausubel et al., 1995). Электрофоретическое разделение проводили при напряжении 80 В, силе тока 33 мА и мощности 3 Вт в течение 30-40 мин. После электрофореза агарозный гель окрашивали водным раствором (0,5 мкг/мл) бромистого этидия (Sambrook et al., 1989) и просматривали в УФ-свете с использованием трансиллюминатора Gel Doc XR (BioRad, США). В качестве свидетеля использовали молекулярный маркер ДНК 100-3000 п.н. (SibEnzyme, Россия). Положительный результат регистрировали в виде единичной полосы, соответствующей позиции фрагмента маркера ДНК определенной длины. В экспериментах по элиминации плазмид использовали адаптированные клетки R. ruber. Для этого клетки выращивали на среде LB, содержащей акридиновый оранжевый в концентрации 50 мкг/мл, в течение 18 ч (Singh et al., 1988). 4.10. Математическое моделирование процесса иммобилизации клеток родококков в колоночном биореакторе с псевдоожиженным слоем. Математическое моделирование проводили совместно с коллегами 79 кафедры теоретической механики Пермского национального исследовательского политехнического университета (зав. кафедрой, д.т.н., профессор Ю.И. Няшин). Рабочую зонy биореактора схематично представляли в виде цилиндра высотой H и радиусом основания R. Скорость подачи бактериальной суспензии в биореактор обозначали через ϕ , скорость движения жидкости в цилиндре ( ) v =ϕ πR 2 . Для описания происходящих в биореакторе процессов использовали подход, изложенный в работе Куюкиной с соавт. (2007). Исходя из данной работы общая формула для расчета изменения концентрации свободных клеток (ns) во времени будет выглядеть следующим образом: = ns (t ) ns 0 1 + Ti (v) Td (v) (Ti (v) Td (v) + exp ( − (1 Ti (v) + 1 Td (v) ) t ) ) ⋅ ⋅ ( K (v) − ( K (v) − 1) exp ( − t T f (v) ) ) .(1) где ns 0 – концентрация свободных клеток в начальный момент времени; Ti (v) среднее время иммобилизации клетки на частице носителя, которое вычисляется по формуле Ti (v) = 2 ( S nc v p(v) ) (2); Td (v) – среднее время десорбции клетки от частицы носителя; К(v) – кратность распада клеточного мицелия; Tf – характерное время распада. Учитывая, что иммобилизация протекает в колоночном биореакторе, где концентрация клеток по высоте неодинакова, необходимо оценить зависимость ns и ni (изменение концентрации иммобилизованных клеток) от точки пространства, то есть от координаты z: ns ( z, t ) и ni ( z, t ) . Пусть из трех процессов: (1) иммобилизации иммобилизованных клеток с свободных поверхности клеток, частиц (2) десорбции носителя с их последующим переходом в свободное состояние и (3) распада клеточного мицелия на иммобилизация. короткие Тогда палочковидные значение формы ns ( z , t + dt ) происходит определяется только переносом свободных клеток из точки с координатой z − vdt и иммобилизацией свободных клеток в точке с координатой z: 80 ns ( z , t + dt ) = ns ( z − vdt , t ) − Ds(1) dt . (3) где Ds(1) есть скорости изменения ns (t ) за счет иммобилизации клеток, которая вычисляется по формуле Ds(1) = −ns ( z , t ) / Ti . (4) ∂ns / ∂t + v∂ns / ∂z + ns / Ti = 0 . (5) Из (2), (3) находим Пусть в начальный момент времени в цилиндре не было свободных клеток, а из колбы поступает клеточная суспензия с постоянной концентрацией ns 0 свободных клеток. Тогда n s ( z , 0) = 0 при 0 < z ≤ H , n s (0, t ) = n s 0 при t ≥ 0 . (6) Решение уравнения (15) с дополнительными условиями (16) имеет вид ns0 exp (– z / (v Ti)) при 0 ≤ z ≤ vt, ns (z, t) = (7) при z > vt Так как в рассматриваемом случае ∂ni / ∂t = ns / Ti (см. (10)) и ni ( z,0) = 0 0 при 0 ≤ z ≤ H, то из (17) находим ns0 (t – z / v) exp (– z / (v Ti)) при 0 ≤ z ≤ vt, ni (z, t) = (8) при z ≥ vt 0 4.11. Статистическая обработка результатов Математическую обработку полученных данных осуществляли с использованием компьютерной программы Excel 2007 (Microsoft Inc., 1999), рассчитывая среднее арифметическое, стандартное отклонение, доверительный интервал. Достоверность различий между средними величинами оценивали с помощью непарного критерия Стьюдента. Связь между переменными определяли с помощью коэффициента корреляции Пирсона. 81 Глава 5. ПОДБОР НОСИТЕЛЯ ДЛЯ ИММОБИЛИЗАЦИИ КЛЕТОК РОДОКОККОВ Иммобилизацию ассоциации клеток R. ruber и R. opacus осуществляли (1) адсорбционным методом на поверхности гидрофобизованных хвойных опилок и (2) путем включения в матрицу криогеля ПВС. Как видно из табл. 6, на поверхности гидрофобизованных опилок иммобилизовалось максимальное (1,7 × 107 клеток/г носителя) число родококков, которое почти в 6 раз больше по сравнению с плотным криогелем ПВС. По-видимому, это обусловлено высокой удельной площадью поверхности опилок, которая достигается за счет рыхлой структуры и шероховатости данного носителя. Следует отметить, что в пересчете на объемные единицы носителя количество иммобилизованных клеток родококков сопоставимо для модифицированных опилок и криогеля ПВС (1,9 × 106 и 1,7 × 106 кл/см3 соответственно). Из представленных в табл. 6 результатов видно, что удельная скорость окисления н-гексадекана и модельной нефти родококками, закрепленными на поверхности опилок, на 18-88% выше соответствующих показателей для криоиммобилизованных клеток. Это может быть обусловлено одинаковой доступностью углеводородов и кислорода для адсорбировавшихся на опилках родококков, а также сорбцией опилками окисляемого субстрата, способствующей повышению его биодоступности для иммобилизованных клеток. Экспериментально установлено, что носитель на основе хвойных опилок способен сорбировать почти в 5 раз больше углеводородов по сравнению с криогелем ПВС (см. табл. 6). В качестве объективного показателя интенсивности протекающих в бактериальных клетках аэробных метаболических процессов многие авторы рассматривают респираторную активность (Игнатов и др., 2000; Graves et al., 1991; Steininger et al., 2002; Gómez et al., 2006). Об эффективном окислении нефтяных углеводородов родококками, закрепленными на хвойных опилках, 82 Таблица 6. Физико-химические и технологические свойства биокатализаторов на основе иммобилизованных родококков Носитель для иммобилизации Параметр модифицированные хвойные опилки криогель ПВС Размер частиц, мм3 3-5 5 Плотность носителя, г/см3 0,11 0,9 Механическая прочность средняя высокая Сорбция углеводородов, об.% 25,3 ± 2,0 5,0 ± 0,3 1,7 × 107 1,9 × 106 23,4 ± 1,9 19,3 ± 1,2 7,2 ± 1,5 0,9 ± 0,03 3-4 2-3 Количество клеток на г носителя Каталитическая активность в отношении н-гексадекана, мг окисленного субстрата/(л·ч) на 106 клеток Каталитическая активность в отношении модельной нефти, мг окисленного субстрата/(л·ч) на 106 клеток Число рабочих циклов с сохранением функциональной эффективности свидетельствовали высокие (1653 и 717 мкл соответственно для О2 и СО2) показатели дыхательной активности, которые в 2 раза превышали таковые для клеток, включенных в криогель ПВС (рис. 6). Выявленные отличия могут быть обусловлены ограниченной диффузией кислорода и углеводородного субстрата в гранулы полимера. За счет значительной площади поверхности хвойных опилок и монослойной адсорбции родококков (Ivshina et al., 2013) кислород и углеводороды одинаково доступны практически для всех закрепленных на носителе клеток, что, в свою очередь, способствует возрас- 83 Количество поглощенного О2 и выделенного СО2 1000 СО2 8 500 7 6 5 0 4 -500 3 2 -1000 -1500 1 О2 -2000 0 4 9 13 17 22 26 30 35 39 43 48 Время, ч Рис. 6. Динамика респираторной активности иммобилизованной на различных носителях ассоциации клеток R. ruber ИЭГМ 615 и R. opacus ИЭГМ 249 при взаимодействии с модельной нефтезагрязненной водой. Обозначения: 1, 8 – иммобилизованные на хвойных опилках родококки; 2, 7 – иммобилизованные в гранулах криоПВС родококки; 3, 6 – неинокулированные опилки; 4, 5 – неинокулированный криоПВС. Здесь, на рис. 8 и в табл. 7 использовали одинаковое количество иммобилизованных клеток на опилках и в гранулах криоПВС. танию интенсивности процесса их окислительной биодеструкции. При использовании гранул ПВС, площадь контакта родококков с субстратом сравнительно меньше, и, несмотря на макропористую структуру криогеля, углеводороды в большей степени доступны для клеток, расположенных 84 ближе к периферии гранул. Это подтверждается более интенсивным окрашиванием периферийных областей гранулы криогеля ПВС с иммобилизованными клетками R. ruber после инкубирования в присутствии модельной нефти (рис. 7). Следует отметить, что зарегистрированное незначительное потребление кислорода в контрольных образцах с использованием неинокулированных носителей может быть обусловлено абиотическими окислительными процессами (Mihelcic, Luthy, 1988). А Б Рис. 7. Гранула криогеля ПВС c иммобилизованными клетками R. ruber ИЭГМ 615 свежеприготовленная (А) и после контакта с нефтезагрязненной водой (Б). Стрелкой показана более интенсивно окрашенная периферийная область гранулы. Использование иммобилизованных бактериальных клеток в процессах биоремедиации поддержания О углеводородзагрязненных сред требует длительного их функциональной стабильности (Gómez et al., 2006). функциональной стабильности родококков в иммобилизованном состоянии свидетельствует высокая скорость их дыхания в присутствии модельной нефти, поддерживаемая в течение 48 ч (рис. 8). При этом удельная скорость потребления О2 и выделения СО2 адсорбированными на поверхности опилок родококками на 63 и 59% выше таковой для клеток, заключенных в криогель ПВС. Кроме того показано, что после десятидневного контакта с нефтезагрязненной водой интенсивность дыхания закрепленных на древесном носителе родококков повышалась по сравнению со свежеприготовленным биокатализатором и превышала исходные показатели в 3,7 и 12,7 раза по количеству потребленного О2 и выделенного 85 Скорость респирации, мкл/мин 0,6 СО2 0,4 4 0,2 3 0 2 -0,2 -0,4 1 О2 -0,6 -0,8 0 4 9 13 17 22 26 30 35 39 43 48 Время, ч Рис. 8. Скорость дыхания иммобилизованной на хвойных опилках (1, 4) и в гранулах криоПВС (2, 3) ассоциации клеток R. ruber ИЭГМ 615 и R. opacus ИЭГМ 249 в присутствии модельной нефти. СО2 соответственно (табл. 7). Согласно Зыриной с соавт. (2008) и Prieto с соавт. (2002 а, б), увеличение респираторной активности бактерий в присутствии токсичных веществ является индикатором увеличения резистентности клеток к данным токсикантам. При этом дыхательная активность криоиммобилизованных родококков после инкубации с нефтезагрязненной водой снижалась на 1-2,5%, что, по-видимому, свидетельствует о снижении числа физиологически активных бактериальных клеток внутри гранул криоПВС (Николаев, 2004). Нами также показано, что деструктирующий потенциал адсорбированных на опилках родококков сохранялся в течение 3-4-х операционных циклов обработки нефтезагрязненной воды, тогда как функциональная активность иммобилизованного биокатализатора на основе криогеля ПВС снижалась после 2-3-кратного использования (рис. 9). 86 Таблица 7. Сравнительная характеристика дыхательной активности иммобилизованных родококков в присутствии модельной нефти Носитель для иммобилизации хвойные опилки Потребление О2, мкл Скорость потребления О2, мкл/мин Выделение СО2, мкл Скорость выделения СО2, мкл/мин свежеприготовленные после контакта с нефтью свежеприготовленный после контакта с нефтью 1653 6171 809 802 0,39 1,29 0,14 0,14 717 3067 336 327 0,19 0,64 0,08 0,08 опилки 100 Степень биодеградации модельной нефти,% криогель ПВС криоПВС 80 60 40 20 0 1 2 3 Цикл обработки нефтезагрязненной воды Рис. 9. Углеводородокисляющая активность иммобилизованных родококков при многократном использовании. 87 Важным фактором, определяющим выбор хвойных опилок в качестве адсорбента для иммобилизации нефтеокисляющих бактерий, является относительная дешевизна и доступность данного материала на территории России. Кроме того, процесс иммобилизации бактерий на опилках можно проводить непосредственно в биореакторе, тогда как применение закрепленных в криогеле клеток требует дополнительных стадий криоиммобилизации (см. главу 4.2). Следует отметить, что синтетический носитель на основе криогеля ПВС целесообразно использовать в биотехнологических процессах получения целевых соединений, тогда как природный древесный носитель – для очистки загрязненных сточных вод (Cassidy et al., 1996; Lozinsky et al., 2003). 88 Глава 6. ДИНАМИКА ПРОЦЕССА ИММОБИЛИЗАЦИИ РОДОКОККОВ В БИОРЕАКТОРЕ С ПЕРЕМЕШИВАНИЕМ И КОЛОНОЧНОГО ТИПА В дальнейших исследованиях в качестве носителя для адсорбционной иммобилизации алканотрофных родококков в условиях лабораторного биореактора использовали гидрофобизованные хвойные опилки. В данной главе изучены динамические характеристики процесса иммобилизации на выбранном носителе в биореакторе с перемешиванием и колоночного типа при различных гидродинамических условиях. Иммобилизация родококков на хвойных опилках в биореакторе с перемешиванием. Как видно из рис. 10, процесс иммобилизации родококков в биореакторе с перемешиванием характеризовался сравнительно равномерным снижением показателя ОП600нм свободных клеток в суспензии в течение первых 48 ч, в ходе чего на поверхности опилок сорбировалось от 21 до 35% бактерий. Однако, следует отметить, что при высоких скоростях перемешивания (110-210 об./мин) в первые часы эксперимента регистрировалось некоторое увеличение показателя ОП600нм, которое может быть обусловлено как распадом клеточного мицелия родококков, помещенных в буфер, на короткие палочковидные формы, так и физикохимическим процессом вымывания материала носителя при используемых высокоскоростных режимах (Ившина и др., 1987). После 72 ч в биореакторе с перемешиванием происходила интенсивная сорбция родококков на носителе. При этом наиболее высокая (75%) степень иммобилизации бактерий регистрировалась при максимальной скорости (210 об./мин) перемешивания. Столь высокая степень адсорбции клеток может быть обусловлена интенсивной фрагментацией клеточного мицелия родококков с последующей их иммобилизацией, а также хорошей аэрацией бактериальной суспензии в условиях интенсивного перемешивания (Ившина и др., 1987; Neu, Poralla, 1988). Так, известно (Rijnaarts et al., 1993; Ivshina et 89 А 1,2 1 ОП600нм 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0 2 4 6 20 22 24 48 72 96 120 144 48 72 96 120 144 168 Время, ч Б 1,2 1 ОП600нм 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0 2 4 6 20 22 24 168 Время, ч Рис. 10. Динамика процесса иммобилизации клеток R. ruber ИЭГМ 231 на хвойных опилках в биореакторе с перемешиванием при различных гидродинамических условиях. Варианты опыта отражают различную угловую скорость движения платформы орбитального шейкера: (□) – 60; (◊) – 110; (♦) – 160; (■) – 210 об./мин. 90 al., 2013), что адгезия родококков к гидрофобной поверхности это – активный физиологический процесс, обусловленный синтезом поверхностноактивных веществ (биосурфактантов). Следует отметить, что процесс иммобилизации (60 и 110 родококков об./мин) при происходил низких скоростях менее интенсивно перемешивания по сравнению с высокоскоростными режимами (160 и 210 об./мин), при которых уменьшение показателя ОП600нм клеточной суспензии наблюдалось в течение 7 сут (см. рис. 10). По-видимому, замедление иммобилизационного процесса со временем обусловлено достижением уровня насыщения центров связывания поверхности носителя с бактериальными клетками (Коваленко и др., 1999). Выявленные закономерности иммобилизационного процесса согласуются с литературными данными (Козляк и др., 1991) и объясняются установлением гидродинамического равновесия между процессом адсорбции клеток на твердом носителе и обратным процессом их десорбции с поверхности носителя, приводящим к постоянному общему уровню клеточной иммобилизации. Иммобилизация родококков на хвойных опилках в условиях лабораторного колоночного биореактора. Закрепление родококков на хвойных опилках в условиях колоночного биореактора происходило наиболее интенсивно в течение первых 48 ч при всех исследуемых скоростях подачи суспензии (рис. 11). В результате данного процесса на опилках адсорбировалось от 18 до 44% бактериальных клеток, что свидетельствовало о наличии достаточного количества доступных сайтов связывания на поверхности носителя. Следует отметить, что с течением времени при скорости подачи клеточной суспензии в биореактор 1,2-2,0 мл/мин наблюдалось постепенное снижение интенсивности адсорбции бактерий на опилках и стабилизация показателя ОП600нм на уровне 0,5-0,7 (рис. 11, А). Вероятно, это обусловлено формированием псевдоожиженного слоя, обеспечивающего равномерное распределение суспендированных клеток между частицами носителя по всей высоте биореактора и, следовательно, 91 А 1 0,9 ОП600нм 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0 24 48 72 96 120 144 168 Время, ч Б 1 0,9 ОП600нм 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0 24 48 72 96 120 144 168 Время, ч Рис. 11. Динамика процесса иммобилизации ассоциации клеток R. ruber ИЭГМ 615 и R. opacus ИЭГМ 249 на хвойных опилках в колоночном биореакторе при средней (А) и минимальной/максимальной (Б) скорости подачи бактериальной суспензии: (○) – 0,6; (♦) – 1,2; (◊) – 2,0; (●) – 2,8 мл/мин. 92 монослойную адсорбцию родококков на их поверхности, что является немаловажным фактором в условиях масштабирования биотехнологических процессов (Shieh, Keenan, 1986). Однако, несмотря на то, что при высокоскоростном режиме работы (2,8 мл/мин) в биореакторе также формировался псевдоожиженный слой, спустя 48 ч регистрировалось незначительное увеличение показателя ОП600нм (рис. 11, Б). Возможно, это обусловлено механическим истиранием носителя в результате интенсивного движения его частиц и значительной десорбцией клеток, которые при столь высокой скорости не успевают вновь адсорбироваться (Donlan, 2002; Soko´ł, Korpal, 2006). В случае минимальной исследуемой скорости (0,6 мл/мин) увеличение показателя ОП600нм может быть обусловлено вымыванием ранее коагрегированных родококков из нижней части биореактора (рис. 11, Б). По-видимому, причиной коагрегации клеток является недостаточно высокая скорость подачи суспензии для формирования псевдоожиженного слоя, в результате чего частицы носителя остаются неподвижными и плотно уложенными в нижней части реактора, препятствуя равномерному распределению между ними суспендированных бактериальных клеток (Soko´ł, Korpal, 2006). Таким образом, эффективность иммобилизации родококков на носителе в значительной мере зависит от скорости подачи суспензии в биореактор. Так, возрастание скорости от 1,2 до 2,0 мл/мин приводило к 25%-ому увеличению степени адсорбции родококков. Известно, что при возрастании скорости подачи бактериальной суспензии пограничный слой жидкости между клетками и носителем уменьшается, увеличивая вероятность прямого контакта между ними и последующей сорбции клеток на поверхности носителя (Zheng et al., 1994; Donlan, 2002). Однако последующее увеличение скорости пропускания бактериальной суспензии через биореактор до 2,8 мл/мин не приводило к повышению эффективности иммобилизационного процесса. Последнее может быть связано 93 с окращением времени взаимодействия клеток с поверхностью носителя при высокоскоростных режимах (Donlan, 2002). Полученные для каждого варианта опыта (иммобилизация в биореакторе с перемешиванием или колоночного типа) довольно значительные величины доверительных интервалов средних значений показателя ОП600нм (см. рис. 10, 11) можно объяснить неравномерностью распределения адсорбированных бактериальных клеток на поверхности носителя, так и вызванной как мозаичностью коагрегацией распределения клеток родококков, гидрофобных участков на модифицированных древесных опилках (Podorozhko et al., 2008). Оценка возможности повторного использования хвойных опилок для иммобилизации родококков. Большинство современных биотехнологий направлено на оптимизацию и интенсификацию процессов с целью сокращения их продолжительности и увеличения эффективности. В связи с этим, нами изучены закономерности адсорбции родококков при повторном использовании хвойных опилок в качестве носителя бактериальных клеток. Из рис. 12 видно, что наиболее интенсивная сорбция клеток на нативном и повторно используемом носителе происходит в течение первых двух суток эксперимента. При этом повторное использование хвойных опилок приводит к сокращению продолжительности иммобилизационного процесса от 7 до 2 сут при увеличении степени иммобилизации в 1,5 раза. Выявленное повышение адсорбционной емкости носителя, по-видимому, связано с «разрыхлением» поверхности опилок при длительном контакте с водой, приводящим к увеличению доступной для иммобилизации площади носителя (Donlan, 2002). Математическое родококков в математического моделирование условиях колоночного моделирования теоретическая формула: процесса биореактора. адсорбционного иммобилизации В процесса результате получена 94 1 ОП600нм 0,8 0,6 0,4 0 1 2 3 4 5 6 7 Время, сут Рис. 12. Динамика процесса иммобилизации ассоциации клеток R. ruber ИЭГМ 615 и R. opacus ИЭГМ 249 в колоночном биореакторе на нативных (■) и повторно (□) используемых опилках. Скорость подачи клеточной суспензии в биореактор – 2 мл/мин. = ns (t ) (Ti (v) Td (v) + exp ( − (1 Ti (v) + 1 Td (v) ) t ) ) ⋅ ⋅ ( K (v) − ( K (v) − 1) exp ( − t T f (v) ) ) , 1 + T (v ) T (v ) ns 0 i 1 d где ns – изменение концентрации свободных клеток со временем (t); ns 0 – концентрация свободных клеток в начальный момент времени; Ti (v) среднее время иммобилизации клетки на частице носителя; Td (v) – среднее время десорбции клетки от частицы носителя; К(v) – кратность распада клеточного Математическое моделирование выполнено на кафедре теоретической механики ПНИПУ Осипенко М.А. и Няшиным Ю.И., результаты опубликованы в статье Куюкиной, М.С., Ившиной, И.Б., Серебренниковой, М.К., Осипенко, М.А., Няшина, Ю.И. Экспериментальное и теоретическое исследование процесса иммобилизации актинобактерий в колоночном биореакторе с псевдоожиженным слоем // Российский журнал биомеханики. – 2012. – Т.16, № 4 (58). – С. 83-91. 1 95 мицелия; v – скорость движения суспензии характерное время распада мицелия, в биореакторе; которую Tf – сопоставляли с экспериментально измеренными значениями ОП600нм. Как видно из рис. 13, теоретические рассчитанные значения показателя ОП600нм качественно совпадают с экспериментальными данными. Следовательно, разработанная модель адекватно описывает основные черты протекания иммобилизационного процесса в биореакторе и может быть использована при его масштабировании. С помощью построенной модели рассчитаны среднее время иммобилизации (Ti) свободных клеток на частице носителя и десорбции иммобилизованных клеток (Td) с ее поверхности, вероятность (р) иммобилизации клетки при ее столкновении с частицей носителя и кратность распада клеточного гидродинамические мицелия условия (К) (табл. оказывают 8). влияние Установлено, на степень что (d) иммобилизации клеток на носителе. Так в биореакторе с перемешиванием величина d достигала максимального (75%) значения при скорости 210 об./мин, тогда как в биореакторе колоночного типа соответствующий показатель (d=55%) регистрировался при скорости подачи суспензии 2,0 мл/мин. Следует отметить, что при данном скоростном режиме в колоночном биореакторе достигалось наиболее оптимальное сочетание условий (наименьшая Ti, соответствующая максимальной d; динамическое равновесие между Ti и Td при высокой р) для иммобилизации алканотрофных родококков на хвойных опилках. Кроме того, использование реактора колоночного типа позволяет проводить процессы иммобилизации бактерий и очистки загрязненной воды в непрерывном режиме (Сироткин и др., 2007; Doaa, Wafaa, 2009). Таким образом, динамика процесса иммобилизации родококков на древесных опилках зависит от типа биореактора (колоночного или с перемешиванием) и гидродинамических условий. Экспериментально определены гидродинамические условия (1,2-2,0 мл/мин) в биореакторе, при 96 Рис. 13. Экспериментальные (точки) и теоретические (линии) зависимости процесса иммобилизации клеток родококков в колоночном биореакторе от скорости подачи суспензии. (○) – 0,6; (◊) – 1,2; (+) – 2,0; (□) – 2,8 мл/мин. 97 Таблица 8. Математически рассчитанные параметры процесса иммобилизации родококков на хвойных опилках в биореакторах различного типа Колоночный биореактор v, мл/ мин Ti , ч Td , ч Биореактор с перемешиванием 2 K p d, % ω, об./ мин Ti , ч Td , ч K p d, % 0,6 49 40 1,0 1,8∙10-4 49 60 130 350 1,6 2,1·10-7 61 1,2 210 140 1,0 2,1∙10-5 35 110 280 ∞ 1,0 2,8·10-8 55 2,0 73 73 1,0 3,5∙10-5 55 160 150 4400 1,2 3,0·10-8 66 2,8 41 53 1,0 4,5∙10-5 24 210 46 1000 3,6 6,8·10-8 75 которых происходит псевдоожижение частиц носителя. На основе математического моделирования подобран оптимальный скоростной режим (2,0 мл/мин) иммобилизации родококков на опилках, при котором происходит прочное закрепление клеток и достигается высокая (1,7 × 107 клеток/г носителя) концентрация биомассы в реакторе. Установлено, что повторное использование хвойных опилок способствует сокращению продолжительности иммобилизационного процесса при увеличении адсорбционной емкости носителя 1,5 раза. Результаты получены сотрудниками кафедры теоретической механики ПНИПУ и опубликованы в статье Куюкиной, М.С., Ившиной, И.Б., Осипенко, М.А., Няшина, Ю.И., Тюленевой, А.Н., Серебренниковой, М.К. Об учете свободной поверхности жидкости при моделировании процесса иммобилизации бактериальных клеток на твердом носителе // Российский журнал биомеханики. – 2009. – Т. 13, № 2. – С. 7-14. 2 98 Глава 7. БИОДЕГРАДАЦИЯ НЕФТЯНЫХ УГЛЕВОДОРОДОВ АССОЦИАЦИЕЙ КОИММОБИЛИЗОВАННЫХ РОДОКОККОВ В КОЛОНОЧНОМ БИОРЕАКТОРЕ Биологические способы очистки нефтезагрязненной воды являются экологически безопасными и экономически целесообразными. В основе биоремедиации лежит способность микроорганизмов окислять нефтяные углеводороды в процессе своей жизнедеятельности, используя их в качестве источника углерода и энергии, либо в процессе соокисления с легкодоступным субстратом. При этом отмечено, что использование бактериальных ассоциаций позволяет более эффективно удалять углеводородные компоненты нефти по сравнению с монокультурами (Жуков и др., 2007; Плешакова и др., 2007; Ghazali et al., 2004; Mikesková et al., 2012). Способность микроорганизмов осуществлять разрушение нефтепродуктов определяется углеводородокисляющей активностью штаммов- биодеструкторов (Леонов, Пищальник, 2005). В связи с этим, в работе использовали иммобилизованную на хвойных опилках ассоциацию штаммов R. ruber ИЭГМ 615 и R. opacus ИЭГМ 249. Из табл. 9 видно, что исследуемые штаммы родококков характеризуются различной способностью к усвоению углеводородных субстратов. Так клетки R. ruber активно росли при всех (3-50 об.%) исследуемых концентрациях н-С10, н-С11, н-С12, а также антрацена и фенантрена. Несколько слабее бактерии росли в присутствии нафталина. Другой исследуемый штамм R. opacus ИЭГМ 249 характеризовался интенсивным ростом в присутствии всех исследуемых концентраций (3-50 об.%) н-С16 и пристана; при 25-50 об.% н-С14. Более слабый рост наблюдался в присутствии 3-13 об.% н-С14. Ни одна из исследуемых культур не росла в присутствии высоких (25-50 об.%) концентраций бензола, а при более низких (3-6 об.%) концентрациях наблюдался интенсивный рост клеток R. ruber и слабый – R. opacus. 99 Таблица 9. Способность клеток R. ruber и R. opacus расти в присутствии нефтяных углеводородов Концентрация углеводорода, об. % Ростовой субстрат 6 +/ +++ 15 ++/ +++ 25 ++/ +++ 50 ++/ +++ н-С11 ++/ +++ ++/ +++ +++/ +++ +++/ +++ +++/ +++ н-С12 ++/ +++ +++/ +++ +++/ +++ +++/ +++ ++/ +++ н-С14 ++/ +++ ++/ +++ ++/ ++ +++/ ++ +++/ ++ н-С16 +++/ +++ +++/ +++ +++/ +++ +++/ ++ +++/ ++ бензол +/ +++ +/ +++ -/ ++ -/ - -/ - фенол нафталин ++ / ++ ++/ ++ ++/ ++ ++/ ++ +++/ ++ ++/ ++ +++ / + +/ ++ +++ / + +/ ++ антрацен +++/ +++ +++/ +++ ++/ +++ ++/ +++ ++/ +++ фенантрен +++/ +++ +++/ +++ +++/ +++ ++/ +++ ++/ +++ пристан +++/ +++ +++/ +++ +++/ ++ +++/ + +++/ + Примечание. (+++) – интенсивный рост; (++) – хороший рост; (+) – слабый рост; (-) – рост отсутствует. В числителе приведены данные для R. ruber, в знаменателе – R. opacus. н-С10; н-С11; н-С12; н-С14; н-С16 – н-декан; н-ундекан; н-додекан; н-тетрадекан; н-гексадекан соответственно. 99 н-С10 3 +/ +++ 100 О высокой окислительной способности бактериальной ассоциации R. ruber и R. opacus в отношении углеводородов свидетельствует дыхательная активность, которая в присутствии модельной нефти на 4-27% выше таковой для индивидуальных штаммов (рис. 14). Повышение респираторной обусловлено активности родококков установлением между в ассоциации штаммами может быть синергетических взаимодействий, которые способствуют повышению степени деградации сложных субстратов и снижению образования токсичных промежуточных метаболитов (Mikesková et al., 2012). Следует отметить, что данный эффект более выражен в том случае, когда для респирометрического анализа использовали что клетки предполагает после контакта возможность с адаптации нефезагрязненной родококков к водой, нефтяным 0,1 0,148 0,144 0,08 0,14 0,06 0,136 0,04 0,132 0,02 0,128 0,124 Скорость выделения СО 2, мкл/мин Скорость потребления О 2, мкл/мин углеводородам (Зырина и др., 2008; Cassidy et al., 1996; Prieto et al., 2002б). 0 исходный опыт R. ruber R. ruber исходный опыт R. opacus R. opacus исходный R. ruberопыт + R. ruber + R. opacus R. opacus Рис. 14. Скорость дыхания родококков в присутствии модельной нефти. Потребление кислорода нативными клетками ( ) и после контакта с нефтезагрязненной водой ( ); выделение углекислого газа нативными клетками ( ) и после контакта с нефтезагрязненной водой ( ). 101 Известно, на что метаболическую уровень солености среды оказывает влияние активность микроорганизмов, окисляющих углеводороды нефти, и эффективность процесса биодеградации (Leahy, Colwell, 1990; Diaz et al., 2002). Из рис. 15 видно, что добавление 1-4,5% хлорида натрия в среду культивирования R. ruber и 1-3% – для R. opacus оказывает стимулирующий эффект на их рост и приводит к увеличению числа жизнеспособных клеток по сравнению со средой без добавления NaCl, что согласуется с литературными данными (Плакунов и др., 1999). При этом максимальные значения показателя ОП630нм (2,8 и 3,6 для R. ruber и R. opacus соответственно) отмечалось в присутствии 1,5% NaCl. Показано, что при концентрациях соли выше 3,0-4,5% родококки оставались жизнеспособными, однако их количество по сравнению с контролем снижалось в 1,3-4 раза. Следует отметить, что изменение ОП630нм для R. ruber в диапазоне концентраций хлорида натрия от 10,5 до 35% было незначительным. Результаты свидетельствуют о возможности использования культур для очистки нефтесодержащей воды с повышенным содержанием солей. 4 ОП630нм 3 2 1 0 0,0 1,0 1,4 2,0 3,0 4,6 7,0 10,4 15,7 23,3 35,0 NaCl, % Рис. 15. Зависимость жизнеспособности клеток R. ruber ИЭГМ 615 (■) и R. opacus ИЭГМ 249 (▲) от концентрации хлорида натрия в среде. 102 Оптимизация процесса биодеградации нефтяных углеводородов ассоциацией иммобилизованных R. ruber и R. opacus в колоночном биологической биореакторе. очистки По модельной нашим данным, нефтезагрязненной эффективность воды зависит от гидродинамического режима биореактора (рис. 16). С одной стороны, высокая скорость подачи загрязненной воды определяет время контакта углеводородов с окисляющей микрофлорой, с другой – обеспечивает формирование псевдоожиженного слоя, необходимого для равномерного распределения загрязненной воды между взвешенными частицами носителя с иммобилизованными клетками. 80 60 40 20 3 0,6 1 1,2 2,0 я, нед ели 2 0 Вр ем Степень очистки, % 100 Скорость, мл/мин Рис. 16. Эффективность очистки модельной нефтезагрязненной воды коиммобилизованными родококками в колоночном биореакторе. Так увеличение скорости подачи воды от 0,6 до 2,0 мл/мин способствовало возрастанию степени биодеградации углеводородов от 72 до 86%. При этом наиболее интенсивное (59-84%) удаление углеводородов происходило в течение первой недели эксперимента. 103 Из рис. 17 видно, что максимальная интенсивность биодеградации н-алканов (90%) и разветвленного алкана – пристана (67%) отмечалась при скорости 2,0 мл/мин, что на 7-16% выше соответствующих показателей для меньших скоростей. Выявленный факт объясняется тем, что при высокоскоростном (1,2-2,0 мл/мин) режиме формируется псевдоожиженный слой, который обеспечивает равномерное распределение загрязненной воды между взвешенными частицами носителя, повышая доступность углеводородов для адсорбированных родококков. Кроме того, при высокой скорости перемешивания приводит водного к потока увеличению усиление гидравлического количества поступающего к иммобилизованным родококкам растворенного кислорода, что также способствует повышению эффективности биодеградационного процесса (Sharma, Pant, 2001; Rajasimman, Karthikeyan, 2009). н-алканы разветвленные алканы ПАУ Степень деградации, % 100 75 50 25 0 0,6 1,2 2,0 Скорость, мл/мин Рис. в 17. зависимости в биореактор. Степень от биодеградации скорости подачи нефтяных углеводородов нефтезагрязненной воды 104 В то же время, степень деградации ПАУ существенно не изменялась в зависимости от скорости подачи воды и варьировала в пределах 70-73% (см. рис. 17). Принимая во внимание тот факт, что данные углеводороды обладают низкой растворимостью в воде и высокой степенью сорбции на твердых поверхностях, их удаление происходит в основном за счет сорбции на носителе и последующего окисления иммобилизованными бактериями (Kermanshahi et al., 2005). Следует отметить, что при минимальной скорости (0,6 мл/мин) прокачивания модельной нефтезагрязненной воды через биореактор, нами визуально зафиксирован интенсивный рост биомассы на расположенных непосредственно у входа в реактор частицах носителя, что затрудняет транспорт углеводородов и кислорода к расположенным в верхней части биореактора бактериальным клеткам. По-видимому, это вызвано возникающим в отсутствии псевдоожижения градиентом концентрации углеводородов по высоте колонки и их длительным (1,2 ч) периодом гидравлического удержания вблизи опилок с адсорбированными родококками. Низкая скорость потока и плотно уложенные частицы носителя препятствуют свободному прохождению избыточной биомассы из нижней зоны реактора и равномерному распределению клеток по всему рабочему объему. С течением времени это может привести к засорению и полной остановке биореактора. Таким образом, оптимальная скорость подачи модельной нефтезагрязненной воды в биореактор, соответствующая максимальной степени (86%) биодеградации углеводородов, составляет 2,0 мл/мин. Данная скорость обеспечивает быстрый перенос углеводородов к иммобилизованным родококкам за счет сокращения диффузного слоя между носителем и загрязненной водой (van Loosdrecht et al., 1990; Zheng et al., 1994; Donlan, 2002). Поскольку увеличение скорости подачи нефтезагрязненной воды от 0,6 до 2,0 мл/мин приводит к снижению продолжительности деградации углеводородов, это указывает на 105 возможность сокращения временных затрат при проведении мероприятий по очистке воды, загрязненной нефтью и нефтепродуктами. Оценка возможности коиммобилизованных многократного родококков для использования очистки модельной нефтезагрязненной воды в биореакторе. Нами установлено, что после первого операционного цикла в биореакторе (2 мл/мин, 28°С, 3 недели) степень деградации индивидуальных углеводородов, входящих в состав модельной нефти, составила от 21 до 100% (рис. 18). При этом иммобилизованные родококки эффективно окисляли углеводороды алифатического ряда с длиной углеродной цепи от 10 до 19 атомов, а также 5 Концентарция углеводородов, г/л антрацен фенантрен 4 нафталин I II III пристан 3 н -С19 н -С17 н -С16 2 н -С14 н-С12 1 н -С11 н -С10 0 1 2 3 Время, недели Рис. 18. Сравнение содержания остаточных углеводородов в воде после 1-го (I); 2-го (II) и 3-го (III) циклов обработки в биореакторе. Исходная концентрация углеводородов в воде – 19,01 г/л. Скорость подачи загрязненной воды в биореактор – 2 мл/мин. н-С10; н-С11; н-С12; н-С14; н-С16 – н-декан; соответственно. н-ундекан; н-додекан; н-тетрадекан; н-гексадекан 106 отметить, что н-декан и нафталин частично удалялись в результате испарения. Наиболее интенсивно происходила биодеградация н-гексадекана (92%) и н-гептадекана (96%), менее интенсивно (от 82 до 88%) – окисление н-ундекана, н-додекана, н-тетрадекана. Что касается разветвленного алкана – пристана, степень его деградации достигала 67%. Наименее эффективно происходило окисление фенантрена и антрацена (21 и 60%, соответственно). По-видимому, это объясняется тем, что данные полиароматические углеводороды являются труднодоступными для биологического окисления, т.к. обладают низкой растворимостью в воде и высокой степенью сорбции к твердым поверхностям. В целом эффективность процесса биодеградации нефтяных углеводородов в биореакторе составила 86% за три недели. Нами установлено, что повторное использование иммобилизованных на опилках R. ruber и R. opacus приводило к 22-26%-ному увеличению эффективности очистки новой порции модельной нефтезагрязненной воды в биореакторе (см. рис. 18). При этом возрастание эффективности деградационного процесса связано с интенсивным окислением пристана (на 16 и 5% после 2-го и 3-го цикла соответственно) и алканов от н-С11 до н-С16 (на 1-2% после каждого цикла). Следует отметить, что эффективность удаления таких углеводородов как н-декан и н-гептадекан оставалась неизменной на протяжении трех циклов обработки нефтезагрязненной воды в биореакторе, а остаточное содержание ПАУ (нафталина, фенантрена и антрацена) по завершению третьего цикла возрастало на 5-7% по сравнению с предыдущим циклом. Вероятнее всего, это обусловлено постепенным вымыванием данных углеводородов с поверхности носителя, на котором они сорбировалось в ходе предыдущих циклов (Abu-Salah, 1996). Повышенная эффективность очистки нефтезагрязненной воды, вероятно, обусловлена тем, что к концу первого цикла в биореакторе формировалась адаптированная к нефтяным углеводородам микробная популяция (Cuenca et al., 2006). Это приводило к сокращению продолжительности (от 16 до 8 ч) лаг-фазы роста адаптированных в реакторе 107 родококков по сравнению с интактными клетками (рис. 19). 1,6 ОП 600нм 1,2 0,8 0,4 0 0 8 16 24 26 28 Время, ч Рис. Динамика 19. роста ассоциации нативных (□) и адаптированных (■) в биореакторе клеток R. ruber и R. opacus в присутствии модельной нефти. Концентрация модельной нефти в воде – 3 об.%. Следует отметить, что многократное использование иммобилизованных микроорганизмов для очистки промышленных сточных вод требует длительного поддержания их функциональной стабильности в условиях биореактора (Gómez et al., 2006). По данным респирометрических исследований, средняя скорость потребления кислорода иммобилизованными клетками родококков в присутствии модельной нефтезагрязненной воды составляла 1,6 мкл/мин, а выделения углекислого газа – 0,7 мкл/мин (рис. 20). Высокая скорость клеточного дыхания в присутствии нефтяных углеводородов поддерживалась в течение почти трех недель, что свидетельствует иммобилизованного биокатализатора. о функциональной стабильности 108 Скорость дыхания, мкл/мин 1 0,5 2 0 -0,5 1 -1 -1,5 -2 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Время, сут Рис. 20. Интенсивность дыхания иммобилизованных родококков в присутствии модельной нефти. 1 – скорость поглощения кислорода; 2 – скорость выделения углекислого газа. При оценке суммарной активности клеточного дыхания установлено, что после очистки нефтезагрязненной воды в колоночном биореакторе кумулятивное потребление кислорода увеличивалось в 2,1 раза, а выделение углекислого газа – в 2,3 раза по сравнению со свежеприготовленными иммобилизованными клетками (рис. 21). Очевидно, это обусловлено ростом клеток родококков в ходе потребления углеводородного субстрата в биореакторе и их последующей иммобилизацией на поверхности опилок. Данное предположение подтверждается выявленной строгой корреляцией (R2=0,99; р≤0,01) между показателями дыхательной активности и численностью родококков в суспензии (рис. 22), что подтверждает возможность использования показателя дыхательной активности для оценки жизнеспособности иммобилизованных бактериальных клеток. 109 Количнство потребленного O2 Скорость выделения CO2 Скорость потребленияO2 20000 1,5 15000 1 10000 0,5 5000 0 Количество потребленного О2 и выделенного СО2, мкл Скорость дыхания, мкл/мин 2 Количество выделенного CO2 0 До цикла биодеградации После цикла биодеградации Рис. 21. Дыхательная активность иммобилизованных родококков в присутствии модельной нефти после 0,4 0,6 операционного цикла в биореакторе. Дыхательная активность, мкл потребленного О2/выделенного СО2 14000 12000 10000 8000 6000 4000 2000 0 0 0,2 0,8 1 ОП600нм Рис. 22. Корреляционная зависимость дыхательной активности от показателя оптической плотности суспензии R. ruber ИЭГМ 231 в натрий-фосфатном буфере. Обозначения: ▲ – количество потребленного кислорода; ■ – количество выделенного углекислого газа; — – линия тренда. 110 С целью оценки жизнеспособности и контроля функциональной стабильности иммобилизованных клеток R. ruber и R. opacus в биореакторе нами разработан комбинированный метод количественной детекции и видовой дифференциации родококков, входящих в состав иммобилизованной бактериальной ассоциации. Суть метода в том, что первоначально путем окрашивания ИНТ и измерения оптической плотности экстракта формазана определяют общее число живых клеток родококков на носителе, а затем определяют видовую принадлежность бактерий путем постановки ПЦР с видоспецифическими праймерами. Данный метод позволяет выделять ДНК из иммобилизованных на носителе клеток, предварительно окрашенных ИНТ, либо после спиртовой экстракции образующегося формазана и получении достоверных результатов видовой ПЦР-детекции. По разработанному методу подана заявка на получение патента РФ № 2013121968/10(032290) от 13.05.2013 г., прошедшая стадию формальной экспертизы и находящаяся на стадии экспертизы по существу. Из электрофореграммы на рис. 23 видно, что после трехнедельного цикла в биореакторе успешно детектируются оба штамма родококков, входящих в состав иммобилизованной ассоциации. Также нами отмечено незначительное увеличение интенсивности окрашивания полос, характерных для R. ruber. По-видимому, это обусловлено ростом и последующей иммобилизацией данных бактерий на носителе в ходе процесса очистки нефтезагрязненной воды (Рубцова, 2011; Ahn et al., 2005), что согласуется с вышеописанными результатами респирометрии (см. рис. 21). При этом интенсивность окрашивания полос, соответствующих ампликонам R. opacus, оставалась неизменной, а значит, их количество в биореакторе существенно не изменялось. Полученные данные позволяют судить о стабильности используемой бактериальной ассоциации нефтезагрязненной воды в биореакторе. в процессе очистки 111 1 2 3 4 5 66 7 М 500 п.н. 400 п.н. 300 п.н. Рис. 23. Электрофореграмма в 1,5 % агарозном геле продуктов амплификации ДНК входящих в состав иммобилизованной ассоциации штаммов Обозначения: с использованием 1 – положительный видоспецифических контроль R. ruber праймеров. ИЭГМ 70Т; 2 – иммобилизованные клетки R. ruber ИЭГМ 615 свежеприготовленные; 3 – после очистки воды в биореакторе; 4 – положительный контроль R. opacus ИЭГМ 716Т; 5 – иммобилизованные клетки R. opacus ИЭГМ 249 свежеприготовленные; 6 – после очистки воды в биореакторе; 7 – отрицательный контроль; М – маркер молекулярного веса (AmpliSizeTM Molecular Ruler, Bio-Rad, США). Из рис. 24 видно, что число жизнеспособных клеток R. ruber после контакта с нефтезагрязненной водой в биореакторе возрастало в 1,2 раза по сравнению с исходным показателем, тогда как количество иммобилизованных клеток R. opacus существенно не изменялось. Таким образом, разработанный комбинированный метод пригоден для мониторинга функциональной активности штаммов микроорганизмов в составе иммобилизованного биокатализатора. На основании полученных данных можно сделать вывод о целесообразности многократного использования иммобилизованных на опилках клеток R. ruber и R. opacus для 112 биодеградации нефтяных углеводородов в условиях колоночного биореактора. 0,3 II I ОП480нм 0,2 0,1 0 R.R.ruber ruber R. opacus R. opacus Рис. 24. Оценка жизнеспособности иммобилизованных родококков из биореактора методом окрашивания ИНТ. Обозначения: I – нативные; II – адаптированные клетки. 113 Глава 8. ВОЗМОЖНЫЕ МЕХАНИЗМЫ АДАПТАЦИИ РОДОКОККОВ К УГЛЕВОДОРОДНЫМ ЗАГРЯЗНИТЕЛЯМ Известно, что эффективность биологической очистки сточных вод, загрязненных нефтепродуктами, во многом зависит от стабильной функциональной активности используемых микроорганизмов в условиях залпового поступления в реактор высококонцентрированных промышленных стоков, а также их способности адаптироваться к повышенным концентрациям загрязнителей (Леонов, Пищальник, 2005). В связи с этим, на следующем этапе работы нами были изучены возможные механизмы адаптации родококков к повышенным концентрациям углеводородов в условиях лабораторного колоночного биореактора. В ходе исследований установлено, что после контакта с модельной нефтью в условиях биореактора увеличивалась интенсивность роста десорбированых с поверхности носителя R.ruber и R. opacus в присутствии высоких (15-50 об.%) концентраций алифатических и полиароматических углеводородов (табл. 10 и 11). При этом оба адаптированных штамма интенсивнее росли в присутствии высоких концентраций (15-50 об.%) алифатических углеводородов (н-С11, н-С12, н-С14 и н-С16), а также нафталина. После цикла в биореакторе клетки R. ruber и R. opacus демонстрировали более интенсивный рост в присутствии 15 об.% пристана, антрацена и фенантрена. Кроме того, адаптированный R. opacus интенсивнее накапливал биомассу в присутствии 3 об.% фенола, тогда как R. ruber был способен расти даже при 15-25 об.% фенола. Таким образом, адаптация родококков устойчивости в биореакторе способствовала 38-40%-ому повышению исследуемых штаммов к нефтяным углеводородам, что существенно при поступлении в биореактор высококонцентрированных нефтезагрязненных сточных вод. 114 Таблица 10. Интенсивность роста (ΔОП630нм) нативных и адаптированных клеток R. ruber в присутствии нефтяных углеводородов Углеводородный субстрат н-С10 н-С11 н-С12 н-С14 пристан фенол фенантрен антрацен нафталин 3 0,629 ± 0,07 0,285 ± 0,03 0,370 ± 0,05 0,225 ± 0,03 0,158 ± 0,06 0,166 ± 0,02 0,353 ± 0,04 0,374 ± 0,02 0,757 ± 0,06 0,293 ± 0,04 0,411 ± 0,03 0,512 ± 0,04 0,623 ± 0,04 0,569 ± 0,06 0,437 ± 0,1 0,601 ± 0,06 0,466 ± 0,12 0,498 ± 0,1 0,487 ± 0,08 0,711 ± 0,05 6 0,377 ± 0,04 0,445 ± 0,1 0,651 ± 0,09 0,829 ± 0,1 0,640 ± 0,09 0,776 ± 0,12 0,380 ± 0,03 0,415 ± 0,04 0,511 ± 0,05 0,804 ± 0,06 0,707 ± 0,09 0,810 ± 0,03 0,684 ± 0,05 0,581 ± 0,03 0,303 ± 0,1 0,521 ± 0,07 0,23 ± 0,11 0,343 ± 0,09 0,626 ± 0,07 0,789 ± 0,07 15 0,462 ± 0,02 1,012 ± 0,2 0,573 ± 0,06 0,804 ± 0,04 0,663 ± 0,06 0,777 ± 0,04 0,372 ± 0,04 0,755 ± 0,06 0,511 ± 0,05 0,717 ± 0,06 0,247 ± 0,12 0,318 ± 0,03 0,84 ± 0,1 0,987 ± 0,08 0,286 ± 0,1 0,391 ± 0,1 0,410 ± 0,07 0,572 ± 0,05 0,633 ± 0,11 1,130 ± 0,13 25 0,613 ± 0,05 0,773 ± 0,1 0,508 ± 0,04 0,574 ± 0,04 0,665 ± 0,04 0,692 ± 0,04 0,358 ± 0,03 0,585 ± 0,07 0,399 ± 0,03 0,815 ± 0,05 0,460 ± 0,04 0,377 ± 0,03 0,80 ± 0,03 0,894 ± 0,05 0,288 ± 0,03 0,280 ± 0,03 0,34 ± 0,07 0,34 ± 0,1 0,639 ± 0,09 0,912 ± 0,1 50 1,149 ± 0,06 1,479 ± 0,1 0,467 ± 0,05 0,520 ± 0,07 0,608 ± 0,07 0,675 ± 0,05 0,250 ± 0,02 0,425 ± 0,07 0,363 ± 0,05 0,784 ± 0,05 0,616 ± 0,1 0,554 ± 0,08 0,828 ± 0,1 0,609 ± 0,05 0,396 ± 0,02 0,373 ± 0,03 0,453 ± 0,06 0,436 ± 0,1 0,781 ± 0,04 0,854 ± 0,05 Примечание. Здесь и в табл. 11 в числителе – нативные, в знаменателе – адаптированные клетки. н-С10; н-С11; н-С12; н-С14; н-С16 – н-декан; н-ундекан; н-додекан; н-тетрадекан; н-гексадекан. ОП630нм исходной суспензии составляла 0,5. 114 н-С16 Концентрация углеводородов, об.% 115 Таблица 11. Интенсивность роста (ΔОП630нм) нативных и адаптированых клеток R. opacus в присутствии нефтяных углеводородов Углеводородный субстрат н-С10 н-С11 н-С12 н-С14 пристан фенол фенантрен антрацен нафталин 3 0,287 ± 0,1 0,186 ± 0,06 0,131 ± 0,02 0,224± 0,02 0,108 ± 0,02 0,309 ± 0,09 0,201±0,07 0,277±0,04 0,390 ± 0,02 0,516 ± 0,03 0,419 ± 0,02 0,542 ± 0,05 0,416 ± 0,05 0,443 ± 0,04 0,221 ± 0,06 0,382 ± 0,03 0,465±0,12 0,623±0,07 0,552 ± 0,03 1,171 ± 0,02 6 0,233 ± 0,06 0,190 ± 0,07 0,210 ± 0,03 0,411 ± 0,08 0,187 ± 0,03 0,430 ± 0,07 0,237±0,02 0,371±0,05 0,519 ± 0,04 0,558 ± 0,03 0,251 ± 0,04 0,303 ± 0,06 0,392 ± 0,04 0,367 ± 0,04 0,249 ± 0,08 0,370 ± 0,05 0,367 ± 0,07 0,569 ± 0,09 0,671 ± 0,04 1,143 ± 0,06 15 0,193 ± 0,04 0,223 ± 0,07 0,549 ± 0,09 0,600 ± 0,07 0,621 ± 0,08 0,674 ± 0,11 0,245 ± 0,03 0,405 ± 0,07 0,432 ± 0,03 0,622 ± 0,04 0,679 ± 0,07 0,710 ± 0,06 0,443 ± 0,07 0,416 ± 0,06 0,278 ± 0,03 0,359 ± 0,03 0,362 ± 0,1 0,563 ± 0,09 0,687 ± 0,07 1,418 ± 0,09 25 0,513 ± 0,07 0,377 ± 0,1 0,704 ± 0,1 0,707 ± 0,07 0,498 ± 0,09 0,547 ± 0,08 0,254 ± 0,03 0,426 ± 0,07 0,470 ± 0,05 0,595 ± 0,02 0,704 ± 0,09 0,719 ± 0,06 0,284 ± 0,02 0,257 ± 0,04 0,182 ± 0,06 0,146 ± 0,05 0,343 ± 0,1 0,325 ± 0,09 1,073 ± 0,09 1,442 ± 0,05 50 0,397 ± 0,09 0,293 ± 0,04 0,681 ± 0,1 0,832 ± 0,1 0,463 ± 0,04 0,488 ± 0,14 0,287 ± 0,03 0,36 ± 0,12 0,553 ± 0,05 0,613 ± 0,03 0,422 ± 0,06 0,424 ± 0,06 0,115 ± 0,02 0,109 ± 0,03 0,240 ± 0,08 0,259 ± 0,03 0,420 ± 0,05 0,420 ± 0,03 0,667 ± 0,09 1,396 ± 0,02 115 н-С16 Концентрация углеводородов, об.% Проведенное атомно-силовое сканирование показало (рис. 25), что при взаимодействии родококков с модельной нефтью изменяется архитектура клеточной поверхности в сторону увеличения степени ее шероховатости на 26%. Это, очевидно, приводит к возрастанию площади контакта с гидрофобным субстратом, способствуя его эффективному поглощению клеткой, а также свидетельствует о возможном участии клеточной стенки в процессе адаптации родококков к углеводородам (Norman et al., 2002; de Carvalho, 2010). Нами отмечено, что увеличение шероховатости сопровождалось изменением размерных характеристик бактериальных клеток. Так адаптированные клетки R. opacus оказались менее широкими (на 0,03-0,05 мкм), но удлиненными до 3,0±0,2 мкм по сравнению с нативными клетками (2,5±0,4 мкм). Рис. 25. АСМ-изображения (слева) и топография поверхности (справа) нативных (А) и адаптированных (Б) жизнеспособных клеток R. opacus ИЭГМ 249. Атомно-силовое сканирование выполнено на базе Rhodococcusцентра ПГНИУ. 117 Степень гидрофобности клеточной стенки играет важную роль в поглощении углеводородов микроорганизмами посредством прямого контакта (Нестеренко и др., 1985; Куюкина и др., 2000). Результаты МАТНтеста показали (табл. 12), что сродство клеток адаптированного R. ruber к углеводородам повышалось на 15% по сравнению с нативными клетками. Таблица 12. Физико-химические свойства клеточной поверхности родококков Штамм Степень гидрофобности, % Суммарные клеточные липиды, мг/г сухого веса Электрокинетический потенциал, мВ R. ruber 35 ± 0,05 50 ± 0,03 0,91 ± 0,03 1,37 ± 0,03 -28,9 ± 0,4 -21,1 ± 1,8 R. opacus 47±0,02 15±0,01 1,95 ± 0,02 1,38 ± 0,1 -7,9 ± 0,5 -24,5 ± 0,8 Примечание. В числителе – нативные, в знаменателе – адаптированные клетки. Известно, что гидрофобность определяется количеством и составом липидов, входящих в состав клеточной стенки. Нами выявлена корреляционная зависимость (R = 0,99, р ≤ 0,01) между возрастанием степени гидрофобности клеточной стенки адаптированного R. ruber и содержанием суммарных клеточных липидов (см. табл. 12). Полученные результаты согласуются с литературными данными о повышении степени гидрофобности клеточной стенки при взаимодействии микроорганизмов с углеводородными субстратами (Куюкина и др., 2000; Pacwa-Płociniczak et al., 2011). Однако в случае R. opacus, гидрофобность десорбированных с поверхности носителя клеток была на 32% ниже, чем у исходного штамма (см. табл. 12). Гидрофилизация клеточной стенки R. opacus, по-видимому, способствует потреблению растворенной в воде фракции углеводородов. Такие условия 118 создаются в нефтезагрязненной колоночном воды, равной биореакторе при скорости подачи 2,0 мл/мин, когда наблюдается формирование псевдоожиженного слоя, способствующего повышению степени солюбилизации углеводородов в воде. В работе Kaczorek и Olszanowski (2011) показано, что снижение гидрофобности клеточной стенки Pseudomonas putida K1 компенсировалось синтезом биосурфактантов, физиологическая роль которых заключается в облегчении поступления углеводородов в клетку вследствие их эмульгирования. Аналогичный эффект отмечен нами для адаптированных клеток R. opacus и R. ruber (рис. 26), эмульгирующая активность которых (Е24) соответственно в 4 и 7 раз выше по сравнению с нативными клетками. Отмеченное ранее для клеток R. ruber увеличение сродства к углеводородным субстратам, дополняющееся возрастанием индекса эмульгирования, свидетельствует о том, что транспорт углеводородов в клетку родококков осуществляется как за счет гидрофобности клеточной стенки, так и путем предварительного эмульгирования (Bouchez-Naitali et al., 1999). Изменение сродства родококков к углеводородам в процессе адаптации сопровождалось изменением их электроповерхностных характеристик (см. табл. 12). Так, электрокинетический потенциал более гидрофобных клеток адаптированного R. ruber возрастал от -28,9 мВ (значение для исходного штамма) до -21,1 мВ. В то же время, снижение степени гидрофобности адаптированных в реакторе клеток R. opacus коррелировало с уменьшением их электрокинетического потенциала на 16,6 мВ. Таким образом, выявлена прямая зависимость (R = 0,98; р = 0,005) между показателем степени гидрофобности клеточной стенки и электрокинетическим потенциалом, что согласуется с ранее опубликованными данными (Рубцова и др., 2012; de Carvalho et al., 2009). Предположительно, возрастание электрокинетического потенциала клеток родококков обуславливает снижение степени их отталкивания от отрицательно заряженных молекул н-алканов. 119 А 80 II Индекс эмульгирования, % I 60 40 20 0 0,1 1 24 Время, ч Индекс эмульгирования, % Б 90 II I 60 30 0 0,1 1 24 Время, ч Рис. 26. Эмульгирующая активность (Е24) клеток R. ruber (А) и R. opacus (Б). I – нативные; II – адаптированные клетки. 120 При изучении антибиотикочувствительности родококков установлено (рис. 27), что оба штамма устойчивы к действию оксациллина. В отношении других антибиотиков R. ruber и R. opacus проявляли различную чувствительность, которая для большинства тестируемых антибиотиков была высокой (зона задержки роста 25,5-48 мм), что является характерной чертой актинобактерий рода Rhodococcus (Ившина, Куюкина, 1997). Адаптация родококков к углеводородам сопровождалась 35%-ным повышением антибиотикорезистентности иммобилизованных штаммов. При этом рост устойчивости к антибиотикам более выражен у адаптированного R. opacus (К = 0,23), который приобрел резистентность к канамицину и налидиксовой кислоте, в то время как коэффициент резистентности адаптированного R. ruber существенно не изменялся (К = 0,08). В то же время, клетки R. opacus после биореактора становились на 42% более чувствительными к действию карбеницеллина, подавляющего синтез клеточной стенки, тогда как чувствительность R. ruber увеличивалась на 2,4-13,9% в отношении ряда антибиотиков: тетрациклин < гентамицин < линкомицин. Выявленное повышение резистентности родококков к большинству исследуемых антибиотиков может быть обусловлено гидрофобизацией их клеточной стенки, а также иммобилизацией клеток, сопровождающейся частично образованием связывая внеклеточного антибиотические матрикса, вещества, который, препятствует их проникновению в клетки (Ившина, 1997; Куюкина и др., 2000; Miller, Bartha, 1989). Адаптация микроорганизмов к токсическому действию химических веществ может быть обусловлена не только изменением физико-химических свойств клеточной стенки, но и наличием плазмид, несущих гены устойчивости к углеводородам, антибиотикам и ионам тяжелых металлов (Larkin et al., 2010). Нами из клеток адаптированного R. ruber выделена плазмида размером около 15 т.п.н., не выявляемая экстракционного метода в исходном штамме (рис. 28). с помощью 121 А Диаметр стерильной зоны, мм 45 30 II I 15 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 9 10 11 12 13 Антибиотик Б Диаметр стерильной зоны, мм 50 I 40 30 II 20 10 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Антибиотик Рис. 27. Чувствительность исходных (I) и адаптированных (II) клеток R. ruber (А) и R. opacus (Б) к антибиотикам: 1 – гентамицину, 2 – канамицину, 3 – неомицину, 4 – стрептомицину, 5 – линкомицину, 6 – олеандомицину, 7 – эритромицину, 8 – ампициллину, 9 – карбеницеллину, 10 – оксациллину, 11 – тетрациклину, 12 – налидиксовой кислоте, 13 – фузидину. 122 1 2 3 4 55 66 7 8 М Размеры, п.н. 15000 10000 5000 Рис. 28. Агарозный гель-электрофорез плазмидной ДНК. Обозначения: 1 и 2 – исходные; 3 и 4 – адаптированные клетки R. ruber; 5 и 6 – исходные; 7 и 8 – адаптированные клетки R. opacus; М – маркер молекулярного веса ДНК. Известно, что копийность плазмид, несущих гены устойчивости бактерий к действию ксенобиотиков, увеличивается при длительном воздействии ингибирующего фактора, что определяет возможность адаптации микроорганизмов (Фомина и др., 1992; Begbie et al., 2005). Ранее у родококков других видов (R. erythropolis, R. globerulus, R. jostii, R. opacus) обнаружены плазмиды, размеры которых варьировали от 2,8 до 1123 т.п.н., кодирующие ферменты деградации алканов, ароматических углеводородов (бифенилов, протокатехолов, фенолов) и производных (тетрафталата, этилбензола), их а галогензамещенных также несущие гены устойчивости к тяжелым металлам (мышьяку, ртути, кадмию) (McLeod et al., 2006; Fetzner et al., 2007; Larkin et al., 2010). Однако нами в эксперименте по элиминированию плазмиды не выявлено связи между наличием плазмиды у адаптированного штамма R. ruber ИЭГМ 615 и его устойчивостью к антибиотикам. нуклеотидной В дальнейшем последовательности планируется провести выделенной сравнение плазмиды с опубликованными последовательностями плазмид других видов родококков 123 (Stecker et al., 2003; Lessard et al., 2004; Na et al., 2005; Matsui et al., 2006; Fetzner et al., 2007). Таким образом, подобранная на основе углеводородокисляющих штаммов R. ruber ИЭГМ 615 и R. opacus ИЭГМ 249 бактериальная ассоциация может быть использована для очистки нефтезагрязненной воды в биореакторе. Данные бактериальные культуры различаются по спектру потребляемых углеводородных субстратов, что позволяет более эффективно удалять углеводороды из загрязненной нефтью воды, а также снизить их токсическое действие на микробные клетки. Кроме того, в процессе очистки нефтезагрязненной воды в биореакторе формируется адаптированная к высоким концентрациям углеводородов популяция родококков, способная сохранять метаболическую активность высококонцентрированных Адаптированные потенциалом, залповом нефтезагрязненных родококки который при обладают зависит от сточных высоким их попадании вод. деградационным способности поглощать углеводородный субстрат. Показано, что для транспорта углеводородов клетки R. opacus используют механизм эмульгирования, в то время как у R. ruber данный процесс обусловлен еще и прямым контактом с углеводородными каплями. Установлено, что адаптация родококков к нефтяным углеводородам сопровождается изменением физико-химических характеристик клеточной антибиотикорезистентности. поверхности, а также увеличением 124 Глава 9. ОЧИСТКА ПРОМЫШЛЕННОЙ НЕФТЕЗАГРЯЗНЕННОЙ СТОЧНОЙ ВОДЫ В ЛАБОРАТОРНОМ КОЛОНОЧНОМ БИОРЕАКТОРЕ С ИММОБИЛИЗОВАННЫМИ РОДОКОККАМИ Далее нами была исследована возможность использования коиммобилизованных на гидрофобизованных опилках R. ruber и R. opacus для очистки промышленной нефтезагрязненной сточной воды в биореакторе. Как видно из табл. 13, применение иммобилизованной ассоциации родококков способствовало 67%-ному удалению нефтяных углеводородов из воды в течение двух недель, что в 2,5 раза эффективнее по сравнению с контролем (неинокулированным носителем). Полученные данные свидетельствуют о том, что основной механизм удаления углеводородов из загрязненной воды – их окислительная биодеградация иммобилизованными родококками (61%), а также физико-химическая адсорбция материалом носителя (26%). Таблица 13. Изменение содержания нефтепродуктов в загрязненной воде в процессе ее очистки в биореакторе Вариант опыта Содержание нефтепродуктов в воде, г/л исходное остаточное Эффективность очистки, % Опил с коиммобилизованными R. ruber и R. opacus 3,6 1,2 66 Неинокулированный носитель 3,6 2,7 26 Степень окисления индивидуальных углеводородов, входящих в состав промышленной нефтезагрязненной воды, иммобилизованными родококками составила от 17 до 89% (рис. 29). Об активации процесса деструкции алифатических углеводородов микроорганизмами судили по изменению углеводородного индекса (Ki), который рассчитывали как отношение суммы 125 А Б Рис. 29. промышленной ГХ-МС сточной хроматограммы воды. Варианты углеводородной опыта: А – фракции исходная нефтезагрязненная вода; Б – нефтезагрязненная вода после обработки в биореакторе. 126 пристана и фитана к сумме С18 и С19. Так для исходного образца этот индекс был равен 0,9, тогда как после очистки нефтезагрязненной воды в биореакторе, заполненном опилками с иммобилизованными родококками, увеличивался до 2,9 и превышал таковой для неинокулированного носителя в 1,7 раза. Из рис. 30 видно, гидрофобизованные опилки обладают высокой (5090%) адсорбционной емкостью в отношении тяжелых металлов. При этом удаление из нефтезагрязненной воды солей Cr, Fe, Co, Cu, и Hg 3 происходило за счет их сорбции носителем, о чем свидетельствуют равные показатели эффективности их извлечения как с использованием неинокулированного носителя, так хвойных опилок с адсорбированными родококками. Эффективность извлечения, % 100 80 60 40 20 0 Cr Cr3+ Mn Mn2+ Fe Fe2+ Co Со2+ иммобилизованные клетки Cu Cu3+ Zn Zn2+ Mo Mo4+ Hg Hg2+ неинокулированный носитель Рис. 30. Эффективность удаления тяжелых металлов в процессе очистки промышленной сточной воды в биореакторе. Содержание солей тяжелых металлов определено сотрудником аналитической лаборатории Центра SETN университета Статклайд (Великобритания) к.б.н. Т.А. Пешкур. 3 127 В то же время, иммобилизация родококков на носителе способствовала 3-10%-ному повышению степени извлечения солей Mn, Zn и Mo по сравнению с неинокулированным носителем. 128 ЗАКЛЮЧЕНИЕ Способность актинобактерий рода Rhodococcus окислять широкий спектр нефтяных углеводородов и ксенобиотиков обусловлена гидрофобной природой их клеточной стенки и синтезом биосурфактантов, а также сложным морфогенетическим циклом развития и склонностью к клеточной агрегации, которые, в сочетании со способностью родококков выживать в неблагоприятных условиях среды, делают их биотехнологически перспективной группой, используемой в очистке нефтезагрязненных сред, в том числе промышленных сточных вод (Ившина и др., 2007; Bell et al. 1998; Larkin et al., 2005; Martínkova et al., 2009; Kuyukina, Ivshina, 2010). Иммобилизация родококков на поверхности носителя позволяет более эффективно окислять углеводороды нефти по сравнению с суспендированными клетками (Криворучко, 2008; Kuyukina et al., 2006). При этом необходимым условием результативности процесса является достижение высокой численности прочно закрепленной на носителе активной биомассы. В связи с этим, для иммобилизации алканотрофных родококков отобраны хвойные опилки, которые за счет шероховатостей и выступов имеют высокую удельную площадь поверхности для адсорбции клеток. В результате проведенных исследований показано, что динамика процесса иммобилизации родококков на древесных опилках зависит от типа используемого биореактора (колоночного или с перемешиванием) и гидродинамических условий. На основе экспериментально полученных данных методом математического моделирования подобран оптимальный скоростной режим (2 мл/мин) подачи клеточной суспензии при котором в колоночном биореакторе за счет высокой вероятности (3,5∙10-5) иммобилизации клетки при ее столкновении с частицей носителя, за минимальный промежуток времени (73 ч) адсорбировалось максимальное число (55%) родококков, а также устанавливалось динамическое равновесие между процессами сорбции свободных и десорбцией иммобилизованных 129 клеток. Кроме того, установлено, что опилок к для повторное использование хвойных иммобилизации алканотрофных сокращению продолжительности 2-кратному родококков приводит иммобилизационного процесса и достижению высокой (1,7 × 107 клеток/г носителя) концентрация биомассы в реакторе, которая превышает таковую для нативных опилок в 1,5 раза. Кроме того, использование реактора колоночного типа позволяет проводить процессы иммобилизации бактерий и очистки загрязненной воды в непрерывном режиме (Сироткин и др., 2007; Doaa, Wafaa, 2009). Известно, что немаловажным фактором, определяющим эффективность биотехнологического процесса, является время гидравлического пребывания (ВГП) загрязняющего вещества, которое зависит от скорости его подачи в биореактор (Martinov et al., 2010). При этом за счет высокой концентрации активной биомассы на носителе процесс может быть высокоэффективным даже при снижении ВГП (Cuenca et al., 2006). Установлено, что увеличение скорости подачи модельной нефтезагрязненной воды в биореактор от 0,6 до 2 мл/мин сопровождалось возрастанием эффективности ее очистки ассоциацией иммобилизованных R. ruber и R. opacus от 72 до 86%. При этом интенсивность биодеградации нормальных алканов (90%) и пристана (67%) была на 7-16% выше соответствующих показателей для более низких скоростей. Экспериментально обоснована целесообразность многократного использования иммобилизованной ассоциации родококков для деградации углеводородов в биореакторе. Показано, что повторное использование родококков для очистки новой порции загрязненной воды в реакторе сопровождалось увеличением интенсивности окисления углеводородных компонентов на 26% и 22% после 2-го и 3-го цикла соответственно. Принимая во внимание тот факт, что многократное использование биокатализаторов предусматривает поддержание их функциональной стабильности (Gómez et al., 2006), следует отметить, что высокая степень деградации углеводородов (86-89%) сочеталась с высокой дыхательной 130 активностью (средняя скорость потребления кислорода составляет 1,6 мкл/мин, а выделения углекислого газа – 0,7 мкл/мин), которая после цикла в биореакторе увеличивалась в 2,1-2,3 раза. В ходе работы для оценки жизнеспособности и контроля функциональной стабильности иммобилизованных клеток в биореакторе разработан комбинированный метод количественной детекции и видовой дифференциации родококков, входящих в состав иммобилизованной бактериальной ассоциации. На основе полученных с его помощью данных видно, что после трехнедельного цикла в биореакторе успешно детектировались оба используемых штамма (R. ruber ИЭГМ 615 и R. opacus ИЭГМ 249), свидетельствуя о функциональной активности родококков в составе иммобилизованного биокатализатора. В ходе исследований показана возможность адаптации родококков к нефтяным углеводородам в условиях колоночного биореактора, в котором формируется устойчивая к высоким ассоциация иммобилизованных концентрациям бактерий, нефтепродуктов способных сохранять метаболическую активность при залповом сбросе высококонцентрированных стоков. При этом показано, что входящие в состав ассоциации родококки используют разные механизмы адаптации. Так для транспорта углеводородов клетки R. opacus свидетельствует 4-х используют кратное механизм повышение эмульгирования, эмульгирующей о чем активности по сравнению с исходным штаммом, в то время как у R. ruber данный процесс обусловлен еще и прямым контактом с углеводородными каплями (Whyte et al., 1999). Возрастанию площади контакта с углеводородным субстратом способствует увеличение степени шероховатости клеточной поверхности (Norman et al., 2002; de Carvalho, 2010), а также гидрофобности клеточной стенки в процессе адаптации родококков. Возрастание степени гидрофобности клеточной стенки адаптированного R. ruber обусловлено 50%-ным увеличением содержания липидов, что также сопровождалось возрастанием электрокинетического потенциала клеток (от -28,9 мВ для 131 исходного штамма до -21,1 мВ у адаптированных клеток). В то же время, гидрофилизация клеточной стенки адаптированных R. opacus коррелировала с уменьшением их электрокинетического потенциала на 16,6 мВ. Кроме того установлено, что адаптация родококков к углеводородам в биореакторе сопровождалась повышением их антибиотикорезистентности. При этом рост устойчивости к антибиотикам был более выражен у адаптированного R. opacus, который приобрел резистентность к канамицину и налидиксовой кислоте, в то время как коэффициент резистентности R. ruber после цикла в биореакторе статистически значимо не изменялся. В лабораторных экспериментах по очистке промышленной нефтезагрязненной воды с применением иммобилизованной ассоциации родококков степень удаления нефтяных углеводородов из воды в течение двух недель составила 67%, что в 2,5 раза эффективнее по сравнению с контрольными показателями для неинокулированного носителя. При этом иммобилизация родококков на носителе способствует повышению степени извлечения Mn, Zn и Mo на 3-10% по сравнению с контролем. Полученные данные свидетельствуют о возможности использования иммобилизованной ассоциации R. ruber и R. opacus в биотехнологическом процессе очистки нефтезагрязненной воды с псевдоожиженным слоем. в условиях колоночного биореактора 132 ВЫВОДЫ × 107 клеток/г опилках достигается 1. Показано, что эффективная иммобилизация (1,7 носителя) родококков на гидрофобизованных в колоночном биореакторе при скорости подачи клеточной суспензии 2,0 мл/мин и повторном использовании органического носителя. 2. Установлено, что степень биодеградации модельной нефти иммобилизованной ассоциацией R. ruber и R. opacus составляет 86-89% после 1-3 циклов обработки загрязненной воды в биореакторе. 3. Выявлено, что адаптация родококков к нефтяным углеводородам сопровождается повышением их антибиотикорезистентности, изменением поверхностных свойств (шероховатость клеточной поверхности, гидрофобность, электрокинетический потенциал), а также содержания клеточных липидов и биосурфактантов. 4. Разработан метод видовой ПЦР-дифференциации жизнеспособных клеток R. ruber и R. opacus, иммобилизованных на органическом носителе в условиях биореактора. 5. Эффективность очистки промышленной нефтезагрязненной воды в колоночном биореакторе с использованием иммобилизованных родококков составляет 67% в течение двух недель. 133 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Алканотрофные родококки как катализаторы процесса биодеструкции непригодных к использованию лекарственных средств / И.Б. Ившина, М.И. Рычкова, Е.В. Вихарева [и др.] // Прикладная биохимия и микробиология. – 2006. − Т. 42, № 4. – С. 443-447. 2. Бактерии рода Rhodococcus грунтовых вод района нефтяных месторождений Пермского Предуралья / И.Б. Ившина [и др.] // Микробиология. − 1981. − Т. 50, Вып. 4. − С. 709-717. 3. Биотехнология / Под. ред Н.С. Егорова, А.В. Олескин. Кн. 1: Проблемы и перспективы / Н.С. Егорова, А.В. Олескин, В.Д. Самуилов. – М.: ВШ., 1987. – 159 с. 4. Бирюков, В.В., Барбот, В.С. Основные направления разработки аппаратуры для биосинтеза микробных метаболитов иммобилизованными клетками аэробных микроорганизмов: сб. науч. трудов «Иммобилизованные клетки в биотехнологии». – Пущино, 1987. – С. 163-173. 5. Взаимосвязь кинетики роста и дыхания у родококков в присутствии высоких концентраций солей / В.К. Плакунов [и др.] // Микробиология. – 1999. –Т. 68, № 1. – С. 40-44. 6. Влияние катаболических плазмид на физиологические параметры бактерий рода Pseudomonas на эффективность биодеградации нефти / А.А. Ветрова [и др.] // Микробиология. – 2007. – Т. 76, № 3. – С. 354-360. 7. Влияние состава клеточных липидов на формирование неспецифической антибиотикорезистентности алканотрофных родококков / М.С. Куюкина, И.Б. Ившина, М.И. Рычкова, О.Б. Чумаков // Микробиология. − 2000. − Т. 69, № 1. − С. 62-69. 8. Гвоздяк, П.И. Иммобилизованные микроорганизмы в очистке сточных вод от ксенобиотиков: сб. науч. трудов «Иммобилизованные клетки в биотехнологии». – Пущино, 1987. – С. 57-61. 9. Гоготов, И.Н. Образование поверхностно-активных веществ бактерией Rhodococcus erythropolis SH-5 при росте на разных источниках 134 углерода / И.Н. Гоготов, P.C. Ходаков // Прикладная биохимия и микробиология. – 2008. – Т. 44, № 2. – С. 207-212. 10. Гостев, В.В. Антибиотикорезистентность микрофлоры ран открытых переломов (II сообщение) / В.В. Гостев, З.С. Науменко, И.И. Мартель // Травматология и ортопедия России. – 2010. – Т. 55, №1. – С. 33-37. 11. Деградация 2,4-динитрофенола свободными и иммобилизованными клетками Rhodococcus erythropolis HL PM-1 / А.Е. Китова [и др.] // Прикладная биохимия и микробиология. – 2004. – Т. 40, № 3. – С. 307-311. 12. Деградация фенантрена и антрацена бактериями рода Rhodococcus / Н.А. Ленева [и др.] // Прикладная биохимия и микробиология. – 2009. – Т. 45, № 2. – С. 188-194. 13. Евтушенков А.Н. Введение в биотехнологию: курс лекций / А.Н. Евтушенков, Ю.К. Фомичев. – Мн.: БГУ, 2002. – 105 с. 14. Егоров, Н.С. Биосинтез биологически активных веществ иммобилизованными клетками микроорганизмов / Н.С. Егоров, Н.С. Ландау, Е.А. Борман // Прикладная биохимия и микробиология. – 1984. – Т.20, № 5. – С. 579-592. 15. Егорова, Т.А. Основы биотехнологии: учеб. пособие для вузов по специальности «Биология» / Т.А. Егорова, С.М. Клунова, Е.А. Живухина. – М.: Академия, 2003. − 208 с. 16. Елькин, А.А. Окислительная биотрансформация тиоанизола клетками Rhodococcus rhodochrous ИЭГМ 66 / А.А. Елькин, В.В. Гришко, И.Б. Ившина // Прикладная биохимия и микробиология. – 2010. – Т. 46, № 6.– С. 637-643. 17. Ефременко, Е.Н. Влияние длительного хранения клеток микроорганизмов, иммобилизованных в криогель поливинилового спирта, на их выживаемость и биосинтез целевых метаболитов / Е.Н. Ефременко, Н.Ю. Татаринова. − Микробиология. − 2007. − Т.76, № 3. − C. 383-389. 135 18. Ефременко, Е.Н. / Гетерогенные биокатализаторы на основе иммобилизованных клеток микроорганизмов: фундаментальные и прикладные аспекты: автореф. дис…. д–ра. биол. наук : 03.00.02, 03.00.23 / Ефременко Елена Николаевна. – М., 2009. – 53 с. 19. Жуков, Д.В. Механизмы деградации углеводородов нефти микроорганизмами / Д.В. Жуков, В.П. Мурыгина, С.В. Калюжный // Успехи современной биологии. – 2006. – Т. 126, № 3. – С. 285-296. 20. Жуков, Д.В. Кинетические закономерности биодеградации алифатических углеводородов бактериями Rhodococcus ruber и Rhodococcus erythropolis / Д.В. Жуков, В.П. Мурыгина, С.В. Калюжный // Прикладная биохимия и микробиология. – 2007. – Т. 43. – № 6. – С. 657-663. 21. Жукова, О.В. Взаимодействие микроорганизмов с твердыми поверхностями – сорбентами при снятии локального нефтяного загрязнения / О.В. Жукова, Н.В. Морозов // Вестник ТГГПУ. − 2010. − Т. 21, № 3 − С. 99-106. 22. Зайцева, Е.А. Изучение биокатализаторов и возможностей их практического использования в рамках Федеральной целевой научнотехнической программы России «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники» / Е.А. Зайцева, Т.А. Осипова // Вестн. Моск. ун-та. сер. 2. Химия. − 2006. − Т. 47, № 1. − С. 4-14. 23. Звягинцев, Д.Г. Взаимодействие микроорганизмов с твердыми поверхностями / Д.Г. Звягинцев. – М.: Изд-во МГУ, 1973. − 176 с. 24. Звягинцев, Д.Г. Почва и микроорганизмы / Д.Г. Звягинцев. – М.: Изд-во МГУ, 1987. – 255 с. 25. Ившина, И.Б. Пропанокисляющие родококки / И.Б. Ившина, Р.А. Пшеничнов, А.А. Оборин. − Свердловск: УНЦ АН СССР, 1987. − 125 с. 26. Ившина, И.Б. Антибиотикочувствительность родококков, культивируемых на разных средах / И.Б. Ившина, Т.Н. Каменских, Г.И. Козырева // Факторы и механизмы регуляции развития бактериальных 136 попуяций: Труды / УрО РАН. Ин-т экологии и генетики микроорганизмов. − Свердловск: УНЦ АН СССР, 1990. − С. 92-98. 27. Ившина, И.Б. Экологические аспекты использования родококков – новых продуцентов биосурфактантов / И.Б. Ившина, М.С. Куюкина, М.И Рычкова // Экологическая безопасность зон градопромышленных агломераций Западного Урала. – Пермь, 1993. – С. 29-30. 28. Ившина, И.Б. Бактерии рода Rhodococcus (иммунодиагностика, детекция, биоразнообразие) : дис. … д–ра биол. наук : 03.00.07 / Ившина Ирина Борисовна. – Пермь, 1997. – 197 с. 29. Ившина, И.Б. Селективное выделение пропанокисляющих родококков с использованием антибиотических веществ / И.Б. Ившина, М.С. Куюкина // Микробиология. – 1997. – Т. 66, № 4. – С. 494-500. 30. Ившина, И.Б. Адаптационные механизмы выживания алканотрофных родококков, реализованные в неблагоприятных условиях среды / И.Б.Ившина, Т.Н. Каменских, Б.А. Анохин // Вестник Пермского университета. – 2007. – Вып. 5 (10). – С. 107-112. 31. Ившина, И.Б. Адаптационные механизмы неспецифической устойчивости алканотрофных актинобактерий к ионам тяжелых металлов / И.Б. Ившина, М.С. Куюкина, Л.В. Костина // Экология. – 2013. – № 2. – С. 115-123. 32. Ильина, Т.С. Биопленки как способ существования бактерий в окружающей среде и организме хозяина: феномен, генетический контроль и системы регуляции их развития / Т.С. Ильина, М.Ю. Романова, А.Л. Гинцбург // Генетика. − 2004. − Т. 40, № 11. − С. 1445-1456. 33. Илялетдинов, А.Н., Алиева, Р.М. Микробиологическая очистка промышленных сточных вод микроорганизмов-деструкторов: сб. иммобилизованными науч. трудов клетками «Иммобилизованные клетки в биотехнологии». – Пущино, 1987. – С. 62-71. 34. Иммобилизация клеток метанокисляющих бактерий / В.И. Карпенко [и др.] // Микробиология. − 1980. − Т. 49, Вып. З. − С. 479-484. 137 35. Иммобилизация на углеродных волокнах уксуснокислых и использование их бактерий для трансформации тиодигликоля / Н.Г. Медведева [и др.] // Биотехнология. − 2001. − № 5. − С. 51-57. 36. Иммобилизованные клетки микроорганизмов / А.П. Синицын, Е.И. Райнина, В.И. Лозинский, С.Д. Спасов. – М.: Изд-во МГУ, 1994. – 288 с. 37. Использование иммобилизованных на керамзите клеток нефтеокисляющих микроорганизмов для очистки воды от нефти / Т.П. Пирог [и др.] // Прикладная биохимия и микробиология. – 2005а. – Т. 41. – № 1. – С. 58-63. 38. Касаткин, А.Г. Основные процессы и аппараты химической технологии. – М.: Химия, 1973. – 750 c. 39. Кейтс, М. Техника липидологии. Выделение, анализ и идентификация липидов. – М.: Мир, 1975. – 324 с. 40. Коваленко, для биологически Г.А. активных Углеродные веществ материалы и как адсорбенты бактериальных клеток / Г.А. Коваленко, В.А. Семиколенов, Е.В. Кузнецова // Коллоидный журнал. – 1999. − Т. 61, № 6. − С. 787-795. 41. Коронелли, Т.В. Изменение ультраструктуры клеток сапротрофных микобактерий под влиянием изониазида / Т.В. Коронелли, Т.В. Калюжная // Микробиология. – 1983. – Т. 52, Вып. 2. – С. 278-281. 42. штаммов Коронелли, Т.В. Поверхностно-активные свойства некоторых углеводородокисляющих бактерий / Т.В. Коронелли, С.Г. Юферова // Вестн. Моск. ун-та. Сер. 16. Биология. – 1990. – № 1. – С. 14-18. 43. Коронелли, Т.В. Принципы и методы интенсификации биологического разрушения углеводородов в окружающей среде (обзор) / Т.В. Коронелли // Прикладная биохимия и микробиология. – 1996. – Т. 32, № 6. – С. 579-585. 138 44. Кощеенко, К.А., Суходольская Г.В. Иммобилизация клеток микроорганизмов: сб. науч. трудов «Иммобилизованные клетки в биотехнологии». – Пущино, 1987. − С. 4-15. 45. Криворучко, А.В. Адсорбционная иммобилизация клеток алканотрофных родококков : дис. … к–та биол. наук : 03.00.07 / Криворучко Анастасия Владимировна. – Пермь, 2008. – 174 c. 46. Куюкина, М.С. Биосурфактанты актинобактерий рода Rhodococcus: индуцированный биосинтез, свойства, применение: дис. … д–ра биол. наук : 03.00.07 / Куюкина Мария Станиславовна. – Пермь, 2006. – 295 с. 47. Лейкин, Ю.А. Саморегенерирующиеся сорбенты для очистки воды от нефтяных углеводородов / Ю.А. Лейкин, Т.А. Черкасова, Н.А. Смагина // Сорбционные и хроматографические процессы. − 2008. − Т. 8, Вып. 4. − С. 585-599. 48. Лейкин, Ю.А. Вермикулитовый сорбент для очистки воды от нефтяных углеводородов / Ю.А. Лейкин, Т.А. Черкасова, Н.А. Смагина // Сорбционные и хроматографические процессы. − 2009. − Т. 9, Вып. 1. − С. 104-117. 49. Леонов, А.В. Анализ условий трансформации нефтяных углеводородов в морских водах и моделирование процесса в заливе Анива / А.В. Леонов, В.М. Пищальник // Качество и охрана вод, экологические аспекты. – 2005. – Т. 32, № 6. – С. 712-726. 50. Махлин, В.А. Разработка и анализ гетерогенно-каталитических процессов и реакторов / В.А. Махлин // Теоретические основы химической технологии. – 2009. – Т. 43, № 3. – с. 261-275. 51. Методические микроорганизмов к указания по определению чувствительности антибиотикам методом диффузии в агар с использованием дисков. – М.: Мин. здрав. СССР, 1983. – 16 с. 52. Микробная трансформация фенантрена и антарцена М.А. Бабошин [и др.] // Микробиология. – 2005. – Т. 73, № 3. – С. 357-364. / 139 53. Молекулярная генетика: учеб.-метод. пособие / под. ред. С.В. Боронниковой. – Пермь: Перм. ун-т., 2007. – 150 с. 54. Нестеренко, О.А. Нокардиоподобные и коринеподобные бактерии. / О.А. Нестеренко, Е.И. Квасников, Т.М. Ногина. – Киев.: Наукова думка, 1985. – 336 с. 55. Нефтеокисляющий штамм Rhodococcus erythropolis B2 как основа создания биопрепарата для ликвидации углеводородных загрязнений и рекультивации земель [Электронный ресурс] / Э.В. Карасева [и др.] // Политематический сетевой электронный научный журнал Кубанского государственного аграрного университета (Научный журнал КубГАУ). – 2012. – Т. 83, № 9. – Режим доступа: http://ej.kubagro.ru/2012/09/pdf/34.pdf. [26.03.2013] 56. Николаев, Ю.А. Внеклеточные факторы адаптации бактерий к неблагоприятным условиям среды / Ю.А. Николаев // Прикладная биохимия и микробиология. − 2004. − Т. 40, № 4. − С. 387-397. 57. Николаев, Ю.А. Биопленка – “город микробов” или аналог многоклеточного организма? / Ю.А. Николаев, В.К. Плакунов // Микробиология. − 2007. − Т. 76, № 2. − С. 149-163. 58. Образование поверхностно-активных веществ при росте штамма Rhodococcus erythropolis ЭК-1 на гидрофильных и гидрофобных субстратах / Т.П. Пирог [и др.] // Прикладная биохимия и микробиология. – 2005б. – Т. 40, № 5. – С. 544-550. 59. Оценка эффективности литического действия пептидогликангидролаз на основе дыхательной активности клеток тесткультуры / Н.В. Зырина [и др.] // Вестник биотехнология. – 2008. – Т. 4, № 2. – С. 5-11. 60. Пат. 2023686 Российская Федерация, МПК7 C02F3/34, E02B15/04, C12P39/00. Консорциум микроорганизмов Rhodococcus sp., Rhodococcus maris, Rhodococcus erythropolis, Pseudomonas stutzeri, Candida sp., используемый для очистки почвенных и солоноватоводных экосистем 140 от загрязнения нефтепродуктами / и патентообладатель Борзенков И.А., [и др.]; заявитель Научно-производственное объединение «Биотехинвест». – N 5031873/13; заявл. 13.04.1992; опубл. 30.11.1994. 61. Пат. 2053205 Российская Федерация, МПК7 C02F3/34, C09K3/32, B09C1/10, B09C101:00. Биопрепарат для очистки почвы и воды от нефти и нефтепродуктов / Белонин М.Д., [и др.]; заявитель и патентообладатель Всеросс. нефтяной научн. исслед. геологоразведочный ин-т. – N 94034274/13; заявл. 29.09.1994; опубл. 27.01.1996. 62. Пат. 2143947 Российская Федерация, МПК7 B01J20/16, B01J20/00, C02F3/34, B09C1/08, B09C1/10. Сорбент для очистки природных вод и почвы от нефтяных загрязнений «Москат» / Ладыгин А.В.; заявитель и патентообладатель Общество с ограниченной ответственностью «Адекватные технологии». – N 99116475/12; заявл. 05.08.1999; опубл. 10.01.2000. 63. Пат. 2191752 Российская Федерация, МПК7 C02F3/34, B09C1/10, C12N1/26, C12N1/26, C12R1:01, C12N1/26, C12R1:32. Биопрепарат для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов / Холоденко В.П., [и др.]; заявитель и патентообладатель Государственный научный центр прикладной микробиологии. – N 99120413/13; заявл. 27.09.1999; опубл. 27.10.2002. 64. Пат. 2193533 Российская Федерация, МПК7 С02F3/34, В09С1/10. Биопрепарат для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов / Чугунов В.А., [и др.]; заявитель и патентообладатель Государственный научный центр прикладной микробиологии. – N 99120414/13; заявл. 27.12.1999; опубл. 27.11.2002. 65. C12N Пат. 2365438 Российская Федерация, МПК7 B09C 1/10, C02F 3/34, 1/26. Биопрепарат для очистки почвы и воды от нефти и нефтепродуктов / Карасева Э.В., [и др.]; заявитель и патентообладатель Государственное образовательное учреждение высшего профессионального 141 образования «Кубанский государственный университет». – N 2006121832/13; заявл. 21.06.2006; опубл. 27.08.2009. Пат. 2384616 Российская Федерация, МПК7 C12N1/26, C02F3/34, 66. B09C1/10. Консорциум штаммов микроорганизмов для очистки окружающей среды от углеводородов / Самсонов Р.О., [и др.]; заявитель и патентообладатель Общество с ограниченной ответственностью «Научн. исслед. ин-т природных газов и газовых технологий - Газпром ВНИИГАЗ». – N 2008109565/13; заявл. 12.03.2008; опубл. 20.03.2010. 67. Пат. 2395583 Российская Федерация, МПК7 C12Q1/68, C12Q1/25, C12Q1/04. Способ детекции микроорганизма и набор для детекции микроорганизма / Соедзима Т.,. Синити Е; заявитель и патентообладатель Моринага Милк Индастри Ко. – N. 2007149047/13; заявл. 17.02.2006; опубл. 27.07.2010. 68. Перспектива использования бактерий рода Rhodococcus и микробных поверхностно-активных веществ для деградации нефтяных загрязнений / Е.В. Карпенко [и др.] // Прикладная биохимия и микробиология. − 2006. − Т. 42, № 2. − С. 175-179. 69. Пирог, Т.П. Интенсификация синтеза поверхностно–активных веществ при культивировании Rhodococcus erythropolis ЭК-1 на гексадекане / Т.П. Пирог, Т.А. Шевчук, Ю.А. Клименко // Прикладная биохимия и микробиология. – 2010. − Т. 46, № 6. − С. 651-658. 70. Плакунов, В.К. Микробные биопленки: перспективы использования при очистке сточных вод / В.К. Плакунов, Ю.А. Николаев // Вода: Химия и экология. – 2008. – № 2. – С. 11-13. 71. Плешакова, Е.В. Интродукция нефтеокисляющих микроорганизмов в загрязненную почву: проблемы и перспективы / Е.В. Плешакова, Е.В. Дубровская, О.В. Турковская // Микроорганизмы и биосфера: Мат. Международной научной конференции. – Москва, 2007. − С. 97-98. 142 72. Плотникова, ароматических Е.Г. углеводородов и Бактерии-деструкторы их хлорпроизводных: разнообразие, особенности метаболизма, функциональная геномика : дис. д–ра биол. наук : 03.02.03 / Плотникова Елена Генриховна. – Пермь, 2010. – 330 с. 73. Разработка технологии очистки сточной воды с использованием иммобилизованной микрофлоры / Н.В. Кобызева [и др.] // Вестник ОГУ. – 2009. – № 1. – С. 104-107. 74. Рачинский, В.В. Локализация окисления н-парафинов дрожжами / В.В. Рачинский, Е.Г. Давидова, А.И. Лопатышкина // ДАН СССР. – 1971. – Т. 200, № 2. – С. 457-460. 75. Респираторная активность бактерии Acinetobacter calcoaceticus ТМ-31 при ассимиляции алкановых углеводородов / О.В. Игнатов [и др.] // Прикладная биохимия и микробиология. – 2000. – Т. 36, № 5. − С. 555-558. 76. Рубцова, Е.В. Адгезия клеток родококков к жидким углеводородам и их производным : дис. … к–та биол. наук : 03.02.03 / Рубцова Екатерина Владиславовна. – Пермь, 2011. – 188 c. 77. Рубцова, Е.В. Влияние условий культивирования на адгезивную активность родококков в отношении н-гексадекана / Е.В. Рубцова, М.С. Куюкина, И.Б. Ившина // Прикладная биохимия и микробиология. − 2012. − Т. 48, № 5. − С. 501-509. 78. Рымовская, М.В. Биосорбционная очистка сточной воды производства полимеров / М.В. Рымовская, Н.С. Ручай // Биотехнология. – 2008. – № 2. – С. 51-58. 79. Сироткин, А.С. Агрегация микроорганизмов: флоккулы, биопленки, микрбные гранулы / А.С. Сироткин, Г.И. Шагинурова, К.Г. Ипполитов. − Казань: Изд-во «Фəн» АН РТ, 2007. − 160 с. 80. Справочник биохимика / Р. Досон, Д. Эллиот, У. Эллиот, К. Джонс. – М.: Мир, 1991. – 544 с. 143 81. Структурно- функциональная характеристика бактериальных биопленок / Т.А. Смирнова [и др.] // Микробиология. – 2010. – T. 79, № 4. – С. 435-446. 82. Углеродсодержащие макроструктурированные керамические носители для адсорбционной иммобилизации ферментов и микроорганизмов. III. Биокаталитические свойства адсорбированной инвертазы / Г.А. Коваленко [и др.] // Биотехнология. − 2003. − № 4. − С. 52-62. 83. Углеродсодержащие макроструктурированные керамические носители для адсорбционной иммобилизации ферментов и микроорганизмов. 5. Адсорбционная иммобилизация нерастущих клеток дрожжей и растущих клеток алканотрофных родококков / Г.А. Коваленко, Л.В. Перминова, Т.В. Чуенко, И.Б. Ившина, М.С. Куюкина, М.И. Рычкова [и др.] // Биотехнология. – 2006. − № 1. − С. 76-83. 84. Утилизация нефти в почве и воде микробными клетками / Л.Ф. Суржко [и др.] // Микробиология. – 1995. – Т. 64, № 3. – С. 393-398. 85. сорбции Физико-химические основы иммобилизации клеток методом (Обзор) / Е.И. Козляк [и др.] // Прикладная биохимия и микробиология. – 1991. − Т. 27, Вып. 6. − С. 788-801. 86. Фомина Л.И., Филатова Л.Б., Волкова М.А. Генно-инженерные подходы к конструированию челночного вектора для Rhodococcus spp. : сб. научн. трудов ИЭГМ УрО АН СССР «Физиология и биохимия микроорганизмов». − Екатеринбург: УрО РАН, 1992. − С. 69-75. 87. Юдин, И.П. Современные подходы к оценке жизнеспособности бактерий с акцентом на феномене некультурабельности / И.П. Юдин // Труды / Института микробиологии и иммунологии им. И.И. Мечникова АМН Украины. − 2007. − №3. − С. 8-15. 88. “Biofilmology”: a multidisciplinary review of the study of microbial biofilms / E. Karunakaran [et al.] // Applied Microbiology and Biotechnology. − 2011. − V. 90, N. 6. − Р. 1869-1881. 144 89. A small cryptic plasmid from Rhodococcus erythropolis: characterization and utility for gene expression / K. Kostichka [et al.] // Applied Microbiology and Biotechnology. – 2003. – V. 62, N. 1. – P. 61-68. 90. A three-dimensional numerical study on the correlation of spatial structure, hydrodynamic conditions, and mass transfer and conversion in bioflms / H.J. Eberl [et al.] // Chemical Engineering Science. − 2000. − V. 55, N. 24. − Р. 6209-6222. 91. Abed, R.M. Bacterial diversity of a cyanobacterial mat degrading petroleum compounds at elevated salinities and temperatures / R.M. Abed, A. Al-Thukair, D. de Beer// FEMS Microbiology Ecology. – 2006. – V. 57, N. 2. – Р. 290-301. 92. Alkanotrophic Rhodococcus ruber as a biosurfactant producer / J.C. Philp, M.S. Kuyukina, I.B. Ivshina [et al.] // Applied Microbiology and Biotechnology. – 2002. – V. 59, N. 2-3. – P. 318-324. 93. Alvarez, M.H. Central metabolism of species of the genus Rhodococcus / M.H. Alvarez // Biology of Rhodococcus / Ed. H.M. Alvarez. Berlin, Heidelberg: Springer-Verlag, 2010. – P. 91-108. 94. Anaerobic biodegradation of diesel fuel-contaminated wastewater in a fluidized bed reactor / M.A. Cuenca [et al.] // Bioprocess and Biosystems Engineering. – 2006. – V. 29, N. 1. – Р. 29-37. 95. Analysis of plasmid diversity in 96 Rhodococcus equi strains isolated in Normandy (France) and sequencing of the 87-kb type I virulence plasmid / F. Duquesne [et al.] // FEMS Microbiology Letters. − 2010. − V. 311, N. 1. − Р. 76-81. 96. Aromatic hydrocarbons removal by immobilized bacteria (Pseudomonas sp., Staphylococcus sp.) in fluidized bed bioreactor / J. Taoufik [et al.] // Annals of Microbiology. − 2004. − V. 54, N. 2. − 189-200. 145 97. Bacterial Adhesion under Static and Dynamic Conditions / H.H.M. Rijnaarts [et al.] // Applied and Environmental Microbiology. − 1993. − V. 59, N. 10. − Р. 3255-3265. 98. Beyenal, H. Dynamics of lead immobilization in sulfate reducing biofilms / H. Beyenal, Z. Lewandowski // Water Research. − 2004. − V. 38, N. 11. − Р. 2726-2736. 99. Biodegradation of crude oil across a wide range of salinities by an extremely halotolerant bacterial consortium MPD-M, immobilized onto polypropylene fibers / M.P. Diaz [et al.] // Biotechnology and Bioengineering. – 2002. – V. 79, N. 2. – Р.145-153. 100. Biodegradation of drotaverine hydrochloride by free and immobilized cell of Rhodococcus rhodochrous IEGM 608 / I.B. Ivshina, E.V. Vikhareva, M.I. Richkova, A.N. Mukhutdinova [et al.] // World Journal of Microbiology and Biotechnology. – 2012. – V. 28, N. 10 – P. 2997-3006. 101. Biodegradation of Hydrocarbon Contamination by Immobilized Bacterial Cells / R.N. Rahman [et al.] // Journal of Microbiology. – 2006. – V. 44, N. 3. – P. 354-359. 102. Biodegradation of hydrocarbons in soil by microbial consortium / F.M. Ghazali [et al.] // International Biodeterioration & Biodegradation. – 2004. – V. 54, N. 1. – Р. 61-67. 103. Biodegradation of MTBE and BTEX in an aerobic fluidized bed reactor / A. Pruden [et al.] // Water Science and Technology. − 2003. − V. 47, N. 9. − Р. 123-128. 104. Biodegradation of phenol in synthetic and industrial wastewater by Rhodococcus erythropolis UPV-1 immobilized in an air-stirred reactor with clarifier / M.B. Prieto [et al.] // Applied Microbiology and Biotechnology. – 2002а. – V. 58, N. 6. – P. 853-859. 146 105. Biodegradation of phenolic industrial wastewater in a fluidized bed bioreactor with immobilized cells of Pseudomonas putida / G. González [et al.] // Bioresource Technology. − 2001. − V. 80, N. 2. − Р. 137-142. 106. Biodegradation potential of the genus Rhodococcus / L. Martínková [et al.] // Environment International. – 2009. – V. 35, N. 1. – P. 162-177. 107. Biofilm microbial community of a thermophilic trickling biofilter used for continuous biohydrogen production / Y. Ahn [et al.] // FEMS Microbiology Letters. – 2005. – V. 249, N. 1. – Р. 31-38. 108. Biofilm reactors for industrial bioconversion processes: employing potential of enhanced reaction rates / N. Qureshi [et al.] // Microbial Cell Factories. – 2005. – N. 25. – Р. 4-24. 109. Bioremediation of crude oil-contaminated soil using slurry-phase biological treatment and land I.B. Ivshina, M.I. Ritchkova [et farming techniques / M.S. Kuyukina, al.] // Soil Sediment Contamination. – 2003. – V. 12. – P. 85-99. 110. Biosorption and biodegradation of tributyltin (TBT) by alginate immobilized Chlorella vulgaris beads in several treatment cycles / T.G. Luan [et al.] // Process Biochemistry. − 2006. − V. 41, N. 7. − Р. 1560-1565. 111. Biosurfactant-enhanced immobilization of hydrocarbon-oxidizing Rhodococcus ruber on sawdust / I.B. Ivshina, M.S. Kuyukina, A.V. Krivoruchko [et al.] // Applied Microbiology and Biotechnology. – 2013. – V. 97, N. 12. – P. 5315-5327. 112. Biotreatment of industrial wastewater by selected algal-bacterial consortia / E. Safonova [et al.] // Engineering in Life Sciences − 2004. − V. 4, N. 4. − Р. 347-353. 113. Cassidy, M.B. Environmental applications of immobilized microbial cells: A review / M.B. Cassidy, H. Lee, J.T. Trevors // Journal of Industrial Microbiology. – 1996. –V. 16, N. 2. – P. 79-101. 147 114. Catalogue of Strains of the Regional Specialized Collection of Alkanotrophic Microorganisms [Электронный ресурс]. – 2008. – Режим доступа: www.iegm.ru/iegmcol/index.html. 115. Characterization of Rhodococcus-E. coli shuttle vector pNC9501 constructed from the cryptic plasmid of a propene-degrading bacterium / T. Matsui [et al.] // Current Microbiology. – 2006. –V. 52, N. 6. – Р. 445-448. 116. Complete nucleotide sequence and genetic organization of the 210kilobase linear plasmid of Rhodococcus erythropolis BD2 / C. Stecker [et al.] // Journal of Bacteriology. − 2003. − V. 185, N. 17. − Р. 5269-5274. 117. Dabbs, E.R. Plasmid-borne resistance to arsenate, arsenite, cadmium, and chloramphenicol in a Rhodococcus species / E.R. Dabbs, G.J Sole // Mol. Gen. Genom. – 1988. – V. 211, N. l. – P. 148-154. 118. de Carvalho, C.C.C.R. Influence of reactor configuration on the production of carvone from carveol by whole cells of Rhodococcus erythropolis DCL14 / C.C.C.R. de Carvalho, M.M.R. da Fonseca // Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic. – 2002. – V. 19-20. – Р. 377-387. 119. de Carvalho, C.C.C. R. The remarkable Rhodococcus erythropolis / C.C.C.R. de Carvalho, M.M.R. da Fonseca // Applied Microbiology and Biotechnology. – 2005. – V. 67, N. 6. – P. 715-726. 120. de Carvalho, C.C.C.R. Preventing biofilm formation: promoting cell separation with terpenes / C.C.C.R. de Carvalho, M.M.R. da Fonseca // FEMS Microbiology Ecology. – 2007. V. 61, N. 3. – P. 406-413. 121. de Carvalho, C.C.C.R. Cell wall adaptations of planktonic and biofilm Rhodococcus erythropolis cells to growth on C5 to C16 n-alkane hydrocarbons / C.C.C.R. de Carvalho, L.Y. Wick, H.J. Heipieper // Applied Microbiology and Biotechnology. – 2009. – V. 82. – Р. 311-320. 122. de Carvalho, C.C.C.R. Adaptation of Rhodococcus to Organic Solvents / C.C.C.R. de Carvalho // Biology of Rhodococcus / Ed. H.M. Alvarez. Berlin, Heidelberg: Springer-Verlag, 2010. – P. 110-131. 148 123. Degradation of Aroclor 1242 in a single-stage coupled anaerobic/aerobic bioreactor / B. Tartakovsky [et al.] // Water Research. − 2001. − V. 35, N. 18. − Р. 4323-4330. 124. Degradation of crude oil by a mixed population of bacteria isolated from sea-surface foams / E. Rambeloarisoa [et al.] // Marine Biology. – 1984. – V. 83. – P. 69-81. 125. Degradation of Estrogens by Rhodococcus zopfii and Rhodococcus equi Isolates from Activated Sludge in Wastewater Treatment Plants / T. Yoshimoto [et al.] // Applied and Environmental Microbiology. − 2004. −V. 70, N. 9. − Р. 5283-5289. 126. Degradation of phenol by Rhodococcus erythropolis UPV-1 immobilized on Biolite® in packed-bed reactor / M.B. Prieto [et al.] // Journal of Biotechnology. – 2002б. – V. 97, N. 1. – P. 1-11. 127. Degradation of trichloroethene by a linear-plasmid-encoded alkene monooxygenase in Rhodococcus corallinus (Nocardia corallina) B-276 / H. Saeki [et al.] // Microbiology. − 1999. − V. 145. − Р. 1721-1730. 128. Desulfurization of light gas oil in immobilized-cell systems of Gordona sp. CYKS1 and Nocardia sp. CYKS2 // J.H. Chang [et al.] // FEMS Microbiology Letters. – 2000. – V. 182, N. 2. – P. 309-312. 129. Development of a genetic transformation system for benzene-tolerant Rhodococcus opacus strains / K.S. Na [et al.] // Journal of Bioscience and Bioengineering. − 2005. − V. 99, N. 4. − P. 408-414. 130. Diversity of bacterial strains degrading hexadecane in relation to the mode of substrate uptake / M. Bouchez-Naitali [et al.] // Journal of Applied Microbiology. – 1999. – V. 86, N. 3. – Р. 421-428. 131. DNA sequence and comparison of virulence plasmids from Rhodococcus equi ATCC 33701 and 103 / S. Takai [et al.] // Infection and Immunity. − 2000. − V. 68, N. 12. − Р. 6840-6847. 149 М.A.R. 132. Doaa, Potential Application of Immobilization Technology in Enzyme and Biomass Production (Review Article) / М.A.R. Doaa, H. A. Wafaa // Journal of Applied Sciences Research. − 2009. − V. 5, N. 12. − Р. 2466-2476. 133. Donlan, R.M. Biofilms: Microbial Life on Surfaces / R.M. Donlan // Emerging Infectious Diseases. − 2002. − V. 8, N. 9. − Р. 881-890. 134. Effect of aromatic compounds on cellular fatty acid composition of Rhodococcus opacus / I.V. Tsiko [et al.] // Applied and Environmental Microbiology. − 1999. − V. 65, N. 2. − Р. 853-855. 135. Enhanced Benzaldehyde Tolerance in Zymomonas mobilis Biofilms and the Potential of Biofilm Applications in Fine-Chemical Production / X.Z. Li [et al.] // Applied and Environmental Microbiology. − 2006. − V. 72, N. 2. − Р. 1639-1644. 136. Environmental Applications of Biosurfactants: Recent Advances / M. Pacwa-Płociniczak [et al.] // International Journal of Molecular Sciences. − 2011. − V. 12, N. 1. − Р. 633-654. 137. Ethidium Monoazide for DNA-Based Differentiation of Viable and Dead Bacteria by 5′-Nuclease PCR / H.K. Nogva [et al.] // Biotechniques. − 2003. − V. 34, N. 4. − 804-813. 138. Evolution of the Rhodococcus equi vap pathogenicity island seen through comparison of host-associated vapA and vapB virulence plasmids / M. Letek [et al.] // Journal of Bacteriology. − 2008. − V. 190, N. 17. − P. 5797-5805. 139. Fetzner, S. Catabolic Linear Plasmids / S. Fetzner, S. Kolkenbrock, K. Parschat // Microbial Linear Plasmids / Ed. F. Meinhardt, R. Klassen. Berlin, Heidelberg: Springer-Verlag, 2007. – Р. 63-98. 140. Finnerty, W.R. The biology and genetics of the genus Rhodococcus / W.R. Finnerty // V. 46. – P. 193-218. Annual Review of Microbiology. – 1992. – 150 141. Gómez, R. The use of respiration indices in the composting process : a review / R. Gómez, F. Lima, A. Ferrer // Waste Management and Research. – 2006. – V. 24, N. 1. – P. 24-37. 142. Gouid, J.C. The determination of bacterial sensitivity to antibiotics / J.C. Gouid, J.H. Bowie // Edinburgh Medical Journal. − 1952. − V. 59. − P. 178-199. 143. Graves, D.A. Respirometric Analysis of the Biodegradation of Organic Contaminants in Soil and Water / D.A. Graves, C.A. Lang, M.E. Leavitt // Applied Biochemistry Biotechnology. – 1991. – V. 28/29. – Р. 813-826. 144. Grund, E. Naphthalene degradation via salicylate and genetisate by Rhodococcus sp. strain B4 / E. Grund, В. Denecke, R. Eichenlaub // Applied and Environmental Microbiology. – 1992. – V. 58. – P.1874-1877. 145. Hallas, L.E. Glyphosate Degradation by Immobilized Bacteria: Field Studies with Industrial Wastewater Effluent / L.E. Hallas, W.J. Adams, M.A. Heitkamp // Applied and Environmental Microbiology. − 1992. − V. 58, N. 4. − Р. 1215-1219. 146. Halwachs, W. Application of immobilized chymotrypsin in a multistage fluidized-bed reactor / W. Halwachs, C. Wandrey, K. Schügerl // Biotechnology and Bioengineering. – 1977. – V. 19, N. 11. – Р. 1667-1677. 147. Heuer, H. Plasmids foster diversification and adaptation of bacterial populations in soil / H. Heuer, K. Smalla // FEMS Microbiology Reviews. – 2012. – V. 36, N. 6. – Р. 1083-1104. 148. High efficiency degradation of tetrahydrofuran (THF) using a membrane bioreactor: identification of THF-degrading cultures of Pseudonocardia sp. strain M1 and Rhodococcus ruber isolate M2 / K.J. Daye [et al.] // Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. –2003. – V. 30, N. 12. – Р. 705-714. 149. Hydrophobised sawdust as a carrier for immobilisation of the hydrocarbon-oxidizing bacterium Rhodococcus ruber / E.A. Podorozhko, 151 V.I. Lozinsky, I.B. Ivshina, M.S. Kuyukina, A.B. Krivorutchko [et al.] // Bioresource Technology. – 2008. – V. 99, N. 6. – 2001-2008. 150. Identification and environmental detection of Rhodococcus species by 16S rDNA-targeted PCR / K.S. Bell, M.S. Kuyukina, S. Heidbrink, J.C. Philp, D.W.J. Aw, I.B. Ivshina [et al.] // Journal of Applied Microbiology. – 1999. – V. 87, N. 4. – Р. 472-480. 151. Immobilization of hydrocarbon-oxidizing bacteria in poly(vinyl alchohol) cryogels hydrophobized using a biosurfactant / M.S. Kuyukina, I.B. Ivshina, A.Yu. Gavrin, E.A. Podorozhko [et al.] // Journal of Microbiological Methods. – 2006. – V. 65, N. 3. – P. 596-603. 152. Immobilized-cell physiology: current data and the potentialities of proteomics / G.-A. Junter [et al.] // Enzyme and Microbial Technology. − 2002. − V. 31, N. 3. − Р. 201-212. 153. Influence of interfaces on microbial activity / M.C. van Loosdrecht [et al.] // Microbiology and Molecular Biology Reviews. − 1990. − V. 54, N. 1. − Р. 75-87. 154. Kaczorek, E. Uptake of Hydrocarbon by Pseudomonas fluorescens (P1) and Pseudomonas putida (K1) Strains in the Presence of Surfactants: A Cell Surface Modification / E. Kaczorek, A. Olszanowski // Water Air Soil Pollut. − 2011. − V. 214. − Р. 451-459. 155. Kermanshahi, A. Biodegradation of petroleum hydrocarbons in an immobilized cell airlift bioreactor / A. pour Kermanshahi, D. Karamanev, A. Margaritis // Water Research. − 2005. − V. 39, N. 15. − Р. 3704-3714. 156. Kuyukina, M.S. Rhodococcus Biosurfactants: Biosynthesis, Properties, and Potential Applications / M.S. Kuyukina, I.B. Ivshina // Biology of Rhodococcus / Ed. H.M. Alvarez. Berlin, Heidelberg: Springer-Verlag, 2010. – P. 292-313. 152 157. Larkin, M.J. Biodegradation and Rhodococcus – masters of catabolic versatility / M.J. Larkin, L.A. Kulakov, C.C. Allen // Current Opinion in Biotechnology. – 2005. – V. 16, N. 3. – 282-290. 158. Larkin, M.J. Biodegradation by Members of the Genus Rhodococcus: Biochemistry, physiology and Genetic Adaptation / M.J. Larkin, L.A. Kulakov, C.C.R. Allen // Advances in Applied Microbiology. – 2006. – V. 59. – Р. 1-29. 159. Larkin, M.J. Genomes and Plasmids in Rhodococcus / M.J. Larkin, L.A. Kulakov, C.C.R. Allen // Biology of Rhodococcus / Ed. H.M. Alvarez. Berlin, Heidelberg: Springer-Verlag, 2010. – P. 73-90. 160. Leahy, J.G. Microbial Degradation of Hydrocarbons in the Environment / J.G. Leahy, R.R. Colwell // Microbiological Reviews. – 1990. – V. 54, N. 3. − Р. 305-315. 161. Li, X.Z. Single-species microbial biofilm screening for industrial applications / X.Z. Li, B. Hauer, B. Rosche // Applied Microbiology and Biotechnology. − 2007. − V. 76, N. 6. − Р. 1255-1262. 162. Littlejohns, J.V. Kinetics and interactions of BTEX compounds during degradation by a bacterial consortium / J.V. Littlejohns, A.J. Daugulis // Process Biochemistry. − 2008. − V. 43, N. 10. − Р. 1068-1076. 163. Martinov, M. Liquid flow residence time in a fibrous fixed bed reactor with recycle / M. Martinov, D. Hadjiev, S. Vlaev // Bioresource Technology. – 2010. – V. 101, N. 4. – Р. 1300-1304. 164. Mathematical modelling of biofilm structures / M.C. van Loosdrecht [et al.] // Antonie Van Leeuwenhoek. − 2002. − V.81, N. 1-4. − Р. 245-256. 165. McCarty, P.L. Numerical model for biological fluidized-bed reactor treatment of perchlorate contaminated groundwater / P.L. McCarty, T.E. Meyer // Environmental Science & Technology. − 2005. – V. 39, N. 3. − P. 850-858. 166. Mechanisms of solvent tolerance in gram-negative bacteria / J.L. Ramos [et al.] // Annual Review of Microbiology. − 2002. − V. 56. − Р. 743-768. 153 167. Metabolism of anthracene by a Rhodococcus species / D. Dean- Ross [et al.] // FEMS Microbiology Letters. – 2001. – V. 204, N. 1. – Р. 205-211. 168. Microbial degradation of aromatic and polyaromatic toxic compounds adsorbed on powdered activated carbon / K. Abu-Salah [et al.] // Journal of Biotechnology. – 1996. – V. 51, N. 3. – P. 265-272. 169. Microbial destruction of fuel oil in soil induced by the biological preparation Devoroil / D.G. Sidorov [et al.] // Applied Biochemistry and Microbiology. − 1998. − V. 34, N. 3. − Р. 255-260. 170. Mihelcic, J.R. Degradation of Polycyclic Aromatic Hydrocarbon Compounds under Various Redox Conditions in Soil-Water Systems // J.R. Mihelcic, R.G. Luthy // Applied and Environmental Microbiology. – 1988. – V. 54, N. 5. – Р. 1182-1187. 171. Mikesková, H. Interspecific interactions in mixed microbial cultures in a biodegradation perspective / H. Mikesková, Č. Novotný, K. Svobodová // Applied Microbiology and Biotechnology. − 2012. − V. 95, N. 4. − Р. 861-870. 172. Miller, R.M. Evidence from Liposome Encapsulation for TransportLimited Microbial Metabolism of Solid Alkanest / R.M. Miller, R. Bartha // Applied and Environmental Microbiology. – 1989. – V. 55, N. 2. – P. 269-274. 173. Molecular Mechanisms of Genetic Adaptation to Xenobiotic Compounds / J.R. van der Meer [et al.] // Microbiological Reviews. − 1992. − V. 56, N. 4. − Р. 677-694. 174. Monocyclic aromatic hydrocarbon degradation by Rhodococcus sp. strain DK17 / D. Kim [et al.] // Applied and Environmental Microbiology. − 2002. − V. 68, N. 7. − Р. 3270-3278. 175. Murygina, V.P. Application of biopreparation “Rhoder” for remediation of oil polluted polar marshy wetlands in Komi Republic / V.P. Murygina, M.Y. Markarova, S.V. Kalyuzhnyi // Environment Intemational. – 2005. – V. 31, N. 2. – Р.163-166. 154 176. Neu, T.R. An amphiphilic polysaccharide for an adhesive Rhodococcus strain / T.R. Neu, K. Poralla // FEMS Microbiology Letters. – 1988.– V. 49, N. 3. – Р. 389-392. 177. Norman, R.S. Variability in Pseudomonas aeruginosa Lipopolysaccharide Expression during Crude Oil Degradation / R.S. Norman, R. Frontera-Suau, P.J. Morris // Applied and Environmental Microbiology. – 2002. – V. 68, N. 10. – Р. 5096-5103. 178. Nwankwoala, A.U. Enhanced biodegradation of methylhydrazine and hydrazine contaminated NASA wastewater in fixed-film bioreactor / A.U. Nwankwoala, N.O. Egiebor, K. Nyavor // Biodegradation. – 2001. – V. 12, N. 1. – Р. 1-10. 179. pB264, a small, mobilizable, temperature sensitive plasmid from Rhodococcus / P.A. Lessard [et al.] // BMC Microbiology. − 2004. − V.4, N. 1. − Р. 1-14. 180. Penicillin production in an inverse fluidized bed bioreactor / B.A. Ramsay [et al.] // Journal of Fermentation and Bioengineering. − 1991. − V. 72, N. 6. − Р. 495-497. 181. Petroleum-contaminated water treatment in a fluidized-bed bioreactor with immobilized Rhodococcus cells / M.S. Kuyukina, I.B. Ivshina, M.K. Serebrennikova, A.V. Krivorutchko [et al.] // International Biodeterioration & Biodegradation. – 2009а. − V. 63, N. 4. – Р. 427-432. 182. Physiological Adaptations Involved in Alkane Assimilation at a Low Temperature by Rhodococcus sp. Strain Q15† / L.G. Whyte [et al.] // Applied and Environmental Microbiology. − 1999. − V. 65, N. 7. − Р. 2961-2968. 183. Picioreanu, C. A theoretical study on the effect of surface roughness on mass transport and transformation in biofilms / C. Picioreanu, M.C. van Loosdrecht, J.J. Heijnen // Biotechnology and Bioengineering. − 2000. − V. 68, N. 4. − Р. 355-369. 155 184. Plasmid pRTL1 controlling 1-chloroalkane degradation by Rhodococcus rhodochrous NCIMB13064 / A.N. Kulakova [et al.] // Plasmid. − 1995. − V.33, N. 3. − Р. 208-217. 185. Polymeric cryogels as promising materials of biotechnological interest / V.I. Lozinsky [et al.] // TRENDS in Biotechnology. – 2003. – V. 21, N. 10. – Р. 445-451. 186. Rajasimman, M. Optimization studies in an Inverse Fluidized Bed Bioreactor for Starch Wastewater Treatment / M. Rajasimman, C. Karthikeyan // International Journal of Environmental. − 2009. − V. 3, N. 4. − Р. 569-574. 187. Rapid purification of nisin Z using specific monoclonal antibodycoated magnetic beads / G. Prioult [et al.] // International Dairy Journal. − 2000. − V. 10, N. 9. − P. 627-633. 188. Rosenberg, M. Role of adherence in growth of Acinetobacter calcoaceticus RAG-1 on hexadecane / M. Rosenberg, E. Rosenberg // Journal of Bacteriology. – 1981. – V. 148, N. 1. – Р. 51-57. 189. Sambrook, J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual / J. Sambrook, T. Maniatis, E.F. Fritish / 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory. New York: Cold Spring Harbor, 1989. – P. 121-376. 190. Scholz, W. Treatment of oil contaminated wastewater in a membrane bioreactor / W. Scholz, W. Fuchs // Water Research. − 2000. − V. 34, N. 14. − Р. 3621-3629. 191. Selection of culturable environmental microbial strains for cellular immobilization: Association of phenotypic adhesive characteristics and quantitative cellular retention / S.C.S. Martins [et al.] // African Journal of Biotechnology. − 2012. − V. 11, N. 58. − Р. 12206-12212. 192. Selective adsorption of hydrocarbon-oxidizing Rhodococcus cells in a column with hydrophobized poly(acrylamide) cryogel / M.S. Kuyukina, E.V. Rubtsova, I.B. Ivshina [et al.] // Journal of Microbiological Methods. − 2009б. − V. 79, N. 1. − Р. 76-81. 156 193. Sequential modular simulation of ethanol production inathree- phasefluidizedbed bioreactor / A. Sheikhi [et al.] // Biochemical Engineering Journal. − 2012. − V. 63. − Р. 95-103. 194. Sharma, S.L. Crude oil degradation by a marine actinomycete Rhodococcus sp. / S.L. Sharma, A. Pant // Indian Journal of Geo-Marine Sciences. − 2001. − V. 30, N. 3. − Р. 146-150. 195. Shieh, W.K. Fluidized Bed Biofilm Reactor for Wastewater Treatment / W.K. Shieh, J.D. Keenan // Advances in Biochemical Engineering Biotechnology. − 1986. − V. 33. − Р. 131-169. 196. Short Protocols in Molecular Biology / Ed. F.M. Ausubel [et al.] 3rd edition. John Wiley and Sons. – 1995. – 900 р. 197. Sikkema, J. Mechanisms of membrane toxicity of hydrocarbons / J. Sikkema, J.A. de Bont, B. Poolman // Microbiological Reviews. – 1995. – V. 59, N. 2. – P. 201-222. 198. Singer, M.E. Construction of an Escherichia coli-Rhodococcus shuttle vector and plasmid transformation in Rhodococcus spp. / M.E. Singer, W.R. Finnerty // Journal of Bacteriology. – 1988. – V. 170, N. 2. – Р. 638-645. 199. Soko´ł, W. Hydrodynamics of a gas-liquid-solid fluidized bed bioreactor with a low-density biomass support / W. Soko´ł, M.R. Halfani // Biochemical Engineering Journal. − 1999. − V. 3, N. 3. − Р. 185-192. 200. Soko´ł, W. Aerobic treatment of wastewaters in the inversefluidised bed biofilm reactor / W. Soko´ł, W. Korpal // Chemical Engineering Journal. − 2006. − V. 118, N. 3. − Р. 199-205. 201. Steininger, C. Clinical significance of inhibition kinetics for Streptococcus pyogenes in response to penicillin / C. Steininger, F. Allerberger, E. Gnaiger // Journal of Antimicrobial Chemotherapy. – 2002. – V. 50, N. 4. – P. 517-523. 157 202. The complete genome of Rhodococcus sp. RHA1 provides insights into a catabolic powerhouse / М. McLeod [et al.] // PNAS – 2006. – V. 103, N. 42. – P. 15582-15587. 203. The Effects of Sub-Inhibitory Levels of Chloramphenicol on pBR322 Plasmid Copy Number in Escherichia coli DH5α Cells / S. Begbie [et al.] // Journal of Experimental Microbiology and Immunology. – 2005. – V. 7. – Р. 82-88. 204. The genus Rhodococcus / K.S. Bell [et al.] // Journal of Applied Microbiology. – 1998. – V. 85. – P. 195-210. 205. Tony, B.D. Decolorization of Direct Red 28 by mixed bacterial culture in an up-flow immobilized bioreactor / B.D. Tony, D. Goyal, S. Khanna // Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. − 2009. − V. 36, N. 7. − P. 955-960. 206. Treatment of MTBE-contaminated water in fluidized bed reactor / S. Vainberg [et al.] // Journal of Environmental Engineering. – 2002. – V. 128, N. 9. – Р. 842-851. 207. van der Geize, R. Harnessing the catabolic diversity of rhodococci for environmental and biotechnological applications / R. van der Geize, L. Dijkhuizen // Current Opinion in Microbiology. − 2004. – V. 7, N. 3. – P. 255-261. 208. van Hamme, J. D. Recent advances in petroleum microbiology / J.D. van Hamme, A. Singh, O.P. Ward // Microbiology and Molecular Biology Reviews. – 2003. – V. 67, N. 4. – P. 503-549. 209. van Schie, P.M. Adhesion of Biodegradative Anaerobic Bacteria to Solid Surfaces / Р.M. van Schie, M. Fletcher // Applied and Environmental Microbiology. − 1999. − V. 65, N. 11. Р. 5082-5088. 210. Walker, J.D. Measuring the potential activity of hydrocarbondegrading bacteria / J.D. Walker, R.R. Colwell // Applied and Environmental Microbiology. − 1976. − V. 31, N. 2. − Р. 189-197. 158 211. Ward, О. Accelerated biodegradation of petroleum hydrocarbon waste / O. Ward, A. Singh, J. van Hamme // Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. – 2003. – V. 30, N. 5. – Р. 260-270. 212. Web-type evolution of Rhodococcus gene clusters associated with utilization of naphthalene / L.A. Kulakov [et al.] // Applied and Environmental Microbiology. – 2005. – V. 71, N. 4. – P. 1754-1764. 213. Weidhaas, J.L. An aerobic sequencing batch reactor for 2,4,6trinitrophenol (picric acid) biodegradation / J.L. Weidhaas, E.D. Schroeder, D.P.Y. Chang // Biotechnology and Bioengineering. – 2007. – V. 97, N. 6. – Р. 1408-1414. 214. Werther, J. Fluidized-Bed Reactors / J. Werther // Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry. – Weinheim, 2007. – Р. 1-50. 215. Wrenn, B.A. Selective enumeration of aromatic and aliphatic hydrocarbon degrading bacteria by a most-probable number procedure / B.A. Wrenn, A.D. Venosa // Canadian Journal of Microbiology. – 1996. – V. 42, N. 3. – P. 252-258. 216. Yeom, S.-H. Analysis of Microbial Adaptation at Enzyme Level for Enhancing Biodegradation Rate of BTX / S.-H. Yeom, Y.-Je. Yoo // Korean J. Chem. Eng. − 2002. − V. 19, N. 5. − Р. 780-782. 217. Zahmatkesh, M. Biodegradation of reactive orange 16 by Phanerochaete chrysosporium fungus: Application in a fluidized bed bioreactor / M. Zahmatkesh, F. Tabandeh, S. Ebrahimi // Iranian Journal of Environmental Health Science & Engineering. − 2010. − V. 7, N. 5. − Р. 385-390. 218. Zeraik, A.E. Biosurfactants as agents to reduce adhesion of pathogenic bacteria to polystyrene surfaces: effect of temperature and hydrophobicity / A.E. Zeraik, M. Nitschke // Current Microbiology. − 2010. − V. 61, N. 6. − Р. 554-559. 219. Zhang, L. Immobilization of microalgae for biosorption and degradation of butyltin chlorides / L. Zhang, G. Huang, Y. Yu // Artificial Cells, Blood Substitutes and Biotechnology. − 1998. − V. 26, N. 4. − Р. 399-410. 159 220. Zheng, D. Influence of laminar flow velocity and nutrient concentration on attachment of marine bacterioplankton / D. Zheng, G.T. Taylora, G. Gyananath // Biofouling: The Journal of Bioadhesion and Biofilm Research. − 1994. − V. 8, N. 2. − Р. 107-120. 221. Zhu, Y. Adaptation of Clostridium tyrobutyricum for Enhanced Tolerance to Butyric Acid in a Fibrous-Bed Bioreactor / Y. Zhu, S.-T. Yang // Biotechnology Progress. − 2003. − V. 19, N. 2. − Р. 365-372.
