Куриный эмбрион

1
Куриный
эмбрион (КЭ) - куриный
зародыш, находящийся на
разных стадиях эмбрионального
развития.
В микробиологической практике
КЭ используют для выделения,
культивирования и
идентификации вирусов,
риккетсий и иногда бактерий.
2
 Интерес
к куриному эмбриону, как
объекту исследования, появился еще у
Аристотеля, который стоит у истоков
эмбриологии и биологии развития.
 С XVII века ряд ученых сделали
открытия, используя в качестве объекта
исследований, куриный эмбрион.
Поэтому невозможно переоценить
значение куриного эмбриона не только
на этапе становления, но и на
дальнейших этапах развития учения об
онтогенезе.
3
 Использование
куриного эмбриона
имеет свои особенности: это доступная
и управляемая система, благодаря
чему можно получать результаты
практически с помощью всех известных
методов; работа с куриным эмбрионом,
может быть реализована на любом
этапе онтогенеза. Эмбрион является
экологически чистым максимально
изолированным от внешней среды
объектом, что снижает вероятность
спонтанного влияния внешних
факторов в процессе эксперимента.
4
 Куриный
зародыш является объектом
экспериментального изучения
закономерностей эмбрионального развития.
Наибольшее число исследований выполнено
в условиях искусственной инкубации, что
позволило испытать влияние различных
внешних факторов на общие закономерности
развития организма.
 При этом сам процесс инкубации, как
основной способ получения
экспериментальной эмбриональной ткани,
сопровождается неизбежными потерями.
 В связи с этим эксперименты с куриными
эмбрионами не противоречат принципам
биоэтики.
5
Зародыши
кур используют в
микробиологии и вирусологии
для определения патогенности и
степени вирулентности
изучаемого микроорганизма.
Кроме того, на эмбрионах
проводят различные опыты:
постановка реакции
нейтрализации, определение
инфекционного титра, изучение
виростатических веществ и т.д.
6
Иммунология
- еще одна отрасль
биологии, где используется
куриный эмбрион в качестве
экспериментального животного.
Это позволило изучить такие
явления, как толерантность,
аллореактивность, онтогенез В- и
Т-лимфоцитов.
7
 Вышеописанные
свойства обусловили
использование куриного эмбриона,
ставшего классическим, в
биологической промышленности при
производстве противовирусных
вакцин и диагностикумов. Высокая
пролиферативная способность клеток
эмбриона, при создании оптимальных
условий выращивания вируса,
позволяет получить достаточное
накопление вирусного материала.
8
При
производстве бактериальных
вакцин куриные эмбрионы
используются в качестве
компонента питательной среды,
что существенно повышает
прирост бактериальной массы
культивируемых
микроорганизмов
9
Известно,
что наиболее
эффективные и перспективные
иммуностимуляторы и препараты
c иммуномодулирующими
свойствами (стволамин, ряд
специфических цитаминов,
плацентоль, экстракт плаценты и
др.) получены из растущих
эмбриональных и плацентарных
тканей животных, а иногда и
человека.
10
 Но
использование таких тканей ограничено
эпизоотическими проблемами, сложностью
получения достаточного количества
эмбрионального материала с
необходимыми параметрами,
невозможностью управляемости развитием
и соображениями биоэтики. Поэтому
куриный эмбрион является наиболее
доступным, рентабельным,
высокоактивным сырьевым субстратом, не
только не уступающим по своим
качествам, но и превосходящий, по ряду
показателей эмбрионально-плацентарные
ткани других животных.
11
12
 Наиболее
благоприятная температура
воздуха вблизи яиц для всех видов
сельскохозяйственной птицы во все
периоды инкубации находится в
пределах 37,7-38,3 градуса цельсия.
Опасная температура для развития
эмбриона ниже 36,1 и выше 39,4
градуса.
 Нельзя укладывать яица острым
концом вверх т.е. вниз воздушной
камерой - это резко снижает вывод.
13
А
- 6 суток развития. 1 –
1-я к., 2 – 2-я к., 3 – 3-я
к., 4 - кровянное
кольцо, 5 – неоплодотворенное яйцо.
 Б - 11 суток развития. 1
– 1-я к., 2 – 2-я к., 3 – 3я к., 4 - замерший
зародыш.
 В - 18,5 суток развития.
1 - 1 – 1-я к., 2 – 2-я к.,
3 – 3-я к., 4 - яйцо с
погибшим эмбрионом.
14
Для
лабораторных целей
отбирают свежие,
оплодотворенные, с хорошо
просвечивающей и не имеющей
трещин скорлупой КЭ.
Инкубацию проводят в гнездах
штатива тупым концом яйца
вверх в хорошо вентилируемых
инкубаторах или термостатах при
37 -37,5 °С, относительной
влажности 63-70 %.
15
Для
заражения отбирают 4- 13дневные эмбрионы с
выраженными кровеносными
сосудами, желточным мешком и
подвижной тенью. Перед
заражением скорлупу яиц
обрабатывают спиртом,
обжигают и в области введения
(чаще над воздушной камерой)
смазывают 2% йодной настойкой.
16
Материал
вводят, вскрывая или
не вскрывая скорлупу, в
желточный мешок (риккетсий), в
аллантоисную или
амниотическую полости
(большинство вирусов), наносят
на хорион-аллантоисную
оболочку. Реже материал вводят
в тело эмбриона или в/в.
17
Зараженные
КЭ помещают в
термостат в условиях и на сроки,
к-рые зависят от вида микроба и
целей исследования. Некоторые
данные о результатах заражения
можно получить при внешнем
осмотре КЭ под микроскопом
(инъекция сосудов, потеря
подвижности и др.).
18
Однако
в большинстве случаев
КЭ вскрывают. Для этого после
обработки спиртом и йодной
настойкой скорлупу срезают
выше границы воздушного
мешка, пастеровской пипеткой
или шприцем отсасывают
сначала аллантоисную, а затем
амниотическую жидкость,
избегая повреждения сосудов и
желточного мешка.
19
Эмбрион
и хорионаллантоисную
оболочку извлекают из
скорлупы, помещают в
стерильные чашки, промывают
стерильной дистил. водой и
осматривают. Дальнейший ход
исследования эмбриона и его
жидкостей зависит от вида
микроба или вируса и целей
опыта.
20
21
Куриные
эмбрионы 9—11дневной инкубации
овоскопируют. Отбирают яйца с
подвижными эмбрионами и
хорошо выраженными сосудами.
На скорлупе простым
карандашом отмечают границы
воздушной камеры и
расположение зародыша.
22
 Поверхность
скорлупы протирают
йодированным спиртом и обжигают.
Стерильными ножницами срезают
скорлупу на 2-3 мм выше границы
воздушной камеры, разрывают
подскорлупную и хорионаллантоисную
оболочки и за шейку извлекают эмбрион,
в стерильную чашку Петри у эмбриона
удаляют голову, лапки, крылья и
внутренние органы. Оставшийся кожномышечный мешок переносят в
стерильную майонезную банку (250 мл) и
измельчают ножницами на кусочки 3—4
мм.
23
 Измельченную
ткань 2—3 раза
отмывают раствором Хенкса от слизи
и кровяных элементов до получения
прозрачных сливных вод и переносят
в колбу для трипсинизации. В колбу
наливают 0,15%-ный раствор
трипсина, подогретого до 35-37 0С
(соотношение ткани и трипсина 1:3),
вносят стерильный магнитик и ставят
на магнитную мешалку.
24
 Трипсинизацию
проводят дробно, т. е.
через каждые 3—5 мин отделившиеся
клетки вместе с трипсином сливают в
центрифужные флаконы и помещают на
лед или в холодильник для прекращения
действия трипсина на клетки. К
оставшемуся в колбе содержимому
добавляют новую порцию трипсина.
Скорость вращения на магнитной
мешалке регулируют так, чтобы не было
пены. Процесс повторяют несколько раз
(3-5) до полного истощения ткани.
25
 После
трипсинизации суспензию клеток
в растворе трипсина центрифугируют
при 1000 мин-1 10 мин, надосадочную
жидкость сливают (выбрасывают), а
осадок клеток ресуспендируют в теплой
(37 °С) питательной среде (в заведомо
известном объеме) и фильтруют через 3слойный марлевый фильтр. После
тщательного перемешивания клеток
берут 1 мл для подсчета клеток.
26
 Успех
культивирования клеток в
значительной степени зависит от
посевной дозы. При малом количестве
клеток не наблюдается образование
монослоя даже при длительном
культивировании. При слишком большой
дозе клеток происходит интенсивная их
пролиферация, и образованный слой
клеток значительно раньше
подвергается старению и
неспецифической дегенерации.
27
К
1 мл взвеси клеток добавляют равный
объем 0,1%-ного раствора
кристаллвиолета, приготовленного на
0,1 н. растворе лимонной кислоты.
После перемешивания камеру заполняют
взвесью клеток и подсчитывают все
клетки, имеющие ядро и
неповрежденную цитоплазму; группу
клеток с явными контурами считают за
одну клетку.
28
 На
основании подсчета клеток в двух
камерах высчитывают среднее
арифметическое в одной из них. Число
клеток в 1 мл суспензии (Х) определяют
по формуле:
 Х= (А*2*1000):0,9,
 Где А — среднее число клеток в одной
камере;
 2 — коэффициент разведения суспензии
добавленным объемом краски; 1000—
число мм3 в 1 см3 0,9 объем камеры
Горяева, мм3.
29
 После
подсчета суспензию клеток
разводят питательной средой с таким
расчетом, чтобы в 1 мл содержалось от
700 тыс., до 1 млн. клеток (для куриных
фибробластов).
 Затем суспензию разливают в матрасы
или пробирки. В пробирки заливают по 1
мл, в матрасы вместимостью 1000, 250 и
100 мл вносят соответственно 100,40 и
15 мл взвеси клеток. Сосуды и пробирки
плотно закрывают стерильными
резиновыми пробками (для
предупреждения защелачивания среды),
делают надпись (вид культуры клеток и
дату).
30
 На
пробирках восковым карандашом
проводят продольную черту, укладывают
их чертой вверх в лотки с наклонным
углом 5° и помещают в термостат при 37
°С. Ежедневно, культуры
просматривают под малым увеличением
микроскопа для определения характера
роста. Если клетки не пролиферируют,
выглядят округлыми, зернистыми,
темными и отслаиваются от стекла, это
свидетельствует о плохой обработке
посуды или токсичности сыворотки,
питательной среды.
31
 Пролиферирующие
клетки светлые,
связаны цитоплазматическими
отростками, растут однослойным
пластом. В процессе размножения
клеток выделяются продукты обмена
веществ, которые вызывают изменение
рН питательной среды в кислую сторону
(среда желтеет), что отрицательно
влияет на клетки и может привести их к
гибели. Такую среду заменяют свежей.
Обычно сплошной монослой куриные
фибробласты образуют через 36 - 48 ч.
 От одного куриного эмбриона получают
70— 120 млн. клеток.
32
33
 Куриные
эмбрионы чувствительны к большинству
вирусов птиц и к некоторым вирусам
млекопитающих (болезни Ньюкасла, гриппа,
оспы птиц, ПГ-3 др.). Используют куриные
эмбрионы от 5-го до 12-го дня инкубации.
Вирусы в них могут репродуцироваться в клетках
самого зародыша, хорионаллантоисной (ХАО) и
амниотической оболочках, в стенках желточного
мешка, накапливается в этих структурах и в
жидкостях аллантоисной и амниотической
полостей. В разных структурах могут
репродуцироваться различные вирусы.
34
 Разработано
несколько методов
заражения куриных эмбрионов, но в
практике чаще используют следующие
методы:
 на ХАО- например, вирусы оспы птиц и
др.;
 в аллантоисную полость- вирусы гриппа,
ПГ-3 крупного рогатого скота, вирус
болезни Ньюкасла и др.;
 в амниотическую полость- вирусы риппа;
 в желточный мешок- вирус
ринопневмании лошадей.
35
 по
гибели зародыша в определенные
характерные для соответствующего
вируса сроки инкубации;
 по патологоанатомическим изменениям
в структурах куриного эмбриона,
например, белые узелки (оспины) при
оспе птиц, инфекционном
ларинготрахеите кур и друих инфекциях
или желто-зеленый цвет аллантоисной
жидкости при гепатите утят и т.п.;
36
 по
реакции гемагглютинации (для
обнаружения гемагглютинирующих вирусов,
например, вируса болезни Ньюкасла, гриппа,
ПГ-З и др.) При наличии вируса в
эмбриональной жидкости куриного эмбриона
через 3-7 мин после смешивания
капли вируссодержащей жидкости и капли
взвести эритроцитов соответствующего вида
животного образуются хлопья эритроцитов
(агглютинация) . Так, для выявления вируса ПГ3 КРС используют эритроциты морской свинки,
вирусов гриппа- эритроциты кур и т.д.
37
 Таким
образом, куриный эмбрион является
не только интересным экспериментальным
объектом, позволившим получить сведения
о практически всех закономерностях
эмбрионального развития, но и
важнейшим материалом для
осуществления актуальных проблемных
исследований в других областях биологии и
медицины, а также ценнейшим сырьем для
биотехнологической промышленности.
38