физиологических особенностей условно

ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧЕРЕЖДЕНИЕ
ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ
«БАШКИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ»
МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
На правах рукописи
Габидуллин
Юлай Зайнуллович
ОСОБЕННОСТИ НЕКОТОРЫХ СВОЙСТВ,
ОПРЕДЕЛЯЮЩИХ ПАТОГЕННЫЙ ПОТЕНЦИАЛ
СОКУЛЬТИВИРУЕМЫХ ВАРИАЦИЙ
БАКТЕРИЙ ENTEROBACTER, CITROBACTER, SERRATIA, E.COLI,
PROTEUS
03.02.03 – Микробиология
диссертация на соискание ученой степени
доктора медицинских наук
Научный консультант:
Заслуженный деятель науки РФ,
член-корреспондент РАН,
доктор медицинских наук,
профессор И.И. Долгушин
Уфа - 2014
2
ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ ……………………………………………………………………….…5
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Роль условно-патогенных энтеробактерий в развитии ассоциированных
инфекций ………………………………………………………………….……..23
1.2 Факторы патогенности условно-патогенных энтеробактерий ……….......30
1.3.Антибиотикоустойчивость
условно-патогенных
энтеробактерий
…………………………….……………………………………………………...40
1.4. Взаимоотношения в системе “хозяин-патоген” и особенности
иммунологического ответа ……………………………………………...……...44
1.5. Апоптоз в системе реагирования “патоген-хозяин”………………………46
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ……………….....52
2.1. Микробиологические методы исследования…………………………...54
2.2. Молекулярно-генетические методы исследования………….................63
2.3. Иммунологические методы исследования………….……………….....67
2.4. Статистическая обработка результатов …………..………………….....74
ГЛАВА
3.
ХАРАКТЕРИСТИКА
МОРФОЛОГИЧЕСКИХ
И
ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ ОСОБЕННОСТЕЙ УСЛОВНО-ПАТОГЕННЫХ
ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ (СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ)……………... 75
3.1.
Характеристика
клинических
штаммов
условно-патогенных
энтеробактерий….……………………………………………………………75
3.1.1. Морфологические и культуральные свойства и контакты между
клетками Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., E.coli,
Proteus spp. ………………………………………………………………..…76
3.2. Факторы патогенности монокультур бактерий родов Enterobacter spp.,
Citrobacter spp., Serratia spp., E.coli, Proteus spp. и их сокультивируемых
вариаций: Enterobacter spp.+Citrobacter spp., Enterobacter spp.+Serratia spp.,
Citrobacter spp.+ Serratia spp., Enterobacter spp.+Е.coli, Citrobacter spp.+Е.coli,
Serratia spp.+Е.coli, Proteus spp.+Enterobacter spp., Proteus spp.+Citrobacter
spp.,
Proteus
spp.+Serratia
spp.,
Proteus
spp.+Е.coli
…………………………………………………………...……………………...98
3.2.1. Адгезивная активность …………………………………………... ..99
3.2.2. Гемолитическая активность …………………………………...…..104
3.2.3. ДНК-азная активность ……………………………………...……...110
3.2.4. Лецитиназная активность ……………………...…………………..113
3.3. Характеристика персистентных свойств монокультур бактерий родов
Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., Е.coli, Proteus spp. и их
сокультивируемых вариаций ………………………..……………………...117
3.3.1. Антилизоцимная активность ……………………………………….118
3.3.2. Антиинтерфероновая активность ………………………………….121
3.3.3. Антикомплементарная активность ………………………………...125
3
3.4. Изучение вирулентности и токсигенности монокультур бактерий родов
Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., Е.coli, Proteus spp. и их
сокультивируемых вариаций: Enterobacter spp.+Citrobacter spp. (Е+С),
Enterobacter spp.+Serratia spp.(Е+S), Citrobacter spp.+Serratia spp.(C+S),
Enterobacter spp.+Е.coli(Ent+Е.coli), Citrobacter spp.+Е.coli(C+Е.coli), Serratia
spp.+Е.coli (S+Е.coli), Proteus spp.+Enterobacter spp.(Prot+Ent), Proteus
spp.+Citrobacter spp.(Prot+Citr), Proteus spp.+Serratia spp.(Prot+Ser), Proteus
spp.+Е.coli(Prot+Е.coli) ………………………………………………………129
3.4.1. Легочная модель ……………………………………….…………...129
3.4.2. Отек лапки ………………………………………………………......133
3.4.3. Петля тонкого кишечника кролика …………………………….….138
3.4.4. Кожнонекротическая проба ……………………….……………….151
3.4.5. Протистоцидная ативность …………………………………….......161
3.5. Устойчивость бактерий родов Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia
spp., Е.coli, Proteus spp. и их совместно культивируемых вариаций:
Enterobacter spp.+Citrobacter spp., Enterobacter spp.+Serratia spp., Citrobacter
spp.+Serratia spp, Enterobacter spp.+Е.coli, Citrobacter spp.+Е.coli, Serratia
spp.+Е.coli, Proteus spp.+Enterobacter spp., Proteus spp.+Citrobacter spp., Proteus
spp.+Serratia spp., Proteus spp.+Е.coli к широко применяемым в практике
антибиотикам ………………………………………………...............................166
3.6. Профиль плазмидной ДНК монокультур бактерий родов Enterobacter
spp., Citrobacter spp., Serratia spp., E.coli, Proteus spp. и их сокультивируемых
вариаций: Enterobacter spp.+Citrobacter spp., Enterobacter spp.+Serratia spp.,
Citrobacter spp.+Serratia spp, Enterobacter spp.+Е.coli, Citrobacter spp.+Е.coli,
Serratia spp.+Е.coli, Proteus spp.+Enterobacter spp., Proteus spp.+Citrobacter
spp., Proteus spp.+Serratia spp., Proteus spp.+Е.coli ………………………….174
3.7. «Островки патогенности» монокультур бактерий родов Enterobacter spp.,
Citrobacter spp., Serratia spp., E.coli, Proteus spp. и их совместно
культивируемых вариаций: Enterobacter spp.+Citrobacter spp., Enterobacter
spp.+Serratia spp., Citrobacter spp.+Serratia spp, Enterobacter spp.+Е.coli,
Citrobacter spp.+Е.coli, Serratia spp.+Е.coli, Proteus spp.+Enterobacter spp.,
Proteus spp.+Citrobacter spp., Proteus spp.+Serratia spp., Proteus
spp.+Е.coli……………………………………………………………………...197
ГЛАВА 4. ВЗАИМООТНОШЕНИЯ В СИСТЕМЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ
“ПАТОГЕН – ХОЗЯИН” (СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ…….……..203
4.1. Влияние монокультур бактерий родов Enterobacter spp., Citrobacter spp.,
Serratia spp., E.coli, Proteus spp. и их сокультивирумых вариаций: Enterobacter
spp.+Citrobacter spp., Enterobacter spp.+Serratia spp., Citrobacter spp.+Serratia
spp, Enterobacter spp.+Е.coli, Citrobacter spp.+Е.coli, Serratia spp.+Е.coli, Proteus
spp.+Enterobacter spp., Proteus spp.+Citrobacter spp., Proteus spp.+Serratia spp.,
Proteus spp.+Е.coli, на фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов
мышей ………………………………….………………………………………205
4
4.2. Влияние монокультур бактерий родов Enterobacter spp., Citrobacter spp.,
Serratia spp., E.coli, Proteus spp. и их сокультивируемых вариаций: Enterobacter
spp.+Citrobacter spp., Enterobacter spp.+Serratia spp., Citrobacter spp.+Serratia
spp, Enterobacter spp.+Е.coli, Citrobacter spp.+Е.coli, Serratia spp.+Е.coli, Proteus
spp.+Enterobacter spp., Proteus spp.+Citrobacter spp., Proteus spp.+Serratia spp.,
Proteus spp.+Е.coli, на лизосомальную активность перитонеальных макрофагов
мышей …………………………………….……………………………………...208
4.3. Сравнительная оценка влияния монокультур бактерий родов Enterobacter
spp., Citrobacter spp., Serratia spp., E.coli, Proteus spp. и их сокультивируемых
вариаций: Enterobacter spp.+Citrobacter spp., Enterobacter spp.+Serratia spp.,
Citrobacter spp.+Serratia spp, Enterobacter spp.+Е.coli, Citrobacter spp.+Е.coli,
Serratia spp.+Е.coli, Proteus spp.+Enterobacter spp., Proteus spp.+Citrobacter spp.,
Proteus spp.+Serratia spp., Proteus spp.+Е.coli, на внутриклеточный
кислородзависимый
метаболизм
перитонеальных
макрофагов
мышей……………………………………………………………………………211
4.4. Сравнительное изучение влияния монокультур бактерий родов
Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., E.coli, Proteus spp. и их
сокультивируемых вариаций: Enterobacter spp.+Citrobacter spp., Enterobacter
spp.+Serratia spp., Citrobacter spp.+Serratia spp., Enterobacter spp.+Е.coli,
Citrobacter spp.+Е.coli, Serratia spp.+Е.coli, Proteus spp.+Enterobacter spp.,
Proteus spp.+Citrobacter spp., Proteus spp.+Serratia spp., Proteus spp.+Е.coli, на
формирование
экстрациллюлярных
сетей
периферической
крови
………………………………………………………………………………...….215
4.5. Сравнительное изучение влияния монокультур бактерий родов
Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., E.coli, Proteus spp. и их
сокультивируемых вариаций: Enterobacter spp.+Citrobacter spp., Enterobacter
spp.+Serratia spp., Citrobacter spp.+Serratia spp., Enterobacter spp.+Е.coli,
Citrobacter spp.+Е.coli, Serratia spp.+Е.coli, Proteus spp.+Enterobacter spp.,
Proteus spp.+Citrobacter spp., Proteus spp.+Serratia spp., Proteus spp.+Е.coli, на
феномен апоптоза клеток перитонеального экссудата в системе «патогенхозяин» ………………………………………………………………………….217
ЗАКЛЮЧЕНИЕ …………………………………………………………………....220
ВЫВОДЫ ……………………………………………………………………..…….228
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ……………………………….………..230
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ……………………………………………………….231
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ………………………………………………………..232
5
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность темы исследования и степень ее разработанности
Организм хозяина − экологическая ниша для многих разнообразных
микроорганизмов, которые в норме и патологии заселяют его биотопы. Проблема
инфекционной патологии человека, рассматриваемая в последние годы в рамках
медицинской микробиологии, свидетельствует о серьезных, как качественных, так
и количественных изменениях в структуре инфекционной заболеваемости
вызванной, в том числе и аутофлорой. Указанное во многом предопределяет
объединение усилий исследователей различного профиля и ранга, которые
интенсифицируют исследования в области взаимодействий микроорганизмов и их
воздействия на макроорганизм [272].
Изменение этиологической структуры инфекционных процессов – сложная и
до настоящего времени неразрешенная проблема, в основе которой лежат
взаимоотношения между патогенными и условно-патогенными бактериями,
составляющих как нормо-, так и патофлору организма человека. Микробиоцинозы
тела
хозяина
представляют
собой
сложные
системы,
отличающиеся
многокомпонентностью и количественным разнообразием. Общепризнано, что в
процессе эволюции при взаимодействии организма человека с окружающими его
микроорганизмами произошел отбор определенных видов микробов, способных к
прикреплению
и
колонизации
слизистых
оболочек
соответствующих
экологических ниш и использующих макроорганизм, как новую среду для
обитания. Так сформировались симбиотические сообщества, составляющие
нормо- и патофлору человека и животных [267]. Совершенно очевидно, что в
природе не существует так называемых чистых биосистем и подавляющее
большинство
результатом
явлений,
наблюдаемых
эволюционно
в
сложившихся
естественных
форм
условиях,
существования
является
различных
микробных ассоциаций [91]. Широкое распространение микроорганизмов,
существование в близких территориальных границах, конкуренция за питательные
ресурсы, борьба за сохранение вида и рода – все это неизбежно приводит к
6
тесному взаимодействию биологических агентов во всем многообразии их
проявлений
[17].
Механизмы
значительной
вариабельностью
многообразие
клинических
взаимодействий
и
бактерий
неспецифичностью,
проявлений
характеризуются
что
инфекционных
определяет
процессов.
Взаимоотношения бактерий основаны на их взаимной адаптации, сигнализации
друг другу, в которой прослеживается универсальный принцип регуляции
паразитарных систем с использованием внешних и внутренних связей, где
превалирующим признаком условных патогенов является токсигенность [85].
Переосмыслению так же подвергнуты взгляды на патогенность бактерий,
рассматриваемую в настоящее время, как динамическое состояние условного и
безусловного патогена, следствием которого является персистенция, как новый
вариант существования возбудителей. «Тактическое же разнообразие приемов, при
помощи которых возбудителю удается отстоять свое право на выживание в
организме, достаточно велико, хотя одновременно и стереотипно» [245]. Среди
ассоциаций многочисленны примеры симбиотических форм взаимоотношений
двух и более микроорганизмов разных видов, при которых создаются
взаимовыгодные условия, и ассоцианты совместно участвуют в регуляции
отношений с внешней средой [21]. Периодический анализ и осмысление на новом
уровне многочисленных проявлений ассоциаций позволяют выяснить патогенез
ряда инфекционных заболеваний различной этиологии, или правильно оценить
происхождение
тех
или
иных
аномалий
в
структуре
микроорганизмов,
приводящих к изменению их типичных свойств или проявлению совершенно
новых необычных биологических свойств. Бактерии не остаются безучастными к
антибактериальному воздействию ассоциантов, а так же к различным изменениям
условий существования. Они адаптируются к ним, изменяя свои свойства и,
прежде всего, обменные процессы. В результате этих изменений происходит
образование устойчивых к антибактериальному воздействию форм, отличных от
исходной культуры по своим морфологическим, биохимическим, антигенным и
другим свойствам. Образование таких устойчивых форм наблюдается как в
7
лабораторных условиях, так и в условиях естественного роста и является
выражением приспособления бактерий к условиям внешней среды [181].
Для уяснения этих вопросов со стороны исследователя, в этой связи
представляется весьма актуальным изучение, как фенотипических, так и
генотипических признаков, контролирующих взаимное индуцирование факторов
вирулентности, персистенции, токсигенности, множественной лекарственной
устойчивости условно-патогенных грамотрицательных микроорганизмов.
В
свете
последних
достижений
молекулярной
и
прикладной
микробиологии, процесс микроэволюции патогенности, в том числе и
токсигенности, происходит на генетическом уровне. Установлены единые
универсальные участки генов, которые сгруппированы в мобильные кластеры,
получившие название “островов патогенности”, способных перемещаться между
различными микроорганизмами. Группы этих генов способны к горизонтальному
и вертикальному перемещению, их встраивание происходит в определенные
сайты бактериальной ДНК («горячие точки») [174]. Представленный механизм
изменения патогенности может рассматриваться таким образом, как один из
механизмов эволюции бактерий, важный для понимания ее закономерностей.
Приобретение
их
в
процессе
“микроб-микробных”
взаимоотношений
в
различных эпитопах реализуется микробами в качестве этиологического фактора
при развитии различных инфекций [77].
Известные фенотипические и генотипические признаки микроорганизмов и
выявленные
факторы
патогенности
бактерий,
верифицированные
генами,
плазмидами, транспазонами и хромосомами, входящими в состав кластеров
“островов патогенности”, могут лишь констатировать факт их этиологической
роли в инфекционной патологии человека, но ни в коем случае не разрешает
вопросы, касающиеся взаимодействия возбудителей и макроорганизма [175].
В связи с этим, следует их рассматривать в целом в системе взаимодействия
различных патогенов, что позволяет полноценно оценить специфику развития
механизмов инфекционных процессов в каждом конкретном случае. Наличие
имеющихся и верифицированных на генетическом уровне факторов агрессии
8
микроорганизмов, равно, как наиболее уязвимые звенья систем макроорганизма,
повреждения которых можно связать с локальными особенностями в цепи
развития патогенеза инфекционного заболевания [128].
В качестве оптимальной модели для соответствующих исследований могут
быть выбраны условно-патогенные представители семейства Enterobacteriaceae и
их сокультивируемые вариации, продуцирующие термолабильные токсические
вещества, поскольку имеются убедительные доказательства об универсальности
генетических
детерминант
токсигенными
токсигенности
представителями
взаимодействия
УПЭ
термолабильных
и
их
взаимодействием
Молекулярный
[34].
энтеротоксинов
между
механизм
условно-патогенных
энтеробактерий обусловлен сложной структурой токсинов, характеризующиеся
наличием множества фрагментов. Указанное позволило выявить целый ряд
закономерностей и различий в патогенезе инфекционных процессов, связанных с
термолабильными токсинпродуцирующими монокультурами и их ассоциациями,
которые
относятся
к
условно-патогенным
микроорганизмам.
Расширение
представлений о механизмах взаимодействия токсигенных бактерий имеет и
прикладное значение, поскольку одной из ключевых проблем теоретической и
практической
медицины
этиопатогенетического
заболеваний,
на
современном
подхода
вызываемых
лечения
и
этапе
является
профилактики
энтеротоксигенными,
как
разработка
инфекционных
моно-,
так
и
ассоциированными вариациями условно-патогенных бактерий [421].
Исходя из вышеуказанного, становится важным сравнительное изучение
каждого иерархического уровня паразитарных отношений. Если удается связать их
воедино с морфологическим описанием процесса, сравнительной характеристикой
факторов патогенности, генетическим контролем, то исследование развития и
проявлений инфекционного процесса представляется актуальной проблемой и с
медицинской и с общебиологической точки зрения.
9
Цель исследования
Дать комплексную характеристику некоторым свойствам, определяющих
патогенный потенциал сокультивируемых вариаций бактерий Enterobacter,
Citrobacter, Serratia, E.coli, Proteus.
Задачи исследования
1. Выделить от больных, страдающих различными инфекциями, штаммы
Enterobacter,
Citrobacter,
культуральных,
Serratia,
морфологических
E.
coli,
Proteus
свойств
и
и
провести
изучение
ультраструктуры
их
сокультивируемых вариаций.
2. Дать сравнительную характеристику вирулентных свойств монокультур
Enterobacter, Citrobacter, Serratia, E. coli, Proteus и их сокультивируемых вариаций
на различных биологических моделях и провести поиск штаммов, обладающих
комплексом факторов патогенности.
3. Провести сравнительное изучение спектра лекарственной устойчивости у
монокультур
Enterobacter,
Citrobacter,
Serratia,
E.
coli,
Proteus
и
их
сокультивируемых вариаций к широко применяемым в практике антибиотикам.
4. У монокультур Enterobacter, Citrobacter, Serratia, E. coli, Proteus и у их
сокультивируемых вариаций определить природу генетических детерминант,
контролирующих факторы патогенности и антибиотикорезистентность.
5. Изучить механизмы действия монокультур бактерий Enterobacter, Citrobacter,
Serratia, E. coli, Proteus и их сокультивируемых вариаций на функции
фагоцитирующих клеток.
6. Сравнить влияние монокультур бактерий Enterobacter, Citrobacter, Serratia, E.
coli, Proteus и их сокультивируемых вариаций на апоптоз перитонеальных
фагоцитов мышей.
10
Методология и методы исследования
Клинический материал был получен из бактериологических лабораторий
ГБУЗ
«Республиканская
детская
клиническая
больница»
и
ГБУЗ
«Республиканская клиническая больница им. Г.Г. Куватова» г.Уфы.
Эксперименты выполнялись на 2250 белых мышах-самцах (беспородных и
линии СВА) массой 18-20 г., на 60 кроликах массой 2,5-3,0 кг. и 360 белых
мышах–сосунках.
Животные содержались в условиях вивария ГБОУ ВПО
БГМУ Минздрава России с естественным световым режимом на стандартной
диете
лабораторных
животных
(ГОСТ
Р50258-92)
с
соблюдением
Международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных
животных, используемых при экспериментальных исследованиях (1997г.), а
также
правил
лабораторной
практики
при
проведении
доклинических
исследований в РФ (ГОСТ З 51000.3-96 и 51000.4-96)[199].
Материалом для наших исследований послужили 265 штаммов условнопатогенных микроорганизмов, выделенных от 3658 больных страдающих
различными инфекциями: по 50 штаммов бактерий Enterobacter spp., Citrobacter
spp., Serratia spp., E.coli, Proteus spp., а также по 10 сокультивируемых вариаций
штаммов Enterobacter spp.+Citrobacter spp. (Е+С), Enterobacter spp.+Serratia spp.
(Е+S), Citrobacter spp.+Serratia spp. (C+S), Enterobacter spp.+Е.coli (Ent+Е.coli),
Citrobacter
spp.+Е.coli
(C+Е.coli),
Serratia
spp.+Е.coli
(S+Е.coli),
Proteus+Enterobacter spp. spp.(Prot+Е), Proteus spp.+Citrobacter spp. (Prot+С),
Proteus spp.+Serratia spp. (Prot+S), Proteus spp.+Е.coli (Prot+Е.coli).
В качестве эталонных культур были использованы штаммы E.coli,
обладающие
комплексом
факторов
патогенности,
которые
были
нами
депонированы в ГИСК им. Л.А. Тарасевича и запатентованы.
Все выделенные культуры идентифицировали по биохимическим свойствам.
Изучение подвижности проводили стандартыми методами «висячая капля» и
«раздавленная капля». Дополнительно использовали столбики с полужидким
агаром [239]. Изучение клеточной поверхности и особенностей морфологической
структуры моно- и сокультивируемых Гр- бактерий проводили с помощью
11
оптического
(«Биолам»,
Россия)
и
электронного
(«JEM-100B»,
Япония)
микроскопов. Адгезивную активность микроорганизмов определяли в реакции
гемагглютинации
с
эритроцитами
птиц
(Габидуллин
З.Г.
Биологическая
характеристика штаммов бактерий рода Proteus, выделенных при инфекционных
процессах различной локализации: автореф. дисс… д-ра мед.наук / З.Г.
Габидуллин. Саратов, 1989. 45с.)[97] и I(0) группы крови человека (Брилис В.И.
Методика определения адгезивного процесса микроорганизмов / В.И. Брилис, Т.А.
Ленцнер, А.А. Ленцнер // Лаб. дело. 1986. №4. С. 210-212)[45]. Продукцию - и
тиолзависимого гемолизина определяли по рекомендациям Габидуллина З.Г.
(Габидуллин З.Г. Биологическая характеристика штаммов бактерий рода Proteus,
выделенных при инфекционных процессах различной локализации: автореф.
дисс… д-ра мед.наук / З.Г. Габидуллин. Саратов, 1989. 45с.)[96] и Albesa J. et al.
(Albesa J. A tiol-activated hemolysin in gram-negative bacteria / J. Albesa, L.J. Barberis,
M.C. Pajaro // Can. J. Microbiol. 1985.Vol.31.P.297-300)[290]. ДНКазную активность
определяли по методу Jeffries C.D. (Jeffries C.D. Rapid metod for determining the
activity of microorganisms on nuclear acids / Jeffries C.D., Holtman D.F., Gas D.G. // J.
of
Bacteriology.
1957.Vol.73.P.590-591)[350].
Определение
лецитиназной
активности проводили на желточном агаре Чистовича Ю.Н. (Справочник по
микробиологическим и вирусологическим методам исследования: руководство для
врачей / под ред. М.О. Берге. Москва: 1982. 462с.)[270], антилизоцимную
активность (АЛА) проводили по методу Бухарина О.В. и др. (Бухарин О.В. Метод
определения антилизоцимной активности микроорганизмов / О.В. Бухарин, Б.Я.
Усвяцов, А.П. Малышкин, Н.В. Немцева // Журнал микробиол., эпидемиол. и
иммунобиол. 1984. №2. С.27-28)[56], антиинтерфероновую активность (АИА) - по
методу Соколова В.Ю.(Персистенция микроорганизмов / под ред. О.В. Бухарина.
Куйбышев, 1990. С. 83-93)[248], антикомплементарную активность (АКА) – по
методу Бухарина О.В. (Бухарин О.В. Изучение антикомплементарной активности
стафилококков / О.В. Бухарин, Ю.А. Брудастов, Д.Т. Дерябин // Клин. лаб. диагн.
1992. №11. С. 68-70.)[55], изучение антибиотикорезистентности проводили по
общепринятой методике с помощью стандартных дисков в соответствии с
12
Инструкцией МЗ СССР от 1986 года, утвержденной Управлением по внедрению
новых лекарственных средств и медицинской техники (Лабораторные методы
исследования в клинике: справочник / под редакцией проф. В.А Меньшикова.
М.:Медицина, 1987, с.341-343.)[201], дополнительно использовали питательные
среды с определенной концентрацией антибиотиков по Миллеру Дж. (Миллер Дж.
Эксперименты в молекулярной генетике / Миллер Дж. под редакцией проф.
Алиханяна С.И. // Москва, Издательство Мир, 1986, С.436.)[123]. Протистоцидную
активность изучали на простейших – Paramecium caudatum (Галикеев Х.Л.
Изучение вирулентности дизентерийных бактерий с использованием инфузорий
туфелек / Х.Л. Геликеев, Н.И. Потатуркина-Нестерова // Здравоохр. Казахстана,
1987, №1. С.34-46.)[104]. Вирулентность оценивалась по способности вызывать
гибель при «интраназальном заражении» белых мышей (Войно-Ясенецкая М.К.
Опыт изучения дизентерийной инфекции у лабораторных животных / М.К. ВойноЯсенецкая // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1957. №4.С.65-69)[89],
токсигенность – в тесте «отек лапки» (Вартанян Ю.П. и соавт. Отек лап белых
мышей – тест для оценки активности энтеротоксинов / Ю.П. Вартанян и соавт. //
Бюлл. эксп. биол. и медицины. 1978. №2. С. 150-152)[83], на модели
«изолированная петля тонкого кишечника кролика» (Gianella R.A. Suckling mouse
model for detection of heat-stable Escherichia coli enterotoxin: characteristics of the
model
/
проводили
R.A.
Gianella)[199].
Изучение
кожно-некротической
по
общепринятой
методике
(Габидуллин
З.Г.
способности
Биологическая
характеристика штаммов бактерий рода Proteus, выделенных при инфекционных
процессах различной локализации: автореф. дисс… д-ра мед.наук / З.Г.
Габидуллин. Саратов, 1989. 49с.)[108]. Выделение плазмидной ДНК по методу
Каdо C.T., Liu S.T.(Каdо C.T., Liu S.T. Rapid procedure for detection and isolation of
large and small plasmids / C.T. Каdо, S.T. Liu // J. Bacteriol. 1981. Vol. 145. P.13651373.)[353]. Элиминацию плазмид проводили при помощи акридинового
оранжевого, бромистого этидия, додецилсульфата натрия и РНК-ингибиторами
транскрипции (рифампицин, актиномицин Д) по методу Дж. Миллера (Дж.
Миллер. Эксперименты в молекулярной генетике / Дж. Миллер // Москва, Мир.
13
1976. 325с.)[353]. Полимеразную цепную реакцию проводили с использованием
пары праймеров, подобранных Boyd E.F., Hart D.L. (Boyd E.F., Hart D.L.
Cromosomal regions specific to the pathogenic isolates of Escherichia coli have a
philogenetically clastered distribution / E.F. Boyd, D.L. Hart // J. Bacteriol. 1998. Vol.
180. P.1159-1165.)[173]. Выявление коньюгативных плазмид проводили по
методической рекомендации составленной коллективом авторов (Мамонтова Т.Н.,
Белокрысенко С.С., Тихомиров Е.Д., Солодовников Ю.П., Турчинская М.В.
Методические рекомендации по обнаружению и классификации R-плазмид у
шигелл / Москва, МЗ СССР. 1983.)[177].
Модель острой экспериментальной инфекции воспроизводили в 3-х
экспериментальных группах. Эксперименты проводились на белых мышах самцах линии СВА – 100 животных в контрольной группе и по 100 животных в
каждой экспериментальной группе:
группа I - моделирование экспериментальной инфекции осуществляли
внутрибрюшинным
введением
бульонных
монокультур
Enterobacter
spp.,
Citrobacter spp., Serratia spp., E.coli, Proteus spp., содержащих LT-энтеротоксин в
дозе LD50 - 5∙108 КОЕ/мл;
группа II - моделирование экспериментальной инфекции осуществляли
внутрибрюшинным
введением
сокультивируемых
вариаций:
Enterobacter
spp.+Citrobacter spp., Enterobacter spp.+Serratia spp., Citrobacter spp.+Serratia spp,
Enterobacter spp.+Е.coli, Citrobacter spp.+Е.coli, Serratia spp.+Е.coli, Proteus
spp.+Enterobacter spp., Proteus spp.+Citrobacter spp., Proteus spp.+Serratia spp.,
Proteus spp.+Е.coli штаммов содержащих LT-энтеротоксин в дозе LD50 - 5∙108
КОЕ/мл;
группа III (контрольная) - введение стерильного бульона Хоттингера для
исключения влияния внешних и внутренних факторов на характеристики
оцениваемых иммунологических параметров.
Оценку всех тестируемых параметров проводили через 12-36-72 часа после
инокуляции монокультур и их сокультивируемых вариаций.
14
Сепарацию фагоцитирующих клеток проводили следующим образом:
резидентные клетки перитонеальных макрофагов (ПМф) у мышей получали
промыванием брюшной полости охлажденной средой 199 с гепарином в
концентрации 10 ед/мл. Все манипуляции проводили при температуре тающего
льда. Выделение макрофагов (Мф) и моноцитов (Мн) из клеточной суспензии, в
процессе культивирования связанное с их адгезивной способностью проводили по
методу Хейфетца Л.Б. (Хейфетц Л.Б. Разделение форменных элементов крови
человека в градиенте плотности верографин-фиколл / Л.Б. Хейфетц, В.А.
Абалакина. // Лаб.дело. 1973. №10.- С.579-581.)[129]. Фагоцитарную активность
исследуемых
клеток
оценивали
по
их
способности
к
захвату
частиц
полистирольного латекса (Фрейдлин И.С. Методы изучения фагоцитирующих
клеток при оценке иммунного статуса человека: учебное пособие / И.С.
Фрейдлин.//Ленинград, 1986. 261с.)[128]. Изучение состояния лизосомального
аппарата фагоцитирующих клеток проводили с помощью метода Зеленина А.В.
(Зеленин А.В. Взаимодействие аминопроизводных акридина с клеткой / А.В.
Зеленин. Москва: Наука, 1971. 231с.)[141]. Изучение НСТ-редуцирующей
активности ПМф проводили по спонтанному и индуцированному тестам
(Маянский
А.Н.
и
соавт.
Характеристика
функциональной
активности
нейтрофилов крови человека с помощью реакции восстановления нитросинего
тетразолия / А.Н. Маянский с соавт. // Журн. микробиол., эпидемиол. и
иммунобиол.1977.№6.С.108-110.)[129].
Определение
образования
экстрациллюлярных сетей проводили по методу Долгушина И.И. c соавт.
(Долгушин И.И. Нейтрофильные ловушки и методы оценки функционального
статуса нейтрофилов / И.И. Долгушин, Ю.С. Андреева, А.Ю. Савочкина // Москва.
Издательство РАМН, 2009. С.131-134.)[129]. Оценку апоптоза эукариотических
клеток проводили в проточном цитофлюориметре (FL3, >600 нм) по структурным
изменениям ядерной ДНК клеток, окрашенных йодистым пропидием (РI)
(Сибиряк С.В. Оценка апоптоза в иммунологических исследованиях / С.В.
Сибиряк, С.В. Хайдуков, А.В. Зурочка. // Екатеринбург. 2008. 48с.)[129].
15
Степень достоверности, апробация результатов, личное участие автора
На
основании
проведенной
проверки
достоверности
первичной
документации (Приказ ректора ГБОУ ВПО «БГМУ» МЗ РФ № 390-а, от
08.11.2013), комиссия в составе председателя – Мурзабаева Х.Х., д.м.н.,
профессора, заведующего кафедрой гистологии, цитологии, эмбриологии; членов
комиссии - Булгакова А.К., д.м.н., профессора кафедры микробиологии,
вирусологии и иммунологии; Лукмановой Г.И., д.м.н., профессора кафедры общей
биологии (акт от 8.11.2013 г.) подтвердила достоверность включенных материалов
в диссертационную работу.
Оценка достоверности результатов исследования выявила что результаты
получены
на
сертифицированном
оборудовании:
выделенные
культуры
идентифицировали по биохимическим свойствам при использовании среды Гисса
с помощью планшет ПБДЭ / Нижне-Новгородский НИИЭМ/, на «Энтеротест»
фирмы «Lachema» (Чехия) и на компьютерной тест - системе типа API фирмы
«BioMeruiox»; изучение клеточной поверхности и особенностей морфологической
структуры бактерий проводили с помощью оптического («Биолам», Россия) и
электронного («JEM-100B», Япония) микроскопов, микроскоп электронный JEM100B, Япония, с ускоряющим напряжением 15, 80 кв., съемку проводили при
инструментальном увеличении в пределах 15-30 тысяч раз, для фотографирования
применяли фотопластинки для ядерных исследований типа «МК», «МР»;
оптическую плотность центрифугата измеряли на ФЭК-56 М при длине волны 600
нм и толщине кюветы 5,17; микроскопические исследования проводили на
микроскопе биологическом рабочем «Биолам Р-11», с увеличением до х1350,
производство ЛОМО, СССР; для очистки воды использовали аквадистиллятор
электрический ДЭ – 4ТЗМОИ, производство ОАО Тюменский завод мед.
оборудования и инструментов; фиксацию результатов микробиологических
исследований проводили фотокамерой «Olimpus»; амплификацию участков ДНК
проводили на термоцикле фирмы «Hybaid»; центрифуга «Фуга/Вортекс микроспин FV-2400», производство ООО Вiosan, Латвия;
ПЦР проводили на
четырехканальном термоциклере «Терцик» научно-производственной фирмы
16
«ДНК-Технология»
(Москва);
электрофоретически,
с
трансиллюминаторе
продукты
последующей
(«VilberLourmat»
амплификации
визуализацией
в
анализировали
УФ-свете
компьютерный
TCP-20M);
на
анализ
электрофореграмм осуществляли при использовании пакета программ TotalLab
from Phoretix (Великобритания);
оценку апоптоза эукариотических клеток
проводили в проточном цитофлюориметре (FL3, >600 нм) по структурным
изменениям ядерной ДНК клеток, окрашенных йодистым пропидием (РI); так же
использовали
камеру
«JENAMED
2»;
Горяева
с
использованием
люминесцентный
светового
микроскоп,
микроскопа
используя
фильтры,
обеспечивающие возбуждающий свет с длинной волны не более 490 нм. и с
эмиссией длинной волны 520 нм. Теория построена на известных, проверяемых
фактах, согласуется с опубликованными в литературе данных Мельникова Н.И.,
Гимранова М.Г., Бухарина О.В., Фадеева С.Б., Туйгунова М.М., Азнабаева Г.К.,
Изикаева В.М., Бондаренко В.М., Габидуллина З.Г., Долгушина И.И., Булгакова
А.К., Перуновой Н.Б., Гибазова Н.Н., Ахтариевой А.А., Гибазова Н.Н., Изикаева
В.М., Идиатуллиной Г.А. Полученные результаты не противоречат данным,
представленным в независимых источниках по данной тематике. В работе
использованы современные методики сбора и обработки исходной информации с
использованием
пакета
прикладных
компьютерных
программ
"Медико-
биологическая статистика" (Primer of Biostatistics, 4th Edition, S.A.Glantz, McGrawHill).
Результаты исследований были представлены на научной конференции
молодых ученых Республики Башкортостан «Медицинская наука» (Уфа,20062013), конференции «Новые лабораторные технологии в диагностике и
лечении заболеваний человека», посвященной 25-летию Центральной научноисследовательской лаборатории Челябинской государственной медицинской
академии
(Челябинск,2006);
«Персистенция
V,
VI
микроорганизмов»
Российской
научной
(Оренбург,2006,2012);
конференции
межвузовской
учебно-методической конференции, посвященной 75-летию Башкирского
государственного
медицинского
университета
(Уфа,2007);
IX
съезде
17
Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов
(Москва, 2007); 73-й итоговой Республиканской научной конференции студентов
и молодых ученых БГМУ «Вопросы теоретической и практической медицины»
(Уфа, 2008); на V ежегодном Всероссийском конгрессе по инфекционным
болезням
(Москва, 2013). Работа обсуждена на совместном заседании
башкирского
отделения
Всероссийского
общества
эпидемиологов,
микробиологов и паразитологов, кафедр микробиологии, вирусологии и
иммунологии, детских инфекционных болезней, общей гигиены с экологией с
курсом гигиенических дисциплин, детской хирургии, биологии, ортопедии и
анестезиологии, факультетской хирургии с курсом колопроктологии ГБОУ ВПО
«Башкирский государственный медицинский университет» Минздрава Россиии и
с ведущими сотрудниками уфимского филиала “Иммунопрепарат” ФГУП НПО
«Микроген» МЗ РФ (Уфа, 2014).
Личный вклад соискателя состоит в непосредственном участии на всех
этапах диссертационного исследования.
Основная идея, планирование научной работы, включая формулировку
рабочей
гипотезы,
диссертационного
определение
исследования
методологии
проводились
и
общей
совместно
концепции
с
научным
консультантом, Заслуженным деятелем науки РФ, член-корр. РАМН, заведующий
кафедрой
микробиологии,
вирусологии,
иммунологии
и
клинической
лабораторной диагностики ГБОУ ВПО «Южно-Уральский государственный
медицинский университет» Минздрава России д.м.н., профессором Долгушиным
И.И.
Цель и задачи сформулированы совместно с научным консультантом.
Дизайн исследования разработан лично диссертантом.
Анализ современной и зарубежной литературы по изучаемой проблеме и
интерпретация результатов исследования проведены лично диссертантом.
Лабораторные исследования осуществлялись лично диссертантом при участии
сотрудников кафедр микробиологии, вирусологии и иммунологии, факультетской
хирургии с курсом колопроктологии, Центральной научной исследовательской
18
лаборатории
ГБОУ
университет»
ВПО
Министерства
«Башкирский
государственный
здравоохранения
Российской
медицинский
Федерации
профессором Габидуллиным З.Г., профессором Туйгуновым М.М., профессором
Булгаковым А.К., профессором Алсынбаевым М.М., профессором Ахтариевой
А.А., профессором Суфияровым Р.С., профессором Тимербулатовым М.В.,
профессором Медведевым Ю.А., доцентами Давлетшиной Г.К., Савченко Т.А.,
Саляховым Р.З., ассистентами Гибазовым Н.Н., Насыровой Р.Ф., Туйгуновой В.Г.,
Изикаевым В.М., д.м.н., профессором института клеточного и внутриклеточного
симбиоза УрО РАН Перуновой Н.Б.
В работе использованы современные методики сбора и обработки исходной
информации с использованием пакета прикладных компьютерных программ
"Медико-биологическая статистика" (Primer of Biostatistics, 4th Edition, S.A.Glantz,
McGraw-Hill). Статистическая обработка первичных данных и анализ полученных
результатов, написание и оформление рукописи диссертации, представление
результатов работы в научных публикациях и в виде докладов на конференциях
осуществлялись диссертантом самостоятельно.
Положения, выносимые на защиту:
1. У бактерий Enterobacter, Citrobacter, Serratia, E. coli, Proteus при совместном
культивировании
происходит
изменение
конструкции
и
архитектуры
взаиморасположения клеток.
2. При совместном культивировании бактерий Enterobacter, Citrobacter,
Serratia, E. coli, Proteus происходит взаимное индуцирование факторов
вирулентности и персистенции.
3. При совместном культивировании бактерий Enterobacter, Citrobacter,
Serratia, E. coli, Proteus происходит увеличение количества клонов, несущих
внехромосомные генетические детерминанты, контролирующие продукцию
факторов патогенности и антибиотикорезистентности.
19
4. При
введении
сокультивируемых
вариаций
бактерий
Enterobacter,
Citrobacter, Serratia, E. coli, Proteus в организм экспериментальных животных по
сравнению
с
их
монокультурами
происходит
изменение
показателей
врожденного иммунитета организма хозяина.
Научная новизна
Впервые с помощью электронного микроскопа описаны морфологические
особенности взаимоотношений между бактериальными клетками у монокультур
Enterobacter, Citrobacter, Serratia, E.coli, Proteus и их сокультивируемых вариаций
(Enterobacter+Citrobacter,
Enterobacter+Serratia,
Enterobacter+E.coli,
Citrobacter+Serratia, Citrobacter+E. coli, Serratia+E.coli, Proteus+Enterobacter,
Proteus+Citrobacter,
Proteus+Serratia,
Proteus+E.coli).
Электронно-
микроскопическое исследование показало, что в концентрических зонах колоний
сокультивируемых бактерий обнаружены клетки, имеющие большое количество
швермеров, которые образуются в зависимости от пульсации “биологических
часов”. При этом у сокультивируемых вариаций бактерий Enterobacter,
Citrobacter, Serratia, E. coli, Proteus выявлены различные типы контактов: «конец в
конец», «конец в бок», «бок в бок», плотное слипание, образование перемычек на
уровне наружных мембран, количество которых превалирует у совместно
культивируемых вариаций. При электронно-микроскопическом исследовании
обнаружено, что клетки сокультивируемых вариаций с высокой адгезивной
активностью в большом количестве (более 15) плотно прилипают к эритроцитам
цыпленка, тогда как количество прилипающих клеток у монокультур составляло
не более 10 на единичный эритроцит. In vitro и in vivo исследованы факторы
патогенности бактерий Enterobacter, Citrobacter, Serratia, E. coli, Proteus,
выделенных при различных инфекциях. Дана сравнительная молекулярнобиологическая
характеристика
факторов
патогенности
монокультур
и
сокультивируемых вариаций бактерий Enterobacter, Citrobacter, Serratia, E.coli,
Proteus в свете новых представлений о генетических основах патогенности
микроорганизмов. Обнаружены гены, аналогичные «островкам патогенности»
20
E.coli. При этом были протестированы штаммы E.coli ГИСК №280 (Патент №
2293765), выделенные в ассоциации с Serratia marcescens, обладающие
комплексом факторов патогенности, депонированные и запатентованные в ГИСК
им. Л.А. Тарасевича; а также штамм E.coli ГИСК №281 (Патент № 2293764),
выделенный в ассоциации с Serratia odorifera. Сравнительно охарактеризованы
молекулярные
механизмы
патогенного
действия
монокультур
и
сокультивируемых вариаций бактерий Enterobacter, Citrobacter, Serratia, E coli,
Proteus на защитные механизмы хозяина. У сокультивируемых вариаций выявлен
более выраженный эффект иммуномодулирующего действия на процессинговую
функцию перитонеальных макрофагов, по сравнению с их монокультур. В
патогенезе
инфекционного
процесса
впервые
изучено
иммунокомпрометирующее влияние монокультур и сокультивируемых вариаций
бактерий Enterobacter, Citrobacter, Serratia,
нейтрофилы.
При
сравнительном
E. coli, Proteus на макрофаги и
изучении
состояния
внутриклеточных
механизмов микробиоцидной активности перитонеальных фагоцитов под
влиянием монокультур и сокультивируемых вариаций энтеробактерий выявлено
более
выраженное
действие
сокультивируемых
вариаций
на
ферменты
гексозомонофосфатного шунта фагоцитов, что характеризовалось резким
повышением образования супероксидных анионов. Сравнительное изучение
влияния монокультур и сокультивируемых вариаций энтеробактерий на феномен
апоптоза клеток воспалительного перитонеального экссудата и спленоцитов
хозяина показало повышение запрограммированной клеточной смерти популяции
спленоцитов под влиянием сокультивируемых вариаций условно-патогенных
энтеробактерий.
Теоретическая и практическая значимость работы
Экспериментальные
данные
патогенетических
механизмов
действия
монокультур и сокультивируемых вариаций бактерий Enterobacter, Citrobacter,
Serratia, E. coli, Proteus позволяют расшифровывать многие стороны развития
ассоциированных инфекционных процессов, вызванных условно-патогенными
энтеробактериями, а также сформировать теоретические предпосылки для
21
разработки
новых
подходов
инфекций.
Выявлены
лечения
наиболее
и
профилактики
уязвимые
звенья
ассоциированных
иммунной
системы,
повреждения которых можно связать с локальными особенностями в цепи
патогенеза ассоциированных инфекционных процессов хозяина. Механизмы
действия представителей Гр- микрорганизмов в системе взаимодействия
“патоген–хозяин” раскрывают особенности развития инфекционных процессов,
обусловленных как моно-, так и ассоциированными условно-патогенными
энтеробактериями, что дает предпосылки этиологической значимости каждого из
патогенов как при моно-, так и при ассоциированных инфекционных процессах,
вызваемых вышеперечисленными энтеробактериями. Комплексное молекулярнобиологическое
применимые
тестирование
в
качестве
клинических
штаммов
тест-культур
штаммы
позволило
отобрать
условно-патогенных
энтеробактерий, обладающие комплексом факторов патогенности, которые могут
быть использованы как эталонные при идентификации условно-патогенных
микроорганизмов, а также при производстве биопрепаратов. Расшифрован
механизм иммуномодулирующего действия некоторых факторов патогенности
моно-
и
ассоциированных
патогенных
экссудата.
энтеробактерий
Выявлены
культур
на
некоторых
макрофагальные
наиболее
уязвимые
представителей
клетки
звенья
условно-
перитонеального
иммунной
системы,
повреждения которых можно связать с локальными особенностями в цепи
патогенеза инфекционного процесса.
Внедрение результатов исследования в теоретическую и практическую
медицину
будет
способствовать
этиопатогенетического
подхода
разработке
лечения
и
оптимальных
профилактики
вариантов
инфекционных
процессов, а также своевременной коррекции иммунологических нарушений,
связанных с действием ассоциаций условно-патогенных энтеробактерий в целом.
Внедрение результатов исследования в практику
Издано
учебное
пособие
для
студентов:
«Условно-патогенные
грамотрицательные и грамположительные бактерии», Уфа-2013. Результаты
исследования
используются
в
бактериологических
лабораториях
ГБУЗ
22
Республиканская детская клиническая больница и ГБУЗ Республиканская
клиническая больница имени Г.Г. Куватова г.Уфы. Результаты исследования
внедрены в учебный процесс на кафедрах микробиологии, вирусологии и
иммунологии; детских инфекционных болезней; общей гигиены с экологией с
курсом
гигиенических
дисциплин;
детской
хирургии,
ортопедии
и
анестезиологии; факультетской хирургии с курсом колопроктологии ГБОУ ВПО
«Башкирский государственный медицинский университет» Минздрава России.
По представленным результатам исследования в 2009 году присужден диплом
правительства Республики Башкортостан.
Публикации
Соискатель имеет 33 опубликованные работы, из них по теме диссертации
опубликовано 22 научных работ общим объемом 13,35 печатных листов, в том
числе 16 публикаций в научных журналах и изданиях, которые включены в
перечень российских рецензируемых научных журналов и изданий для
опубликования научных результатов диссертаций (12 статей, 2 патента РФ на
изобретение, 2 тезиса) и опубликовано 3 статьи в научных журналах,
зарегистрированных в базе РИНЦ, 1 работа представлена в материалах
всероссийской конференции, 1 учебное пособие для врачей, 1 монография.
Авторский вклад 80 %.
23
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
В данной главе проведен анализ литературных данных о факторах
патогенности
энтеробактерий,
их
устойчивости
к
антибиотикам
и
взаимодействии с иммунной системой.
1.1. РОЛЬ УСЛОВНО-ПАТОГЕННЫХ ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ
В РАЗВИТИИИ
АССОЦИИРОВАННЫХ ИНФЕКЦИЙ
Патология различных органов и систем человека, вызванная условнопатогенными энтеробактериями является общемедицинской проблемой, поскольку
эти микроорганизмы влияют на различные функции организма человека. В
процессе
филогенетического
развития
живых
организмов,
в
природе
сформировалась микроэкологическая система, характеризующаяся наличием
сложного динамического равновесия между гомеостазом макроорганизма и
микробными ассоциациями, заселяющими его внешние поверхности и органы,
сообщающиеся с внешней средой [266]. Микроорганизмы, формирующие
микрофлору хозяина, находятся между собой в разнообразных взаимоотношениях
(конкуренции, мутуализма, синергизма, комменсализма, паразитизма и др.).
Недостаток или избыток того или иного из этих микроорганизмов, а также
изменения окружающей среды служат сигналом для адаптивных, и возможно
необратимых изменений, в соответствующем звене микроэкологической системы.
Неся в себе элементы саморегуляции, эта система способна противостоять, по
крайней мере в известных пределах, изменениям условий среды и колебаниям
плотности и состава микробных популяций [53].
В
настоящее
совокупность
время
множества
нормальную
микрофлору
микробиоценозов,
рассматривают
занимающих
как
многочисленные
экологические ниши на коже и слизистых всех открытых внешней среде полостей
макроорганизма и находящиеся в симбиотических отношениях с организмом
хозяина. Нормальная микрофлора включает в себя десятки и сотни разнообразных
видов, а их общий численный состав у взрослого человека достигает 1015, что
24
почти на порядок больше числа клеток всех тканей и органов макроорганизма.
Базис нормальной микрофлоры человека составляют облигатно и факультативно
анаэробные бактерии. Даже на коже в ее глубоких слоях число анаэробов в 3-10
раз превышает число аэробных бактерий. В полости рта, в толстой кишке это
соотношение может увеличиваться до 1000:1 и более. Помимо хорошо известных
анаэробных бактерий (бифидобактерии, бактероиды, лактобациллы, пептококки и
др.) в составе нормальной микрофлоры в последние годы обнаружены
многочисленные представители и других факультативно-анаэробных групп
микроорганизмов. Следует иметь в виду, что до настоящего времени число
рутинно культивируемых анаэробных бактерий, составляющих нормальную
микрофлору человека не превышает 7-50% их предполагаемого истинного
количества. Подсчитано, что в кишечнике взрослого человека количество
микроорганизмов составляет - 10¹³, в полости рта - 10¹º, на коже -10¹². Наиболее
сложные микробиоценозы у млекопитающих - это микрофлора толстой кишки,
ротовой полости и носоглотки, а также - гениталий. Поверхность кожи и
пространства носовых ходов формируют более простые микробиоценозы.
О
чрезвычайной сложности состава микрофлоры человека свидетельствует тот факт,
что 1г содержимого слепой кишки содержит порядка двух биллионов
микроорганизмов, представителей 17 различных семейств, 45 родов и свыше 400
различных видов микроорганизмов. Количество характеристических (постоянно
встречающихся) видов относительно невелико, но численно они всегда
представлены в значительном количестве [202].
Микробиоценоз макроорганизма человека включает до 1000 видов бактерий,
и в определенной степени представлен бактериями семейства Еntеrоbасtеriасеае.
Эти микроорганизмы входящие в группу условно-патогенных бактерий весьма
разнообразны по особенностям экологии, кругу хозяев, а также патогенности для
человека, животных, насекомых, растений [103] и биологическая значимость этих
микроорганизмов изучена недостаточно.
Условно-патогенные
энтеробактерии,
могут
быть
этиологическими
факторами гнойно-септических заболеваний, инфекций мочеполового тракта,
25
острых кишечных заболеваний и причиной внутрибольничных инфекций. Многие
условно-патогенные энтеробактерии, способны вызывать заболевания не только
при снижении естественной резистентности макроорганизма, но и при отсутствии
нозологической специфичности [221]. Установлено, что патогенная и условнопатогенная микрофлора, наиболее часто колонизирующая различные участки тела
человека
обладает
полирезистентностью
значительным
к
широкому
набором
ферментативных
спектру
антибиотиков
свойств
[164],
и
являясь
потенциальным этиологическим фактором развития эндогенных инфекционных
заболеваний [137] и микробная флора биоценоза слизистых оболочек организма
хозяина претерпевает изменения у лиц, страдающих различными заболеваниями
[247].
Анализ особенностей микрофлоры различных участков тела человека, а так
же у больных в отделениях интенсивной терапии показал, что у таких больных
происходит замещение индигенной микрофлоры на несвойственные в норме
энтерококки, стафилококки, грамотрицательные энтеро- и неферментирующие
бактерии [44]. Наблюдение за состоянием условно-патогенной
микрофлоры в
пред- и после операционный период у хирургических больных, позволило выявить
уменьшение колонизационной резистентности слизистой оболочки и увеличение
частоты
выделения
ассоциированных
вариаций
условно-патогенных
микроорганизмов, что возможно отражало влияние на общее состояние пациентов
[273]. Имеются данные об отрицательном влиянии интоксикации организма,
вызванных смешанными инфекциями условно-патогенных бактерий, на состояние
общего иммунитета, сердечно-сосудистой системы [120], общего физического
развития детей и подростков [217], а также на репродуктивную систему женщин
детородного возраста [255]. Условно-патогенные микроорганизмы в виде
монокультур или ассоциаций выделяются из мокроты, жидкости, гнойных
отделяемых. При этом к числу наиболее часто высеваемых из патологического
материала относят бактерии семейства Enterobacteriaceae [2,6,232].
Представители семейства Enterobacteriaceae широко распространены в
почве, в воде открытых водоемов [113,153,281]. Некоторые исследователи считают
26
их представителями естественной микрофлоры кишечника человека, т.к. часто
обнаруживаются у практически здоровых людей [92,190,209]. Тем не менее, в
последние годы участились сообщения, где авторы не сомневаются в этиологии
развития
гнойно-воспалительных,
урологических
и
кишечных
инфекций,
вызванных исключительно бактериями семейства Enterobacteriaceae, особенно их
ассоциированными антигеннесущими серотипами [86,98,99].
При этом данные ряда исследователей
показывают, что по частоте
встречаемости бактерии семейства Enterobacteriaceae при ассоциированных
инфекционных процессах составляют от 9,3% до 14,5%, от общего числа из всех
выделенных условно-патогенных грамотрицательных возбудителей [423]. По
мнению же других авторов, высеваемость бактерий семейства Enterobacteriaceae
при острых кишечных заболеваниях значительно выше и достигает 19,4-39,0%
[153,154,155]. Sedlak J. et Rische H. описали случай вспышки пищевой
токсикоинфекции, вызванной бактериями семейства Enterobacteriaceae, еще в
первой половине ХХ века. Plots J. et al. у больных с пищевой токсикоинфекцией
выделили ассоциации энтеробактерий. Описан случай вспышки пищевой
токсикоинфекции, вызванный исключительно токсигенными ассоциированными
культурами Enterobacteriaceae, источником которой явился растительный салат,
который удобряли навозом свиней [264].
Особую актуальность в последние годы приобретает внутрибольничная
инфекция, вызванная УПЭ, которая наносит значительный социальный и
экономический ущерб, увеличивая больничную летальность, различного рода
гнойных осложнений и длительность пребывания больных в стационаре. На долю
семейства Enterobacteriaceae приходится 50% случаев всех внутрибольничных
инфекций [267]. По данным Покровского В.И. из-за внутрибольничной
инфекции, вызываемой условно-патогенными микроорганизмами, страдает
свыше 2 миллионов жителей России. По данным других авторов, регистрируется
до 18 % случаев внутрибольничных инфекций, вызванных УПЭ, из которых 3%
погибают.
Так,
на
долю
УПЭ
приходится
40
%
всех
возбудителей
внутрибольничных септикоциемии. Многочисленны случаи послеоперационных
27
осложнений
в
виде
перитонита,
абсцесса
печени,
перитонзилярного
и
ретрофаренгиального абсцессов [216]. Наряду с ассоциациями E.coli+P.mirabilis и
другими
ассоциациями,
возбудителями
внутрибольничных
инфекций,
ассоциации энтеробактерий обнаруживаются на раневых поверхностях при
ожогах, осложняя при этом заживление ран. Энтеробактериальные ассоциации
вызывают спорадические и эпидемические вспышки менингитов. При этом одна
третья часть заболевших погибает и у 75% реконвелесцентов наблюдаются
тяжелые
неврологические
определенных
осложнения,
особенностей
что
свидетельствует
возбудителей
о
наличии
проходить
через
гематоэнцефалический барьер макроорганизма [99].
Finn et al. (Finn et al., 1988) описали случай септицемии и менингита у
новорожденного, вызванного исключительно ассоциированными культурами
Enterobacteriaceae. При этом источником инфекции у новорожденного явилась
мать, что, возможно, свидетельствует на внутриутробное заражение плода.
Зачастую менингиты осложняются абсцессом мозга и заканчиваются летально. В
литературе имеется
немало
сообщений, свидетельствующих о
развитии
септического шока, вызванного токсигенными и антибиотикорезистентными
ассоциированными культурами условно-патогенных энтеробактерий [204].
В
патологических
процессах,
часто
связанными
с
оперативными
вмешательствами на различные органы и ткани, под действием различных
терапевтических средств происходит селекция условно-патогенных бактерий и
их
ассоциаций,
обладающих
характеризующиеся
резким
факторами
патогенности
снижением
количества
бифидобактерий, энтерококков, аэрококков и
поддерживается
и
персистенции,
лактобактерий,
в результате развивается и
транслокация условно-патогенных микробов и токсинов в
кровяное русло с инфицированием различных органов и тканей [134].
УПЭ
часто выделяются от больных с воспалительными процессами
респираторного тракта. Эти микроорганизмы вызывают инфекционные процессы
практически во всех отделах дыхательной системы, включая асимптомную
локализацию в ротоглотке, хронический бронхит, пневмонию, рак легкого и
28
эмфизему, что наиболее чаще характеризуется выделением смешанных культур
[175].
К.И.Савицкая
с
соавторами
обнаружили
некоторые
особенности
представителей семейства Enterobacteriaceae. Так у детей с острыми гнойнодеструктивными пневмониями, высевались из разных отделов респираторного
тракта,
трехкомпонентные
ассоциации
представителей
семейства
Enterobacteriaceae. Та же группа микроорганизмов вызывала инфекционные
процессы практически во всех отделах дыхательного и репродуктивного трактов
[229]. В настоящее время пневмонии,
вызываемые культурами условно-
патогенных микроорганизмов, являются наиболее частой патологией среди
заболеваний дыхательной системы. Пневмонии, вызываемые ассоциированными
инфекционными условно-патогенными
агентами, имеют очень выраженную
клиническую картину. Важнейшими диагностическими критериями явилось
выделение ассоциированных культур в мокроте, наличие на рентгенограмме зон
обширной инфильтрации и выраженная для пневмонии картина крови. При
пневмониях
вызванных
ассоциациями
гр-
бактерий,
существует
ряд
особенностей. Они часто сочетаются с поражениями других органов, например,
мочевыделительной системы, кожи и др. При этом инфекция может иметь и
гематогенный путь распространения из орофарингеальной области. Другой
особенностью является то, что инфекция нередко распространяется за пределы
патологического очага и сопровождается инфекционным шоком. И смертность
значительно выше при ассоциированных гнойно-воспалительных процессах, чем
при инфекциях вызванных монокультурами условно-патогенных возбудителей
[232]. По данным американских исследователей, в США с каждым годом
увеличивается число урологических заболевании вызванных ассоциациями
грбактерий, особенно их
мультирезистентными
вариантами и при этом
резистентные культуры наиболее часто, высеваются от женщин с уросепсисом.
Среди
грамотрицательных
микроорганизмов,
вызывающих
урологические
заболевания, штаммы условно-патогенных микроорганизмов составляют от 20 %
до 25%, что составляет 15% от общего числа данных заболевании и при этом
29
резистентные культуры ассоциаций наиболее часто, высеваются от женщин с
уросепсисом. Некоторыми авторами было установлено, что из мочи больных с
воспалительными процессами почек и мочевыводящих путей Enterobacteriaceae
и их полигамные вариации высеваются от 10% и до 15% случаях, при котором на
долю детей приходится 8% [224].
При исследовании кишечных расстройств в 10% случаев были выделены
бактерии семейства Enterobacteriaceae. На возможную роль условно-патогенных
микроорганизмов
в
этиологии
кишечных
инфекций
указывают
факты
обнаружения повышенных титров специфических антител в сыворотке крови у
больных энтеритами, при которых патогенные бактерии не обнаруживались. Так,
при обследовании больных детей с острыми кишечными инфекциями в 15% - 20
% случаев выделены ассоциации бактерий семейства Enterobacteriaceae, и по
мнению ряда авторов энтеробактерии могут вызывать ассоциированную
кишечную инфекцию, которая клинически проявляется в форме носительства или
дисбактериоза [237].
Результаты исследований последних лет показывают, что бактерии
семейства Enterobacteriacae по частоте встречаемости при различных гнойновоспалительных ассоциированных процессах, занимают одно из ведущих мест и
составляют от 15 до 20% от общего числа всех выделенных условно-патогенных
возбудителей [243].
Таким образом, из кратко представленного обзора литературы следует
заключить, что ассоциированные инфекции, вызываемые представителями
условно-патогенных грамотрицательных энтеробактерий, остаются недостаточно
изученными. В связи с чем, возникает настоятельная необходимость проведения
комплексных исследований, направленных на отработку оптимальных подходов
по выяснению механизма действия комплекса факторов патогенности, на
развитие ассоциированных гнойно-воспалительных, урологических и кишечных
инфекций.
30
1.2. ФАКТОРЫ ПАТОГЕННОСТИ УСЛОВНО-ПАТОГЕННЫХ
ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ
Вопросы интерференции возбудителя с клеточными и гуморальными
защитными механизмами хозяина, устойчивость микробов к факторам защиты
макроорганизма и способности к размножению in vivo у разных видов микробов
могут определяться специфическими для возбудителя факторами, химическая
природа которых у различных представителей гр- бактерий хорошо изучена [95].
Пусковым и наиболее важным моментом на начальном этапе развития
инфекционного
процесса
является
адгезия
микроорганизмов,
которая
осуществляется благодаря наличию специальных молекул адгезинов, входящих в
состав фимбрий бактериальных клеток или поверхностных структур клеточной
стенки [109].
Наличие фимбрий у бактерий часто коррелирует с их способностью к
адгезии. Молекула белка фимбрий состоит из нескольких участков, среди которых
доминирует Fim A, а также присутствуют Fim G и Fim H. Последний, как
выяснилось позже, ответственен за связывание Д-маннозы [351]. Наличие
фимбрий 1 типа отмечено у большинства представителей условно-патогенных. Р
фимбрии и фимбрии 1 типа у E.coli усиливают в эпителиальных клетках
продукцию цитокинов in vivo и in vitro, в отличие от изогенных пар, не имеющих
этих.
Р
фимбрии
последовательностью,
связываются
с
содержащейся
на
Gal-α(1-4)Gal
поверхности
олигосахаридной
билипидного
слоя
чувствительной клетки, и активизируют внутриклеточный церамид. Церамид в
клетке действует как вторичный мессенджер, активизирует путь к апоптозу и/или
другие внутриклеточные реакции. Аналогично действуют и TNF- α, IL-1β, FASлиганд, которые связываются через соответствующие рецепторы и активизируют
клеточную сфингомиелиназу с последующим расщеплением сфингомиелина и с
освобождением и накоплением церамида. Недавно установлено, что E.coli,
имеющие Р фимбрии, активизируют церамидный путь через освобождение
церамида из гликолипидных рецепторов эукариотических клеток. Изогенные пары
штаммов, имеющие 1 тип фимбрии, не обладают такой способностью [397].
31
В настоящее время многие исследователи, отмечая важную роль фимбрий в
адгезивной активности, не исключают значения других структурных компонентов
бактериальной клетки, ферментов и продуктов жизнедеятельности в лигандрецепторном взаимодействии между возбудителем и чувствительными клетками
макроорганизма. Так, некоторые авторы относят поверхностный белок условнопатогенных бактерий к факторам, которые усиливают адсорбцию бактериальных
клеток на клетках НЕр-2. Преодолев защитные механизмы хозяина, достигнув
определенного
популяционного
уровня,
параллельно
синтезируя
высоко
специфические токсины или токсические вещества, возбудитель поражает
восприимчивый организм, который в свою очередь реагирует на это развитием
определенного симптомокомплекса инфекционной болезни [21].
Поскольку условно-патогенные энтеробактерии обуславливают острые
кишечные инфекции, урологические и гнойно-воспалительные заболевания, то
особую актуальность приобретают сравнительные исследования именно тех
основных факторов патогенности, которые определяют патогенез заболевания и
связанные с ним все возможные клинические проявления болезни.
Согласно последним данным, факторы патогенности, а это в основном
бактериальные токсины, подразделяются в соответствии с механизмом их
действия на чувствительные клетки хозяина следующим образом:
- повреждающие клеточные мембраны;
- ингибирующие белковый синтез;
-
активирующие
пути
метаболизма,
контролируемые
вторичными
мессенджерами;
- ингибирующие высвобождение нейромедиаторов;
- активирующие иммунный ответ макроорганизма.
Многие бактериальные экзоферменты и экзотоксины (гиалуронидазы,
коллагеназы
и
фосфолипазы)
способны
повреждать
экстрацеллюлярные
структуры или плазматическую мембрану эукариотических клеток с помощью
ферментативного
гидролиза
или
в
результате
формирования
пор.
Эти
повреждения могут вызвать не только прямой лизис клеток, но также
32
способствовать распространению бактерий в макроорганизме. К представителям
этой группы токсинов относятся: -токсин Clostridium perfringens, стрептокиназа
Streptococcus
pyogenes.
Наиболее
изученными
в
этом
отношении
у
Enterobacteriaceae является нейраминидаза и гиалуронидаза [133].
Порообразующие токсины и ферменты в соответствии со своим названием
формируют трансмембранные поры и нарушают селективный вход и выход
ионов через плазматическую мембрану. Эта группа токсинов включает RTXтоксины (repeats in toxins) грамотрицательных УПЭ  цитолизины, гемолизины,
лейкотоксины, металлопротеазы, липазы. В научной литературе встречаются
лишь сообщения о продукции гемолизинов ассоциаций Enterobacteriacae, где
авторы указывают о нечастой встречаемости -гемолизина, тогда как продукция
тиолзависимого гемолизина характерна для них и составляет 79,0% случаев [187].
Мембранный белок у энтеробактерий с молекулярной массой 25-32 KD,
выделенный при менингитах, обладает гемолитической активностью, который, по
ряду
данных
авторов,
является
этиологическим
маркером
бактерий,
обусловливающих менингиты, связанных с этими различными биоварами [215].
По данным других авторов, -гемолизин представляет собой белок
определенной
молекулярной
массы.
Механизм
лизиса
эритроцитов
не
расшифрован, однако известно, что при постоянном увеличении концентрации
эритроцитов количество высвобождающегося гемоглобина увеличивается до
определенного уровня, а потом выходит на плато, что свидетельствует о том, что
гемолизин действует по принципу единичного удара. Отмечено, что при
образовании пор под действием гемолизина запускаются вторичные процессы,
которые обусловливают развитие патологических последствий. Эти процессы
включают
активацию
эндонуклеаз,
увеличение
экзоцитоза
тромбоцитов,
высвобождение цитокинов и медиаторов воспаления, а также выделение
эйкозаноидов. Синтез и экспрессия гемолизина сопряжена с наличием hlyдетерминант как плазмидной, так и хромосомной локализации. Известно, что hlyдетерминанта состоит из 4 цистронов: hlyA, hlyB (Ba), hlyC, hlyD(Bd), которые
33
тесно взаимосвязаны между собой и отвечают за определенные механизмы
экспрессии,
синтеза
и
секреции
гемолизина.
Методом
молекулярного
зондирования у C.diversus некоторые исследователи обнаружили аналогичные
участки hlyA и hlyB детерминант с S.typhimurium, тогда как hly-детерминанты
гемолитически активных штаммов P.vulgaris и M.morganii, S.marcescens не были
обнаружены, что может указывать на неоднородность генов, кодирующих синтез
гемолизинов энтеробактерий, либо иную природу гемолитической активности
изученных культур [236].
Данные
литературы
о
гемолитической
активности
энтеробактерий
продолжают оставаться немногочисленными и противоречивыми. Вместе с тем
выявлено, что их гемолизины вызывают деструктивные изменения монослоя
культуры клеток, включают механизмы апоптоза в макрофагах и культурах клеток
J744, развитие геморрагической пневмонии у мышей, оказывают цитотоксическое
действие на эукариотические клетки [10, 264].
Бактериальные токсины, объединенные во вторую группу, поражают
клетки-мишени в результате подавления синтеза белков. Субстратами для этих
токсинов являются фактор элонгации биосинтеза и рибосомальная РНК. Так,
дифтерийный токсин и экзотоксин А Pseudomonas spp. вызывают АДФрибозилирование фактора элонгации 2(EF2), нарушают синтез белка. S.
dysenteriae серотипа 1 и некоторые другие клинически значимые бактерии,
например Stx-продуцирующие Е. coli (STEC), вырабатывают Stx-токсины
(веротоксины). Stx-токсины инактивируют рибосомальную РНК, нарушая ее
взаимодействие с факторами элонгации. Подавление белкового синтеза данной
группой токсинов приводит в конечном итоге к гибели клетки-мишени [402].
Stx-токсины являются мощными цитотоксинами и могут быть разделены на
две группы, отличающиеся по антигенным свойствам и имеющие 5060%
гомологии: Stx/Stxl- и stх2-токсины. Stx-токсин S. dysenteriae серотипа 1 и Stxlтоксин Е. coli отличаются только одной аминокислотой. Различные модификации
stх2-токсинов обнаружены у штаммов Е. coli. Хотя Stx2-токсин рассматривается
в качестве прототипа этой группы, были найдены различные модификации,
34
отличающиеся по антигенным свойствам, степени сродства к рецепторам и
способности активироваться под действием интестинальной слизи. Некоторые из
перечисленных свойств обусловлены различиями в одном-двух нуклеотидах
кодирующих
генов.
По
поводу
выработки
шигаподобного
токсина
ассоциированных культур условно-патогенных микроорганизмов в литературе
встречаются лишь единичные сообщения [406].
Schmidt H. et al. [391], анализируя молекулярное строение Stx токсинов,
продуцируемых
условно-патогенными
энтеробактериями
и
инактивацию
цитопатического действия на клетки линии Vero антитоксической сывороткой,
показали на близкородственное происхождение шигатоксинов некоторых
энтеробактерий с Stx2 E.coli.
Stx токсины имеют типичную “АВ” структуру, то есть ферментативно
активная субъединица “А” нековалентно связана с субъединицей
“В”,
непосредственно взаимодействующей с мишенью. Уже хорошо изучена
кристаллическая структура пентамера В в Stx 1-токсине и холотоксина в Stxтоксине. Подобная АВ-структура токсина характерна для термолабильного
токсина Е. coli, холерного токсина и токсина коклюша [405].
Зрелые мономерные субъединицы “А” и “В” имеют молекулярную массу
около 35 и 7,5 кДа соответственно, при этом холеротоксин содержит 5 молекул
субъединицы
“В”.
Пентамер
субъединицы
“В”
регулирует
связывание
холотоксина с гликолипидными рецепторами на поверхности чувствительных
эукариотических клеток. После связывания полипептид “А” расщепляется на
ферментативно активную часть Ai и часть Аз, соединенные дисульфидной
связью. Аз-часть служит связующим звеном между фрагментом Ai и пентамером
В [404].
Субъединица “А”, обладающая ферментативной активностью, действует
как
N-гликозидаза,
отщепляя
единичный
адениновый
остаток
от
28S
рибосомальной РНК. Подобная депуринизация в конечном итоге подавляет
синтез белка в пораженной клетке. При этом к действию N-гликозидазы
одинаково чувствительны рибосомы про- и эукариот [340].
35
Ген stx у S. dysenteriae всегда расположен на хромосоме, тогда как гены,
кодирующие Stxl и Stx2 некоторых представителей Enterobacteriaceae, могут
входить в состав бактериальной хромосомы или генетического материала
лизогенных бактериофагов. Гены, определяющие А и В субъединицы Stxтоксинов (stxA и stxB соответственно), объединены в оперон. Оперон Stx/Stxlтоксинов (но не Stx2) содержит область, ответственную за регуляцию экспрессии
Stx- и Stxl-токсинов, которая в свою очередь зависит от наличия ионов железа. На
экспрессию Stx2-токсина не влияют ни наличие железа, ни другие внешние
факторы. Однако кишечная слизь, напротив, усиливает активность некоторых
разновидностей Stx2-токсина. Stx-токсины, которые имеют типичные лидерные
последовательности на N-конце, не способны активно выделяться через стенку
бактериальной клетки. Предполагается, что в данном случае токсин выходит во
внешнюю среду при лизисе клетки [347].
Участки генов, контролирующие продукцию Stx токсина различных видов
энтеробактерий, оказались идентичными с детерминантами Stx2 токсина E.coli. В
частности, ген, кодирующий компонент “В” был гомологичен с Stx2 vhcB, а
компонент “А” токсина отличался от Stx2 vhcA E.coli лишь в 4 позициях [354].
Бактериальные токсины, объединенные в третью группу, нарушают
функции различных клеточных белков, не вызывая непосредственной гибели
клеток. Активация или модификация вторичных мессенджеров под действием
токсинов может обусловить значительные нарушения процессов передачи
сигналов, имеющих критическое значение в поддержании разнообразных
функций клеток. Подобным способом действуют термолабильные (LT),
термостабильные (ST) энтеротоксины и токсин CNF типа 1 (CNF1), среди
которых наиболее детально изучены энтеротоксины эшерихий. Бондаренко В.М.
и соавт. [35], методом ДНК-ДНК гибридизации с проклонированным LTопероном, кодирующий синтез холероподобного энтеротоксина E.coli, удалось
установить аналогичные последовательности генов у 39,5% Еntеrоbасtеriасеае,
выделенных от больных с острой кишечной инфекцией. В исследованиях
Karasawa
T.
et
al.
[359]
обнаружили,
что
токсин,
продуцируемый
36
Еntеrоbасtеriасеае иммунологически реагировал с сывороткой против холерного и
термолабильного энтеротоксина E.coli. В дальнейших опытах молекулярногенетического анализа определили гены, кодирующие “А” и “В” участки токсина,
и оказалось, что они имеют 45-46% и 68-69% гомологии, соответственно, с
генами, кодирующими “А” и “В” субъединицы V.cholerae и LT энтеротоксина
E.coli. Хотя в отличие от предыдущих, токсин, продуцируемый Citrobacter
freundii, не вызывал накопление экссудата в изолированной петле тонкого
кишечника. Все эти данные свидетельствуют о наличии близкой родственности,
как в молекулярном строении токсинов энтеробактерий, так и их генетических
детерминант, ответственных за эти функции микроорганизмов, однако имеются
некоторые отличия механизма патогенного действия токсинов.
LT-энтеротоксин представляет собой белок, о чем свидетельствует
инактивация его при нагревании выше 60°С в течение 30 минут, а также его
чувствительность к действию проназы, трипсина и пепсина [416].
LT-энтеротоксин
состоит
из
комплекса
двух
функционально
и
иммунохимически различных белков: компонент A и B. Компонент A
представляет собой фермент, чаще всего АДФ - рибозил - трансфераза.
B-
компонент токсина представлен либо лектинами, либо белками, участвующими в
процессах биологического узнавания и межклеточной регуляции. Кроме того, у
LT-энтеротоксина известна функция участия транслокации его регуляторного
компонента во внутренние структуры чувствительных клеток, а также участки
экранирования компонента А, находящегося в составе общей токсической
молекулы и соединенного между собой гидрофобными связями. Они в
отдельности не обладают токсической активностью при использовании их в
концентрациях, сравнимых с концентрацией “целого” токсина. При этом эффект
A-компонента в бесклеточных системах идентичен эффекту, который развивается
в результате действия всей молекулы токсина на чувствительные клетки.
Последние данные показывают, что поражающий спектр действия токсина прямо
зависит от способности В-компонента взаимодействовать с рецепторными
структурами большого количества эукариотических клеток, что свидетельствует
37
о том, что практически любая клетка может стать чувствительной к действию
токсина [264].
Клеточными рецепторами для LT-энтеротоксина служат ганглиозиды.
Ганглиозид Gm1 обладает сильным ингибирующим действием на энтеротоксин в
опытах на легированной петле тонкого кишечника кролика. Культура мышиных
фибробластов, которая не содержит таких рецепторов, не чувствительна к
действию LT-энтеротоксина. Добавление к культуре клеток экзогенного
ганглиозида Gm1, по данным некоторых исследователей, видимо сопровождается
включением его в мембрану и приводит к тому, что клетки становятся
чувствительными
к
действию
LТ-энтеротоксина.
Однако,
повышение
чувствительности указанных клеток к LT- энтеротоксину наблюдалось и после
включения в мембрану других ганглиозидов, поэтому, вполне вероятно, что
помимо Gm1, функцию клеточных рецепторов для LT-энтеротоксина могут
выполнять и другие структуры, имеющие ганглиозиды. Не исключено, что эту
функцию может осуществлять и мембранный гликопротеин [10].
Ферментативный
компонент
токсина
активирует
аденилатциклазу,
стимуляция которой сопровождается повышением в клетках внутриклеточного
цАМФ, что приводит к нарушению функций калий - натриевого насоса с
последующим выходом электролита из клетки [105].
Локус токсигенности (Ent) наиболее часто располагается в плазмидах и
чаще всего является конъюгативным, что доказано в опытах межвидовой и
межродовой конъюгативной передачи плазмид с формированием токсигенных
штаммов различных видов УПЭ. Не исключено появление, таким образом, и
токсигенных клонов условно-патогенных энтеробактерий in vivo [173].
Цитотоксический некротизирующий фактор (CNF) типа ff2 (CNF1/2),
продуцируемый Е. coli, принадлежит к группе бактериальных токсинов,
модифицирующих Rho-подсемейство небольших ГТФ-связывающих белков,
которые являются регуляторами актинового цитоскелета. Большинство токсинов
этого семейства, включающего основные клостридиальные цитотоксины и СЗэкзоэнзим С. botulinum, инактивируют Rho. CNF1, CNF2 и дерматонекротический
38
токсин Bordetella spp. являются уникальными для представителей своего
семейства, так как обладают способностью активировать Rho. CNF1 сходен с
CNF2 по аминокислотному составу на 99% [371].
Ген, кодирующий CNF1, локализован на хромосоме уропатогенных Е. coli в
составе так называемого “островка патогенности”. Токсин синтезируется в виде
гидрофильного полипептида с молекулярной массой примерно 115 кДа, который
сохраняется
первое
время
в
цитоплазме
из-за
отсутствия
сигнальной
последовательности. Недавние исследования структуры и действия CNF1
показали, что токсин имеет два различных четко выраженных домена:
связывающий и ферментативный. N-концевая часть CNF1, включающая два
потенциальных трансмембранных домена, содержит участок, ответственный за
связывание с клеткой-мишенью. Эта часть молекулы сходна по аминокислотному
составу с токсином Pasteurella multocida - мощным митогеном, который считают
этиологическим фактором развития прогрессирующего атрофического ринита у
свиней. С-концевая часть представляет собой ферментативный домен токсина.
Он имеет участок длиной 100 аминокислотных остатков, гомологичный
дермонекротическому токсину, который, возможно, является активным центром
токсина [390].
В
эукариотических
клетках,
пораженных
CNF1,
развивается
ряд
характерных явлений: складчатость мембраны, фокальная адгезия и напряженные
актиновые волокна, а также ДНК-репликация без клеточного деления  феномен,
в результате которого образуются гигантские многоядерные клетки. Столь
драматические изменения в клетках, подвергшихся воздействию CNF1, являются
результатом способности токсина модифицировать Rho. Недавно установлено,
что эта модификация заключается в дезаминировании остатка глутамина в
позиции 63 с образованием глутаминовой кислоты. Подобное изменение
аминокислоты вызывает образование доминирующего активного Rho белка, не
способного гидролизовать ГТФ. In vivo CNF1 вызывает некроз кожи у кроликов
после внутрикожной инъекции и персистирующее воспаление у мышей.
Эпидемиологические данные подтверждают значение CNF1, как фактора
39
вирулентности при внекишечных инфекциях у человека, однако прямые
доказательства роли токсина в развитии данных заболеваний еще предстоит
доказать [259]. Данные, касающиеся продукции ассоциаций энтеробактерий,
цитотоксического некротизирующего фактора, в доступной нам литературе мы
не нашли.
Патогенные
для
человека
штаммы
ЕТЕС
могут
продуцировать
термостабильные (ST) энтеротоксины. STa-токсины различных штаммов ЕТЕС
являются родственными, но отличными друг от друга токсинами.
STh токсин
вырабатывается штаммами, выделяемыми у человека, в то время как STp
преимущественно
обнаруживают
в
штаммах,
полученных
от
свиней.
Термостабильный энтеротоксин различных представителей условно-патогенных
энтеробактерий, представляет собой полипептид с молекулярной массой в
пределах 1000-10000, устойчив к действию трипсина, панкреатина и проназы,
растворим в метаноле, токсичность которого не теряется при кипячении в
течение 10 минут и утрачивается при автоклавировании (120°С) в течение 30
минут, а также при обработке 2-меркаптоэтанолом. Рецептором связывания STэнтеротоксина является GC-C рецептор, по химической природе который
представляет гликопротеин, расположенный на щеточной кайме энтероцитов и
активирует гуанилатциклазу клеток эпителия тонкого кишечника. Накопление цГМФ в плазматической мембране сопровождается нарушением секреции ионов
хлора и электролитов, что ведет к выпоту жидкости в просвет кишечника и
хорошо выявляется на биологических моделях на изолированной петле тонкой
кишки кролика и на мышах-сосунках. Следует отметить, что ST-энтеротоксин
действует быстрее и менее продолжительно, чем LT-энтеротоксин, обуславливая
быстро проходящую диарею [174].
Гены, кодирующие STa (estA) у ЕТЕС, входят в состав мобильного
генетического элемента. Они обнаружены во множестве репликонов. STa
транслируется в виде молекулы-прекурсора, состоящей из 72 остатков
аминокислот, которая после двукратного расщепления в процессе “созревания”
выделяется во внешнюю среду. Зрелые ST токсины  небольшие пептиды,
40
содержащие от 19 до 53 аминокислотных остатков. STh и STp содержат 19 и 18
аминокислотных остатков, соответственно. Токсины, относящиеся к семейству
STa, имеют на С-конце последовательность протяженностью 13 аминокислотных
остатков, определяющих токсичность и термостабильность токсина. Шесть
остатков цистеина, связанных между собой тремя дисульфидными “мостиками”,
в составе данного домена обусловливают токсичность этой молекулы [366].
Некоторые патовары УПЭ могут обладать несколькими факторами
патогенности, что возможно является “инструментом” для поломки защитных
механизмов хозяина и дает им возможность размножаться в различных эпитопах
хозяина.
1.3.
АНТИБИОТИКОУСТОЙЧИВОСТЬ
УСЛОВНО-ПАТОГЕННЫХ
ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ
Несмотря
на
высокоэффективных
широкое
применение
антибактериальных
в
медицинской
препаратов,
лечение
практике
больных
с
инфекционной патологией, вызванной УПЭ и в особенности их ассоциациями,
остается весьма трудной задачей [44].
Широкое
применение
антибиотиков
в
медицинской
практике
способствовало вытеснению чувствительных и распространению устойчивых к
действию антибактериальных препаратов микроорганизмов. Этот процесс
сопровождается формированием множественно устойчивых культур бактерий,
что привило к накоплению в природе генов резистентности и циркуляции их в
микробных популяциях [87].
Энтеробактерии
резистентности.
вариаций
УПЭ
могут
иметь
почти
Внутригоспитальное
является
главной
все
известные
механизмы
распространение
полирезистентных
проблемой
многих
для
лечебно-
профилактических учреждений. Вспышки внутригоспитальной инфекции часто
являются
следствием
микроорганизмов [404].
распространения
одной
полирезистентной
линии
41
В настоящее время происходит не только рост числа циркулирующих
полирезистентных штаммов и культур определенных видов, но и расширение
спектра родов и семейств с множественной лекарственной устойчивостью.
Механизмы развития множественной устойчивости к антибиотикам стали
понятны лишь после открытия экстрахромосомного их детерминирования у
бактерий [329].
Некоторые
условно-патогенные
грамотрицательные
микроорганизмы
обладают природной устойчивостью к антибактериальным препаратам, но в
большинстве случаев полирезистентность этих бактерий детерминируется Rплазмидами. Одной из причин возникновения полирезистентных штаммов,
бактерий и культур микроорганизмов, помимо применения противомикробных
препаратов, является возникновение резервуаров плазмид множественной
устойчивости.
В этой связи необходимо рассмотреть основные механизмы
лекарственной устойчивости, которые могут наблюдаться как у моно-, так и их
ассоциированных
вариаций
условно-патогенных
микроорганизмов.
Из
окружающей среды и от больных с гнойно-воспалительными заболеваниями
различной локализации, выделяются бактерии родов Enterobacter, Citrobacter,
Serratia, E.coli, Proteus устойчивые ко многим широко применяемым в практике
антибиотикам [10,18,44,95,99].
Так, из более 100 выделенных ассоциаций условно-патогенных микробов, а
в частности культур бактерий Enterobacter, Citrobacter, Serratia, E.coli, Proteus
большинство обладали устойчивостью к большому спектру антибактериальных
препаратов.
При
сопоставлении
чувствительности
ассоциаций
УПЭ
в
зависимости от их происхождения выявлено, что микроорганизмы, выделенные
из патологического материала, по сравнению с бактериями от здоровых людей,
не отличались по чувствительности к бензилпенициллину и цепорину. Вместе с
тем ассоциации условно-патогенных микроорганизмов, выделенных от больных
с
инфекционными
процессами
различной
полирезистентностью к ампициллину [51].
локализации,
обладали
42
Ряд авторов [77,93,95,109] отмечают, что у ассоциаций наблюдается
изменение устойчивости к антибиотикам. Литературные данные подтверждают,
что распространение коньюгативных детерминант антибиотикорезистентности
энтеробактерий, а в частности бактерий Enterobacter, Citrobacter, Serratia, E.coli,
Proteus в ассоциациях
гораздо выше, чем у их монокультур. Распространение
множественной лекарственной устойчивости среди представителей семейства
Enterobacteriaceae возможно связано, в основном с наличием коньюгативных Rплазмид. Штаммы этих микроорганизмов, выделенные при смешанных и
ассоциированных
гнойно-воспалительных
процессах,
чаще
имели
гены
резистентности плазмидной локализации с молекулярной массой от 20 до 120
МД. Примерно 20% внутрибольничных ассоциированных культур бактерий
семейства Enterobacteriaceae, обладали множественной устойчивостью к 4 и более
антибиотикам. Имеются сообщения, о наличии определенной зависимости между
ферментативной активностью и антибиотикорезистентностью бактерий [182].
Существует два пути формирования множественной лекарственной
устойчивости, кодируемой плазмидами. Первый наиболее часто встречаемый у
УПЭ, заключается в формировании одной крупной коньюгативной плазмиды с
массой 60-120 МДА, которая может контролировать устойчивость к 6-8-10
антибактериальным препаратам. Второй путь – накопление в бактериальной
клетке
плазмид,
сохраняющих
физическую
независимость.
Большинству
полирезистентных вариаций бактерий Enterobacter, Citrobacter, Serratia, E.coli,
Proteus присуще сходство спектра и уровня устойчивости, что свидетельствует о
распространении среди клинических штаммов 1-2 плазмид, детерминирующих
множественную лекарственную устойчивость [109].
В
развитии
устойчивости
бактерий
к
бактериальным
препаратам
определенное значение имеют транспозоны, которые являются отдельными
фрагментами ДНК, способными легко перемещаться от одного репликона к
другому и имеют характерную структуру. Для перемещения транспозона с
одного репликона к другому не требуется наличия специальных ферментов, при
этом транспозонные элементы определяют как резистентность к антибиотикам,
43
так и устойчивость к тяжелым металлам [136]. Так гены резистентности к
хлорамфениколу, помимо плазмидной локализации, могут быть транспозоны.
Однако устойчивость к хлорамфениколу зависит не только от синтеза фермента
хлорамфениколацетилтрансферазы, кодируемой плазмидами или хромосомами,
но и от структуры цитоплазматической мембраны, которая создает барьер при
проникновении данного антибиотика в клетку. Получены данные, что Rплазмидный ген хлорфамениколацетилтрансферазы ответственен одновременно
за устойчивость энтеробактерий и к фузидиновой кислоте. Эксперементальные
исследования показали возможность передачи R-плазмиды, отвечающей за
устойчивость к хлорамфениколу, среди различных представителей УПЭ. Роль Rплазмид не ограничивается резистентностью к антибактериальным препаратам,
поскольку они так же влияют на чистоту мутаций, и создают благоприятные
условия для отбора полиплазмидных штаммов, содержащих наряду с Rплазмидами и плазмиды патогенности. Отмечается возможность мобилизации
нетрансмиссивных R-плазмид с детерминантами Ent, Hly, Col. Кроме того, Rплазмиды помимо антибиотикорезистентности могут включать гены синтеза LTэнтеротоксина. Возможна совместная передача R-плазмиды с Ent-плазмидой,
детерминирующей продукцию энтеротоксина. При этом ряд авторов отмечает
локализацию генов продукции энтеротоксина и резистентности на одной
плазмиде [167].
Имеются сообщения, что одни и те же плазмиды у E.coli детерминируют
устойчивость к антибиотикам и синтез LT и ST энтеротоксинов, что создает
возможность распространения плазмид, несущих гены синтеза энтеротоксинов,
при бесконтрольном применении антибиотиков [174].
По крайней мере некоторые детерминируемые плазмидами LT и ST
токсины переносятся Inc F1 плазмидами. Резистентность к ампициллину,
хлорамфениколу,
стрептомицину,
сульфаниламидам,
тетрациклину
и
цефалоридину была наиболее частой [394].
Таким образом, представленные данные литературы свидетельствуют, что
селективное действие, создаваемое антибактериальными препаратами, приводит
44
к распространению плазмид и транспозонов, несущих гены полирезистентности к
химиотерапевтическим средствам среди культур УПЭ. Поэтому, лечение
инфекционных процессов, вызванных смешанной бактериальной флорой,
особенно УПЭ, является весьма сложной проблемой, поскольку вопросы
касающиеся механизма развития ассоциированных инфекционных процессов
условно-патогенной природы, остаются недостаточно изученными.
В связи с этим, возникает настоятельная необходимость поиска новых
подходов направленных на профилактику и лечение ассоциированных инфекций
вызванных условно-патогенными энтеробактериями.
1.4.
ВЗАИМООТНОШЕНИЯ
В
СИСТЕМЕ
“ХОЗЯИН-ПАТОГЕН”
И
ОСОБЕННОСТИ ИММУНОЛОГИЧЕСКОГО ОТВЕТА
В основе любого инфекционного процесса лежат сложные взаимоотношения
между микро- и макроорганизмом, в котором патоген, для преодоления защитных
механизмов
хозяина,
использует
все
свои
потенциальные
возможности,
называемые “факторами патогенности”. К разряду существенных патогенных
факторов бактерий семейства Enterobacteriaceae многие исследователи относят
адгезивную,
цитотоксическую,
гемолитические
активности
и
продукцию
различных ферментов и токсинов. В системе “хозяин-патоген”, в экологической
нише, устанавливается определенный баланс, обусловленный естественными
барьерами и механизмами неспецифической защиты со стороны хозяина,
направленный на селективное подавление роста и размножения микроорганизмов.
Со стороны возбудителя это выражается в виде продукции определенных белков и
других веществ, нарушающих механический и иммунологический барьер хозяина,
обеспечивающих уклонение от защиты, а также приобретение способности
размножаться и колонизировать эпителий кишечника [311].
Механизм защиты макроорганизма обусловлен, с одной стороны, факторами
неспецифической защиты, а с другой, формированием специфического клеточного
и гуморального иммунного ответа. Неспецифические механизмы защиты хозяина
ингибируют рост и размножение множества патогенных и условно-патогенных
микроорганизмов и обусловлены развитием защитной реакции, тканевой
45
бактерицидностью, способностью определенных клеток к фагоцитозу, выработке
лизоцима, интерферона, секреторного IgA, комплемента, интерлейкинов и др.
Специфическая иммунная защита хозяина сопряжена активацией определенных
субпопуляций иммунокомпетентных клеток и направлена на специфические
структуры бактериальной клетки, такие как, жгутики, фимбрии, поверхностные
белки, липополисахариды клеточной стенки, а также на ими секретируемые
продукты [409].
В экологической нише патоген, для уклонения от защитных механизмов
макроорганизма,
продуцирует
приобретает
вещества,
“неэффективные”
способность
подавляющие
антитела,
обходит
к
молекулярной
иммунный
действия
ответ,
комплемента
мимикрии,
индуцирует
и
других
бактерицидных субстанций хозяина [329].
В
системе
сегодняшний
взаимоотношений
день
стоит
“патоген-хозяин”
вопрос,
касающийся
наиболее
остро
на
условно-патогенных
микроорганизмов, к числу которых относятся и бактерии Enterobacter, Citrobacter,
Serratia, E.coli, Proteus, а так же их ассоциации. Это связано с тем, что УПЭ
являются постоянными составляющими микробиоценозов различных эпитопов
человека, но при этом зачастую выделяются в качестве этиологического, как в
моно-, а так и в составе миксткультур при гнойно-воспалительных процессах
различной локализации. В такой ситуации наиболее сложно дифференцировать
их этиологическую причастность, когда обнаруживаются такие бактерии в
составе миксткультур. При каких условиях и обстоятельствах происходит
превращение УПЭ в патогенные ? Не связано ли это с виной самого хозяина,
создающего жесткие условия, способствующего селективному отбору для
некоторых
клонов
сапрофитных
микроорганизмов,
что
“заставляет”
их
приобретать новые “факторы патогенности” для выживания, дающие им
возможность размножаться и колонизировать – и, соответственно, “оставлять
после себя плодовитое патогенное потомство” в различных эпитопах организма
хозяина. Не исключено, что это связано с мобильными генетическими
элементами, типа IS-последовательностей, бактериофагами и плазмидами,
46
которые “превращают” коменсальные сапрофиты УПЭ, порой не по желанию
даже самих коменсалов, в агрессивные агенты, нарушающие естественную
резистентность хозяина?
Вышеперечисленные
соответственно,
требуют
фенотипических
признаков
вопросы
являются
всестороннего
факторов
весьма
актуальными,
комплексного
патогенности,
с
изучения
и
связи
генотипическими
структурами, входящих в состав “островов патогенности”, так и особенностей
механизмов взаимоотношения и защиты иммунного ответа хозяина при
инфекциях,
связанных
с УПЭ,
имеющих
известные ключевые факторы
патогенности. Все это позволит выявить в конечном итоге наиболее уязвимые
звенья в цепи патогенеза заболеваний и выбрать оптимальные стратегии
этиопатогенетического лечения и профилактики заболеваний, вызываемых
различными вариациями бактерий семейства Enterobacteriaceae.
1.5. АПОПТОЗ В СИСТЕМЕ РЕАГИРОВАНИЯ “ПАТОГЕН-ХОЗЯИН”
Несмотря на постоянное самообновление клеток во взрослом организме,
количественное
соотношение
функционально
активных
клеток
остается
относительно постоянным. Это обусловлено противоположными пролиферации
процессами, способствующими медленному отмиранию “отживших”, ненужных
клеток, но существенно отличающимися от воспаления и некроза и называемыми
– “апоптоз”. Апоптозу могут подвергаться любые эукариотические клетки, однако
есть и исключения, например лимфоциты, подвергающиеся негативной селекции
путем
апоптоза,
которые
способны
избегать
заблаговременной
гибели,
превращаясь в клетки памяти. Физиологический процесс суицида клеток
некоторые микроорганизмы используют в процессе взаимоотношения в системе
“хозяин-патоген”
в
целях
выживания,
внедрения
и
самозащиты.
Запрограммированная гибель клеток может инициироваться самими патогенами, в
основном это направлено против клеток иммунной системы, или же программа
включается непосредственно самими эукариотическими клетками, которые
поражены
внутриклеточными
патогенами.
Этот
процесс
направлен
на
47
предотвращение внутриклеточного размножения патогена и последующей
элиминации его из организма. В связи с этим в системе “хозяин - патоген”
выделяют три стратегии включения клеток суицидной программы:
-активация апоптоза для элиминации “отживших” клеток;
-использование процесса апоптоза для инициации воспаления;
-апоптоз может быть представлен как защитная реакция хозяина, связанная с
отторжением поверхностных пластов инвазированных эпителиальных клеток для
дальнейшей элиминации бактерий вместе с энтероцитами [242].
В естественных условиях в организме физиологическое отмирание клеток
регулируется
через
эндогенные
факторы
(гормоны,
цитокины,
дериваты
арахидоновой кислоты, прямые межклеточные контакты). Действие этих факторов
осуществляется через специальные рецепторы, которые экспрессируются на
поверхностной мембране клеток. Наиболее известной системой является Fas-FasL,
где FasL служит лигандом, стимулирующим апоптоз после связывания с Fas
(СD95/Apo-1), выступающим в роли рецептора. Fas - рецептор имеется на многих
типах клеток, тогда как FasL экспрессируется, в основном, на активированных Тлимфоцитах. Среди цитокинов, обладающих эффекторной функцией апоптоза в
организме, выделяется TNF-. На клетках, “считающих себя ненужными”,
появляется рецептор TNF-R1 к TNF-, и при лиганд-рецепторном взаимодействии
запускается
суицидная
индуцируется IFN-
программа.
В
культурах
клеток
HT-29
апоптоз
в комбинации с TNF-. Fas и TNF-R1 являются
поверхностным “доменом смерти” экспрессируемыми клетками, выбравшими путь
смерти. После активации рецепторного аппарата внутри клетки запускается
каскадный механизм, включающий внутриклеточные каспазы (цистеиновые
протеазы) с уникальной субстратной специфичностью, гранзимы (сериновые
протеазы) и эндонуклеазы. Первой каспазой, активированной после лигандрецепторного
взаимодействия,
является
каспаза-8,
которая
активируется
определенными внутриклеточными адаптерными молекулами FADD/MORT1 (Fasassociated death domain). Активированная каспаза-8 действует на внутриклеточные
зимогены (прокаспазы), последние, как правило, активируясь, превращаются в
48
каспазу-3 и/или 7, возможно, включается и каспаза-6, которые завершают
суицидную программу клетки с фрагментацией наследственного материала и
экзоцитозом апоптозных тел [264].
Однако есть механизмы, где экзекуционная процедура осуществляется по
инициативе самой клетки. В таких случаях апоптоз запускается не через
поверхностные рецепторы и их внешние эффекторы, а через внутриклеточные
белки, в основном митохондриальные, такие как цитохром С, Apaf-1, которые
активизируют каспазу-9. Созревшая каспаза-9, аналогично каспазе-8, действует на
зимогены, что в последующем включает каспазы 3, 7 и 6. Однако известно, что
каспаза-9 непосредственно или косвенно, инактивирует транспортную функцию
ядерной мембраны и усиливает диффузию кариоплазмы через ядерные поры, что
создает определенную “почву” для работы остальных ферментов, реализующих
экзекуционную программу клетки [270].
Активированные каспазы инициируют процессинг и активацию “смерть
субстратных” белков, которые осуществляют протеолитический распад и
дробление клетки с фрагментацией наследственного материала. На финальном
этапе фрагментированные части клетки подвергаются фагоцитозу [66].
Реализация запрограммированной клеточной смерти, будь она через лигандрецепторное начало, или же осуществленные через внутриклеточные индукторы
апоптоза, осуществляется на конечных этапах через активацию каспазы-3,
играющей основную роль активной транспортировки ядерного материала через
ядерные поры, что, по мнению многих исследователей, является как бы
необходимым заключительным механизмом и в этой стадии клетка уже не может
обратно реанимироваться [72].
Суицидная программа клетки контролируется двумя противоположно
действующими генами, продукты которых усиливают или подавляют апоптоз.
Примерами
генов,
субстраты
которых
контролируют
апоптоз
клеток
млекопитающих, являются семейство bcl-2 генов, с-myc, p53 и nur-77 гены.
Экспрессия этих белков зависит от множества внутри и внеклеточных ростковых
факторов, посредством которых эффективно поддерживается и регулируется
49
количественный баланс между вновь образовавшимися и отмирающими клетками.
Большинство факторов, вызывающих некроз клеток, способны инициировать
апоптоз, если они действуют в малых дозировках. Бактериальными индукторами
апоптоза являются гемолизины, экзотоксины, мембранные белки (III тип
секреторных белков) и другие, действующие как апоптический эффектор в очень
малых концентрациях. Однако не все микробные патогены являются индукторами
апоптоза, а напротив некоторые наоборот наталкивают клетку на “вынужденный”
митотический цикл, либо замедляют процесс физиологической смерти клеток [78].
Начальный сайт взаимодействия патогенов с клетками хозяина начинается
на
слизистых
оболочках
желудочно-кишечного,
урогенитального
и
бронхолегочного тракта. Клетки слизистых оболочек в определенной степени тоже
подвергаются запрограммированной клеточной смерти. Так, адгезин Fim H
уропатогенных E.coli способен вызывать апоптоз цилиндрического эпителия
урогенитального тракта. При шигеллезах происходит усиленный апоптоз
энтероцитов, инициируемый через медиатор - IL-1 конвертирующий фермент
(ICE), тождественный каспазе-1. Иpa B - поверхностный белок, кодируемый
плазмидой инвазивности (Invasion plasmid antigen (Ipa)B) у Shigella flexneri,
связываясь с ICE, активизирует его. ICE наподобие Asp 297 активизирует
прокаспазу-8 в каспазу, что в последующем запускает каскады апоптических
реакций. Предположительно, ICE вызывает апоптоз и макрофагов, что позволяет
последним эффективно освобождать IL-1. В свою очередь IL-1 сопровождает
иммунную индукцию воспалительных процессов с синдромом острой диареи,
характерной
для
шигеллезов.
Гибель
макрофагов
можно
рассматривать
дуалистически: с одной стороны, ICE одинаково действует на клетки иммунной
системы для их уничтожения, а с другой стороны, макрофаги как бы специально
погибают для полного высвобождения внутриклеточных медиаторов воспаления
[128].
Аналогичен патогенез развития заболевания и при сальмонеллезе. Salmonella
spp. продуцирует белок (Sip)B, который гомологичен с Ipa и тоже является
активатором ICE [133].
50
Совершенно иной механизм индукции апоптоза у Y. enterocolitica.
Активаторным белком служит YopP. Они взаимодействуют с внутриклеточными
IkB- и IkB- белками, продуктами NF-kB генов эукариотических клеток, которые
являются основными энханцерами клеток на выживание, в связи с чем нарушается
внутриклеточное равновесие белков “усилителей” и “подавителей” клеточной
пролиферации. В результате этого белки “подавители” начинают превалировать и
клетки вынуждены выбирать путь к самоуничтожению. Вместе с тем YopP белки
подавляют в макрофагах и продукцию TNF-, что приводит к нарушению
иммунной регуляции хозяина [334].
Немногочисленны данные, касающиеся способности E.coli вызывать апоптоз
эукариотических
клеток.
Известно,
что
фактором,
вызывающим
апоптоз
макрофагов является гемолизин, продуцирующий энтероаггрегативный патовар
кишечной палочки (EaggEC). @-гемолизин, являющийся прототипом Са2+зависимого
пороформирующего
проницаемости
клеточной
цитолизина,
мембраны
для
приводит
ионов
к
изменению
кальция.
Увеличение
внутриклеточного кальция сопровождается вторичными изменениями в клетке,
что запускает апоптоз. Смерть-индуцирующие сигналы, у энтеропатогенных
представителей E.coli (EPEC), опосредованы через III тип секреторной системы,
которые также способны вызывать апоптоз клеток хозяина. Однако механизм
включения
суицидной
Энтерогеморрагические
продуцирующие
программы
остается
представители
шига-подобный
E.coli
токсин
2,
еще
не
O157:H7
напротив
понятным.
серогруппы,
замедляет
апоптоз
нейтрофилов. Возможно, такой патогенез болезни ухудшает нейтрофил связанное
разрушение
тканей
при
VT2-ассоциированных
заболеваниях.
Программированная смерть существует не только в эукариотических клетках, но и
в прокариотических. Такая смерть в бактериальных клетках играет важную роль в
развитии
процессов,
таких
как
лизис
материнской
клетки
в
процессе
спорообразования у Bacillus subtilis и лизис вегетативных форм клеток при
созревании Myxococcus Xanthus [337]. Стратегия самообороны патогенов против
иммунокомпетентных клеток через активацию механизмов самоуничтожения
51
эукариотических клеток вполне укладывается в понятии “защита от чужеродного”.
Неясным остается тот факт: зачем патогену нужно активизировать в энтероцитах
апоптический механизм на начальных этапах его взаимодействия с клетками
хозяина? Ведь в данной ситуации такая тактика направлена против самого
патогена?! Этот вопрос остается проблемным и нуждается в дальнейших
исследованиях.
Представленные
данные
свидетельствуют,
что
условно-патогенные
энтеробактерии и их ассоциации, выделяются в качестве этиологических при
инфекционных
процессах
различной
локализации.
Известные
факторы
патогенности энтеробактерий и их ассоциаций, характеризуются структурной и
функциональной гомологией друг с другом. Консервативность механизмов
функциональной активности факторов патогенности и их генетический контроль
предопределили исследование механизмов взаимоотношений патогена и хозяина
на примере монокультур бактерий Enterobacter, Citrobacter, Serratia, E.coli, Proteus
и их cокультивируемых вариаций, поскольку секретируемые токсические
продукты жизнедеятельности, по данным ряда авторов, имеют иммунологическое
сходство с энтеротоксином E.coli и холерогеном V.cholerae, а также имеется
гомология в генах, кодирующих их токсигенность. В этой связи исследования и
сравнительная оценка молекулярных механизмов патогенеза инфекционных
процессов, обусловленных монокультурами бактерий Enterobacter, Citrobacter,
Serratia,
E.coli,
Proteus
и
их
ассоциациями,
могут
отразить
патогенез
инфекционных процессов целого ряда представителей УПЭ, секретирующих
термолабильные энтеротоксины.
52
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Работа выполнена на кафедре микробиологии, вирусологии и иммунологии
(заведующий кафедрой – Заслуженный деятель науки РБ и РФ, д.м.н., профессор
З.Г.Габидуллин) ГОУ ВПО «БГМУ Росздрава» (ректор – д.м.н., профессор
Павлов В.Н.). План исследования был одобрен экспертным советом по
биомедицинской этике по теоретическим дисциплинам и утвержден на заседании
ученого совета ГОУ ВПО «БГМУ Росздрава» 28.02.2013г.
Материалом для исследований послужили 265 штаммов изучаемых нами
условно-патогенных микроорганизмов, выделенных как из проб клинического
материала,
так
и
от
здоровых
людей:
от
3658
больных
воспалительными, кишечными и урологическими заболеваниями:
с
гнойно-
50 штаммов
Enterobacter spp., 50 штаммов Citrobacter spp., 50 штаммов Serratia spp., 50
штаммов E.coli, 50 штаммов Proteus spp., а так же 10 вариаций сокультивируемых
штаммов Enterobacter spp.+Citrobacter spp. (Е+С), 10 вариаций Enterobacter
spp.+Serratia spp. (Е+S), 10 вариаций Citrobacter spp.+ Serratia spp. (C+S), 10
вариаций Enterobacter spp.+Е.coli (Ent+Е.coli), 10 вариаций Citrobacter spp.+Е.coli
(C
+Е.coli),
10
вариаций
Serratia
spp.+Е.coli
(S+Е.coli),
10
вариаций
Proteus+Enterobacter spp. spp.(Prot+Е), 10 вариаций Proteus spp.+Citrobacter spp.
(Prot+С), 10 вариаций Proteus spp.+Serratia spp. (Prot+S), 10 вариаций Proteus
spp.+Е.coli (Prot+ Е.coli). Дополнительно были использованы по 5 штаммов
Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., Е.coli, Proteus spp. выделенных от
898 здоровых людей.
Клинический материал получали из бактериологических лабораторий
Республиканской клинической больницы им. Г.Г. Куватова, г.Уфа; городской
клинической больницы №21, г.Уфа; Республиканской детской клинической
больницы, г.Уфа; больницы скорой медицинской помощи №22, г. Уфа;
Калтасинской районной клинической больницы, Республика Башкортостан; в
период с 2003 по 2013 год.
53
В качестве эталонных культур были использованы E.coli обладающие
комплексом факторов патогенности, которые были нами депонированы в ГИСК
им. Л.А. Тарасевича и запатентованы (Escherichia coli ГИСК №281, патент
№2293764; Escherichia coli ГИСК №280, патент №2293765).
Эксперименты выполнены на 2250 белых мышах-самцах (беспородных и
линии
СВА),
60-ти
кроликах,
360
белых
мышах–сосунках.
Животные
содержались в условиях вивария ГОУ ВПО «БГМУ Росздрава» с естественным
световым режимом на стандартной диете лабораторных животных (ГОСТ
Р50258-92)
с
соблюдением
конвенции
по
защите
Международных
позвоночных
рекомендаций
животных,
Европейской
используемых
при
экспериментальных исследованиях, а также правил лабораторной практики при
проведении доклинических исследований в РФ (ГОСТ З 51000.3-96 и 51000.4-96).
Выделенные культуры идентифицировали по биохимическим свойствам при
использовании среды Гисса с помощью планшет ПБДЭ / Нижне-Новгородский
НИИЭМ/, на «Энтеротест» фирмы «Lachema» (Чехия) и на компьютерной тест системе типа API фирмы «BioMeruiox».
Изучение подвижности проводили по общепринятым методам «висячая
капля» и «раздавленная капля». Дополнительно использовали столбики с
полужидким агаром [239].
Изучение
клеточной
поверхности
и
особенностей
морфологической
структуры моно- и сокультивируемых гр- бактерий проводили с помощью
оптического
(«Биолам»,
Россия)
и
электронного
(«JEM-100B»,
Япония)
микроскопов. Электронно-микроскопические исследования проводили на базе
лаборатории
физических
«Иммунопрепарат»
ФГУП
методов
«НПО
исследования
«Микроген»
МЗ
уфимского
РФ.
филиала
Культуры
для
исследования в электронном микроскопе наносили платиновой петлей и
размещали на пленках-подложках, опорой для которых служили специальные
медные сетки. Сначала их просматривали под оптическим микроскопом для
установления густоты микробных тел и высушивали при комнатной температуре.
Затем оттеняли в специальных вакуумных установках типа «JEE-40». Напыление
54
препаратов проводили платиной и углем. Препараты просматривали в
электронном микроскопе1 («JEM-100B», Япония) с ускоряющим напряжением 15,
80 кв. Съемку проводили при инструментальном увеличении в пределах 15-30
тысяч раз. Для фотографирования объектов применяли фотопластинки для
ядерных исследований типа «МК» и «МР».
2.1. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Методы тестирования патогенности и персистентных свойств
микроорганизмов in vitro
Адгезивную
активность
микроорганизмов
определяли
в
реакции
гемагглютинации с эритроцитами птиц (Габидуллин З.Г. с соавт. Авторское
свидетельство №1312098, 1989 г) [97]. Для этого брали по 0,05 мл 3% суспензии
эритроцитов, содержащих 0,6% Д - маннозы и без нее и суспензию монокультур
и сокультивируемых штаммов с оптической плотностью от 250 тыс. до 1 млрд.
КОЕ в 1 мл, наносили на предметное стекло и осторожно смешивали. По
образованию агглютинационных хлопьев в течение 1-2 минут судили о
способности
культур
маннозорезистентную
давать
Д-маннозочувствительную
гемагглютинацию.
Появление
и
Д-
гемагглютинационных
хлопьев при смешивании суспензии эритроцитов с культурой плотностью от 25
млн. до 1 млрд. КОЕ в 1 мл считали как проявление слабой активности, от 15 до
25 млн. КОЕ в 1 мл – умеренной активности, от 5 до 15 млн. КОЕ в 1 мл –
средней, от 500 тыс. до 5 млн. КОЕ в 1 мл – высокой активности и отсутствие
хлопьев при любых концентрациях суспензий моно- и сокультивируемых
микроорганизмов, как показатель отрицательной реакции.
Количественную оценку адгезивной активности проводили по Брилису В.И.
с соавт. [45]. Для постановки опыта на предметное стекло наносили каплю
буферного раствора /рН 7,2/, в которой суспендировали взвесь изучаемых монои
сокультивируемых
микроорганизмов
и
отмытых
стандартных
Выражаем искреннюю благодарность зав. лабораторией физических методов исследования филиала
«Иммунопрепарат» ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ, с.н.с. Ишкильдину И.Б.
1
55
формалинизированных эритроцитов I(0) группы крови системы АВО. Препарат
на 30 минут помещали во влажную камеру при 37С, после чего высушивали при
той же температуре, фиксировали метанолом и окрашивали метиленовой синью,
изучение проводили под световым микроскопом «Биолам» (Россия). Степень
адгезивной активности оценивали с помощью среднего показателя адгезии
/СПА/, под которым понималось среднее количество
микроорганизмов,
прикрепившихся к одному эритроциту. Адгезивность считалась нулевой при
СПА от 0 до 1,00, низкой – при СПА от 1,04 до 2,00, средней – от 2,04 до 4,00 и
высокой при СПА свыше 4.00.
 - гемолитическую активность изучали следующим образом: на 2 % агар
Хоттингера, содержащий 5% суспензию эритроцитов кролика (Габидуллин З.Г.
рац. предл. №168, 1978г.) [96]. В одной половине чашки Петри вертикальным и
горизонтальным штрихами засевали суточные агаровые монокультуры, а в
другой половине эти же культуры сеяли в виде креста и инкубировали при 37 С
в течение 24 часов. Культуры считались высокоактивными при наличии зоны
гемолиза диаметром 5-8 мм, средней - 3-5 мм, слабой - 1-3 мм и отрицательной при отсутствии зоны гемолиза. Уровень -гемолитической активности культур
Enterobacter spp., Citrobacter spp, Serratia spp., E.coli, Proteus - устанавливали
следующим образом: брали 2 мл 3% суспензии эритроцитов, наливали 1 мл 2-х
млрд. суспензии суточных моно- и сокультивируемых штаммов и инкубировали в
термостате при 37 С 1,5 часа, затем центрифугировали при 8 тыс. об.\мин. в
течение 15 минут и измеряли оптическую плотность центрифугата на ФЭК-56 М
при длине волны 600 нм и толщине кюветы 5,17. В качестве контроля служили:
1) центрифугат состава - 2мл 3% суспензии эритроцитов + 1мл физиологического
раствора; 2) центрифугат - состава - 2 мл 3% суспензии эритроцитов + 1 мл
физиологического
раствора+5мг
сапонина.
Культуры
считались
высокоактивными при гемолизе эритроцитов от 70 до 100%, средней - от 40 до 70
%, слабой - от 2 до 40%, а ниже - не активными. Показатель оптической
56
плотности при полном гемолизе эритроцитов - 0,34, при отсутствии гемолиза 0,00.
Энтерогемолитическую
активность
бактерий
Enterobacter,
Citrobacter,
Serratia, E.coli, Proteus определяли по методике Beutin L. еt al (1988г.) [299].
Сеяли штрихом и в виде креста суточные агаровые культуры на среду для
определения энтерогемолизина.
Состав:
агар Дифко
-1,0
Oxoid
-1,0
Вода дистиллированная
- 98 мл
Стерилизовали при 1 атм. в течение 30 минут. Перед опытом добавляли 5 мл
дефибринированной крови барана и 10 М хлористого кальция, перемешивали и
разливали в чашки Петри. В одной половине чашки Петри вертикальным и
горизонтальным штрихами засевали суточные агаровые монокультуры, а в
другой половине эти же культуры сеяли в виде креста и инкубировали при 37 С
в течение 24 часов. По образованию вокруг колоний зон двойного гемолиза
судили о способности бактерий продуцировать энтерогемолизин.
О количественном уровне синтеза энтерогемолизина судили на основании
определения титра гемолитической активности супернатантов. Для этого брали
0,5 мл 3% суспензии эритроцитов барана, смешивали 0,5 мл супернатанта
монокультур и сокультивируемых штаммов в разведениях от
1:5 до 1:160. Учет результатов лизиса эритроцитов проводил через 30 минут
после инкубирования проб в термостате при 37С путем измерения оптической
плотности на ФЭК-56м при длине волны 600 нм. Положительной реакцией на
присутствие гемолизина были показатели снижения оптической плотности
суспензии эритроцитов не менее чем на 10%.
Активность энтерогемолизина считали высокой при титре разведения
супернатанта от 1:80 до 1:160, средней - от 1:40 до 1:80, слабой - 1:5 до 1:40.
Дополнительно
гемолитические
активности
Габидуллина З.Г. (Рац. предл. № 638, 1983г.)[95].
были
изучены
по
методике
57
Тиолзависимый гемолизин бактерий Enterobacter, Citrobacter, Serratia, E.coli,
Proteus определяли путем посева штрихом и виде креста суточных агаровых
культур на среду для определения тиолзависимого гемолизина (Appelbaum P.C.,
Prozecky O.W., 1983г.) [293].
Состав:
агар Дифко
-1,2
ферментативный гидролизат казеиа
- 0,5
экстракт кормовых дрожжей сухой
- 0,5
бульон Хоттингера
- 98,0мл
цистеин
-0,2
Стерилизовали при 121С в течение 30 мин. Ex tempore добавляли 0,2 мл
стерильного аминопептида, 5 мл дефибринированной крови кролика и 1,2 мл 4%
раствора глюкозы и разливали в чашки Петри. В дальнейшем чашки Петри
сушили, штрихами и в виде креста сеяли исследуемые культуры и ставили в
термостат при 37С на 2 часа, затем на 24 часа при 4С. Наличие вокруг колоний
зеленой зоны гемолиза свидетельствует о способности культур бактерий
синтезировать тиолзависимый гемолизин.
ДНК - азную активность моно- и сокультивируемых бактерий Enterobacter,
Citrobacter, Serratia, E.coli, Proteus определяли по Jeffries C.D. (Jeffries C.D., 1957)
[350].
Состав: питательный агар –100 мл;
ДНК – 200 мг
ДНК растворяли в физиологическом растворе и смешивали с питательным
агаром. Агар стерилизовали однократно текучим паром 30 минут. Перед посевом
агар растапливали, добавляли хлорид кальция из расчета 0,8 мл на 100 мл среды,
разливали на чашки Петри и подсушивали. Изучаемые культуры, рассевали на
агаре штрихами и в виде креста, инкубировали в термостате при 37С в течение
18-24 часов. Затем в чашки наливали 5-6 мл раствора 1Н HCl и оставляли на 10
минут. После этого кислоту сливали и учитывали результат. Под действием НCl
образуется непрозрачный белый осадок, а вокруг колоний – зона просветления.
58
Образование зоны просветления диаметром 5-8 мм указывает на наличие
высокой ДНК-азной активности, просветление диаметром 3-5 мм и 1-3 мм –
средней и низкой, соответственно, а без образования зоны просветления ДНКазная активность – отрицательная.
Определение
лецитиназной
активности
моно-
бактерий Enterobacter, Citrobacter, Serratia, E.coli,
и
сокультивируемых
Proteus проводили на
желточном агаре Чистовича Ю.Н. (Чистович Ю.Н., 1961) [270]. Для этого
суточные агаровые культуры засевали штрихами и в виде креста на 2% агар
Хоттингера, содержащий лецитовителлин, инкубировали при 37С в течение 24
часов. Культуры считали высокоактивными при наличии вокруг колонии
радужного венчика диаметром 5-7 мм, средней активности – 3-5 мм, слабой – 1-3
мм и неактивными – при отсутствии венчика.
Изучение антилизоцимной активности проводили по методике Бухарина
О.В. [56]. Для этого к 1,5% - ному питательному агару добавляли различные дозы
яичного
лизоцима
(Олайнский
завод
химреактивов,
марки
В),
2,3,4,5,10,20,30,40,50 мкг) и разливали в чашки Петри. После застывания среды и
ее подсушивания, на поверхность наносили штрихами и в виде креста суточные
агаровые культуры Enterobacter, Citrobacter, Serratia, E.coli, Proteus. Чашки
инкубировали сутки при 37С, после чего выросшие колонии обрабатывали
парами хлороформа в течение 10 минут, а затем на чашки наслаивали слой 0,7%
питательный агар с 0,1 мл одно-миллиардной взвеси суточной агаровой культуры
Micrococcus lysodeikticus и ставили в термостат при 37 С на сутки. Учет
результатов проводили по наличию зон его роста. Тест-культура вырастала
вокруг колоний тех микроорганизмов, которые нейтрализовали внесенный в слой
агара яичный лизоцим. Антилизоцимную активность исследуемых культур
выражали в микрограммах инактивированного в среде лизоцима.
Антиинтерфероновую активность исследовали по методу Соколова В.Ю.
[248]
с
учетом
антибактериального
действия
препарата
человеческого
лейкоцитарного интерферона и осуществляли следующим образом: исследуемые
культуры Enterobacter, Citrobacter, Serratia, E.coli, Proteus выращивали штрихами
59
и в виде креста, на питательной среде в присутствии препарата человеческого
лейкоцитарного интерферона (уфимский филиал «Иммунопрепарат» ФГУП
«НПО «Микроген» МЗ и СР РФ.) в различных разведениях (1,2,5,10 ед), чашки
инкубировали сутки, выросшие культуры инактивировали в течение 10 минут
парами хлороформа, а затем на посев наслаивали 0,7% агара, содержащего взвесь
тест-культуры Сorуnоbacterium xerosis (ГИСК №181 им. Л.А.Тарасевича). Посевы
инкубировали 24 часа при 37С и определяли антиинтерфероновую активность
микроорганизмов по наличию роста тест-культуры вокруг колоний испытуемых
культур.
Изучение антикомплементарной активности моно- и сокультивируемых
штаммов Enterobacter, Citrobacter, Serratia, E.coli, Proteus проводили по методу
Бухарина О.В. с соавт. [55]. Изучаемые культуры выращивали штрихами и в виде
креста, в течение 18 - 24 часов при 37С на слое 1,5% питательного агара, после
чего инактивировали в течение 30 минут в парах хлороформа и на них
наслаивали второй слой 0,7 % агара, содержащий комплемент в концентрации
1,5,10,20 СН50/мл (в качестве источника комплемента использовали сыворотки от
20 - 25 доноров). Данная двухслойная система инкубируется в течение 1 часа при
37С, во время чего происходит реализация антикомплементарных свойств и
продуктов их жизнедеятельности. Результатом этого является инактивация
комплемента вокруг колоний, обладающих указанным признаком. В дальнейшем
наслаивали третий слой 0,7% питательного агара, содержащего 0,1 мл 500 миллионной взвеси индикаторной культуры E. coli 1203 в 0,15 М растворе
хлорида натрия и после 16-18-часовой инкубации при 37С, во время которой
происходит выявление антикомплементарных свойств, проводили регистрацию
результатов по росту индикаторного штамма вокруг исследуемых моно- и
сокультивируемых штаммов, где произошла инактивация комплемента. При этом
культуры
считали
высокоактивными
при
инактивации
комплемента
в
концентрации от 15 СН50/мл и более, средней активности – от 5 до 15 СН50/мл и
низкой – от 1до 5 СН50/мл.
60
Изучение
антибиотикорезистентности
клинических
моно-
и
сокультивируемых на бульоне Хоттингера штаммов Enterobacter, Citrobacter,
Serratia, E.coli, Proteus, проводили по общепринятой методике с помощью
стандартных дисков в соответствии с Инструкцией МЗ СССР от 1984 года.
Дополнительно использовали питательные среды с определенной концентрацией
антибиотиков по Миллеру Дж. [123].
Состав: 2% агар Хоттингера рН 7,4 (охлaжденный до 45С) антибиотики,
мкг/мл: Cm – 50, Sm – 500, Ap – 5000, Nх – 50, Tc – 100, Rif – 100, Pen – 500.
Хорошо перемешивали, разливали в чашки Петри по 12 мл и сушили в
термостате при 37С в течение 40 минут.
Протистоцидную
активность
моно-
и
сокультивируемых
штаммов
Enterobacter, Citrobacter, Serratia, E.coli, Proteus тестировали на простейших –
Paramecium caudatum. [104]. P.caudatum выращивали в колбах, содержащих
настой сена при комнатной температуре (20-22С) до достижения концентрации
простейших 100-150 клеток в 1 мл. Для определения токсичности клинических
моно- и сокультивируемых штаммов
Enterobacter, Citrobacter, Serratia, E.coli,
Proteus 0,2 мл настоя сена, содержащего 100-150 P.caudatum, наносили на
предметное стекло и смешивали с 0,05 мл исследуемой моно- и с
сокультивируемой вариацией, выращенной или сокультивируемой на бульоне
Хоттингера, содержащей 5 млрд. микробных тел в 1 мл. Наблюдение проводили с
использованием микроскопа МБС-9 (Россия) под малым увеличением (12,51).
Наблюдали за поведением P.caudatum до и после внесения моно- и
сокультивируемых
штаммов.
При
добавлении
вирулентных
культур
микроорганизмов, P.caudatum в течение 0,08-0,1 минут ускорялось, а затем их
движения
замедлялись
и
прекращались
полностью.
Те
культуры
микроорганизмов, которые вызывали в течение 0,5-1,5 минут гибель P.caudatum,
относили к высокотоксичным; моно- и сокультивируемые штаммы, которые
вызывали гибель P.caudatum в течение 3,5-5,5 минут, относили к средней
токсической активности, и вариации моно- и сокультивируемых штаммов,
61
которые не вызывали гибель простейших в течение 5,5 и более минут, относили к
нетоксичным.
Методы комплексной оценки вирулентности микроорганизмов in vivo
Патогенность in vivo изучали методом интраназального заражения мышей
массой 16-18 г. [89]. Мышам массой 16-18 г под легким эфирным наркозом
интраназально вводили 0,05 мл 18-часовой монокультуры или вариации
сокультивируемых штаммов (6-8106) бактерий Enterobacter, Citrobacter, Serratia,
E.coli, Proteus. Часть мышей немедленно забивали, вскрывали грудную клетку,
извлекали легкие, а затем растирали в стерильных ступках со стеклянным песком
в физиологическом растворе (1 мл) и определяли среднее количество
микроорганизмов,
попавших
при
инфицировании
легких
высевом
соответствующих разведений на 2% агар Хоттингера. Культуры бактерий,
вызывающие впервые 3-5 часов после заражения гибель 50% и более
экспериментальных животных, считали высоковирулентными, в 12-18 часов –
средневирулентными, в 36-48 часов – слабовирулентными, а не вызывающие
каких-либо изменений в поведении животных – авирулентными.
Определение токсигенности культур проводили на изолированной кишке
кролика [199]. Кроликам (1,5-2 кг), предварительно голодавшим в течение 24
часов, под барбитуровым наркозом (тиопентал натрия 10мг/кг веса) послойно
вскрывали
брюшную
полость.
На тонкой
кишке кролика
готовили 5
изолированных участков длиной 12 см с такими же интактными участками, не
считая дистального и проксимального отделов, которые не были использованы в
исследованиях. После введения монокультур и сокультивируемых штаммов в
изолированные петли по 1 мл и контрольных проб, брюшную полость зашивали
послойно. Через 16-18 часов животных умерщвляли воздушной эмболией,
вскрывали брюшную полость и рассчитывали индекс дилатации отношением
объема экссудата к длине изолированной петли (замеряли длину лигированного
отрезка и объем жидкости). Положительной считали кишечную реакцию (V/L)
при коэффициенте 1,0 и более. Результаты фотографировали цифровой
фотокамерой “Canon”.
62
Тест
«отек
лап»
для
определения
LТ-энтеротоксигенности
моно-
сокультвируемых штаммов бактерий Enterobacter, Citrobacter, Serratia, E.coli,
Proteus – проводили по методике Вартанян Ю.П. с соавт. [83]. Для этого в
подушечку задней левой лапы мыши вводили 0,05 мл центрифугат 20-часовой
монокультуры
или
сокультивируемой
вариации
штаммов
Enterobacter,
Citrobacter, Serratia, E.coli, Proteus. Через 24 часа мышей умерщвляли эфиром,
ампутировали задние лапки на уровне голеностопного сустава и взвешивали на
торсионных весах. По разнице масс опытной и контрольной лап определяли
показатель теста «отек лапки». За положительный результат принимали
показатель, равный 65 мг и более. В качестве контроля использовали стерильный
бульон Хоттингера и нагретые при 56 и 85С центрифугаты вариаций моно- и
сокультивируемых штаммов..
Изучение SТ-энтеротоксигенности моно- и сокультивируемых вариаций
штаммов бактерий Enterobacter, Citrobacter, Serratia, E.coli, Proteus проводили на
мышах-сосунках [63]. Мышам-сосункам 2-3-дневного возраста, предварительно
не кормленным в течение 20 часов, через анальное отверстие вводили 18-48часовые бульонные культуры моно- и сокультивируемых микроорганизмов, в
объеме 0,05-0,1 мл и через 4 часа умерщвляли эфиром, затем вскрывали,
взвешивали кишечник и оставшуюся часть тела для последующего вычисления
их соотношения по формуле: К = вес кишечника (мг): веса тела (мг), где Ккоэффициент,
свидетельствующий
о
накоплении
жидкости
в
просвете
кишечника, который должен быть при положительном результате не менее 0,065.
Кожнонекротическая способность бактерий была принята нами в качестве
одного из критериев определения вирулентности бактерий
Enterobacter spp.,
Citrobacter spp, Serratia spp., Proteus проводилась по общепринятой методике [108].
Способность давать некроз кожи на кроликах при внутрикожном введении
изучалась в сравнении, как у моно-, так и у сокультивируемых энтеробактерий.
Для этого суточные моно- и сокультивируемые культуры УПЭ, с одинаковым
количеством микробных клеток (2млрд.микробных тел в 1мл.), изучаемых нами
63
микроорганизмов, на тщательно выстриженную кожу боковой поверхности тела
кролика внутрикожно вводили суспензию живой культуры в объеме 0,125 или
0,250 мл. На одном кролике делали не более одной инъекции. Результаты опытов
регистрировали через 12, 24, 48, 72 часа путем измерения размеров очага и
установление характера воспаления (гнойник, некроз).
2.2. МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Выделение плазмидной ДНК моно- и сокультивируемых микроорганизмов
проводили по методу Каdо C.T. и Liu S.T. [353]. В 6 мл мясопептонного бульона в
течение ночи выращивали монокультуры и сокультивировали штаммы бактерий
Enterobacter, Citrobacter, Serratia, E.coli, Proteus при 28-30С, осаждали
центрифугированием в рефрижераторе при 7-8 тыс. об.\мин в течение 20 минут.
Осадок суспендировали в пробирке Eppendorf, содержащей 40 мкл буфера «ТАЕ»
/Трис-7,2г, ЭДТА-1,1г, ледяная уксусная кислота – 2мл, вода дистиллированная –
1500 мл/, добавляли 200 мкл лизирующей смеси /Трис – 300 мг, Sds – 3 г, Н2О –
100 мл, рН – 12,6/ и прогревали всю смесь на водяной бане при 56С в течение
часа. Затем одновременно добавляли 2 объема смеси фенол хлороформа (рН7,6)
и 0,2 объема 5М хлористого натрия и энергично встряхивали для получения
равномерной суспензии. Смесь охлаждали и центрифугировали при 12 тыс.
об./мин в течение 15 минут при 4С. Верхнюю прозрачную водную фазу
осторожно отбирали автоматической пипеткой в новые пробирки Eppendorf и
добавляли 1\10 объема 3М ацетата натрия и 2 объема охлажденного 96 %
этанола, осторожно перемешивали и ставили в морозильник на несколько часов.
Затем в холоде центрифугировали при 12 тыс. об./мин в течение 15 минут.
Центрифугат осторожно сливали и ставили пробирки на фильтровальную бумагу
вверх дном на 10 минут, к осадку добавляли осторожно холодный 70 % этанол в
количестве 500 мкл, вращали пробирки и повторно ставили вверх дном на
фильтровальную бумагу. Оставшийся осадок суспендировали в 50 мкл буфера
«TАЕ», где плазмидная ДНК растворялась и была готова к электрофорезу.
64
Краситель - (бромфенол голубой – 0,07 г, Sds – 7 г, глицерол – 33 мл, вода
дистиллированная – 60 мл), вносили в пробу в соотношении 1:6 в 0,8 %
горизонтальный гель (агароза фирмы «Вектор Бест»), электрофорез проводили в
трис-боратной буферной системе при силе тока 60 мА. По окончании разгонки
нуклеиновых кислот гель окрашивали 15 минут в водном растворе бромистого
этидия фирмы «Вектор Бест» (10 мкг/мл) при комнатной температуре. Гель
промывали в дистиллированной воде. Фотографирование осуществляли при
помощи фотоаппарата «Olimpus».
В качестве источников реперных плазмид использовали эталонные штаммы
E.coli К12, несущие плазмиды с известной мол.м.: pBr 322 (2,8 МД), R 40а (96 МД),
R60 (60 МД), R27 (112 МД), S. typhimurium NR61 (120; 53; 4,0; 3,2; 1,4 МД),
P.vulgaris Rts–1 (120 МД).
Элиминацию плазмид проводили при помощи акридинового оранжевого,
бромистого этидия, додецилсульфата натрия и РНК-ингибиторами транскрипции
(рифампицин, актиномицин Д) [353]. Для этого брали 0,1 мл 10-5 разведения 1618 – часовые монокультуры и сокультивируемые вариации штаммов бактерий
Enterobacter, Citrobacter, Serratia, E.coli, Proteus несущих плазмиду, засевали в 6мл
бульона Хоттингера (рН 7,4-7,6), содержащего 75 мкг акридина оранжевого или
100 мкг\мл бромистого этидия в 1мл. Таким же образом готовили контроль –
культуры без красителя. Пробирки инкубировали в течение 18 часов при 37°С.
Затем опытную или контрольную культуры бактерий разводили с 10 -1 до 10-8
степени и из разведения 10-5–10-6 бульонной культуры по 0,1 мл засевали на
соответствующий агар.
Выявление конъюгативных плазмид у микроорганизмов проводили по
методической рекомендации, составленной коллективом авторов (Мамонтова
Т.Н., Белокрысенко С.С. с соавт.) [177] и утвержденной МЗ СССР в 1983 году.
Исследуемую
суточную
агаровую
культуру
штамма-донора
и
штамма-
реципиента засевали раздельно в бульон Хоттингера и инкубировали при 37С в
течение 18 часов. Утром ночные культуры донора и реципиента разводили 1:10
(32С) теплым бульоном и раздельно подращивали в течение 40 минут. Затем
65
готовили конъюгационную смесь, смешивая 4 мл бульона Хоттингера (рН 7,27,4) и 0,5 мл реципиента. Смесь инкубировали в наклонном положении в течение
16-18 часов при 32 и 42С. В дальнейшем брали 0,1 мл смеси и засевали на три
чашки
Петри
с
селективной
средой
таким
образом,
чтобы
получить
изолированные колонии. В контроле делали посевы отдельно культур донора и
реципиента, которые на среде селекции не должны давать роста. Посевы
инкубировали
при
32С
в
течение
24-48
часов.
Выросшие
колонии
трансконъюгатов дважды засевали на свежие среды селекции для очистки от
клеток
донора
и
реципиента.
У
трансконъюгатов
проверяли
наличие
неселективных маркеров, передавшихся одновременно с маркерами, по которым
вели первичный отбор. Для проверки неселективных маркеров трансконъюгаты
после очистки засевали короткими штрихами в чашки с агаром и оставляли в
термостате при 32С на ночь. Выросшие колонии перепечатывали на чашки с
различными антибиотиками с помощью репликатора, покрытого лоскутом
стерильного бархата. Чашки инкубировали в течение ночи при 30-32С.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) [173].
Материалом для исследования служили образцы ДНК, выделенных из
бактериальных суспензий моно- и сокультивируемых бактерий, которые были
протестированы на наличие генов вирулентности: фимбрий типа S (sfaA, sfaG) и
типа Р (papC, papCH), LT-энтеротоксинов (Lth) и продукции гемолизинов (hlуA,
hlуB). Для выполнения работы использовались пары праймеров, подобранных по
данным работ Boyd E.F. и Haiti D.L., по данным последовательностей
«островков» патогенности ДНК E.coli «GenBank» и синтезированных в НПФ
«Литех» г. Москва (табл.1).
66
Таблица 1- Праймеры для амплификации
Ген /
группа
генов
Sfa A
Sfa G
Pap C
Hly A
Hly B
Pap АН
Последовательности
нуклеотидов
Ожидаемый
размер
праймерах
продукта, (пн)
5'-CGGTGTGCGTAGTTCAAT-3'
5'-CACCCGCATGGATAAAAA-3'
5'-TGCCGGGAACACAGACCATAG-3'
5'-CAATCTTGATACCGCCAGCATTC-3'
5'-CGTTCGCCGGGTATCGTTTCTCAG-3'
5'-CCCGTTCCCCAGCGATTTGTCAC-3'
5'-CACGCGTGCCGACAAGTT-3'
5'-GCCACATCCCGGAAATCAAT-3'
5'-CGACGTCGCCTTGATGATA-3'
5'-TCCCCCTGCTTAATACTGAGAT-3'
5 '-GGAAGGTATCGGGTCAT-3'
5'-GGAATCAGAGAAAAGGTT-3'
Lth
в
5'-ATATATGGATGGTATCGTGTT-3'
641
450
724
474
542
856
627
5'-TCCTTCATCCTTTCAATGGC-3'
Аплификация проводилась при использовании 20 мкл реакционой смеси
следующего состава: 50 мМ КСl, 10 мM трис-НСl (рН-8,4), 2,5 мМ MgCl2, 0,1 %
тритон-Х-100, 0,2 мМ каждого из dАТФ,
dГТФ, dТТФ, dЦТФ, 2,0 мкМ/л
праймера, 1,5 U Tag ДНК-полимеразаы, 5 мкл бактериального лизата. После
предварительной денатурации в течение 5 мин при 94С осуществлялись 30
циклов амплификации при следующих условиях: 40 с при 94С, 1,30 с при 56С,
1,30 с при 72С. ПЦР проводили на четырехканальном термоциклере «Терцик»
научно-производственной фирмы «ДНК-Технология» (Москва).
Анализ ДНК.
Присутствие продуктов амплификации анализировали электрофоретически в
1 % агарозном геле, после окрашивания гелей бромистым этидием, с
последующей визуализацией в УФ-свете на трансиллюминаторе («VilberLourmat»
67
TCP-20M). В качестве маркеров молекулярных масс использовали ДНК фага 
рестрицированную Bst E2 (М1) и 123 пн - лестница «Promega» (М2).
Компьютерный
анализ
электрофореграмм.
Компьютерный
анализ
электрофореграмм осуществляли при использовании пакета программ TotalLab
from Phoretix (Великобритания).
2.3. ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Метод воспроизведения экспериментальной острой инфекции
Модель острой экспериментальной инфекции воспроизводили в
3-х экспериментальных группах:
- группа I - моделирование экспериментальной инфекции осуществляли
внутрибрюшинным
введением
бульонных
монокультур
Enterobacter
spp.,
Citrobacter spp., Serratia spp., E.coli, Proteus spp., содержащих LT-энтеротоксин в
дозе LD50 - 5∙108 КОЕ/мл;
группа II - моделирование экспериментальной инфекции осуществляли
внутрибрюшинным
введением
сокультивируемых
вариаций:
Enterobacter
spp.+Citrobacter spp., Enterobacter spp.+Serratia spp., Citrobacter spp.+Serratia spp,
Enterobacter spp.+Е.coli, Citrobacter spp.+Е.coli, Serratia spp.+Е.coli, Proteus
spp.+Enterobacter spp., Proteus spp.+Citrobacter spp., Proteus spp.+Serratia spp.,
Proteus spp.+Е.coli, штаммов содержащих LT-энтеротоксин в дозе LD50 - 5∙108
КОЕ/мл;
группа III (контрольная) - введение стерильного бульона Хоттингера (для
исключения влияния внешних и внутренних факторов на характеристики
оцениваемых иммунологических параметров).
При введении дозы LD50 (5∙1010 КОЕ/мл) развивался инфекционный процесс,
сопровождающийся выраженными изменениями активности животных, массы и
состояния шерстяного покрова.
Оценку всех тестируемых параметров проводили через 12-36-72 часа после
инокуляции монокультур и их ассоциаций.
68
Для
исключения
сезонных
колебаний
функциональной
активности
иммунной системы и воздействия различных факторов внешней среды (условия
содержания, питание, влажность, температура и т.д.) в контроле использовались
те же животные, что и в опытах, а именно: животные того же пола, возраста и т.д.
Сепарация эукариотических клеток
Резидентные клетки перитонеальных макрофагов (ПМф) у мышей
получали промыванием брюшной полости охлажденной средой 199 с гепарином
в концентрации 10 ед/мл. Клетки после отмывания разводили до концентрации
106 кл/мл средой 199, содержащей 200 мг/л L-глютамина, и вносили по 1 мл в
«сапожки», на дне которых помещались покровные стекла. Инкубированные в
течение 1 часа при 37С макрофаги прочно прикреплялись к поверхности стекла.
Монослойную культуру три раза промывали раствором Хенкса. В полученной
популяции клеток макрофаги составляли приблизительно 25-35%, лимфоциты 6070%. Примесь гранулоцитов не превышала 5%.
Селезенку, после извлечения и взвешивания, разрезали ножницами на
несколько частей, помещали в стеклянный гемогенизатор Поттера с неплотно
притертым пестиком и путем 2-3 тракций выдавливали клеточную массу в
охлажденную среду 199.
Кровь
у
животных
забирали
из
ретроорбитального
синуса
в
силиконированные пробирки с 50 Ед гепарина.
Мононуклеарные
клетки
периферической
крови
получали
путем
градиентного центрифугирования в плотности фиколл-верографина (q=1,077) в
течение 30 мин при 1500 об/мин. Клетки белого кольца отсасывали в
силиконовые пробирки.
Полученные суспензии клеток фильтровали через слой капроновой сетки,
отмывали средой 199 посредством центрифугирования в течение 10 минут при
1000 об/мин. Осадок ресуспензировали в необходимом количестве охлажденной
среды 199 и определяли число клеток в камере Горяева. С помощью 0,1%
раствора трипановой сини подсчитывали количество живых клеток. Полученные
клеточные взвеси разводили средой 199 до нужной концентрации и использовали
69
для постановки реакций. Все манипуляции проводили при температуре тающего
льда [129].
Методы исследования функции перитонеальных, селезеночных
макрофагов и моноцитов перифирической крови
Фагоцитарную
активность
исследуемых
клеток
оценивали
по
их
способности к захвату частиц полистирольного латекса.
В основе метода лежит выделение макрофагов (Мф) и моноцитов (Мн) из
клеточной суспензии в процессе культивирования, связанное с их адгезивной
способностью [128].
К прилипшим и отмытым культурам мононуклеаров добавляли 0,1 мл
взвеси стандартных частиц латекса диаметром 1,7 мкм в концентрации 108
частиц/мл. Через 1 час культивирования в термостате при 37С препараты
ополаскивали
в растворе
Хенкса, монтировали
на предметном стекле,
фиксировали метанолом и окрашивали по Романовскому - Гимзе. Микроскопию
проводили с иммерсией. Учитывали активность фагоцитоза – количество
мононуклеарных фагоцитов, содержащих частицы латекса в цитоплазме, и его
интенсивность – число частиц латекса в 100 подсчитанных клетках в пересчете на
1 клетку или 100 клеток.
Изучение состояния лизосомального аппарата фагоцитирующих клеток
проводили с помощью люминисцентно-микроскопического метода [141]. Для
этого к 0,2 мл взвеси перитонеальных макрофагов с концентрацией 5-106 кл/мл
добавляли 0,02 мл рабочего раствора акридинового оранжевого. Через 30 минут
инкубирования при 37С каплю препарата помещали на предметное стекло,
накрывали покровным стеклом и микроскопировали в люминесцентном
микроскопе Р-8 с использованием сине-фиолетового света. По интенсивности
поглощения флюорохрома лизосомами все фагоциты делили на 4 группы: 0 –
клетки, в которых нет лизосом или присутствуют единичные гранулы; 1 –
фагоциты, в которых интенсивность свечения лизосом слабая, но они занимают
1/3 клеточной цитоплазмы; 2 – клетки, в которых лизосомы со средней
интенсивностью свечения занимают 1/2 цитоплазмы; 3 – фагоциты, в которых вся
70
цитоплазма заполнена ярко – красными светящимися гранулами. Для подсчета
суммарной люминесценции лизосом число подсчитанных клеток в группе 3
умножали на 10, в группе 2 – на 3, в группе 1 – на 1, произведения суммировали
и делили на число сосчитанных фагоцитов (100 клеток).
Изучение
внутриклеточного
кислородзависимого
метаболизма
перитонеальных фагоцитов проводили, используя НСТ-тест [129]. Метод основан
на учете интенсивности восстановления клетками нитросинего тетрозолия в его
нерастворимую форму – диформазан, который в виде грубодисперсных темных
гранул откладывается внутри или на поверхности клеток. К 0,2 мл клеточной
взвеси с концентрацией не менее 5-107 кл/мл в среде 199 с 20% сывороткой
АВ(IV) Rh (-) добавляли 0,1 мл 0,2 % раствора реактива P-NST «Reonal»
(Венгрия) и инкубировали 30 минут при 37С. Затем в реакционную смесь
вводили
3,0
мл
0,1
HCI
для
остановки
реакции.
центрифугированием в течение 5 мин при 103 об/мин.
Клетки
осаждали
Из осадка готовили
препараты – «мазки», фиксировали метанолом, ядра докрашивали в течение 5
минут 0,1% водным раствором сафранина Т. Учет результата проводили в
иммерсионном микроскопе при увеличении 90x10x1,5. По степени активности
все фагоциты делили на 4 группы: 0 – клетки с единичными пылевидными
гранулами и без них; 1 – клетки с отложениями диформазана, не превышающими
в сумме 1/3 площади ядра; 2 – клетки с отложениями более 1/3, но не более
размеров ядра; 3 – клетки с отложениями диформазана, превышающими размер
ядра.
Для
получения
показателя
интенсивности
реакции
количество
подсчитанных клеток в каждой группе умножали на порядковый номер группы,
суммировали и делили на 100 (число сосчитанных фагоцитов).
Методы определения экстрацеллюлярных сетей
Суть данного метода заключается в использовании раствора акридинового
оранжевого для окраски ядерного вещества фиксированных нейтрофилов,
выделенных из переферической венозной крови человека и активированных
разными микроорганизмами (Долгушин И.И., c соавт. 2009) [129].
71
Для обнаружения экстрацеллюлярных сетей 1 мл. тестируемой взвеси
нейтрофилов инкубируют при 37оС в течении 30 минут в присутствии разных
активаторов. Для контороля используют взвесь нейтрофилов, инкубируемых в
тех же условиях, но без активаторов. После инкубации клеточную взвесь наносят
на стекло и высушивают. Для фиксации используют 96% этиловый спирт,
который наносят на мазок в количестве 100 мкл. (после испарения спирта мазок
считается фиксированным).
Для окрашивания экстрацеллюлярных сетей на фиксированный препарат
наносят 200 мкл. рабочего раствора акридинового оранжевого и выдерживают
при комнатной температуре в течении 2 минут в темноте. Раствор акридинового
оранжевого предварительно готовят по следующей схеме: 5мг. сухого красителя
растворяют в 5 мл. физиологического раствора, полученный таким образом
маточный раствор (1мг/мл) хранят при 4оС. Перед использованием 0,2 мл
раствора смешивают с 4,8 мл физиологического раствора.
Учет проводят с помощью люминисцентного микроскопа, используя
фильтры, обеспечивающие возбуждающий свет с длинной волны не более 490
нм. и эмиссию с длинной волны 520 нм. При таком способе окраски ядра
нейтрофилов окрашиваются в ярко-зеленый цвет, цитоплазма гранулоцитов не
окрашивается, экстрацеллюлярные сети представлены тонкими ярко-зелеными
нитями, занимающими пространство, в 2-3 раза превосходящие диаметр
неизмененного нейтрофила, а бактерии-активаторы имеют ярко-оранжевый цвет.
Способ
обнаружения
экстрацеллюлярных
сетей
при
окрашивании
акридиновым оранжевым позволяет количественно оценить образующиеся
структуры, так как хорошо различимы нейтрофилы с разной морфологией ядра,
которые объединяют в 3 группы:
1) Клетки с сегментироавнным яром
2) Клетки с недифференцированным ядром
3) Свободнолежащие ярко-зеленые волокна, представляющие собой нити
ДНК (экстрацеллюлярные сети). Подсчитывают 100 структур разных групп и
определяют процентное содержание каждой морфологической формы.
72
Так
как
имеется
контраст
между
нейтрофилами
и
их
сетями,
окрашиваемыми в зеленый цвет, а так же бактериями, окрашиваемыми в
оранжевый, оценивают 4 критерия, отражающих активность и интенсивность
активного захвата микроорганизмов в процессе фагоцитоза или пассивного
попадания бактерий-активаторов в экстрацеллюлярные сети:
1) Активность фагоцитоза (в %) – долю нейтрофилов с сегментированным
ядром,
содержащих
бактериальные
клетки
в
цитоплазме
из
100
подсчитанных клеток с сегметированным ядром;
2) Интенсивность фагоцитоза (в усл.ед) – число бактерий в 100 подсчитанных
клетках с сегментированным ядром в пересчете на 1 клетку;
3) Число экстрацеллюлярных сетей (в %) – количество экстрацеллюлярных
сетей,
содержащих
бактериальные
клетки,
из
100
подсчитанных
сетеподобных структур;
4) Индекс экстрацеллюлярной сети (в усл.ед) – число бактерий в 100
подсчитанных экстрацеллюлярных сетей в пересчете на одну структуру.
Способ обнаружения экстрацеллюлярных сетей с применением 2 красителей
Суть предлагаемого способа заключается в использовании сложного
способа окраски нативного препарата с применением 2 красителей – Sytox Green
для окрашивания внеклеточных волокон ДНК и ядер погибших клеток, так же
синьки Эванса для фонового окрашивания нативного препарата [129].
Для обнаружения экстрацеллюлярных сетей мукозальный секрет в
количестве 0,1 мл. вносят в 0,9 мл. физиологического раствора. Затем 0,1 мл.
полученной суспезии смешивают с 0,1 мл. сложного красителя, который готовят
ex temporo в отдельной пробирке: 1 мл. синьки Эванса в концентрации 1:8000
смешивают с одним мл. красителя Sytox Green в концентрации 1:500.
Инкубируют в течении 5 минут в темноте. Из окрашенного материала готовят
препарат «раздавленная капля». Учет проводят с помощью люминесцентого
микроскопа, используя фильтры, обеспечивающие возбуждающий свет с длинной
волны не более 490 нм. и эмиссия с длинной волны 520 нм. Погибшие клетки и
73
экстрацеллюлярные сети окрашиваются в ярко-зеленый цвет, жизнеспособные
клетки и слизь – в ярко-оранжевый.
Можно провести количественную оценку жизнеспособности нейтрофилов,
так как при таком способе происходит дифферецированное окрашивание клеток:
выявляются
1) Жизнеспособные клетки ярко-оранжевого цвета
2) Клетки с зеленым ядром и ярко-оранжевой цитоплазмой, по видимому,
подвергшиеся апоптозу
3) Погибшие клетки зеленого цвета
4) Свободнолежащие ярко - зеленые волокна, представляющие собой нити
ДНК (экстрацеллюлярные сети). Проводят подсчет 100 структур разных групп и
определяют процентное содержание каждой морфологической единицы.
При предлагаемом способе окрашивании можно оценить как, активность и
интенсивность поглащения микроорганизмов неизмененными нейтрофилами, так
и показатели захвата микроорганизмов экстрацеллюлярными сетями. Для этого
рассчитывают следующие показатели:
1) Активность фагоцитоза (в %) – число нейтрофилов содержащих
бактериальные клетки в цитоплазме из 100 подсчитанных гранулоцитов;
2) Интенсивность фагоцитоза (усл. ед) – число бактерий в 100
подсчитанных нейтрафилах в пересчете на 1 клетку;
3) Число экстрацеллюлярных сетей (в %) – количество экстрацеллюлярных
сетей, содержащих бактериальные клетки, из 100 подсчитанных сетеподобных
структур;
4) Индекс экстрацеллюлярной сети (в усл. ед) – число бактерий в 100
подсчитанных ловушках в пересчете на одну структуру.
74
Апоптоз эукариотических клеток
Оценку апоптоза эукариотических клеток проводили в проточном
цитофлюориметре (FL3, >600 нм) по структурным изменениям ядерной ДНК
клеток, окрашенных йодистым пропидием (РI) [129]. Клетки перитонеального
экссудата отбирали в cреду 199, осаждали центрифугированием при 400 g в (1300
об/мин) в течение 10 минут на центрифуге «Jouan B 3.11» (Франция).
Полученный осадок клеток переносили в чистую пробирку, клетки дважды
отмывали в среде Хенкса. Количество клеток подсчитывали в камере Горяева с
использованием
светового
микроскопа
«JENAMED
2».
Осадок
клеток,
ресуспендированный в среде Хенкса (100 мкл), содержащей 5х105 клеток
перитонеального экссудата, помещали в пробирки с ледяным -70о этанолом и
хранили в холодильнике (-20оС до окрашивания). Процедура окрашивания
проводилась в стандартных пробирках для цитометрии. Клетки отмывали после
этанола ФСБР и ресуспензировали в красящем растворе, содержащем 0,005%
йодистого пропидия, 0,1% цитрата Na, 0,1% Тритона Х100. Непосредственно
перед проведением процедуры к красящему раствору добавляли РНК-азу
(«Sigma») в концентрации 50 мкг/мл для удаления примесей двуспиральной РНК
в образцах.
2.4. СТАТИСТИЧЕСКАЯ ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ
Статистическая обработка результатов проводилась общепринятыми методами
вариационной
статистики
с
определением
средней
арифметической
вариационного ряда (М), среднего квадратичного отклонения (δ), средней
ошибки средней арифметической (m). Показатель достоверности различий (р)
определялась по таблице с использованием критерия Стьюдента (t). Разница
между сравниваемыми величинами считалась достоверной при значении р<0,05
[11].
75
ГЛАВА 3. ХАРАКТЕРИСТИКА МОРФОЛОГИЧЕСКИХ И
ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ ОСОБЕННОСТЕЙ УСЛОВНОПАТОГЕННЫХ ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ (СОБСТВЕННЫЕ
ИССЛЕДОВАНИЯ)
3.1.
Характеристика
энтеробактерий
клинических
штаммов
условно-патогенных
Материалом для исследований послужили 265 штаммов изучаемых нами
условно-патогенных микроорганизмов, выделенных как из проб клинического
материала: от 3658 больных с гнойно-воспалительными, кишечными и
урологическими заболеваниями, а так же от 898 здоровых людей: 50 штаммов
Enterobacter spp., 50 штаммов Citrobacter spp., 50 штаммов Serratia spp., 50
штаммов E.coli, 50 штаммов Proteus spp., а так же 10 вариаций сокультивируемых
штаммов Enterobacter spp.+Citrobacter spp. (Е+С), 10 вариаций Enterobacter
spp.+Serratia spp. (Е+S), 10 вариаций Citrobacter spp.+ Serratia spp. (C+S), 10
вариаций Enterobacter spp.+Е.coli (Ent+Е.coli), 10 вариаций Citrobacter spp.+Е.coli
(C
+Е.coli),
10
вариаций
Serratia
spp.+Е.coli
(S+Е.coli),
10
вариаций
Proteus+Enterobacter spp. spp.(Prot+Е), 10 вариаций Proteus spp.+Citrobacter spp.
(Prot+С), 10 вариаций Proteus spp.+Serratia spp. (Prot+S), 10 вариаций Proteus
spp.+Е.coli (Prot+Е.coli). Дополнительно были использованы по 5 штаммов
Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., Е.coli, Proteus spp. выделенных от
898 здоровых людей. Так же в процессе выполнения работы нами были
использованы приоритетные штаммы E. coli обладающие комплексом факторов
патогенности, которые были депонированы в ГИСК им. Л.А. Тарасевича и
запатентованы (патенты: E.coli ГИСК №280, №2293765; E.coli ГИСК №281,
№2293764), и могут быть использованы как эталонные при идентификации
условно-патогенных энтеробактерий. Все выделенные и используемые культуры
по своим свойствам были типичными для соответствующих родов бактерий.
76
Морфологические и культуральные свойства и контакты между
клетками Enterobacter spp., Citrobacter spp.,Serratia spp., E.coli,
Proteus spp.
Исследуемые штаммы Enterobacter spp. при первичном посеве на
3.1.1.
поверхности плотной питательной среды давали рост в виде характерных
изолированных колоний. На среде Эндо лактозоположительные варианты росли с
образованием колоний малинового цвета, а лактозоотрицательные – в виде
безцветных
или
серовато-розовых
колоний.
На
среде
Плоскирева
микроорганизмы росли с образованием желтоватых колоний. При определении
родовой принадлежности учитывали биохимичскую активность культур по
отношению утилизировать цитрат в среде Симонсона, образования кислоты и
газа в глюкозе, гидролизовать эскулин, ферментировать манит, малонат, адонит,
аргинин, сахарозу, рамнозу, сорбит, трегалозу, дульцит, инозит, целлобиозу.
Штаммы бактерий Enterobacter spp. не обладали фенилаланиндезаминазной
активностью и большинство штаммов медленно разжижали желатин. Мочевину
гидролизовали слабо или медленно. Давали положительную реакцию ФогесаПроскауэра и отрицательную с метиловым красным. Не образовывали
сероводород и индол. На жидких питательных средах через двое суток давали
помутнение с образованием слабого осадка на дне пробирки и образование
нежной пленки на поверхности среды. При бактериоскопии препарата
«раздавленная и висячая капля» бактериальные клетки обладали поступательным
и маятникообразным движением. При посеве на полужидкий агар штаммы
Enterobacter spp. диффундировали в среду через 12-24 часов при температуре 37
ºC.
При
просвечивающей
электронной
микроскопии
(увеличение
10 4)
бактериальные клетки представляли собой палочки длинной 1,2 – 3,0 мкм и 0,6 –
1,0 мкм в поперечнике с перитрихиально расположенными жгутиками. Изучение
ультраструктуры штаммов показало, что среднее число жгутиков колеблется от 7
до 60.
77
Рисунок 1 - Жгутики Enterobacter spp.
Штаммы Citrobacter spp. так же при первичном посеве, на поверхности
плотной питательной среды давали характерный рост в виде изолированных
колоний. На среде Эндо лактозоположительные варианты Citrobacter spp.
образовывали колонии, розового или красного цвета, у лактозоотрицательных
вариантов колонии были бесцветными или розовато-серого оттенка. При
определении родовой приналежности учитывали биохимическую активность
культур по отношению утилизировать цитрат в среде Симонсона, образование
газа в глюкозе, ферментировать манит, рамнозу, сорбит, арабинозу, ксилозу и
мальтозу. Штаммы бактерий Citrobacter spp. не обладали лизиндекарбоксилазной,
фенилаланиндезаминазной
и
желатиназной
активностями.
Мочевину
гидролизовали слабо или медленно. Давали положительную реакцию с
метиловым красным и отрицательную реакцию Фогеса-Проскауэра. Были
способны образовывать сероводород и индол.
На жидких питательных средах через 2 суток давали помутнение с
образованием слабого осадка на дне пробирки, а так же нежной пленки на
поверхности среды. При изучении подвижности обладали поступательным и
маятникообразным движением. При посеве на полужидкий агар штаммы
диффундировали в среду через 12-24 часа при температуре 37°C. При
электронной микроскопии (увеличение 104) бактериальные клетки представляли
78
собой палочки длинной 2,0-6 мкм и 0,5– 1 мкм в поперечнике с перитрихиально
расположенными жгутиками. Изучение ультраструктуры бактерий показало, что
число жгутиков колеблется от 8 до 70.
Рисунок 2-Жгутики Citrobacter spp.
Исследуемые штаммы Serratia spp. при первичном посеве на поверхности
плотной питательной среды все давали рост в виде изолированных колоний, а
пигмент образующие штаммы красно-малиновый рост. При определении родовой
принадлежности, так же учитывали биохимическую активность культур по
отношению, образование газа в глюкозе, ферментировать манит, рамнозу, сорбит,
арабинозу, сахарозу, ксилозу. Штаммы бактерий Serratia spp.
давали
положительную реакцию Фогеса-Проскауэра, большинство штаммов замедленно
разжижали желатин, не обладали аргининдекарбоксилазной активностью. Не
образовывали сероводород и индол. В мясопептонном бульоне – вызывают
равномерное
помутнение
с
выпадением
осадка
к
концу
суточного
культивирования. Исследования на подвижность методом бактериоскопии в
раздавленной и висячей капель показали, что бактериальные клетки обладали
поступательными и маятникообразными движениями. При посеве на полужидкий
агар
диффундировали
микроскопическом
в
среду
исследовании
в
течение
бактерий
суток.
Serratia
При
электронно-
(увеличение
104)
бактериальные клетки представляли собой палочки длинной 0,9-2,0 мкм и
79
шириной 0,5-0,8 мкм, окруженные перитрихиально расположенными жгутиками.
Среднее число жгутиков колебалось от 6 до 50-60.
Штаммы Е.соli на поверхности МПА в течении суток вырастали в виде
полупрозрачных колоний с гладкой поверхностью и ровными краями размером
около 3-4 мм. На среде Эндо они давали рост в виде красно-малиновых колоний с
металлическим блеском, при этом лишь два штамма лактозонегативными и
вырастали в виде бледноватоматовых выпуклых колоний с ровными краями. При
культивировании штаммов бактерий Е.соli в жидкой питательной среде,
образовывалось равномерное помутнение, с выпадением легкого осадка
в
течение 20-24 часов. Бактериоскопия в раздавленной и висячей каплях показало,
что клетки обладают поступательными и маятникообразными движениями. При
посеве на полужидкий агар бактерии диффундировали в среду в течение 12-24
часов при температуре 37°C. При электронно-микроскопическом исследовании
бактерий рода Е.соli (увеличение 104) бактериальные клетки представляли собой
палочки
длинной
перитрихиально
2,0-6,0
мкм
расположенными
и
шириной
жгутиками.
1,1-1,5
Среднее
мкм,
окруженные
число
жгутиков
колебалось от 5 до 50-60.
Из выделенных штаммов Proteus при первичном посеве на поверхность
твердой питательной среды 35 давали характерный стелющийся рост с
образованием голубовато-дымчатого налета и 15 - в виде изолированных
колоний. Все роящиеся штаммы Proteus на 2 сутки культивирования в бульоне
давали помутнение с образованием слабого осадка на дне пробирки, а иногда
нежной пленки на поверхности жидкой питательной среды. При бактериоскопии
в раздавленной и висячей каплях бактериальные клетки обладали выраженной
подвижностью. При посеве уколом в полужидкий агар типичные роящиеся
формы протея при комнатной температуре (21-23°C) полностью диффундировали
в среду в течение 10-12 часов. При просвечивающей электронной микроскопии
(увеличение в 20 тысяч раз), бактериальные клетки представляли собой палочки
длиной 0,5-3,0 мк и 0,5-0,6 мк в поперечнике (рис.3), с множеством
перитрихиалыно расположенных жгутиков (рис.4) и ресничек длиной от 125 до
80
583 нм и шириной 8,3 нм (рис.5). При этом необходимо отметить, что реснички
некоторых штаммов Proteus обнаруживались по всему периметру клетки, тогда
как клетки других штаммов не имели ресничек или имели их в небольшом
количестве.
Рисунок 3 - Клетки роящейся формы протея под электронным микроскопом
(JEM-100Вув.2000х).
Рисунок 4 - Микробные клетки роящейся формы протея под
электронным микроскопом. Перитрихиально расположенные жгутики
(JEM-100 В ув. 20000х).
81
Рисунок 5 - Клетки протея под электронным микроскопом
(JEM-100 В ув. 30000х).
Реснички длиной от 125 до 583 нм и шириной 8,3 нм.
Выделенная из клинического материала и полученная в экспериментальных
условиях нестабильно нероящаяся форма протея на поверхности твердой
питательной среды росла в виде округлой, выпуклой, блестящей колонии с
ровными краями, а на мясопептонном бульоне давала диффузное помутнение с
образованием слабого осадка к началу вторых суток культивирования.
При бактериоскопии раздавленной и висячей капели бактериальные клетки
протея представляли собой подвижные клетки, а на окрашенных препаратах–
грамотрицательные палочки с полиморфизмом.
При посеве уколом в полужидкий агар культуры при 21-23°C полностью
диффундировали в среду в течение 12-14 часов. При электронной микроскопии
клетки имели слаборазвитые жгутики (рис.6).
82
Рисунок 6 - Клетки нестабильно нероящейся формы под электронным
микроскопом (JEM-100 В ув. 20000х). Клетки имеют слаборазвитые
жгутики.
Только у молодых форм, исследуемых через 3-4 часа после нанесения на
МПА, удается обнаружить морфологические различия между роящимися и
нестабильно нероящимися формами протея.
Для получения стабильно нероящейся формы брали додецилсульфат
натрия, добавляли в стерильный бульон (рН 7,2-7,4) в концентрации 5%,
разливали в пробирки по 8 мл, кипятили трехкратно по 30 минут и засевали
роящимися формами протея. Для опыта брали 4 роящихся штамма P. vulgaris и 4
– P. mirabilis. Все штаммы были выделены от больных. В начале опыта путем
кратковременного культивирования в мясопептонном агаре, содержащем 5%
додецилсульфата натрия (Sds), попытались установить возможность подавления
ползучего роста протеев. Для этого брали 18-часовую бульонную культуру P.
vulgaris или P. mirabilis
и засевали на чашки Петри с 1,5% мясопептонным
агаром с 5% Sds и культивировали в термостате при 37°С в течение 24-72 часов.
При этом часть клонов росла в виде изолированных колоний. Однако, при первом
же посеве по Щукевичу такие формы ревертировали в исходные роящиеся
формы. Далее была предпринята попытка культивирования P. vulgaris или P.
mirabilis в течение 28-30 дней при комнатной температуре (18-20°С). С этой
целью брали по 0,1 мл бульонной культуры, засевали на чашки Петри с 1,5%
83
мясопептонным агаром (рН 7,2-7,4) и ставили в термостат при 37°С на 48 часов.
Все 30-дневные бульонные культуры P. vulgaris или P. mirabilis без
додецилсульфата натрия при посева на 1,5% мясопептонный агар росли в виде
роящихся Н-форм, а большинство культур, выросших в мясопептонном бульоне с
5% концентрацией додецилсульфата натрия на чашках Петри с 1,5%
мясопептонным агаром, росли в виде изолированных О-клонов.
В дальнейшем от каждого штамма брали по 100 изолированных О-клонов и
в течение 8 месяцев их периодически пересевали по Щукевичу (через каждые 15
дней). Те клоны, которые росли в виде О-колоний, трехкратно пересевали в
нативный мясопептонный бульон, каждый раз проверяя ползучесть на
скошенном 1,5% мясопептонном агаре по Щукевичу.
Результаты наших исследований показали, что 93-95% клонов штаммов
протеев после 2-3 кратного посева по Щукевичу превращались в Н-формы, 24%
клонов – после 9-10 кратного, а оставшиеся 7% клонов ревертировали в ползучие
формы только после 3–кратного культивирования в нативном мясопептонном
бульоне. А у 9-10% клонов после 4-5 кратного посева на скошенный
мясопептонный агар по Щукевичу, 15-17% клонов после 9-10 кратного посева по
Щукевичу превращались в исходные Н-формы. Трехкратное культивирование
оставшихся изолированных клонов в нативном мясопептонном бульоне показало,
что у 2 штаммов оставались 28% и 29% соответственно, в виде стабильных Оформ, у штамма № 2731-26% клонов оставались в виде стабильных О-колоний.
Дальнейшие
наблюдения
показали, что
большинство
клонов
сохраняли
способность расти в виде изолированных колоний и не ревертировали в роящиеся
Н-формы в течение 3 летнего срока пересевов. Эти результаты показывают, что
культивирование Н-формы протея в течение 28-30 дней в мясопептонном
бульоне, содержащем 5% концентрации додецилсульфата натрия, приводит к
селекции стабильных О-форм клонов этого микроорганизма.
Выделенные и экспериментально полученные стабильно нероящиеся
формы протеев на поверхности твердой питательной среды росли в виде мелких
округлых, выпуклых, лишенных блеска колоний диаметром не более
2-3 мм.
84
При просмотре под косым освещением колонии имели голубоватый оттенок, а в
мясопептонном бульоне давали слабое помутнение с образованием осадка на дне
пробирки. Причем бактериальные клетки стабильно нероящейся формы по
сравнению с исходной формой характеризовались более низким уровнем выхода
бактериальной массы.
При бактериоскопии раздавленной и висячей капель бактериальные клетки
обладали
слабым
спиралевидным,
волнообразным
движением.
Культура,
посеянная в полужидкий агар, при 21-23оС диффундировала в среду только через
30-34 часа. На окрашенных по Граму препаратах бактериальные клетки
представляли собой мелкие грамотрицательные палочки, отличающиеся от
роящейся формы выраженным полиморфизмом, среди которых встречались
короткие по структуре клетки (рис.7).
Рисунок 7 - Клетки стабильно нероящейся формы под электронным
микроскопом (JEM-100 В ув. 12000х).
85
Рисунок 8 - Ультратонкие срезы клеток стабильно нероящихся форм протея
под электронным микроскопом (JEM-100 В ув. 60000х). Клеточная стенка с
выраженными изгибами (а), плотно прилегающая к цитоплазматической
мембране (б).
Спонтанные ревертанты, полученные из стабильно нероящихся клонов, на
питательных средах росли в виде исходной роящейся формы и по роению и
морфологическим свойствам были сходны с родительскими.
Результаты наших исследований согласуются с данными других авторов
[37,123].
В дальнейшем изучали ультраструктуру роящихся и нероящихся
изогенных пар штаммов различных видов протеев, выделенных от урологических
больных, и мутантов полученных в экспериментальных условиях с помощью
просвечивающей и сканирующей электронной микроскопии.
В опыте были использованы роящиеся и нестабильно роящиеся, и
стабильно нероящиеся варианты штаммов протея.
Все нестабильно нероящиеся клетки были получены по разработанной
Габидуллинным З.Г. методике [рац. предложение за №168, 1978, г.Уфа] путем
культивирования на 4% мясопептонном агаре, которые при однократном посеве
по Щукевичу ревертировали в роящиеся формы [38].
86
Все стабильно нероящиеся мутанты протеев не ревертировали к роящемуся
фенотипу при работе с культурами в течение 3 лет.
Изучаемые бактерии выращивали на мясопептонном агаре (МПА) в
течение 1 суток. Роящиеся бактерии исследовали также в динамке роста на
чашках с МПА, забирая их для микроскопии каждые 2 часа от момента высева.
Для
получения
негативно
окрашенных
препаратов
суспензии
бактерий
металлической петлей в небольшом количестве наносили на медные сетки,
покрытые формфаровой пленкой [9]. Сначала их наблюдали под оптическим
микроскопом для установления густоты микробных тел и высушивали в
эксикаторе при комнатном температуре, затем оттеняли в специальных
вакуумных установках типа JJE-4. Напыление препаратов проводили нихромом.
В
препаратах,
изготовленных
этим
способом,
проводили
с
помощью
электронного микроскопа JEM-100В с ускоряющим напряжением 80 кВ учет
количества жгутиков на 100 контуров бактериальных клеток.
Колонии, предназначенные для просмотра в просвечивающем электронном
микроскопе, фиксировали in situ 2,5% глутаровым альдегидом 10 минут и
покрывали тонким слоем расплавленного агара. Затем колонии вырезали вместе с
надлежащим и подлежащим слоями агара и помещали в новую порцию 2,5%
глутарового альдегида на 20 мин. Дофиксировали 1% раствором четырехокиси
осмия на этом же буфере 1 час и после обезвоживания в возрастающих
концентрациях этанола заключали в аралдит. Срезы получали на ультратоме LkbIII (Швеция) и просматривали в электронном микроскопе JEM-СХ (Япония) при
ускоряющем напряжении 80 кВ (Рис.8).
Колонии бактерии, предназначенные для исследования в сканирующем
электронном микроскопе, выращивали на целлофановой пленке, помещенной на
поверхность МПА. Снятую вместе с бактериями пленку фиксировали 1%
глутаровым альдегидом на кокадилатном буфере 1 час с последующей
дофиксацией 1% раствором четырехокиси осмия и обезвоживанием в ряду
возрастающих концентраций этанола.
87
Путем проведения через абсолютный этанол образцы высушивали методом
обхода критической точки в установке фирмы «Balzers», напыляли золотом
(толщина напыления 50 нм) и просматривли в сканирующем электронном
микроскопе Hitaсhi S-405А (Япония) при ускорящем напряжении 15 кВ.
При исследовании негативно окрашенных препаратов установлено, что
штаммы протеев, способные к роению и нестабильно нероящиеся мутанты в
среднем
имели
одинаковое
количество
жгутиков,
хотя
прослеживалась
определенная тенденция уменьшения их количества у нестабильно нероящихся
форм протея.
Среднее число жгутиков у роящихся форм колебалось в пределах от 8 до
60-70 и более, а у нестабильно нероящихся форм - от 5 до 30-50
свежесформированных и развитых жгутиков на контур бактериальной клетки
(рис. 4,6,9). При этом необходимо отметить, что клетки различных штаммов
имели разное количество жгутиков, на что определенное влияние оказывали и
используемые при приготовлении препарата вещества. Так, при обработке
препарата раствором уранилацетата, наблюдали большую ломкость жгутиков и,
соответственно, резкое уменьшение их количества. Жгутики часто располагались
в межклеточном пространстве отдельно от поверхности бактерий.
88
Рисунок 9 - Электронная микроскопия (JEM-100 В ув. 12000х)
а) Жгутики роящихся клеток густой сетью располагаются по периметру
клетки.
б) Жгутики стабильно нероящегося мутанта не превышает 4-х.
89
Рисунок 10 - Электронная микроскопия (JEM-СХ /Япония/ ув. 30000)
Ультратонкие срезы роящихся колоний. Клетки имеют горизонтальную
ориентацию, жгутики между ними расположены в виде густой сети.
Рисунок 11 - Электронная микроскопия (JEM-СХ /Япония/ ув. 30000)
Ультратонкие срезы колоний мутантов утративших свойство роения.
Клетки,
прилегающие
ориентацию.
к
поверхности
агара,
имеют
вертикальную
90
В ультратонких срезах, выполненных с колоний роящихся форм, жгутики
выявляли в виде густой сети (рис. 9(а)). Провести их количественный учет, а
также выявить какие-либо различия в количестве жгутиков роящихся и не
роящихся форм протея не представлялось возможным из-за их сложного
пространственного расположения.
Далее мы, используя просвечивающую и растровую микроскопию,
исследовали структуру бактерий, забираемых из центральноЙ и периферической
зон их роста на плотной питательной среде. Установлено, что ориентация
бактерий в центре колоний, зафиксированных in situ, не зависела от наличия у
штаммов признаков роения. Следует отметить, что нижний слой бактерий,
прилагающий к поверхности агара имеет почти вертикальную ориентацию,
изредка
перемещающуюся
горизонтально
расположенными
бактериями;
последующие слои лежат слегка наклонно. Подобная структура расположения
клеток сохраняется у протеев, лишенных способности к роению и на периферии
колоний, имеющих, как правило, четкий контур (рис. 9(б)). Нарастание вуали
колоний за счет деления бактерий идет, на наш взгляд, в основное путем
увеличения слоев и достаточно редко, как это показано на рис.13 - за счет выхода
отдельных особей за пределы колонии.
Иначе обстоит дело у роящихся штаммов протеев. Микробные клетки по
периферии колоний, значительно превышающие по размерам бактерии,
расположенные в центре колоний, располагались на свободном пространстве
агара длинными линейными группировками, далеко распространяющимися от
края колонии по свободному пространству агара.
Различия в строении края колонии роящихся и нероящихся бактерий,
выращенных на целлофановой подложке, наиболее четко выявляются при их
изучении в сканирующем пучке электронов.
91
Рисунок 12 - Изображение в сканирующем пучке электронов (Hitachi S –
Япония).
405A,
Нижний
слой
клеток
нероящегося
мутанта
лежит
вертикально.
Рисунок 13 - Изображение в сканирующем пучке электронов. Микробные
клетки
роящего
штамма
значительно
превышают
по
размерам
расположенные в центре колонии и распространяются от края колонии по
свободному пространству агара (ув. 7500х).
Как показали опыты, дикие стабильно нероящиеся штаммы, выделенные от
больных урологическими инфекциями, а также полученные мутанты в отличие от
роящихся не имели или имели не более 2-4 жгутиков, определяемых в негативно
92
окрашенных препаратах (рис. 15). После обработки микробной суспензии
методом Келенбергера, половину приготовленной суспензии исследовали с
негативным окрашиванием 2 и 3% раствором ФВК. Для чего препараты
фиксировали 3% раствором глутарового альдегида, дофиксировали 1% раствором
четырехокиси осмия. Ультратонкие срезы полимеризировали по Рейннольду 3%
раствором уронилацетата и просматривали при помощи просвечивающего
электронного микроскопа. При этом клетки роящихся форм оказались по размеру
относительно однородными, имели овоидно-вытянутую форму, в цитоплазме
ультратонких срезов клеток просматривалась четкая зернистость, клетки имели
относительно ровные клеточные стенки и между клеточной стенкой и
цитоплазматической мембраной было четко выраженное пространство, в
промежутках между клетками выявляли срезы густой сети жгутиков (рис.5).
Несколько иная структура была обнаружена у клеток стабильно
нероящихся форм протея (рис. 13). Клетки оказались полиморфными (рис. 11),
имели по сравнению с роящимися формами несколько вытянутую форму (pиc.
12), цитоплазма была лишена четкой зернистости (рис. 13), имели неровную
клеточную стенку с хорошо выраженными изгибами, которая плотно прилегала к
цитоплазматической мембране, между которыми отсутствовало свободное
пространство, отсутствовали или были единичными срезы жгутиков.
В следующей серии опытов произведена оценка подвижности исходной
роящейся и нероящихся форм протея.
Бактериоскопия методом раздавленной и висячей капли показала, что
клетки как роящихся, так и нероящихся форм в той или иной степени обладали
подвижностью. Некоторые различия в подвижности между роящимися и
нестабильно нероящимися формами можно было обнаружить лишь в первые 7-10
минут с момента приготовления бактериальной суспензии. С истечением этого
срока времени трудно было установить какие-либо различия в подвижности
исходной
роящейся
неустойчивой
сравнительном изучении
нероящейся
подвижности
исходной
формами
протея.
роящейся
и
При
стабильно
93
нероящейся форм, клетки стабильно нероящейся формы обладали слабым
спиралевидным и волнообразным движением вокруг своей оси.
Наиболее показательное и достоверное различие в подвижности роящихся
и нероящихся форм протея были обнаружены при посеве культур методом укола
в полужидкий агар с последующей их инкубацией при 21-22°C. Так,
бактериальные клетки роящихся форм при посеве уколом в полужидкий агар
диффундировали в среду полностью в течение 10-12 часов, нестабильно
нероящиеся формы - в течение 12-14 часов, тогда как устойчивые формы только в
течение 30-34 часов. Статистическая обработка показала достоверность различий
в подвижности роящихся и стабильно нероящихся форм протея (Р<0,05). Coetzee
J.N. и соавт. [310] у изолированных форм протея обнаружили подвижность и
наличие жгутиков, тогда как Г.Н. Нестерова и др. считали нероящиеся формы
протея неподвижными и лишенными жгутиков [196].
На
основании
результатов
наших
исследований
и
данных
ряда
исследователей можно смело говорить о том, что у протея в природе встречаются
3 формы диссоциации: исходная роящаяся, нестабильно нероящаяся, стабильно
нероящаяся, отличающиеся друг от друга по морфологическим, культуральным
свойствам и ультраструктуре. Бактериальные клетки, находящиеся в нероящейся
форме, имеющие незначительное количество жгутиков и обладают в той или
иной степени подвижностью, в связи с чем они не могут быть отнесены к так
называемым неподвижным О-формам протея. Вероятно, феномен роения зависит
не только от наличия жгутиков, но и от других структурных элементов или
свойств бактериальной клетки протеев.
Микроскопическое исследование методом окраски по Граму препаратов
моно- и совместно культивируемых Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia
spp., Е.соli, Proteus spp. позволило нам на визуальном уровне выявить наличие
разницы в картинах между моно- и сокультивирумыми вариациями (рис
14,15,16).
94
Рисунок 14 - Монокультура Enterobacter spp.
(«Биолам»x900)
Рисунок 15 - Монокультура Serratia spp.
(«Биолам»x900)
Рисунок 16 - Сокультивируемые вариации
Enterobacter spp.+Serratia spp.
(«Биолам»x900)
95
Электоронно-микроскопическое исследование моно- и сокультивируемых
Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., Е.соli, Proteus spp., базировавшиеся
на форме, рисунке, макро- и микроструктуре бактериальных колоний,
свидетельствуют
о
переходе
представлений
от
одноклеточности
микроорганизмов к представлению о микробных колониях как целостных
«сверхорганизмах». В толще колоний, на электоронограммах отпечатков колоний
моно- и совместно культивируемых штаммов Enterobacter spp., Citrobacter spp.,
Serratia spp., Е.соli,
Е.соli, Proteus spp. обнаружено, что между клетками
существуют контакты различных типов: плотное слипание, контакты «конец в
конец», «бок в бок», «бок в конец». (Рис. 17,18)
Рисунок 17 - Плотное слипание
Рисунок 18 - Взаимодействие
пилей сокультивируемых вариаций
пилей сокультивируемых
вариаций (Jem 100 x25000)
вариаций(Jem 100 x28000)
В зоне плотного слипания границы наружных мембран клеточных стенок
трудно различимы. Через липидные слои их мембран видимо проходят
соприкасающиеся белковые структуры, получившие название «Байеровские
зоны»,
которые
были
значительно
больше
у
бульонных
совместно
96
культивируемых штамов Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., Е.соli,
Proteus spp., чем у монокультур. Вероятно за счет байеровских зон может
контактировать цитоплазма совместно культивируемых соприкасающихся клеток
Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., Е.соli, Proteus spp.. Известно, что в
байеровских зонах осуществляется транспорт веществ в бактериальную клетку и
из нее [6]. Большинство клеток, таким образом, контактируют с несколькими
другими клетками. Контакт второго типа, который существует внутри колоний
Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., Е.соli, Proteus spp.–внутри
плазматические мостики между клетками (рис.19), образованные наружной
мембраной клеточных стенок. Часть перемычек расположены по длине клеток,
другие располагаются с боку. На электронограмме видно, что они также
обеспечивают контакты между несколькими клетками, находящихся в различных
плоскостях и в колониях.
Рисунок 19 - Внутриплазматические мостики между клетками УПЭ.
(Jem 100x10000)
В настоящее время постепенная перемена микробиоциноза макроорганизма
–
переход
от
представлений
об
одноклеточности
представлению о микробных колониях, как целостных
микроорганизмов
к
“сверхорганизмах” –
находит свое отражение в нарастающем интересе к форме, рисунку, макро- и
микроструктуре бактериальных колоний, что особенно проявляется у бактерий
97
существующих в различных эпитопах человека в виде ассоциации с другими
представителями грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов.
Электоронно–микроскопические исследования “колоний” демонстрируют
способность к клеточной дифференцировке и многоклеточной организации. Эта
способность, возможно, имеется у бактерий в их природных местообитаниях, где
они
в
основном
существуют
в
виде
био-пленок,
цепочек,
матов,
и
“микроколоний” [142]. Многочисленные работы по колониальной организации
микроорганизмов свидетельствуют о морфологической и физиологической
гетерогенности входящих в ее состав клеток [6, 334].
Рисунок 20 - Воздухоносные микрополости при взаимодействии УПЭ.
(Jem 100 x22000)
Отмечено наличие в колониях системы воздухоносных микрополостей,
часто пересеченных “балками” из клеточных тяжей. Сложная система
микрополостей фактически превращает колонии в совокупность частично
изолированных друг от друга очагов сгущения (микроколоний). Микроколонии,
сформированные слизистым матриксом и разделенные открытыми (часто
заполняемыми водой) каналами, характерны так же для внутренней структуры
биопленок. Это своего рода аналог примитивной “церкуляторной системы”,
доставляющей питательные субстраты и убирающей продукты метаболизма. В
колониях бактерии имеются поры и каналы, а так же более специализированные
структуры (“газовые баллоны”), окруженные своеобразной “мембраной” и
содержащие внеклеточные гемопротеины (рис. 20). Предположительно, такие
98
структуры способствуют транспорту кислорода к клеткам в агрегатах, как аналог
дыхательной системы органов [163].
Таким
образом,
структурированность,
изолированные
состоящую
из
колонии
имеют
дифферинцированных
клеток
четкую
УПЭ,
контактирующих между собой и имеющих свои четко сформированные
“биокомуникации”.
Изучение морфологических и культуральных свойств, контакты между
клетками Enterobacter spp., Citrobacter spp.,Serratia spp., E.coli, Proteus spp. было
проведено совместно с сотрудниками кафедр
микробиологии, вирусологии и
иммунологии, факультетской хирургии с курсом колопроктологии ГБОУ ВПО
«Башкирский
государственный
медицинский
университет»
Министерства
здравоохранения Российской Федерации (Морфологические, ультраструктурные
и биологические особенности диссоциативных форм протея. / Р.С. Суфияров,
З.Г. Габидуллин,
М.В. Тимербулатов, Р.Р. Суфияров, А.А. Ахтариева,
Габидуллин Ю.З., Н.Н. Гибазов, В.М. Изикаев, Г.А. Идиатуллина, Р.Ф. Насырова
// Медицинский вестник Башкортостана-2010г., №6, т. 5, стр.108-111).
3.2. Факторы патогенности монокультур бактерий родов Enterobacter spp.,
Citrobacter spp., Serratia spp., E.coli, Proteus spp. и их сокультивируемых
вариаций: Enterobacter spp.+Citrobacter spp., Enterobacter spp.+Serratia spp.,
Citrobacter spp.+ Serratia spp., Enterobacter spp.+Е.coli, Citrobacter spp.+Е.coli,
Serratia spp.+Е.coli, Proteus spp.+Enterobacter spp., Proteus spp.+Citrobacter
spp., Proteus spp.+Serratia spp., Proteus spp.+Е.coli.
В соответствии с уровнем эволюционного развития различных видов и
родов условно-патогенных энтеробактерий, каждый представитель находится на
различных
этапах
взаимоотношений
и
характеризуется
различными
потенциалами патогенности. Под патогенностью принято понимать способность
микроорганизмов вызывать инфекционный процесс, который определяется
совокупным действием различных свойств и факторов, обуславливающих в
организме
патологические
изменения.
Последнее
свойство,
определяется
99
наличием факторов патогенности, особенно влияющих на сопротивляемость
макроорганизма. Для преодоления биологического барьера многие бактерии
приспособились продуцировать ряд продуктов жизнедеятельности, которые
способствуют их проникновению, выживанию и колонизации в тканях
макроорганизма хозяина [38].
3.2.1.Адгезивная активность
Взаимодействие микробных клеток с клетками хозяина осуществляется
благодаря их адгезивной способности, поскольку адгезивность является одним из
ведущих факторов, реализующих патогенность микроба на начальном этапе
развития инфекционного процесса. Известно, что рецепторы эпителиальных
клеток, принимающих участие в адгезии, аналогичны структурам, которые
определяют группу крови и поэтому метод гемагглютинации с использованием
эритроцитов различных видов птиц и животных широко используется для
предварительного выявления возможных адгезинов у бактерий [98].
Исходя
из
вышеизложенного,
мы
сочли
необходимым
провести
сравнительное изучение адгезивной активности на эритроцитах цыпленка 24
часовых бульонных монокультур Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp.,
Е.соli, Proteus spp , так и их совместно культивируемых вариаций: Enterobacter
spp.+Citrobacter spp. , Enterobacter spp.+Serratia spp., Citrobacter spp.+ Serratia spp.,
Enterobacter spp.+Е.coli, Citrobacter spp.+Е.coli, Serratia spp.+Е.coli, Proteus
spp.+Enterobacter spp., Proteus spp.+Citrobacter spp., Proteus spp.+Serratia spp.,
Proteus spp.+Е.coli. Изучение адгезивной активности проводили на предметном
стекле по методу Габидуллина З.Г. (автор. св-во № 1312098 от 22.01.87) с
использованием 3% суспензии эритроцитов цыпленка, содержащей 0,6 %
концентрации Д-маннозы
и без нее, что позволило выявить наличие у
монокультур и у сокультивируемых вариаций способность прикрепляться к
клеткам макроорганизма [95].
При постановке реакции гемагглютинации с эритроцитами цыпленка Д –
маннозочувствительную (MS) реакцию из 50 монокультур Enterobacter spp.
100
давали 24 (48%), а
Д – маннозорезистентную (MR) - 12 штаммов (24%).
Изучение адгезивной активности монокультур бактерий родов Citrobacter spp. и
Serratia spp. показало, что из 50 штаммов Citrobacter spp. и из 50 культур Serratia
spp. MS-реакцию гемагглютинации с эритроцитами цыпленка давали 25(50%)
штаммов Citrobacter spp. и 22(44%) штаммов Serratia spp., а MR-реакцию 10(20%)
и 11(22%) штаммов, соответственно. Из 50 монокультур Е.соli положительную
маннозочувствительную (MS) реакцию гемагглютинации давали 25(50%)
штаммов, а Д – маннозорезистентную (MR) - 12 (24%). При изучении адгезивной
активности 50 штаммов бактерий рода Proteus spp. было выявлено, что
положительную маннозочувствительную (MS) реакцию гемагглютинации давали
23(46%) штаммов, а Д – маннозорезистентную (MR) - 15 (30%).
В дальнейшем нами было проведено сравнительное изучение адгезивной
активности
вариаций
совместно
культивируемых
штаммов:
Enterobacter
spp.+Citrobacter spp. , Enterobacter spp.+Serratia spp., Citrobacter spp.+ Serratia spp.,
Enterobacter spp.+Е.coli, Citrobacter spp.+Е.coli, Serratia spp.+Е.coli, Proteus
spp.+Enterobacter spp., Proteus spp.+Citrobacter spp., Proteus spp.+Serratia spp.,
Proteus spp.+Е.coli. При этом было выявлено, что показатели MS-реакции
гемагглютинации с эритроцитами цыпленка были значительно выше чем у их
монокультур: в частности (E+C)-MS-80% (8 из 10 вариаций), (E+S)-MS-90% (9 из
10 вариаций), (C+S)- 90% вариаций (9 из 10), (E+Е.соli)-MS-70 % (7 из 10
вариаций), (C+Е.соli)-MS-60 % (6 из 10 вариаций), (S+Е.соli)-MS-70% (7 из 10
вариаций), Prot+Ent-MS-90% (9 из 10 вариаций), Prot+Citr-MS-90%(9 из 10
вариаций), Prot+Ser-90% вариаций (9 из 10), Prot+Е.coli-MS-80% (8 из 10
вариаций). И при изучении способности давать MR-реакцию гемагглютинации с
эритроцитами цыпленка сокультивируемых вариаций были получены данные –
(E+C)-MS-40% (4 из 10 вариаций), (E+S)-MS-40% (4 из 10 вариаций), (C+S)- 40%
вариаций (4 из 10), (E+Е.соli)-MS-60 % (6 из 10 вариаций), (C+Е.соli)-MS-50 % (5
из 10 вариаций), (S+Е.соli)-MS-60% (6 из 10 вариаций), Prot+Ent-MS-50% (5 из 10
вариаций), Prot+Citr-MS-50%(5 из 10 вариаций), Prot+Ser-40% вариаций (4 из 10),
Prot+Е.coli-MS-60% (6 из 10 вариаций), соответственно.
101
При электронно-микроскопическом исследовании обнаружено, что клетки
совместно культивируемых штаммов Enterobacter, Citrobacter, Serratia, Е.соli,
Proteus в большом количестве (более 15) плотно прилипают к эритроцитам
цыпленка (Рис.21.), тогда как количество прилипающих клеток у монокультур,
составляло не более 10 на единичный эритроцит (Рис.22).
Рисунок 21 - Совместно культивируемые штаммы УПЭ с высокой
адгезивной активностью.
Кроме того было выявлено, что клетки Enterobacter spp. дающие MRреакцию с эритроцитами цыпленка имели реснички длинной от 110 до 430 нм и
шириной 4,5-5,5 нм.; клетки Citrobacter spp. длинной от 110 до 420 нм. и шириной
5-5,4 нм.; клетки Serratia spp. реснички длиной от 100 до 380 нм. и шириной 34,3 нм.; и клетки Е.coli реснички длиной от 90 до 350 нм. и шириной 3-4,3 нм.;
клетки
Proteus
spp.,
способные
вызывать
реакцию
гемагглютинации
с
эритроцитами цепленка, по периметру так же имели реснички длиной от 125 до
583 нм и шириной 6-8,3 нм. Большинство бактериальных клеток исследуемых
УПЭ, не способных давать РГА, реснички не имели или имели их в небольшом
количестве.
102
Рисунок 22 - Электронная микроскопия (JEM-100В ув. 3000х)
Количество клеток, не дающих феномена гемагглютинации вокруг
эритроцитов птиц, составляет не более 3-5.
Проведенные
исследования
показали,
что
клетки
микрооганизмов,
способных вызывать реакции гемагглютинации с эритроцитами цепленка, по
периметру имели реснички (рис. 23(а)), тогда как большинство клеток, не
способных давать реакции гемагглютинации, не имели или имели их в
небольшом количестве (рис. 23(б)).
Рисунок 23 - а) Пили УПЭ и контакты между УПЭ
(JEM-100В ув. 20000х)
103
б) У клеток не адгезивных монокультур пили отсутствуют
(JEM-100В ув. 26000х).
Таким образом адгезия у бактерий Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia
spp., Е.coli, Proteus spp.,
наличия
фимбриальных
специфическое
представляет собой сложный процесс и зависит от
структур,
взаимодействие
с
помощью
бактериальной
которых
клетки
с
происходит
определенными
рецепторами клеток организма хозяина. Что касается адгезии совместно
культивируемых вариаций энтеробактерий, то возможно при этом происходит
взаимное индуцирование адгезивных свойств, что необходимо учитывать при
оценке этиологической значимости бактерий родов Enterobacter spp., Citrobacter
spp., Serratia spp., Е.coli, Proteus spp.
выделенных при ассоциированных
инфекционных процессах.
Исследования
сокультивируемых
по
изучению
адгезивной
условно–патогенных
актиности
энтеробактерий
монокультур
были
и
проведены
совместно с сотрудниками кафедр микробиологии, вирусологии и иммунологии,
факультетской хирургии с курсом колопроктологии ГБОУ ВПО «Башкирский
государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения
Российской Федерации (Морфологические, ультраструктурные и биологические
особенности диссоциативных форм протея. / Р.С. Суфияров, З.Г. Габидуллин,
М.В. Тимербулатов, Р.Р. Суфияров, А.А. Ахтариева, Габидуллин Ю.З., Н.Н.
104
Гибазов, В.М. Изикаев, Г.А. Идиатуллина, Р.Ф. Насырова // Медицинский
вестник Башкортостана-2010г., №6, т. 5, стр.108-111).
3.2.2. Гемолитическая активность
Колонизация поверхностей эпителия макроорганизма бактериальными
агентами, параллельно сопровождается секрецией веществ, относящихся к
факторам,
коррелирующих
с
патогенностью
условно-патогенных
энтеробактерий, среди которых наиболее часто обнаруживаются агрессины, часто
используемые
потенциальной
в
качестве
определенного
цитотоксичности,
показателя
выделенных
неоднообразной
и
условно-патогенных
представителей. К таким агрессинам можно отнести гемолизины [98].
Исходя из этого мы проводили сравнительное изучение α-гемолитической,
тиолзависимой и энтерогемолитической активности, как у монокультур бактерий
Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., Е.coli, Proteus spp. так и у их
совместно культивируемых вариаций: Enterobacter spp.+ Citrobacter spp. (Е+С),
Enterobacter spp.+ Serratia spp. (Е+S), Citrobacter spp. + Serratia spp. (C+S),
Enterobacter spp. + Е.coli (Ent+Е.coli), Citrobacter spp. + Е.coli (C+Е.coli), Serratia
spp. + Е.coli (S+Е.coli), Proteus spp.+Enterobacter spp. (Prot+Ent), Proteus
spp.+Citrobacter spp.(Prot+Citr), Proteus spp.+Serratia spp.(Prot+Ser), Proteus
spp.+Е.coli(Prot+Е.coli).
@-гемолитическую
активность
определяли
на
средах,
содержащих
эритроциты 0(І) человека [96]. Уровень гемолитической активности определяли
по количеству гемолизированных эритроцитов. При этом все штаммы условно
делили
на 4 группы:
в первую
группу относили
культуры
высокой
гемолитической активности, которые вызывали гемолиз от 70 до 100 %
эритроцитов I группы крови человека, во вторую – культуры средней активности,
которые вызывали гемолиз от 40 до 70 % эритроцитов, в третью – культуры
слабой гемолитической активности, которые вызывали от 2 до 40 % эритроцитов
105
и 4 группа – культуры не активные, которые не вызывали или вызывали гемолиз
не более 2 % эритроцитов.
Исследования α-гемолитической активности монокультур Enterobacter spp.,
Citrobacter spp., Serratia spp., Е.coli, Proteus spp. показали, что из 50 монокультур
Enterobacter spp. α-гемолитической активностью обладали 12(24%) штаммов,
среди которых высокую активность проявляли 4(33%), среднюю 3(25%), слабую
активности 5(41,6%)штаммов. Из 50 монокультур Citrobacter spp. 13(26%)
штаммов обладали α-гемолитической активностью, среди которых 4(30,7%)
проявляли высокую, 3(23,07%) среднюю и 6(46,1%) слабую активности. Из 50
культур Serratia spp. α-гемолитическую активность проявляли 10 штаммов (20%),
среди которых 4(40%) проявляли высокую, 5(50%) штаммов среднюю и 1(10%)
штамм слабую активности; из 50 штаммов Е.coli 13(26%) культур обладали αгемолитической активностью, среди которых 3(23,07%) проявляли высокую,
4(30,7%) среднюю и 6(46,1%) штаммов слабую активности; из 50 монокультур
Proteus spp. 10(20%) штаммов обладали α-гемолитической активностью, среди
которых 5(50%) штаммов обладали высокой, 4(40%)-средней и 1(10%) штамм
слабой α-гемолитической активностью, соответственно. Штаммы Enterobacter
spp., Citrobacter spp., Serratia spp., Е.coli, Proteus spp. изолированные от здоровых
людей, значительно реже проявляли α-гемолитическую активность (10%, 10%,
10%, 10%, 10%), соответственно.
В следующей
серии опытов нами
было проведено
изучение α-
гемолитической активности совместно культивируемых вариаций: Enterobacter
spp.+Citrobacter spp. (Е+С), Enterobacter spp.+Serratia spp. (Е+S), Citrobacter
spp.+Serratia
spp.(C+S),
Enterobacter
spp.+Е.coli(Ent+Е.coli),
Citrobacter
spp.+Е.coli(C+Е.coli), Serratia spp.+Е.coli(S+Е.coli), Proteus spp.+Enterobacter
spp.(Prot+Ent), Proteus spp.+Citrobacter spp.(Prot+Citr), Proteus spp.+Serratia
spp.(Prot+Ser), Proteus spp.+Е.coli(Prot+Е.coli). При этом частота встречаемости αгемолитической активности были значительно выше чем у их монокультур: в
частности вариации Enterobacter spp.+Citrobacter spp. - 60 % (6 из 10), среди
которых проявляли высокую 3(50%)вариации, среднюю 2(33,3%) и низкую
106
1(16,6%) вариация; из 10 вариаций Enterobacter spp.+Serratia spp. - 70 % (7 из 10)
обладали α-гемолитической активностью, среди которых проявляли высокую
2(28,5%)вариации, среднюю 3(42,8%) и низкую 2(28,5%) вариации; Enterobacter
spp.+Е.coli - 50% (5 из 10), из них высокоактивных было 2 вариации (40%),
среднеактивных 2 вариации (40%) и низкоактивных 1(20%) вариация; Citrobacter
spp.+Serratia spp. - 80% (8 из 10),
6 (75%) вариаций высокоактивных, 1
среднеактивная вариация и 1 низкоактивная вариация (12,5%), соответственно;
Citrobacter spp.+Е.coli – 60% (6 из10), среди которых высокоактивные 2 (33,3%)
вариации, среднеактивные 3(50%) и низкоактивная 1(16,6%) вариация; Serratia
spp.+Е.coli – 50% (5 из 10), из них высокоативная 1(20%) вариация,
среднеактивных 2(40%) и низкоактивные 2 вариации; из 10 вариации Proteus
spp.+Enterobacter spp. - 60 % (6 из 10) обладали α-гемолитической активностью,
среди которых проявляли высокую 3(50%) вариации, среднюю 1(16,6%) и
2(33,3%) вариации низкую α-гемолитическую активность; 70 % вариаций (7 из
10) Proteus spp.+Citrobacter spp. обладали α-гемолитической активностью, среди
которых проявляли высокую 3(42,8%) вариации, 2(28,5%) среднюю и 2(28,5%)
вариации низкую α-гемолитическую активность; из 10 вариаций Proteus
spp.+Serratia spp. 90 % вариаций (9 из 10) обладали α-гемолитической
активностью, среди которых проявляли высокую 2(22,2%) вариации, 6(66,6%)
среднюю и 1(11,1%) вариация проявляла низкую α-гемолитическую активность;
Proteus spp.+Е.coli - 80% (8 из 10), 1 вариация (12,5%) высокоактивных, 6 (75%)
среднеактивная вариация и 1 низкоактивная вариация (12,5%), соответственно.
При этом штаммы Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., Е.coli, Proteus
spp. при совместном культивировании значительно чаще проявляли высокую и
среднюю α-гемолитическую активности, чем их монокультуры (Р<0,05).
Таким образом, полученные результаты показывают, что штаммы
Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., Е.coli, Proteus spp. при совместном
культивировании чаще проявляют высокую и среднюю α-гемолитическую
активность чем их монокультуры, что по нашему мнению возможно связано с
взаимным индуцированием α-гемолитической активности энтеробактерий, что
107
необходимо учитывать при оценке этиологической значимости ассоциаций этих
микроорганизмов, выделенных при различных инфекциях.
Albesa J. et al. [290], Barbers L.J et al. [295] показали, что бактерии
кишечной группы синтезируют отличающийся от α-гемолизина тиолзависимый
гемолизин, который лизирует эритроциты в присутствии цистеина и в той или
иной степени обуславливает патогенный потенциал возбудителя.
Исходя
из
этого,
нами
была
сравнительно
изучена
способность
синтезировать тиолзависимый гемолизин на кровяном агаре с эритроцитами
кролика у монокультур Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., Е.coli,
Proteus spp. и у их совместно культивируемых вариаций: Enterobacter
spp.+Citrobacter spp. (Е+С), Enterobacter spp.+Serratia spp. (Е+S), Citrobacter
spp.+Serratia
spp.
(C+S),
Enterobacter
spp.+Е.coli
(Ent+Е.coli),
Citrobacter
spp.+Е.coli (C +Е.coli), Serratia spp.+Е.coli (S+Е.coli), Proteus spp.+Enterobacter spp.
(Prot+Ent),
Proteus
spp.+Citrobacter
spp.(Prot+Citr),
Proteus
spp.+Serratia
spp.(Prot+Ser), Proteus spp.+Е.coli(Prot+Е.coli).
Проведенные исследования показали, что из 50 штаммов монокультур
Enterobacter spp. 20(40%) штаммов проявляли способность синтезировать
тиолзависимый гемолизин, среди которых 5(25%) обладали высокой, 10(50%)средней и 5(25%)-слабой, тогда как среди культур изолированных от здоровых
людей только один штамм обладал средней тиолзависимой гемолитической
активностью. Из 50 монокультур Citrobacter spp. 25(50%) синтезировали
тиолзависимый
гемолизин,
среди
которых
9(36%)
проявляли
высокую
активность, 8(32%) среднюю, 8(32%) слабую активности. Тогда как из
монокультур изолированных от практически здоровых людей, одна культура
Citrobacter spp. проявляла высокую тиолзависимую гемолитическую активность.
Из 50 монокультур Serratia spp. тиолзависимой гемолитической активностью
обладали 16(32%) штаммов, среди которых 8(50%) обладали высокой, 4(25%)
средней и 4(25%) – слабой тиолзависимой гемолитической активностью. Из 10
культур Serratia spp., выделенных от здоровых людей 2(20%) штамма обладали
слабой тиолзависимой гемолитической активностью. Из 50 культур Е.coli
108
синтезировали тиолзависимый гемолизин 19(38%) штаммов, среди которых
5(26,3%) проявляли высокую активность, 13(68,4%) среднюю и 1(5,2%) штамм
слабую тиолзависимую гемолитическую активность. Из 10 штаммов Е.coli,
выделенных от здоровых людей, 2(20%) штамма обладали слабой тиолзависимой
гемолитической активностью. Из 50 культур Proteus spp. 25(50%) штаммов
синтезировали тиолзависимый гемолизин, среди которых 8(32%) штаммов
проявляли высокую, 9(36%) среднюю и 8(32%) штаммов проявляли
слабую
тиолгемолитическую активность, соответственно.
Тогда как при совместном культивировании штаммов: Enterobacter
spp.+Citrobacter spp.– 6(60%) вариаций
из 10 синтезировали тиолзависимый
гемолизин, среди которых 3(50%) вариации синтезировали тиолзависимый
гемолизин высокой, 2(40%) средней и 1(10%) слабой активности; Enterobacter
spp.+Serratia spp. – из 10 вариаций 7(70%) синтезировали тиолзависимый
гемолизин, среди которых проявляли высокую активность 2(28,5%) вариации,
3(42,8%)-среднюю, 2(28,5%) слабую активности; из 10 вариаций Enterobacter
spp.+ Е.coli 6(60%) проявляли тиолгемолитическую активность, из них
синтезировали тиолзависимый гемолизин высокой активности 3(50%) вариации,
средней - 2 вариации (40%) и 1(20%) слабой активности; вариации Citrobacter
spp.+Serratia spp. – 8(80%) синтезировали тиолзависимый гемолизин, среди
которых 4(50%)-высокой активности, 2(25%)-средней и 2(25%) вариации
синтезировали тиолзависимый гемолизин слабой активности; из 10 вариаций
Citrobacter spp.+Е.coli – 7(70%) вариации проявляли тиолгемолитическую
активность, из них синтезировали тиолзависимый гемолизин высокой активности
3(42,8%) вариации, средней - 3 вариации (42,8%) и 1(14,2%) вариация слабой
активности; вариации Serratia spp.+Е.coli - 6(60%) синтезировали тиолзависимый
гемолизин, среди которых 2(40%)-высокой активности, 3(50%)-средней и 1(10%)
вариация синтезировала тиолзависимый гемолизин слабой активности; из 10
вариации Proteus spp.+Enterobacter spp.-70 % (7 из 10) вариаций обладали
тиолгемолитической активностью, среди которых проявляли высокую 3(48,2%)
вариации,
среднюю
3(48,2%)
и
1(14,8%)
вариация
проявляла
низкую
109
тиолгемолитическую активность; 80% вариаций Proteus spp.+ Citrobacter spp. (8
из 10) обладали тиолгемолитической активностью,
среди которых 6 (75%)
вариаций были высокоактивными, 1(12,5%) среднеактивная вариация и 1
низкоактивная вариация (12,5%), соответственно; из 10 вариаций Proteus
spp.+Serratia spp. 90 % вариаций (9 из 10) обладали α-гемолитической
активностью, среди которых проявляли высокую 6(66,6%) 2(22,2%) вариации,
2(22,2%) среднюю и 1(11,1%) вариация проявляла низкую тиолгемолитическую
активность;
Proteus
spp.+Е.coli
80%
(8
из
10),
1
вариация
(12,5%)
высокоактивных, 6 (75%) среднеактивная вариация и 1 низкоактивная вариация
(12,5%), соответственно. При этом штаммы бактерий родов Enterobacter spp.,
Citrobacter spp., Serratia spp., Е.coli, Proteus spp. при совместном культивировании
значительно чаще проявляли высокую и среднюю тиолгемолитическую
активность, чем их монокультуры (Р<0,05).
Учитывая важную роль гемолизинов в патогенезе бактериальных инфекций
в последние годы многие исследователи отмечают особую роль гемолизинов,
обуславливающих
развитие
диарейных
инфекций
–
так
называемый
энтерогемолизин [31].
Как показали исследования, среди используемых Enterobacter spp.,
Citrobacter spp., Serratia spp., Е.coli, Proteus spp. энтерогемолитическая активность
выявлена только у культур изолированных при диарейных инфекциях, тогда как
штаммы выделенные от больных с гнойно-воспалительными, урологическими
заболеваниями, не проявляли энтерогемолитической активности.
Сравнительный анализ энтерогемолитической активности монокультур и
сокультивируемых штаммов изолированных при диарейных инфекциях, показал,
что 7 штаммов Enterobacter spp. и по 8 штаммов Citrobacter spp. и Serratia spp., 4
штамма Е.coli, 5 штаммов Proteus spp.
активностью. И
обладали энтерогемолитической
было установлено, что монокультуры Enterobacter spp.,
Citrobacter spp., Serratia spp., Е.coli, Proteus spp.
в 1,5 раза реже проявляли
высокую и в 2 раза чаще слабую энтерогемолитическую активность, чем
совместно культивируемые вариации вышеизложенных микроорганизмов.
110
Таким образом, результаты данного раздела исследований позволяют нам
сделать заключение, что бактерии Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp.,
Е.coli, Proteus spp. при совместном культивировании значительно чаще
проявляют высокую и среднюю α-, тиолзависимую, энтерогемолитическую
активности чем их монокультуры, что необходимо учитывать при оценке
этиологической значимости энтеробактерий, выделенных в виде ассоциаций.
Исследования по изучению α-, тиолзависимой и энтерогемолитической
активностей
монокультур
и
сокультивируемых
условно–патогенных
энтеробактерий были проведены совместно с сотрудниками Центральной
научной исследовательской лаборатории и кафедры микробиологии, вирусологии
и иммунологии ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский
университет»
Министерства
здравоохранения
Российской
Федерации
(Характеристика свойств монокультур и сокультивируемых вариаций условнопатогенных энтеробактерий / Ю.А.Медведев, Ю.З.Габидуллин, Р.С.Суфияров,
З.Г.Габидуллин, М.М. Туйгунов // Материалы V Ежегодного Всероссийского
Конгресса по инфекционным болезням. – Москва, 25-27 марта 2013г.).
3.2.3. ДНК-азная активность
Данные литературы показывают, что нуклеиновые кислоты являются
основным субстратом для действия ДНК-аз и РНК-аз, которые относятся к
факторам патогенности [350]. Известно, что отдельные представители семейства
Enterobacteriaceae, выделенные от больных с инфекционными процессами
различной
локализации
обладают
ДНК-азной
активностью
[6,9,51].
Литературные данные в отношении ДНК-азной активности ассоциированных
культур Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., Е.coli, Proteus spp. весьма
скудны и противоречивы.
Исходя из вышеизложенного, мы
сочли необходимым провести
сравнительное изучение ДНК–азной активности монокультур Enterobacter spp.,
Citrobacter spp., Serratia spp., Е.coli, Proteus spp. и их сокультивируемых вариаций:
111
Enterobacter spp.+Citrobacter spp.(Е+С), Enterobacter spp.+Serratia spp.(Е+S),
Citrobacter spp.+Serratia spp.(C+S), Enterobacter spp.+Е.coli(Ent+Е.coli), Citrobacter
spp.+Е.coli(C+Е.coli), Serratia spp.+Е.coli(S+Е.coli), Proteus spp.+Enterobacter
spp.(Prot+Ent), Proteus spp.+Citrobacter spp.(Prot+Citr), Proteus spp.+Serratia
spp.(Prot+Ser), Proteus spp.+Е.coli(Prot+Е.coli) по методу Jeffries C. D. et al.(350).
При этом культуры считались высокоактивными при наличии зоны просветления
вокруг колоний радиусом 5 – 8 мм (+++), средней активности – 3 – 5 мм (++),
слабоактивными – 1 – 3 мм (+) и не активными – менее 2 мм (-).
Исследования ДНК – азной активности монокультур Enterobacter spp.
показали, что из 50 монокультур Enterobacter spp. ДНК – азной активностью
обладали 18(36%) штаммов, среди которых высокую активность проявляли
8(44,4%), среднюю 8(44,4%) и слабую 2(11,2%) культур. Из 50 монокультур
Citrobacter spp. 19(38%) штаммов обладали ДНК – азной активностью, среди
которых 3(15,7%) штамма проявляли высокую ДНК – азную активность, 8(42,1%)
среднюю и 8(42,1%) слабую ДНК–азную активности. Из 50 культур Serratia spp.
ДНК – азную активность проявляли 17 штаммов (34%), среди которых 5(29,4%)
проявляли высокую, 6(35,2%) среднюю и 6(35,2%) слабую ДНК–азную
активности. Из 50 штаммов Е.coli ДНК–азную активность проявляли 15 штаммов
(30%), среди которых 7(46,6%) проявляли высокую, 7(46,6%) среднюю и 1(6,6%)
слабую ДНК–азную активности. Из 50 культур
Proteus spp. ДНК–азную
активность проявляли 16 штаммов (32%), среди которых 10(62,5%) проявляли
высокую, 3(18,7%) среднюю и 3(18,7%) слабую ДНК–азную активности.
В следующей серии опытов нами было проведено изучение ДНК– азной
активности
вариаций
совместно
культивируемых
штаммов:
Enterobacter
spp.+Citrobacter spp. (Е+С), Enterobacter spp.+Serratia spp. (Е+S), Citrobacter
spp.+Serratia spp.(C+S), Enterobacter spp.+Е.coli (Ent+Е.coli), Citrobacter spp.+Е.coli
(C+Е.coli), Serratia spp.+Е.coli (S+Е.coli), Proteus spp.+Enterobacter spp. (Prot+Ent),
Proteus spp.+Citrobacter spp.(Prot+Citr), Proteus spp.+Serratia spp.(Prot+Ser), Proteus
spp.+Е.coli (Prot+Е.coli). При этом частота встречаемости ДНК–азной активности
у сокультивируемых вариаций была значительно выше чем у их монокультур: в
112
частности из 10 вариаций Enterobacter spp.+Citrobacter spp. - 7(70%), из 10
вариаций Enterobacter spp.+Serratia spp. - 8(80%) вариаций, из 10 вариаций
Citrobacter spp.+Serratia - 9(90%), из 10 вариаций Enterobacter spp.+Е.coli-6(60%),
из 10 вариаций Citrobacter spp.+Е.coli 7 - (70%), из 10 вариаций Serratia spp.+Е.coli
- 7(70%) вариаций обладали ДНК-азной активностью; так же при исследовании
вариаций Proteus spp.+Enterobacter spp. - 7 (70%) обладали ДНК-азной
активностью; вариации Proteus spp.+Citrobacter spp.-8(80%) вариаций; Proteus
spp.+Serratia spp. - 9(90%) вариаций, Proteus spp.+Е.coli - 8(80%) вариаций
обладали ДНК-азной активностью.
Необходимо отметить, что штаммы Enterobacter spp., Citrobacter spp.,
Serratia spp., Е.coli, Proteus spp. при их совместном культивировании значительно
чаще обладали высокой и средней ДНК – азной активностью: в частности
Enterobacter spp.+Citrobacter spp. - из 7 вариаций обладали высокой 3(40%)
вариации, средней 3(40%) и слабой 1(20%) вариация обладали ДНК – азной
активностью; из 8 ДНК-аза положительных вариаций Enterobacter spp.+Serratia
spp. - 4 (50%) обладали высокой ДНК–азной активностью, 3(37,5%) средней и
слабой 1(12,5%) вариация; из 9(90%) ДНК-аза положительных вариаций
Citrobacter spp.+ Serratia - 4(44,4%) обладали высокой, 4(44,4%) средней и
1(11,1%) вариация обладала слабой ДНК–азной активностью; из 6-ти ДНК-аза
положительных вариаций Enterobacter spp.+Е.coli 4 вариации обладали высокой
(66,6%), 1 средней (16,6%) и 1 вариация (16,6%) слабой ДНК – азной
активностью; из 5(50%) ДНК-аза положительных вариаций Citrobacter spp.+Е.coli
3(60%) вариации обладала высокой, 1(20%) средней и 1(20%) слабой ДНК –
азной активностью; из 6(60%) ДНК-аза положительных вариаций Serratia spp.+
Е.coli обладали высокой активностью 1(30%) вариация, 1(30%) средней и 1(30%)
вариация обладала слабой ДНК – азной активностью; из 7 вариаций Proteus
spp.+Enterobacter spp. - обладали высокой 3(40%) вариации, средней 3(40%) и
слабой 1(20%) вариация обладали ДНК – азной активностью; из 8 ДНК-аза
положительных вариаций Proteus spp.+Citrobacter spp.- 5 (62,5%)вариаций
обладали высокой ДНК–азной активностью, 2(25%) вариации средней и 1(12,5%)
113
вариация слабой ДНК–азной активностью; из 9 ДНК-аза положительных
вариаций Proteus spp.+Serratia spp. - 6(66,6%) вариаций обладали высокой ДНК–
азной активностью, 2(22,2%) вариации средней и 1(11,1%) вариация слабой
ДНК–азной активностью; из 8 ДНК-аза положительных вариаций Proteus
spp.+Е.coli - 4 (50%) вариации обладали высокой ДНК–азной активностью,
3(37,5%) средней и 1(12,5%) вариация обладала слабой ДНК-азной активностью,
соответственно.
Таким образом, полученные результаты данного раздела исследований
показывают, что штаммы Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., Е.coli,
Proteus spp., при совместном культивировании чаще проявляют высокую и
среднюю ДНК – азную активность чем их монокультуры, что по нашему мнению
возможно
связано
сокультивируемых
этиологической
с
взаимной
штаммов,
значимости
индукцией
что
этих
ДНК
необходимо
–
азных
учитывать
микроорганизмов
свойств
при
выделенных
оценке
в
виде
ассоциаций, а также при проведении целенаправленной профилактики и лечении
ассоциированных
инфекционных
процессов,
вызванных
различными
представителями условно-патогенных энтеробактерий.
Исследования по изучению ДНК–азной активности монокультур и
сокультивируемых
условно–патогенных
энтеробактерий
были
проведены
совместно с сотрудниками кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии
ГБОУ
ВПО
«Башкирский
государственный
медицинский
университет»
Министерства здравоохранения Российской Федерации (Факторы патогенности
семейства Enterobacteriaceae, обеспечивающие выживание в организме хозяина. /
З.Г. Габидуллин,
Туйгунова,
Н.Х.
А.А. Ахтариева, М.М. Туйгунов, Р.С. Суфияров, В.Г.
Насибуллин,
Р.Р.
Суфияров,
Ю.З.
Габидуллин,
Г.А.
Идиатуллина, В.М. Изикаев // Мед. вестник Башкортостана - 2009г. т.4 №5 с.9498).
3.2.4. Лецитиназная активность
Лецитиназную активность условно-патогенных энтеробактерий, некоторые
исследователи
наряду с гемолитической и протеолитической активностями,
114
относят к факторам патогенности, которая может быть одним из важнейших
показателей вирулентности высеваемых клинических изолятов от больных с
инфекционными процессами различной локализации [133].
Исходя
из
вышеизложенного,
мы
сочли
необходимым
изучить
лецитиназную активность монокультур Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia
spp., Е.coli, Proteus spp. и их сокультивируемых вариаций: Enterobacter spp.+
Citrobacter spp. (Е+С), Enterobacter spp.+ Serratia spp. (Е+S), Citrobacter spp. +
Serratia spp.(C+S), Enterobacter spp. + Е.coli (Ent+Е.coli), Citrobacter spp.+Е.coli
(C+Е.coli), Serratia spp.+ Е.coli (S+Е.coli), Proteus spp.+Enterobacter spp.(Prot+Ent),
Proteus spp.+Citrobacter spp.(Prot+Citr), Proteus spp.+Serratia spp.(Prot+Ser), Proteus
spp.+Е.coli(Prot+Е.coli).
Изучение
лецитиназной
активности
монокультур
Enterobacter
spp.,
Citrobacter spp., Serratia spp., Е.coli, Proteus spp. и их совместно культивируемых
вариаций проводили на желточной среде Г.Н.Чистовича (1960)[106]. При этом
считали
высокоактивными
при
наличии
вокруг
колоний
моно-
и
сокультивируемых штаммов Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., Е.coli,
Proteus spp. радужного венчика диаметром 5-7 мм и отметили в виде (+++) –
высокая лецитиназная активность, средняя лецитиназная активность – 3-5 мм
(++), слабая лецитиназная активность – (+) и неактивные – при отсутствии
радужного венчика (-).
Исследование лецитиназной активности монокультур Enterobacter spp.,
Citrobacter spp., Serratia spp., Е.coli, Proteus spp. показали, что из 50 штаммов
Enterobacter spp. лецитиназной активностью обладали 11(22%) культур, среди
которых высокую активность проявляли 4(36,3%) штамма, 5(45,4%) среднюю и
2(18,1%) штамма слабую активность. Из 50 штаммов Citrobacter spp. 20(40%)
обладали лецитиназной активностью, среди которых высокой лецитиназной
активностью обладали 6(30%) штаммов, средней активностью 7(35%) и 7(35%)
слабой лецитиназной активностью. Из 50 культур Serratia spp. лецитиназную
активность проявляли 25(50%) штаммов, среди них высокоактивными были
9(36%), среднеактивными 10(40%) и слабоактивными 6(24%) штаммов. А из 50
115
штаммов Е.coli лецитиназной активностью обладали 19(38%) культур, среди
которых высокую активность проявляли 9(47,3%) штаммов, 5(26,3%) штаммов
среднюю и 5(26,3%) штаммов проявляли слабую лецитиназную активность.
Изучение лецитиназной активности монокультур Proteus spp. показали, что из 50
штаммов Proteus spp. лецитиназной активностью обладали 11(22%) культур,
среди которых высокую активность проявляли 5(45,4%) штаммов, 4(36,3%)
штамма проявляли среднюю лецитиназную активность
и 2(18,1%) штамма
проявляли слабую лецитиназную активность.
В последующем изучали изменение характера проявления лецитиназной
активности при совместным культивировании штаммов бактерий родов
Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., Е.coli, Proteus spp. вариаций:
Enterobacter spp.+ Citrobacter spp., Enterobacter spp.+ Serratia spp., Citrobacter
spp.+Serratia spp., Enterobacter spp. + Е.coli, Citrobacter spp.+Е.coli, Serratia
spp.+Е.coli, Proteus spp.+Enterobacter spp., Proteus spp.+Citrobacter spp., Proteus
spp.+Serratia spp., Proteus spp.+Е.coli.
При
этом частота
встречаемости
лецитиназной активности была значительно выше чем у их монокультур: в
частности
из
10
вариаций
Enterobacter
spp.+Citrobacter
spp.
обладали
лецитиназной активностью 7(70%) вариаций; из 10 вариаций Enterobacter
spp.+Serratia spp. 8(80%) вариаций; из 10 вариаций Citrobacter spp.+Serratia spp. 9(90%); из 10 вариаций Enterobacter spp.+Е.coli - 6(60%) вариации; из вариаций
Citrobacter spp.+Е.coli - 6(60%) вариаций обладали лецитиназной активностью; из
вариаций Serratia spp.+Е.coli - 7(70%) вариаций обладали лецитиназной
активностью; из 10 вариаций Proteus spp.+Enterobacter spp. - 7(70%) вариаций; из
10 вариаций Proteus spp.+Citrobacter spp. обладали лецитиназной активностью
8(80%) вариаций; 9 вариаций Proteus spp.+Serratia spp. из 10 расщепляли
лецитоветилазу; и 7 вариаций из 10 Proteus spp.+Е.coli обладали лецитиназной
активностью. И что характерно при совместном культивировании бактерии родов
Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., Е.coli, Proteus spp. значительно
чаще проявляли высокую и среднюю лецитиназную активности: так при
вариациях Enterobacter spp.+Citrobacter spp.- из 7 лецитоветилазоположительных
116
вариаций 4(57,1%) вариации обладали высокой лецитиназной активностью,
2(28,5%) вариации средей и 1(14,2%) слабой активностью; при вариациях
Enterobacter
spp.+Serratia
spp.-из
8
лецитиназоположительных
вариаций
5(62,5%)вариаций обладали высокой активностью, 2(25%) средней и 1(12,5%)
слабой активностью; из 10 вариаций Citrobacter spp.+Serratia 9 обладали
лецитиназной активностью – из 9 положительных вариаций обладающих
лецитиназной активностью проявляли высокую-5(55,5%), среднюю - 3(33,3%) и
1(11,1%)слабую степень активности; из 6(60%) лецитиназоположительных
вариаций Enterobacter spp.+Е.coli 2(33,3%) вариации проявляли высокую,
2(33,3%) - среднюю и
2 вариации (33,3%) проявляли слабую степень
лецитиназной активности; из 6(60%) лецитиназоположительных вариаций
Citrobacter spp.+Е.coli – 1(16,6%) вариация обладала высокой лецитиназной
активностью, 4(66,6%) вариации средней и 1(16,6%) слабой активностью; из
7(30%) лецитиназоположительных вариаций Serratia spp. + Е.coli 2(28,5%)
вариации обладали высокой активностью, 4(57,1%) средней и 1(14,2%) вариация
обладала
слабой
лецитиназной
активностью;
из
7(70%)
лецитиназоположительных вариаций Proteus spp.+Enterobacter spp. 2(28,5%)
вариации обладали высокой лецитиназной активностью, 4(57,1%) вариации
средей
и
1(14,2%)
слабой
лецитиназной
активностью;
из
8(80%)
лецитиназоположительных вариаций Proteus spp.+Citrobacter spp. 5(62,5%)
обладали высокой лецитиназной активностью, 1(12,5%) вариация средней и
2(25%)вариации слабой лецитиназной активностью;
из 10 вариаций Proteus
spp.+Serratia spp. 9(90%) расщепляли лецитоветилазу, среди которых 4(44,4%)
вариации обладали высокой активностью, 4(44,4%) средней и 1(11,1%) вариация
обладала слабой лецитиназной активностью; из 7(70%) вариаций Proteus
spp.+Е.coli обладающих лецитиназной активностью, 4(57,1%) обладали высокой,
2(28,5%) средней и 1(14,2%) слабой лецитиназной активностью, соответственно.
Таким образом, результаты проведенных исследований показывают, что
при совместном культивировании, штаммы бактерий Enterobacter spp., Citrobacter
spp., Serratia spp., Е.coli, Proteus spp. чаще проявляют высокую и среднюю
117
лецитиназную активность, чем изолированные в виде монокультур, что
необходимо
учитывать
при
профилактике,
диагностике
и
лечении
ассоциированных инфекционных процессов различной локализации.
Исследования по изучению лецитиназной активности монокультур и
сокультивируемых
условно–патогенных
энтеробактерий
были
проведены
совместно с сотрудниками кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии
ГБОУ
ВПО
Министерства
«Башкирский
государственный
здравоохранения
Российской
медицинский
Федерации
университет»
(Сравнительная
характеристика некоторых биологических свойств у бактерий Proteus и культур
Staphylococcus aureus, выделенных при гнойно-воспалительных заболеваниях у
больных, находящихся на стационарном лечении в онкологических отделениях и
республиканской клинической больнице Г.Г. Куватова г. Уфа. / З.Г.Габидуллин,
Н.Х.Насибуллин, Ю.З.Габидуллин, Р.С.Суфияров, Р.Р. Суфияров // Медицинский
вестник Башкортостана - 2008. №4. стр. 25-28).
3.3. Характеристика персистентных свойств монокультур Enterobacter spp.,
Citrobacter spp., Serratia spp., Е.coli, Proteus spp. и их сокультивируемых
вариаций
Инфекции, вызванные ассоциациями условно-патогенных энтеробактерий
отличаются тем, что выделение микроорганизма из клинического материала
подразумевает необходимость дальнейшего изучения биологических свойств
культур с целью оценки их потенциальной патогенности.
Предметом исследования явилось обнаружение и их сравнительный анализ
свойств,
наличие
которых
коррелирует
с
патогенностью
моно-
и
ассоциированных культур бактерий на различных этапах их взаимодействия с
восприимчивым макроорганизмом и способностью противостоять факторам
резистентности организма хозяина (персистенция) [58,63].
Литературные данные свидетельствуют, что применительно к условнопатогенным энтеробактериям и их ассоциированным культурам, являющимся
118
представителями пато- и
свойствами,
нормофлоры организма человека, ключевыми
позволяющими
инактивировать
факторы
естественной
противоинфекционной защиты макроорганизма, могут быть их антилизоцимная,
антиинтерфероновая и антикомплиментарная активности [73].
3.3.1. Антилизоцимная активность
Для сохранения от бактерицидных факторов сыворотки или фагоцитов
микробная
клетка
располагает
средствами
дистанционного
действия,
направленных на инактивацию определенных механизмов иммунного ответа
организма. Среди специализированных и наиболее изученных у множества
представителей микроорганизмов школой академика Бухарина О.В. в этом
отношении
является
антилизоцимный
фактор,
который
направлен
на
инактивацию тканевого лизоцима и лизоцима фагоцитов, обеспечивающий
выживание
возбудителя
в
макрофаге
[56].
Кроме
того
выделяют
антиинтерцидные и антикомплементарные факторы микроорганизмов, которые
соответственно обладают инактивирующей активностью против катионных
белков лейкоцитов и комплемента организма хозяина [76].
Исходя из этого, мы сочли необходимым провести сравнительное изучение
фенотипического признака инактивации лизоцима у монокультур Enterobacter
spp., Citrobacter spp., Serratia spp., Е.coli, Proteus spp. и у их сокультивируемых
вариаций: Enterobacter spp.+Citrobacter spp. (Е+С), Enterobacter spp.+Serratia
spp.(Е+S), Citrobacter spp.+Serratia spp.(C+S), Enterobacter spp.+Е.coli (Ent+Е.coli),
Citrobacter
spp.+Е.coli
(C+Е.coli),
Serratia
spp.+Е.coli
(S+Е.coli),
Proteus
spp.+Enterobacter spp.(Prot+Ent), Proteus spp.+Citrobacter spp.(Prot+Citr), Proteus
spp.+Serratia
spp.(Prot+Ser),
Proteus
spp.+Е.coli(Prot+Е.coli).
Изучение
антилизоцимной активности (АЛА) проводили по методу О.В. Бухарина (62).
При этом культуры считали высокоактивными при нейтрализации лизоцима в
концентрации более 10 мкг/мл, среднеактивными от 5 до 10 мкг/мл и
слабоактивными до 5 мкг/мл.
119
Проведенные исследования показали, что из 50 монокультур Enterobacter
spp. 30(60%) штаммов инактивировали лизоцим, из которых 10(33,3%)
инактивировали лизоцим в концентрации до 5 мкг/мл, 8(26,6%) в концентрации
5-10 мкг/мл и 12(40%) в концентрации выше 10 мкг/мл; из 50 монокультур
Citrobacter spp. - 25(50%) штаммов инактивировали лизоцим, из которых 12(48%)
инактивировали лизоцим в концентрации до 5 мкг/мл, 10(40%) в концентрации 510 мкг/мл и 3(12%) в концентрации более 10 мкг/мл; из 50 штаммов Serratia spp.
26(52%)
штаммов
инактивировали
лизоцим,
из
которых
10(38,4%)
инактивировали лизоцим в концентрации до 5 мкг/мл, 11(42,3%) в концентрации
5-10 мкг/мл и 5(19,2%) в концентрации выше 10 мкг/мл; из 50 монокультур Е.coli.
23(46%)
штаммов
инактивировали
лизоцим,
из
которых
15(65,2%)
инактивировали лизоцим в концентрации до 5 мкг/мл, 5(21,7%) в концентрации
5-10 мкг/мл и 3(13,04%) в концентрации выше 10 мкг/мл; из 50 штаммов Proteus
spp. 25(50%) штаммов инактивировали лизоцим, из которых 10(40%) штаммов
инактивировали лизоцим в концентрации до 5 мкг/мл, 12(48%) в концентрации 510 мкг/мл и 3(12%) в концентрации более 10 мкг/мл, соответственно.
В
следующей
серии
опытов
нами
было
проведено
изучение
антилизоцимной активности при совместном культивировании этих культур в
вариациях: Enterobacter spp.+Citrobacter spp. (Е+С), Enterobacter spp.+ Serratia
spp.(Е+S), Citrobacter spp. + Serratia spp.(C+S), Enterobacter spp. + Е.coli
(Ent+Е.coli), Citrobacter spp.+Е.coli (C+Е.coli), Serratia spp.+ Е.coli (S+Е.coli),
Proteus spp.+Enterobacter spp.(Prot+Ent), Proteus spp.+Citrobacter spp.(Prot+Citr),
Proteus spp.+Serratia spp.(Prot+Ser), Proteus spp.+Е.coli(Prot+Е.coli). Проведенные
исследования показали, что из 10 вариаций совместно культивируемых штаммов
Enterobacter spp.+Citrobacter spp. 8(80%) вариаций обладали способностью
инактивировать лизоцим, из которых 1(12,5%) вариация в концентрации до 5
мкг/мл, 1(12,5%) вариация в концентрации 5-10 мкг/мл и 6(75%) вариаций в
концентрации выше 10 мкг/мл; из 10 вариаций Enterobacter spp.+Serratia spp. 9(90%) вариаций инактивировали лизоцим, из которых 1(11,1%) вариация в
концентрации до 5 мкг/мл, 2(22,2%) в концентрации 5-10 мкг/мл и 6(66,6%) в
120
концентрации выше 10 мкг/мл; из 10 вариаций Citrobacter spp.+Serratia spp.
7(70%)
инактивировали лизоцим, из которых 1(14,2%) в концентрации до 5
мкг/мл, 3(48,2%) вариации в концентрации 5-10 мкг/мл, 6(60%) вариаций
инактивировали лизоцим в концентрации выше 10 мкг/мл; из 10 вариаций
Enterobacter
spp.+Е.coli
–
7(70%)
вариаций
обладали
способностью
инактивировать лизоцим, из которых 1(14,2%) вариация в концентрации до 5
мкг/мл, 4(57,1%) вариации в концентрации 5-10 мкг/мл и 2(21,5%) вариации в
концентрации выше 10 мкг/мл; из 10 вариаций Citrobacter spp.+ Е.coli 7(70%)
вариаций обладали способностью инактивировать лизоцим, из них 1(14,2%)
вариация инактивировала лизоцим в концентрации до 5 мкг/мл, 4(57,1%)
вариации в концентрации 5-10 мкг/мл и 2(28,5%) вариация в концентрации выше
10 мкг/мл; из 10 вариаций Serratia spp.+Е.coli 7(70%) вариаций обладали
способностью инактивировать лизоцим, из которых 2(28,5%) в концентрации до
5 мкг/мл, 4(57,1%) вариации в концентрации 5-10 мкг/мл и 1(14,2%) вариация в
концентрации выше 10 мкг/мл; из 10 вариаций Proteus spp.+Enterobacter spp.
8(80%) вариаций обладали способностью инактивировать лизоцим, из которых
2(25%) вариации инактивировали лизоцим в концентрации до 5 мкг/мл, 2(25%)
вариации в концентрации 5-10 мкг/мл и 4(50%) вариации инактивировали
лизоцим в концентрации выше 10 мкг/мл; из вариаций Proteus spp.+Citrobacter
spp. 8(80%) вариаций обладали способностью инактивировать лизоцим, из
которых 2(25%) вариации инактивировали лизоцим в концентрации 5-10 мкг/мл и
6(75%) вариаций в концентрации выше 10 мкг/мл; из вариаций Proteus
spp.+Serratia spp. 8(80%) инактивировали лизоцим, из которых 4(50%) вариации
в концентрации 5-10 мкг/мл, 4(50%) вариаций инактивировали лизоцим в
концентрации выше 10 мкг/мл; и из 10 вариаций Proteus spp.+Е.coli 7 вариаций
были способны инактивировать лизоцим, среди которых 1(14,2%) вариация в
концентрации до 5 мкг/мл, 2(21,5%) вариации в концентрации 5-10 мкг/мл и
4(57,1%)вариации в концентрации выше 10 мкг/мл, соответсвенно.
Таким образом, результаты данного раздела проведенных исследований
показывают, что совместно культивируемые штаммы в вариациях: Enterobacter
121
spp.+Citrobacter spp., Enterobacter spp.+Serratia spp., Citrobacter spp.+Serratia spp.,
Enterobacter spp.+Е.coli, Citrobacter spp.+Е.coli , Serratia spp.+Е.coli, Proteus
spp.+Enterobacter spp., Proteus spp.+Citrobacter spp., Proteus spp.+Serratia spp.,
Proteus spp.+Е.coli, чаще обладалют высокими и средними значениями
антилизоцимной активности, чем их монокультуры, что необходимо учитывать
при оценке этиологической значимости и персистентного потенциала бактерий
Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., Е.coli, Proteus spp., выделенных
при ассоциированных гнойно-воспалительных процессах различной локализации.
Исследования по изучению антилизоцимной активности монокультур и
сокультивируемых
условно–патогенных
энтеробактерий
были
проведены
совместно с сотрудниками кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии
ГБОУ
ВПО
«Башкирский
государственный
медицинский
университет»
Министерства здравоохранения Российской Федерации и Института клеточного и
внутриклеточного симбиоза УрО РАН (Изменение биопленкообразования и
антилизоцимной активности Citrobacter freundii под действием метаболитов
кишечной микробиоты / Н.Б. Перунова, В.Г. Туйгунова, Е.В. Иванова, Ю.З.
Габидуллин
//
Научно-практический
журнал
«Медицинский
вестник
Башкортостана, 2013. Т.8., - №4. – С. 61 – 64).
3.3.2. Антиинтерфероновая активность
В секретируемом начале, обеспечивающим персистирование микробной
клетки в макроорганизме, следует отнести и «антиинтерцидный» (АИА) признак,
характеризующий
способность
бактерий
инактивировать
лейкоцитарный
катионный белок [63].
Будучи важнейшим фактором неспецифической резистентности организма
человека система интерферона является барьером, с которыми сталкиваются
агенты бактериальной и вирусной природы. Преодоление этого барьера
возможно только лишь при условии проявления возбудителем устойчивости к
летальному действию интерферона [248].
122
В связи с этим мы сочли необходимым провести сравнительное изучение
антиинтерфероновой активности монокультур Enterobacter spp., Citrobacter spp.,
Serratia spp., Е.coli, Proteus spp. и их сокультивируемых вариаций: Enterobacter
spp.+Citrobacter spp.(Е+С), Enterobacter spp.+Serratia spp.(Е+S), Citrobacter
spp.+Serratia spp.(C+S), Enterobacter spp.+Е.coli (Ent+Е.coli), Citrobacter spp.+Е.coli
(C+Е.coli), Serratia spp.+Е.coli (S+Е.coli), Proteus spp.+Enterobacter spp.(Prot+Ent),
Proteus spp.+Citrobacter spp.(Prot+Citr), Proteus spp.+Serratia spp.(Prot+Ser), Proteus
spp.+Е.coli(Prot+Е.coli), что возможно поможет нам более полно вместе с
другими факторами патогенности оценить этиологическую значимость моно- и
ассоциированных культур этих микроорганизмов.
Изучение антиинтерфероновой (АИА) активности проводили по методу
О.В. Бухарина и В.Ю. Соколова (65) с учетом антибактериального действия
препарата
человеческого
исследуемых
культур
лейкоцитарного
считали
интерферона.
При
высокой при инактивации
этом
АИА
человеческого
лейкоцитарного интерферона в концентрации более 10 ед/мл, средней от 5-10
ед/мл и низкой – менее 5 ед/мл.
Изучение АИА в различных концентрациях лейкоцитарного интерферона
показало, что из 50 монокультур Enterobacter spp. антиинтерфероновой
активностью
обладали
инактивировали
29(58%)
интерферон
в
штаммов,
среди
концентрации
до
5
которых
10(34,4%)
ед/мл,
12(41,3%)
инактивировали интерферон в концентрации до 10 ед/мл и 8(27,5%) в
концентрации выше 10 ед/мл; из 50 монокультур Citrobacter spp. АИА обладали
26(52%) штаммов, среди которых 10(40%) инактивировали интерферон в
концентрации до 5 ед/мл, 8(31,4%) в концентрации от 5-10 ед/мл и 7(28,5%) в
концентрации
выше
10
ед/мл;
из
50
монокультур
Serratia
spp.
антиинтерфероновой активностью обладали 25(50%) штаммов, среди которых
10(40%) инактивировали интерферон в концентрации до 5 ед/мл, 10(40%)
инактивировали в концентрации от 5-10 ед/мл и 5(20%) в концентрации выше 10
ед/мл. А из 50 культур Е.coli 22(44%) штаммов обладали антиинтерфероновой
активностью, среди которых 7(31,8%) штаммов инактивировали интерферон в
123
концентрации до 5 ед/мл, 13(59%) штаммов в концентрации до 10 ед/мл и 2(9%)
штаммов инактивировали интерферон в концентрации выше 10 ед/мл. Из
изучаемых 50 монокультур Proteus spp. антиинтерфероновой активностью
обладали 29(58%) штаммов, среди которых 8(27,5%) штаммов инактивировали
интерферон в концентрации до 5 ед/мл, 12(41,3%) в концентрации до 10 ед/мл и
10(34,4%) штаммов в концентрации выше 10 ед/мл. Среди штаммов Enterobacter
spp., Citrobacter spp., Serratia spp., Е.coli, Proteus spp. выделенных от здоровых
людей по 1 культуре каждого рода обладали слабой антиинтерфероновой
активностью и инактивировали интерферон в концентрации до 5 ед/мл,
соответственно.
В
следующей
антиинтерфероновой
серии
опытов
активности
нами
совместно
было
проведено
культивируемых
изучение
вариаций:
Enterobacter spp.+Citrobacter spp., Enterobacter spp.+Serratia spp., Citrobacter
spp.+Serratia spp., Enterobacter spp.+Е.coli, Citrobacter spp.+Е.coli, Serratia
spp.+Е.coli, Proteus spp.+Enterobacter spp., Proteus spp.+Citrobacter spp., Proteus
spp.+Serratia spp., Proteus spp.+Е.coli. Результаты исследований показали, что из
10 вариаций совместно культивируемых штаммов Enterobacter spp.+Citrobacter
spp. 8(80%) вариаций оказались способными инактивировать интерферон, среди
которых 1(12,5%) вариация инактивировала интерферон в концентрации до 5
ед/мл, 1(12,5%) от 5-10 ед/мл и 6(75%) вариаций инактивировали интерферон в
концентрации выше 10 ед/мл; из 10 вариаций Enterobacter spp.+Serratia spp.
9(90%) вариаций инактивировали интерферон, среди которых 1(11,1%) вариация
инактивировала интерферон до 5 ед/мл, 2(22,2%) от 5-10 ед/мл и 6(66,6%)
вариаций инактивировали интерферон в концентрации выше 10 ед/мл; из 10
вариаций Citrobacter spp.+Serratia spp. 9(90%) инактивировали интерферон, среди
которых 1(11,1%) вариация инактивировала интерферон в концентрации до 5
ед/мл, 2(22,2%) от 5-10 ед/мл и 6(66,6%) вариаций инактивировали интерферон в
концентрации выше 10 ед/мл; из 10 вариаций Enterobacter spp.+Е.coli 8(80%)
вариаций обладали способностью инактивировать интерферон, из которых
2(25%) вариация в концентрации до 5 ед/мл, 4(50%) вариации в концентрации 5-
124
10 ед/мл и 2(25%) вариации в концентрации выше 10 ед/мл; из 10 вариаций
Citrobacter spp.+Е.coli 9(90%) вариаций обладали способностью инактивировать
интерферон,
из
них
2(22,2%)
вариация
инактивировала
интерферон
в
концентрации до 5 ед/мл, 5(55,5%) в концентрации от 5-10 ед/мл и 2(22,2%)
вариации инактивировали интерферон в концентрации выше 10 ед/мл; из 10
вариаций
Serratia
spp.+Е.coli
7(70%)
вариаций
обладали
способностью
инактивировать интерферон, из которых 1(14,2%) вариация в концентрации до 5
ед/мл мкг/мл, 2(28,5%) вариации в концентрации 5-10 ед/мл и 4(57,1%) вариации
в концентрации выше 10 ед/мл; из вариаций Proteus spp.+Enterobacter spp. 7(70%)
вариаций обладали способностью инактивировать интерферон, из которых
1(14,2%) вариация инактивировала интерферон в концентрации до 5 ед/мл,
1(14,2%) вариация в концентрации 5-10 ед/мл и 5(71,4%) вариаций в
концентрации выше 10 ед/мл; среди вариаций Proteus spp.+Citrobacter spp. 8(80%)
оказались способными инактивировать интерферон, среди которых 1(12,5%)
вариация инактивировала интерферон
в концентрации до 5 ед/мл, 1(12,5%)
инактивировала интерферон от 5-10 ед/мл и 6(75%) вариаций инактивировали
интерферон в концентрации выше 10 ед/мл; из 10 вариаций Proteus spp.+Serratia
spp. 8(80%) вариаций были способными инактивировать интерферон в различных
концентрациях, из которых 2(25%) вариация инактивировала интерферон в
концентрации до 5 ед/мл, 4(50%) вариация в концентрации 5-10 ед/мл и 2(25%)
вариаций в концентрации выше 10 ед/мл; из 10 сокультивируемых вариаций
Proteus spp.+Е.coli 7 (70%) вариаций были способными инактивировать
интерферон в различных концентрациях, среди которых 1(14,2%) вариация
инактивировала интерферон в концентрации до 5 ед/мл, 1(14,2%) вариация в
концентрации 5-10 ед/мл и 5(71,4%) вариаций инактивировали интерферон в
концентрации выше 10 ед/мл.
Таким образом, опыты по сравнительному изучению антиинтерфероновой
активности монокультур Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., Е.coli,
Proteus spp. и их совместно культивируемых вариаций показали, что
вышеизложенные
микроорганизмы,
при
совместном
культивировании
125
значительно чаще проявляют высокую и среднюю антиинтерфероновую
активность, чем их монокультуры (Р<0,05), что необходимо учитывать при
оценке этиологической роли и значимости ассоциаций условно-патогенных
энтеробактерий, изолированных от больных страдающих инфекционными
заболеваниями, что в последующем поможет провести целенаправленную
диагностику, профилактику и лечение ассоциированных инфекций, вызванных
этими бактериями.
Исследования по изучению антиинтерфероновой активности монокультур
и сокультивируемых условно–патогенных энтеробактерий были проведены
совместно с сотрудниками кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии
ГБОУ
ВПО
«Башкирский
государственный
медицинский
университет»
Министерства здравоохранения Российской Федерации (Характеристика свойств
определяющих персистенцию моно- и ассоциативных культур
условно-
патогенных энтеробактерий / Ю.З.Габидуллин, А.А.Ахтариева, М.М.Алсынбаев,
Э.Ф.Мамбетова, М.М.Туйгунов, Д.Т Гашимова., Ф.С.Билалов, Н.Н.Гибазов,
Р.М.Ахмадеев, А.К. Булгаков // Журнал микробиологии, эпидемиологии и
иммунобиологии. - 2006г.№4 стр. 62-64).
3.3.3. Антикомплементарная активность
Антикомплементарный признак обеспечивает персистирование микробной
клетки
и
характеризует
способность
инактивировать
комплемент.
Антикомплементарная активность выявлена у многих условно-патогенных
энтеробактерий
[72],
антикомплиментарной
однако
в
активности
доступной
нам
литературе
ассоциированных
культур
данные
об
условно-
патогенных энтеробактерий весьма скудны и противоречивы.
Исходя из этого мы сочли необходимым провести сравнительное изучение
антикомплементарной активности монокультур Enterobacter spp., Citrobacter spp.,
Serratia spp., Е.coli, Proteus spp. и их сокультивируемых вариаций: Enterobacter
spp.+Citrobacter spp.(Е+С), Enterobacter spp.+Serratia spp.(Е+S), Citrobacter
spp.+Serratia spp.(C+S), Enterobacter spp.+Е.coli (Ent+Е.coli), Citrobacter spp.+Е.coli
(C+Е.coli), Serratia spp.+Е.coli (S+Е.coli), Proteus spp.+Enterobacter spp.(Prot+Ent),
126
Proteus spp.+Citrobacter spp.(Prot+Citr), Proteus spp.+Serratia spp.(Prot+Ser), Proteus
spp.+Е.coli(Prot+Е.coli).
Изучение антикомплементарной активности (АКА) проводили по методу
О.В. Бухарина и соавт. (59). При этом культуры считали высокоактивными при
инактивации комплемента в концентрации 15СН50/мл и более, среднеактивными
– от 5 до 15СН50/мл и слабоактивными от 1 до 5СН50/мл.
Исследования антикомплементарной активности монокультур Enterobacter
spp., показали что из 50 культур Enterobacter spp. антикомплементарной
активностью обладали 26(52%) культур, среди которых 12(46,1%) штаммов
инактивировали комплемент в концентрациях до 5СН50/мл, 10(38,4%) штаммов в
концентрациях 5-15СН50/мл, 4(15,3%) в концентрации более 15СН50/мл; из 50
монокультур Citrobacter spp. - 24(48%) штаммов инактивировали комплемент,
среди
которых
11(45,8%)
в
концентрации
до
5СН50/мл,
10(41,6%)
в
концентрациях 5-15СН50/мл, 3(12,5%) в концентрации более 15СН50/мл; из 50
штаммов Serratia spp. 25(50%) штаммов инактивировали комплемент, из которых
10(40%) в концентрации до 5СН50/мл, 10(40%) в концентрации от 5 до 15СН50/мл,
5(20%) в концентрации более 15СН50/мл. А из 50 монокультур Е.coli 15(30%)
штаммов инактивировали комплемент, из которых 7(46,6%) в концентрации до
5СН50/мл, 7(46,6%) штаммов в концентрации от 5 до 15СН50/мл и 1(16,6%) в
концентрации более 15СН50/мл; из 50 исследуемых штаммов Proteus spp. 24(48%)
штамма инактивировали комплемент, среди которых 10(41,6%) культур в
концентрации до 5СН50/мл, 11(45,8%) в концентрациях 5-15СН50/мл и 3(12,5%)
штамма Proteus spp. в концентрации более 15СН50/мл. Среди культур
изолированных от здоровых людей по 1 штамму Enterobacter spp. и
Е.coli
проявляли слабую АКА и по 2 штамма Citrobacter spp., Serratia spp., Proteus spp.
проявляли среднюю антикомплементарную активности.
В
следующей
серии
опытов
нами
было
проведено
изучение
антикомплементарной активности у совместно культивируемых вариаций:
Enterobacter spp.+Citrobacter spp.(Е+С), Enterobacter spp.+Serratia spp.(Е+S),
Citrobacter spp.+Serratia spp.(C+S), Enterobacter spp.+Е.coli(Ent+Е.coli), Citrobacter
127
spp.+Е.coli(C +Е.coli), Serratia spp.+Е.coli(S+Е.coli), Proteus spp.+Enterobacter
spp.(Prot+Ent), Proteus spp.+Citrobacter spp.(Prot+Citr), Proteus spp.+Serratia
spp.(Prot+Ser), Proteus spp.+Е.coli(Prot+Е.coli).
Проведенные исследования показали, что из 10 вариаций Enterobacter
spp.+Citrobacter spp. 7(70%) оказались способными инактивировать комплемент,
среди которых 1(14,2%) вариация инактивировала комплемент в концентрации до
5СН50/мл, 2(28,5%) вариации в концентрациях от 5-15СН50/мл и 4(57,1%)
вариации в концентрации выше 15СН50/мл; из 10 вариаций Enterobacter
spp.+Serratia spp. - 8(80%) (Р<0,001) вариаций инактивировали комплемент, из
которых 4(50%) вариации инактивировали комплемент в концентрации до
5СН50/мл, 1(12,5%) вариация в концентрации от 5-15СН50/мл и 3(37,5%) вариации
в концентрации более 15СН50/мл; из 10 вариаций Citrobacter spp.+Serratia spp.
9(90%)
инактивировали
инактивировала
комплемент,
комплемент
в
из
которых
концентрации
до
1(11,1%)
вариация
5СН50/мл,
2(22,2%)
инактивировали комплемент в концентрации от 5 до 15СН 50/мл и 6(66,6%)
вариаций в концентрации более 15СН50/мл; из 10 вариаций Enterobacter
spp.+Е.coli 6(60%) оказались способными инактивировать комплемент, из
которых 1(16,6%) вариация в концентрации до 5СН50/мл, 1(16,6%) – в
концентрациях от 5-15СН50/мл и 4(66,6%) вариации инактивировали комплемент
в концентрации выше 15СН50/мл; 6(60%) из 10 вариаций Citrobacter spp.+Е.coli
оказались способными инактивировать комплемент, среди которых 2(33,3%)
инактивировали
комплемент
в
концентрации
до
5СН50/мл,
2(33,3%)
в
концентрациях от 5-15СН50/мл, 2(33,3%) в концентрации выше 15СН50/мл; из 10
сокультивируемых вариаций Serratia spp.+Е.coli 6(60%) вариаций оказались
способными
инактивировать
инактивировали
комплемент
комплемент,
в
концентрации
среди
до
которых
5СН50/мл,
2(33,3%)
2(33,3%)
в
концентрациях от 5-15СН50/мл, 2(33,3%) вариаций инактивировали комплемент в
концентрации выше 15СН50/мл; из 10 вариаций Proteus spp.+Enterobacter spp. 8(80%) вариаций инактивировали комплемент, из которых 1(12,5%) вариация
инактивировала комплемент в концентрации до 5СН50/мл, 3(37,5%) вариации в
128
концентрации от 5-15СН50/мл и 4(50%)вариации в концентрации более
15СН50/мл; из вариаций Proteus spp.+Citrobacter spp.– 9(90%) вариаций
инактивировали комплемент, из которых 2(22,2%) вариации инактивировала
комплемент в концентрации до 5СН50/мл, 1(11,1%) вариация инактивировала
комплемент в концентрации от 5 до 15СН50/мл и 6(66,6%) вариаций в
концентрации более 15СН50/мл; из 10 вариаций Proteus spp.+Serratia spp. 8(80%)
вариаций
были
способны
инактивировать
комплемент
в
различных
концентрациях, среди которых 2(25%) вариации инактивировала комплемент в
концентрации до 5СН50/мл, 4(50%) вариации в концентрации от 5-15СН50/мл и
2(50%)вариации инактивировали комплемент в концентрации более 15СН50/мл;
из 10 вариаций Proteus spp.+Е.coli 8(80%) вариаций инактивировали комплемент,
из которых 4(50%) вариации инактивировали комплемент в концентрации от 515СН50/мл и 4(50%)вариации в концентрации более 15СН50/мл
Данные
сравнительного
изучения
антикомплиментарной
активности
монокультур Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., Е.coli, Proteus spp. их
сокультивируемых вариаций: Enterobacter spp.+Citrobacter spp., Enterobacter
spp.+Serratia spp., Citrobacter spp.+Serratia spp., Enterobacter spp.+Е.coli, Citrobacter
spp.+Е.coli,
Serratia
spp.+Е.coli,
Proteus
spp.+Enterobacter
spp.,
Proteus
spp.+Citrobacter spp., Proteus spp.+Serratia spp., Proteus spp.+Е.coli показали, что
бактерии родов Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., Е.coli, Proteus spp.,
при совместном культивировании значительно чаще проявляют высокую и
среднюю антикомплементарную активности (Р<0,05).
Таким образом, результаты данного раздела наших исследований, дают нам
основание полагать, что совместно культивируемые вариации энтеробактерий:
Enterobacter spp.+Citrobacter spp., Enterobacter spp.+Serratia spp., Citrobacter
spp.+Serratia spp., Enterobacter spp.+Е.coli, Citrobacter spp.+Е.coli, Serratia
spp.+Е.coli, Proteus spp.+Enterobacter spp., Proteus spp.+Citrobacter spp., Proteus
spp.+Serratia spp., Proteus spp.+Е.coli значительно чаще обладают високими и
средними значениями персистирующих свойств, а в частности высокой и средней
антилизоцимной, антиинтерфероновой и антикомплементарной активностями (Р-
129
<0,05), чем изолированные в виде монокультур, что необходимо учитывать при
оценке этиологической значимости этих микроорганизмов, выделенных в виде
ассоциаций при инфекционных процессах различной локализации.
Исследования по изучению антикомплементарной активности монокультур
и сокультивируемых условно–патогенных энтеробактерий были проведены
совместно с сотрудниками кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии
ГБОУ
ВПО
«Башкирский
государственный
медицинский
университет»
Министерства здравоохранения Российской Федерации (Характеристика свойств
определяющих персистенцию моно- и ассоциативных культур
условно-
патогенных энтеробактерий / Ю.З.Габидуллин, А.А.Ахтариева, М.М.Алсынбаев,
Э.Ф.Мамбетова, М.М.Туйгунов, Д.Т Гашимова., Ф.С.Билалов, Н.Н.Гибазов,
Р.М.Ахмадеев, А.К. Булгаков // Журнал микробиологии, эпидемиологии и
иммунобиологии. - 2006г.№4 стр. 62-64).
3.4. Изучение вирулентности и токсигенности монокультур Enterobacter spp.,
Citrobacter spp., Serratia spp., Е.coli, Proteus spp. и их сокультивируемых
вариаций: Enterobacter spp.+Citrobacter spp. (Е+С), Enterobacter
spp.+Serratia spp. (Е+S), Citrobacter spp.+Serratia spp.(C+S), Enterobacter
spp.+Е.coli (Ent+Е.coli), Citrobacter spp.+Е.coli (C+Е.coli), Serratia spp.+Е.coli
(S+Е.coli), Proteus spp.+Enterobacter spp. (Prot+Ent), Proteus spp.+Citrobacter
spp. (Prot+Citr), Proteus spp.+Serratia spp. (Prot+Ser), Proteus spp.+Е.coli
(Prot+Е.coli).
3.4.1. Легочная модель
В основе развития любого инфекционного процесса лежат сложные
взаимоотношения
между
микроорганизмами
и
защитными
механизмами
макроорганизма. Поэтому с целью выяснения этиологической значимости
условно-патогенных
энтеробактерий
и
их
ассоциаций
создается
экспериментальная модель инфекционного процесса, из которых наиболее
простым и чувствительным методом при изучении вирулентности бактерий
семейства Enterobacteriaceae является метод интраназального заражения белых
мышей [89]. Данный метод позволяет определить динамику размножения
130
бактерий через различные интервалы времени от момента введения возбудителя,
а по времени гибели и количеству погибших животных установить степень
вирулентности бактерий [51].
Для
выявления
вирулентности
монокультур
клинических
штаммов
бактерий родов Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., Е.coli, Proteus spp.
и их сокультивируемых вариаций: Enterobacter spp.+Citrobacter spp.(Е+С),
Enterobacter
spp.+Serratia
spp.(Е+S),
Citrobacter
spp.+Serratia
spp.(C+S),
Enterobacter spp.+Е.coli(Ent+Е.coli), Citrobacter spp.+Е.coli(C+Е.coli), Serratia
spp.+Е.coli(S+Е.coli),
Proteus
spp.+Enterobacter
spp.(Prot+Ent),
Proteus
spp.+Citrobacter spp.(Prot+Citr), Proteus spp.+Serratia spp.(Prot+Ser), Proteus
spp.+Е.coli(Prot+Е.coli), мы использовали метод интраназального заражения
беспородных белых мышей самцов весом 18-20г. [89], что поможет нам более
полно
совместно
с
другими
факторами
патогенности
и
персистенции,
сравнительно оценить этиологическую значимость моно- и ассоциированных
культур этих микроорганизмов.
При этом критериями оценки вирулентности были таковы: культуры
способные вызывать острую токсическую пневмонию с гибелью 50 % животных
в течение 5 часов считали высоковирулентными; в течение 12-18 часов – средней
степени вирулентности; способность вызывать гибель 50% животных в течении
36-48 часов – считались культуры слабой вирулентности и культуры не
вызывавшие гибель или болезненное состояние животных – авирулентными.
Сначало на легочной модели была изучена вирулентность монокультур
бактерий родов родов Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., Е.coli,
Proteus spp..
Из всех исследуемых 50 монокультур Enterobacter spp. 12(24%) штаммов
проявляли вирулентность, среди которых обладали высокой 2(16,6%) штамма,
средней 5(41,6%) штаммов, 5(41,6%) обладали слабой вирулентностью и 38(76%)
штаммов были авирулентными; из 50 монокультур Citrobacter spp. 14(28%)
проявляли вирулентность, среди которых обладали высокой вирулентностью
2(14,2%)
штаммов,
2(14,2%)-средней,
10(71,4%)
обладали
слабой
131
вирулентностью и 36(72%) штаммов были авирулентными; из 50 штаммов
Serratia spp. 13(26%) обладали вирулентностью, среди которых проявляли
высокую вирулентность 3(23,07%) штаммов, 3(23,07%)-среднюю, 7(53,8%)слабую вирулентность, и 37(74%) штаммов был авирулентными; из 50
монокультур Е.coli 10(20%) проявляли вирулентность, среди которых обладали
высокой вирулентностью 2(20%) штамма, 5(50%)-средней, 3(30%) штаммов
обладали слабой вирулентностью и 40(80%) штаммов были авирулентными; из
50 штаммов Proteus spp. 15(30%) проявляли вирулентность, среди которых
обладали
высокой вирулентностью 2(13,3%) штаммов, 2(13,3%)-средней,
11(73,3%) обладали слабой вирулентностью и 35(70%) штаммов были
авирулентными. Штаммы выделенные от здоровых людей, соответственно,
оказались авирулентными.
В последующем проведенные исследования по изучению вирулентности
совместно
культивируемых
энтеробактерий
в
вариациях:
Enterobacter
spp.+Citrobacter spp., Enterobacter spp.+Serratia spp., Citrobacter spp.+Serratia spp.,
Enterobacter spp.+Е.coli, Citrobacter spp.+Е.coli, Serratia spp.+Е.coli, Proteus
spp.+Enterobacter spp., Proteus spp.+Citrobacter spp., Proteus spp.+Serratia spp.,
Proteus
spp.+Е.coli,
позволили
выявить
более
выраженную
динамику
размножения сокультивируемых бактерий и сокращение интервала времени
гибели
экспериментальных
ассоциированных
культур,
животных
что
с
момента
установило
введения
степень
суспензий
вирулентности
сокультивируемых микроорганизов в виде ассоциаций.
Из всех 10 исследуемых совместно культивируемых вариаций Enterobacter
spp.+Citrobacter spp. – 4(40%) вариации обладали вирулентностью, среди которых
проявляли высокую 2(50%) вариации, 1(25%)-среднюю и 1(25%) вариация
проявляла слабую вирулентность, а 6(60%) вариации были авирулентными; из 10
совместно культивируемых вариаций Enterobacter spp.+Serratia spp. – 4(40%)
обладали вирулентностью, среди которых проявляли высокую 1(25%) вариации,
2(50%)-среднюю и 1(25%) вариация проявляла слабую вирулентность; из 10
вариаций Citrobacter spp.+Serratia spp. – 5(50%) обладали вирулентностью, среди
132
которых проявляли высокую 2(40%) вариаций, 2(40%) вариации проявляли
среднюю вирулентность и 1(20%) вариация прявляла слабую вирулентность, а
5(50%) вариаций оказались авирулентными; из 10 сокультивируемых вариаций
Enterobacter spp.+Е.coli 6(60%) вариаций
обладали вирулентностью, среди
которых проявляли высокую 2(33,33%) вариации, 2(33,33%)-среднюю и
2(33,33%) вариация проявляла слабую вирулентность, а 4(40%) вариации были
авирулентными; из 10 вариаций Citrobacter spp.+Е.coli 4(40%) обладали
вирулентностью, среди которых проявляли высокую вирулентность 2(50%),
1(25%) вариации проявляли среднюю вирулентность и 1(25%) вариация слабую
вирулентность, а 6(60%) вариаций были авирулентными; из 10 вариаций
совместно культивируемых штаммов Serratia spp.+Е.coli - 4(40%) обладали
вирулентностью, среди которых проявляли высокую вирулентность 1(25%)
вариация, 2(50%) вариации – среднюю и 1(25%) вариация Serratia spp.+ Е.coli
проявляла слабую вирулентность, а 6(60%) вариаций Serratia spp.+Е.coli были
авирулентными; из 10 сокультивируемых вариаций Proteus spp.+Enterobacter spp.
- 6(60%) вариаций обладали вирулентностью, среди которых проявляли высокую
вирулентность 2(33,33%) вариации, среднюю – 2(33,3%) вариации и слабую
вирулентность 2(33,33%) вариации, а 4(40%) вариации были авирулентными; из
10
вариаций
Proteus
spp.+Citrobacter
spp.
4(40%)
вариаций
обладали
вирулентностью, среди которых проявляли высокую вирулентность 2(50%)
вариации, 1(25%) вариация проявляла среднюю вирулентность и
1(25%)
вариация слабую, а 6(60%) вариаций оказались авирулентными; из 10 вариаций
Proteus spp.+Serratia spp. 4(40%) вариации обладали вирулентностью, среди
которых проявляли высокую вирулентность 2(50%) вариации, 1(25%) вариация
проявляла среднюю вирулентность и 1(25%) вариация обладала слабой
вирулентностью,
а
6
вариаций
Proteus
spp.+Serratia
spp.
оказались
авирулентными; из вариаций Proteus spp.+Е.coli 5(50%) вариаций из 10 обладали
вирулентностью, среди которых проявляли высокую вирулентность 2(40%)
вариации, 2(40%) вариация проявляла среднюю вирулентность и
1(20%)
133
вариация обладала слабой вирулентностью, а 5(50%) вариаций Proteus spp.+Е.coli
были авирулентными (Р<0,05).
Таким
образом, результаты
данного
раздела
наших
исследований
показывают, что при совместном культивировании штаммы бактерий родов
Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., Е.coli, Proteus spp., значительно
чаще проявляют высокую и среднюю вирулентность, чем их монокультуры, что
возможно связано с взаимной передачей между энтеробактериями факторов
вирулентности, и метод
использован
при
микроорганизмов,
оценке
интраназального заражения мышей может быть
этиологической
выделенных
при
значимости
инфекционных
ассоциаций
процессах
этих
различной
локализации.
Исследования
по
изучению
вирулентности
монокультур
и
сокультивируемых условно–патогенных энтеробактерий методом интраназального
заражения беспородных белых мышей самцов весом 18-20г. были проведены
совместно с сотрудниками Центральной научной исследовательской лаборатории
и кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии ГБОУ ВПО «Башкирский
государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения
Российской
Федерации
сокультивируемых
(Характеристика
вариаций
свойств
условно-патогенных
монокультур
и
энтеробактерий
/
Ю.А.Медведев, Ю.З.Габидуллин, Р.С.Суфияров, З.Г.Габидуллин, М.М. Туйгунов
// Материалы V Ежегодного Всероссийского Конгресса по инфекционным
болезням. – Москва, 25-27 марта 2013г.).
3.4.2. Отек лапки
Способность бактерий продуцировать токсин тесным образом связана с
патогенетической значимостью возбудителя при развитии инфекционных
заболеваний, вызванных условно-патогенными энтеробактериями. В настоящее
время
выделяют
отдельную
группу
энтеротоксинов,
так
называемых
термолябильных энтеротоксинов, продукция которых определенным образом
обуславливает развитие диарейного симптомокомплекса инфекций вызванных
134
условно-патогенными грамотрицательными бактериями. По данным многих
исследователей [10, 95, 264], способность бактерий вызывать инфекционный
процесс зависит от наличия у возбудителя многих факторов патогенности, но
токсигенность при этом является определяющим в развитии инфекционного
заболевания.
По данным В.М. Бондаренко и соавторами [39], ЛТ – энтеротоксигенность
условно-патогенных энтеробактерий является одним из ведущих факторов их
патогенности. Имеются в литературе сообщения, указывающие о возможности
использования метода «отека лап» для выявления у условно-патогенных
грамотрицательных бактерий способности продуцировать термолябильного
токсического вещества типа ЛТ-энтеротоксина [83]. Однако данные об
использовании теста «отек лапки» при изучении способности ассоциированных
культур
условно-патогенных
энтеробактерий
продуцировать
токсические
вещества типа ЛТ-энтеротоксина отсутствуют.
В этой связи мы на модели «отек лапки» белых мышей проводили
сравнительные изучение степени активности термолябильных токсических
веществ монокультур Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., Е.coli,
Proteus spp. и их сокультивируемых вариаций: Enterobacter spp.+Citrobacter
spp.(Е+С), Enterobacter spp.+Serratia spp.(Е+S), Citrobacter spp.+Serratia spp.(C+S),
Enterobacter spp.+Е.coli(Ent+Е.coli), Citrobacter spp.+Е.coli(C+Е.coli), Serratia
spp.+Е.coli(S+Е.coli),
Proteus
spp.+Enterobacter
spp.(Prot+Ent),
Proteus
spp.+Citrobacter spp.(Prot+Citr), Proteus spp.+Serratia spp.(Prot+Ser), Proteus
spp.+Е.coli(Prot+Е.coli). При этом, центрифугаты 20-часовых бульонных культур
дающие разницу между опытной и контрольной лапками более 95 мг. считали как
продуцирующих высокоактивный ЛТ-энтеротоксин, культуры дающие разницу
между опытной и контрольной лапками от 75 до 95 мг. мы их условно считали
способными
продуцировать
активный
ЛТ-энтеротоксин,
центрифугаты
бульонных культур дающие разницу от 60 до 75 мг считали способными
продуцировать ЛТ-энтеротоксин слабой активности и культуры дающие разницу
135
между опытной и контрольной лапками менее 65мг считали не способными
продуцировать ЛТ-энтеротоксин.
Как показали результаты исследований, из 50 штаммов Enterobacter spp. 20
часовых бульонных культур центрифугат 10(20%) монокультур вызывали отек
лап, из которых 2 вызывали отек лап от 60 до 75 мг., 4 вызывали отек лап от 65
до 70 мг, 4 давали положительный тест «отек лапки» от 65 до 70 мг, а остальные
40 штаммов давали отек лапки 60 мг.;
из 50 монокультур Citrobacter spp. 12
штаммов вызывали «отек лапки» от 60 до 80 мг., из которых центрифугат 3
вызывали отек лап от 60 до 80 мг, 3 от 60 до 75 мг и 6 вызывали «отек лапки» от
60 до 70 мг., а 38(76%) штаммов давали отек лапки менее 60 мг.; из 50
монокультур Serratia spp. центрифугат 8(16%) штаммов вызывали «отек лапки»,
среди которых 3 штаммов вызывали отек лап от 65 до 75 мг, 1 штамм давал «отек
лапки» 65 мг. и 4 штамма давали положительный «отек лапки» от 60 до 70 мг., а
42(84%) штамма Serratia spp. давали «отек лапки» менее 60мг. Из 50 монокультур
Е.coli центрифугат 6(12%) штаммов вызывали «отек лапки» от 65-75мг., среди
которых 1 штамм вызывал «отек лап» 75 мг, 1 штамм давал «отек лапки» 70 мг. и
4 штамма давали положительный «отек лапки» от 60 до 70 мг., а 44 штамма Е.coli
давали «отек лапки» менее 60мг.; из 50 штаммов Proteus spp. 7 вызывали отек лап
от 65-85мг., из которых 2 штамма вызывали отек лап от 65 до 85 мг., 4 штамма
вызывали отек лап от 60 до 80 мг. и 1(14,2%) штамм давал положительный тест
«отек лапки» 65 мг, а остальные 43 штамма давали отек лапки менее 60 мг.
Штаммы Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., Е.coli и Proteus spp.,
выделенные от здоровых людей, вызывали отек лап мышей не более 30 мг.
Среди 10 сокультивируемых вариаций Enterobacter spp.+Citrobacter spp.
центрифугаты 4(40%) вариаций вызывали отек лап от 65 до 90 мг., среди которых
2(50%) вариации давали отек лап от 90 мг., 1 (25%) вариация 75 мг. и 1(25%)
вариация 65 мг, а 6(60%) вариаций давали отек лап менее 60 мг.; из 10 вариаций
Enterobacter
spp.+Serratia
spp.
центрифугаты
5(50%)
вариаций
давали
положительный тест «отек лапки» от 65 до 95 мг., среди которых 3(60%)
вызывали отек лап до 95 мг., 1(20%) вариация 75 мг. и 1(20%) вариация вызывала
136
отек лапки 65 мг., а 5(50%) вариаций давали отек лап менее 60 мг.; из 10
вариаций Citrobacter spp.+Serratia spp. 5(50%) давали положительный тест «отек
лапки» от 65-95 мг., среди которых 4(80%) вариации вызывали отек лап от 65 до
95 мг., 1(20%) вариация – 75 мг. (Р<0,01), а 5(50%) вариаций давали отек лап
менее 60 мг.; из 10 вариаций Enterobacter spp.+Е.coli центрифугаты 6(60%)
вариаций давали положительный тест «отек лапки» от 60 до 90 мг., среди
которых 3(50%) вызывали отек лап от 60 до 95 мг., 2 вариации от 60 до 75 мг. и 1
вариация вызывала отек лапки 70 мг и 4 вариации давали тест «отек лапки» менее
60 мг.; из 10 исследуемых вариаций Citrobacter spp.+Е.coli 6(60%) вариаций
давали положительный тест «отек лапки» от 65-95 мг., среди которых
2
вариации вызывали отек лап до 75-85 мг., 3(50%) вариации – от 65 до 75 мг. и 1
вариация 65 мг. и 4(40%) давали «отек лапки» мышей менее 60 мг.; из 10
вариаций Serratia spp.+Е.coli 4(40%) вариаций давали положительный тест «отек
лапки» от 65 до 85 мг., среди которых 1вариация вызывала отек лап 85 мг., 2
вариации от 75 до 85 мг и 1 вариация вызывала отек лапки
65 мг., а 6(60%)
вариаций давали «отек лапки» менее 60 мг.; из 10 вариаций Proteus
spp.+Enterobacter spp. центрифугаты 4(40%) вариаций давали положительный
тест «отек лапки» от 65 до 95 мг., среди которых 1 вариация вызывала отек лап
95 мг., 2 вариации от 75 до 95 мг и 1 вариация вызывала отек лапки 65 мг. и
6(60%) вариаций менее 60 мг.; 5 из 10 вариаций Proteus spp.+Citrobacter spp.
5(50%) вариаций давали положительный тест «отек лапки» от 60 до 95 мг., среди
которых 1 вариация вызывала отек лап 95 мг., 3 вариации от 75 до 85 мг и 1
вариация вызывала отек лапки 70 мг. и 5(50%) вариаций давали тест менее 60 мг.;
из 10 вариаций Proteus spp.+Serratia spp. 4(40%) вариации давали положительный
тест «отек лап» от 60-85мг., среди которых 1 вариация вызывала отек лап 85 мг.,
2 вариации от 75 до 80 мг. и 1 вариация вызывала отек лапки 65 мг.; из вариаций
Proteus spp.+Е.coli 5(50%) вариаций давали положительный тест «отек лапки» от
60-80 мг., среди которых 1 вариация вызывала отек лап 80 мг.,
3 вариации – от
70 до 75 мг. и 1 вариация от 65 мг.. Результаты наших исследований показывают,
что штаммы бактерий Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., Е.coli и
137
Proteus spp. при совместном культивировании, чаще продуцируют ЛТэнтеротоксины высокой и средней активности (Р<0,05).
С целью выяснения природы веществ, обуславливающих «отек лап» мышей
монокультур бактерий родов Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., Е.coli,
Proteus spp. и их сокультивируемых вариаций, центрифугаты 20 часовых
бульонных монокультур и их сокультивируемых вариаций нагревали при
температуре 56 0С и 850С в течение 45 минут и вводили субплантарно. При этом
гретые при 560С центрифугаты давали разницу между опытным и контрольными
лапками в пределах от 25-40 мг, при 85 0С – от 15–25 мг, что указывает на
термолабильность токсических веществ продуцируемых монокультурами и их
сокультивируемыми вариациями. И в результате одновременного изучения
энтеротоксигенности
и
адгезивной
активности,
установлено,
что
высокотоксичные совместно культивируемые штаммы обладали более высокой
адгезивной активностью, чем их монокультуры.
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют, что бактерии
родов Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., Е.coli и Proteus spp., при
совместном культивировании, значительно чаще синтезируют токсические
вещества типа ЛТ-энтеротоксина высокой активности, чем их монокультуры,
обуславливающее отек лап мышей, что возможно и связано с более
злокачественным
течением
гнойно-воспалительных
процессов,
вызванных
ассоциациями условно-патогенных грамотрицательных энтеробактерий.
Исследования по изучению способности монокультур и сокультивируемых
условно–патогенных энтеробактерий продуцировать термолабильное токсическое
вещество типа LT-энтеротоксин были проведены совместно с сотрудниками
кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии ГБОУ ВПО «Башкирский
государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения
Российской
Федерации
(Особенности
некоторых
биологических
свойств
монокультур бактерий родов Еnterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., Proteus
spp. и их совместно сокультивируемых вариаций / Ю.З. Габидуллин, Р.С.
Суфияров, З.Г. Габидуллин, Р.З. Суфиярова, М.Г. Зайнуллина. // Вестник Южно-
138
Уральского Государственного Университета. Серия здравоохранение. – Т.13, №1,
2013г.).
3.4.3. Петля тонкого кишечника кролика
В
основе
развития
энтеробактериями,
заболеваний,
ведущую
роль
вызванных
играют
условно-патогенными
термолабильные
(LT)
и
термостабильные (ST) энтеротоксины, которые вызывают диарейные синдромы и
общую интоксикацию макроорганизма [37]. Кроме того микроорганизмы
продуцирующие энтеротоксины, вызывают патоморфологические изменения
стенок органов желудочно-кишечного, а в частности различных отделов
кишечника [174].
В связи с этим мы проводили сравнительное изучение токсигенности
монокультур Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., Е.coli, Proteus spp. и
их
сокультивируемых
Enterobacter
вариаций:
spp.+Serratia
Enterobacter
spp.(Е+S),
spp.+Citrobacter
Citrobacter
spp.(Е+С),
spp.+Serratia
spp.(C+S),
Enterobacter spp.+Е.coli(Ent+Е.coli), Citrobacter spp.+Е.coli(C+Е.coli), Serratia
spp.+Е.coli(S+Е.coli),
Proteus
spp.+Enterobacter
spp.(Prot+Ent),
Proteus
spp.+Citrobacter spp.(Prot+Citr), Proteus spp.+Serratia spp.(Prot+Ser), Proteus
spp.+Е.coli(Prot+Е.coli) на модели «изолированная петля тонкого кишечника
кролика» [95].
Полученные результаты показали, что из 25 штаммов Enterobacter spp.
центрифугат 5(20%) культур оказались способными вызывать накопление
жидкости в тонкой кишке кролика (V/L от 1,0 до 1,1), и при этом центрифугат 1
штамм давал соотношение объема экссудата к длине сегмента (V/L) - 1,1; у 4
штамма – 1,0; а у 20(80%) штаммов Enterobacter spp. соотношение V/L были
менее 0,7. В сегментах, куда были введены центрифугаты 5(20%) штаммов
Enterobacter spp. у 2-х мы наблюдали накопление геморрагического экссудата
(энтерогемолизин), а у остальных 3-х накопление серозного экссудата. Следует
отметить, что все штаммы Enterobacter spp.
оказались
выделенными
от больных,
продуцирующие энтерогемолизин,
страдающих острыми
кишечными
139
инфекциями. Для выяснения природы токсического продукта, продуцируемого
штаммами Enterobacter spp., вызывающих накопление жидкости в изолированной
петле тонкого кишечника кролика, мы центрифугаты 5 штаммов 18-20 часовых
бульонных культур Enterobacter spp. нагревали при 56°С, 85°С в течение 10
минут. При введении гретого (56°С) центрифугата, у 4 штаммов, продуцирующих
ЛТ-энтеротоксин, соотношение V/L экссудата составило не более 0,6, а гретый
при 85°С вызывали накопление жидкости и соотношение V/L были не более 0,35.
При нагревании до 85°С в течение 10 минут центрифугаты 2(40%) штаммов
вызывали накопление жидкости (V/L от 0,9 до 1,0), что указывало о возможной
способности этих культур продуцировать СТ-энтеротоксин. В сегментах, куда
были введены центрифугаты 25 штаммов Citrobacter spp. у 5(20%) штаммов
соотношение объема экссудата к длине сегмента (V/L) составило от 1,0 до 1,1,
среди которых у 1 штамма (V/L) составило 1,1, и у 3 штаммов-1,0 и у 1 штамма
V/L составило – 0,9, а у 20(80%) штаммов Citrobacter spp. соотношение V/L были
менее 0,6. В сегментах с положительной V/L, куда вводили центрифугат 2
штаммов Citrobacter spp., у 1 штамма наблюдали накопление серозного экссудата,
а у 1 штамма геморрагический экссудат. Далее для выяснения природы
токсического продукта, продуцируемого штаммами Citrobacter spp., вызывающих
накопление жидкости в изолированных сегментах тонкого кишечника, мы
центрифугаты нагревали при 56°С, 85°С в течение 10 минут. При введении
гретых (56°С) центрифугатов, у 1 штамма Citrobacter spp., продуцирующих
высокоактивный ЛТ-энтеротоксин, соотношение V/L уменьшилось (до 0,6), а
гретых при 85°С в течение 10 минут, центрифугаты 2-х штаммов Citrobacter spp.
продуцирующих ЛТ-энтеротоксин не вызывали накопление жидкости и
соотношение V/L составило (не более 0,4). При введении супернатантов
бульонных культур 25 штаммов бактерий родов Serratia spp. наблюдали в 4(16%)
случаях
накопление
экссудата
в
просвете
тонкого
кишечника,
и
характеризовалось значениями (V/L) в пределах от 1,0 до 1,1. При этом 1 штамм
Serratia spp. вызывал накопление серозного экссудата в пределах 1,1; 2 штамма
вызывали накопление жидкости и соотношение V/L составило в пределах 1,0; 1
140
штамм вызывал накопление жидкости и соотношение V/L составило 0,9, а
центрифугаты остальных 21(84%) штаммов Serratia spp. давали показатели менее
0,5. Необходимо отметить, что отношение объема к длине петли при введении
гретого при 56°С центрифугата составило не более 0,35, что дополнительно
подтверждало
термолябильность
токсического
вещества,
вызывающего
накопление жидкости в петле тонкого кишечника кролика. При введении
супернатантов бульонных культур 25 штаммов Е.coli наблюдали в 4(16%)
случаях
накопление
экссудата
в
просвете
тонкого
кишечника,
и
характеризовалось значениями (V/L) в пределах от 1,0 до 1,1. При этом 1 штамм
Е.coli вызывал накопление серозного экссудата в пределах 1,1; 2 штамма
вызывало накопление жидкости и соотношение V/L составило в пределах 1,0; и 1
штамм вызывал накопление жидкости и соотношение V/L составило 0,8-0,9, а
центрифугаты остальных 21(84%) штаммов Е.coli давали показатели менее 0,6.
Необходимо отметить, что отношение объема к длине петли при введении
гретого при 56°С центрифугата составило не более 0,35, что дополнительно
подтверждало о термолябильности токсического вещества, вызывающего
накопление жидкости в петле тонкого кишечника кролика. При введении
супернатантов бульонных 25 монокультур штаммов бактерий Proteus spp. в
6(24%) случаях наблюдали накопление экссудата в просвете тонкого кишечника
и характеризовались значениями (V/L) в пределах от 1,0 до 1,1. При этом 2
штамма Proteus spp. вызывали накопление серозного экссудата в пределах 1,1; 2
штамма вызывали накопление жидкости и соотношение V/L составило 1,0 и
более; 2 штамма вызывали накопление жидкости и соотношение V/L составило
0,9-1,0; и 19(76%) штаммов не вызывали накопление жидкости и соотношение
V/L составило не более 0,35. Необходимо отметить, что отношение объема к
длине петли при введении гретого при 56°С центрифугата составило не более 0,3,
что дополнительно подтверждало о термолябильности токсических продуктов,
вызывающих накопление жидкости в петле тонкого кишечника кролика.
Монокультуры штаммов Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp.,
Е.coli,
Proteus
spp.
продуцирующие
ЛТ-энтеротоксины,
вызывали
141
патоморфологические изменения кишечника, которые проявлялись на снимке
(Рис.24): стенка тонкого кишечника малокровная, кишка находилась в состоянии
умеренного отека, отмечалась умеренная гиперемия сосудов стенки и брыжейки.
Слизистая
оболочка
сохранена,
определялись
некоторые
скопления
микроколоний бактерий. Подслизистая оболочка умеренно отечная, сосуды
малокровные, незначительно расширены, лимфатический аппарат сохранен.
Рисунок 24 - Лигированная петля тонкого кишечника кролика
при введении ЛТ-энтеротоксинпродуцирующего штамма Citrobacter
spp.
Результаты
проведенных
опытов
показали,
что
при
введении
центрифугатов совместно культивируемых штаммов Enterobacter spp., Citrobacter
spp., Serratia spp., Е.coli, Proteus spp. в вариациях: Enterobacter spp.+Citrobacter
spp.(Е+С), Enterobacter spp.+Serratia spp.(Е+S), Citrobacter spp.+Serratia spp.(C+S),
Enterobacter spp.+Е.coli(Ent+Е.coli), Citrobacter spp.+Е.coli(C+Е.coli), Serratia
spp.+Е.coli(S+Е.coli),
Proteus
spp.+Enterobacter
spp.(Prot+Ent),
Proteus
spp.+Citrobacter spp.(Prot+Citr), Proteus spp.+Serratia spp.(Prot+Ser), Proteus
spp.+Е.coli(Prot+Е.coli)
наблюдалась
картина
с
наиболее
выраженными
142
макроскопическими и гистологическими изменениями. Вариации совместно
культивируемых штаммов, обладающие способностью продуцировать ЛТэнтеротоксин, обуславливали накопление экссудата в просвете тонкой кишки,
значительно чаще чем их монокультуры, что характеризовалось значениями
отношения объема жидкости в длине легированного сегмента (V/L) 1,0; 1,3 и
более (1,7) (Р<0,05).
Так при введении центрифугата совместно культивируемых штаммов
вариаций Enterobacter spp.+Citrobacter spp. из 10 вариаций 7(70%) вызывали
накопление жидкости в петле тонкого кишечника кролика, и показатели V/L
колебались в пределах 1,0-1,3, среди которых в 3(42,5%) случаях были 1,3, у
3(42,5%) вариаций – 1,1-1,2 и у 1(14,3%) вариации–1,0, и не давали
положительную реакцию 3(30%) вариации (V/L менее 0,7). В дальнейшем
проводили изучение на модели «петля тонкого кишечника кролика» вариаций
Enterobacter spp.+Serratia spp. Так из 10 вариаций давали положительную
делятацию 6(60%) и соотношение V/L колебалось в пределах 1,1-1,4, среди них
2(33,33%) вариаций Enterobacter spp.+Serratia spp. вызывали накопление
жидкости в тонком кишечнике и соотношение V/L составил 1,3 и более, 2
(33,33%) вариации V/L колебалось в пределах 1,1-1,2; и 2(33,33%) в пределах от
1,0-1,1 и не давала положительную делятацию 4(10%) вариации и V/L составило
менее 0,7. Из 10 вариаций Citrobacter spp.+Serratia spp. 6(60%) вариаций давали
положительную делятацию (V/L от 1,0-1,3), среди которых 3(50%) вариации
вызывали накопление жидкости и V/L составило 1,2-1,3 и более, 2(33,33%) – от
1,1-1,2 и у 1(16,6%) вариации – соотношение V/L было 1,0. Так при изучении
вариаций Enterobacter spp.+Е.coli - 7(70%) вариаций давали положительную
делятацию (V/L от 1,0-1,3), среди которых 4(57,1%) вызывали накопление
жидкости и V/L составило 1,2-1,3, 2(28,5%) – от 1,1-1,2 и у 1(14,2%) вариации
соотношение V/L было 1,0; и не вызывали накопление жидкости в тонком
кишечнике кролика 3(30%) вариации Enterobacter spp.+Е.coli и соотношение
составило V/L менее 0,7. Из 10 вариаций Citrobacter spp.+Е.coli
давали
положительную делятацию 7(70%) вариаций (V/L от 1,0-1,3 и более), среди
143
которых 3(42,8%) вызывали накопление жидкости и V/L составило 1,3 и более,
3(42,8%) – от 1,1-1,2 и у 1(14,2%) вариация – соотношение V/L было 1,0; и не
вызывали накопление жидкости в тонком кишечнике кролика 3(42,8%) вариации
и соотношение V/L составило менее 0,7. И при изучении вариаций Serratia
spp.+Е.coli - 5(50%) вариаций давали положительную делятацию (V/L от 1,0-1,3 и
более), среди которых 2(40%) вызывали накопление жидкости и V/L составило
1,3 и более; 2(40%) – от 1,1-1,2 и у 1(20%) вариации соотношение V/L было 1,0;
и не вызывали накопление жидкости в тонком кишечнике кролика 5(50%)
вариации и соотношение V/L составило менее 0,7. Так из 10 вариаций Proteus
spp.+Enterobacter spp. давали положительную делятацию 5(50%) и соотношение
V/L колебалось в пределах 1,0-1,3 и более, среди них 3(60%) вариации вызывали
накопление жидкости в тонком кишечнике и соотношение V/L составило 1,3 и
более, у 1-ой (20%) вариации V/L колебалось в пределах 1,1 и у 1(20%) вариации
в пределах 1,0 и не давала положительную делятацию 5(50%) вариаций и V/L
составило менее 0,7; из 10 исследуемых вариаций Proteus spp.+Citrobacter spp.
положительную делятацию давали 5(50%) вариаций (V/L от 1,0-1,3 и более),
среди которых 3(60%) вызывали накопление жидкости и V/L составило 1,3,
1(25%) – 1,1 и у 1(25%) вариации соотношение V/L было 1,0; и не вызывали
накопление жидкости в тонком кишечнике кролика 5(50%) вариаций; из 10
вариаций Proteus spp.+Serratia spp. 6(60%) давали положительную делятацию и
соотношение V/L колебалось в пределах 1,0-1,3 и более, среди которых 2(33,33%)
вариаций Proteus spp.+Serratia spp. вызывали накопление жидкости в тонком
кишечнике и соотношение V/L составил 1,3 и более; 3 (50%) вариации V/L
колебалось в пределах 1,1-1,2; и у 1(16,6%) вариации в пределах - 1,0; при
исследовании 10 сокультивируемых вариаций Proteus spp.+Е.coli, положительную
делятацию давали 6(60%) вариаций (V/L от 1,0-1,3), среди которых 3(50%)
вызывали накопление жидкости и V/L составило 1,3 и более, 2(33,33%) – от 1,11,2 и у 1(16,6%) вариации соотношение V/L было 1,0; и не вызывали накопление
жидкости в тонком кишечнике кролика 5(50%) вариаций.
144
Наиболее
выраженными
при
морфологическом исследовании
были
изменения кишечника кролика, при введении центрифугатов сокультивируемых
штаммов вариаций Citrobacter spp.+Serratia spp. и
Proteus spp.+Serratia spp.
(Рис.25): штамм продуцирующий ЛТ-энтеротоксин + штамм продуцирующий
энтерогемолизин.
Рисунок 25 - Лигированная петля тонкого кишечника кролика при введении
сокультивируемой вариации (C+S): штамм Citrobacter spp., суперпродуцент
высокоактивного ЛТ-энтеротоксина+ энтерогемолизинпродуцирующий
штамм Serratia spp..
Макроскопически: стенка тонкого кишечника была полнокровной, чернобагрового цвета, в состоянии выраженного отека выраженная гиперемия сосудов
стенки и брыжейки кишки. Эластичность и прочность кишечной стенки были
значительно снижены, чем при введении монокультур и при небольшом усилии
ткань кишки легко рвалась. В просвете кишечника определялось большое
145
количество мутного с геморрагическим оттенком экссудата. На слизистой
оболочке
макроскопически
выявлялись
очаги
эрозий-изъязвлений,
крупноочаговые кровоизлияния в слизистую оболочку до 1-5 мм, местами
сливающиеся между собой. В отдельных участках слизистая оболочка и
подлежащие ей ткани имели черный цвет, они характеризовались дряблостью и
находились в состоянии некроза. Макроскопически отмечались общий отек
стенки кишки, мелкие, точечные кровоизлияния в толщу мышечной оболочки на
фоне выраженного полнокровия сосудов брыжейки, мутности и тусклости
серозной оболочки.
В норме же микроскопически ворсинки слизистой оболочки тонкой кишки
были представлены выпячиваниями собственной пластинки слизистой, покрытые
столбчатым каемчатым эпителием (87±6,3%) содержащий бокаловидные клетки
(13±1,1%) с круглой или овальной супрануклеарной вакуолью. По форме
ворсинки были листовидными и гребневидными. Высота ворсинок составляла
320±12 мкм, ширина - 102±8 мкм. Глубина крипт 125±9,8 мкм. Крипты были
выстланы преимущественно базофильным эпителием. Собственная пластинка
слизистой оболочки представляла собой типичную рыхлую соединительную
ткань, в которой расположены кровеносные и лимфатические сосуды. Под
эпителием располагаются фибробластоподобные клетки. Здесь же встречаются
единичные мелкие солитарные лимфоидные фолликулы, не проникающие за
мышечную пластинку собственной слизистой. Эпителий, лежащий над ними,
состоит из М-клеток с подлежащей порозной мембраной. Эти и подлнжащие его
ткани слабо инфильтрированы лимфоцитами. Строение подслизистой, мышечной
и адветициальной оболочек соответствует строению других отделов кишечника
(рис. 26).
В сегменте, куда вводили физиологический раствор для контроля, общая
гистологическая картина соответствует вышеописанному строению тонкой
кишки. Высота эпителия нормальная, щеточная каемка сохранена. Инфильтрации
эпителиального слоя лимфоцитами и плазмоцитами не отмечается. В солитарных
фолликулах кишки, наблюдается относительная гиперплазия. Тем не менее,
146
отнести данные изменения к разряду воспалительных нельзя. Скорее всего, имеет
место
индивидуальная
особенность
функционирования,
обусловленная
условиями содержания животного.
Рисунок 26 -
Тонкая кишка кролика в норме.
Контрольная группа животных.
Окраска гематоксилином и эозином. х 100.
Рисунок 27 - Десквамация клеток кишечного эпителия.
Окраска гематоксилином и эозином. х 100.
147
У животных, зараженных монокультурами Enterobacter spp., Citrobacter
spp.,
Serratia
spp.,
Е.coli,
Proteus
spp.
имелись
сходные
по
глубине
распространения и степени тяжести патологические процессы. Отмечалась
десквамация клеток кишечного эпителия как единичных клеток, так и пластов по
5-10 клеток (рис.27). Бокаловидные клетки практически не определялись.
Большая часть ворсин была деформирована, и основная их масса сливалась в
конгломераты по 3-5 ворсин. Их высота колебалась от 180 до 260 мкм. Были
выявлены патологические изменения в криптах, но незначительные. Собственная
пластинка
имела
повышенную
клеточную
плотность
по
сравнению
с
вышеописанными группами. Клеточный инфильтрат собственной пластинки был
представлен
лимфоцитами
и
некоторым
количеством
гранулоцитов
и
макрофагов. В сосудах собственной оболочки отмечалось полнокровие и
периваскулярный отек, которые наиболее ярко проявлялись в строме ворсин
(рис.28). Мышечная пластинка слизистой оболочки сохранена. В подслизистом
слое наблюдается умеренный отек и лимфостазы. Данная картина соответствует
катаральному, эрозивному энтериту.
Рисунок 28 - Полнокровие и слабый периваскулярный отек в строме ворсин,
зараженных монокультурами. Окраска гематоксилином и эозином. х 100.
148
В сегменты кишечника, куда вводили взвесь монокультур, продуцирующих
высокоактивный
термолабильный
энтеротоксин,
отмечалась
тотальная
десквамация клеток кишечного эпителия. Структура ворсин полностью потеряна,
но были сохранены кишечные крипты. Слизистая большими полями замещена
воспалительно-клеточным
детритом
с
фибринозным
пропитыванием.
В
собственной пластинке слизистой оболочки наблюдалась выраженная диффузная
лимфоплазмоцитарная и нейтрофильная инфильтрация. Мышечная пластинка
слизистой
оболочки
сильно
фрагментирована,
разрушена
на
большом
протяжении. В подслизистом слое определялась выраженная экссудативная
реакция.
В
мышечной
оболочке
отмечалась
фрагментация
пучков
гладкомышечных клеток и диффузная лимфоплазмоцитарная инфильтрация. В
соединительно-тканной основе адвентициальной оболочки отмечались острые
экссудативные реакции в форме пареза сосудов, отмечалось их полнокровие и
внутрисосудистый стаз эритроцитов, периваскулярный отек, плазморрагия и
диффузная нейтрофильная инфильтрация (рис.29).
Рисунок 29 - Острая экссудативная реакция в подслизистой, мышечной и
адвентициальной
оболочках
тонкой
кишки
культурами, продуцирующми LT-энтеротоксин.
Окраска гематоксилином и эозином. х 100.
кролика,
зараженных
149
Рисунок 30 - Язвенно-некротический энтерит. Сегмент тонкой кишки, куда
ввели токсигенные сокультивируемые вариации
Окраска гематоксилином и эозином. х 100.
Рисунок
31
-
Тонкая
сокультивируемых
кишка
штаммов
кролика,
(ЛТ+)+(НLI+).
куда
В
вводили
центре
вариации
размножения
солитарного фолликула определяются крупные одноядерные клетки.
Окраска гематоксилином и эозином. х 100.
150
Поражение кишечной стенки в группе животных, которым вводили
сокультивируемые вариации (рис. 30), в стенке кишечника имелась резкая
гиперплазия групповых и солитарных фолликулов с выраженной пролиферацией
лимфоидных клеток в центрах размножения, и появление среди них крупных
одноядерных клеток со светлым ядром округлой или овальной формы (рис. 31).
Подобная картина встречается при паратифах с присоединением вторичной
патогенной флоры.
Таким образом, патоморфологическая картина поражения кишечника в
известной степени дифференцировалась в зависимости от наиболее выраженных
фенотипических свойств, наличие которых коррелирует с патогенностью
бактерий и их количественным составом. На основании проведенного
морфологического исследования с монокультурами и сокультивируемыми
вариациями, можно констатировать следующее:
что при введении монокультур имеет место более слабое поражение кишечной
стенки, чем при введении сокультивируемых вариаций, и у сокультивируемых
вариаций прослеживается более тяжелое поражение кишечной стенки, что может
говорить о крайне выраженном патологическом процессе при попадании
ассоциаций в организм хозяина.
Проведенные
исследования,
по
изучению
энтеротоксигенности
монокультур Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., Е.coli, Proteus spp. и
их сокультивируемых вариаций: Enterobacter spp.+Citrobacter spp., Enterobacter
spp.+Serratia spp., Citrobacter spp.+Serratia spp, Enterobacter spp.+Е.coli, Citrobacter
spp.+Е.coli,
Serratia
spp.+Е.coli,
Proteus
spp.+Enterobacter
spp.,
Proteus
spp.+Citrobacter spp., Proteus spp.+Serratia spp., Proteus spp.+Е.coli на модели
«петля
тонкого
кишечника
кролика»
показали,
что
при
совместном
культивировании штаммов Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., Е.coli,
Proteus spp. происходит увеличение продукции токсических веществ типа ЛТ и
SТ-энтеротоксинов
+
энтерогемолизинов,
которые
отягощают
течение
диарейных инфекций, вызванных ассоциациями этих микроорганизмов, что
151
необходимо учитывать при профилактике и лечении заболеваний вызваемых
полигамными вариациями условно-патогенных энтеробактерий.
Исследования
сокультивируемых
по
изучению
токсигенности
условно–патогенных
монокультур
энтеробактерий
на
и
модели
«изолированная петля тонкого кишечника кролика» были проведены совместно с
сотрудниками кафедр факультетской хирургии с курсом колопроктологии и
микробиологии, вирусологии и
иммунологии
ГБОУ ВПО «Башкирский
государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения
Российской Федерации (Комплксный подход профилактики и лечения гнойновоспалительных
процессов,
вызванных
ассоциациями
условно-патогенных
бактерий / Р.С. Суфияров, З.Г. Габидуллин, Р.З., М.В. Тимербулатов, Ю.З.
Габидуллин // Монография – Уфа, 2013г, 200с.).
3.4.4. Кожнонекротическая проба
Кожнонекротическое действие условно-патогенных энтеробактерий, была
нами принята в качестве одного из маркеров токсигенности моно- и совместно
культивируемых штаммов Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., Е.coli,
Proteus spp. которая поможет нам отличить моно- и ассоциированные
инфекционные процессы, вызванных изучаемыми нами микроорганизмами [108].
В качестве экспериментальных животных использовали кроликов самцов весом
2,5 кг.
Способность некротизировать участки кожи у кроликов, при внутрикожном
введении суспензий моно- и совместно культивируемых штаммов Enterobacter
spp., Citrobacter spp., Serratia spp., Е.coli, Proteus spp. изучалась нами следующим
способом: на тщательно выстриженную кожу на боковой поверхности кролика
вводили внутрикожно суспензию моно- или совместно культивируемых штаммов
Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., Е.coli, Proteus spp. так, чтобы
количество внутрикожных инъекций не превышало одной у каждого кролика.
Для заражения животных во всех опытах была принята единая постоянная доза,
содержание в которой, количества микробных тел составляло 2 млрд. в 1 мл.
152
Результаты регистрировали через 12,24,48 и 72 часа путем измерения размеров
воспалительного фокуса и установления характера воспалительного процесса
(некротизирующий фактор, характер гнойно-воспалительного процесса, общее
состояние испытуемого животного). Все взятые в эксперимент животные до
опытов выдерживались в карантине около 2-х–3-х недель с целью исключения
какой-либо инфекции.
Изучение кожно-некротического действия суспезии моно- и совместно
культивируемых штаммов условно-патогенных энтеробактерий проводились по
выработанным нами критериям оценки проведенных исследований:
1) Разница в величине воспалительного участка (гнойника, некроза) на
месте введения моно- и совместно культивируемых изучаемых нами условнопатогенных энтеробактерий.
2) Разница в течении и развитии инфекционного очага и процесса, и их
характера и сроков его течения (общее состояние испытуемого животного) при
введении монокультур и их сокультивируемых вариаций: Enterobacter spp.,
Citrobacter spp., Serratia spp., Е.coli, Proteus spp.: Enterobacter spp.+Citrobacter spp.,
Enterobacter
spp.+Serratia
spp.,
Citrobacter
spp.+Serratia
spp,
Enterobacter
spp.+Е.coli, Citrobacter spp.+Е.coli, Serratia spp.+Е.coli, Proteus spp.+Enterobacter
spp., Proteus spp.+Citrobacter spp., Proteus spp.+Serratia spp., Proteus spp.+Е.coli.
В опыт нами были взяты 31 кролик, на которых были исследованы
культуры: Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., Е.coli, Proteus spp. (по 2
кролика на каждую культуру) и вариации совместно культивируемых штаммов:
Enterobacter spp.+Citrobacter spp., Enterobacter spp.+Serratia spp., Citrobacter
spp.+Serratia spp, Enterobacter spp.+Е.coli, Citrobacter spp.+Е.coli, Serratia
spp.+Е.coli, Proteus spp.+Enterobacter spp., Proteus spp.+Citrobacter spp., Proteus
spp.+Serratia spp., Proteus spp.+Е.coli – по 2 испытуемых животных на каждую
вариацию и один кролик для контроля.
При изучении кожнонекротической способности 2 монокультур штаммов
бактерий родов Enterobacter spp. у взятых в опыт 2-х животных после введения
суспензий 2 миллиардных культур, через 12 часов отмечалось повышение
153
температуры тела животных до 39°С (нормальная температура у кроликов равна
38-38,5°С), снижение активности и развитие на месте введения суспензии
монокультур Enterobacter spp. очага гиперемии и отека. В дальнейшем эти
явления становились более интенсивными, но не доходя до развития
обособленного очага гнойного воспаления. Очаг воспалительного фокуса через
24 часа составлял
2,5×2,5 см.- красного цвета и с повышением температуры
тела кроликов до 39,5°С; через 48 часов с момента внутрикожного заражения
очаги увеличились до размеров
3×3,5 см., с образованием обособленных
участков и гнойно-воспалительных очагов размерами 1×1,5 см., гнойным мешком
и с повышением температуры до 40°С. Через 72 часа после введения суспензии
бактерии Enterobacter spp. характер развития инфекционного процесса развивался
в пользу убывания, и проявлялся в виде спада температуры тела кроликов до
39,5°С и улучшения общего состояния животных. Что касается места введения
суспензии монокультур Enterobacter spp., в течении последующих 4,5,6 и 7 суток,
происходило заживление с процессом рассасывания очагов воспаления, без
образований каких либо выраженных и видимых изменений поверхности кожных
покровов животных.
При внутрикожном введении суспензий 2-х миллиардных
монокультур
Citrobacter spp., через 12 часов отмечалось повышение температуры до 39°С,
снижение активности, угнетение общего состояния испытуемых животных и
развитие на местах введения суспензии монокультур бактерий рода Citrobacter
spp. очагов гиперемии и отека, что сопровождалось угнетением общего состояния
кроликов. В дальнейшем эти явления становились более интенсивными,
образовались очаги воспаления с размерами 2,0×2,0 см. Размеры очагов
воспаления через 24 часа составляли 2,5×2,5см., приобретали красный цвет с
последующим образованием серозных мешков и накоплением серозного
экссудата, с повышением температуры тел кроликов до 40°С; через 48 часов
после внутрикожного заражения очаги увеличились до размеров 3×3 см., с
образованием
обособленных
участков
гнойно-воспалительного
процесса
размерами 1,5×1,5 см. и с образованием гнойных мешков. Через 72 часа после
154
введения суспензии бактерий Citrobacter spp. характер развития инфекционных
процессов развивался в пользу убывания и происходило снижение температуры
до 39°С.
При внутрикожном введении культур Serratia spp., картина развития
воспалительного процесса показала, что при введении суспензий 2 миллиардных
монокультур бактерий родов Serratia spp., через 12 часов, отмечалось повышение
температуры тела кроликов до 39°С, снижение активности, пассивность, развитие
на месте введения суспензии монокультур штаммов бактерий рода Serratia spp.
очагов гиперемии и отека размерами 1,5×1,5 см., с образованием неоднородных
гиперемированных участков, что сопровождалось в дальнейшем признаками
развития инфекции, образуя очаги воспалительной зоны, размерами 2,0×2,5 см.
Очаги воспалительного фокуса через 24 часа составляли 3,0×2,5 см., приобретали
красный цвет с последующим образованием гнойных мешков с серозно-гнойным
экссудатом и повышением температуры до 40°С. Через
48 часов, с момента
введения суспензии Serratia spp., воспалительные очаги сохраняли свои границы,
но признаки интоксикации проявлялись в меньшей степени, в виде снижения
температуры тела до 39°С, улучшением общего состояния кролика. Через 72 часа
после введения суспензии бактерии Serratia spp. происходило снижение
температуры тел кроликов до 38,5°С, с улучшением общего состояния
испытуемых животных.
При изучении кожнонекротической способности 2 культур Е.coli у взятых в
опыт 2-х животных после введения суспензий 2 миллиардных культур, через 12
часов отмечалось повышение температуры тела животных до 39°С, снижение
активности и развития на месте введения суспензии монокультур бактерий родов
Е.coli очага гиперемии и отека. В дальнейшем эти явления становились более
интенсивными, но не доходя до развития обособленного очага гнойного
воспаления. Очаг воспалительного фокуса через 24 часа составлял 2,0×2,0 см. –
красного цвета и с повышением температуры тела кроликов до 40°С. Через 48
часов, с момента введения суспензии культур бактерии Е.coli воспалительные
очаги сохраняли свои границы. Через 72 часа после введения суспензии бактерии
155
характер развития инфекционного процесса развивался в пользу убывания, и
проявлялся в виде спада температуры тела кроликов до 39°С и улучшения общего
состояния животных. Что касается места введения суспензии монокультур, в
течении последующих 4,5,6 и 7 суток, происходило заживление с процессом
рассасывания очагов воспаления, без образований каких либо выраженных и
видимых изменений поверхности кожных покровов животных.
При внутрикожном введении суспензий 2-х миллиардных
монокультур
Proteus spp., через 12 часов отмечалось повышение температуры до 39°С,
снижение активности, угнетение общего состояния испытуемых животных и
развитие на местах введения суспензии монокультур Proteus spp. очагов
гиперемии и легкого отека. В дальнейшем эти явления становились более
интенсивными, образовались очаги воспаления с серозным содержимым,
размерами 1,5×2,0 см. Размеры очагов воспаления через 24 часа составляли
2,5×2,5см., приобретали бордовый цвет с последующим образованием больших
серозных мешков и накоплением серозного-гнойного экссудата, с повышением
температуры тел кроликов до 40°С. Через 48 часов, с момента введения
суспензии культур бактерии Proteus spp. воспалительные очаги воспаления не
расширяли свои границы и признаки интоксикации проявлялись в меньшей
степени, что было в виде снижения температуры до 39,5°С, а так же увеличением
активности и улучшением общего состояния кролика. Через 72 часа после
введения суспензии бактерий характер развития инфекционных процессов
развивался в пользу убывания и происходило снижение температуры до 38,5°С
(Фото 32).
156
Фото 32 - Картина острой экспериментальной инфекции при введении
монокультуры Proteus spp.
Что касается характера воспалительного процесса, вызванных введением
совместно культивируемых штаммов, картина течения развития ассоциированной
инфекции показала, что при внутрикожном введении суспензий 2 миллиардных
культур
совместно
культивируемых
штаммов
вариаций
Enterobacter
spp.+Citrobacter spp., через 12 часов отмечалось повышение температуры до
39,5°С, снижение активности, угнетение общего состояния испытуемых
животных, пассивность, развитие гиперемированного и геморрагического отека,
размерами 2,5×3,5 см., а так же с образованием гнойных мешков с
гемморрагическим содержимым размерами 1,5×2,5см.. Очаги воспалительных
фокусов через 24 часа составляли 3,5×3,5 см., становясь багрово-красного цвета с
последующим образованием обильного гемморрагического экссудата и гнойных
мешков размерами 2,5×3,0 см., а так же повышением температуры до 40°С; через
48 часов очаги увеличились до размеров 4,0×3,5 см. с образованием разлитой и
обширной гиперемии с увеличением размеров гнойных мешков до 3,0×3,5 см. и
157
повышением температуры до 40,5°С. Через 72 часа, после введения суспензий
совместно
сокультивируемых
вариаций
Enterobacter spp.+Citrobacter
spp.,
характер развития инфекционного процесса не угасал и в течение последующих
12 часов температура тела кроликов держалась в пределах 41°С, что привело к
гибели одного кролика из двух.
Картина течения развития ассоциированной инфекции при внутрикожном
введении суспензий 2 миллиардных культур совместно сокультивируемых
вариаций Enterobacter spp.+Serratia spp. показала, что через 12 часов, отмечалось
повышение температуры тела кроликов до 39,5°С, снижение активности
кроликов, угнетенное состояние, пассивность, развитие на месте введения
суспензии совместно сокультивируемых штаммов Enterobacter spp.+Serratia spp.
очага гиперемированного участка и геморрагического отека, размерами 2,5×3,0
см., а так же с образованием гнойного мешка с гемморрагическим содержимым
размерами 1,5×1,0, что сопровождалось в дальнейшем с образованием
воспалительного очага обширной гиперемированной зоной, размерами 3,5×3,0
см. Очаг воспалительного фокуса через 24 часа составлял 3,0×3,5 см., с ярко
багрово-красным цветом, с обильным накоплением гемморрагического экссудата
гнойного мешка размерами 3,0×3,0 см., а так же повышением температуры тела
до 40°С; через 48 часов с момента внутрикожного введения, гнойновоспалительный очаг увеличился до размеров 3,5×4,0 см. с образованием
разлитой и обширной гиперемии, а так же увеличением размеров гнойного мешка
до 3,5×3,5 см. и повышением температуры до 40,5°С. Через 72 часа после
введения суспензий совместно сокультивируемых штаммов бактерий родов
Enterobacter spp.+Serratia spp. развитие инфекционного процесса приобрело ярко
выраженный характер (температура тела кролика достигла 41°С), что привело к
гибели 1-го из 2-х экспериментальных животных.
При внутрикожном введении суспензий 2 миллиардных культур совместно
культивируемых вариаций Citrobacter spp.+Serratia spp., через 12 часов,
отмечалось повышение температуры тела до 39,5°С, резкое снижение активности
кроликов,
развитие
на
месте
введения
суспензии
обширного
очага
158
гиперемированного участка c геморрагическим отеком, размерами 2,5×2,5 см., а
так же с образованием гнойного мешка с гемморрагическим содержимым
размерами 1,5×2,0 см., что сопровождалось в дальнейшем более интенсивными
признаками развития ассоциированной инфекции. Очаг воспалительного фокуса
последующие 24 часа составлял 3,0×3,0 см., становясь ярко багрово-красного
цвета с резким и обильным накоплением гемморрагического экссудата гнойного
мешка размерами 2,0×2,0 см., а так же повышением температуры до 40°С; через
48 часов с момента внутрикожного введения, гнойно-воспалительный очаг
увеличился до размеров 3,5×3,5 см. с образованием разлитой и обширной
гиперемии,
а так же увеличением размеров гнойного мешка до 3,0×3,0 см. и
повышением температуры тела кролика до 40,5 °С. Через 72 часа с момента
введения внутрикожно экспериментальным кроликам суспензий совместно
сокультивируемых штаммов бактерий родов Citrobacter spp.+Serratia spp. течение
инфекционного процесса приобрело ярко-выраженный характер, что привело к
гибели 2-х экспериментальных животных.
При внутрикожном введении суспензий 2 миллиардных культур при
вариациях Enterobacter spp.+E.coli, через 12 часов отмечалось повышение
температуры до 39,5°С, снижение активности, угнетение общего состояния
испытуемых животных, пассивность, развития очагов гиперемированного и
геморрагического отека, размерами 2,0×2,0 см., а так же с образованием гнойных
мешков с серозным содержимым, размерами 1,0×1,5, что сопровождалось в
дальнейшем с интенсивным развитием признаков ассоциированной инфекции,
образуя обширные гиперемированные зоны, размерами 3,0×3,0 см. Очаги
воспалительных фокусов через 24 часов составляли 3,0×3,5 см., становясь
красного цвета с последующим образованием мешка с обильным серозногемморрагическим экссудатом и гнойных мешков размерами 2,0×2,0 см., а так же
повышением температуры до 40°С; через 48 часов очаги увеличились до
размеров 4,0×4,0 см. с образованием разлитой и обширной гиперемии с
увеличением размеров гнойных мешков до 2,5×2,5 см. и повышением
температуры до 40,5°С. Через 72 часа, после введения суспензий совместно
159
культивируемых
штаммов
Enterobacter
характер
spp.+E.coli,
развития
инфекционного процесса не угасал и в течение последующих 12 часов
температура тела кроликов держалась в пределах от 40,5-41°С, что привело к
гибели одного из двух экспериментальных животных.
Развитие ассоциированной инфекции при внутрикожном введении 2
миллиардных суспензий совместно культивируемых вариаций
Citrobacter
spp.+E.coli показало, что через 12 часов, отмечалось повышение температуры
тела кроликов до 39,5°С, снижение активности кроликов, угнетенное общего
состояния,
пассивность,
развитие
на
месте
введения
суспензий
сокультивируемых Citrobacter spp.+E.coli очага гиперемированного участка и
отека, размерами 2,0×2,0 см., а так же с образованием мешка с серозным
содержимым
размерами
1,5×1,5,
что
сопровождалось
в
дальнейшем
с
образованием воспалительного очага обширной гиперемированной зоны. Очаг
воспалительного фокуса через 24 часа составлял 2,5×3,0 см., ярко красного цвета,
с обильным накоплением гемморрагического экссудата и образованием мешка
размерами 2,0×2,0 см., а так же повышением температуры тела до 40,5°С; через
48 часов с момента внутрикожного введения, гнойно-воспалительный очаг
увеличился до размеров 3,0×3,0 см. с образованием разлитой и обширной
гиперемии, а так же увеличением размеров гнойного мешка до 2,5 см. в диаметре
и повышением температуры до 40,5°С. Через 72 часа после введения суспензий
совместно
культивируемых
штаммов
Citrobacter
spp.+E.coli,
развитие
инфекционного процесса приобрело ярко выраженный характер (температура
тела кролика 40,5-41°С), что так же привело к гибели 1-го из 2-х
экспериментальных животных.
Аналогичные
результаты
были
получены
при
постановке
кожно-
некротической пробы на кроликах с сокультивируемыми вариациями: Serratia
spp.+E.coli, Proteus spp.+Enterobacter spp., Proteus spp.+Citrobacter spp., Proteus
spp.+Serratia spp., Proteus spp.+Е.coli (Фото 33).
160
Фото 33 - Гнoйно-некротическая рана в эксперименте при введении
сокультивируемой вариации Proteus spp.+Е.coli
Таким
образом,
полученные
результаты
исследования
кожно-
некротической способности монокультур энтеробактерий и их сокультивируемых
вариаций дают нам основания заключить, что бактерии родов Enterobacter spp.,
Citrobacter
spp.,
Serratia
spp.,
Е.coli,
Proteus
spp.
способны
вызывать
положительную кожнонекротическую пробу, которая значительно ярче и
интенсивней проявляется у суспензий их
сокультивируемых штаммов, что
возможно связано с взаимным индуцированием факторов патогенности при
сокультивировании этих микроорганизмов.
Исследования
по
изучению
кожно-некротической
способности
монокультур и сокультивируемых условно–патогенных энтеробактерий на
модели «изолированная петля тонкого кишечника кролика» были проведены
совместно
с
сотрудниками
кафедр
факультетской
хирургии
с
курсом
колопроктологии и микробиологии, вирусологии и иммунологии ГБОУ ВПО
«Башкирский
государственный
медицинский
университет»
Министерства
здравоохранения Российской Федерации (Комплксный подход профилактики и
лечения гнойно-воспалительных процессов, вызванных ассоциациями условно-
161
патогенных бактерий / Р.С. Суфияров, З.Г. Габидуллин, Р.З., М.В. Тимербулатов,
Ю.З. Габидуллин // Монография – Уфа, 2013г, 200с.).
3.4.5. Протистоцидная ативность
Проведенные тесты на экспериментальных животных (интраназальное
заражение белых мышей и «отек лап» мышей) показали, что эти исследования не
всегда выполнимы в условиях бактериологических лабораторий больниц,
особенно в условиях сельских клиник.
Некоторые исследователи для выявления способности условно-патогенных
энтеробактерий рекомендуют использовать протистоцидный тест [173], который
по мнению Габидуллина З.Г.(1990) позволяет оценить наличие не только токсина,
но и определить вирулентность энтеробактерий.
Исходя из этого, нами была сравнительно изучена токсигенность
монокультур Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., Е.coli, Proteus spp. и
их совместно культивируемых вариаций: Enterobacter spp., Citrobacter spp.,
Serratia spp., Е.coli, Proteus spp.: Enterobacter spp.+Citrobacter spp., Enterobacter
spp.+Serratia spp., Citrobacter spp.+Serratia spp, Enterobacter spp.+Е.coli, Citrobacter
spp.+Е.coli,
Serratia
spp.+Е.coli,
Proteus
spp.+Enterobacter
spp.,
Proteus
spp.+Citrobacter spp., Proteus spp.+Serratia spp., Proteus spp.+Е.coli, на модели
инфузорий туфелек [104].
При изучении на модели инфузорий туфелек токсических свойств моно- и
совместно культивируемых клинических штаммов Enterobacter spp., Citrobacter
spp., Serratia spp., Е.coli и Proteus spp. оказалось, что время гибели простейших
при воздействии на них моно- и совместно культивируемых изучаемых нами
микроорганизмов были не одинаковыми, и при добавлении суспензий более
вирулентных
культур,
движение
инфузорий
замедлялось
быстрее
или
прекращалось полностью. За поведением инфузорий наблюдали до и после
внесения суспензии монокультур Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp.,
Е.coli, Proteus spp. и их сокультивируемых вариаций: Enterobacter spp.+Citrobacter
spp., Enterobacter spp.+Serratia spp., Citrobacter spp.+Serratia spp, Enterobacter
162
spp.+Е.coli, Citrobacter spp.+Е.coli, Serratia spp.+Е.coli, Proteus spp.+Enterobacter
spp., Proteus spp.+Citrobacter spp., Proteus spp.+Serratia spp., Proteus spp.+Е.coli.
Бактериальные суспензии, которые вызывали в течение 30-90 секунд гибель
инфузорий, относили к первой высокотоксичной группе и отмечали в виде (+++);
культуры, которые вызывали гибель простейших в течение 1,5-3,5 минут,
относили ко второй группе, они продуцировали токсины средней активности
отмечали их в виде (++); культуры, которые вызывали гибель простейших в
течение 3,5-5,5 минут относили к третьей - слабой группе и отмечали в виде (+); и
культуры, которые не вызывали гибель простейших в течение 5,5 и более минут,
относили – к четвертой нетоксичной группе и отмечали в виде (-).
При воздействии на простейших суспензии 50 монокультур Enterobacter
spp. 10(20%) штаммов вызывали гибель инфузорий туфелек в течении от 30
секунд до 5,5 минут, из которых 4(40%) штамма вызывали гибель инфузорий в
течении 30-90 секунд, 4(40%) вызывали гибель инфузорий в течение 1,5-3,5
минут и 2(20%) вызывали гибель инфузорий в течение 3,5-5,5 минут, а 40(80%)
монокультур Enterobacter spp. не вызывали гибель простейших в течение 5,5 и
более минут; из 50 монокультур Citrobacter spp. 12(24%) штаммов вызывали
гибель инфузорий туфелек в течении от 30 секунд до 5,5 минут, из которых
3(25%) вызывали гибель инфузорий в течение 30-90 секунд, 3(25%) вызывали
гибель инфузорий в течение 1,5-3,5 минут и 6(50%) вызывали гибель инфузорий
в течение 3,5-5,5 минут, а 38(76%) штаммов не вызывали гибель простейших в
течение 5,5 и более минут; из 50 монокультур Serratia spp. 8(16%) штаммов
вызывали гибель инфузорий туфелек в течении от 30 секунд до 5,5 минут, из
которых 3(37,5%) штамма вызывали гибель инфузорий в течение 30-90 секунд,
1(12,5%) штамм в течение 1,5-3,5 минут, 4(50%) штамма вызывали гибель
простейших в течение 3,5-5,5 минут и 42(84%) штамма Serratia spp. не вызывали
гибель простейших в течение 5,5 и более минут; из 50 штаммов Е.coli 6(12%)
штаммов вызывали гибель инфузорий туфелек в течении от 30 секунд до 5,5
минут, из которых 1(16,6%) вызывал гибель инфузорий в течение 30-90 секунд,
1(16,6%) штамм вызывал гибель инфузорий в течение 1,5-3,5 минут и 4(66,6%)
163
штамма вызывали гибель инфузорий в течение 3,5-5,5 минут, а 44(88%) культуры
Е.coli не вызывали гибель простейших в течение 5,5 и более минут; из 50
монокультур Proteus spp. 12(24%) штаммов Proteus spp. вызывали гибель
инфузорий туфелек в течении от 30 секунд до 5,5 минут, среди которых 3(25%)
штамма вызывали гибель инфузорий в течение 30-90 секунд, 3(25%) вызывали
гибель инфузорий в течение 1,5-3,5 минут и 6(50%) штаммов вызывали гибель
инфузорий в течение 3,5-5,5 минут, а 38(76%) штаммов не вызывали гибель
простейших в течение 5,5 и более минут.
Тогда как изучение протистоцидной активности сокультивируемых
вариаций показало изменение протистоцидной активности при совместном
культивировании
условно-патогенных
энтеробактерий
и
были
получены
следующие результаты: из 10 вариаций Enterobacter spp.+Citrobacter spp. гибель
инфузорий туфелек в течение от 30 до 5,5 минут происходило в 7(70%) случаях,
из которых 3(42,8%) вариации вызывали гибель инфузорий в течении 30-90
секунд, 3(42,8%) вызывали гибель инфузорий в течении 1,5-3,5 минут и 1(14,2%)
вариация вызывала гибель инфузорий в течении 3,5-5,5 минут, а 3(30%) вариации
Enterobacter spp.+Citrobacter spp. не вызывали полного обездвиживания и гибели
инфузорий туфелек в течение 5,5 и более минут; при исследовании 10 вариаций
Enterobacter spp.+Serratia spp. гибель инфузорий туфелек происходила в 6(60%)
случаях в течение от 30 секунд до 5,5 минут, из которых 4(66,6%) вызывали
гибель инфузорий в течении 30-90 секунд, 1(16,6%) вариация вызывала гибель
инфузорий в течении 1,5-3,5 минут и 1(16,6%) вариация вызывала гибель
инфузорий в течении 3,5-5,5 минут, а 4(40%) не вызывали гибель простейших в
течение 5,5 и более минут; из 10 вариаций Citrobacter spp.+Serratia spp. гибель
инфузорий туфелек происходило в течение от 30 секунд до 5,5 минут в 8(80%)
случаях, из которых 3(37,5%) вариации Citrobacter spp.+Serratia spp. вызывали
гибель инфузорий в течении 30-90 секунд, 4(50%) вызывали гибель инфузорий в
течении 1,5-3,5 минут и 1(12,5%) вариация вызывала гибель инфузорий в течении
3,5-5,5 минут, а 2(20%) вариации Citrobacter spp.+Serratia spp. не вызывали
обездвиживание и гибель инфузорий туфелек в течение 5,5 и более минут; из 10
164
исследуемых вариаций Enterobacter spp.+E.coli гибель инфузорий туфелек в
течение от 30 секунд до 5,5 минут происходило у 4(40%) вариаций, из которых
2(50%) вызывали гибель инфузорий в течении 30-90 секунд, 1(25%) вариация
вызывала гибель инфузорий в течении 1,5-3,5 минут и 1(25%) вариация вызывала
гибель инфузорий в течении 3,5-5,5 минут, а 6(60%) вариаций Enterobacter
spp.+E.coli не вызывали полного обездвиживания и гибели инфузорий туфелек в
течение 5,5 и более минут;
из 10 вариаций Citrobacter spp.+E.coli гибель
инфузорий туфелек происходило в течение от 30 секунд до 5,5 минут у 5(50%)
вариаций, из которых 3(60%) вариации Citrobacter spp.+E.coli вызывали гибель
инфузорий в течении 30-90 секунд, 1(20%) вариация в течении 1,5-3,5 минут,
1(20%) вызывала гибель инфузорий в течении 3,5-5,5 минут и 5(50%) вариаций
не вызывали обездвиживания и гибель инфузорий туфелек в течение 5,5 и более
минут; из 10 сокультивируемых вариаций Serratia spp.+E.coli гибель инфузорий
туфелек происходило в 6(60%) случаях в течение от 30 секунд до 5,5 минут, из
которых 4(66,6%) вариации вызывали гибель инфузорий в течении 30-90 секунд,
1(16,6%) вариация вызывала гибель инфузорий в течении 1,5-3,5 минут и
1(16,6%) вариация вызывала гибель инфузорий в течении 3,5-5,5 минут, а 4(4%)
вариации не вызывали гибель инфузорий в течение 5,5 и более минут; при
исследовании вариаций Proteus spp.+Enterobacter spp. – 8(80%) вариаций
вызывали гибель инфузорий туфелек в течение от 30 секунд до 5,5 минут, из
которых 4(50%) вариации вызывали гибель инфузорий в течении 30-90 секунд,
3(37,5%) вызывали гибель инфузорий в течении 1,5-3,5 минут и 1(12,5%)
вариация вызывала гибель инфузорий в течении 3,5-5,5 минут, а 2(20%) вариации
Proteus spp.+Enterobacter spp. не вызывали обездвиживание и гибель инфузорий
туфелек в течение 5,5 минут и более; из 10 вариаций Proteus spp.+Citrobacter spp.
– 9(90%) вариаций вызывали гибель инфузорий туфелек в течение от 30 секунд
до 5,5 минут, из которых 5(55,5%) вариаций вызывали гибель инфузорий в
течении 30-90 секунд, 3(33,3%) вызывали гибель инфузорий в течении 1,5-3,5
минут и 1(11,1%) вариация вызывала гибель инфузорий в течении 3,5-5,5 минут,
а 1(10%) вариации Proteus spp.+ Citrobacter spp. не вызывала обездвиживание и
165
гибель инфузорий туфелек в течение 5,5 минут и более; а из 10 вариаций Proteus
spp.+Serratia spp. все 10(100%) вариаций вызывали гибель инфузорий туфелек в
течение от 30 секунд до 5,5 минут, из которых 5(50%) вариаций вызывали гибель
инфузорий в течении 30-90 секунд, 3(30%) вызывали гибель инфузорий в течении
1,5-3,5 минут и 2(11,1%) вариации в течении 3,5-5,5 минут; и из 10
сокультивируемых вариаций Proteus spp.+Е.coli – 9(90%) вариаций вызывали
гибель инфузорий туфелек в течение от 30 секунд до 5,5 минут, среди которых
6(66,6%) вариаций вызывали гибель инфузорий в течении 30-90 секунд, 2(22,2%)
вариации в течении 1,5-3,5 минут и 1(11,1%) вариация в течении 3,5-5,5 минут, и
1(10%) вариация не вызывала обездвиживание и гибель инфузорий туфелек в
течение 5,5 минут и более (Р<0,05).
Данные проведенных исследований протистоцидной активности моно- и
сокультивируемых штаммов изучаемых нами энтеробактерий показывают, что
более высокими значениями протистоцидной активности обладают суспензии
сокультивируемых бактерий Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., Е.coli,
Proteus spp., а именно вариации: Enterobacter spp.+Citrobacter spp., Enterobacter
spp.+Serratia spp., Citrobacter spp.+Serratia spp, Enterobacter spp.+Е.coli, Citrobacter
spp.+Е.coli,
Serratia
spp.+Е.coli,
Proteus
spp.+Enterobacter
spp.,
Proteus
spp.+Citrobacter spp., Proteus spp.+Serratia spp., Proteus spp.+Е.coli, чем их
монокультуры
(Р<0,001),
что
возможно
связано
с
более
выраженной
биологической активностью продукции токсических веществ, вырабатываемых
ассоциациями этих микроорганизмов.
Исследования по изучению протистоцидной активности монокультур и
сокультивируемых
условно–патогенных
энтеробактерий
были
проведены
совместно с сотрудниками кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии
ГБОУ
ВПО
Министерства
«Башкирский
государственный
здравоохранения
Российской
медицинский
Федерации
университет»
(Сравнительная
характеристика некоторых биологических свойств у бактерий Proteus и культур
Staphylococcus aureus, выделенных при гнойно-воспалительных заболеваниях у
больных, находящихся на стационарном лечении в онкологических отделениях и
166
республиканской клинической больнице Г.Г. Куватова г. Уфа. / З.Г.Габидуллин,
Н.Х.Насибуллин, Ю.З.Габидуллин, Р.С.Суфияров, Р.Р. Суфияров // Медицинский
вестник Башкортостана - 2008. №4. стр. 25-28.)
3.5. Устойчивость бактерий Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp.,
Е.coli, Proteus spp. и их совместно культивируемых вариаций: Enterobacter
spp.+Citrobacter spp., Enterobacter spp.+Serratia spp., Citrobacter spp.+Serratia
spp, Enterobacter spp.+Е.coli, Citrobacter spp.+Е.coli, Serratia spp.+Е.coli,
Proteus spp.+Enterobacter spp., Proteus spp.+Citrobacter spp., Proteus
spp.+Serratia spp., Proteus spp.+Е.coli к широко применяемым в практике
антибиотикам
Устойчивость условно-патогенных энтеробактерий к антибактериальным
препаратам является основной из причин, ограничивающая эффективность
лечения и долгое время считалось, что широкое распространение резистентности
характерно, в основном, для возбудителей моноинфекций. Кроме того в последние
годы,
некоторые
генетического
исследователи
обмена
с
мобильными
тревогой
отмечают
внехромосомными
интенсификацию
элементами
между
условно-патогенными энтеробактериями и циркуляцией клонов, содержащих
плазмиды множественной лекарственной устойчивости, нередко включающих
одновременно гены, контролирующие синтез известных факторов патогенности,
повышающих вирулентность циркулирующих штаммов [66].
В
связи
с
этим
нами
было
проведено
сравнительное
изучение
антибиотикочувствительности монокультур Enterobacter spp., Citrobacter spp.,
Serratia spp., Е.coli, Proteus spp. и их совместно культивируемых вариаций:
Enterobacter spp.+Citrobacter spp., Enterobacter spp.+Serratia spp., Citrobacter
spp.+Serratia
spp,
Enterobacter
spp.+Е.coli,
Citrobacter
spp.+Е.coli,
Serratia
spp.+Е.coli, Proteus spp.+Enterobacter spp., Proteus spp.+Citrobacter spp., Proteus
spp.+Serratia spp., Proteus spp.+Е.coli.
Определение
энтеробактерий
чувствительность
антибиотикочувствительности
проведено
к
49
методом
стандартных
антибиотикам,
в
условно-патогенных
дисков
частности
[201].
были
Изучали
использованы
антибиотики - ингибиторы синтеза и функций клеточной стенки (азлоцилин,
167
азтреонам,
ампициллин,
карбенециллин,
бензилпенициллин,
меропенем,
новобиоцин,
ванкомицин,
оксациллин,
имипенем,
пиперациллин,
стрептомицин, цефазолин, цефаклор, цефалексин, цефалотин, цефамандол,
цефиксим, цефипим, цефоперазон, цефотаксим, цефтазидим, цефтриаксон,
цефуроксим); ингибиторы синтеза и функций цитоплазматической мембраны
(азитромицин, полимиксин); ингибиторы синтеза белка на уровне рибосом
(доксициклин,
кларитромицин,
олеандомицин,
ристомицин,
клиндамицин,
левомецитин,
рокситромицин,
линкомицин,
тетрациклин,
фузидин,
эритромицин); ингибиторы синтеза нуклеиновых кислот (налидиксовая кислота,
офлоксацин, рифампицин, ципрофлоксацин); а так же антибиотики смешанного
механизма действия (амикацин, гентамицин, канамицин, неомецин, нетилмецин,
сизомицин, тобрамицин, фуродонин).
Изучение антибиотикочувствительности изучаемых нами микроорганизмов
проводили в соответствии с Инструкцией МЗ СССР 1984 года. При изучении
чувствительности к антибиотикам методом дисков монокультур Enterobacter spp.,
Citrobacter spp., Serratia spp., Е.coli, Proteus spp. и их совместно культивируемых
вариаций: Enterobacter spp.+Citrobacter spp., Enterobacter spp.+Serratia spp.,
Citrobacter spp.+Serratia spp, Enterobacter spp.+Е.coli, Citrobacter spp.+Е.coli, Serratia
spp.+Е.coli, Proteus spp.+Enterobacter spp., Proteus spp.+Citrobacter spp., Proteus
spp.+Serratia spp., Proteus spp.+Е.coli культуры считали высокочувствительными
при наличии зоны задержки роста 7-12мм. и более, умеренно чувствительными –
при наличии зоны задержки 2-7 мм. и культуры считали не чувствительными,
когда отсутствовала зона задержки или зона была менее 2 мм. и при этом все
культуры
по
чувствительности
к
антибиотикам
делили
на
3
группы:
чувствительные, умеренно чувствительные и не чувствительные.
Исследование антибиотикочувствительности монокультур Enterobacter spp.
показали, что штаммы Enterobacter spp. были чувствительными к азтреонаму,
меропенему,
неомецину,
нетилмецину,
офлоксацину,
пиперацилину,
рифампицину, фуродонину, цефазолину, цефалотину, цефиксиму, цефипиму,
цефоперазону, цефотаксиму, цефтазидиму, цефтриаксону, ципрофлоксацину. Были
168
умеренно чувствительны к действию амикацину, гентамицину, доксициклину,
канамицину, кларитромицину, цефатоксиму и были не чувствительны к действию
азитрамицину, азлоциллину, ампицилину, бензилпнициллину, ванкомицину,
карбенициллину, клиндамицину, левомицитину, линкомицину, налидиксовой
кислоте,
оксациллину,
рокситромицину,
олеандомицину,
сизомицину,
полимиксину,
стрептомицину,
ристомицину,
тетрациклину,
тобрамицину,
фузидину, фурагину, цефаклору, цефалексину, цефамандолу, цефуроксиму,
эритромицину.
Штаммы Citrobacter spp. были чувствительными к азтреонаму, амикацину,
ампицилину,
имипенаму,
карбенициллину,
клиндамицину,
левомецитину,
меропенему, налидиксовой кислоте, неомецину, нетилмецину, олеандомецину,
офлоксацину, пиперацилину, рокситромицину, стрептомецину, тобрамицину,
цефазолину, цефаклору, цефалексину, цефамандолу, цефиксиму, цефоперазону,
цефотаксиму, цефтазидиму, цефтриаксону, цефуроксиму, ципрофлоксацину. Были
умеренно
чувствительными
фуродонину,
цефалотину
к
и
азитромицину,
были
не
канамицину,
чувствительными
рифампицину,
к
азлоциллину,
бензилпнициллину, ванкомицину, гентамицину, доксициклину, кларитромицину,
линкомицину,
оксациллину,
полимексину,
ристомицину,
сизомицину,
тетрациклину, фузидину, цефипиму, эритромицину.
Штаммы Serratia spp. были чувствительными к азлоциллину, азтреонаму,
амикацину, гентамицину, имипенаму, канамицину, карбенициллину, меропенему,
налидиксовой кислоте, нетилмецину, офлоксацину, пиперацилину, рифампицину,
стрептомецину, тетрациклину, тобрамицину, фузидину, цефаклору, цефалотину,
цефамандолу,
цефтриаксону,
цефипиму,
цефоперазону,
ципрофлоксацину.
Штаммы
цефотаксиму,
Serratia
spp.
цефтазидиму,
были
умеренно
чувствительными к ванкомицину, доксициклину, клиндамицину, левомецитину,
неомецину, сизомицину, фуродонину и были не чувствительными к азитромицину,
ампициллину, бензилпенициллину, кларитромицину, линкомицину, оксациллину,
олеандомицину,
полимиксину,
ристомицину,
рокситромицину,
фурагину,
цефазолину, цефалексину, цефиксиму, цефипиму, цефуроксиму, эритромицину.
169
Исследование антибиотикочувствительности монокультур Е.coli показали,
что штаммы Е.coli были чувствительными к азитрамицину, азлоциллину,
ампицилину, бензилпнициллину, ванкомицину, имипенаму карбенициллину,
клиндамицину, левомицитину, линкомицину, налидиксовой кислоте, оксациллину,
олеандомицину,
полимиксину,
ристомицину,
рокситромицину,
сизомицину,
стрептомицину, тетрациклину, тобрамицину, фузидину, фурагину, цефаклору,
цефалексину, цефамандолу, цефуроксиму,. Были умеренно чувствительны к
действию амикацину, гентамицину, доксициклину, канамицину, кларитромицину,
цефатоксиму и были не чувствительны к действию азтреонаму, меропенему,
неомецину,
нетилмецину,
офлоксацину,
пиперацилину,
рифампицину,
фуродонину, цефазолину, цефалотину, цефиксиму, цефипиму, цефоперазону,
цефотаксиму, цефтазидиму, цефтриаксону, ципрофлоксацину.
Штаммы Proteus spp. были чувствительными к азлоциллину, азтреонаму,
амикацину, гентамицину, имипенаму, канамицину, карбенициллину, меропенему,
налидиксовой кислоте, нетилмецину, офлоксацину, пиперацилину, рифампицину,
стрептомецину, тетрациклину, тобрамицину, фузидину, цефаклору, цефалотину,
цефамандолу,
цефипиму,
цефтриаксону,
цефоперазону,
ципрофлоксацину.
цефотаксиму,
Штаммы
Proteus
цефтазидиму,
были
spp.
умеренно
чувствительными к ванкомицину, доксициклину, клиндамицину, левомецитину,
неомецину, сизомицину, фуродонину и были не чувствительными к азитромицину,
ампициллину, бензилпенициллину, кларитромицину, линкомицину, оксациллину,
олеандомицину,
полимиксину,
ристомицину,
рокситромицину,
фурагину,
цефазолину, цефалексину, цефиксиму, цефуроксиму, эритромицину.
А
исследование
антибиотикорезистентности
вариаций
совместно
культивируемых штаммов Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., Е.coli,
Proteus
spp.
в
вариациях:
Enterobacter
spp.+Citrobacter
spp.,
Enterobacter
spp.+Serratia spp., Citrobacter spp.+Serratia spp, Enterobacter spp.+Е.coli, Citrobacter
spp.+Е.coli,
Serratia
spp.+Е.coli,
Proteus
spp.+Enterobacter
spp.,
Proteus
spp.+Citrobacter spp., Proteus spp.+Serratia spp., Proteus spp.+Е.coli показало, что
происходило расширение спектра резистентности культур к вышеперечисленным
170
антибиотикам, так при вариациях Enterobacter spp.+Citrobacter spp. к 11
антибиотикам: в частности к амикацину, имипенаму, меропенему, нетилмецину,
олеандомецину,
цефтазидиму,
офлоксацину,
цефазолину,
ципрофлосацину,
были
цефиксиму,
умеренно
цефотаксиму,
чувствительны
к
8
антибактериальным препаратам: в частности к азтреонаму, доксициклину,
налидиксовой кислоте, неомицину, пиперацилину, цефамандолу, цефоперазону и
цефтриаксону, а к остальным 28 антибактериальным препаратам, культуры
совместно культивируемых вариаций Enterobacter spp.+Citrobacter spp. были не
чувствительными.
При исследовании чувствительности к антибиотикам вариаций Enterobacter
spp.+Serratia spp. были чувствительными к 12 из 49 антибиотика, в частности к
амикацину, имипенаму, меропенему, нетилмецину, офлоксацину, пиперацилину,
цефиксиму,
цефипиму,
цефотаксиму,
цефтазидиму,
цефтриаксону,
ципрофлосацину; были умеренно чувствительными к азитромицину, азтреонаму,
ампициллину, клиндамицину, налидиксовой кислоте, неомецину, рифампицину,
стрептомицину,
цефуроксиму,
фузидину,
к
сокультивируемых
цефазолину,
остальным
штаммов
35
цефалотину,
антибиотикам
Enterobacter
цефоперазону
вариации
spp.+Serratia
spp.
и
совместно
были
не
чувствительными.
При исследовании чувствительности вариаций Citrobacter spp.+Serratia spp.
были чувствительными к действию 10 из 49 антибактериальных препаратов, в
частности к амикацину, гентамицину, имипенаму, мерпенему, нетилмецину,
офлоксацину, пиперацилину, цефтазидиму, цефтриаксону, ципрофлосацину; были
умеренно чувствительными к 9 препаратам – азлоциллину, азтреонаму,
карбенициллину, налидиксовой кислоте, олеандомецину, рифампицину, фузидину,
цефалотину, цефамандолу, цефотоксиму, а к остальным 30 антибактериальным
препаратам были не чувствительными.
Исследование чувствительности к антибиотикам вариаций Enterobacter
spp.+Е.coli
показало,
что
так
же,
как
и
при
исследовании
других
сокультивируемых вариаций изучаемых нами микроорганизмов происходило
171
изменение параметров данного признака: вариации Enterobacter spp.+Е.coli были
чувствительными к действию 13 из 49 антибактериальных препаратов, в частности
в частности к амикацину, ампициллину, гентамицину, имипенаму, мерпенему,
нетилмецину,
офлоксацину,
пиперацилину,
цефтазидиму,
цефтриаксону,
ципрофлосацину; были умеренно чувствительными к азлоциллину, азтреонаму, а к
остальным 36 антибактериальным препаратам были не чувствительными.
При исследовании чувствительности к антибиотикам вариаций Citrobacter
spp.+Е.coli – были чувствительными к действию 11 антибиотиков: в частности
амикацина, имипенама, меропенема, нетилмецина, олеандомецина, офлоксацина,
цефазолина, цефиксима, цефотаксима, цефтазидима, ципрофлосацина, были
умеренно чувствительны к действию 8 препаратов: в частности к азтреонаму,
доксициклину, налидиксовой кислоте, неомицину, пиперацилину, цефамандолу,
цефоперазону и цефтриаксону, а к остальным 28 антибактериальным препаратам
вариации Citrobacter spp.+Е.coli были не чувствительны.
Так исследование вариаций Serratia spp.+Е.coli показало, что они были
чувствительны к 11 антибиотикам: в частности к амикацину, имипенаму,
меропенему, нетилмецину, олеандомецину, офлоксацину, цефазолину, цефиксиму,
цефотаксиму, цефтазидиму, ципрофлосацину, были умеренно чувствительны к 8
антибактериальным препаратам: в частности к азтреонаму, доксициклину,
налидиксовой кислоте, неомицину, пиперацилину, цефамандолу, цефоперазону и
цефтриаксону, а к остальным 28 антибактериальным препаратам, вариации Serratia
spp.+Е.coli были не чувствительными.
При
изучении
антибиотикочувствительности
вариаций
Proteus
spp.+Enterobacter spp., так же было выявлено снижение чувствительности к
вышеперечисленным антибиотикам: к 11 антибиотикам, в частности к амикацину,
имипенаму, меропенему, нетилмецину, олеандомецину, офлоксацину, цефазолину,
цефиксиму,
цефотаксиму,
цефтазидиму,
ципрофлосацину,
были
умеренно
чувствительны к 8 антибактериальным препаратам: в частности к азтреонаму,
доксициклину, налидиксовой кислоте, неомицину, пиперацилину, цефамандолу,
172
цефоперазону и цефтриаксону, а к остальным 28 антибактериальным препаратам
вариации Proteus spp.+Enterobacter spp. были не чувствительными.
При исследовании чувствительности вариаций Proteus spp.+Citrobacter spp.
были чувствительными к действию 10 из 49 антибактериальных препаратов, в
частности к амикацину, гентамицину, имипенаму, мерпенему, нетилмецину,
офлоксацину, пиперацилину, цефтазидиму, цефтриаксону, ципрофлосацину; были
умеренно чувствительными к 9 препаратам–
азлоциллину, азтреонаму,
карбенициллину, налидиксовой кислоте, олеандомецину, рифампицину, фузидину,
цефалотину, цефамандолу, цефотоксиму, а к остальным 30 антибактериальным
препаратам были не чувствительными.
Исследование чувствительности к антибиотикам вариаций Proteus spp.+
Serratia spp. показало, что были чувствительными к действию 10 из 49
антибактериальных
препаратов,
в
частности
к
амикацину,
гентамицину,
имипенаму, мерпенему, нетилмецину, офлоксацину, пиперацилину, цефтазидиму,
цефтриаксону,
препаратам
ципрофлосацину;
–
олеандомецину,
азтреонаму,
рифампицину,
были
умеренно
карбенициллину,
фузидину,
чувствительными
налидиксовой
цефалотину,
к
10
кислоте,
цефамандолу,
цефотоксиму, а к остальным 29 антибактериальным препаратам были не
чувствительными.
При изучении антибиотикочувствительности вариаций Proteus spp.+Е.coli,
так же было выявлено снижение чувствительности к вышеперечисленным
антибиотикам: к 11 антибиотикам, в частности к амикацину, имипенаму,
меропенему, нетилмецину, олеандомецину, офлоксацину, цефазолину, цефиксиму,
цефотаксиму, цефтазидиму, ципрофлосацину, были умеренно чувствительны к 8
антибактериальным препаратам: в частности к азтреонаму, доксициклину,
налидиксовой кислоте, неомицину, пиперацилину, цефамандолу, цефоперазону и
цефтриаксону, а к остальным 28 антибактериальным препаратам вариации Proteus
spp.+Е.coli были не чувствительными (Р<0,05). И анализ полученных результатов
показал, что сокультивируемые вариации наиболее чаще были чувствительны к
антибиотикам смешанного механизма действия.
173
В
дальнейшем
изучали
возможность
трансконьюгативной
передачи
множественной лекарственной усточивости к широко применяемых в практике
антибиотиков, между бактериями Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp.,
Е.coli, Proteus spp., и от бактерий родов Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia
E. coli K12G62RifR. При этом у
spp., Е.coli, Proteus к универсальному реципиенту
50%
и
более
трансконьюгатов
коньюгационную
передачу
сокультивируемых
реципиентам
вариаций
устойчивости
к
обнаружили
левомицетину,
ампициллину, стрептомицину, неомицину и мономицину. При этом частота
передачи
устойчивости
к
вышеперечисленным
антибиотикам
оказалась
относительно низкой 5x10-8 – 5x10-9. Коньюгационная передача устойчивости к
вышеперечисленным антибиотикам от доноров к универсальному реципиенту E.
coli K12G62RifR обнаружена у 50% и более сокультивируемых вариаций. При этом
частота
образования
антибиотикорезистентных
трансконьюгантов
между
бактериями родов Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., Proteus spp. и E.
coli K12G62RifR по сравнению с межродовыми вариациями была значительно ниже,
и составляла не более 2 x 10-9, что свидетельствовало о меньшей компетентности
реципиентов бактерий Citrobacter spp., Serratia spp., Proteus spp., нежели культуры
E.
coli.
При
этом
необходимо
отметить,
что
частота
образования
лекарственноустойчивых трансконьюгантов зависела от времени контакта,
условий культивирования. Полученные трансконьюганты были способны к
передаче маркеров резистентности к реципиенту, не отличающиеся по частоте
передачи от родительских культур.
Таким образом, результаты данного раздела исследований дают нам
основание заключить, что при совместном культивировании бактерий Enterobacter
spp., Citrobacter spp., Serratia spp., Е.coli, Proteus spp. происходит расширение
спектра устойчивости к антибактериальным препаратам, чем у их монокультур,
что возможно связано с обменом мобильных внехромосомных элементов (Rплазмид) между клонами вариаций изучаемых нами микроорганизмов.
Исследования
трансконьюгативной
по
передачи
изучению
множественной
антибиотикочувствительности,
лекарственной
устойчивости
174
монокультур и сокультивируемых условно–патогенных энтеробактерий были
проведены совместно с сотрудниками кафедры микробиологии, вирусологии и
иммунологии, факультетской хирургии с курсом колопроктологии ГБОУ ВПО
«Башкирский
государственный
медицинский
университет»
Министерства
здравоохранения Российской Федерации (Условно-патогенные энтеробактерии.
Пособие для врачей-бактериологов и клинических лаборантов. / З.Г. Габидуллин,
Т.А. Савченко, М.М. Алсынбаев, М.М. Туйгунов, А.К. Булгаков, Г.К. Давлетшина,
А.А. Ахтариева, Ю.З. Габидуллин, Р.З. Саляхов // Уфа - 2009г.; Лечение гнойновосполительных заболеваний мягких тканей протейно-энтеробакторной природы /
З.Г. Габидуллин, В.М. Изикаев, Г.А. Идиатуллина, В.Г. Туйгунова, Р.Ф. Насырова,
Р.Р.Суфияров, Н.Н.Гибазов, Ю.З.Габидуллин, Р.Р. Суфияров, М.В. Тимербулатов,
Р.С. Суфияров, А.А. Ахтариева // Медицинский вестник Башкортостана - 2011г.,
№6 стр.94-98.).
3.6. Профиль плазмидной ДНК монокультур Enterobacter spp., Citrobacter
spp., Serratia spp., E.coli, Proteus spp. и их сокультивируемых вариаций:
Enterobacter spp.+Citrobacter spp., Enterobacter spp.+Serratia spp., Citrobacter
spp.+Serratia spp, Enterobacter spp.+Е.coli, Citrobacter spp.+Е.coli, Serratia
spp.+Е.coli, Proteus spp.+Enterobacter spp., Proteus spp.+Citrobacter spp.,
Proteus spp.+Serratia spp., Proteus spp.+Е.coli.
Исследования последних лет показывают, что популяционно-генетическая
изменчивость у микроорганизмов связана с изменениями в десятках и сотнях
полиморфных локусов и сайтов [173,174].
Возможность изменения структуры бактериальной ДНК в процессе
жизнедеятельности
микроорганизмов
не
вызывает
сомнения.
Указанное
одновременно подразумевает изменчивость ДНК в бактериальных популяциях в
целом, что обуславливает актуальность изучения этого процесса с теоретических
позиций, поскольку позволяет понять генетическую структуру популяции и
филогенетические отношения между различными штаммами, родами, видами
микробов. Очевидно, что это в равной степени важно и касательно генетических
175
детерминированных изменений патогенности микроорганизмов, значимых в
инфекционной патологии человека.
С учетом
вышеизложенного, мы провели ряд исследований по
обнаружению хромосомных и внехромосомных элементов, детерминирующих
факторы патогенности монокультур Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia
spp., Е.coli, Proteus spp. и их сокультивируемых вариаций: Enterobacter
spp.+Citrobacter spp., Enterobacter spp.+Serratia spp., Citrobacter spp.+Serratia spp,
Enterobacter spp.+Е.coli, Citrobacter spp.+Е.coli, Serratia spp.+Е.coli, Proteus
spp.+Enterobacter spp., Proteus spp.+Citrobacter spp., Proteus spp.+Serratia spp.,
Proteus spp.+Е.coli, а так же был изучен профиль их плазмидной ДНК.
В первой серии опытов мы проводили изучение профиля плазмидной ДНК
монокультур Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., E.coli, Proteus spp. и
их способность давать MS и MR реакции гемагглютинации с эритроцитами
цыпленка (Габидуллин З.Г. и соавт., А.С. № 1312098, 1987) [97].
Для этого брали 23 штамма Enterobacter spp., дающих MS и MR
положительную реакции гемагглютинации с эритроцитами цыпленка и изучали
их профиль плазмидной ДНК. При этом 11 штаммов Enterobacter spp. оказались
бесплазмидными, 12 штаммов–несли плазмиды молекулярной массы 40 МД, 60 и
120 МД, среди которых 4 штамма Enterobacter spp. несли плазмиды молекулярной
массы 60 МД, 3 штамма – плазмиды молекулярной массы 40 и 120 МД и 5
штаммов – плазмиды молекулярной массы 120МД. В дальнейшем путем
культивирования их в бульоне Хоттингера, содержащий 5% концентрацию
додецилсульфата натрия или 80-100 мкг/мл бромистого этидия, проводили
элиминацию плазмид. При этом изогенные пары штаммов бактерий родов
Enterobacter spp. в одинаковой степени проявляли MS и MR реакции
гемагглютинации с эритроцитами цыпленка.
Наши попытки в опытах прямой передачи плазмид, осуществить передачу
между штаммами Enterobacter spp. детерминанты контролирующей реакцию
гемагглютинации с эритроцитами цыпленка не увенчались успехом.
176
В дальнейшем путем культивирования штаммов Citrobacter spp. дающих
MS и MR реакции гемагглютинации с эритроцитами цыпленка и несущих
плазмиды массой 120,60,40 МД, в бульоне Хоттингера содержащем 5% SDS или
75 мкг/мл акридин оранжевого проводили элиминацию плазмид. При этом
изогенные пары штаммов Citrobacter spp. в одинаковой степени проявляли MS и
MR реакции гемагглютинации с эритроцитами цыпленка.
В следующей серии опытов, мы попытались выяснить роль плазмид в
способности бактерий рода Serratia spp. давать МS и МR гемагглютинации.
Для этого отобрали 16 культур Serratia spp. с высокой адгезивной
активностью и изучали профиль их плазмидной ДНК. При этом 8 штаммов
бактерий рода Serratia spp. оказались несущими плазмиды. Молекулярные массы
плазмид значительно различались. Так электрофаретически было установлено,
что Serratia spp. могут нести плазмиды массой от 19 до 120 МД. В качестве
контроля использовали штамм S. macescens ГИСК № 268, несущий плазмиду
массой 120 МД, обладающий свойством давать МS и МR гемагглютинации с
эритроцитами цыпленка и его изогенный бесплазмидный вариант. При этом у
изученных культур Serratia spp. не выявлено наличие какой-либо разницы в их
способности давать реакции гемагглютинации с эритроцитами цыпленка. В
дальнейшем подбирали штаммы Serratia spp. несущие плазмиду молекулярной
массы
60
МД,
дающие
положительную
реакцию
гемагглютинации
и
элиминировании плазмиды при их культивировании в бульоне Хоттингера
содержащий 5 % додецилсульфат натрия или 75 мкг/мл акридин оранжевого.
Изогенные пары штаммов Serratia spp. в одинаковой степени проявляли МS и
МR гемагглютинации с эритроцитами цыпленка независимо от наличия у
бактерий плазмид. Аналогично, изучение адгезивной активности изогенных пар
штаммов S. macescens ГИСК № 268 отличающих по наличию плазмиды 120 МД,
не позволило выявить какую-либо разницу в их способности давать реакции
гемагглютинации.
177
Рисунок 34 - Электрофореграмма плазмид различной молекулярной массы
штаммов обладающих МS и MR реакцией гемагглютинации.
Адгезивность штаммов E.coli, выделенных при различных инфекциях, была
так же нами изучена в реакции гемагглютинации с использованием эритроцитов
цыпленка (Габидуллин З.Г. и соавт. Авторское свидетельство №1312098, 1987)
[97]. Мы отобрали штаммы E.coli, обладающие МS и МR гемагглютинирующей
активностью, и изучали профиль их плазмидной ДНК. Для оценки зависимости
адгезивной активности от наличия плазмид у адгезивных штаммов бактерий
провели следующую серию опытов со штаммами, имеющими плазмиды. путем
культивирования их в бульоне Хоттингера, содержащем различные концентрации
додецилсульфата
натрия
(0,2-5%),
проводили
элиминирование
плазмид.
Тестирование изогенных пар штаммов E.coli, не несущих плазмиды, на их
способность давать МS- и МR-реакции гемагглютинации с эритроцитами
цыпленка показало, что штаммы E.coli в одинаковой степени агглютинируют
эритроциты цыпленка.
В следующей серии опытов мы попытались выяснить природу генетической
детерминанты, контролирующей адгезивность Proteus. Для выяснения природы
генетической детерминанты,
контролирующей адгезивную активность Proteus,
был изучен профиль плазмидной ДНК у 43 штаммов, обладающих положительной
Д-маннозочувствительной и Д-маннозорезистентной реакцией гемагглютинации.
178
При этом 20 штаммов оказались бесплазмидными, 5 - несли плазмиды мол. массы
40 и 60 мДа, 3 - плазмиды мол. массы 40 и 120 мДа и 15 - плазмиды мол. массы 120
мДа. На 14 штаммах, обладающих высокой адгезивной активностью (№№132,
183, 4701, 290, 2731, 2316, 2365, 2936, 6, 36, 1503, 1280, 1380, 1118) была
исследована связь адгезии с наличием выявляемых плазмид. В качестве контроля
использовали штамм Rts-1 P. vulgaris, несущий плазмиду массой 120 мДа, дающий
положительную Д-маннозочувствительную и Д-маннозорезистентную реакцию
гемагглютинации
с
эритроцитами
цыпленка,
а
также
его
изогенные
бесплазмидные клоны. Проведенные исследования не позволили выявить наличие
какой-либо зависимости в способности культур протеев давать реакцию
гемагглютинации с наличием плазмид (рис. 34).
В следующей серии опытов мы подбирали штаммы, несущие плазмиды
мол.массой 40, 60 мДа, которые давали положительную реакцию гемагглютинации
с эритроцитами цыпленка (МS и MR) и путем культивирования их а бульоне
Хоттингера, содержащем 5% додецилсудьфата натрия или 80-100 мкг/мл
бромистого этидия проводили элиминирование плазмид. При этом изогенные пары
штаммов в одинаковой степени проявляли Д-маннозочувствительную и Дманнозорезистентную реакцию гемагглютинации с эритроцитами цыпленка. Также
не
было
обнаружено
каких-либо
различий
в
адгезивной
плазмидосодержащих и бесплазмидных клонов штамма P. vulgaris Rts1.
активности
179
1 2 3 4 5 6 7 8 9 101112 13 1415
Рисунок 35 - Электрофореграмма профиля плазмидной ДНК штаммов
протеев дающих положительную MS- и MR- реакции гемагглютинации и их
изогенных пар.
Изучение роящихся (№№290, 2731, 29, 34, 35), нестабильно нероящиеся
(№№290а, 2731а, 29а, 34а, 35а) форм, несущих плазмиду массой 120 мДа и их
стабильно нероящихся бесплазмидных мутантов (№№290-41, 2731-41, 29-41)
также не выявило существенных различий в их способности давать реакцию
гемагглютинации с эритроцитами цыпленка (Рис. 35).
Наши попытки в опытах прямой передачи плазмид и тройного скрещивания
осуществить передачу между штаммами протеев детерминанта, контролирующего
реакцию гемагглютинации с эритроцитами цыпленка не увенчались успехом.
Полученные результаты дают нам основание полагать, что генетической
детерминантой,
контролирующей
Д-маннозочувствительную
и
Д-
маннозорезистентную реакцию гемагглютинации с эритроцитами цыпленка
штаммов Proteus spp., вероятно являются структурные элементы хромосомной
природы.
Обобщая результаты данного раздела наших исследований можно полагать,
что
генетической
детерминантой,
контролирующей
МS
и
МR
реакцию
180
гемагглютинации с эритроцитами цыпленка у штаммов Enterobacter spp.,
Citrobacter spp., Serratia spp., E.coli и Proteus spp., возможно являются структурные
элементы хромосомной природы. Наши попытки в опытах прямой передачи
плазмид между штаммами Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., E.coli,
Proteus spp. детерминанты, контролирующеей реакцию гемагглютинации с
эритроцитами цыпленка не увенчались успехом.
Некоторыми исследователями показано, что продукция ЛТ-энтеротоксина
у ЭТКП, детерминируется Ent-плазмидами, молекулярная масса которых
колеблется от 55 до 61 МД и принадлежит к группе несовместимости. В то же
время энтеротоксин холерного вибриона иммунологически родственен к ЛТэнтеротоксину ЭТКП, который контролируется структурными элементами
хромосомной природы [230]. Однако, природа генетического детерминанта,
ответственного за синтез холероподобного энтеротоксина у монокультур
штаммов Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., E.coli, Proteus spp.
изучена недостаточно.
Исходя из этого, мы попытались выяснить природу генетической
детерминанты, контролирующей у монокультур штаммов Enterobacter spp.,
Citrobacter spp., Serratia spp., E.coli, Proteus spp. продукцию ЛТ-энтеротоксина.
Для этого брали 2 группы штаммов Enterobacter spp. и изучали профиль их
плазмидной ДНК. Первую группу составили 6 штаммов Enterobacter spp.
продуцирующие высокоактивный ЛТ-энтеротоксин, вызывавшие отек лап мышей
75 мг. и более, вторую – культуры, не продуцирующие ЛТ-энтеротоксин и
вызывавшие отек лап не более 35 мг. При этом 3 штамма Enterobacter spp.
продуцирующие высокоактивный ЛТ-энтеротоксин (вызывающие отек лап 90 и
более мг.), все оказались несущими плазмиду массой 60МД. У 27 штаммов
Enterobacter spp. второй группы не была выявлена плазмида массой 60МД. В
дальнейшем брали все 3 штамма, несущие плазмиды массой 60МД и
продуцирующие высокоактивный ЛТ-энтеротосин и путем их культивирования в
бульоне Хоттингера, содержащий 5% концентрацию додецилсульфата натрия или
75 мкг/мл акридин оранжевого, проводили элиминацию плазмид и у клонов,
181
утративших свойство продуцировать ЛТ-энеротоксин, изучали профиль их
плазмидной ДНК. Из 100 клонов каждого штамма Enterobacter spp., утративших
свойство продуцировать ЛТ-энтеротоксин у двух клонов (иногда у трех и не
более), на фореграмме просматривалась плазмида массой 60МД, остальные
клоны Enterobacter spp. оказались не несущими данной плазмиды.
В дальнейшем изучали возможность коньюгативной передачи Ent-плазмиды
между Enterobacter spp., для чего брали в качестве донора № 25 E.aerogenes (Ent+,
CmR, tetS) и реципиента № 962 E.aerogenes (Ent-, CmS, tetR). Приготовили
селективную среду, содержащую 100 мкг/мл левомицитина и тетрациклина 100
мкг/мл. Полученные трансконьюгаты в 50% и более случаях, были способны
давать отек лап более 75 мг. и на фореграмме просматривалась плазмида массой
60 МД. Исходя из этого, можно предположить, что генетическим детерминантом
контролирующим у Enterobacter spp. продукцию ЛТ-энтеротоксина, возможно,
является коньюгативная плазмида массой 60 МД, выявляемая у ряда штаммов
Enterobacter spp., вызывающая «отек лап мышей» более 75 мг.
Рисунок 36 - Электрофореграмма монокультур продуцирующих ЛТэнтеротоксин. Количество клонов несущих плазмиды массой 60 МД.
значительно меньше чем у сокультивируемых вариаций.
Для выяснения природы генетической детерминанты Citrobacter spp.,
контролирующей синтез ЛT-энтеротоксина, так же брали две группы штаммов и
изучали профиль их плазмидной ДНК. Первую группу составляли 5 штаммов
Citrobacter spp. продуцирующие ЛT-энтеротоксин высокой активности (75-120
мг.), вторую – 52 штамма не продуцирующие ЛT-энтеротоксин и вызывающие
«отек лап» не более 35 мг. Из 5 штаммов Citrobacter spp. продуцирующих ЛTэнтеротоксин высокой активности, 4 штамма оказались несущими плазмиду
массой 60МД. У штаммов второй группы не была выявлена плазмида массой 60
182
МД. В дальнейшем отобрали 4 штамма Citrobacter spp. несущих плазмиду массой
60МД
и
продуцирующих
высокоактивный
ЛТ-энтеротоксин.
Путем
культивирования их в бульоне Хоттингера, содержащий 5% концентрации
додецилсульфата натрия или 75 мкг/мл акридин оранжевого, проводили
элиминацию плазмид массой 60 МД и у клонов, утративших свойство
продуцировать
высокоактивный
ЛТ-энтеротоксин,
изучали
профиль
их
плазмидной ДНК. У штаммов Citrobacter spp. утративших свойство продуцировать
ЛТ-энтеротоксин, у (двух, трех, четырех и не более) из 50 клонов на фореграмме
просматривалась плазмида массой 60 МД, а остальные изогенные клоны
Citrobacter spp. оказались не несущими данной плазмиды.
В дальнейшем изучали возможность коньюгативной передачи Entплазмиды между Citrobacter spp.. Для чего брали в качестве донора C. diversus №
885 (Ent+, CmR, MonS) и реципиента C. freundii № 904 (Ent-, CmS, MonR)
Приготовили селективную среду содержащую 300 мкг/мл мономицина и
левомецитина в концентрации 100 мкг/мл. Полученные трансконьюгаты имели
плазмиду массой 60 МД и были способными давать «отек лап» 95 мг. и более.
Для выявления природы генетической детерминанты, контролирующей
синтез ЛТ-энтеротоксина бактерий рода Serratia spp., брали две группы штаммов
Serratia spp. и проводили изучение профиля их плазмидной ДНК. Первую группу
составили 8 штаммов Serratia spp. продуцирующие высокоактивный ЛТэнтеротоксин, которые вызывали «отек лапки» от 65 мг. и более, вторую – 10
штаммов, не продуцирующие ЛТ-энтеротоксин и вызывающий «отек лапки» не
более 35 мг. Из 8 штаммов Serratia spp. продуцентов ЛТ-энтеротоксина, 5оказались несущими плазмиду массой 60 МД, а у клонов 10 штаммов второй
группы не была выявлена плазмида массой 60 МД. В дальнейшем с целью
конкретизации роли плазмид в продукции ЛТ-энтеротоксина, нами была
проведена элиминация плазмиды массой 60 МД.
(3 % SDS или 75 мкг/мл
акридин оранжевого) и проводили изучение профиля плазмидной ДНК и
способности изогенных пар штаммов бактерий рода Serratia spp. вызывать отек
лап мышей. При этом изогенные пары клонов утративших плазмиду массой
183
60МД. давали отек лап мышей не более 35 мг., что дополнительно указывало на
возможную
роль плазмиды
массой
60
МД.
в детерминировании
ЛТ-
энтеротоксина бактерий Serratia spp.
В следующей серии опытов изучали возможность коньюгативной передачи
Ent-плазмиды между Serratia spp. В качестве селективной среды использовали 2%
мясопептонный агар, содержащий 100 мкг/мл левомицитина и 300 мкг/мл
ампицилина. Полученные трансконьюгаты были способны давать «отек лап» 75
мг. и более и на фореграмме просматривалась плазмида массой 60 МД.
Рядом
авторов
показано,
что
синтез
LT-энтеротоксина
у
E.coli
детерминируются Ent-плазмидами, молекулярная масса которых колеблется от 55
до 61 МД. В то же время энтеротоксин холерного вибриона, иммунологически
родственный LT-энтеротоксину E.coli, детерминируется структурными генами
хромосомной природы [95].
Исходя из этого, мы попытались выяснить природу генетической
детерминанты, контролирующей у штаммов E.coli продукцию LT-энтеротоксина.
Для изучения данного признака были отобраны 2 группы штаммов E.coli:
первую
группу
составили
штаммы
суперпродуценты
LT-энтеротоксина,
способные вызывать «отек лап» мышей 95 мг. и более, а вторую – культуры
E.coli, не продуцирующие LT-энтеротоксин и в опытах “отек лапки” белых
мышей разницу давали не более 35 мг. Изучали профиль их плазмидной ДНК. Из
6 изученных штаммов E.coli первой группы, 4 (173, 587, 581, 165) штамма
оказались несущими плазмиды массой 60 МД, 1 штамм (26) – 60 и 3,2 МД и 1
штамм (123) – 60, 40 и 1,4 МД. Среди 4 штаммов второй группы (611, 769, 795,
843) 2 культуры были, несущими плазмиды массой 38 МД и 2 – бесплазмидными
(рис. 16).
Опыты по элиминированию плазмид путем культивирования в бульоне
Хоттингера
с
додецилсульфатом
натрия
(0,2-5%)
у
штаммов
E.coli,
продуцирующих высокоактивный LT-энтеротоксин у двух на электрофореграмме
просматривалась плазмида массой 60 МД, остальные клоны оказались не
несущими данной плазмиды и не давали положительные тесты в биологических
184
пробах. В дальнейшем изучали возможность коньюгативной передачи Entплазмиды между штаммами бактерий E.coli и от E.coli к E.coli К12 G62 RifR. Для
чего в качестве донора брали штамм №587 E.coli (Ent+, StrR, AmpS) и реципиента
№ 256 E.coli (Ent-, StrS, AmpR). У штаммов изучали резистограмму и на основе
этого готовили селективную среду, содержащую 300 мкг/мл мономицина и 500
мкг/мл стрептомицина. Полученные транконьюгаты давали рост в селективной
среде и были способны вызывать «отек лапки» у мышей с разницей 95 мг. и
более.
Анализ профиля плазмидной ДНК показал, что из 48 трансконьюгатов
E.coli – 35 обладали плазмидой массой 60 МД, которые одновременно давали
положительный тест «отек лап» у мышей с разницей 95 мг.
В дальнейшем мы попытались выяснить генетическую природу признака,
контролирующего у Proteus spp. продукцию LТ-энтеротоксина. У штаммов двух
групп изучили профиль их плазмидной ДНК. Первую группу составляли штаммы
- суперпродуценты LТ-энтеротоксина, вызывающие "отек лап" мышей до 95 мг и
более, вторую - культуры, не продуцирующие LТ-энтеротоксин и вызывающие
"отек лап" не более 35 мг. Из 5 штаммов первой группы (№№132, 183, 423, 151,
1284), три (№№132, 183, 423) оказались несущими 2 плазмиды мол. массой 60 и
120 мДа и 2 штамма (№№151, 1234) – 1 плазмиду мол. массой 120 мДа. Среди 7
штаммов второй группы (№№737, 73, 4477, 2779, 7, 35, 102) не было выявлено
культур несущих плазмиду массой 60 мДа, и лишь у штаммов № 2779 и № 7
были обнаружены по 10 клонов, несущих плазмиду мол. массой 120 мДа. В
последующем
были
отобраны
штаммы,
обладающие
плазмидами
и
продуцирующие высокоактивный LТ-энтеротоксин (132, 183, 423, 151, 1234).
Путем культивирования в бульоне Хоттингера, содержащем 5% додецилсульфата
натрия или 80-100 мкг/мл бромистого этидия, проводили элиминацию плазмид у
клонов (не менее 50), утративших свойство продуцировать LТ-энтеротоксин, с
последующим изучением профиля плазмидной ДНК. Из 50 клонов каждого
штамма, утративших свойство продуцировать LТ-энтеротоксин, у двух на
фореграмме просматривалась плазмида массой 60 мДа. С целью исключения
185
роли других плазмид в продукции LТ-энтеротоксина отбирали штаммы, несущие
плазмиды массой 120, 40 и 10 мДа и изучали способность центрифугата 18-20
часовой бульонной культуры вызывать "отек лап" мышей. Из взятых в опыт 15
штаммов 3 вызывали "отек лап" мышей до 45-65 мг, 5 - до 35-49 мг и 7 - не более
25 мг, что является дополнительным подтверждением роли плазмиды с мол.
массой 60 мДа в продукции бактериями рода Proteus LТ-энтеротоксина.
Результаты данного раздела проведенных исследований дают нам основание
полагать, что
генетической
детерминантой, контролирующей
у штаммов
Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., E.coli и Proteus spp. продукцию LTэнтеротоксина, является коньюгативная плазмида массой 60 МД. выявляемая
только у штаммов, вызывающих отек лап более 95 мг.
Данные литературы показывают, что бактерии Enterobacter spp., Citrobacter
spp.. Serratia spp., E.coli, Proteus spp. обладают α-гемолитической активностью,
однако природа генетического контроля продукции α-гемолизина у штаммов
Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., E.coli и Proteus spp. остается не до
конца выясненной. В связи с этим мы попытались выяснить природу
генетической детерминанты, контролирующий продукцию α-гемолизина у
штаммов Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., E.coli и Proteus spp.
Исследование проводили на 12 штаммах Enterobacter spp. обладающих αгемолитической активностью и 12 штаммов не способных продуцировать
α-
гемолизин. В качестве эталонного использовали штамм Р.vulgaris Rts – 1,
обладающий α-гемолитической активностью и несущий плазмиду с массой 120
МД. Результаты исследований показали, что среди клонов 10 штаммов
Enterobacter spp., обладающих α-гемолитической активностью, у части клонов 8
штаммов Enterobacter spp. обнаружили плазмиду с молекулярной массой 120
МД, что указывало на возможную роль данной плазмиды в продукции αгемолизина.
В
следующей
серии
опытов,
брали
штаммы
Enterobacter
spp.
продуцирующие α-гемолизин и культивировали их в бульоне Хоттингера (рН 7,47,6), содержащем 75 мкг/мл акридин оранжевого при 37°С в течение 38 часов для
186
элиминации у бактерий плазмид массой 120 МД и у клонов изучали профиль их
плазмидной ДНК. При этом большинство клонов (60 из 100) 6 штаммов
Enterobacter spp. потеряли свойство продуцировать α-гемолизин и у них на
фореграмме не просматривалась плазмида массой 120 МД., а клоны (40, 50 из
100) 2 культур продолжали продуцировать α-гемолизин.
В дальнейшем с целью конкретизации роли 120 МД. плазмиды в αгемолитичекой активности Enterobacter spp., брали изогенные пары их штаммов,
и при этом у большинства гемолитически активных штаммов №№ 880 и 320
(соответственно 32, 28 из 50) на фореграмме обнаружели плазмиды массой 120
МД., а у мутантов штаммов №№ 880, 320 (кроме 3,4 клонов из 50,
соответственно)
обнаружено
не
проявляющих
плазмиды
массой
гемолитической
120
МД.
Все
активности,
эти
данные
не
было
являются
дополнительным подтверждением о возможной роли плазмиды массой 120 МД. в
α-гемолитической активности бактерий рода Enterobacter spp. А так же часть
штаммов Enterobacter spp., были способны продуцировать высокоактивные
биологические вещества, вызывающие гемолиз эритроцитов, но по своей природе
не относящиеся к α-гемолизину и возможно могут быть детерминированы
бактериальной хромосомой.
Исследование генетического контроля ответственного за продукцию
α-
гемолизина Citrobacter spp. проводили на 13 штаммах Citrobacter spp.,
обладающих α-гемолитической активностью и 15 штаммах Citrobacter spp. не
способных продуцировать α-гемолизин. В качестве эталонного использовали
штамм Р.vulgaris Rts-1, обладающий α-гемолитической активностью и несущий
плазмиду с массой 120 МД.
Результаты исследований показали, что среди 13 штаммов Citrobacter spp.,
обладающих α-гемолитической активностью, у 7 штаммов обнаружили плазмиду
массой 120 МД. В дальнейшем элиминировали эти плазмиды по общепринятой
методике (3% SDS или 75 мкг/мл акридин оранжевого) и у клонов изучали
профиль плазмидной ДНК. При этом из 100 клонов 90 клонов 4 штаммов
187
Citrobacter spp. потеряли свойство продуцировать α-гемолизин, а часть клонов (от
4 до 10) продолжали продуцировать α-гемолизин.
С целью выяснения роли плазмиды массой 120 МД в продукции αгемолизина Citrobacter spp., мы брали изогенные пары штаммов. При этом у
большинства клонов α-гемолитически активных штаммов Citrobacter spp. на
фореграмме просматривалась плазмида массой 120 МД, а у мутантов, не
проявляющие гемолитической активности, и в большинстве случаях (90%) не
просматривалась плазмида массой 120 МД. Все эти данные, являются
дополнительным подтверждением о возможной роли плазмиды массой 120 МД в
продукции
α-гемолизина
Citrobacter
spp..
Тем
не
менее,
наличие
α-
гемолитической активности у клонов утративших плазмиды массой 120 МД., по
нашему мнению, свидетельствует о вероятности существования у Citrobacter spp.
генетической детерминанты иной природы, контролирующей продукцию αгемолизина и которая требует дальнейшего изучения. Но не исключено, что так
же часть штаммов Citrobacter spp. способных продуцировать высокоактивные
биологические вещества, вызывающие гемолиз эритроцитов, по своей природе не
относятся к α-гемолизину и могут быть детерминированы хромосомой.
В
следующей
серии
опытов
мы
попытались
выяснить
природу
генетической детерминанты Serratia spp., контролирующей продукцию αгемолизина. Исследование проводили на 7 штаммах бактерий родов Serratia spp.,
обладающих α-гемолитической активностью и 10 штаммах не способных
продуцировать α-гемолизин. В качестве эталонной культуры использовали
штамм Р. vulgaris Rts-1, обладающий α-гемолитической активностью и несущий
плазмиду массой 120 МД. Результаты исследований показали, что среди клонов 7
штаммов
Serratia
spp.,
обладающих
α-гемолитической
активностью,
у
большинства обнаружили плазмиду массой 120 МД, что указывало на
возможную роль данной плазмиды в продукции α-гемолизина. В дальнейшем
брали 5 штаммов Serratia spp. несущих плазмиду массой 120 МД. и
элиминировали эти плазмиды по общепринятой методике и у клонов изучали
профиль плазмидной ДНК. При этом большинство (более 90%) клонов у 5
188
штаммов изогенных пар Serratia spp. потеряли свойство продуцировать αгемолизин, и на фореграмме не просматривалась плазмида массой 120 МД, что
указывало на возможную роль данной плазмиды в продукции α-гемолизина. Тем
не менее, некоторые (от 4 до 10) из 100 клонов, утратившие плазмиды массой 120
МД,
продолжали
продуцировать
α-гемолизин,
что
свидетельствовало
о
вероятности существования у бактерий рода Serratia spp. генетической
детерминанты иной природы, контролирующей продукцию α-гемолизина.
Опыты по определению гемолитической активности E.coli показывают то,
что гемолизины являются одним из ведущих факторов патогенности клинических
штаммов. Для выяснения роли плазмиды, контролирующей гемолитическую
активность E.coli, нами изучен плазмидный профиль α-гемолитически активных
культур. Исследование проводили на 22 штаммах E.coli обладающих αгемолитической активностью, и 6 штаммах, не способных продуцировать αгемолизин. В качестве эталона использовали штамм Proteus vulgaris Rts-1,
обладающий гемолитической активностью и несущий плазмиду с массой 120
МД.
Результаты исследований плазмидного профиля показали, что среди 22
штаммов E.coli, у 17 обнаружили плазмиду массой 120 МД (3,4,6,7,8,9,13
фиргерпринты),
в то
время как
в
группе
штаммов,
не обладающих
гемолитической активностью этой плазмиды не оказалось, что указывало на
возможную роль данной плазмиды в продукции α-гемолизина.
Для уточнения роли плазмиды массой 120 МД, в следующей серии опытов
проводили элиминирование этой плазмиды у бактерий, культивируя αгемолитически активные штаммы E.coli в бульоне Хоттингера (рН 7,4-7,6),
содержащем 75 мкг/мл акридин оранжевого и полученных клонов изучали
профиль плазмидной ДНК. При этом клоны 15 штаммов потеряли способность
продуцировать α-гемолизин, а часть клонов штаммов E.coli №661 и E.coli №171
продолжали продуцировать α-гемолизин.
Данные этих исследований, на наш взгляд, свидетельствуют о вероятности
существования
у
E.coli
генетической
детерминанты
иной
природы,
189
контролирующей продукцию α-гемолизина. Не исключено, что часть штаммов
способны продуцировать биологически активные вещества, вызывающие гемолиз
эритроцитов, но по своей природе не относящиеся к α-гемолизину. Все наши
попытки осуществить коньюгативную передачу плазмиды массой 120 МД между
бактериями E.coli к универсальному реципиенту E.coli К12 G62 RifR
не
увенчались успехом.
В дальнейшем с целью конкретизации роли 120 МД плазмиды в αгемолитической активности брали изогенные пары штаммов E.coli. При у
большинства гемолитически активных штаммов E.coli – 22,26,131, 586, 171, 143,
154, на фореграмме наблюдали наличие плазмиды массой 120 МД, а у мутантов
22-э, 26-э, 131-э, 586-э, 171-э, 143-э, 154-э не проявляющих гемолитической
активности, не были обнаружены плазмиды массой 120 МД.
По данным В.Г. Петровской с соавт., гемолитическая активность бактерий P.
mirabilis является одним из признаков, значимых при бактериальном поражении
мочевыводящих путей [211].
Л.В. Пархоменко, И.Г. Лукач с соавт., основываясь на результатах
обследования больных энтеральной патологией микробного генеза, считают, что
гемолитическая активность протеев является признаком, кодируемым как
хромосомными, так и плазмидными детерминантами [169].
Учитывая важную
роль гемолизинов в патогенезе инфекции мы
попытались выяснить природу генетического детерминанта, контролирующего
свойство продуцировать α-гемолизин у Proteus spp..
Исследование проводили на 32 штаммах Proteus spp., обладающих высокой
α-гемолитической активностью и на 16 - не продуцирующих α-гемолизин. В
качестве эталонных штаммов использовали плазмидную ДНК E. coli, несущих
плазмиды известной молекулярной массы 62,5 МД, Sa -23 МД, R 100, R 40a S.
typhimurium 415 (60 мДа) и обладающий гемолитической активностью P. vulgaris
Rts -1 -120 мДа. Результаты исследования показали, что среди клонов 32 штаммов
Proteus spp., обладающих гемолитической активностью, у большинства изученных
190
клонов 27 культур обнаружили плазмиду массой 120 мДа, что указывало на
возможную роль данной плазмиды в продукции α-гемолизина (рис. 36).
В следующей серии опытов брали 31 штамм Proteus spp. средней и 35
штаммов Proteus spp. с слабой гемолитической активностью и изучали профиль их
плазмидной ДНК. При этом только у 19 штаммов Proteus spp. с средней
активностью на фореграмме обнаружили плазмиду массой 120 мДа. В
дальнейшем, культивируя α-гамолитически активные штаммы Proteus spp. в
бульоне Хоттингера (pН 7,4-7,6), содержащем 75 мкг/мл акридин оранжевого, при
37°С в течение 38 часов элиминировали у бактерий плазмиду массой 120 мДа и у
клонов изучали профиль плазмидной ДНК. При этом клоны 30 штаммов Proteus
spp. оказались бесплазмидными, среди которых клоны культур №№132, 183, 151,
1033 (соответственно №№35, 32, 30, 30 из 50) продолжали продуцировать αгемолизин.
1
2
3
4 5
6
7
8 9 10 11 12 13 14 15 16
Рисунок 37 - Электрофореграмма профиля плазмидной ДНК штаммов,
обладающих высокой α-гемолитической активностью.
5 – штамм 1300, несущий плазмиду массой 120 мДа
8 - Реперный штамм P.vulgaris Rts -1, продуцирующий α-гемолизин
(плазмида мол. массой 120 мДа).
10 – 737 Hiy – бесплазмидный и не продуцирующий α-гемолизин.
Данные этих исследований, по нашему мнению, свидетельствуют о
вероятности существования у Proteus spp. генетической детерминанты иной
природы, контролирующей продукцию α-гемолизина. Не исключено, что часть
штаммов Proteus spp. способна продуцировать биологически активные вещества,
191
вызывающие гемолиз эритроцитов, но по своей природе не относящиеся к αгемолизину. По нашему мнению, выяснение этого вопроса является весьма
актуальным и перспективным и вполне может быть предметом отдельных
исследований.
Все наши попытки осуществить коньюгативную передачу плазмиды массой
120 мДа между бактериями рода Proteus и от протеев к универсальному
реципиенту E. coli K12G62RifR не увенчались успехом.
С целью конкретизации роли плазмиды
мол. массой 120 мДа в α -
гемолитической активности использовали изогенные пары штаммов Proteus spp..
При этом у большинства гемолитически активных клонов культур роящихся и
нестабильно нероящихся Proteus spp. (2731, 290, 29) (2731а, 290а, 29а)(35, 41, 39 и
35) (соответственно 30, 30, 29 из 50) на фореграмме наблюдали наличие плазмиды
массой 120 мДа, а у мутантов 290-41, 29-41, не проявляющих α-гемолитической
активности, не было обнаружено плазмиды массой 120 мДа. Тем не менее, у части
клонов (7, из 50) штамма 2731-41, проявляющих α-гемолитическую активность,
аналогично с исходной формой просматривалась плазмида массой 120 мДа.
Таким образом, полученные результаты дают нам основание полагать, что
генетическим детерминантом, контролирующим продукцию α-гемолизина у
культур Proteus spp., возможно является плазмида массой 120 мДа. Все эти данные
являются
дополнительным
подтверждением,
что
возможно
бактериальная
хромосома и/или плазмида массой 120 МД является генетической детерминантой
α-гемолитической активности монокультур Enterobacter spp., Citrobacter spp..
Serratia spp., E.coli и Proteus spp.
В дальнейшем, мы попытались провести передачу плазмиды массой 120
МД. между штаммами Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., E.coli,
Proteus spp. в вариациях: Enterobacter spp.+Citrobacter spp., Enterobacter
spp.+Serratia spp., Citrobacter spp.+Serratia spp, Enterobacter spp.+Е.coli, Citrobacter
spp.+Е.coli,
Serratia
spp.+Е.coli,
Proteus
spp.+Enterobacter
spp.,
Proteus
spp.+Citrobacter spp., Proteus spp.+Serratia spp., Proteus spp.+Е.coli. И все наши
попытки осуществить коньюгативную передачу плазмиды массой 120 МД. между
192
штаммами Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., E.coli, Proteus spp. не
увенчались успехом.
Таким
образом,
результаты
данного
раздела
наших
исследований
показывают, что генетической детерминантой способности бактерий Enterobacter
spp., Citrobacter spp., Serratia spp., E.coli, Proteus spp. давать реакцию
гемагглютинации с эритроцитами цыпленка видимо являются структурные
элементы хромосомной природы; продукции ЛТ-энтеротоксина – плазмида
массой 60 МД.; α-гемолизина – возможно плазмида массой 120 МД. и
бактериальная хромосома.
Исходя из вышеизложенного, мы не смогли в опытах прямой передачи
плазмид,
изучить
механизм
усиления
адгезивной
и
α-гемолитической
активностей у сокультивируемых вариаций: Enterobacter spp.+Citrobacter spp.,
Enterobacter
spp.+Serratia
spp.,
Citrobacter
spp.+Serratia
spp,
Enterobacter
spp.+Е.coli, Citrobacter spp.+Е.coli, Serratia spp.+Е.coli, Proteus spp.+Enterobacter
spp., Proteus spp.+Citrobacter spp., Proteus spp.+Serratia spp., Proteus spp.+Е.coli,
поскольку
эти
хромосомной
признаки
природы,
детерминировались
α-гемолитическая
структурными
активность
элементами
неконьюгативной
плазмидой массой 120 МД., которую не смогли передать от донора к реципиенту
между штаммами внутри родов бактерий Enterobacter spp., Citrobacter spp.,
Serratia spp., E.coli, Proteus spp.
Рисунок
38
-
Электрофореграмма
плазмид
клинических
штаммов
монокультур Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., E.coli,
Proteus spp. обладающих гемолитической активностью
Поэтому, в следующей серии опытов, мы попытались изучить роль
плазмиды
массой
60
МД.
в
изменении
ЛТ-энтеротоксигенности
193
сокультивируемых вариаций: Enterobacter spp.+Citrobacter spp., Enterobacter
spp.+Serratia spp., Citrobacter spp.+Serratia spp, Enterobacter spp.+Е.coli, Citrobacter
spp.+Е.coli,
Serratia
spp.+Е.coli,
Proteus
spp.+Enterobacter
spp.,
Proteus
spp.+Citrobacter spp., Proteus spp.+Serratia spp., Proteus spp.+Е.coli.
Для этого сначала брали вариации Enterobacter spp.+Citrobacter spp., в
которых
присутствуют
штаммы
Enterobacter
spp.
суперпродуценты
ЛТ-
энтеротоксина, вызывающие «отек лап» мышей 95 мг. и более, а так же несущие
плазмиды молекулярной массы 60 МД. и штаммы Citrobacter spp., не
продуцирующие ЛТ-энтеротоксин и вызывающие «отек лап» не более 35 мг. и не
несущие какой-либо плазмиды и у их трансконьюгатов после их совместного
сокультивирования изучали профиль их плазмидной ДНК.
Результаты исследования профиля плазмидной ДНК у трансконьюгатов
совместно культивируемых штаммов вариаций Enterobacter spp.+ Citrobacter spp.
показали, что происходило увеличение клонов на 50% трансконьюгатов вариаций
сокультивируемых штаммов Enterobacter spp.+Citrobacter spp., у которых на
фореграмме
просматривалась
плазмида
молекулярной
массы
60
МД.,
обладающих способностью вызывать отек лап более 75 мг.
Рисунок 39 - Электрофореграмма клонов сокультивируемых вариаций.
Количество клонов несущих плазмиды массой 60 МД. значительно больше
чем у монокультур.
В дальнейшем были отобраны трансконьюгаты совместно культивируемых
штаммов
Enterobacter
spp.+Citrobacter
spp.,
обладающие
плазмидами
и
продуцирующие высокоактивный ЛТ-энтеротоксин и путем культивирования в
бульоне Хоттингера, содержащем 5% концентрации додецилсульфата натрия или
194
80-100 мг/мл бромистого этидия проводили элиминацию плазмид и у их клонов
(не менее 50) утративших свойство продуцировать ЛТ-энтеротоксин, изучали
профиль плазмидной ДНК.
Из 50 клонов каждой вариации Enterobacter spp.+Citrobacter spp.,
утративших свойство продуцировать ЛТ-энтеротоксин у двух и не более на
фореграмме просматривалась плазмида массой 60 МД, остальные оказались не
несущими плазмид, что является дополнительным подтверждением о возможной
коньюгативной передачи между этими бактериями и соответственно роли 60 МД
плазмиды в продукции ЛТ-энтеротоксина вариаций Enterobacter spp.+Citrobacter
spp. С целью исключения роли других плазмид в продукции ЛТ-энтеротоксина
отбирали вариации Enterobacter spp.+Citrobacter spp. несущие плазмиды 40 и 10
МД и штаммы Enterobacter spp. и Citrobacter spp. несущие плазмиды массой 120
МД и изучали способность центрифугатов 18-20 часовых культур и их
ассоциаций бульонных культур вызывать «отек лап» мышей. Из взятых в опыт 15
вариаций совместно сокультивируемых штаммов Enterobacter spp.+Citrobacter
spp. и 6 монокультур - по 3 культуры из каждого рода, 9 штаммов вызывали «отек
лап» мышей до 45 – 55 мг., 6 культур – до 35 – 49 мг. и 3 не более 25 мг., что
является дополнительным подтверждением роли 60 мегадальтоновой плазмиды в
продукции
вариаций
Enterobacter
spp.+Citrobacter
spp.
термолябильного
энтеротоксина (Рис.39).
В дальнейшем изучали возможность коньюгативной передачи Entплазмиды между бактериями Enterobacter spp. и Citrobacter spp. и от Enterobacter
spp. и Citrobacter spp. к E.coli К12 G62 RifR . В качестве селективной среды
использовали мясопептонный агар, содержащий 100 мкг/мл рифампицина и в
зависимости
тетрациклин.
от
резистентности
Реципиент
290-1
доноров
левомецитин,
(Citrobacter
spp.)
был
ампициллин
чувствителен
или
к
левомецитину, ампициллину, тетрациклину и устойчивым к рефампицину в
концентрации 100 мкг/мл. В качестве доноров брали по 16 штаммов Enterobacter
spp. и Citrobacter spp.. При этом из всех вариаций штаммов при скрещивании
донорного штамма Enterobacter spp. 423 (Enterobacter spp.) и реципиента 290-
195
41(Citrobacter spp.) обнаружили коньюгативную передачу Ent-плазмиды. Анализ
профиля плазмидной ДНК показал, что из 50 у 41 трансконьюгатов на
фореграмме просматривалась плазмида массой 60 МД., которые одновременно
давали отек лапки 95 мг. и более.
Таким образом, результаты исследований дают нам основание полагать,
что
генетическим
детерминантом
контролирующим
у
сокультивируемых штаммов Enterobacter spp.+Citrobacter spp.
вариаций
продукцию
термолябильного токсического вещества и дающий «отек лап мышей» 95 и более
мг. и при использовании кожнонекротической пробы
на экспериментальных
кроликах, дающее обширное воспаление, с образованием гнойно-вопалительного
очага, возможно является плазмида массой 60МД., что так же не исключает
взаимное индуцирование токсигенных свойств штаммов симбионтов, как нам
показывает MR и MS реакции гемагглютинации, что говорит о этиологической
значимости ассоциаций вышеизложенных микроорганизмов.
В аналогичной серии опытов, в которых брали вариации: Enterobacter
spp.+Serratia spp., Citrobacter spp.+Serratia spp, Enterobacter spp.+Е.coli, Citrobacter
spp.+Е.coli,
Serratia
spp.+Е.coli,
Proteus
spp.+Enterobacter
spp.,
Proteus
spp.+Citrobacter spp., Proteus spp.+Serratia spp., Proteus spp.+Е.coli, где так же
брали штаммы в различных вариациях: суперпродуценты ЛТ-энтеротоксина,
вызывающие «отек лап» мышей 95 мг. и более, а так же несущие плазмиды
молекулярной массы 60 МД. и штаммы не продуцирующие ЛТ-энтеротоксин и
вызывающие «отек лап» не более 35 мг. и не несущие какой-либо плазмиды. И у
их трансконьюгатов после совместного культивирования в различных вариациях,
изучали профиль их плазмидной ДНК.
Результаты
исследования
профиля
плазмидной
ДНК
у
клонов
сокультивируемых штаммов в вариациях: Enterobacter spp.+Serratia spp.,
Citrobacter spp.+Serratia spp, Enterobacter spp.+Е.coli, Citrobacter spp.+Е.coli,
Serratia spp.+Е.coli, Proteus spp.+Enterobacter spp., Proteus spp.+Citrobacter spp.,
Proteus spp.+Serratia spp., Proteus spp.+Е.coli показали, что происходило
увеличение на 50% клонов вариаций, у которых на фореграмме просматривалась
196
плазмида молекулярной массы 60 МД., обладающие способностью вызывать отек
лап более 75 мг.
В дальнейшем так же были отобраны клоны вариаций обладающих
плазмидой
60МД.,
культивировали
в
продуцирующие
бульоне
высокоактивный
Хоттингера,
ЛТ-энтеротоксин
содержащем
5%
и
концентрации
додецилсульфата натрия или 80-100 мг/мл бромистого этидия и элиминировали
плазмиды и у клонов (не менее 70) утративших свойство продуцировать ЛТэнтеротоксин, изучали профиль плазмидной ДНК. Из 70 клонов каждой
вариации, утратившей свойство продуцировать ЛТ-энтеротоксин у трех и не
более на фореграмме просматривалась плазмида массой 60 МД, а остальные
оказались бесплазмидными, что является дополнительным подтверждением о
возможной коньюгативной передачи Ent-плазмиды между этими бактериями и
соответственно роли 60 МД плазмиды в продукции ЛТ-энтеротоксина
сокультивируемых вариаций (Р<0,05).
Таким образом, обобщая результаты данного раздела наших исследований
показывают, что у транконьюгантов совместно культивируемых вариаций,
происходило
увеличение
общего
количества
клонов
несущих
плазмид
молекулярной массы 60 МД., обладающих способностью вызывать отек лап
более 75 мг.
Исследования
по
обнаружению
хромосомных
и
внехромосомных
элементов, детерминирующих факторы патогенности монокультур Enterobacter
spp., Citrobacter spp., Serratia spp., Е.coli, Proteus spp. и их сокультивируемых
вариаций, а так же профиль их плазмидной ДНК были проведены совместно с
сотрудниками
кафедры
микробиологии,
вирусологии
и
иммунологии,
факультетской хирургии с курсом колопроктологии ГБОУ ВПО «Башкирский
государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения
Российской Федерации (Комплксный подход профилактики и лечения гнойновоспалительных
процессов,
вызванных
ассоциациями
условно-патогенных
бактерий / Р.С. Суфияров, З.Г. Габидуллин, Р.З., М.В. Тимербулатов, Ю.З.
Габидуллин // Монография – Уфа, 2013г, 200с.).
197
3.7. «Островки патогенности» монокультур Enterobacter spp., Citrobacter
spp., Serratia spp., E.coli, Proteus spp. и их совместно культивируемых
вариаций: Enterobacter spp.+Citrobacter spp., Enterobacter spp.+Serratia spp.,
Citrobacter spp.+Serratia spp, Enterobacter spp.+Е.coli, Citrobacter spp.+Е.coli,
Serratia spp.+Е.coli, Proteus spp.+Enterobacter spp., Proteus spp.+Citrobacter
spp., Proteus spp.+Serratia spp., Proteus spp.+Е.coli.
В
настоящее
время
установлено,
что
изменения
патогенности
на
генетическом уровне реализуются через мутации и генетические рекомбинации.
Наиболее существенными для изменения болезнетворности условно-патогенных
энтеробактерий
происходящих
ввиду
«скачкообразного»
превращений
характера
микроорганизма
и
кардинальности
рассматривают
генетические
рекомбинации. Они определяют геномную пластичность Enterobacteriaceae через
несколько конкретных механизмов, связанных с IS–элементами (insertion
sequences):
транспозонами,
интегринами,
бактериофагами
и
особенно
с
«островками патогенности». Относительно недавно «островки патогенности»
были обнаружены у традиционно условно-патогенных Е.соli. В частности, среди
патогенных для человека вариантов Е.соli обнаружены достаточно крупные
нестабильные
фрагментами
ДНК
(5-200
тпо),
содержащие
кластеры
вирулентности, которые были обозначены как «островки патогенности». Так,
генетические детерминанты штаммов E.coli, имеющих различные факторы
патогенности, расположены в одних и тех же сайтах хромосомы. В частности,
установлено, что штаммы Е.соli, выделенные из мочевыводящих путей, обычно
имеют 1-2 «островка патогенности», детерминирующие синтез Р-фимбрий и
индукцию гемолизина. Эти «островки» размерами 70 и 170 тпо расположены в
области генов т-РНК лейцина и селеноцистеина. У энтеропатогенных и
энтерогеморрагических штаммов E.coli все известные гены патогенности,
например, еае А и esp B, также обнаружены в виде вставки размером 35 тпо в той
же области гена т-РНК селеноцистеина. При этом последовательности «островков
патогенности» патогенных вариантов E.coli не обнаружено у непатогенных E.coli
К-12, но в то же время тесно примыкают к областям, имеющимся и у тех, и у
других [174].
198
Данные по транспозонам и IS-элементам, а также проведенные собственные
исследования по изучению плазмидного профиля бактерий Enterobacter spp.,
Citrobacter spp., Serratia spp., E.coli, Proteus spp. показали, что гены «островков
патогенности» могут свободно мигрировать внутри одного вида, рода бактерий
или между близкородственными микроорганизмами. Отсюда логично вытекает
суждение о том, что гены, кодирующие факторы патогенности у энтеробактерий,
могут быть одинаковыми у многих его представителей, и микроорганизмы могут
заимствовать их друг у друга в процессе сложных внутривидовых, межвидовых и
межродовых взаимоотношений.
В этой связи нами была проведена оценка вероятности существования у
клинических штаммов Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., Proteus spp.
генетических детерминант, родственных ряду генов известных «островков
патогенности» E.coli, продукты которых ответственны за ключевые этапы
взаимодействия патогена и хозяина.
Проведенные исследования позволили установить факт наличия у
протестированных штаммов Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., Proteus
spp., фрагментов ДНК, специфичных известным генам кластеров патогенности
E.coli.
В частности, в общем пуле исследованных штаммов Enterobacter spp. (34
шт.) образование искомых ампликонов при использовании праймеров к hlyA
имело место в 7 случаях (20,5%), hlyB – в 8 (23,5%) , papAH - в 4 (11,8%), papC – в
5 (14,7%) случаях, sfaG и sfaA обнаружены у 2 (5,9%) и 8 (23,6%) штаммов
соответственно. Фрагменты, специфичные генам kpsMT и Lth, обнаружены не
были.
199
Рисунок 40 - Частота обнаружения фрагментов ДНК генов
«островков патогенности» у клинических штаммов Enterobacter spp. (%)
Количество обнаруженных генов у штаммов Enterobacter spp., выделенных
при инфекциях желудочно-кишечной тракта, составляло 10; у штаммов,
изолированных при урологических инфекциях – 8; а у штаммов, выделенных при
гнойно-воспалительных процессах–12, относительно контроля. При этом среди
штаммов Enterobacter spp., изолированных из группы контроля, встречались гены,
специфичные генам hlyA, hlyB, papC и sfaA. Из этого следует, что гены,
определяющие кластеры «островков патогенности» у клинических штаммов
Enterobacter spp. в той или иной степени, имеют определенную схожесть с генами
E.сoli (Рис.40).
Так же были проведены серии амплификаций бактериальной ДНК
Citrobacter spp. с подобранными и синтезированными праймерами к нескольким
генам “островов патогенности” E.coli, определяющими их способности к
образованию фимбрий типа S (sfaA, sfaG) и типа Р (рарС, рарАН),
капсулообразованию (kpsMT) и продукции гемолизинов (hlуА, hlуВ). Для синтеза
некоторых из них использовались последовательности, приведенные в работе
Boyd E.F et Haiti D.L.[361].
В серии амплификации были использованы 14 клинических штаммов
Citrobacter spp., фенотипически у которых заранее были определены некоторые
факторы патогенности. Проведенные исследования позволили установить факт
200
наличия у протестированных Citrobacter spp. фрагментов ДНК, специфичных
известным генам кластеров патогенности E.coli. Частота обнаружения фрагментов
генов “островов патогенности” у клинических штаммов Citrobacter spp. носило
следующий характер: hlyA – 35,7%, hlyB – 21,4%, papAH – 21,4%, papC – 14,3%,
sfaG – 0%, sfaA – 7,1%, kps MT – 7,1%. Из этого следует, что гены, определяющие
кластеры “островов патогенности” у клинических штаммов Citrobacter spp. в той
или иной степени имеют определенную схожесть с генами E.сoli (рис. 41).
Рисунок 41 - Частота обнаружения генов “островов патогенности”
у клинических штаммов Citrobacter spp. (%).
40
35,7
35
30
25
21,4
21,4
20
14,3
15
10
7,1
7,1
sfaA
kpsMT
5
0
0
HlyA
HlyB
papAH
papC
sfaG
Амплификацию участков ДНК бактерий рода Serratia spp. «островков
патогенности» так же осуществляли методом ПЦР. Проведенные исследования
позволили установить факт наличия у протестированных Serratia spp. фрагментов
ДНК, специфичных известным генам кластеров патогенности E. coli. В целом у
исследованных штаммов образование искомых ампликонов при использовании
праймеров к hly A и hly B имело место по 4 (23,4%) случая, cnf 1- 2(11,8%), sfa A и
sfa G – по 2 (11,8%) случая, соответственно (Рис. 42).
При этом у 2-х штаммов Serratia spp. одновременно были обнаружены
фрагменты генов «островков патогенности» к образованию sfa A и sfa G,
201
продукции hly A и hly B, cnf 1, которые были выделены при урологических и
гинекологических инфекциях, относящихся к виду S. marcescens.
Рисунок 42 - Электрофореграмма тестирования культур
Serratia spp. на наличие генов
hly A, hly B.
В серии опытов были протестированы E. coli, фенотипически у которых
заранее
были
определены
некоторые
факторы
патогенности.
Результаты
исследований позволили установить факт наличия у E. coli генов рар С (пили
адгезии Рар), hly A-(@-гемолизин), Lth-(LT-энтеротоксин). Так у штаммов E.сoli
ген Рар С обнаруживался у 12 штаммов, ген hly A у 11, ген Lth – у 7 культур.
В серии
амплификации
были
использованы
штаммы
Proteus spp.,
фенотипически у которых заранее были определены некоторые факторы
патогенности. Проведенные исследования позволили установить факт наличия у
протестированных Proteus spp. фрагментов ДНК, специфичных известным генам
кластеров патогенности E.coli. Частота обнаружения фрагментов генов “островов
патогенности” у клинических штаммов Proteus spp. носило следующий характер:
hlyA – 8%, hlyB – 20%, papAH – 20%, papC – 20%, sfaG – 16%, sfaA – 14%, kps MT
– 2%. Из этого следует, что гены, определяющие кластеры “островов
патогенности” у клинических штаммов Proteus spp. в той или иной степени имеют
определенную схожесть с генами E.сoli
202
Таким образом, среди штаммов Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia
spp., E. coli, Proteus spp. вне зависимости от источника их выделения,
обнаруживаются гены hlyA, hlyB, papAH, papC, Lth, sfaG и sfaA. Это указывает на
то, что между патогенными и условно-патогенными микроорганизмами постоянно
осуществляется генетический обмен благодаря трансформации, трансдукции и
конъюгации. Полученные результаты исследования дают основание полагать, что
штаммы, относящиеся к разным видам и родам, содержат гены, кодирующие их
токсигенность и вирулентность, фланкированные в состав кластеров «островков
патогенности». Это указывает на универсальный тип кодирования факторов
патогенности и токсигенности, и соответственно, на схожий механизм развития
патогенеза инфекционных процессов, обусловленных различными патоварами
УПЭ.
Обнаружение
фрагментов
генов
«островов
патогенности»
бактерий
Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., E. coli, Proteus spp. было проведено
при непосредственном участии проведены сотрудников кафедры микробиологии,
вирусологии
медицинский
и
иммунологии
университет»
ГБОУ
ВПО
Министерства
«Башкирский
государственный
здравоохранения
Российской
Федерации (Факторы патогенности семейства Enterobacteriaceae, обеспечивающие
выживание в организме хозяина. / З.Г. Габидуллин,
А.А. Ахтариева, М.М.
Туйгунов, Р.С. Суфияров, В.Г. Туйгунова, Н.Х. Насибуллин, Р.Р. Суфияров, Ю.З.
Габидуллин, Г.А. Идиатуллина, В.М. Изикаев // Мед. вестник Башкортостана 2009г. т.4 №5 с.94-98).
203
ГЛАВА 4. ВЗАИМООТНОШЕНИЯ В СИСТЕМЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ
“ПАТОГЕН – ХОЗЯИН”
Изолируемые
при
инфекционных
процессах
различной
локализации
культуры энтеробактерий, характеризуются наличием свойств, определяющих их
потенциальную
способность
макроорганизма,
благодаря
выживать
способности
в
условиях
прикрепляться
внутренней
к
среды
энтероцитам
и
колонизировать поверхность различных участков макроорганизма, а также
противостоять факторам специфической резистентности организма хозяина [72].
Механизм взаимодействия многих патогенов с клеткой хозяина отличается
значительной
вариабельностью
и
неспецифичностью,
что
предопределяет
многообразие клинических проявлений инфекционных процессов, вызванных
этими микроорганизмами [272].
Из характеристики биологических свойств микробов логически вытекает
новое направление в микробиологии и иммунологии, связанное с изучением
молекулярных механизмов, лежащих в основе патогенеза заболевания. В связи с
этим, на сегодняшний день особую актуальность приобретает изучение
особенностей и характера взаимоотношений в системе «патоген-хозяин». Это
будет способствовать полному пониманию развития и специфики патогенеза
заболевания в каждом конкретном случае в зависимости от наличия факторов
вирулентности и, соответственно, выявлению наиболее уязвимых звеньев
иммунной системы и, возможно, поможет связать их с локальными особенностями
в цепи патогенеза заболеваний [264].
Многообразие
факторов
патогенности,
необходимых
микробу
для
преодоления защитных механизмов хозяина, имеет важное значение на
определенных этапах развития инфекционного процесса. В качестве объектов для
исследований, так же были выбраны эталонные штаммы E.coli ГИСК №280,
патент № 2293765; E.coli ГИСК №281, патент № 2293764, которые были
депонированы и запатентованы, и являются приоритетными.
204
Эксперименты проводились на белых мышах - самцах линии СВА – 100
животных в контрольной группе и по 100 животных в каждой экспериментальной
группе:
группа I - моделирование экспериментальной инфекции осуществляли
внутрибрюшинным
введением
бульонных
монокультур
Enterobacter
spp.,
Citrobacter spp., Serratia spp., E.coli, Proteus spp., содержащих LT-энтеротоксин в
дозе LD50 - 5∙108 КОЕ/мл;
группа II - моделирование экспериментальной инфекции осуществляли
внутрибрюшинным
введением
сокультивируемых
вариаций:
Enterobacter
spp.+Citrobacter spp., Enterobacter spp.+Serratia spp., Citrobacter spp.+Serratia spp,
Enterobacter spp.+Е.coli, Citrobacter spp.+Е.coli, Serratia spp.+Е.coli, Proteus
spp.+Enterobacter spp., Proteus spp.+Citrobacter spp., Proteus spp.+Serratia spp.,
Proteus spp.+Е.coli, штаммов содержащих LT-энтеротоксин в дозе LD50 - 5∙108
КОЕ/мл;
группа III (контрольная) - введение стерильного бульона Хоттингера (для
исключения влияния внешних и внутренних факторов на характеристики
оцениваемых иммунологических параметров).
При
введении
дозы
LD50
развивался
инфекционный
процесс,
сопровождающийся выраженным снижением активности животных, веса и
изменением общего состояния и состояния шерстяного покрова.
Данный подход исследований продиктован тем, что ЛПС клеточной стенки
бактериальной клетки является мощным иммуномодулятором, как и энтеротоксин.
Комбинация их в эксперименте обеспечила дифференциальное влияние LTэнтеротоксина и ЛПС на клетки организма хозяина.
Сравнительную верификацию результатов изучаемых штаммов Enterobacter
spp., Citrobacter spp., Serratia spp., E.coli, Proteus spp. и их сокультивируемых
вариаций проверяли на биологических моделях: изолированная петля тонкого
кишечника кролика, тест «отек лапки», «легочная модель». Также проводили
электрофорез 16-18-часовых монокультур штаммов бактерий Enterobacter spp.,
205
Citrobacter spp., Serratia spp., E.coli, Proteus spp. и их сокультивируемых вариаций,
на агарозном геле.
В следующей серии наших опытов, мы определяли летальную дозу (LD50)
монокультур штаммов бактерий Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp.,
E.coli,
Proteus
spp.(LT+)
и
их
сокультивирумых
вариаций:
Enterobacter
spp.(LT+)+Citrobacter spp.(LT+), Enterobacter spp.(LT+)+Serratia spp.(LT+), Citrobacter
spp.(LT+)+Serratia
spp.(LT+),
Enterobacter
spp.
(LT+)+Е.coli(LT+),
Citrobacter
spp.(LT+)+Е.coli(LT+), Serratia spp.(LT+)+Е.coli(LT+), Proteus spp.(LT+)+Enterobacter
spp.(LT+), Proteus spp. (LT+)+Citrobacter spp.(LT+), Proteus spp.(LT+)+Serratia
spp.(LT+), Proteus spp. (LT+)+Е.coli(LT+).
4.1. Влияние штаммов Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., E.coli,
Proteus spp. и их сокультивирумых вариаций: Enterobacter spp.+Citrobacter
spp., Enterobacter spp.+Serratia spp., Citrobacter spp.+Serratia spp, Enterobacter
spp.+Е.coli,
Citrobacter
spp.+Е.coli,
Serratia
spp.+Е.coli,
Proteus
spp.+Enterobacter spp., Proteus spp.+Citrobacter spp., Proteus spp.+Serratia spp.,
Proteus spp.+Е.coli, на фагоцитарную активность перитонеальных
макрофагов мышей
Защита организма от факторов окружающей среды в значительной мере
связана с макрофагами, которые могут действовать самостоятельно или в
совокупности с клетками воспаления или иммунной системы в целом. Отмечая
существенную роль макрофагов в защите организма, выдающийся русский
микробиолог Мечников И.И. писал: «Скопления фагоцитов в месте внедрения
бактерий и их бактерицидные свойства являются механизмом, служащим для
защиты против атаки бактерий и для охраны неприкосновенности организма»
[181]. В основе защитной функции макрофагов лежит фагоцитарный процесс,
который направлен на уничтожение чужеродного материала. Взаимодействие
микроорганизмов с макрофагами влечет за собой несколько последствий. Если
микроорганизмы захватываются и перевариваются внутри макрофагов, эти
события могут оказаться достаточными для предотвращения дальнейшего
развития инфекционного процесса. Однако многие патогенные и условно-
206
патогенные микроорганизмы в процессе эволюции паразитизма приобрели
эффективные пути ускользания от действия фагоцитарных клеток; некоторые из
них
способны
противостоять
поглощению
фагоцитами,
другие
активно
внедряются в АПК и свободно развиваются и реплицируются в клетках.
Нарушение фагоцитоза может привести к иммунной недостаточности, поскольку
нарушаются
процессы
распознавания
продукции
противовоспалительных
цитокинов и хемокинов, процессинга бактериальных антигенов и презентации их
эффекторами
врожденного
иммунитета
Т–лимфоцитам
[66].
Исходя
из
вышеизложенного, нами были изучены активность и интенсивность фагоцитоза
перитонеальных
макрофагов
функционального
состояния.
мышей,
Результаты
являющиеся
изучения
показателем
активности
их
фагоцитоза
выявили тенденцию к увеличению показателей активности фагоцитоза во всех
экспериментальных группах с первых 12 часов исследования (Рисунок 43).
Рисунок 43 - Влияние монокультур и сокультивируемых вариаций бактерий Enterobacter
spp., Citrobacter spp., Serratia spp., E. coli, Proteus spp. на фагоцитарную активность
перитонеальных макрофагов мышей полученных через 12, 36 и 72 часа после инокуляции
(активность фагоцитоза)(%).
207
Увеличение активности фагоцитоза можно объяснить тем, что при изучении
иммунологических
показателей
реализуется
складывание
суммарного
воздействия двух антигенов на активацию иммунных клеток. Это зависит от
многих причин, в частности, от наличия синергизма или антагонизма
внутриклеточных сигналов, возникающих внутри клеток.
Исходя из вышеизложенного, в следующей серии опытов нами была изучена
интенсивность фагоцитоза при действии монокультур и сокультивирумых
вариаций бактерий Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., E.coli, Proteus
spp. (Рисунок 44).
Рисунок 44 - Влияние монокультур и сокультивируемых вариаций бактерий Enterobacter
spp., Citrobacter spp., Serratia spp., E. coli, Proteus spp. на фагоцитарную активность
перитонеальных макрофагов мышей полученных через 12, 36 и 72 часа после инокуляции
(интенсивность фагоцитоза) (усл. ед.).
Таким образом, действие монокультур бактерий Enterobacter spp., Citrobacter
spp., Serratia spp., E.coli, Proteus spp. способно увеличивать показатели активности
и интенсивности фагоцитоза перитонеальных макрофагов мышей, тогда как
суммарное
действие
вариаций
штаммов
продуцирущих
LT-энтеротоксин
208
(LT+)+(LT+), оказывает более выраженное влияние на активность и интенсивность
фагоцитоза перитонеальных макрофагов мышей, а так же увеличение их
показателей, что может служить предпосылкой к отнесению ассоциаций условнопатогенных микроорганизмов к этиологически значимым.
Изучение влияния монокультур и сокультивируемых вариаций Enterobacter
spp., Citrobacter spp., Serratia spp., E. coli, Proteus spp. на фагоцитарную активность
перитонеальных макрофагов мышей было проведено при непосредственном
участии
научного
вирусологии
медицинский
и
консультанта
иммунологии
университет»
и
сотрудников
ГБОУ
ВПО
Министерства
кафедры
«Башкирский
микробиологии,
государственный
здравоохранения
Российской
Федерации (Влияние термолабильного энтеротоксина Enterobacter cloaceae на
фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов мышей / А.А.Ахтариева,
И.И.Долгушин, З.Г.Габидуллин, Ю.З.Габидуллин, А.А.Камалова // Журнал
микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии - 2007г. №4 стр. 58-61.).
4.2. Влияние монокультур Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp.,
E.coli, Proteus spp. и их сокультивируемых вариаций: Enterobacter
spp.+Citrobacter spp., Enterobacter spp.+Serratia spp., Citrobacter spp.+Serratia
spp, Enterobacter spp.+Е.coli, Citrobacter spp.+Е.coli, Serratia spp.+Е.coli,
Proteus spp.+Enterobacter spp., Proteus spp.+Citrobacter spp., Proteus
spp.+Serratia spp., Proteus spp.+Е.coli, на лизосомальную активность
перитонеальных макрофагов мышей
Механизмы внутриклеточной микробицидности фагоцитов отличаются
широким
спектром
биологически
активных
веществ,
сосредоточенных
в
лизосомах. В них содержится много различных ферментов, включающих
протеиназы, нуклеотидазы, липазы, глюкозидазы и др. Число лизосом в
цитоплазме фагоцитов представляет собой такой показатель, который отражает их
функциональную активность и способность к реагированию на внешние
воздействия
[128].
Насыщенность
антимикробными
факторами
можно
детектировать in vitro с применением теста изучения лизосомальной активности
фагоцитов. Так, активация лизосомальных гранул в ПМф происходит во всех
209
экспериментальных группах уже в первые 12 часов исследования, но более
выраженные показатели были в II-ой группе, соответственно.
Рисунок 45 - Активация лизосомальных гранул в ПМф под действием монокультур и
сокультивируемых вариаций Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., E. coli, Proteus
spp., (усл. ед.).
В контрольной группе показатели через 12 часов были 320,6±1,13 усл.ед.,
через 36 часов – 328,0±4,23 усл.ед. и через 72 часа составило – 317,3±2,77 усл.ед.,
соответственно.
Широкий спектр микробицидных продуктов, содержащихся в гранулах,
обеспечивает эффективный киллинг целого ряда возбудителей – Neisseria
gonorrhoeae, Stahpylococcus epidermidis, облигатных анаэробов, γ-зеленящего
стрептококка и др.. Обнаружено, что антимикробное действие бактерицидного
индуцирующего
грамотрицательные
протеина
бактерии
(БИП)
нейтрофильных
повышает
гранулоцитов
белково-пептидные
на
соединения,
обнаруженные в фагоцитах. Их бактерицидный эффект усиливается в синергизме с
210
катепсином G, дефенсинами и эластазой.
Исход фагоцитарной реакции, где
участвуют фагоциты и бактерийные патогены, далеко не всегда заканчивается в
пользу фагоцита. В ряде ситуаций микробной клетке удается, несмотря на ее
поглощение фагоцитом, избежать последующего киллинга, что связано c
различными приемами, выработанными патогеном в процессе микроэволюции.
Установлено, что нейтрализация бактерицидных факторов лизосом фагоцитов
легионеллами осуществляется за счет снижения кислотности среды, разрушения
гидролаз с помощью бактериальных протеиназ, специфической ингибиции
бактерицидных белков и ферментов [282]. Это свидетельствует о способности
микроорганизмов обеспечивать себе внутриклеточное выживание в фагоцитах за
счет инактивации антимикробных веществ лизосом.
Таким
образом,
действие
токсических
веществ
продуцируемых
монокультурами Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., E.coli, Proteus spp.
в перитонеальных макрофагах увеличивает число лизосом, приводящее к
увеличению их функциональной активности и переваривающей способности, что
более выраженно при исследовании их сокультивируемых вариаций.
Изучение влияния монокультур и сокультивируемых вариаций Enterobacter
spp., Citrobacter spp., Serratia spp., E. coli, Proteus spp. на лизосомальную активность
перитонеальных макрофагов мышей было проведено при непосредственном
участии
научного
вирусологии
и
медицинский
Федерации
консультанта
иммунологии
университет»
(Состояние
и
ГБОУ
сотрудников
ВПО
«Башкирский
Министерства
некоторых
кафедры
звеньев
микробиологии,
государственный
здравоохранения
иммунной
Российской
системы
мышей,
инфицированных энтеротоксин-продуцирующими штаммами бактерий рода
Enterobacter. / А.А.Ахтариева, И.И.Долгушин, З.Г.Габидуллин, Ю.З.Габидуллин,
Т.А.Савченко,
Г.К.Давлетшина, Д.М.Галимова,
М.Ф. Газизова
//
микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии.-2007 №5 стр. 84-87.).
Журнал
211
4.3. Сравнительная оценка влияния термолабильного энтеротоксина
монокультур Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., E.coli, Proteus
spp. и их сокультивируемых вариаций: Enterobacter spp.+Citrobacter spp.,
Enterobacter spp.+Serratia spp., Citrobacter spp.+Serratia spp, Enterobacter
spp.+Е.coli,
Citrobacter
spp.+Е.coli,
Serratia
spp.+Е.coli,
Proteus
spp.+Enterobacter spp., Proteus spp.+Citrobacter spp., Proteus spp.+Serratia spp.,
Proteus spp.+Е.coli, на внутриклеточный кислородзависимый метаболизм
перитонеальных макрофагов мышей
Фагоцитоз сопряжен c серией метаболических реакций, типичными чертами
которого являются быстрое увеличение потребления кислорода с превращением
его
в первичные
(супероксиданион
–
О2, перекись
водорода
–
Н2О2,
гидроксильный радикал – ОН, синглетный кислород – ↑О2, озон – О3) и вторичные
(гипохлорная кислота – НОСI, хлорамин, продукты перекисного окисления
липидов) метаболиты активированного кислорода в системе НАДФ∙Н-оксидазы
[10,141,264]. Для оценки кислородного «взрыва» существуют различные методы,
среди которых наиболее доступным является НСТ-тест. В основе этого метода
лежит реакция восстановления нитросинего тетразолия (НСТ) ионом водорода и
супероксидным анионом, при котором в клетках образуется грубодисперсный
темно-синего цвета диформазан, определяемый с помощью светового микроскопа
[226].
212
Рисунок 46 - Спонтанная НСТ-активность перитонеальных макрофагов у мышей
зараженных монокультурами и сокультивируемыми вариациями Enterobacter spp.,
Citrobacter spp., Serratia spp., E.coli, Proteus spp., (%).
Оценка активности спонтанной НСТ-реакции перитонеальных макрофагов
показала увеличесние их НСТ-редуцирующей способности (Табл. №4). Обращает
на себя внимание тот факт, что в клетках мышей I группы активность процессов
образования активных форм кислорода несколько ниже по сравнению со II-ой
экспериментальной группой, причем увеличение образования супероксидного
аниона, относительно контроля, наблюдается уже через 12 часов эксперимента при
введении
сокультивируемых
вариаций.
В
другой
серии
экспериментов
установлено, что индуцированная НСТ-реакция макрофагов была ниже, чем
спонтанная. Следует отметить, что во II-ой группе мышей показатели спонтанной
НСТ-реакции имели достоверно высокие значения, по сравнению с контролем и Iой группой, соответственно. Сравнительный анализ индуцированной НСТ-
213
восстанавливающей
способности,
относительно
II-ой
группы,
показал
статистически значимые различия (Рисунок 47).
Рисунок 47 - Индуцированная НСТ-активность перитонеальных макрофагов у мышей
зараженных монокультурами и сокультивируемыми вариациями Enterobacter spp.,
Citrobacter spp., Serratia spp., E.coli, Proteus spp., (%).
Данные
свидетельствуют
о
предельных
возможностях
работы
гексозомонофосфатного шунта клеток под действием токсических продуктов
сокультивируемых вариаций, поскольку показатели количества образования
свободных радикалов без индукции были намного выше (Рисунок 46, 47). Фактор
изменения реактивности фагоцитов многими авторами рассматривается как
ключевой момент в патогенезе инфекционного процесса. Ключевая роль в
развитии респираторного «взрыва» принадлежит НАДФ∙Н-оксидазе, которая
является непосредственным транспортером электронов от НАДФ цитозоля к
молекулярному
кислороду.
Стимуляторами
НАДФ∙Н-оксидазы
выступают
фагоцитированные бактерии, иммунные комплексы, цитокины, опсонизированные
214
частицы, продукты комплемента. Однако кислородзависимая микробицидная
активность фагоцитов может меняться под действием факторов патогенности
патогенных бактерий и их ассоциированных вариаций. Установлено, что
экзотоксины токсического шока S.aureus подавляют продукцию биоцидных
соединений фагоцитами. Смирнова Т.Г. с соавт. [246] показала, что ассоциации
штаммов S.aureus и L.monocitogenes устойчивы к действию кислородзависимых и
нитроксидзависимых ферментных систем макрофагов.
Таким образом, результаты данного раздела исследования показывают, что в
перитонеальных
макрофагах
мышей
инфицированных
сокультивируемыми
вариациями, происходит более выраженная способность к восстановлению НСТ,
чем
при
инфицировании
кислородзависимых
их
монокультурами,
механизмов
бактерицидности
что
отражает
ассоциаций
дефекты
условно-
патогенных энтеробактерий.
Оценку влияния термолабильного энтеротоксина монокультур Enterobacter
spp., Citrobacter spp., Serratia spp., E.coli, Proteus spp. и их сокультивируемых
вариаций на внутриклеточный кислородзависимый метаболизм перитонеальных
макрофагов мышей проводили совместно сотрудниками кафедры микробиологии,
вирусологии
медицинский
и
иммунологии
университет»
ГБОУ
ВПО
Министерства
«Башкирский
государственный
здравоохранения
Российской
Федерации (Оценка влияния энтеротоксин-продуцирующего Enterobacter cloaceae
на внутриклеточный кислородзависимый метаболизм перитониальных макрофагов
мышей. / З.Г.Габидуллин, А.А.Ахтариева, Ю.З.Габидуллин, Т.А.Савченко,
Ф.С.Билалов, Э.Ф.Мамбетова, А.А. Камалова // Материалы IX – съезда НЛОЭМП
ч. II 2007г. стр. 209.; Оценка внутриклеточного кислород зависимого метаболизма
нейтрофилов перитонеального экссудата мышей в эксперименте / А.А.Ахтариева,
Ю.З.Габидуллин, Т.А. Савченко // Медицинская наука.- Уфа 2008г. стр. 42-43;
Исследование фагоцитоза и кислородзависимого метаболизма
перетонеальных
макрофагов мышей после воздействия сокультивируемых бактерий Enterobacter
cloacae и St. Aureus / З.Г. Габидуллин, В.М. Изикаев, А.А. Ахтариева, Р.С.
215
Суфияров , Р.Р. Суфияров, А.А. Камалова, Габидуллин Ю.З. // Медицинский
вестник Башкортостана - 2011г. №1, т.6, стр.92-95.).
4.4. Сравнительное изучение влияния монокультур Enterobacter spp.,
Citrobacter spp., Serratia spp., E.coli, Proteus spp. и их сокультивируемых
вариаций: Enterobacter spp.+Citrobacter spp., Enterobacter spp.+Serratia spp.,
Citrobacter spp.+Serratia spp., Enterobacter spp.+Е.coli, Citrobacter spp.+Е.coli,
Serratia spp.+Е.coli, Proteus spp.+Enterobacter spp., Proteus spp.+Citrobacter
spp., Proteus spp.+Serratia spp., Proteus spp.+Е.coli, на формирование
экстрациллюлярных сетей нейтрофилами периферической крови
В последние годы показано, что даже после гибели нейтрофилы могут
выполнять атимикробную функцию за счет образования внеклеточных ловушек
(Neutrophil Extracellular Traps, NETs, НВЛ). В ответ на микробные и немикробные
стимулы нейтрофилы активно формируют во внеклеточном пространстве
сетеподобные структуры, состоящие из нуклеиновых кислот и ферментов (Fuches
T. A., Abed U. et al., 2007).
Используемый способ позволил нам выявить свободнолежащие нити ДНК
нейтрофила, т.е. так называемые экстрациллюлярные сети (Долгушин, И.И.,
2008)[129].
Данным способом нами было окрашено 80 фиксированных препаратов, из
которых 10 содержали взвесь нейтрофилов без активаторов (контроль), и 4 группы
по 5 мазков на каждый микроорганизм или вариацию, были приготовлены из
взвеси нейтрофилов, активированных смесью монокультур бактерий родов
Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., E.coli, Proteus spp. и их
сокультивируемыми вариациями.
В результате проведенных исследований обнаружили, что при действии в
течение 30 минут монокультур Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp.,
E.coli, Proteus spp. количество экстрациллюлярных сетей возрастает. При этом
максимальные
изменения
этих
показателей
наблюдаются
при
действии
сокультивруемых вариаций (Рисунок 48). И было выявлено, что представители
условно-патогенной флоры оказывают стимулирующее влияние на образование
216
экстрациллюлярных сетей, при этом наибольшее количество обнаружено в группе,
активированных сокультивируемыми вариациями: Enterobacter spp.+Citrobacter
spp., Enterobacter spp.+Serratia spp., Citrobacter spp.+Serratia spp., Enterobacter
spp.+Е.coli, Citrobacter spp.+Е.coli, Serratia spp.+Е.coli, Proteus spp.+Enterobacter
spp., Proteus spp.+Citrobacter spp., Proteus spp.+Serratia spp., Proteus spp.+Е.coli.
Рисунок 48 - Образование экстрацилюлярных сетей при исследовании влияния
монокультур и сокультивируемых вариаций Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia
spp., E.coli, Proteus spp., (%).
В контрольной группе процент образования экстрацилюлярных сетей
составил через 12 часов – 5,67±0,33 %, через 36 часов – 9,35±0,65 % и через 72
часа – 8,13±1,87 % (Р<0,05).
Таким образом, можно констатировать тот факт, что действие монокультур и
сокультивируемых вариаций способствует образованию экстрацилюлярных сетей,
которых образуется больше при действии сокультивируемых вариаций.
И
несмотря на более чем вековые исследования нейтрофилов, основные клетки
врожденного иммунитета скрывают от исследователей еще множество тайн.
Однако уже сейчас можно с уверенностью утверждать, что экстрацилюлярные
сети – это не только один из способов клеточной гибели, но и важный механизм
217
противоинфекционной защиты организма, биологическая функция которого не
менее важна, чем фагоцитоз и секреция биологически активных веществ.
4.5. Сравнительное изучение влияния монокультур Enterobacter spp.,
Citrobacter spp., Serratia spp., E.coli, Proteus spp. и их сокультивируемых
вариаций: Enterobacter spp.+Citrobacter spp., Enterobacter spp.+Serratia spp.,
Citrobacter spp.+Serratia spp., Enterobacter spp.+Е.coli, Citrobacter spp.+Е.coli,
Serratia spp.+Е.coli, Proteus spp.+Enterobacter spp., Proteus spp.+Citrobacter
spp., Proteus spp.+Serratia spp., Proteus spp.+Е.coli, на феномен апоптоза
клеток перитонеального экссудата в системе «патоген-хозяин»
Спектр механизмов бактерийного выживания при инфекции в последнее
время расширился за счет способности микробных патогенов регулировать
процесс апоптоза. В условиях инфекционной патологии обычно апоптоз
выполняет функцию защиты макроорганизма, где гибель инфицированных клеток
с последующей их элиминацией из организма предотвращает распространение
инфекции. Однако, некоторые патогенны в условиях инфицированного организма
«отменяют» клеточную гибель, поддерживая жизнь клеток хозяина, тем самым
способствуя выживанию и персистенции возбудителя [141].
В связи с этим на наш взгляд, эти обстоятельства диктуют необходимость
сравнительного изучения явлений запрограммированной клеточной смерти
хозяина под влиянием монокультур Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp.,
E.coli, Proteus spp. и их сокультивируемых вариаций: Enterobacter spp.+Citrobacter
spp., Enterobacter spp.+Serratia spp., Citrobacter spp.+Serratia spp, Enterobacter
spp.+Е.coli, Citrobacter spp.+Е.coli, Serratia spp.+Е.coli, Proteus spp.+Enterobacter
spp., Proteus spp.+Citrobacter spp., Proteus spp.+Serratia spp., Proteus spp.+Е.coli,
поскольку в доступной нам литературе мы не встречали подобной информации.
Цитометрический
анализ
клеток
перитонеального
экссудата
(КПЭ)
с
использованием двух видов светорассеяния (малого и под углом 90С) показал,
что КПЭ содержат две основные субпопуляции клеток, различающиеся размерами
и гранулярностью цитоплазмы.
218
Во всех опытных группах отмечается появление апоптотических клеток.
Однако, стабильно статистически достоверные различия, по сравнению с
контролем, наблюдались в II-ой группе мышей (рисунок 49).
Рисунок 49 - Выраженность апоптоза клеток перитонеального экссудата мышей,
зараженных монокультурами и сокультивируемыми вариациями Enterobacter spp.,
Citrobacter spp., Serratia spp., E.coli, Proteus spp., (усл. ед.).
Что касается исследования феномена аппоптоза клеток перетониального
экссудата при введении сокультивируемых вариаций, послеживалось явное
увеличение появления аппототических клеток и были статистически достоверные
различия, по сравнению с контролем и I-ой группой мышей.
В
контрольной
группе
показатели
апоптоза
были
относительно
постоянными. Так, через 12 часов - 1,97±0,18 усл.ед., через 24 часа – 2,04±0,21
усл.ед., через 36 часов – 2,40±0,11 усл.ед., через 48 часов – 2,13±0,01 усл.ед. и
через 72 часа - 2,04±0,21 усл.ед.
Таким образом, монокультуры Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp.,
E.coli, Proteus spp. и их сокультивируемые вариации влияют на процесс апоптоза
клеток перитонеального экссудата мышей, что более выражено при изучении
сокультивируемых вариаций тестируемых нами микроорганизмов. Оценку
219
влияния монокультур Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., E.coli, Proteus
spp.
и
их
сокультивируемых
перитонеального
консультантом
иммунологии
экссудата
и
мышей
сотрудниками
ГБОУ
вариаций,
ВПО
на
феномен
проводили
кафедры
«Башкирский
апоптоза
совместно
микробиологии,
с
клеток
научным
вирусологии
государственный
и
медицинский
университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (Влияние
термолабильного энтеротоксина Enterobacter cloacae на иммунную систему мышей
/ А.А. Ахтариева, И.И. Долгушин, З.Г. Габидуллин,
Камалова,
Р.М.
Ахмадеев
//
Журнал
Ю.З. Габидуллин, А.А.
микробиологии,
эпидемиологии
и
иммунобиологии. - 2009 №6 с. 98-104; Регуляция апоптоза бактериальными
клетками семейства Enterobacteriaceae. / З.Г. Габидуллин, А.А. Ахтариева, М.М.
Туйгунов, Р.С. Суфияров, В.Г. Туйгунова, Н.Х. Насибуллин, Р.Р. Суфияров, Ю.З.
Габидуллин, Г.А. Идиатуллина, В.М. Изикаев // Мед. вестник Башкортостана 2009г. т.4 №6 С. 68-76.).
220
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Благодаря
созданию
системы
противоэпидемических
мероприятий,
основанных на научных знаниях молекулярной биологии и микробиологии
возбудителей, механизмов развития эпидемических процессов, были достигнуты
определенные успехи в борьбе с острыми инфекционными заболеваниями
различной локализации, вызванными условно-патогенными энтеробактериями.
Однако, в связи с неблагоприятной экологической ситуацией и не всегда
рациональным применением широкого спектра антибактериальных препаратов, в
настоящее время возникли серьезные проблемы, связанные с выяснением
этиологической роли различных ассоциированных форм микробных популяций
[61]. Проблема гнойно-воспалительных процессов различной локализации,
вызванных различными представителями условно-патогенных энтеробактерий, до
настоящего времени остается весьма актуальным. Монокультуральные и
поликультуральные инфекционные процессы условно-патогенной природы веками
тревожат многих микробиологов и проведение комплексных исследований,
направленных на профилактику и лечение инфекций, вызванных различными
формами микробных популяций, является весьма своевременным [71]. В
настоящее время одной из проблем, стоящих перед исследователями, является
решение
вопросов
диагностики,
снижения
заболеваемости,
вызванных
ассоциациями условно-патогенных энтеробактерий [77]. Условно-патогенные
энтеробактерии
обладая
значительным
арсеналом
приспособительных
механизмов, способны менять свойства продуцировать различные ферменты
вирулентности, и вызывают энтеральные и парентеральные инфекции, число
которых нарастает из года в год [78].
До настоящего времени роль различных форм ассоциаций условнопатогенных энтеробактерий с измененными признаками патогенности остается не
до конца изученной. Не отработаны оптимальные подходы по определению
этиологической значимости ассоцированных форм в развитии инфекционных
процессов различной локализации [6,99,108,181, 202,208].
221
Поэтому
становится
важным
сравнительное
изучение
каждого
иерархического уровня паразитарных отношений и если удается связать их
воедино с морфологическим описанием процесса, сравнительной характеристикой
факторов патогенности, генетическим их контролем, картина развития и
проявления инфекционного процесса представляется актуальной и с медицинской
и с общебиологической точки зрения.
Материалом для наших исследований послужили 265 штаммов условнопатогенных микроорганизмов, выделенных как из проб клинического материала,
так и от здоровых людей: от 3658 больных с гнойно-воспалительными,
кишечными и урологическими заболеваниями: 50 штаммов Enterobacter spp., 50
штаммов Citrobacter spp., 50 штаммов Serratia spp., 50 штаммов E.coli, 50
штаммов Proteus spp., а так же 10 вариаций сокультивируемых штаммов
Enterobacter spp.+Citrobacter spp. (Е+С), 10 вариаций Enterobacter spp.+Serratia
spp. (Е+S), 10 вариаций Citrobacter spp.+ Serratia spp. (C+S), 10 вариаций
Enterobacter spp.+Е.coli (Ent+Е.coli), 10 вариаций Citrobacter spp.+Е.coli (C
+Е.coli),
10
вариаций
Serratia
spp.+Е.coli
(S+Е.coli),
10
вариаций
Proteus+Enterobacter spp. spp.(Prot+Е), 10 вариаций Proteus spp.+Citrobacter spp.
(Prot+С), 10 вариаций Proteus spp.+Serratia spp. (Prot+S), 10 вариаций Proteus
spp.+Е.coli (Prot+Е.coli). Дополнительно были использованы по 5 штаммов
Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., Е.coli, Proteus spp. выделенных от
898 здоровых людей. Так же в процессе выполнения работы нами были
использованы приоритетные штаммы E. coli обладающие комплексом факторов
патогенности, которые были депонированы в ГИСК им. Л.А. Тарасевича и
запатентованы (патенты: E.coli ГИСК №280, патент № 2293765; E.coli ГИСК
№281, патент № 2293764), и могут быть использованы как эталонные при
идентификации условно-патогенных микроорганизмов.
Эксперименты выполнены на 2250 белых мышах-самцах (беспородных и
линии
СВА),
60-ти
кроликах,
360
белых
мышах–сосунках.
Животные
содержались в условиях вивария ГОУ ВПО «БГМУ Росздрава» с естественным
световым режимом на стандартной диете лабораторных животных (ГОСТ
222
Р50258-92)
с
соблюдением
конвенции
по
защите
Международных
позвоночных
рекомендаций
животных,
Европейской
используемых
при
экспериментальных исследованиях, а также правил лабораторной практики при
проведении доклинических исследований в РФ (ГОСТ З 51000.3-96 и 51000.496)[199]. Все выделенные культуры идентифицировали по биохимическим
свойствам. Изучение подвижности проводили методами «висячая капля» и
«раздавленная капля». Дополнительно использовали столбики с полужидким
агаром[239]. Изучение клеточной поверхности и особенностей морфологической
структуры моно- и сокультивируемых гр- бактерий проводили с помощью
оптического
(«Биолам»,
Россия)
и
электронного
(«JEM-100B»,
Япония)
микроскопов. Адгезивную активность микроорганизмов определяли в реакции
гемагглютинации с эритроцитами птиц (Габидуллин З.Г. с соавт. (Авторское
свидетельство №1312098, 1989 г. 45c.)[97], количественную оценку адгезивной
активности проводили по Брилису В.И. с соавт.(1986г.)[45],  - гемолитическую
активность по методу Габидуллина З.Г. (рац. предл. №168, 1978г.)[96],
энтерогемолитическую активность бактерий определяли по методике Beutin L. еt
al.[299], дополнительно гемолитические активности были изучены по методике
Габидуллина З.Г. (Рац. предл. № 638, 1983г.)[96], тиолзависимый гемолизин
путем посева на среду для определения тиолзависимого гемолизина (Appelbaum
P.C., Prozecky O.W., 1983г.)[293], ДНК - азную активность определяли по Jeffries
C.D. et al.(1957г.)[350], определение лецитиназной активности проводили на
желточном агаре Чистовича Ю.Н.(1961г.)[270], изучение антилизоцимной
активности
проводили
антиинтерфероновую
по
методике
активность
Бухарина
исследовали
О.В.
по
и
др.(1984г.)[56],
методу
Соколова
В.Ю.(1990г.)[248], антикомплементарную активность (АКА) – по методу
Бухарина
О.В.[55],
изучение
антибиотикорезистентности
проводили
по
общепринятой методике с помощью стандартных дисков в соответствии с
Инструкцией МЗ СССР от 1984 года [201], дополнительно использовали
питательные среды с определенной концентрацией антибиотиков по Миллеру
Дж.(1976)[123], протистоцидную активность тестировали на простейших –
223
Paramecium caudatum (Галикеев Х.Л., 1987г.)[104], патогенность in vivo изучали
методом интраназального заражения мышей массой 16-18 гр. (Войно-Ясенецкая
М.К.,
1957г.)[89],
определение
токсигенности
культур
проводили
на
изолированной петле тонкого кишечника кролика, тест «отек лап» по методике
Вартанян
проводили
Ю.П.
на
с
соавт.
(1978г.)[83],
мышах-сосунках
кожнонекротическую
способность
изучение
(Gianella
проводил
выделение плазмидной ДНК проводили
по
R.
по
SТ-энтеротоксигенности
Et
al.,
1978)[199],
общепринятой
методу Каdо
методике,
C.T. и Liu
S.T.(1981)[353], полимеразная цепную реакцию проводил с использованием пары
праймеров, подобранных по данным работ Boyd E.F. и Haiti D.L.[173]; модель
острой экспериментальной инфекции воспроизводили в 3-х экспериментальных
группах. Оценку всех тестируемых параметров проводили через 12-36-72 часа
после инокуляции монокультур и их сокультивируемых вариаций. Сепарацию
эукариотических клеток проводили следующим образом: резидентные клетки
перитонеальных макрофагов (ПМф) у мышей получали промыванием брюшной
полости охлажденной средой 199 с гепарином в концентрации 10 ед/мл. Все
манипуляции проводили при температуре тающего льда. Фагоцитарную
активность исследуемых клеток оценивали по их способности к захвату частиц
полистирольного латекса (Фрейдлин И.С., 1986)[128], так же проводили
выделение макрофагов (Мф) и моноцитов (Мн) из клеточной суспензии в
процессе культивирования, связанное с их адгезивной способностью (Хейфетц
Л.Б., 1973)[129], изучение состояния лизосомального аппарата фагоцитирующих
клеток проводили с помощью метода Зеленина А.В. (1971)[141], изучение
внутриклеточного кислородзависимого метаболизма перитонеальных фагоцитов
проводили используя НСТ-тест (Маянский А.Н., 1977)[129], определение
образования экстрацеллюлярных сетей проводили по методу Долгушина И.И. c
соавт.(2009)[129], оценку апоптоза эукариотических клеток проводили в
проточном цитофлюориметре (FL3,>600 нм) по структурным изменениям
ядерной ДНК клеток, окрашенных йодистым пропидием (РI) (Сибиряк С.В.,
2008)[129], статистическая обработка результатов проводилась общепринятыми
224
методами вариационной статистики с определением средней арифметической
вариационного ряда (М), среднего квадратичного отклонения (δ), средней
ошибки средней арифметической (m). Показатель достоверности различий (р)
определялась по таблице с использованием критерия Стьюдента (t). Разница
между сравниваемыми величинами считалась достоверной при значении р<0,05.
Все выделенные и используемые культуры по своим культуральным,
морфологическим
и
биохимическим
свойствам
были
типичными
для
соответствующих родов бактерий. Микроскопическое исследование методом
окраски по Граму препаратов моно- и совместно культивируемых Enterobacter
spp., Citrobacter spp., Serratia spp., Е.соli, Proteus spp. позволило нам на
визуальном уровне выявить наличие разницы в картинах между моно- и
сокультивирумыми вариациями. Электоронно-микроскопическое исследование
моно- и сокультивируемых Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., Е.соli,
Proteus spp., базировавшиеся на форме, рисунке, макро- и микроструктуре
бактериальных колоний, свидетельствуют о
переходе представлений от
одноклеточности микроорганизмов к представлению о микробных колониях как
целостных «сверхорганизмах». В толще колоний, на электоронограммах
отпечатков колоний моно- и совместно культивируемых штаммов Enterobacter
spp., Citrobacter spp., Serratia spp., Е.соli, Е.соli, Proteus spp. обнаружено, что
между клетками существуют контакты различных типов: плотное слипание,
контакты на концах, контакты «бок в бок», «бок в конец», «конец в бок». При
постановке реакции гемагглютинации с эритроцитами цыпленка было выявлено,
что показатели MS- и MR-реакций гемагглютинации с эритроцитами цыпленка
были
значительно
микроскопическом
выше
чем
исследовании
у
их
монокультур.
обнаружено,
что
При
клетки
электронносовместно
культивируемых штаммов Enterobacter, Citrobacter, Serratia, Е.соli, Proteus в
большом количестве (более 15) плотно прилипали к эритроцитам цыпленка,
тогда как количество прилипающих клеток у монокультур, составляло не более
10 на единичный эритроцит.
225
Сравнительное
изучение
гемолитических
свойств,
ДНК
–
азной,
лецитиназной, антилизоцимной, антиинтерфероновой, антикомплементарной
активностей, вирулентности, ЛТ-энтеротоксигенности показали, что штаммы
Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., Е.coli, Proteus spp. при совместном
культивировании значительно чаще проявляли высокие и средние значения
вышеизложенных признаков, чем в виде монокультур.
Изучение
антибиотикочувствительности
бактерий
Enterobacter
spp.,
Citrobacter spp., Serratia spp., Е.coli, Proteus spp. и их совместно культивируемых
вариаций методом стандартных дисков показало, что сокультивируемые вариации
реже были чувствительны к широко применяемым в практике антибиотикам. А
при изучении возможности трансконьюгативной передачи множественной
лекарственной устойчивости к широко применяемым в практике антибиотикам
между бактериями Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., Е.coli, Proteus
spp., и от бактерий Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., Е.coli, Proteus к
универсальному реципиенту E. coli K12G62RifR было выявлено, что у 50% и более
трансконьюгатов сокультивируемых вариаций обнаружена коньюгационная
передача
реципиентам
устойчивости
к
левомицетину,
ампициллину,
стрептомицину, неомицину и мономицину.
Дальнейшие
внехромосомных
исследования
элементов,
по
обнаружению
детерминирующих
хромосомных
факторы
и
патогенности
монокультур Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., Е.coli, Proteus spp. и
их сокультивируемых вариаций, а так же изучение профиля их плазмидной ДНК
показали, что генетической детерминантой способности бактерий Enterobacter
spp., Citrobacter spp., Serratia spp., E.coli, Proteus spp. давать реакцию
гемагглютинации с эритроцитами цыпленка, видимо являются структурные
элементы хромосомной природы; продукции ЛТ-энтеротоксина – плазмида
массой 60 МД; продукции α-гемолизина, возможно, плазмида массой 120 МД и
бактериальная хромосома. Также мы не выявили в опытах прямой передачи
плазмид,
усиление
адгезивной
и
α-гемолитической
активностей
у
сокультивируемых вариаций. Результаты исследования профиля плазмидной
226
ДНК у трансконьюгатов совместно культивируемых штаммов вариаций
Enterobacter spp.+Citrobacter spp. показали увеличение на 50% клонов, несущих
плазмиды молекулярной массой 60 МД. и обладающих способностью вызывать
отек лап более 95 мг.
В общем пуле исследованных штаммов Enterobacter spp. (34 шт.)
образование искомых ампликонов при использовании праймеров к hlyA имело
место в 7 случаях (20,5%), hlyB – в 8 (23,5%), papAH - в 4 (11,8%), papC – в 5
(14,7%) случаях, sfaG и sfaA обнаружены у 2 (5,9%) и 8 (23,6%) штаммов
соответственно.
Частота
обнаружения
фрагментов
генов
“островков
патогенности” у клинических штаммов Citrobacter spp. носила следующий
характер: hlyA – 35,7%, hlyB – 21,4%, papAH – 21,4%, papC – 14,3%, sfaG – 0%,
sfaA – 7,1%, kps MT – 7,1%. У исследованных штаммов Serratia spp. образование
искомых ампликонов при использовании праймеров к hly A и hly B имело место
по 4 (23,4%) случая, cnf 1- 2(11,8%), sfa A и sfa G – по 2 (11,8%) случая,
соответственно. При этом у 2-х штаммов Serratia spp. одновременно были
обнаружены фрагменты генов «островков патогенности» к образованию sfa A и
sfa G, продукции hly A и hly B, cnf 1, которые были выделены при урологических
и гинекологических инфекциях, относящихся к виду S. marcescens. Из 50
штаммов E.сoli ген Рар С обнаруживался у 12 штаммов, ген hly A у 11, ген Lth – у
7 культур. Частота обнаружения фрагментов генов “островков патогенности” у
клинических штаммов Proteus spp. носила следующий характер: hlyA – 8%, hlyB
– 20%, papAH – 20%, papC – 20%, sfaG – 16%, sfaA – 14%, kps MT – 2%. Таким
образом, при изучении генетических детерминант у клинических штаммов
Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., E. coli, Proteus spp. вне зависимости
от источника их выделения обнаруживаются гены hlyA, hlyB, papAH, papC, Lth,
sfaG и sfaA.
Результаты
изучения
активности, интенсивности
фагоцитоза выявили
тенденцию к увеличению показателей активности, интенсивности фагоцитоза во
всех экспериментальных группах с первых 12 часов исследования. А изучение
активности и интенсивности фагоцитоза, путем введения сокультивируемых
227
вариаций показало, что происходило резкое увеличение значений изучаемого нами
признака. Активация лизосомальных гранул в ПМф происходит во всех
экспериментальных группах уже в первые 12 часов исследования, но более
выраженные показатели были в II-ой группе.
Оценка активности спонтанной НСТ-реакции перитонеальных макрофагов
показала, что в клетках мышей II-ой группы активность процессов образования
активных форм кислорода была выше по сравнению с I-ой группой, причем
максимальное увеличение образования супероксидного аниона, относительно
контроля, наблюдалось уже через 12 часов эксперимента. В другой серии
экспериментов установлено, что индуцированная НСТ-реакция макрофагов была
выше, чем спонтанная, и имела тенденцию к увеличению. Следует отметить, что
во II-ой группе мышей показатели имели достоверно высокие значения, по
сравнению с контролем и I-ой группой мышей. Данные свидетельствуют о
предельных возможностях работы гексозомонофосфатного шунта клеток под
действием токсических продуктов сокультивируемых вариаций.
Исследования по обнаружению экстрацеллюлярных сетей показало, что при
действии в течение 30 минут монокультур Enterobacter spp., Citrobacter spp.,
Serratia spp., E.coli, Proteus spp. количество экстрацеллюлярных сетей возрастает.
При этом максимальные изменения этих показателей наблюдаются при действии
сокультивируемых вариаций. И было выявлено, что представители условнопатогенной
флоры
оказывают
стимулирующее
влияние
на
образование
экстрацеллюлярных сетей, при этом наибольшее их количество обнаружено в
группе, активированных сокультивируемыми вариациями. Таким образом,
несмотря на более чем вековые исследования, основные клетки врожденного
иммунитета скрывают от исследователей еще множество тайн. Однако уже сейчас
можно с уверенностью утверждать, что экстрацеллюлярные сети – это не только
один из способов клеточной гибели, но и важный механизм противоинфекционной
защиты организма, биологическая функция которого не менее важна, чем
фагоцитоз и секреция биологически активных веществ.
228
Сравнительное изучение явления запрограммированной клеточной смерти
хозяина под влиянием монокультур Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp.,
E.coli, Proteus spp. и их сокультивируемых вариаций показало, что во всех
опытных группах отмечалось появление апоптотических клеток. Однако,
стабильно статистически достоверные различия, по сравнению с контролем,
наблюдались и во II-ой группе мышей.
Результаты
наших
исследований
в
целом
характеризуют
сложные
взаимодействия патогена с клетками хозяина и на всех этапах взаимодействия
имеются определенные моменты, которые необходимо учитывать при подборе
этиопатогенетического
принципа
профилактики
и
лечения
инфекционных
процессов, связанных с монокультурами и ассоциациями условно-патогенных
энтеробактерий в целом, понимание которых имеет теоретическое и прикладное
значение для медицины.
ВЫВОДЫ
1. У штаммов бактерий Enterobacter, Citrobacter, Serratia, E. coli, Proteus
выделенных от больных, страдающих гнойно-воспалительными, урологическими,
кишечными инфекциями и от здоровых людей, при совместном культивировании
происходит изменение конструкции и архитектуры взаимрасположения клеток,
которая проявляется в виде увеличения количества контактов различных типов:
бок о бок, конец в бок, конец в конец, плотное слипание на уровне наружных
мембран и образование перемычек.
2. Электорнно-микроскопическое
исследование
показало,
что
в
концентрических зонах колоний у сокультивируемых вариаций Enterobacter,
Citrobacter, Serratia, E. coli, Proteus обнаружены клетки имеющие большое
количество швермеров, по сравнению с их монокультурами, которые образуются в
зависимости от пульсации биологических часов.
3. При
сравнительном
электронно-микроскопическом
исследовании
адгезивной активности обнаружено, что клетки совместно культивируемых
штаммов бактерий Enterobacter, Citrobacter, Serratia, Е.соli, Proteus с высокой
адгезивной активностью в большом количестве (более 15) плотно прилипают к
229
эритроцитам цыпленка, тогда как количество прилипающих клеток у монокультур,
составляло не более 10 на единичный эритроцит. Высокоадгезивные штаммы
Enterobacter, Citrobacter, Serratia, Е.соli, Proteus по периметру имели реснички
длиной 100-500 нм. и шириной 2,0-6,0 нм, соответственно.
4. При
совместном
культивировании
штаммов
бактерий
Enterobacter,
Citrobacter, Serratia, E. coli, Proteus происходит статистически достоверное
увеличение
гемолитической,
антиинтерфероновой,
лецитиназной,
ДНК-азной,
антикомплементарной
антилизоцимной,
активностей,
ЛТ-
энтеротоксигенности и вирулентности, по сравнению с их монокультурами.
5. Дана сравнительная характеристика вирулентных свойств монокультур
Enterobacter, Citrobacter, Serratia, E. coli, Proteus и у их сокультивируемых
вариаций на различных биологических моделях, и отобраны штаммы E. coli,
обладающие комплексом факторов патогенности, которые были депонированы в
ГИСК им. Л.А. Тарасевича и запатенотованы (патенты: E.coli ГИСК №280, патент
№ 2293765; E.coli ГИСК №281, патент № 2293764).
6. Сравнительное
монокультур
изучение
спектра
лекарственной
Enterobacter, Citrobacter, Serratia, E. coli,
устойчивости
Proteus
и
у
у их
сокультивируемых вариаций показало, что при совместном култивировании
бактерий Enterobacter, Citrobacter, Serratia, E. coli происходит расширение спектра
устойчивости к широко применяемым в практике антибиотикам.
7. При сравнительном изучении профиля плазмидной ДНК у монокультур
Enterobacter, Citrobacter, Serratia, E. coli, Proteus и их сокультивируемых вариаций,
выявлено увеличение у сокультивируемых вариаций количества клонов несущих
плазмиду 60 МД., продуцирующих термолабильное токсическое вещество,
дающие «отек лап мышей» 95 мг. и выраженную кожно-некротическую пробу на
кроликах.
8. Сравнительное изучение механизмов действия сокультивируемых вариаций
бактерий Enterobacter, Citrobacter, Serratia, E. coli, Proteus на функции фагоцитов
зараженных мышей показало статистически достоверное увеличение количества
перитонеальных
фагоцитов,
активности
и
интенсивности
фагоцитоза,
230
лизосомальной,
НСТ-редуцирующей
активности
этих
клеток,
числа
экстрацилюлярных сетей и апоптозных клеток, по сравненению с действием
монокультур.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
1.
Для установления этиологической значимости ассоциаций штаммов бактерий
родов Enterobacter, Citrobacter, Serratia, E. coli, Proteus, выделенных от больных с
различными инфекциями, рекомендуется определение их факторов патогенности.
2.
Знания о взаимном индуцировании патогенных свойств при совместном
культивировании бактерий родов Enterobacter, Citrobacter, Serratia, E. coli, Proteus
рекомендуется
использовать
при
проведении
лечебно-профилактических
мероприятий инфекционных процессов, вызванных ассоциациями указанных
бактерий.
3.
Данные иммунологических исследований об изменениях в иммунной системе
животных рекомендуются в перспективе использовать для своевременной
коррекции иммунологических нарушений, вызываемых ассоциациями бактерий
родов Enterobacter, Citrobacter, Serratia, E. coli, Proteus.
4.
Штаммы E.coli ГИСК №280 (патент № 2293765), E.coli ГИСК №281 (патент
№ 2293764) рекомендуется использовать в качестве эталонных культур при
идентификации выделенных штаммов от больных и в биотехнологии в качестве
суперпродуцентов термолабильного энтеротоксина.
231
Список сокращений:
АИА – антиинтерфероновая активность
АКА – антикомплементарная активносоть
АЛА – антилизоцимная активность
АОК – антителобразующие клетки
ДНК – дезоксирибонкуклеиновая кислота
КонА – конкавалин А
ЛТ или LТ-энтеротоксин – термолабильный энтеротоксин
МД – мегадальтон
Мф – макрофаги
MS – маннозочувствительная реакция агглютинации
MR – маннозорезистентная реакция агглютинации
НВЛ – нейтрофильные внеклеточные ловушки
П Мф – перитонеальные макрофаги
ПЦР – полимеразно-цепная реакция
СТ или ST – энтеротоксин – термостабильный энтеротоксин
ФГА - фитогемагглютинин
ЭТКП – энтеротоксигенные кишечные палочки
ЭПКП – энтеропатогенные кишечные палочки
Вариации сокультивируемых штаммов:
Enterobacter spp.+Citrobacter spp. - (Е+С), Enterobacter spp.+Serratia spp. - (Е+S),
Citrobacter
spp.+Serratia spp. - (C+S), Enterobacter spp.+Е.coli - (Ent+Е.coli),
Citrobacter
spp.+Е.coli
-
(C
+Е.coli),
Serratia
spp.+Е.coli
-
(S+Е.coli),
Proteus+Enterobacter spp. spp. - (Prot+Е), Proteus spp.+Citrobacter spp. - (Prot+С),
Proteus spp.+Serratia spp. - (Prot+S), Proteus spp.+Е.coli - (Prot+Е.coli)
SdS - додецилсульфат натрия
232
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Абаев, Ю.К.. Раневая инфекция в хирургии. – Минск: Беларусь, 2003.-296с.
2. Абрамзон, О.М. Биологические свойства микроорганизмов как основа
прогнозирования тяжести гнойно-воспалительных заболеваний легких и плевры
/О.М. Абрамзон, О.Л. Карташова, А.В. Валышев, и др.// Журн. микробиологии,
эпидемиологии и иммунобиологии.-2004.-№3. С.7-10.
3. Абрамзон, О.М. Биологические свойства возбудителей и их коррекция при
острых гнойных заболеваниях легких и плевры. Автореф. дис. … д-ра. мед. наук.Оренбург -2004.
4. Аверина, И.В. Биологическая характеристика отдельных серологических
групп бактерий рода Proteus, изолированных от детей с острыми кишечными
заболеваниями / И.В. Аверина // Журн. микробиологии, эпидемиологии и
иммунологии. -1974. -№4. –С.66-71.
5. Адилханова, А.Н. Роль кишечной микрофлоры в патологии мочекаменной
болезни (МКБ) / А.Н. Адилханова, Н.У. Утегенов, Л.Г Константинова //
Медицинские науки. - 2009. - № 5.- С. 13-15.
6. Азнабаев,
выделенных
Г.К.
при
Биологические
моно-
и
свойства
ассоциированных
бактерий
рода
Citrobacter,
бактериальных
инфекциях.
Автореферат дисс. канд.мед.наук. Оренбург- 2003.
7. Алексахина, Н.Н. Влияние оксидов металлов на рост, гемолитические и
серологические свойства Klebsiella pneumoniae. / Алексахина Н.Н., Мирясова Л.В.,
Баснакьян И.А. // Журнал микробиологии. - 2002. - №6. – С.3-9.
8. Аталикова, Ж.Б. Бактериоцины в типировании серраций: автореф. дис. …
канд. мед. наук / Ж.Б. Аталикова. // Кабардина-Балкарская республика, г. Нальчик,
2000.
9. Ахтариева, А.А. Некоторые биологические свойства бактерий рода
Enterobacter, выделенных при различных инфекционных процессах: автореф. дис.
… канд. мед. наук. Уфа, 2000.
233
10. Ахтариева,
А.А.
Иммунобиологические
свойства
термолабильного
энтеротоксина бактерий рода Enterobacter в системе взаимодействия "патоген
хозяин". Автореф. дис. д-ра мед. наук. – Челябинск. – 2010.
11. Ашмарин,
И.П.,
Воробьев
А.А.
Статистические
методы
в
микробиологических исследованиях. - Л., Изд-во Мед.литературы.-1962. С.180.
12. Бабский, В.Г. Явление самоорганизации у бактерий на клеточном и
популяционном уровнях / В.Г. Бабский // Нелинейные волны. Динамика и
эволюция. - 1989. - С.299-303.
13. Бакиров, А.Б. Некоторые биологические свойства микрофлоры гнойновоспалительных осложнений у гематологических больных. /Бакиров А.Б.,
Габидуллин З.Г. //Гематология и трансфузиология – 1995.-№3.-с. 32-34.
14. Балабанов, М.В. Влияние фосфадена и унитиола на циклазную систему
слизистой тонкой кишки кролика на экспериментальном сальмонеллезе / М.В.
Балабанов, В.И. Мелихов, В.А. Юркиев // Журн. Микробиол. -1988. -№3. - С.82-85.
15. Барановский, А.Ю. Дисбактериоз и дисбиоз кишечника. / Барановский А.Ю.,
Кондрашина Э.А.// -С-Питербург, 2002.- С.224.
16. Белобородов,
В.Б.
Антибактериальная
терапия
больных
oстрыми
кишечными инфекциями. / Белобородов В.Б., Алятин Ю.С.// Сonsilium medicum. 2002.-№6,т.4-с.43-47.
17. Белобородова, Н.В. Особенности микрофлоры зева у детей в отделениях
интенсивной терапии / Н.В. Белобородова, Т.Ю.Вострикова // Антибиотики и
химиотерапия. – 1998. - №8. – С.16 – 22.
18. Белокрысенко, С.С. Микробная экология и ретроспективная оценка
возможности прогноза вспышки гнойных менингитов, вызванной штаммом
Serratia marcescens, в стационаре для выхаживания недоношенных детей / С.С.
Белокрысенко, Н.В. Шестопалов, В.П. Гераськина, Р.Ф. Парфенюк
// Журн.
микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. - 1992. - №2.- С. 28- 31.
19. Белокрысенко,
С.С.
Неконтролируемое
формирование
микрофлоры
кишечника новорожденных в условиях стационара и его последствия. /
234
Белокрысенко С.С. Бажина Е.В. // Всесоюзный семинар по антибиотикотерапии:
Тезисы. - М.,1988. – ч.1. - С.3020. Бельский, В.В. Взаимное влияние возбудителей при смешанной инфекции
ожоговой травмы. /В.В. Бельский, Е.В. Шаталова //Журн. микробиологии,
эпидемиологии и иммунобиологии-1999.-№4. С.3-4.
21. Беляков В.Д. Проблема саморегуляции паразитарных систем и механизмы
развития эпидемиологического процесса.// Вестн. АМН СССР.-1983.-№5.-С.3-9.
22. Березина, Л.А. Частота встречаемости и характеристика штаммов Klebsiella
pneumoniae при инфекциях новорожденных./ Березина Л.А., Ценева Т.Я., Бойков
С.Г., и др. // Журнал микробиологии.-1993.-№5.-С.18–22.
23. Бернасовская,
В.К.
Условно-патогенные
микроорганизмы
и
их
этиологическое значение при острых кишечных инфекциях / В.К. Бернасовская,
Ю.А. Барштейн // Острые кишечные инфекции, вызванные условно-патогенными
микроорганизмами. – Киев, 1984. - С.5-39.
24. Бигон М., Харпер Дж., Таунсенд К. Экология. Особи, популяции и
сообщества: Пер. с англ.-М., 1989.-Т.2.- С.118-121.
25. Биргер М.О. Справочник по микробиологическим и вирусологическим
методам исследования. М.; Медицина, 1982, 464 с.
26. Бисенова, Н.М. Сочетанная продукция энтеротоксинов и MR-адгезинов
штаммами цитробактер / Н.М. Бисенова, Ш.И. Сарбасова // Матер. V объед. съезда
гиген. эпидемиол. микробиол. паразитол. и инфекц. Казахстана. - 1991. - Т.5. –
С.19-21.
27. Бисенова, Н.М. Энтеротоксигенная активность цитробактер различного
происхождения / Н.М. Бисенова // Матер. V объед. съезда гиген. эпидемиол.
микробиол. паразитол. и инфекц. Казахстана. - 1991. -Т.5. – С. 17-19.
28. Боев, Б.В. Методическая модель оперативного анализа и прогноза вспышек
госпитальных инфекций среди новорожденных (на примере клебсиеллезной
инфекции) / Б.В. Боев, В.М. Бондаренко // Журн. микробиологии, эпидемиологии
и иммунологии. -1996, - №3. - С. 106-109.
235
29. Божокина, Е.С. Термолизиноподобные металлопротеазы бактерий и их роль
в инвазии эукариотических клеток. /Е.С. Божокина //Автореф. к.б.н. СанктПетербург, 2008. С.24.
30. Бондаренко, В. М. / Влияние гемолитических плазмид на развитие
“бьющего эффекта” у энтеробактерий разных видов. // Бондаренко В.М., Голубева
А. В., Корягина И.П. // Ж. Микробиол.- 1983.- №9. С. 50- 53.
31. Бондаренко, В. М. Гемолизины энтеробактерий и их связь с вирулентностью
возбудителя / В.М. Бондаренко, А.В. Голубева // Журн. микробиологии,
эпидемиологии и иммунологии. - 1988. - №11. –С. 102-109.
32. Бондаренко, В. М. Общий анализ представлений о патогенных и условно
патогенных бактериях / В.М. Бондаренко // Журн. микробиологии, эпидемиологии
и иммунологии. – 1997. – С. 180-183.
33. Бондаренко, В.М. Характеристика плазмиды Klebsiella pneumonia, несущей
маркеры лекарственной устойчивости и антилизоцимной активности / В.М.
Бондаренко, А.Л. Яблочков, Ю.М. Романова, В.Г. Петровская
// Журн.
микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. -1988.- №3.- С. 28- 32.
34. Бондаренко, В.М. Антилизоцимный фактор Klebsiella pneumoniae: природа,
биологические функции и генетический контроль. / Бондаренко В.М., Петровская
В.Т., Яблочков А.Л. // Журнал микробиологии.- 1994.-№5.- Приложение.- С.22-27.
35. Бондаренко, В.М. Клеточный и молекулярный уровни взаимодействия
паразита и хозяина / В.М. Бондаренко, Ю.Е. Полоцкий // Эпидемический процесс
как социально - экологическая система / М., 1986.- С. 138-150.
36. Бондаренко, В.М. О значимости высеваемости клебсиелл, энтеробактер,
цитробактер, и кишечных иерсиний при бактериальных исследованиях. /
Бондаренко В.М., Тимофеева И.Г. // Ж.Микробиол.- 1987.-№5.-С.74-78.
37. Бондаренко, В.М. Термостабильные энтеротоксины условно-патогенных
представителей Enterobacteriaceae / В.М. Бондаренко, А.Р. Мавзютов, З.Г.
Габидуллин // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. - 1998.-№3.С.104-107.
236
38. Бондаренко, В.М. Факторы патогенности бактерий и их роль в развитии
инфекционного процесса.// Ж. микробиол.-1999.- №5.-С.34-39.
39. Бондаренко, В.М. Энтеротоксигенная способность штаммов родов Klebsiella
и Enterobacter, выделенных при острых кишечных заболеваниях у детей./
Бондаренко В.М., Баркус М.М., Бондаренко Вл.М.//Ж.микробиол.-1990.-№10.С.28-32.
40. Бондаренко, В.М. Характеристика плазмиды Klebsiella pneumonia, несущей
маркеры лекарственной устойчивости и антилизоцимной активности /В.М.
Бондаренко, А.Л. Яблочков, Ю.М. Романова и др. //Журн. микробиологии,
эпидемиологии и иммунобиологии. - 1988. - №11. - С.102-109.
41. Борисов С.Д.. Антилизоцимная активность менингококков и ее применение
в диагностике менингококковой инфекции: Автореф. дис.
… канд. Мед. наук.-
Челябинск, 1988.-24с.
42. Бочков,
И.А.
новорожденных
Особенности
формирования
в раннем неонатальном периоде
аутомикрофлоры
(эпидемиологические
у
и
микробиологические аспекты). Автореф. дисс. … докт. мед. наук. М., 1998. С.243.
43. Бочков, И.А.. Микрофлора зева у здоровых в условиях экстремальных
состояний / И.А. Бочков, Н.А.Селин, Н.Н.Лизько, Л.П.Юрко // Эпидемиология и
инфекционные болезни. – 1998. - №3 - С.26-30.
44. Бриан,
Л.Е.
Бактериальная
резистентность
и
чувствительность
к
химиопрепаратам. / Бриан Л.Е. / Москва.-1984.
45. Брилис, В.И. Методика изучения адгезивного процесса микроорганизмов./
Брилис.В.И., Брилене Т.А., Ленцнер Х.П., Ленцнер А.А. // Лабораторное дело.1986.- №4.-С.210-212.
46. Брудастов, Ю.А. Антикомплементарная активность бактерий: Автореф.
дисс. … канд. Мед. наук. – Челябинск, 1992.-24 с.
47. Брудастов,
Ю.А.,
Дерябин
Д.Г..
Биологическое
значение
антикомплементарной активности бактерий.//Журн. микробиол., эпидимиол.
иммунобиол.-1994.-Приложение. - С.28-32.
237
48. Брудастов, Ю.А. Антикомплементарная активность./ Брудастов Ю.А.,
Валышев А.В., Брудастов А.Н. // Журнал микробиологии. - 1996.-№3. - С.91-93.
49. Брудастов, Ю.А. Определение антикомплементарной активности бактерий
по кинетике иммунного гемолиза.// Вестник ОГУ.-2005.- №12.-С.51-54.
50. Будашеев, В.П. Анализ причин осложнений вторичной хирургической
обработки гнойных ран по материалам Республиканской клинической больницы
им. Н.А. Семашко г. Улан-Удэ / Будашеев В.П., Цыбиков Е.Н., Лепехова С.А.,
Санжимитыпов С.М. // Сибирский медицинский журнал (г. Иркутск). - 2009. - Т.
89. № 6. - С. 59-61.
51. Булгаков, А.К. Факторы вирулентности и лекарственной устойчивости
некоторых представителей семейства Enterobacteriaceae, их чувствительность к
новому ряду азотсодержащих гетероциклов. Автореф. дис. … д-ра. мед. наук.Челябинск.- 2000.
52. Буркин,
А.В.
Клинико-эпидемиологическая
характеристика
острых
кишечных инфекций у детей нижнего Поволжья / Буркин А.В., Харченко Г.А. //
Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2006. - № 1. - С. 6972.
53. Бутакова, Л.Ю. Динамика клинико-лабораторных показателей у больных
гнойно-воспалительными процессами, иммунизированных протейной вакциной:
автореф. дис. … канд. мед. наук / Бутакова Л.Ю.// - Москва, 1984.
54. Бухарин, О. В. Бактерионосительство. / О.В. Бухарин, Б.Я. Усвяцов
//
Екатеринбург. - 1996. – с.78 – 89.
55. Бухарин,
О.В.
Антикомплементарная
активность
производственного
штамма Bacillus cereus IP 5832 и энтеробактерий при их совместном
культивировании. / Бухарин О.В., Брудастов Ю.А., Валышев А.В., Брудастов А.Н.
// Журн. микробиол.-1996.-№3.-С.91-93.
56. Бухарин,
О.В.
Антилизоцимный
тест
микроорганизмов / Бухарин О.В., Усвяцов Б.Я.
как
маркер
персистенции
// Теоретическая и прикладная
иммунология: Тез. Докл.1 всесоюзн. конф. / М., 1982.- С.58-34.
238
57. Бухарин, О.В. Биология патогенных кокков / О.В.Бухарин, Б.Я. Усвяцов, О.Л.
Чернова. // М.: Медицина, Екатеринбург: УрО РАН. – 2002. с.281-282.
58. Бухарин, О.В. Биомедицинские аспекты персистенции бактерий.//Журнал
микробиологии. - 1994.- №4.-Приложение.- С.4-13.
59. Бухарин, О.В. Изучение антикомплементарной активности стафилококков./
Брудастов Ю.А., Дерябин Д.Г.// Ж. Клин. лаб. диагн.-1992.-№3.-С.43-46.
60. Бухарин, О.В. Лизоцим микроорганизмов / Бухарин О.В., Васильева Н.В.,
Усвяцов Б.Я. // Томск,1984.- С.214.
61. Бухарин, О.В. Межбактериальные взаимодействия./ Бухарин О.В., Усвяцов
Б.Я., Хуснутдинова Л.М. //Журнал микробиологии.-2003.-№4.-С.3-8. 45
62. Бухарин, О.В. Определение антилизоцимной активности. / Бухарин О.В.,
Усвяцов Б.Я., Малышкин А.П., Немцова Н.В. // Журнал микробиологии.- 1984. №2.- С.27-28.
63. Бухарин, О.В. Персистенция патогенных бактерий: теория и практика / О.В.
Бухарин // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. - 2000, - №4.С.4-7.
64. Бухарин, О.В. Питательная среда для выделения стафилококков с
персистентными характеристиками. / Бухарин О.В., Матюшина С.Б., Чернова О.Л.
// Ж.Клиническая лаб.диагностика. – 1999.-№8. – С.35-36.
65. Бухарин, О.В. Способ определения антиинтерфероновой активности
микроорганизмов. А.с.1564191 СССР / Бухарин О.В., Соколов В.Ю. // № 18.-1990.
66. Бухарин,
разнообразия
О.В.
Экологическая
патогенных
детерминированность
бактерий
/О.В.Бухарин,
внутривидового
В.А.Гриценко
//
Ж.Микробиолог.-2000.-№1.- С.103-105.
67. Бухарин, О.В.
антибиотикам.
Антилизоцимная активность бактерий и ее регуляция
/ Бухарин О.В., Усвяцов Б.Я., Зыкова Л.С. и др. //Антиб. и мед.
биотехнол.-1987.-№8.-С.597-602.
68. Бухарин,
О.В.
Антилизоцимный
тест
как
маркер
персистенции
микроорганизмов /Бухарин О.В., Усвяцов Б.Я. // Теоретическая и прикладная
иммунология: Тез. Докл.1 всесоюзн. конф. /М., 1982.-С.58-64.
239
69. Бухарин, О.В. Антилизомцимная активность менингококков. /Бухарин О.В.,
Борисов С.Д., Езепчук Ю.В. и др. //Журн. микробиологии, эпидемиологии и
иммунобиологии. - 1991.-№7. - С. 17-20.
70. Бухарин, О.В. Биологическое значение антикарнозиновой активности
бактерий. /Бухарин О.В., Стадников А.А., Чернова О.Л. и др. // Журн. микробиол.
- 2000. - №4. - Приложение. - С. 56-59.
71. Бухарин, О.В. Межбактериальные взаимодействия. / О.В. Бухарин, Б.Я.
Усвяцов, Л.М. Хуснутдинова //Журнал микробиол.-2003.-№4.-С.3-8.45
72. Бухарин, О.В. Механизмы выживания бактерий. / О.В. Бухарин, А.Л.
Гинцбург, Ю.М. Романова, Г.И. Эль-Регистан //М.: Медицина. 2005.- 367.
73. Бухарин, О.В. Механизмы персистенции бактериальных патогенов //Вестн.
РАМН. - 2000. - №2. - С. 43-49.
74. Бухарин, О.В. Персистенция патогенных бактерий. - М.: Медицина. – 1999.
– 368 с.
75. Бухарин, О.В. Персистенция патогенных бактерий: теория и практика
//Журн. микробиол. - 2000. - №4.- Приложение. - С. 4-7.
76. Бухарин О.В., Гинцбург А.Л., Романова Ю.М. с соавт. Механизмы
выживания бактерий. М.: Медицина; 2005.-367с.
77. Бухарин О.В., Лобкова Е.С., Немцева Н.В. с соавт. Ассоциативный симбиоз.
Екатеринбург: УрО РАН, 2007.-264.
78. Бухарин О.В., Усвяцов Б.Я., Хлопко Ю.А. Структурно-функциональная
характеристика микросимбиоциноза человека // Журн. микробиол., эпидимиол.
иммунобиол. – 2009.-№4.-С.4-8.
79. Вальд А. Последовательный анализ. М., Медицина, 1960, С.57-60.
80. Валышев, А.В. Факторы персистенции энтеробактерий фекальной флоры
при дисбиозе кишечника. / Валышев А.В., Гильмутдинова Ф.Г., Фомичева С.В. //
Ж.Микробиол.- 1996.-№3.-С.96-98.
81. Валышев, А.В. Влияние водорастворимых витаминов на антилизоцимную
активность энтеробактерий.
/Валышев А.В., Кириллова В.А., Кириллов Д.А. //
Журн. микробиол.-2000. - №4. - Приложение. - С.80-82.
240
82. Валышев, А.В. Факторы персистенции энтеробактерий и влияние на них
пробиотиков при дисбиозе кишечника.- Автореф. дис. … канд. мед. наук.Оренбург. - 1997. – 18 с.
83.
Вартанян, Ю.П. Отек лап белых мышей-тест для оценки активности
энтеротоксинов / Ю.П. Вартанян, М.К. Северцева, О.И. Введенская, Е.С.
Станиславский. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. -1978. -№2. С.150-152.
84. Вертиев, Ю.В. Бактериальные токсины и биотехнология / Ю.В. Вертиев //
Микробиологические аспекты иммунобиотехнологии: Сб.трудов. -М., 1992. -С.2432.
85. Вертиев, Ю.В. Бактериальные токсины: биологическая сущность и
происхождение.//Журнал микробиол.- 1993.- №3.-С.43-46.
86. Вильшанская,
Н.И.
Микробиологические
подходы
к
установлению
этиологического значения выделенных при острых кишечных заболеваниях
условно-патогенных энтеробактерий / Н.И. Вильшанская, Р.В. Энштейн-Литвак //
IV Всероссийский съезд эпидемиологов и микробиологов. -М., 1978. -С.113-116.
87. Вишневская, С.М. Видовой состав бактерий семейства Enterobacteriaceae./
Вишневская С.М.// Издание лабораторное дело.- 1982.- №11.-С.677-679.
88. Воеводин,
Д.А.
Роль
дисбактериоза
в
формировании
хронической
неинфекционной патологии у детей. / Воеводин Д.А., Розанова Г.Н., Стенина
М.А., Чередеев А.Н. // Журнал микробиол.- 2001.-№6.-С.88-93
89. Войно-Ясенецкая, М.К. Опыт изучения дизентерийной инфекции и
устойчивость лабораторных животных. / М.К. Войно-Ясенецкая // Журн.
микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. - 1957. - №4.-С.65-69.
90. Воробьев, А.А. Бактерии нормальной микрофлоры: биологические свойства
и защитные функции./ Воробьев А.А., Лыкова Е.А. // Журн. микробиологии. –
1999.- №6.- С.102-105.
91. Воробьев, А.А. Изменения микробиоценоза толстой кишки у больных
различными заболеваниями. / Воробьев А.А., Иноземцева Л.О., Буданова Е.В.,
Пашков Е.П., Несвижский Ю.В. и др. // Вестн. РАМН. – 1995.- №5.-С.59-64.
241
92. Воробьев, А.А. Мир микробов./А.А. Воробьев, А.Л. Гинцбург, В.М.
Бондаренко // Вестник РАМН. – 2000.- № 11.- С.11-14.
93. Воробьев, А.А. Популяционно-генетические аспекты микробиологического
фенотипа кишечника здорового человека / А.А. Воробьев, Ю.В. Несвижский, Е.В.
Буданова,
Л.О.
Иноземцев
//
Журн.
микробиологии,
эпидемиологии
и
иммунологии. – 1995. -№4.- С.30-35.
94. Вышегуров, Я.Х. Кишечный эндотоксин как важный фактор патогенеза
иридоциклитов и эндофтальмитов неясной этиологии. / Вышегуров Я.Х., Закирова
Д.З., Расческов А.Ю., Яковлев М.Ю. // Казанский медицинский журнал. - 2007. - Т.
88. № 6. - С. 570-573.
95. Габидуллин,
З.Г.
Биологическая
характеристика
штаммов
Proteus,
выделенных при инфекционных процессах различной локализации. Автореф. дис.
… д-ра. мед. наук.- Саратов.-1990.
96. Габидуллин, З.Г. Биология О-формы протея. Автореф. дис. … канд. мед.
наук / Габидуллин З.Г. – Челябинск, 1978.
97. Габидуллин,
З.Г.
Энтеротоксигенная
способность
гемолизинпродуцирующих штаммов протеев, выделенных при острых кишечных
инфекциях у детей / Габидуллин З.Г., Батыршин Р.А., Жукова С.Л. и др. // Журн.
Микробиол. - 1990. - №6. - С.49-53.
98. Габидуллин, З.Г. Характеристика свойств определяющих, персистенцию
моно- и ассоциированных культур условно-патогенных энтеробактерий. /
Габидуллин З.Г., Габидуллин Ю.З., Ахтареева А.А. и др. / Ж. микробиология. –
2006. - №4. – с. 62-64.
99. Габидуллин, Ю.З. Сравнительная характеристика некоторых биологических
свойств монокультур и сокультивируемых вариаций бактерий родов Enterobacter,
Citrobacter, Serratia: Автореф. дис. … канд. мед. наук. - Уфа, 2006.
100.
Габрилович, И.М. Гетерогенность антилизоцимной активности в
популяциях условно-патогенных энтеробактерий. / Габрилович И.М., Бозиев В.Б.,
Габрилович М.И., Нагоев Б.С., Накова Л.В., Усаева Я.С. // Журнал микробиол.1994.- №5 (приложение). - С.32-33.
242
101.
Габрилович,
И.М.
Тиолактивируемые
гемолизины
как
фактор
бактерий родов цитробактер и серраций / И.М. Габрилович, Р.Х. Гайрабеков, М.А.
Шеожев, О.С. Якушенко // Персистенция бактерий. – Куйбышев. –1994. - С.67-71.
102.
Габриэлян, Н.И. Функции микрофлоры желудочно-кишечного тракта и
последствия ее нарушения после хирургических вмешательств / Н.И. Габриэлян, Е.М.
Горская, Н.Д. Снегова // Антибиотики и химиотерапия. – 2000. – Т45, №9 – С. 24-29.
103.
Газиев, Г.М. Характеристика штаммов клебсиелл, выделенных от
больных острыми кишечными заболеваниями. / Газиев Г.М., Батуро А.П. //
Журнал микробиол. - 1986.- №5.- С.32-34.
104.
Галикеев, Х.Л. Изучение вирулентности дизентерийных бактерий с
использованием инфузорий-туфелек / Х.Л. Галикеев, Н.И. Потатуркина-Нестерова //
Здравоохр. Казахстана.- 1987. -№1.-С.34-36.
105.
Гашимова, Д.Т. Биологические свойства клинических штаммов
Morganella, выделенных от больных с инфекционными процессами различной
локализации.- Автореф. дис. … к-та. мед. наук.-Уфа.-1995.
106.
Гашимова, Д.Т. Определение лецитиназной активности у бактерий
рода Морганелла моргании. / Д.Т. Гашимова, Э.А. Галиева, Д.Ф. Сайфуллина. //
Тез. Докладов 57 – научной конференции БГМИ. Вопросы теоретической и
практической медицины. – Уфа - 1992. – с. 28.
107.
Герасимов В.Е. Роль антилизоцимной активности во внутриклеточном
паразитировании шигелл: Автореф. дис. … канд. Мед наук.-Челябинск, 1989.-24с.
108.
Гимранов,
М.Г.
Факторы,
определяющие
взаимоотношения
возбудителей гнойных инфекций. Автореферат дис. … доктора мед. наук /
Гимранов М.Г. – Куйбышев, 1967.
109.
Гинцбург, А.Л. Современное состояние и перспективы молекулярно-
генетических методов в решении задач медицинской микробиологии / А.Л. Гинцбург,
Н.А. Зиангирова, Ю.М. Романова // Журн. микробиологии, эпидемиологии и
иммунологии. – 1999. - №5. - С. 22-26.
110.
1998.-459с.
Гланц С. Медико-биологическая статистика. Пер. с англ. М. Практика,
243
111.
Глазева С.А. Роль микробного фактора в течении осложненных форм
рожистого воспаления: Автореф. дис. … канд. мед. наук. - Оренбург, 2008.-32с.
112.
Годзе,
Г.М.
Серологическая
характеристика
бактерий
рода
цитробактер / Г.М. Годзе, Г.М. Чупрун // Острые кишечные инфекции. -Л., 1978. №2. -С.109-112.
113.
Гордейко, В.А. Потенциально патогенные бактерии в природе. /В.А.
Гордейко. - М., 1991. - С.75-86.
114.
Гостева, В.В. Адгезия Klebsiella pneumoniae на эпителиоидных клетках
in vitro./ Гостева В.В., Бондаренко В.М., Корягина И.П., Клицунова Н.В. // Журнал
микробиол. - 1984.- №3. - С.32-35.
115.
Государственный доклад о состоянии здоровья населения Российской
Федерации в 2001 году.// Здравоохранение Российской Федерации.-2003.-№4.-С.317.
116.
Грачев, С.В. Современные аспекты патогенеза сепсиса / С.В. Грачев и
др. // Тер. Архив. - 2003. - №11. - С.84-89.
117.
Гречухина, Ю.А. Особенности иммунной системы и центральной
гемодинамики у больных ангиной в зависимости от уровня сердечного тропонина
Т в сыворотке крови / Ю.А. Гречухина, В.Н.Ослопов, В.Х.Фазылов // Казанский
медицинский журнал. – 2003.- №2.- С.89-97.
118.
Громова, Г.Г. Микробиологические критерия ранней диагностике
пиелонефрита у детей. - Автореф. дис. …канд. мед. наук. - Оренбург, 1996. – 21 с.
119.
Гуманенко Е.К., Лебедев В.Ф., Рожков А.С. и соавт. Инфекционные
осложнения ранений и травм.//Хирургическая инфекция: проблема, пути решения.
Выпуск 1.-Оренбург,2003.-С.5-14.
120.
Далин, М.В. Белковые токсины микробов / М.В. Далин, Н.Г. Фиш // –
М., 1980. – С. 179-180.
121.
Дерябин, Д.Г. Роль персистентных характеристик
возбудителя в
определении затяжного течения гнойно-воспалительного процесса. / Дерябин Д.Г.,
Курлаев П.П., Брудастов Ю.А. // Журн. микробиол. - 1996. - №3. - С. 74-77.
244
122.
Дещекина, М.Ф. Новые возможности защиты новорожденных детей от
контаминации условно-патогенными микроорганизмами. / Дещекина М.Ф.,
Коршунов В.И., Демин В.Ф. и др. // Педиатрия. - 1993.-№4.- С.9-12.
123.
Дж. Миллер. Эксперименты в молекулярной генетике / Дж. Миллер.//
М. Мир, 1976. - С. 325.
124.
Дж. Хоулт. Определитель бактерий Берджи / Перевод с англ. Под
редакцией Дж. Хоулта, Н. Грига, П. Сита, С. Уильямса. // Москва, Мир,1997.С.432.
125.
Джамали, Н.Ф. Становление биоценоза кишечника у здоровых и
больных новорожденных детей. / Джамали Н.Ф., Бони Е.Г. // Педиатрия. - 1991.№2.- С.88-91.
126.
Дикий, В.Н. К вопросу о болезнетворных свойств протея / В.Н. Дикий
// Кишечные инфекции. Киев. - 1974. - №7. - С. 163-165.
127.
Дмитриева, С.Н. Функциональное состояние желудочно-кишечного
тракта и коррекция дисбактериоза кишечника у новорожденных и детей первых
месяцев жизни. Автореф. дисс. … канд. мед. наук. - Запорожье. 1990. С.20.
128.
Долгушин, И.И. Нейтрофилы и гомеостаз / И.И. Долгушин, О.В.
Бухарин. – Екатеринбург, 2001.-259 с.
129.
Долгушин, И.И. Нейтрофильные внеклеточные ловушки и методы
оценки функционального статуса нейтрофилов: монография / И.И. Долгушин,
Ю.С. Андреева, А.Ю. Савочкина.- М.: РАМН, 2009.-208с.
130.
Домарадский, И.В. Вирулентность бактерий как функция адаптации
//Журн. микробиол. - 1997. - №4. - С.16-20.
131.
Домбровский, А.М. Особенности представленных микроорганизмами
семейства Enterobacteriaceae, ассоциаций, выделенных из испражнений здоровых и
больных сальмонеллезом детей / А.М. Домбровский, А.В. Бодрягина // Журн.
Микробиол. - 1986. - №12. - С.38-43.
132.
Дорофейчук, В.Г. Дисбактериоз кишечника у детей в период
новорожденности и его последствия./ Дорофейчук В.Г., Леканцева Г.А.
//Педиатрия.-1982.-№1.-С.72-77.
245
133.
Езепчук, Ю.В. Патогенность как функция биомолекул. / Ю.В.
Езепчук./ М.: Медицина, 1985. – С.145.
134.
Елагина, Н.Н. Факторы персистенции неспорообразующей анаэробной
микрофлоры кишечника человека. / Автореф. дис. … канд. мед. наук. - Оренбург,
2000. - 18с.
135.
Еремина, Н.В. Региональная распространенность воспалительных
заболеваний уха и их лечение с учетом чувствительности микрофлоры. / Еремина
Н.В., Владимирова Т.Ю., Еремин С.А., Головизнина К.С. // Медицинский
альманах. 2008. № 2. С. 51-53.
136.
Жуковицкий,
В.Г.
Обоснование
рациональной
антибактериальной
терапии в оторинолярингологии с позиции бактериолога / В.Г. Жуковицкий //
Consilium medicum. – 2001.-Т3, №8 – С.362-371.
137.
Заикина, О.Л. Клиническое значение антилизоцимного признака
возбудителей инфекции мочевой системы у детей. Автореф.дис. …к.м.н.
Оренбург, 1995.
138.
Зайцев, В.М. Прикладная медицинская статистика [Текст] / В.М.
Зайцев, В.Г. Лифляндский, В.И. Маринкин.- СПб.: Фолиант, 2006.-432с.
139.
Запруднов, А.М. Микробная флора кишечника и пробиотики. /
Запруднов А.М., Мазанкова Л.Н. // Москва. 1999. С.117.
140.
Зыкова, Л.С. Роль персистентных характеристик микрофлоры в
этиологической диагностике и определении источников инфицирования органов
мочевой системы при пиелонефрите у детей первого года жизни // Журн.
микробиол. - 1997. - №4. -С. 98-102.
141.
Изикаев, В.М. Некоторые биологические свойства монокультур и
сокультивируемых вариаций бактерий рода Enterobacter и Staphilococcus aureus и
особенности их действия на перитонеальные макрофаги мышей: Автореф. дис. …
к.м.н. – Челябинск -2013.
142.
Иерусалимский, И.Д. Физиология развития чистых бактериальных
культур: Автореф. дис. … д-ра. биол. наук. М., 1952. – С.38.
246
143.
Ильинская, Б.В. /О критериях вирулентности микробов рода протея.
Ильинская Б.В., Керашева С.И.//Изобретательство и рационализация в
медицине.-1979.-.179-181.
144.
Калюжная, Л.Д. Бактериологическая характеристика микробной
флоры кишок у детей раннего возраста при пневмонии с кишечным синдромом. /
Калюжная Л.Д., Балезина Т.А. и др. // Кишечные инфекции: Респ. межвед.сб. Киев. -1985.- С.62-65.
145.
Каральник, Б.В. Стандартизация определения фимбрий / адгезины
Citrobacter / Б.В. Каральник, Ш.И. Сарбасова, Т.Д. Акбаев // Лаб. дело -1990. - №2.
– С. 46-49.
146.
Керашева, С.И. Определение лецитиназной активности бактерий рода
Proteus. /Керашева С.И., Притчина Е.А., //Лаб. Дело.-1974,-№3.-С. 99-100.
147.
Киселева, Б.С. Роль Klebsiella pneumoniae в этиологии бактериального
сепсиса. / Киселева Б.С., Красноголовец В.Н. // Журнал микробиологии. - 1983.№2.- С.20-22.
148.
Клемпарская, Н.Н. О роли протея в этиологии пищевых отравлений.
//Ж. микробиол. -1948.-№6.-С.63-65.
149.
Колкер,
послеоперационной
И.И.
Клинико-бактериологические
бактериемии
и
септического
сопоставления
тромбоэндокардита
при
протезировании клапанов сердца / И.И. Колкер, О.А. Крастин, А.М. Светухин, и
др. // Проблемы клинической микробиологии в неинфекционной клинике.Винница, 1983. - С.73-74.
150.
Коротяев,
А.И.
Медицинская
микробиология,
иммунология
и
вирусология./ Коротяев А.И., Бабичев С.А. // С.-П., Специальная литература.1998.- С.592.
151.
Коршунов, В.М. Влияние подкожной контаминации стафилококками
на состояние микрофлоры кишечника у животных. / Коршунов В.М., Радакова
Е.Д., Дугашева Л.Г. // Ж.микробиол.-1990.-№3.- С.105-105.
247
152.
Коршунов,
В.М.
Микроэкология
желудочно-кишечного
тракта.
Коррекция микрофлоры при дисбактериозах кишечника. / Коршунов В.М.,
Володин Н.Н., Ефимов Б.А. и др. // М.1999. С.178.
153.
Костюковская, О.Н. К вопросу о роли бактерий рода Citrobacter в
этиологии острых кишечных заболеваний / О.Н. Костюковская, Е.А. Гладкая, В.Т.
Бунин и др. // Кишечные инфекции. - Киев, 1981. -№13. -С.74-77.
154.
Кочорбаев,
Т.К.
Изучение
этиологического
значения
условно-
патогенных микроорганизмов при остром аппендиците / Т.К. Кочорбаев,
Т.А.Абдыкеримова//Проблемы клинической микробиологии в неинфекционной
клинике. - Винница, 1983. - С.60-61.
155.
Кошнина, Е.П. О сочетанном поражении слизистых оболочек бронхов
и желудочно-кишечного тракта при атопическом синдроме и крапивнице./
Кошнина Е.П., Колганова Н.А., Фурмон Н.Е., Грачева Н.М., Щербаков И.Т.,
Аваков А.А., Соловьева А.И. // Пульмонология. - 1984.-№3.-С.22-23.
156.
Куваева, И.Б. Микроэкологические и иммунные нарушения у детей. /
Куваева И.Б., Ладодо К.С. // М.-1991.- С.224.
157.
Куземин, А.А. Современный подход к антибиотикопрофилактике при
абортах и "малых" гинекологических операциях // Гинекология. – 2005. - Т.7. №2. – с. 13-17.
158.
Кузнецова, Т.А. Клинико-этиологическая характеристика и оценка
эффективности антибиотикотерапии острых осложненных пневмоний у детей. /
Кузнецова Т.А., Катосова Л.К., Акуратова Л.Л. // Вопросы охраны материнства и
детства.-1989.-№7.-С.33-36.
159.
Кузьмин, М.Д. Влияние радиоволновой гипертермии на микрофлору
предстательной железы при лечении простатита, осложнённого бесплодием. /
Кузьмин М.Д., Бухарин О.В., Иванов Ю.Б., Михайлов Е.А.
//Журн.
микробиол.-2001.-№4.-С.95-97.
160.
Кулинич, Д.Г. Взаимосвязь состояния иммунитета и микробиоценоза
кишечника у детей раннего возраста, больных острыми заболеваниями органов
248
дыхания. / Кулинич Д.Г., Абатуров А.Е., Герасименко О.Н. // Педиатрия. - 1990.№10.- С.15-17.
161.
Кулпова, Н.В. Передача R-плазмид и выражение их генов в Proteus
mirabilis // Ж.микробиол.-1977.-№9.-С.106-114.
162.
Кушнарева,
М.В.
Микрофлора
кишечника
и
её
коррекция
биопрепаратами при пневмонии у новорожденных детей. / Кушнарева М.В.,
Черноног М.Н., Дементьева Г.М. и др. // Национ. конгресс по болезням органов
дыхания,5-й: Сб. резюме - Москва 14-17 марта 1995.-№.940.
163.
Леванов, А.В. Феномен бактериальной
транслокации
условно-
патогенных микроорганизмов из желудочно-кишечного тракта / А.В. Леванов //
Антибиотики и химиотерапия. – 2001. – Т46, №5. – С.28-30.
164.
Леванова, Л.А. Становление микрофлоры кишечника у детей первого
года жизни. / Леванова Л.А., Алёшкин В.А., Воробьев А.А., Афанасьев С.С. и др. //
Журнал микробиол.- 2001.-№4.-С.47-50.
165.
Лессовой,
В.С..
Микробиота
зева
пациентов
и
помещений
многопрофильной клинической больницы Волгограда: экологические аспекты
/
В.С.Лессовой, И.В.Новицкая, И.В.Зимина, О.И.Кузнецов // Эпидемиология и
инфекционные болезни. – 2002. - №5.- С.16-19.
166.
Лиманский, А.М. Видоспецифическая детекция Рroteus vulgaris и
Рroteus mirabilis посредством полимеразной цепной реакции. / Лиманский А.,
Минухин В., Лиманская О., Павленко Н., Мишина М., Цыганенко А. // Журнал
микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2005. - № 4. - С. 33-39.
167.
Литвинова,
Е.И.
Контаминация
микроорганизмами
растворов
дезинфектантов и антисептиков / Е.Н.Литвинова // Актуальные проблемы
нозокомиальных инфекций и лекарственной устойчивости микроорганизмов. Минск, 1986. – С.151-152.
168.
Литяева,
Л.А.
Микроэкологические
подходы
профилактики
инфекционных заболеваний новорожденных. / Литяева Л.А. // Педиатрия. - 1993.№3.-С.32-35.
249
169.
Лукач, И.Г. Протейная инфекция.
/Лукач
И.Г.,
Бидненко
С.И.,
Бернасовская Е.П.-Киев.: Здоровье, 1985.-С.102.
170.
Лучшев, В.И. Дисбактериозы у больных шигеллёзами: причины
развития и пути коррекции. / Лучшев В.И., Бондаренко В.М., Шахмарданов В.М. //
РМЖ.-2000.-№3.-С.35-38.
171.
Лыйв, Х.Д. О лабораторной диагностики инфекционной диареи у
грудных детей: Автореф. дис. … канд. мед. наук. – Ташкент, 1973. – С. 26.
172.
Лыкова, Е.А. Ассоциативная инфекция при острых бронхолегочных
заболеваниях у детей. / Лыкова Е.А., Воробьев А.А., Боковой А.Г., Каражас Н.В.,
Евсеева Л.Ф. // Вестник РАМН .-2003.-№ 4. -С.50-53.
173.
Мавзютов, А.Р. Молекулярно-генетические основы токсигенности
условно-патогенных представителей Enterobacteriaceae: Автореф дис. … д-ра мед.
наук / А.Р. Мавзютов. – Челябинск. 2000.
174.
Мавзютов,
А.Р.
«Острова»
патогенности
условно-патогенных
энтеробактерий /А.Р. Мавзютов, С.В. Фиалкина, В.М. Бондаренко. //Журн.
микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии.-2002.-№1.-С.-84-90.
175.
Малицкая Е.В. Особенности течения хирургической инфекции мягких
тканей второго уровня в зависимости от вида возбудителя и его биологических
свойств: Автореф. дисс. … канд. мед. наук.- Оренбург, 2008.-24с.
176.
Мамайчук, М.И. Патогенность и токсигенность для лабороторных
животных выделенного из ран протея. // Ж. микробиол.- 1960.-№6.-С.66-71.
177.
Мамонтова, Т.Н. Методические рекомендации по обнаружению и
классификации R – плазмид у шигелл. / Т.Н. Мамонтова, С.С. Белокрысенко,
Е.Д.Тихомиров, Ю.П. Солодовников, М.В.Турчинская // М. – 1983. – МЗ СССР.
178.
Маньковский, А.В. К вопросу о токсигенности культурных фильтратов
протея разного происхождения // А.В. Маньковский // Журн. микробиол. 1965.-Т.
ХХVII Вып.4.-С.10-13.
179.
Марушко, Ю.В. Чувствительность к антибиотикам тонзилярной
стафилококковой и стептококковой флоры у часто болеющих детей /
Марушко // Врачебное дело. – 1999. - №4 – С. 95-98.
Ю.В.
250
180.
Маянский, А. Н. Микробиология для врачей. Дисбактериоз: иллюзии и
реальность./ Маянский А. Н. // И-во НГМА Н.Новгород. - 1999. – С.264-281.
181.
Мельников, Н.И. / Ферменты патогенности и токсины бактерий. //
Мельников Н.И., Мельников В.Н., Гимранов М.Г. // М.: Медицина, 1969.
182.
Меньшиков, Д.Д. Актуальные проблемы нозокомиальных инфекций и
лекарственная устойчивость микроорганизмов. / Меньшиков Д.Д., Енилеев Р.Х.,
Кумачева Е.Г. // Минск.- 1986.- С.173–174.
183.
Мессинова,
О.В.
Дезоксирибонуклеаза
патогенных
бактерий.
/Мессинова О.В., Юсупова Д.В. //Ж. микробиол.-1966.-№3.-С.39-44.
184.
Методические
рекомендации.
Определение
чувствительности
к
имипенему диско-диффузионным методом. Смоленск,1997.- С.22.
185.
Миллер Дж. Эксперименты в молекулярной генетике / под ред. проф.
Алиханяна С.И. // Москва, Издательство Мир, 1986.-С.436.
186.
Минушкин,
О.Н.
Дисбактериоз
кишечника./
Минушкин
О.Н..,
Ардатская М.Д.., Бабин В.А., Домарадский И.В., Дубинин А.В. // Российский
медицинский журнал.- 1999.- №3.- С.40–44.
187.
Митрохин, С.Д. Значение энтеробактерий в инфекционной патологии
человека. /С.Д. Митрохин //Инфекции и антимикробная терапия.-2005, том 7.-№2.
188.
Митрохин,
микроорганизмов
при
С.Д.
Факторы
дисбактериозе
персистенции
условно-патогенных
желудочно-кишечного
тракта.
/С.Д.
Митрохин, В.И. Минаев, О.Н. Зайцева //Журн. микробиологии, эпидемиологии и
иммунобиологии.-1997.-№4.-С.- 84-87.
189.
Мнацаканов,
С.Т.
D-Маннозорезистентная
гемагглютинация
у
условно-патогенных энтеробактерий при диареях у детей./ Мнацаканов С.Т.,
Коцинян М.Е. // Журнал микробиол.-1984. - №3.- С.46-48.
190.
Мнацаканов, С.Т. О выделении условно-патогенных энтеробактерий у
детей раннего возраста / С.Т.Мнацаканов, М.Е.Когинян, Р.Г.Акопян // Журн.
Микробиол. – 1983. - №5. - С.106-108.
251
191.
Мнацаканов,
С.Т.
Энтетоксигенность
условно-патогенных
энтеробактерий при острых кишечных заболеваниях у детей. / Мнацаканов С.Т. //
Ж.Микробиол.- 1983.-№6.-С.53-55.
192.
Мощич, Г.С. Особенности становления микрофлоры у новорожденных
в раннем неонатальном периоде. / Мощич Г.С., Чернышева Л.И. // Вопросы
охраны материнства и детства. - 1988.- №1.- С.29.
193.
Мухина, Ю.Г. Диагностика и коррекция дисбактериоза у детей./
Мухина Ю.Г. // Российский медицинский журнал.- 1999, том 7.- №11.- С.487–494.
194.
Навроцкий, В.А. Особенности клиники и лечения гнойно-септических
заболеваний, осложненных дисбактериозом, у детей раннего возраста: Афтореф.
Дисс. … к.м.н. - Киев.- 1986.- С.23.
195.
Нестерова, Г.Н., Леонтьева А.Н., Макарова И.Б. О лецитиназной
активности бактерий рода Proteus. /Нестерева Г.Н., Леонтьева А.Н., Макарова И.Б.
// Ж. Микробиол.- 1973.-№11.-С.124-127.
196.
Нестерова, Г.Н. Патогенетическое значение эколо-физиологических
особенностей бактерий рода Proteus / Г.Н. Нестерова // – Горький. -1975.
197.
Нетрусов А.И., Егорова М.А., Захарчук Л.М. Практикум по
микробиологии. М., Академия.2005.-608 с.
198.
Николаева, И.В. Частота колонизации стафилококками кишечника у
детей с явлениями дисбактериоза. / Николаева И.В, Бондаренко В.М., Анохин
В.А., Галеева О.П. // Ж.микробиол -2000.-№1.-С.17-21.
199.
«Об унификации микробиологических (бактериологических) методов
исследования…», Приказ МЗ СССР №353, 1985.
200.
Обгольц
А.А.
Механизмы
персистирования
бактерий.//
Журн.
микроорганизмов
к
микробиол.-1992.-№4.-С.70-72.
201.
Определение
чувствительности
антибактериальным препаратам (Методическое указание МУК 4.2. 1890-04)//
Клин. микробиол. антимикроб. химиотер.-2004; №6.-С.306-359.
202.
Очилова, Р.А. Биологические свойства штаммов К. pneumoniae и S.
aureus, выделенных в виде монокультур и ассоциаций, при дисбактериозах
252
кишечника у детей с бронхолегочной патологией: Автореф. дис. … канд. мед.
наук.- Уфа, 2004.
203.
Паньков, А.С. Микробиоценоз дыхательной системы и межмикробные
взаимодействия при гриппе. Автореф. дис. … доктора мед. наук.- Челябинск, 2013.
204.
Парфенов, А.И. Микробная флора кишечника и дисбактериоз./
Парфенов А.И. // Русский медицинский журнал. – 2000, том 6.- №18.С.20.
205.
Пархоменко Л.В. К характеристике гемолизинов / Л.В. Пархоменко,
И.Б. Лукач, Д.Е. Дыховичная
// Журн. микробиологии, эпидемиологии и
иммунологии. -1986. –Т.48. -№6. –С. 24-29.
206.
Петровская, В.Г. Генетические основы вирулентности патогенных и
условно-патогенных бактерий / В.Г. Петровская // Журн. микробиологии,
эпидемиологии и иммунологии. – 1984. - № 7. – С. 74 – 85.
207.
Петровская, В.Г. Адгезины энтеротоксигенных кишечных палочек:
роль в патогенезе диарей и генетический контроль./ Петровская В.Г., Бондаренко
В.М. // Ж. микробиол.- 1990.-№5.-С.110-116.
208.
Петровская, В.Г. Микрофлора человека и патологии / В.Г.Петровская,
Марко О.П. - М.: Медицина, 1976. – С.213.
209.
Петровская, В.Г. Общие закономерности взаимодействия в системе
паразит-хозяин и проблема смешанных инфекций / В.Г.Петровская // Журн.
Микробиол. - 1982. - №8. - С.24-31.
210.
Петровская, В.Г. Роль множественной лекарственной устойчивости в
биологии патогенных и условно-патогенных бактерий / В.Г. Петровская // Журн.
микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. -1984. -№7. - С. 77-85.
211.
Петровская, В.Г. Характеристика штаммов рода Proteus, Klebsiella,
Enterobacter и Citrobacter, выделенных при уроинфекциях. / Петровская В.Г.,
Бондаренко В.М., Маринова Р., Корягина И.П., Афанасьева С.М. // Журнал
микробиологии. - 1983.- №2.- С.25-31.
212.
Петровская, В.Г. Энтеротоксины энтеротоксигенных Echerichia coli:
характеристика, механизм действия и генетический контроль. /В.Г. Петровская,
253
В.М. Бондаренко //Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии.1990.-№7.-С.92-98.
213.
Петряев, Е.Д. Вспышка пищевых отравлений, вызванных Proteus
vulgaris // Гигиена и санитария.-1947.-№7.-С.24.
214.
Писарев, В.Ф. Влияние тонзилэктомии на физическое развитие
юношей /В.Ф. Писарев // Вестник оторинолярингологии. – 2000.-№2.- С.41-43.
215.
Подзолокова, Н.М. Тяжелые бактериальные инфекции в акушерстве и
гинекологии /Н.М. Подзолокова, Т.И. Никитина //Инфекции и антимикробная
теропия.-2004, том 6.-№3.
216.
Покровский, В.И. Человек и микроорганизмы. Здоровье и болезнь. /
В.И. Покровский // Вестник РАМН.- 2000.-№11.-С.3-6.
217.
Поликарпов,
Н.А.
Биологические
свойства
условно-патогенных
микроорганизмов, выделенных от больных с острыми кишечными заболеваниями.
/ Поликарпов Н.А. // Воен.-мед.журнал.- 1991.№7.-С.19-23.
218.
Поликарпов,
Н.А.
Некоторые
количественные
обсемененности
испражнений нуклеазоположительными микроорганизмами у людей с нормальной
микрофлорой и при дисбактериозе кишечника. / Поликарпов Н.А., Викторов А.Н.,
Зубков М.Н. // Ж.микробиол.- 1990.- №4.-С.117-119.
219.
Полоцкий, Ю.Е. Адгезивность, инвазивность и энтеротоксигенность
возбудителей кишечных инфекций / Ю.Е. Полоцкий, Т.А. Авдеева
// Журн.
микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. -1981. -№5.-С. 23-32.
220.
Полоцкий, Ю.Е. Экспериментально-морфологические обоснования
подразделения энтеропатогенных кишечных палочек / Ю.Е. Полоцкий, Т.А.
Авдеева // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. – 1980. -№10.С.3-10.
221.
Постникова, Е.А. Изучение качественного и количественного состава
микрофлоры кишечника у клинически здоровых детей в раннем возрасте./
Постникова Е.А., Пикина А.П., Кафарская Л.И., Ефимов Б.А. // Журнал
микробиол. –2004.-№1.-С.62-67.
254
222.
Прозоровский С.В., Кац Л.Н., Каган Г.Я.. L-формы бактерий.-М.:
Медицина, 1981.-240с.
223.
Реброва,
О.Ю.
Статистический
анализ
медицинских
данных:
применение пакета прикладных программ Statistica [Текст] / О.Ю. Реброва. – М.:
Медицина, 2002. – 312с.
224.
Решедько Г.К., Рябкова Е.Л., Кречикова О.И. и соавт. Резистентность к
антибиотикам грамотрицательных возбудителей нозокоминальных инфекций в
ОРИТ многопрофильных стационаров Росси // Клин. Микробиол. Антимикроб.
Химиотер.-2008.- Т.10, №2.-С.163-179.
225.
Руднев, И.А. Тиолзависимые гемолизины как факторы патогенности
клебсиелл. / Руднев И.А., Бондаренко В.М. // Журнал микробиол. - 1993.-№6.С.31-32.
226.
Рыжкова, А.И. Влияние микробных и немикробных факторов на
формирование внеклеточных ловушек нейтрофилами периферической крови:
Автореф. дис. … к.м.н. – Челябинск -2010.
227.
Материалы
Рысс, Е. С. Антибиотики в гастроэнтерологии / Рысс Е. С. //
научно-практической
конференции
«Практика
современной
антибактериальной терапии внебольничных и госпитальных инфекций». - 2000. С. 42-50.
228.
Савицкая, К.И. Микрофлора верхних дыхательных путей у детей
раннего возраста в норме и при заболеваниях органов дыхания. Нормальная
микрофлора и дисбиоз различных уровней верхних дыхательных путей у здоровых
и больных пневмонией детей. /Савицкая К.И., Воробьев А.А., Солодилова О.Е. //
Ж.микробиол.-1987.-№1.- С.22-29.
229.
Савицкая, К.И. Современные представления о роли и составе кишечной
микрофлоры у здоровых людей / К.И. Савицкая, А.А. Воробьев, Е.Ф. Швецова //
Вестник РАМН. – 2002. - №2.- С.50-53.
230.
Саляхов, Р.З. Характеристика некоторых биологических свойств
бактерий рода Serratia, выделенных при инфекционных процессах различной
локализации: Автореф. дис. … канд. мед. наук. - Оренбург, 2005.
255
231.
Самсыгина, Г.А. Бактериофаги и фаготерапия в педиатрической
практике. / Самсыгина Г.А., Бони Е.Г. // Педиатрия.-1984.-№ 4.-С.67-70.
232.
Самсыгина,
Г.А.
Характеристика
микробной
колонизации
новорожденных детей с перинатальной патологией. / Самсыгина Г.А., Бони Е.Г.,
Черкасская Р.С. // Педиатрия. - 1988.- №8.-С.18-22.
233.
Сарбасова, Ш.И. Серологические и бактериологические показатели
при экспериментальной кишечной цитробактер инфекции / Ш.И. Сарбасова //
Матер. V объед. съезда гиген. эпидемиол. микробиол. паразитол. и инфекц.
Казахстана. - 1991. - Т.5. –С.17-19.
234.
Сарбасова, Ш.И. Принципы лабораторной диагностики кишечной
цитробактер-инфекции: Автореф. дис. … д-ра. мед. наук. – Алматы, –1993.С.42 .
235.
Саркулова, М.Н. Микробиологическая характеристика возбудителей
внутрибольничной инфекции урологических больных. / М.Н. Саркулова // Журн.
микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии.-2005.-№5.-С.101-103.
236.
Сгибнев А.В. Регуляция активности бактериальной каталазы в
межмикробных взаимодействиях: Автореф. дис. … канд. мед. наук.-Оренбург,
2009.-24с.
237.
Семенов А.В. Характеристика антагонистической активности бактерий
при межмикробных взаимодействиях: Автореф. дис. … канд. мед. наук. Оренбург, 2009.-24с.
238.
Сергеев, П.В. Очерки биохимической фармокологии / П.В.Сергеев,
П.А.Галенко-Ярошевский, Н.Л.Шимановский // - М., 1996. – С.384.
239.
Сиволодский, Е.П. Систематика и идентификация энтеробактерий. /
Сиволодский Е.П. // Методические рекомендации. С.Петербург, 1998.- С.36.
240.
Сидоренко,
С.В.
Бета-лактамные
антибиотики
для
перорального
применения в лечении инфекций дыхательных путей / С.В Сидоренко // Антибиотики
и химиотерапия. – 2001. – Т46, № 7.- С. 27-34.
241.
Сидоренко, С.В. Есть ли будущее у антибактериальной терапии / С.В.
Сидоренко// Антибиотики и химиотерапия. – 1999. – Т44, № 1 – С.3-5.
256
242.
Сидоренко,
С.В.
Роль
бактериальных
пленок
в
патологии
человека.//Инфекция в хирургии.-2004. №2.-С. 16-20.
243.
Скала Л.З., Сидоренко С.В., Нехорошева А.Г., с соавт. Практические
аспекты современной клинической микробиологии. Тверь, «Триада», 2004.-312с.
244.
Славский, А.Н. Влияние тонзилогенной интоксикации на нарушение
менструальной функции у женщин детородного возраста / А.Н. Славский,
Ю.М.Овчинников, Н.М.Побединский // Акушерство и гинекология. – 1999.- №2.С.23.
245.
Смирнов И.В. Возбудители бактериальных инфекций человека.// Клин.
микробиол. антимикроб. химиотер.-2000.-Т.2, №2.-С.4-11.
246.
Смирнова, Т.Г. Влияние женских половых стероидных гармонов на
механизмы внутри- и внеклеточной бактерицидности фагоцитирующих клеток:
Автореф. дис. … канд. биол. наук. -Челябинск, 2013.
247.
Смородова, Г.П. Материалы к изучению роли вульгарного протея в
этиологии острых кишечных заболеваний./ Смородова Г.П., Левина П.М., Ачкасов
А.Н., Сирото В.А.// Издание «Кишечные инфекции».- Киев,1974.№7.-С.165-167.
248.
Соколов, В.Ю. Антиинтерфероновая активность микроорганизмов /
В.Ю. Соколов // Персистенция микроорганизмов / Под редакцией Бухарина О.В.Куйбышев. - 1990. – С.83 – 93.
249.
Соколова, К.Я. Методика оценки состояния микрофлоры толстой
кишки с использованием ЭВМ / К.Я.Соколова, И.В.Шутова, А.Н.Коровенков //
Журн. Микробиол. - 1988. - №11. - С.11-16.
250.
Соколова, Н.А. Обнаружение патогенных свойств у почвенных
азотофиксирующих энтеробактерий / Н.А.Соколова, В.А.Лаврова // Журн.
Микробиол. - 1991. - №12. - С.13-14.
251.
Соколова,
Р.Б.
Активность
нуклеодеполимеров бактерий группы
внеклеточных
и
внутриклеточных
Proteus-Providencia в процессе роста
клеточной популяции. /Соколова Р.Б., Юсупова Д.В., Беляева М.М.
микробиол. -1977.№6.-С.137-138.
//Ж.
257
252.
Субботина,
М.Д.
Дисбактериоз
кишечника
у
детей
и
микроэкологические подходы к его коррекции. / Субботина М.Д., Тимошенко В.А.
и др. // Учебно-методическое пособие. - С.-Петербург. 1997.- С.25.
253.
Сурикова, Е.В. Диагностическая ценность определения факторов
персистенции клебсиелл при дисбактериозах. / Сурикова Е.В., Леванова Л.А. //
Ж.микробиол.-1999.-№4.-С.87-88.
254.
Сурикова, Е.В. Факторы персистенции клебсиелл. / Сурикова Е.В. //
Журнал микробиол. - 1994.- №5 (приложение). - С.104-106.
255.
Таболин, В.А. Рациональная терапия дисбактериоза кишечника у
детей. Методические рекомендации. / Таболин В.А., Бельме С.В., Гасилина Т.В. и
др. // - М., 1998. – С.11.
256.
Тарасова, А.П. О взаимоотношении Bacteri morganii и Bacteri proteus
vulgaris // Ж. Микробиол.-1940.-№9.-С.58-64.
257.
Теблоева, Л.Т. Микробиологическая диагностика пиелонефрита у
детей / Л.Т.Теблоева, М.В.Цванг // Проблемы клинической микробиологии в
неинфекционной клинике. - М., 1983. -С.38-99.
258.
Тенке, П.. Европейско-Азиатские рекомендации по ведению пациентов
с инфекциями, связанными с уретральным катетером, и по профилактике катетерассоциированных инфекций / П. Тенке, Б. Ковач, T.E. Бьерклунд Йохансен, T.
Мацумото, П.А. Тамбья, К.Г. Набер // Клин. Микробиол. Антимикроб. Химиотер.
– 2008. - Т.10. №3. – с. 201-215.
259.
Тец В.В., Артеменко Н.К., Заславская Н.В. с соавт.. Биопленки
возбудителей уроинфекций и использование фторхинолонов //
Consilium
medicum.- 2008.-№4.-С.110-114.
260.
Тимохина Т.Х., Курлович Н.А., Паромова Я.И. с соавт. Биоритмы
пролиферативной
активности
музейных
и
госпитальных
штаммов
микроорганизмов.// Журн. микробиол., эпидимиол., иммунобиол. – 2007, №4, С.35.
261.
Тиссо-Геррас, Ф. Госпитальная инфекция в родильных домах. / Тиссо-
Геррас Ф., Сетр Ж.С., Мелье С.С. и др. // Журн. микробиол.- 1995. №4.- С. 35–39.
258
262.
Туйгунова, В.Г. Характеристика биологических свойств бактерий рода
Citrobacter при межмикробных взаимодействиях в микросимбиоценозе: Автореф.
дис. … к.м.н. – Оренбург -2013.
263.
Туйгунов, М.М. Характеристика некоторых биологических свойств
бактерий рода Citrobacter, выделенных при инфекционных процессах различной
локализации. Автореф. дис. … к.м.н. - Уфа.-1998.
264.
Туйгунов, М.М. Роль Энтеротоксина бактерий рода Citrobacter в
исходе взаимодействия «патоген-хозяин»: Автреферат д-ра. мед. наук. –
Челябинск-2003.-41с.
265.
Усвяцов, Б.Я. Взаимодействие бактерий и эритроцитов / Б.Я. Усвяцов,
Е.А. Ханина, О.В. Бухарин // Журн. микробиологии, эпидемиологии и
иммунобиологии.-2005.-№4.-С.89-95.
266.
Фадеев, С.Б. Видовой состав и персистентные характеристики
возбудителей хирургической инфекции мягких тканей. Автореферат дисс.
канд.мед.наук. Оренбург,1998.- С.24.
267.
Фадеев, С.Б. Хирургическая инфекция мягких тканей второго уровня,
особенности этиотропной терапии: Автреферат дисс. д-ра. мед. наук. – Оренбург2010.- 40с.
268.
Фельдман, С.З. Клиническое значение факторов персистенции
возбудителя при сальмонелёзной инфекции у детей. /Фельдман С.З., Каган Ю.Д.,
Усвяцов Б.Я., Паршута Л.И. //Журн. микробиол.-2003.-№4.-С.59-60.
269.
Хайкина, Е.В.. Инфекции мочевых путей у больных сахарным
диабетом / Хайкина Е.В., Решедько Г.К., Морозов М.В. // Клин. Микробиол.
Антимикроб. Химиотер. – 2008. - Т.10 №3. – С. 235-244.
270.
Хамзин, Р. Ш. Биологические особенности клинических штаммов
Proteus, выделенных от больных с инфекционными процессами различной
локализации. – Автореф. дис. к.м.н.- Уфа, 1995.
271.
Хмелевская,
Г.В.
Факторы
патогенности
некоторых
условно-
патогенных бактерий, вызывающих диареи. / Хмелевская Г.В., Девтерова Л.В.,
259
Яговкин Э.А., Шепелев А.П., Мартыненко Л.Д. // Ж.микробиол.-1990.-№ 4.-С.97–
101.
272.
Хуснутдинова, Л.М. Межбактериальные взаимодействия на слизистой
оболочке миндалин человека. Автореферат дисс. канд.мед.наук. Оренбург- 2004.
273.
Черненкая, Т.В. Чувствительность энтеробактерий к беталактамным
антибиотикам. / Черненкая Т.В. // Антибиотики и химиотерапия.-2000, Т.45,№4.С.28-29.
274.
Шапиро,
Дж.А.
Бактерии
как
многоклеточные
организмы
/
Дж.А.Шапиро // В мире науки. - 1988. - № 8. - С.46-54.
275.
Швиденко, И.Г. Бактериоциногены свойства бактерий рода Proteus //
Ж.Микробиол.-1978.-№1.-С.27-30.
276.
Шевелева, С.А. Энтеротоксинообразование представителей условно-
патогенной микрофлоры кишечника как диагностический тест при дисбактериозах
кишечника. / С.А. Шевелева, И.Б. Куваева, Ф.С. Флуер и др. // Вопр. питания.2002.-№4.-С23-26.
277.
Шендеров, Б.А. Колонизационная резистентность и антимикробные
препараты. - В кн.:Антибиотики и колонизационная резистентность / Под ред.
Б.А.Шендерова. М. //-1990.-С.91-98.
278.
Шендеров, Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное
питание. Том 1: Микрофлора человека и животных и её функции. - М.: 1998. –
С.288.
279.
Шендеров, Б.А. Нормальная микрофлора и её роль в поддержании
здоровья человека. / Шендеров Б.А. // Российский журнал гастроэнтерологии,
гепатологии, колопроктологии. – 1998,том 8.- №1.- С.61–65.
280.
Шеришорина, С.Ш. Изучение клебсиелл, выделенных от больных и
здоровых людей. / Шеришорина С.Ш., Савельев В.Н. // Журнал микробиологии. 1972.- №9.- С.134-137.
281.
Шилов, В.М. К вопросу некоторых особенностях биологических
свойств возбудителей внутрибольничных инфекций / Шилов В.М., Поликарпов
260
Н.А., Брагина М.Н. // Актуальные проблемы нозокоминальных инфекций и
лекарственной устойчивости.-Минск,1986.-С.208.
282.
Шишкова, Ю.С. Роль нейтрофилов в формировании колонизационной
резистентности слизистых оболочек: Автореферат дисс. доктора мед. наук.
Челябинск - 2010.
283.
Шмит, Клер К. Бактериальные токсины: друзья или враги. / Шмит
Клер К., Мейсик Карен С., Алисон Д. О Браэн.// Ж. клинической микробиологии,
антимикробной химиотерапии том 2. 2000 год. №1.-С.3-7
284.
Шуркалин, Б.К. Изучение эффективности различных препаратов при
лечение больных с распространенным перитонитом / Б.К. Шуркалин, W Вusch,
А.Г. Кригер // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии.-1994.№4.-С.28-32.
285.
Яковлев, С.В. Госпитальные инфекции, вызванные резистентными
грамотрицательными микроорганизмами: клиническое значение и современные
возможности терапии / С.В. Яковлев // Инфекции и антимикробная терапия.-2004,
том 6.-№4.-С. 133-136.
286.
Яковлева,
О.Н.
Характеристика
плазмид
штаммов
Salmonella
различного происхождения / О.Н. Яковлева, Б.И. Маракушев, В.Г. Петровская //
Ж. Микробиол.-1987.№4.-С.14-21.
287.
Якушенко, О.С. Тиолзависимая гемолитическая активность и ее
значение для проявления вирулентности у цитробактер: Автореф. дис. … канд.
мед. наук. – М., 1989. – С.29.
288.
Abrams, G.D. Microbial effects on mucosal structure and function. // Amer.
J Clin. Nutr..- 1977. - Vol.30.P.107-115.
289.
Aktories ,K. Rho proteins: targets for bacterial toxins / K.Aktories // Trends
Microbiol. -1997. –Vol.5. –P.282-8.
290.
Albesa, J. A tiol-activated hemolysin in gram-negative bacteria / J. Albesa,
L.J. Barberis, M.C. Pajaro et al. // Can. J. Microbiol. -1985. -Vol.31. -P.297-300.
261
291.
Allesio, М.et al. Interspecific plasmid transferand modification of heat
stable enterotoxin expression by Klebsiella pneumoniae from infants with diarrhea/ M.
Allesio, F. Albano, L. Tarralo, A. Guarino// Pediatr. Res.- 1993.-Vol. 33.-P. 205-208.
292.
Al-Hasan M.N., Wilson J.W., Lahr B.D. et al. Incidence of Pseudomonas
aeruginosa bacteremia: a population-based study. // Am. J. Med. – 2008. - Vol.121(8).
P.702-708.
293.
Appelbaum, H.C. Transductional analysis of nonmotile mutans in Proteus
mirabilis. / Appelbaum H.C. Prozecky O.W. // J.of Gen. Microbiology - 1973. - Vol.77.N.1.-P.89-97.
294.
Asad S., Opal S.M. Bench-to-bedside review: Quorum sensing and the role
of cell-to-cell communication during invasive bacterial infection.//Critical Care.-2008. Vol.12(6). P.236.
295.
Barberis, L.J. Molecular weight determination and partial characterization
of Klebsiella pneumonia haemolysins / L.J. Barbers, A.J. Eraso, M.C. Pajaro and J.
Albesa // Can. J. Microbiol.- 1986.-v.32.-p.884-885.
296.
Baron, E.J. Manual of Clinical Microbiology. / Baron E.J., Pfaller M.A.,
Tenover F.C., Yolken R.H. // - 7th ed., ed. in chief P.R.Myttay. - Washington: Am.Soc.
Microbiol.- 1999. - 1773p.
297.
Bayer, M.E. Membrane biogenesis / M.E. Bayer.–N.Y., 1975. – 427 p.
298.
Bergeys manual of systematic bacteriology: // Eds. N.R.Kreig, J.G.Holt. -9-
th of Baltimore: Williams and Wilkins Co, 1984. -Vol.1. -P.409-588.
299.
Beutin, L. Enterohemolysin, a new type by some strains of
enteropathogenic E.coli (EPEC) / L. Beutin, J. Prado, S. Zamerman et al. // Zbl.
Bakteriol. Hyd.A.- 1988, A 267.-S. 576-588.
300.
Bhakdi, S. Staphylococcal alpha-toxin, streptolysin-0 and Escherichia coli
hemolysm: prototypes of pore-forming bacterial cytolysins / S.Bhakdi, H. Bayley et al. //
Arch. Microbiol. -1996. –Vol.165.-P.73-9.
301.
Bisset, K.A. The motion of the smarm in Proteus mirabilis //J.Med.
Microbiology.-1973.-6-№1.-З.33-35.
262
302.
Brian, V. Jones. Robert Young, Eshwar Mahenthiralingam, and David J.
Stickler. // Ultrastructure of Proteus mirabilis Swarmer Cell Rafts and Role of Swarming
in Catheter-Associated Urinary Tract Infection / R. Microbiol. - 2004.-Vol.72, No.7
303.
Brubaker, R.R. Mechanism of bacterial virulence / R.R. Brubaker //Ann.
Rev. Microbiol. -2000, 290. – P. 153-165.
304.
Brumfitt, W. Evidence for an schowing in trimethoprim resistance during
1981 - a comparison with carlier years / W.Brumfitt, M.T.Ramilton-Willer, A.Wood // J.
Antimicrob. Chemother. -1983. -Vol.11. -P.503-9.
305.
Budding, A. E. The Dienes Phenomenon: Competition and Territoriality in
Swarming Proteus mirabilis / A. E. Budding, C. J. Ingham, W. Bitter, C. M.
Vandenbroucke-Grauls, P. M. Schneeberger // J. Bacteriol. – 2009. – Vol. 191(12) – P.
3892–3900.
306.
Cisneros-Garcia, N. Acute gastric distension due to sepsis in a newborn
infant / N.Cisneros-Garcia, I.Rodriguez-Balderrama // Bol. Med. Hosp. Infant. Mex. 1993. -V.50 –P.406-9.
307.
Civen, R. Peritonsillar abscess, retropharyngeal abscess, mediastinitis, and
nonclostridial anaerobic myonecrosis: a case report / R.Civen, M.L.Vaisanen,
S.M.Finegold // Clin. Infect. Dis. -1993.-Vol.16. -P.S299-S303.
308.
Coconnicr, M.H. Antibakterial Effekt of Adhering Human Laktobacillus
acidofilus Strain LB. / Coconnicr M.H., Lievin V., Bernet-Camarad M.F. et al. //
Antimikrobial Agents and Chemotherapy. - 1997. -Vol.41, №5. - P.1046-1052.
309.
Collier, R.J. ADP-ribosylating toxins and g proteins / Eds. J.Moss,
M.Vaughan. Washington: Am Soc Microbiol., 1990. –P.3-19.
310.
Сoetzee, J.N. Fimbriae and Haemaglutining properties in strains of Proteus/
Сoetzee J.N. Perhet G., Nheron J.J. //Nature(London)-1962.-V.196.-P.-497-498.
311.
Costerton, J.W. Microbial interactions in biofilms / J.W. Costerton //
Beijerinck Centennial. Microbial Physiology and Gene Regulation: Emerging Principles
and Applications. Book of Abstracts /Eds. W.A. Scheffers, J.P. van Dijken. -Delft. Univ.
Press, 1995. -P.20-21.
263
312.
Cullmann, W. Comparative evaluation of orally active antibiotics against
community-acquired pathogens: a multi-center study in five Mediterranean countries /
W.Cullmann // J. Chemother. -1995. –Vol.7.–P.21-5.
313.
Cushing, A.H. Serum immune response to carriage of toxigenic fecal
bacteria with and without diarrhea / A.H.Cushing // Dev. Biol. Stand. -1983. -Vol.53. P.107-11.
314.
Davis S.C., Ricotti C., Cazzaniga A. et al., Microscopic and physiologic
evidence for biofilm-associated wound colonization in vivo.// Wound Repair. Regen.2008.- Vol.16(1).- P.23-32.
315.
De la Cruz, F. Hemolysis determinant common to Escherichia coli
hemolytic plasmids of different incompatibility groups / De la Cruz F., Muller D., Ortiz
J.M. // J. of Bacteriology. -1980. –v. 143. -№2. –P. 825-833.86
316.
Duffy, L.C. Effectiveness of Bifidobacterium bifidum in mediating the
clinical course of murine rotavirus diarrheа. / Duffy L.C., Zielezny M.F., RiepenhoffTalty M. et al. // Pediatr. Res..1994.- Vol. 35.-P.690-695.
317.
Echeverria, P. Examination of colonies and stool blots for detection of
enteropathogens by DNA hybridization with eight DNA probes / P.Echeverria,
D.N.Taylor, J. Seriwatana et al. // J.Clin.Microbiol. -1989. –Vol.27. –P.331-4.
318.
Eremin, S.R. Epidemiological features of hospital purulentseptic infections
in otolaryngological wards./ Eremin S.R. // Zh.Microbiol.Epidimiol.Immunobiol.-1992.№3.-Р.36-39.
319.
Esselman, M.T., Liu P.V. Lecitinase production by gram-negative bacteria
// J. of Bacteriology.-1961.-81.-№6.- P.939-945.
320.
Falkinham, J.O., Uniqui developmental characteristics of the swarm and
ahort cells of Proteus vulgaris and Proteus mirabilis // J. of Bacteriology.-1984.-158.№3.-P.1037-1049.
321.
Field, M. Heat-stable enterotoxin of E.coli in vitro effects on guanilate
cyclase activity cyclic GMP concentration and ion transport in small intestine / M.Field,
L.H.Grof, W.J. Laird, P.L.Smith // Proc.Natl.Acad.Sci.USA. -1978. -Vol.75. -P.2800-4.
264
322.
Finlay, B.D. Common themes in microbial pathogenicity revisited.
Microbiol. / Finlay B.D., FalkoW S. // Mol. Biol. Rev.-1997.-Vol 61.-P.136-169.
323.
Flatau, G. Toxin-induced activation of the G protein p21 Rho by
deamidation of glutamine / G.Flatau, E.Lemichez et al. // Nature. -1997. -Vol.387. –
P.729-33.
324.
Frasier, M.E. Crystal structure of the holotoxin from Shigella dysenteriae at
A resolution / M.E.Frasier, M.M.Chernaia, Y.V.Kozlov, M.N.James // Nature Structural
Biol. -1994. –Vol.1. –P.59-64.
325.
Frigo Silva Maria, de Arevedo, Joao Lucia Influencia de plasmido R-no
Frequencia de mutacao em E. coli // Rev. microbial.-1985.-16.-№4.-255-259.
326.
Fujii, T. Coexisting respiratory tract infection and bacteremia or sepsis
caused by the same bacterium / T.Fujii, Y.Inoue, S.Sacata et al. // Kansenshogaku.
Zasshi. -1994. -Vol.68. -P.217-25.
327.
Molecular
Galas, M. Nationwide Study of the Prevalence, Characteristics, and
Epidemiology
of
Extended-Spectrum-β-Lactamase-Producing
Enterobacteriaceae in France. / Galas M., Decousser J.W., Breton N., Godard T.,
Allouch P.Y., Pina P. // Antimicrob. A. Chemother. – 2008. – Vol. 52(2). – P. 786–789.
328.
Garbers, D.L. Guanylyl cyclase receptors and their endocrine, paracrine and
autocrine ligands /minireview/ D.L.Garbers // Cell. -1992. –Vol.71.-P.1-4.
329.
Garriguens, N. Dissemination of antibiotic resistance genes in the digestive
microflora. / Garriguens N., Wittmer A., Duval-Iflah Y. // Abstr. 21 Intern. Congress
Microb. Ecol. Disease. Paris, 28-30 October 1996. – P.165-171.
330.
Gilbert, D.N. The Sanford Guide to Antimicrobial Therapy. / Gilbert D.N.,
Moellering R.C., Sande M.A. // 31st ed. - 2001. - 142p.162.
331.
Giles, C.L., Barnum D.A. A heat labile, enterotoxin from strains of E. coli
enteropathogenic for pigs // J. Infection Diseases.-1969.-120.-P.419.
332.
Gillispie, D. S. A quantitative assay for DNA/RNA hybrids with DNA
immobilized on a membrane / D. Gillispie, S. Spiegelman // J. Mol. Biol. –1965. –
Vol.12. –P.829-842.
265
333.
Giron, R. Characterization of fimbriae produced by enteropathogenic E.coli
/Giron R. A.S.Y. Ho Schoonik G.K.// J.Bacteriology.-1993.-v.175.-P.7391-7403.
334.
Gómez-Duarte, O.G. Detection of E. coli, Salmonella spp., Shigella spp.,
Yersinia enterocolitica, Vibrio cholerae, and Campylobacter spp. enteropathogens by
Three-reaction Multiplex PCR. / Oscar G. Gómez-Duarte, Jing Bai, and Elizabeth
Newel. // Diagn. Microbiol. Infect. Dis. – 2009. – Vol. 63(1). – p. 1–9.
335.
Gregor, R., Jack S.D. Bacteria adhererence in the pathogenesis of urinary
tract infection a review // Rev. Infect. Diseases.-1987.-9.-№3.Р.470-487.
336.
Gupta, A.C., Arora D.R., Chandna R., Ich hpujomi R.L. R-plasmid
mediated drug resistance in Proteus Species //J.Commun. Diseases.-1984.-16.-№4.P.311-316.
337.
Hacker, J. Patho-genicity islands of virulent bacteria: structure, function,
and impact on microbial evolution / J Hacker, G Oehler-Blum, I Muhlodorfer, H
Tschape // Mol. Microbiol.- 1997, 23.- P. 1089- 1097.
338.
Haddy, R. Enterobacter bacteremia in community hospital. / Haddy R.,
Cecil NM.L., Markert R.J. // J.Fam. Pract.-1991.-32.-N.6.-Р.601-606.
339.
Harrington, D.J. Bacterial collagenases and collagen-degrading enzymes
and their potential role in human disease / D.J.Harrington // Infect. Immun. -1996. –
Vol.64. –P.1885-91.
340.
Helin, D.R., Goebel W. Endonuclease I of Proteus mirabilis, II. Properties
of the noncomplexed and transfer Ribonucleic acid-compled forms of the enzyme // The
J. of Biological Chemistri.-1971.-V-.246.-№2.-P.3856-3862.
341.
Henderson, B. Are bacterial exotoxins cytokine network regulators. / B.
Henderson, M. Wilson, B. Wren // Trends Microbiol. Sci. -1997. -Vol.5. -P.454-58.
342.
Hentges, D.J. Human intestinal microflora in Health and Disease. /
D.J.Hentges (ed.).// New York, Academic Press, 1983.-Р.548-557.
343.
Hoeniger, J.F. Development of flagella by Proteus mirabilis // The journal
of General Microbiology.-1965.-V.40.-№1.-Р.29-42.
344.
Holmgren, J. Action of cholera toxin and the prevention and treatment of
cholera / J.Holmgren // Nature. -1981. -Vol.292. -P.413-7.
266
345.
Horiguchi, Y. Bordetella bronchiseptica dermonecrotizing toxin induces
reorganization of actin stress fibers through deamidation of Gin-63 of the GTP-binding
protein Rho / Y.Horiguchi, N.Inouc et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. –1997. –
Vol.94.-P.11623-6.
346.
Hughes, W.H. Areconsideration of the swarming Proteus vulgaris // Journal
of Gen. Microbiology.-1957.-17.-№1.-49-58.
347.
Hung, E.W. Proteus bacteriuria is associated with significant morbidity in
spinal cord injury / EW Hung, RO Darouiche, and BW Trautner // Spinal Cord. – 2007. Vol. 45(9). – P. 616–620.
348.
Infection and antibiotic therapy in 4000 burned patients treated in Milan,
Italy, between 1976 and 1988 / L.Donati, F.Scamazzo, M.Gervasoni et al. // Burns. 1993. -Vol.19. -P.345-8.
349.
Ishikawa, H. Analysis of cases with liver abscess following transcatheter
arterial chemoembolization “TAE” for malignant hepatic tumors / H.Ishikawa, T.Kanai,
T. Ono et al.// Gan. To. Kagaku. Ryoho.- 1994. -Vol.21. -P.2233-6.
350.
Jeffries, C.D. Rapid metod for determining the activity of microorganisms
on nuclear acids. / Jeffries C.D., Holtman D.F., Gus D.G. // J.of Bacteriology-1957.v.73.N.4-P.590-591.
351.
Jones, H.E., Park R.W.A. The influence of medium composition on the
growth and swarming of Proteus // The gen. Microbiol.- 1967.-47.-№3.-P.369-378.
352.
Jorgenson, S. E. Studies on the origin of the alpha haemolysin produced by
Escherichia coli. / Jorgenson, S. E., E. C. Short, H. J. Kurtz, H. K. Mussen, and G. K.
Wu.//J. Med. Microbiol. -1975.-9:173-189.
353.
Kado, C.T. Rapid procedure for detection and isolation of large and small
plasmids / C.T. Kado, S.T. Liu // J.Вacteriol.- 1981.- Vol.145.-P.1365-1373.
354.
Karch, H. Single primer for amplifying segments of distinct shiga-lake-
toxin genes by polymerase chain reaction / H.Karch, T.Meyer // J. Clin. Microbiol. 1989. –Vol.27. –P.2751-7.
355.
Kato, A. Spontaneous bacterial peritonitis in an abult patient with nephrotic
syndrome / A.Kato, T.Ohtake, R.Furua et al. // Intern.Med. -1993. -Vol.32. - P.719-721.
267
356.
Klose, K.E. The suckling mouse model of cholera / K.E. Klose // Trends
Microbiol. –2000. –Vol.8. –P.189-91.
357.
Kotenko, K., Kaga N., Rosalski A., Some biological features of Proteus
bacilli 2. Hemolytic activities of
Proteus mirabilis and Proteus vulgaris // Acta
microbial. pol.-1983.-32.-№4.-P.345-351.
358.
Kwittingen, J. Studies of the life-cycle of Proteus Hauser // Asta pathol.
Microbial. Scand.-1949.-Vol.26.-P.24-50.
359.
Lally, E.T. The interaction between RTX toxins and target cells / E.T.Lally,
R.B.Hill, I.R.Kieba, J.Korostoff // Trends Microbiol. –1999. –Vol.7. –P.356-61.
360.
Lane, M.C. Oxygen-Limiting Conditions Enrich for Fimbriate Cells of
Uropathogenic Proteus mirabilis and Escherichia coli / Lane M.C., Xin Li, Melanie M.
Pearson, Amy N. Simms, and Harry L. T. Mobley // J Bacteriol. 2009. Vol. 191(5) – P.
1382–1392.
361.
Laurel, S. Burall. Proteus mirabilis Genes That Contribute to Pathogenesis
of Urinary Tract Infection: Identification of 25 Signature-Tagged Mutants Attenuated at
Least 100-Fold // Burall L.S., Harro J.M., Xin Li, C.Virginia Lockatell, Himpsl S.D.,
Hebel J.R., Johnson D.E., Harry L. T. Mobley H.L.T. // Infect. Immun. – 2004. – Vol.
72(5). – P. 2922–2938.
362.
Ledakis, N., Leonardopoulos L., Papavassilion I. Egg. yolk reaction on
Proteus Boll. Ist., steroter Milan.- 1974.-53.-#2.-P.-332-335.
363.
Leelarasamee, A. Antimicrobial resistance of 100 serial gram - negative
isolates in two intensive care units./ Leelarasamee A., Jenyapoon K. // J. Med.Assos.
Thai.-1992.-Vol.75.-N. 12.-P. 680-687.
364.
Leelarasamee, A. Antimicrobial resistance of 100 serial gram - negative
isolates in two intensive care units./ Leelarasamee A., Jenyapoon K. // J. Med.Assos.
Thai.-1992.-Vol.76.-N. 13.-P. 180-183.
365.
Lesseva, M.I. Analysis of bacteriuria in patients with burns / M.I.Lesseva,
O.G.Hadjiski // Burns. -1995. –Vol.21. -P.3-6.
268
366.
Llanes, C. Stability of conjugative and non-conjugative R-plasmids from
Serratia marcescens to gyrase inhibitors / C Llanes; Y Michel-Briand; M Thouverez; C
Bailly; F Grimont // Microbiologica, 1990 Apr; Vol. 13 (2), pp. 157-159.
367.
Lobo, A.L. Identification and assay of RTX family of cytolysins /
A.L.Lobo, R.A.Welch // Methods enzymol. -1994. –Vol.235. –P.667-78.
368.
Lottenberg, R. Capturing host plasmin(ogen): a common mechanism for
invasive pathogens. / R Lottenberg, D. Minning-Wenz, M.D.Boyle // Trends Microbiol. 1994. –Vol.2. –P.20-4.
369.
Matsui, S. Clinical bacteriology and empiric therapy for hospital-acquired
pneumonia in the elderly at a national leprosarium / S.Matsui, T.Nakasawa // Nippon.
Kyobu. Shikkan. Gakkai. Zasshi. -1994. -Vol.32. -P.851-5.
370.
May, A.K. All Rights Reserved. Contribution of Escherichia coli Alpha-
Hemolysin to Bacterial Virulence and to Intraperitoneal Alterations in Peritonitis. / May
A.K., Gleason T.H., Sawyer R.G., Pruet T.L. // Infect. And Immun.-2000 Jan.-Vol.68,
No. 1.-p. 176-183.
371.
Mazurier, S. RAPD analysis of Campylobacter isolates: DNA fingerprinting
without the need to purify DNA / S. Mazurier, A. Giessen, K. Heuvelman, K. Wernas //
Lett. Appl. Microbiol. –1992. –Vol.14. -P.260-2.
372.
Melton-Celsa, A.R. Activation of Shiga-like toxins by mouse and human
intestinal mucus correlates with virulence of enterohemorrhagic Escherichia coli
091:H21 isolates in orally infected, streptomycin-treated mice / A.R.Melton-Celsa,
A.D.O'Brien // Infect. Immun. -1996. –Vol.64. –P.1569-76.
373.
Melton-Celsa, A.R. Activation of Shiga-like toxins by mouse and human
intestinal mucus correlates with virulence of enterohemorrhagic Escherichia coli
091:H21 isolates in orally infected, streptomycin-treated mice / A.R.Melton-Celsa,
A.D.O'Brien // Infect. Immun. -1996. –Vol.64. –P.1569-76.
374.
Miles, A.A. The mouse pathogenecity and toxicity of Proteus vulgaris //J.
gen. Microbiology.-1951.-5/-P.307-316.
375.
Nair, G.B. The heat-stable enterotoxins / G.B.Nair, Y.Takeda // Microb.
Pathog. –1998. –Vol.24. –P.123-31.
269
376.
Narang, A. Neonatal necrotizing enterocolitis: a clinical study / A.Narang,
R.Rao, O.N.Bhakoo // Indian. Pediatr. -1993. –Vol.30. –P.1417-22.
377.
Nassif, X. Less systems bacteriens de captation du for: leur role dans la
virulence / X.Nassif, P.Sansonetti // Bull. Inst. Pastuer. -1987. -Vol.85. -P.307-27.
378.
National Committee for Clinical Laboratory Standards. Performance
Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing, NCCLS Ninth Informational
Supplement. M 100.-1998.- Vol.18, N1.- S8.
379.
Neter, E. Enteropathogenicity: recent developments / E.Neter // Klin.
Wochenschr. -1982. -Vol.60. -P.699-701.
380.
Peerborms, P.G.H., Verwei J.A.U., Pijiper A.M. Uropathogenic properties
of Proteus mirabilis and Proteus vulgaris. // J. of Memicrobiology.-1985.-19.-№1.-Р.5560.
381.
Phan, V. ZapA, a Virulence Factor in a Rat Model of Proteus mirabilis-
Induced Acute and Chronic Prostatitis / Phan V., Belas R., Gilmore B., Howard Ceri //
Infect. Immun. – 2008. - Vol. 76(11) – P. 4859–4864.
382.
Rahman, M.M. The structure of the capsular polysaccharide from a
swarming strain of pathogene Proteus vulgaris. Rahman M.M., Guardpetter J., Asokan
K., Carlson R.W. // Carbohydrat. Res.-1997.-№34.-P. 213-220
383.
Ramos, S.R. Neonatal bacterial meningitis: etiological agents in 109 cases
during a 10 year period. / Ramos S.R., Feferbaum R., Manissadjian A., Vaz F.A. / Arq.
Neuropsiquiatr, 1992 Sep; Vol. 50 (3), pp. 289-430.
384.
Rappaport, R. Development of a purified cholera toxoid. III Refinements in
purification of toxin and methods for the determination of residual somatic antigen / R.
Rappaport, W. Pierschala, G. Boncle // Infect. Immun. -1976. -Vol.14. -P.687-93.
385.
Rauss, K.F. The systematic position of Morgans bacillis. // J. Path. And
Bact.-1936.V.42.(XLII).-Р.183.
386.
Rozalski Antoni, Wykrota Marianna Some biological latures of Proteus
bacilli. Comparison of hemolytic activity of Proteus and Serratia strains. // Acta
microbial.- 1986.-35.-№1-2.-Р.57-59.
270
387.
Rusch, V.C. Das Konzept Symbiose: Eine Ubersicht uber die Terminologie
zur Beschreibung von Lebensgemeinschaften ungleichnamiger Organismen./Rusch
V.C.// Microekol. Therapy.- 1989.-Vol. 19.-P.542-549.
388.
Saxena, S.K. Shiga toxin, Shiga-like toxin II variant, and ricin are all single-
site RNA N-glycosidases of 28 S RNA when microinjected Xenopusoocytes / S.K.
Saxena, A.D. O'Brien, K.J. Ackerman // J. Biol. Chem –1989. –Vol.264. –P.596-601.
389.
Schaberg, D.R. Major trends in the microbial etiology of nosocomial
infection. / Schaberg D.R., Culvr D.H., Gaynes R.P. // Am. J. Med. - 1991.-Vol.91.N3B.-Р. 72-75.
390.
Schaefer, F. Bacterial keratitis: a prospective clinical and microbiological
study / F. Schaefer; O. Bruttin; L. Zografos; Y. Guex-Crosier // Br. J. Ophthalmol, 2001
Jul; Vol. 85 (7), pp. 842-7.
391.
Schmid, E.N. Unstable L-form Proteus mirabilis induced by bosfomycin. //
Chemotherapy.-1985.-V.31.-№4.-P.286-291.
392.
Sears, C.L. Enteric bacterial toxins: mechanisms of action and linkage to
interstinal secretion / C.L.Sears, J.B.Kaper // Microbiol. Reviews. -1996. –Vol.60. –
P.167-215.
393.
Shapiro, J.A. Pattern and control in bacterial colonies / J.A. Shapiro // Sci.
Progr. -1994. -Vol.76. -P.399-424.
394.
Shoddy, A. Polymicrobial gramnegative bacteremia associated with saline
solution flush used with a needless intravenous system. / Shoddy A., Pettis A.M.,
Schoonmaker D., Shelly M.A. // Am.J. Infect. Control. -1995. -Vol.26. -N6. -P.357-400.
395.
Simon, G.L. Intestinal Flora in Health and Disease. / Simon G.L., Gorbach
S.L. // Gastroenterology.- 1984.- Vol. 86.,-P.105-122.
396.
Sixma, Т.К. Comparison of the B-pentamers of heat-labile enterotoxin
and verotoxin-1:
two
structures
with remarkable similarity and dissimilarity. /
Sixma Т.К., Stein P.E., Hoi W.G., Read R.J. // Biochemistry.- 1993, 32.- P. 191-198.
397.
Songer, J.G. Bacterial phospholipases and their role in virulence /
J.G.Songer // Trends Microbiol -1997. –Vol.5. –P.156-61.
271
398.
Spencer Michael Bacterial motion Sguare is beautiful. //Nature.-
1985.V.313.-№5999.-Р.183.
399.
Stahi Susan J., Stewart Kenneth R., Williams F.D. Extracellular slime
associated with Proteus mirabilis during swarming. // J. of Bacteriology.-1983.-V.154.№2.-Р.930-937.
400.
Stein, P.E. The crystal structure of pertussis toxin / P.E.Stein, A.Boodhoo et
al. // Structure. -1994. –Vol.2. –P.45-57.
401.
Strulens, M.J. Modification of antibiotic policy associated with decrease in
antibioticresistant gram-negative bacilli in ICU / Strulens M.J., Byl B., Govaerts D. et al.
// 38-th ICAAC, San - Diego, 1998. - Abstract 502.
402.
Strulens, M.J. Modification of antibiotic policy associated with decrease in
antibioticresistant gram-negative bacilli in ICU / Strulens M.J., Byl B., Govaerts, D. et
al. // 43-th ICAAC, San - Diego, 2003.
403.
Suh, J.K. Shiga toxin attacks bacterial ribosomes as effectively as
eukaryotic ribosomes / J.K.Suh, C.J.Hovde, J.D.Robertus // Biochemistry. -1998. –
Vol.37. –P.9394-8.
404.
Tan, T.Y. Evaluation of Screening Methods To Detect Plasmid-Mediated
AmpC in Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, and Proteus mirabilis / Tan T.Y.,
Yong Ng L.S., Jie He, Tse Hsien Koh, and Li Yang Hsu // Antimicrob Agents
Chemother. – 2009. – Vol. 53(1): 146–149.
405.
Tenover, F.C. Identification of Plasmid-Mediated AmpC β-Lactamases in
Escherichia coli, Klebsiella spp., and Proteus Species Can Potentially Improve Reporting
of Cephalosporin Susceptibility Testing Results / Tenover F.C., Emery S.L., Spiegel
C.A, Bradford P.A., Eells S., Endimiani A., Bonomo R.A., McGowan J.A., // J. Clin.
Microbiol. – 2009. - Vol. 47(2). – P. 294–299.
406.
Tesh, V.L. The pathogenic mechanisms of Shiga toxin and the Shiga-like
toxins / V.L.Tesh, A.D.O'Brien // Mol Microbiol –1991.-Vol.5. –P.1817-22.
407.
Thomas, Venetta S. Identification of Ure R binding sites in the
Enterobacteriaceae plasmid-encoded and P.mirabilis urease gene operons // Thomas
Venetta S., M. Collins Carleen. // Mol. Microbiol.-1999.-Vol. 31.-№5.-p.1417-1428.
272
408.
Takano, M. Protective roles of T cells and interleukin – 15 in Escherichia
coli infection in mice. / M. Takano, H. Nishimyra, Y. Kimura // Infect. Immun. 1998.Vol.66.-P. 3270-3278.
409.
Torres, R. Endovas-cular infections due to salmonella non-typhi the of
surgery to active cure. / Torres R., Azofra J., Verdejo C., Fernandes-Juerrero M.L. //
5th Eur.Congr.Clin.Microbiol.and Infect.Dis.,Oslo.9-l 1, 1991:Abstr.-[Oslo].[1991]P.168-187.
410.
Tumbarello, M. Predictors of Mortality in Patients with Bloodstream
Infections Caused by Extended-Spectrum-β-Lactamase-Producing Enterobacteriaceae:
Importance of Inadequate Initial Antimicrobial Treatment / Tumbarello M., Sanguinetti
M., Montuori E., Trecarichi E.M., Posteraro B., Fiori B., Citton R., D'Inzeo T., Fadda
G., R. Cauda, Spanu T. // Antimicrob. Agents. Chemother. – 2007. – Vol. 51(6). – P.
1987–1994.
411.
Tundidor-Bermudez A.M. A xanthogranulomatous psoas abscess 4 years
after nephrectomy for xanthogranulomatous pyelonephritis / A.M.Tundidor-Bermudez,
D. Brene-Padron //Arch. Esp. Urol. -1993.-Vol.46. –P.428-9.
412.
Ulitzur, S. The mechanism of swarming of vibrio alginolyticus. // Arch.
Microbial.-1975.-104.-P.67-71.
413.
Unhanand, M. Gram-negative enteric bacillary meningitis: a twenty-one-
year experience / M.Unhanand, M.M.Mustafa, G.H.McCracken, J.D.Nelson // J. Pediatr.
-1993. -Vol.122. –P.15-21.
414.
Vatopoulos, A.C. Risk factors for nosocomial infections caused by gram-
negative bacilli. The Hellenic Antibiotic Resistance Study Group / A.C.Vatopoulos,
V.Kalapothaki, N.J.Legakis // J. Hosp. Infect. -1996. –Vol.34. –P.11-22.
415.
Vincent, J.L. The prevalence of nosocomial infection in intersive care units
in Europe / Vincent J.L., Bihari P.M., Suter P.M. et al. // JAMA. -1995. - Vol. 274. P.639 -644.
416.
Wachsmulth, I.K., Falkow S., Ryder R.W. Plasmid-mediated properties of a
heat-stable enterotoxin producing E. coli associates with infantile diarrhaea. // Infection
and Immunity.-1976.-14.-403-407.
273
417.
Wick, M.J., Iglewski B.H. ADP-ribosylating toxins and g proteins. / Eds.
J.Moss, M.Vaughan. Washington: Am Soc Microbiol., 1990. –P.21-43.
418.
Wiegand, I. Detection of Extended-Spectrum Beta-Lactamases among
Enterobacteriaceae by Use of Semiautomated Microbiology Systems and Manual
Detection Procedures / Wiegand I., Geiss K. H, Mack D., Stürenburg E., Seifert H. // J.
Clin. Microbiol. - 2007 - Vol. 45(4). - P. 1167–1174.
419.
Wilson, M. Bacterial pertubation of cytokine networks. / Wilson M.,
Seymour R., Henderson B // Ibid. 1998. -Vol.66, №6.-Р. 2401-2409.
420.
Wiswell, T.E. No Lumbar puncture in the evolution for early neonatal
sepsis: will meningitis be missed. / T.E.Wiswell, S.Baumgart, C.M.Gannon, A.R.Spitzer
// Pediatrics. -1995. -Vol.95.-P.803-6.
421.
Yaeshima, T. Benefits of Bifidobacteria to human health / Yaeshima T. //
Bulletin FIL-IDF (Belgium). Intern. Dairi Federation. - 1996. - №.313. - P.36-42.
422.
Yamamoto, T. Evolutionary origin of pathogenic determinants in
enterotoxigenic Escherichia coli and Vibrio cholerae 01 / T.Yamamoto, T.Gojobori,
T.Yokota // J. Bacteriol. -1987. –Vol.169. –P.1352-7.
423.
Yamamoto, T. Evolutionary origin of pathogenic determinants in
enterotoxigenic Escherichia coli and Vibrio cholerae 01 / T.Yamamoto, T.Gojobori,
T.Yokota // J. Bacteriol. -1987. –Vol.169. –P.1352-7.
424.
Youssef, P.P. Septic arthritis: a second decade of experience / P.P.Youssef,
J.R.York // Aust. N. Z. J. Med. -1994. -Vol.24. -P.307-11.
425.
Zabłotni, A. Serological and structural characterization of the O-antigens of
the unclassified Proteus mirabilis strains TG 83, TG 319, and CCUG 10700 (OA) /
Zabłotni A., Zych K, Kondakova A.V., Siwińska M., Knirel Y.A., Sidorczyk Z. // Arch.
Immunol. Ther. Exp. (Warsz). – 2007. - Vol. 55(5). – P. 347–352.
426.
Zembrzuska-Sadkowska, E. The danger of infections of the hospitalized
patients with the microorganisms present in preparations and in the hospital environment
/ E.Zembrzuska-Sadkowska // Acta. Pol. Pharm. -1995. –Vol.52. –P.173-8.
427.
Zych, K. Serological classification and epitope specificity of Proteus
vulgaris TG 251 from Proteus serogroup O65. / Kołodziejska K., Drzewiecka D.,
274
Perepelov A.V., Knirel Y. A., Sidorczyk S. // Arch Immunol. Ther. Exp. (Warsz). 2007. - Vol. 55(3). – P. 187–191.