Дерябин, П.Г. К вопросу о коронавирусной инфекции и

Оригинальная статья
К вопросу о коронавирусной инфекции
и перспективах профилактики и лечения
препаратами интерферона альфа-2b
человеческого рекомбинантного
П.Г.Дерябин1, В.В.Зарубаев2
НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского Минздрава России, Москва, Российская Федерация;
НИИ гриппа Минздрава России, Санкт-Петербург, Российская Федерация
1
2
Цель. Анализ результатов оценки противовирусной активности препарата Гриппферон® на основе исследования его
суммарного вирусингибирующего эффекта на модели коронавирусной инфекции в культуре клеток.
Материал и методы. Дан ретроспективный анализ данных отчета о результатах исследования суммарного вирусингибирующего эффекта препарата Гриппферон®, проведенного Научно-исследовательским институтом гриппа РАМН
на модели коронавирусной инфекции в культуре клеток под контролем чистоты использованного изолята коронавируса на каждом этапе методом электронной микроскопии (негативный контраст). Контролями служили: культура клеток,
зараженная вирусом (позитивный контроль), и интактная культура клеток, в которые вместо растворов исследуемых
веществ вносили поддерживающую среду (негативный контроль).
Результаты. Выявлено, что препарат Гриппферон® подавлял как прямую репликацию коронавируса в культуре, так и
снижал инфекционность вирусного потомства. Химиотерапевтический индекс препарата составляет минимум 10, что
является относительно высоким показателем для химиопрепаратов.
Заключение. Препарат Гриппферон® при коронавирусной инфекции человека может рассматриваться как одно из
перспективных средств в профилактике и терапии.
Ключевые слова: Гриппферон®, интерферон альфа-2b человеческий рекомбинантный, коронавирус
Regarding the Coronavirus infection and prospects for
prevention and treatment by recombinant human interferon
alpha-2b medications
P.G.Deryabin1, V.V.Zarubaev2
D.I.Ivanovsky Research Institute of Virology, Ministry of Public Health of the Russian Federation,
Moscow, Russian Federation;
2
Research Institute of Influenza (Russia), Ministry of Public Health of the Russian Federation,
St.Petersburg, Russian Federation
1
The objective. Analyze the results of anti-viral activity assessments for medicine «Grippferon®» based on a study of its total
viral inhibitory effect on a Coronavirus infection model in a cell culture.
Materials and methods. The retrospective analysis of report data was given regarding research results of the total viral
inhibitory effect of medicine «Grippferon®», conducted by Research Institute of Influenza (Russia) on a Coronavirus infection
model in a cell culture, controlling the purity of the utilized Coronavirus isolate at each stage by electron microscopy (negative
contrast). Controls were: the cell culture infected by the virus (positive control) and an intact cell culture, in which a support
medium was introduced instead of test substance solutions (negative control).
Results. It was revealed that medicine «Grippferon®» inhibited both the direct replication of the Coronavirus in the culture and
reduced the infectiousness of the viral progeny. The chemotherapeutic medication index is at least 10, which is relatively high
for chemotherapy medications.
Conclusion. Medicine «Grippferon®», during a Coronavirus infection of a person, can be considered as one of the perspective
means for prevention and therapy.
Key words: recombinant human interferon alpha-2b, coronavirus
К
оронавирусы (CoV) относятся к роду Alphacoronavirus
и Betacoronavirus (отряд Nidovirales, семейство Coro­
naviridae, подсемейство Coronavirinae) и способны заразить
широкий спектр млекопитающих, включая человека [1].
Для корреспонденции:
Дерябин Петр Григорьевич, доктор медицинских наук, профессор,
и.о. директора НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского Минздрава России
Адрес: 123098, Москва, ул. Гамалеи, 16
Телефон: (499) 190-2874
Статья поступила 7.08.2014 г., принята к печати 22.09.2014 г.
32
Известные коронавирусы человека (HCoVs): HCoV-HKU1,
HCoV-229E, HCoV-NL63 и HCoV-OC43 обычно вызывают
легкую до умеренной инфекцию дыхательных путей; однако у некоторых больных течение заболевания может быть
бо­лее выраженным. В 2002–2003 гг. эпидемия тяжелой
ин­фекции нижних дыхательных путей с летальностью ≈10%
была вызвана вирусом тяжелого острого респираторного
синдрома (ТОРС, SARS) [2]. В 2012 г. другой коронавирус
явился причиной тяжелой болезни дыхательных путей
человека на Аравийском полуострове и был назван коро­
К вопросу о коронавирусной инфекции, профилактика и лечение препаратами ИФН-a2b человеческого рекомбинантного
навирусом ближневосточного респираторного синдрома
(MERS) [3].
Как SARS-CoV, так и MERS-CoV являются зоонозными
вирусами, и ученые предполагают, что источником этих вирусов являются летучие мыши. Коронавирусы, вызывающие
ТОРС-CoVs, были идентифицированы в организме летучих
мышей Rhinolophus spp. в Китае и Европе, а MERS-CoV
были найдены у летучих мышей Pipistrellus в Европе и у летучих мышей Neoromicia в Южной Африке [4–7]. Пред­
положительно, коронавирус MERS-CoV, подобно инфекции
SARS-CoV, может передаваться людям от промежуточных
хозяев – животных, так, нейтрализующие антитела против
MERS-CoV были найдены в Аравии у верблюдов из Омана,
Испании и Египта [6, 7].
Передача возбудителя MERS-CoV между людьми по-преж­
нему ограничена, и идентификация промежуточных хо­зяев
может позволить разработать меры общественного здравоохранения для предотвращения будущего распространения
вируса среди людей. Хотя нейтрализующие антитела и были
обнаружены у верблюдов из Омана, Испании и Египта, ра­
нее вирус не был обнаружен у верблюдов [6, 7].
Одним из направлений поиска промежуточного хозяина
коронавируса было изучение репликативной способности
коронавируса, вызывающего острый респираторный синдром на Ближнем Востоке (MERS-CoV), которая оценивалась с использованием клеточных линий, полученных из
органов и тканей домашних животных и мелких млекопи­
тающих на Аравийском полуострове. Только линии клеток,
полученных из тканей коз и верблюдов, обеспечивали эффективную репликацию MERS-CoV [8].
Поиск экспериментальных (лабораторных) моделей коронавирусной инфекции представляет значимость и для доклинической оценки противовирусных препаратов в отношении этой актуальной инфекции.
Целью данной работы является анализ результатов оценки
противовирусной активности препарата Гриппферон® на ос­но­
ве исследования его суммарного вирусингибирующего эф­
фекта на модели коронавирусной инфекции в культуре клеток.
Материалы и методы
По данным отчета Научно-исследовательского Института
гриппа РАМН, имеющегося в архиве научно-иссле­дова­
тельского центра ЗАО «Фирн М», использован препарат
Гриппферон® производства ЗАО «Фирн М» (РN000089/01050111), представляющий собой смесь рекомбинантного
человеческого альфа-2b интерферона с поливинилпирролидоном, полиэтиленоксидом и трилоном Б. Концентрация
рекомбинантного интерферона составляла 10 000 МЕ/мл.
Препарат растворяли в среде для культур клеток и вносили
в пробирки или лунки планшетов до конечной концентрации 10–2000 МЕ/мл. Коронавирус человека был выделен
в 2003 г. в НИИ гриппа от ребенка с кишечной и респираторной патологией, пассирован на культуре клеток фиброблас­
тов легкого человека и идентифицирован в реакции связывания комплемента с референс-сыворотками как человечес­
кий коронавирус 229Е. Культивирование клеток культуры
фибробластов легкого человека проводили в пробирках или
96-луночного планшета до состояния монослоя в среде
DMEM с добавлением 100 мкг/мл гентамицина, 5% сыворотки КРС для среды роста клеток и 1,5% сыворотки для среды
поддержания. Визуально фиксировали морфологические
изменения клеточного монослоя в контроле и в присутствии
препарата на сроках 1–8 сут контакта.
Для оценки противовирусного действия препарата
Гриппферон® в отношении человеческого коронавируса культуру фибробластов легкого человека заражали серийными
десятикратными разведениями вируса от 10–1 до 10–4. После
заражения культуру клеток инкубировали в термостате при
37,5°С в течение 1–1,5 ч (период адсорбции вируса), после
чего в пробирки вносили препарат и инкубировали в термостате до четкого проявления цитопатогенного действия (ЦПД)
в контрольных пробирках или лунках планшетов. Контролями
служили: культура клеток, зараженная вирусом (позитивный
контроль), и интактная культура клеток, в которые вместо
растворов исследуемых веществ вносили поддерживающую
среду (негативный контроль). Учет результатов проводили
после появления выраженного ЦПД в контроле вируса.
Визуально оценивали степень интактности клеточного монослоя, за титр вируса принимали величину, обратную десятичному логарифму наибольшего разведения исходного вируса,
способного вызвать проявления ЦПД в культуре клеток.
Инфекционность вирусного потомства оценивали по титру
вируса, выращенного в присутствии препарата и в контроле,
во втором пассаже. Противовирусное действие препарата
определили по разнице титров вируса в опыте и в контроле,
которую выражали в IgCTD50.
Для оценки чистоты изолята коронавируса, использованного в работе, осуществлялся контроль на каждом этапе
методом электронной микроскопии (негативный контраст).
Для этого культуральную жидкость из контрольных проби­
рок или лунок планшетов в количестве 3 мл центрифуги­
ровали в течение часа при 40 000 об./мин в роторе SW 50.1
(Beckman). Осадок ресуспендировали в 100 мкл фосфат­
ного буфера, инкубировали с подложкой для электронной
микроскопии, контрастировали фосфорно-вольфрамовой
кислотой и просматривали на электронном микроскопе
JTM-100S (Jeol, Япония) при инструментальном увеличении 80 кВ.
Результаты исследования и их обсуждение
Данные о противовирусной активности препарата Грипп­
ферон® в отношении коронавируса представлены в таблице.
Как видно из представленных результатов, препарат
Гриппферон® подавлял как прямую репликацию коронавируса в культуре, так и снижал инфекционность вирусного потомства. В слабой степени этот эффект сохранялся до концентраций 125 и 100 МЕ/мл соответственно. Концентрация
2000 МЕ/мл оказывалась токсичной для культуры фибробластов легкого, используемой в исследовании. Исходя из приведенных данных, химиотерапевтический индекс препарата
(отношение максимальной переносимой концентрации к минимальной действующей концентрации) составляет минимум 10, что является относительно высоким показателем
для химиопрепаратов.
Для подтверждения вирусной специфичности наблюдаемого ЦПД в культуре концентрат культуральной жидкости
33
П.Г.Дерябин, В.В.Зарубаев / Инфекционные болезни, 2014, т. 12, №3, с. 32–34
Таблица. Противовирусное действие препарата Гриппферон® в отношении коронавируса человека
Концентрация
Титр вируса
Снижение титра вируса
Инфекционность вирусного потомства
Снижение инфекционного титра
препарата, МЕ/мл
в присутствии
по сравнению
при разведении вируса, IgCTD50
по сравнению с контролем
препарата, IgCTD50
с контролем, IgCTD50
при разведении вируса, IgCTD50
1:10
1:100
1:10
1:100
2000,0
токсично
–
1,5
1,0
1,5
1,5
1000,0
0
3,0
ND*
ND
ND
ND
500,0
0
3,0
ND
ND
ND
ND
250,0
2,5
0,5
ND
ND
ND
ND
125,0
2,75
0,25
ND
ND
ND
ND
100,0
ND
ND
2,5
2,0
0,5
0,5
62,5
3,0
0
ND
ND
ND
ND
31,3
3,0
0
ND
ND
ND
ND
15,0
3,0
0
ND
ND
ND
ND
10,0
ND
ND
3,0
2,5
0
0
0
3,0
0
3,0
2,5
0
0
*ND – величину не определяли.
исследовали на присутствие коронавируса и контаминирующих микроорганизмов. В ходе исследований было показано,
что культуральная жидкость содержала вирусные частицы,
морфологически и морфометрически идентифицированные
как коронавирус. Других микроорганизмов в концентрате
культуральной жидкости обнаружено не было. Таким образом, наблюдаемое ЦПД в культуре было вирусспецифичес­
ким, т.е. вызвано коронавирусом, против которого тестировался препарат.
Заключение
В результате проведенных исследований получены
данные, свидетельствующие о наличии у препарата
Гриппферон® прямой ингибирующей активности в отношении коронавируса человека. Эта активность проявлялась
как в дозозависимом снижении репликации вируса в присутствии препарата, так и в снижении инфекционного титра
вирусного потомства и сопровождалась высоким химиотерапевтическим индексом.
Полученные данные позволяют рассматривать препарат
Гриппферон® как одно из перспективных средств профилактики и терапии коронавирусной инфекции человека.
2. Drosten C, Gunther S, Preiser W, vander Werf S, Brodt HR, Becker S. Identification
of a novel coronavirus in patients with severe acute respiratory syndrome. N Engl
J Med. 2003;348:1967-76.
3. De Groot RJ, Baker SC, Baric RS, Brown CS, Drosten C, Enjuanes L, et al. Middle
East respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV): announcement of the
Coronavirus Study Group. J Virol. 2013;87:7790–2.
4. Lau SK, Woo PC, Li KS, Huang Y, Tsoi HW, Wong BH, et al. Severe acute respiratory
syndrome coronavirus-like virus in Chinese horseshoe bats. Proc Natl Acad Sci
USA. 2005;102:14040-5.
5. Li W, Shi Z, Yu M, Ren W, Smith C, Epstein JH, et al. Bats are natural reservoirs of
SARS-like coronaviruses. Science. 2005;310:676-9.
6. Perera RA, Wang P, Gomaa MR, El-Shesheny R, Kandeil A, Bagato O, et al.
Seroepidemiology for MERS coronavirus using microneutralisation and
pseudoparticle virus neutralisation assays reveal a high prevalence of antibody in
dromedary camels in Egypt. Euro Surveill. 2013;18:20574.
7. Reusken CB, Haagmans BL, Muller MA, Gutierrez C, Godeke GJ, Meyer B, et al.
Middle East respiratory syndrome coronavirus neutralising serum antibodies in
dromedary camels: a comparative serological study. Lancet Infect Dis. 2013;
13:859-66.
8. Eckerle I, Corman VM, Müller MA, Lenk M, Ulrich RG, Drosten C. Replicative
Capacity of Coronavirus in Livestock Cell Lines. Emerg Infect Diseases.
2014;20(2):276-9.
Информация о соавторе:
Литература/References
1. Woo PC, Lau SK, Huang Y, Yuen KY. Coronavirus diversity, phylogeny and
interspecies jumping. ExpBiolMed (Maywood). 2009;234:1117-27.
Зарубаев Владимир Викторович, кандидат биологических наук,
заведующий лабораторией молекулярных основ химиотерапии
вирусных инфекций НИИ гриппа Минздрава России
Адрес: 197376, Санкт-Петербург, ул. проф. Попова, 15/17
Телефон: (812) 499-1526
Научная жизнь
Конференции «Актуальные аспекты
природной очаговости болезней»
11–12 ноября 2014 года
Омск, Россия
Телефон/факс: (3812) 65-16-33
E-mail:[email protected]
34
III Южно-российская конференция
по антимикробной терапии
Ростов-на-Дону, Россия
19–20 марта 2015 г.
Тел.: (4812) 45-06-02
E-mail: [email protected]
XVII Международный конгресс
по антимикробной терапии
Москва, Россия
20–22 мая 2015 г.
Тел.: (4812) 45-06-02
E-mail: [email protected]