Работа 4 - НГТУ им. Р.Е. Алексеева

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РФ
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ
ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ
ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ
«НИЖЕГОРОДСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ТЕХНИЧЕСКИЙ
УНИВЕРСИТЕТ имени Р.Е. Алексеева»
Кафедра «Биотехнология, физическая и аналитическая химия»
ИЗУЧЕНИЕ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ К
АНТИБИОТИКАМ. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СПЕКТРА АНТИМИКРОБНОГО
ДЕЙСТВИЯ АНТИБИОТИКОВ
Методические указания к лабораторным занятиям
по дисциплине «Основы биотехнологии»
для студентов, обучающихся по направлению
«Биотехнология» и «Техносферная безопасность»
дневной формы обучения
Нижний Новгород 2013
Составители: О.В. Кузина, О.Н. Смирнова
УДК 576(076.5)
Изучение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам. Определение
спектра антимикробного действия антибиотиков. Методические указания к лабораторным занятиям по дисциплине «Основы биотехнологии» для студентов,
обучающихся по направлению «Биотехнология» и «Техносферная безопасность» дневной формы обучения / НГТУ; Сост.: О.В. Кузина, О.Н. Смирнова.–
Н. Новгород, 2013.– 7 с.
Методические указания предназначены для проведения микробиологических работ по определению спектра антимикробного действия антибиотиков.
Рассмотрены классификация и механизм действия наиболее часто применяемых антибиотиков. Изложена методика определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам по величине зоны угнетения их роста.
Редактор Э.Б. Абросимова
Подписано в печать
. Формат 60 801/16. Бумага газетная.
Печать офсетная. Усл. п. л. . Уч.-изд. л. . Тираж 80 экз. Заказ
.
Нижегородский государственный технический университет им. Р.Е. Алексеева.
Типография НГТУ. 603950, г. Нижний Новгород, ул. Минина, 24.
Нижегородский государственный технический
университет им. Р.Е. Алексеева, 2013
2
Цель работы: определение степени чувствительности бактерий к различным
антибиотикам.
Антибиотики – это специфические продукты жизнедеятельности микроорганизмов и их модификации, обладающие высокой физиологической активностью по отношению к определенным группам микроорганизмов, избирательно
задерживая или полностью подавляя их рост.
Антибиотические вещества разнообразны по химическому составу и механизму действия. Характерной особенностью антибиотиков является избирательность их действия: каждый антибиотик проявляет биологическое воздействие (эффективен) лишь по отношению к определенным организмам или группам организмов, не оказывая воздействие на другие.
С развитием науки, особенно молекулярной биологии, представилась возможность изучить механизм действия антибиотиков на молекулярном уровне.
Установлено, что одни из них ингибируют синтез клеточной стенки, другие –
синтез белка, третьи – нуклеиновых кислот и т.д. Ингибиторами клеточной
стенки бактерий являются пенициллины, цефалоспорины. Они действуют на
растущие клетки, тормозят образование некоторых аминокислот, входящих в
состав пептидогликана (муреина). В результате образуются протопласты – сферические структуры, лишенные клеточной стенки, которые затем лизируются
автолитическими ферментами.
Синтез белка ингибирует антибиотик хлорамфеникол, под его влиянием
нарушается функция рибосом, в результате чего быстро наступает гибель микробной клетки. Таким же действием обладают стрептомицин, канамицин, тетрациклин, эритромицин и др. Актиномицин и другие антибиотики подавляют
синтез нуклеиновых кислот, задерживают рост бактерий, грибов, опухолевых
клеток. Из сказанного видно, что действие антибиотиков на макро- и микроорганизмы комплексное, включающее множество разнообразных факторов.
Антибиотики обладают специфическим действием. Это их свойство используется для выяснения роли отдельных молекул в метаболизме клетки. Так,
многие детали механизма синтеза балка установлены с помощью его же ингибитора – левомицитина. Антибиотики применяют также для построения генетических карт микроорганизмов, их идентификации, определения свойств и т.д.
Образование антибиотиков – это наследственно закрепленная особенность
метаболизма организмов, это специфическая особенность вида или даже штамма микроорганизмов, возникшая в результате эволюционного развития как одна
из приспособительных особенностей, обуславливающая проявление широко
распространенных в мире микроорганизмов антагонистических отношений.
К синтезу антибиотиков, главным образом, способны грибы из p.
Penicillium (гризеофульвин, пенициллин), актиномицеты (актиномицин, гентамицин, канамицин) и некоторые группы бактерий (грамицидин). Процесс образования антибиотиков тесно связан с развитием организмов-продуцентов и
осуществляется, как правило, в фазу замедления роста. В процессе производства препараты антибиотиков подвергаются сложной химической очистке. В лечебную сеть препараты антибиотиков поступают только после тщательного
3
контроля их активности, безвредности, стерильности и других показателей качества. В таблице 1 приведены примеры наиболее широко используемых антибиотиков.
Таблица 1
Наиболее широко применяемые антибиотики
Антибиотик
Пенициллин (бензилпенициллин)
Ампициллин
Цефалоспорин С
Гризеофульвин
Стрептомицин
4
Организмпродуцент
Механизм
действия
Спектр антимикробного
действия
Антибиотики, образуемые грибами
Penicillium
Ингибирует Подавляет рост Гр (+) микрооргаnotatum,
синтез пеп- низмов, возбудителей рожи свиней,
P. crustosum, тидоглакана пастереллеза, сибирской язвы, некP. chrysoge(муреина)
робактериоза, инфекционного масnum
клеточной
тита и др. заразных болезней
стенки микробов
Подавляет рост Гр (+) и Гр (-) мик- - // - - - // - роорганизмов, возбудителей желудочно-кишечных болезней: эшерихиоза (колибактериоза), сальмонеллеза и др.
CephalospoПодавляет рост Гр (-) и Гр (+) микrium acremo- - // - роорганизмов, устойчивых к пениnium
циллину, возбудителей пневмонии,
сепсиса, менингита и др. инфекций
Penicillium
Ингибирует Фунгицид широкого спектра дейgriseofulvum синтез кле- ствия, против возбудителей мучниточной стен- стой росы клубники, огурцов и др.
ки
грибов, растений; для лечения дерматомипредупрежкозов и трихофитии (стригущего
дая проник- лишая) животный и человека
новение патогенных
грибов
Антибиотики, образуемые актиномицетами
Actinomyces Нарушается Подавляет рост Гр (+) и Гр (-) микstreptomycini функция ри- робов, стафилококков, стрептококбосом, инги- ков, возбудителей сальмонеллезов,
бируется
дизентерии, туберкулеза. При длисинтез белка тельном применении поражаются
центральные и периферические отделы органов слуха и равновесия
Канамицин
Actinomyces
kanamyceticus
Тетрациклины
(хлортетрациклин, дибиомицин,
окситетрациклин,
тетрациклин, морфоциклин)
Эритромицин
Actinomyces
aureofaciens
и
химическим путем
Актиномицин
Actinomyces
griseus
Полимиксины (полимиксин
В, Е и М)
Грамицидин С
Actinomyces
erythreus
- - // - -
- - // - -
- - // - Подавляет
ДНКзависимый
синтез РНК
Подавляет рост микробов, устойчивых к пенициллину, стрептомицину, левомицетину, тетрациклинам и др. антибиотикам. Токсичен
так же, как и стрептомицин
Обладают очень широким спектром действия. Тетрациклины подавляют не только возбудителей
болезней, но и нормальную микрофлору кишечника, в результате
чего развивается дисбактериоз.
Общетоксическое действие на организм проявляется в виде головных болей, потере аппетита и др.
Подавляет рост Гр (+) и Гр (-) микроорганизмов, риккетсий, клостридий, пенициллиноустойчивых микробов
Подавляет рост Гр (+) бактерий,
микобактерий, грибов, злокачественных новообразований. Применяется как противоопухолевый
препарат, токсичен
Антибиотики, образуемые бациллами
Bacillus poУвеличивает Полимексины применяются внутрь
lymyxa, Bac. проницаепри желудочно-кишечных болезcolistinus
мость стенки нях, наружно при лечении гнойных
микробной
процессов (плохо заживающих
клетки, на- язв), маститов. Антибиотики данрушая функ- ной группы токсичны
цию клеточной мембраны
Bacillus breЭто один из самых активных антиvis
- - // - биотиков. Активен против гноеродных микробов: стафилококков,
стрептококков, возбудителей сальмонеллезов, столбняка, сибирской
язвы и других болезней. Антибиотик токсичен при приеме внутрь,
поэтому назначается наружно
5
В результате бесконтрольного применения антибиотиков к некоторым из
них микробы приобретают устойчивость. Она возникает у микробов в трансмиссибельных плазмидах, содержащих гены устойчивости (R-фактор), которые
вырабатывают ферменты, инактивирующие антибиотики и другие лекарственные вещества. Фактор наследственности передается при конъюгации к одному
или нескольким антибиотикам одновременно. При выявлении резистентных
форм микробов одни антибиотики заменяют другими – одинаковыми по действию, но разными по происхождению и химическому составу. Появление устойчивых форм микробов обязывает применять антибиотики рационально.
Антибиотики должны отвечать следующим требованиям:
1) в очень низкой концентрации (10-50 мкг/мл) обладать цидным или статическим действием. Цидное – это действие, при котором микроб погибает, статическое – задерживает его рост;
2) быть безвредным и не снижать свою активность в организме;
3) подавлять рост микробов, не нарушая физиологического состояния организма.
Таким требованиям отвечают немногие органические вещества, поэтому из
более чем 5 тыс. описанных в практике применяют около 100 антибиотиков.
Антибактериальная активность антибиотиков выражается в единицах действия (ЕД). Для большей части антибиотиков (стрептомицин, тетрациклины,
неомицин, канамицин, гентамицин, эритромицин, рифампицин и др.) 1 ЕД соответствует 1 мкг, а 1000 ЕД – 1 мг химически чистого препарата. Для некоторых антибиотков (пенициллин, полимиксин, нистатин) единицы действия имеют другое весовое выражение.
Задачей практических бактериологических лабораторий является не проверка получаемых препаратов антибиотиков, а определение концентраций антибиотиков в крови, моче и других жидкостях организма (иногда в тканях), а
также определение чувствительности к антибиотикам выделенных от больного
возбудителей. Для определения спектра антимикробного действия антибиотика
или чувствительности микроорганизмов к антибиотикам используются методы,
основанные на способности антибиотика диффундировать в толщу агара.
Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам
На чашки Петри с подсушенной твердой питательной средой засевают исследуемую культуру сплошным газоном. Посев производят стерильным ватным
тампоном, смоченным суспензией исследуемой культуры, или шпателем. Стерильным пинцетом на агар плотно накладывают индикаторные бумажные диски (4-5 штук), пропитанные раствором определенного антибиотика на равном
расстоянии друг от друга и на расстоянии около 2,5 см от центра чашки.
Диски номеруют на обратной стороне дна чашки. Засеянные чашки с нанесенными дисками термостатируют (вверх дном) при 37 0С в течение 16-18 часов.
Антибиотики, диффундирующие в толщу агара, предотвращают или задерживают рост чувствительных к ним культур микроорганизмов, что проявля6
ется в образовании вокруг соответствующих дисков зоны угнетения роста, четко выделяющейся на фоне сплошного газона роста тестируемой культуры.
Величина зоны угнетения определяет степень чувствительности микроорганизмов к данному антибиотику:
Диаметр зоны задержки роста, мм
Более 25
15-25
10-14
менее 10 и полное отсутствие
Таблица 2
Степень чувствительности к
антибиотику
Высокочувствительные
Чувствительные
Малочувствительные
Устойчивые
МАТЕРИАЛЫ, ОБОРУДОВАНИЕ, РЕАКТИВЫ
Чашки Петри, МПА, среда Чапека-Докса, шпатель, пинцет, бумажные диски антибиотиков, вата, этанол 96%-ный, термостат для культивирования микроорганизмов, спиртовки, предметные стекла, бактериологическая петля, спиртовка, микроскоп, иммерсионное масло, линейка.
ЗАДАНИЕ К РАБОТЕ
1. Провести тестирование чувствительности к 4-5 антибиотикам культуры
микроорганизма (рекомендованной преподавателем) методом бумажных дисков. Определить степень чувствительности по величине зоны
задержки роста.
2. Обосновать степень чувствительности тестируемых культур к изученным антибиотикам, исходя из их химического строения и механизма
действия.
РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА
1. Асонов Н.Р. Микробиология. – М.: Колос, 2001. – 352с.
2. Шлегель Г. Общая микробиология. – М.: Мир, 1987. – 567с.
3. Градова Н.Б., Бабусенко Е.С., Горнова И.Б., Гусарова Н.А. Лабораторный практикум по общей микробиологии. - М.: ДеЛи принт, 2001. – 131с.
4. Практикум по микробиологии. Под ред. Н.С. Егорова. – М.: МГУ, 1976.
– 307 с.
7