удк: 619:576.807.7 получение и характеристика моноклональных

УДК: 619:576.807.7
ПОЛУЧЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ
К ХЛОРАМФЕНИКОЛУ
Жумалин А.Х, Куйбагаров М.А.
НИИ биотехнологии АО «Казахский агротехнический университет им. С. Сейфуллина»,
г. Астана, E.mail: [email protected]
Научный руководитель – доктор ветеринарных наук, профессор Булашев А.К.
В настоящее время все большее значение приобретает проблема отрицательного
влияния остаточных количеств антибиотиков, находящихся в продуктах питания в
количествах, превышающих допустимые уровни, на здоровье человека.
В качестве объекта исследований был выбран хлорамфеникол (левомицетин) –
антибиотик широкого спектра действия часто применяемый в сельском хозяйстве. В
отличие от многих препаратов хлорамфеникол медленно выводится из организма
животных, сравнительно долго сохраняет свою активность при хранении продуктов и
оказывает негативное действие на кроветворную систему. Гигиенические требования к
качеству и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов не допускают
присутствия хлорамфеникола в мясе, молоке и яйцах. Низкие концентрации антибиотика
можно обнаружить только с помощью высокочувствительных современных методов. В
современной мировой практике для этой цели широко используются методы на основе
иммуноферментного анализа (ИФА) [1, 2, 3]. Одним из основных реагентов при этом
являются специфические антитела. При этом получение иммуноглобулинов к
антибиотикам (как и к другим гаптенам) остается трудновыполнимой задачей, поскольку
в чистом виде они не вызывают иммунного ответа.
В связи с этим, целью данной работы было получение штаммов гибридом
продуцентов МКА специфичных хлорамфениколу.
В качестве высокомолекулярных белков-носителей использовали бычий
сывороточный альбумин (БСА) с молекулярной массой 66 кД (Sigma), овальбумин (ОВА)
с молекулярной массой 45 кД (Sigma). Также в качестве носителя был использован латекс
(Latex beads, carboxylate- modified polystyrene, 0.9 μm mean particle, Sigma). В качестве
сшивающего
агента
использовали
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide
hydrochloride (EDC) (Sigma). Для конъюгации использовали «Левомицетин – КМП»
(хлорамфеникол) ОАО «Киевмедпрепарат», Украина.
Синтез конъюгатов хлорамфеникола (ХАФ) с БСА и ОВА проводили с
использованием препарата 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydrochloride
(EDC). Очистку конъюгатов от не связавшихся реагентов проводили на колонке (15х1,5
см) с сефадексом G-25. Элюирование проводили с помощью Tris-HCl буфера (рН-7,5).
Для синтеза конъюгата хлорамфеникола с латексом (1%
суспензия) также
использовали EDC с конечной концентрацией 1 мг/мл.
Иммунизацию мышей линии Balb/c проводили конъюгатом латекс-ХАФ
внутрибрюшинно в дозе 0,1 мл 4 раза в течение 14 суток. Через 7 суток проводили
реиммунизацию. Взятие крови у иммунизированных мышей проводили через 3 дня после
последней иммунизации и исследовали в непрямом варианте ИФА. Для этого ячейки 96луночного планшета для иммунологических реакций сенсибилизировали конъюгатами
БСА-ХАФ и ОВА-ХАФ на фосфатно-солевом растворе (ФСР) рН 7,2 в концентрации (30
мкг/мл), при 4ºС в течение ночи. После этого вносили антителосодержащую жидкость,
инкубировали при 37ºС в течение 60 минут. Результаты ИФА учитывали с помощью
спектрофотометра с вертикальным потоком света (ASYS Expert 96) при длине волны 450
нм.
Гибридизацию клеток миеломы Х63 Ag 8.653 и иммунных спленоцитов проводили по
методу [4]. Клетки после гибридизации высевали в ячейки 96–луночного планшета (Nunc,
Дания) с «питающим слоем» перитонеальных клеток и инкубировали при 37ºС в
атмосфере с 5% СО 2 . В качестве селективной среды использовали RPMI-1640,
содержащую гипоксантин, аминоптерин, тимидин (ГАТ) (Sigma). По истечении 14 суток
проводили контроль роста слившихся клеток путем просмотра культур под
инвертированным микроскопом.
Определение изотипов МКА проводили в ИФА с использованием набора
специфических антисывороток к различным классам мышиных иммуноглобулинов ISO2
(Sigma).
В результате тестирования сывороток крови иммунных мышей было определено,
что конъюгат латекс-ХАФ активно стимулирует иммунную систему животных, титры
антител при этом составляли 1:3200-1:6400. От линейных мышей были выделены
иммунные спленоциты и использованы для гибридизации с миеломными клетками.
Тестирование культуральной жидкости клонов проводили в непрямом варианте
ИФА. В качестве антигенов для сенсибилизации лунок планшета были использованы как
конъюгаты хлорамфеникола с белковыми носителями (ХАФ-БСА, ХАФ-ОВА) так и
чистые препараты носителей (БСА, ОВА). Тестирование показало наличие в
культуральной жидкости 3-х гибридом (2D9, 3B11, 4B8) антител, специфичных эпитопам
хлорамфеникола. При повторном тестировании стабильность и специфичность сохранили
антитела гибридомы 3B11. При дальнейшем тестировании антител установили их
высокую активность по отношению к хлорамфениколу в составе белкового конъюгата и
отсутствие реакции с белками-носителями.
Гибридомы штамма 3B11 были подвергнуты клонированию методом лимитирующих
разведений. В результате клонирования для дальнейшей работы были отобраны субклоны
с наибольшей активностью в ИФА (3B11F8, 3B11C6, 3B11G7). Титр антител
культуральной жидкости субклонов, при которых еще обнаруживалось связывание
антител в ИФА, был в диапазоне 1:64-1:128. Определение изотипа показало, что
полученные МКА относятся к классу IgM. Продуктивность штаммов in vitro составила 60125 мкг/мл.
Таким образом, в результате проведенной работы были получены штаммы гибридом,
продуцирующие моноклональные антитела специфичные антигенным эпитопам
антибиотика хлорамфеникола. Результаты исследований могут быть использованы при
разработке экспресс-методов определения остаточных количеств хлорамфеникола в
продуктах животного происхождения.
Список использованной литературы:
1
Ke LI, Liqiang LIU, ChuanLai XU, XiaoGang CHU. Rapid Determination of
Chloramphenicol Residues in Aquaculture Tissues by Immunochromatographic /Assay
analytical sciences. November 2007, vol. 23, P.1281.
2
Mookda Pattarawarapan, Sawitree Nangola, Chatchai
Tayapiwatana.
Establishment of Competitive ELISA for Detection of Chloramphenicol /Chiang Mai J. Sci.
2006; 33(1) : 85-94.
3
Ковалев И.Е., Полевая О.Ю. Биохимические основы иммунитета к
низкомолекулярным соединениям. М 1985.
4
Oi V., Herzenberg L. Immunoglobulin – producing hybrid cell lines.//Selected
methods in cellular immunology.//Ed. By. Mishell B and Shiigi. – San Francisco, 1980, P. 351352.