Л. В. Маслиенко, Д. А. Курилова, Е. Ю. Шипиевская, А

МАСЛИЧНЫЕ КУЛЬТУРЫ. Научно-технический бюллетень Всероссийского научно-исследовательского
института масличных культур. Вып. 1 (140), 2009
__________________________________________________________
Л. В. Маслиенко,
доктор биологических наук
Д. А. Курилова,
младший научный сотрудник
Е. Ю. Шипиевская,
кандидат биологических наук
А. М. Асатурова,
научный сотрудник
ГНУ ВНИИМК Россельхозакадемии
Россия, 350038, г. Краснодар, ул. Филатова, 17
тел.: (861)275-85-19, факс (861)259-44-23
e-mail: [email protected]
ПЕРВИЧНЫЙ СКРИНИНГ ШТАММОВ ГРИБОВ И БАКТЕРИЙ АНТАГОНИСТОВ
К ВОЗБУДИТЕЛЮ ФУЗАРИОЗА СОИ
Ключевые слова: соя, фузариоз, скрининг, штаммы, грибы, бактерии, антагонисты, антагонистическая
активность
УДК 633.853.52:632.9
Введение. В последние годы в нашей стране всѐ большее внимание уделяется ценной белково-масличной культуре сое. Севообороты насыщаются этой культурой, что создаѐт условия для распространения
болезней и повышения их вредоносности. Особую опасность для сои представляет фузариоз, который поражает всходы, вызывает корневую гниль и трахеомикозное увядание, а также гниль бобов и семян, что приводит к существенному снижению урожая и его качества. Результаты наших исследований показали, что
наиболее распространѐнными возбудителями фузариоза на сое являются Fusarium oxysporum Schlecht.
Emend. Snyd. et Hans. и его разновидность F. oxysporum var. orthoceras (App. et Wr.) Bilai, а также высокотоксичный для человека и животных вид F. sporotrichiella Bilai var. poae (Pk.) Wr. emend Bilai.
Для снижения вредоносности фузариоза на сое необходимо проведение комплексных мероприятий,
включающих и разработку микробиометода.
Биологическая защита растений на современном этапе включает использование веществ
биотического происхождения и применение биопрепаратов на основе живых культур микроорганизмов. При
этом использование биопрепаратов может преследовать различные цели: защиту растений и урожая от фитопатогенов, стимуляцию прорастания семян и роста растений, улучшение питания растений, получение компостов, супрессирующих возбудителей корневых гнилей растений и т.д. [1]. Однако отмечено, что в борьбе с
фузариозными заболеваниями растений наиболее интересным подходом является использование живых
культур микроорганизмов. Известно, что агрессивные расы патогенов обладают в благоприятных условиях
более высоким коэффициентом размножения, но отличаются меньшей устойчивостью к неблагоприятным
условиям среды. Грибы рода Fusarium являются почвообитающими факультативными паразитами, способными длительное время вести сапрофитное существование, а при благоприятных условиях вызывать болезни
растений, поэтому интродукция антагонистов должна создавать дополнительное давление в сторону элиминирования агрессивных рас [2].
Успешность микробиологического метода во многом определяется выбором микроорганизмовантагонистов, способных обеспечить эффективную защиту в течение вегетационного периода. Потенциальными биологическими агентами, перспективными для защиты растений от фузариозов, могут быть микроорганизмы различного таксономического положения.
В основе создания микробиопрепаратов лежит ступенчатый скрининг штаммов антагонистов к
возбудителям болезни.
Материалы и методы. На первом этапе скрининга тестировали коллекцию перспективных штаммов антагонистов фитопатогенов масличных культур лаборатории биометода ВНИИМК, которая включает в
себя 20 грибных штаммов, представленных родами Trichoderma, Penicillium, Chaetomium, Sordaria, Talaramyces и класса Basidiomycetes; и 26 бактериальных штаммов, представленных родами Bacillus и
Pseudomonas.
В качестве тест-объекта для испытания антагонистической активности штаммов грибов и бактерий
был выбран наиболее агрессивный изолят гриба F. sporotrichiella Bilai var. poae (Pk.) Wr. emend Bilai., выделенный нами из корневой системы сои.
Для выращивания культур использовали агаризированные питательные среды: картофельносахарозный агар (для грибов и бактерий рода Bacillus) и Кинга В (для бактерий рода Pseudomonas).
Определение антагонистической активности проводили методом двойных или встречных культур
[3, 4] при двух температурных режимах: +25 и +10 ºС.
Культуры антагонистов и патогена выращивали отдельно в течение 15-ти суток. Блок агара с мицелием патогена и антагониста вырезали стерильным пробойным сверлом, диаметром 0,5 мм, посев бактерий
осуществляли бактериологической петлѐй в виде штриха. Блок агара либо штрих с антагонистом и блок агара с мицелием патогена помещали одновременно в чашку Петри на агаризированную питательную среду на
расстоянии 6 см друг от друга. В течение 40 суток культуры росли при температуре +25 и +10 ºС. Контроль –
чистые культуры антагонистов и патогена, посеянные отдельно. Визуальный осмотр проводили через каждые сутки культивирования, учѐты на 5, 7, 10, 15, 20 и 40-е сутки инкубации. Изучали характер взаимоотношений антагониста и патогена: наличие или отсутствие зон, их размер, изменение цвета, плотности,
толщины и направления роста мицелия патогена.
Результаты и обсуждение. Для защиты культуры сои от возбудителей фузариоза в условиях ранних
и оптимальных посевов скрининг штаммов осуществляли при двух температурных режимах.
Особенность антагонистических взаимоотношений – изменения тест-объекта под воздействием антагониста. По наличию или отсутствию признаков морфологических изменений мицелия патогена (потемнение и лизис) судили о фунгистатическом или фунгицидном типе антагонизма.
Все активные штаммы при совместном культивировании с возбудителем фузариоза F.
sporotrichiella var. poae показали три типа взаимоотношений (из пяти возможных) по классификации Пестинской [5] (рис. 1):
I тип – фунгистатический антибиотический антагонизм, т. е. ингибирование роста колонии патогена происходит на расстоянии под воздействием антибиотических веществ (с образованием между ними пустой, «стерильной» зоны);
III тип – фунгистатический алиментарный антагонизм выражается в остановке роста колонии патогена при контакте с колонией антагониста, а также в нарастании последнего на патоген;
V тип – фунгицидный паразитический антагонизм – антагонист паразитирует на вегетативных и
репродуктивных органах тест-объекта.
а
b
а
b
а
b
1
2
3
4
Рисунок 1 – Антагонистическая активность штаммов грибов-антагонистов к F. sporotrichiella var. poae (ориг.)
1 – контроль (чистая культура F. sporotrichiella var. poae);
2 – фунгистатический антибиотический антагонизм на примере штамма Tk-1 Trichoderma koningii;
3 – фунгистатический алиментарный антагонизм на примере штамма А-1 Basidiomycetes;
4 – фунгицидный паразитический антагонизм на примере штамма Т-4 Trichoderma sp.
а – патоген; b – антагонист
Установлено, что при температуре +25 ºС максимальную эффективность показали 8 штаммов, из
которых Тk-1 Trichoderma koningii, Xk-1 Chaetomium olivacium, А-1 Basidiomycetes относятся к III типу
взаимоотношений с патогеном, а Т-1 Trichoderma sp., Т-2 Trichoderma sp., Т-3 Trichoderma sp., Т-4 Trichoderma sp. и Sm-1 Sordaria macrospora – к V типу (табл. 1).
При температуре +10 ºС наиболее активными признаны 4 штамма, из которых: Sm-1 Sordaria
macrospora относится к III типу взаимоотношений с патогеном, а Тk-1 Trichoderma koningii, Т-4 Trichoderma,
и А-1 Basidiomycetes – к I типу (табл. 2).
Штаммы грибов-антагонистов из рода Penicillium – Pv-3 P. verrucosum, Pbc-1 P. brevi-compactum и
Pp-1 P. purpurescens – в результате саморассева вначале совместной инкубации при пониженной температуре занимали 65,0-95,0 % площади питания в чашке Петри, но к концу наблюдений происходило нарастание
мицелия патогена на колонию антагониста.
В результате первичного скрининга бактерий-антагонистов с F. sporotrichiella var. poae исследованные при температуре +25,0 ºС штаммы по механизму антагонистического действия на патоген разделены
нами на две группы [6] (рис. 2):
- образующие стерильную зону антагонистического действия (15 штаммов);
- обладающие высоким показателем подвижности (11 штаммов).
Таблица 1 – Антагонистическая активность штаммов грибов-антагонистов к возбудителю
фузариоза сои F. sporotrichiella var. рoae при температуре +25,0 ºС на 10-е сутки культивирования
Вариант
Площадь зарастания поверхности питательной
среды
контроль
антагонистом
патогеном
Зона нарастания
антагониста (а),
патогена (п)
%
см²
%
см²
%
см²
%
см²
2
100
3
66,4
4
-
5
-
6
-
7
-
8
-
Tv-1 Trichoderma viride
100
66,4
32,5
21,6
70,0
46,5
2,5
Tk-1 Trichoderma koningii
100
66,4
50,0
33,2
50,0
33,2
0
T-1 Trichoderma sp.
100
66,4
100
66,4
37,5
24,9
37,5
T-2 Trichoderma sp.
100
66,4
100
66,4
47,5
31,5
47,5
T-3 Trichoderma sp.
100
66,4
95,0
63,1
32,5
21,6
27,5
T-4 Trichoderma sp.
100
66,4
100
66,4
42,5
28,2
42,5
Pk-1 Penicillium vermiculatum
100
66,4
27,5
18,3
82,5
54,8
10
M-24 Penicillium vermiculatum
100
66,4
47,5
31,5
75,0
49,8
22,5
Pv-3 Penicillium verrucosum
100
66,4
45,0
29,9
80,0
53,1
25,0
Pf-1 Penicillium funiculosum
100
66,4
22,5
14,9
87,5
58,1
10,0
Pbc-1 Penicillium brevi-compactum
80,0
53,1
55,0
36,5
55,0
36,5
10,0
Pr-1 Penicillium rugulosum
15,0
10,0
16,7
11,1
90,0
59,8
6,7
Pp-1Penicillium purpurescens
100
66,4
37,5
24,9
100
66,4
37,5
Tr-1 Trichothecium roseum
Xk-1 Chaetomium olivaceum
Х-2 Chаetomium globosum
Sm-1 Sordaria macrospora
100
90,0
100
100
66,4
59,8
66,4
66,4
52,5
65,0
27,5
80,0
34,9
43,2
18,3
53,1
47,5
35,0
72,5
27,5
31,5
23,2
48,1
18,3
0
0
0
7,5
Tt-1 Talaramyces trachispermus
20,0
13,3
10,0
6,6
97,5
64,7
7,5
A-1 Basidiomycetes
100
66,4
40,0
26,6
60,0
39,8
0
И-3 Basidiomycetes
100
66,4
37,5
24,9
67,5
44,8
5,0
9
п
1,7
0
а
24,9
а
31,5
а
18,3
а
28,2
п
6,6
п
14,9
п
16,6
п
6,6
п
6,6
п
4,5
п
24,9
0
0
0
0
п
5,0
0
п
3,3
1
Fusarium sporotrichiella var. рoae
Размер
антибиотической
зоны, мм
10
0
0
0
0
0
0
0
0
2,0
0
3,5
1,5
0
0
0
0
0
0
0
0
Из 15-ти штаммов, образующих стерильную зону на 5-е сутки совместной инкубации, 14 штаммов
проявили антагонистическую активность, диаметр антибиотической зоны составил от 3,0 до 14,0 мм (табл.
3). Однако на 20-е сутки совместной инкубации лишь 4 бактериальных антагониста удерживали зону ингибирования патогена: 12-2 Pseudomonas sp., 14-3 Pseudomonas sp., Sgrc-1 P. fluorescens и 11-1 Bacillus sp. Также необходимо отметить, что в зоне антагонистического действия бактерий наблюдался лизис мицелия
патогена.
Таблица 2 – Антагонистическая активность штаммов грибов-антагонистов к возбудителю фузариоза сои
F. sporotrichiella var. рoae при температуре +10,0 ºС на 20-е сутки культивирования
Площадь зарастания поверхности питательной
среды
Вариант
контроль
Fusarium sporotrichiella var. рoae
Tv-1 Trichoderma viride
Tk-1 Trichoderma koningii
T-1 Trichoderma sp.
T-2 Trichoderma sp.
T-3 Trichoderma sp.
T-4 Trichoderma sp.
Pk-1 Penicillium vermiculatum
M-24 Penicillium vermiculatum
%
42,5
0
5,0
5,0
0
0
5,0
0
0
см²
28,2
0
3,3
3,3
0
0
3,3
0
0
Pv-3 Penicillium verrucosum
100
66,4
Pf-1 Penicillium funiculosum
0
Pbc-1 Penicillium brevi-compactum
антагонистом
патогеном
см²
0
3,3
26,6
0
1,3
5,0
0
0
%
77,5
22,5
80,0
37,5
70,0
17,5
45,0
37,5
см²
51,5
14,9
53,1
24,9
46,5
11,6
29,9
24,9
%
0
0
0
0
0
0
0
0
63,1
17,5
11,6
12,5
0
%
0
5,0
4,0
0
2,0
7,5
0
0
ср
95,0
0
0
80,0
53,1
0
100
66,4
65,0
43,2
40,0
26,6
5,0
Pr-1 Penicillium rugulosum
5,0
3,3
3,3
80,0
53,1
0
Pp-1 Penicillium purpurescens
22,5
14,9
59,8
32,5
21,5
22,5
Tr-1 Trichothecium roseum
Xk-1 Chaetomium olivaceum
Х-2 Chаetomium globosum
Sm-1 Sordaria macrospora
Tt-1 Talaramyces trachispermus
A-1 Basidiomycetes
И-3 Basidiomycetes
Примечание: ср – саморассев.
10,0
10,0
5,0
100
0
20,0
10,0
6,6
6,6
3,3
66,4
0
13,3
6,6
5,0
ср
90,0
5,0
10,0
5,0
62,5
0
10,0
15,0
3,3
6,6
3,3
41,5
0
3,3
10,0
27,5
55,0
40,0
37,5
82,5
27,5
55,0
18,3
36,5
26,6
24,9
54,8
18,3
36,5
0
0
0
0
0
0
0
а
1
b
2
Размер
антибиотической
зоны, мм
Зона нарастания
антагониста (а),
патогена (п)
см²
0
0
0
0
0
0
0
0
п
8,3
0
п
4,0
0
п
15,0
0
0
0
0
0
0
0
а
0
12,5
0
1,5
0
8,5
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
8,5
0
b
3
Рисунок 2 – Антагонистическая активность бактериальных штаммов в отношении гриба
F. sporotrichiella var. poae (ориг.)
1 – контроль (чистая культура F. sporotrichiella var. poae);
2 – образование бактерией-антагонистом стерильной зоны в отношении патогена
на примере штамма 12-2 Pseudomonas sp.;
3 – блокирование роста мицелия патогена бактерией-антагонистом на примере
штамма Б-5 B. licheniformis.
а – патоген; b – антагонист.
Таблица 3 – Антагонистическая активность бактериальных штаммов, образующих
стерильную зону в отношении гриба F. sporotrichiella var. poae,
при температуре +25 ºС
Краснодар, ВНИИМК, 2007 г.
Штамм
Sgc-1 Pseudomonas sp.
12-2 Pseudomonas sp.
Sgrc-1 P. fluorescens
14-3 Pseudomonas sp.
Oif 2-1 Pseudomonas sp.
D 1-3 Bacillus sp.
11-1 Bacillus sp.
№1а B. polymyxa
Р-9 B. polymyxa
Р-8 B. polymyxa
К1-1 B. subtilis
ВВ(с) B. subtilis
5Б-1 B. subtilis
Б-2 B. circulans
Б-4 B. circulans
Диаметр зоны ингибирования, мм
инкубация, сутки
5-е
7-е
12-е
20-е
12,0±1,4
8,0±1,4
3,0±1,4
3,0±1,4
11,5±3,5
9,0±1,4
4,5±0,7
4,5±0,7
10,0±1,4
1,0±1,4
0
0
14,0±1,4
10,0±1,4
8,5±2,1
8,5±2,1
8,5±2,1
0
0
0
6,0±5,7
1,5±2,1
0
0
11,5±7,8
5,5±0,7
7,5±0,7
6,0±1,4
9,5±0,7
1,0±0
0
0
6,5±0,7
0
0
0
0
0
0
0
4,0±5,6
0
0
0
7,5±2,1
0
0
0
8,0±0
0
0
0
3,0±4,2
0
0
0
8,0±2,8
0
0
0
Из штаммов, обладающих высоким показателем подвижности, максимальную ингибирующую активность по отношению к F. sporotrichiella var. poae показали: Far 8 Bacillus sp., Б-5 B. licheniformis и Б-12
B. licheniformis, которые уже на вторые сутки совместной инкубации занимали максимальную площадь питательной среды чашки Петри, блокируя дальнейшее разрастание патогена (табл. 4). Кроме того, следует
отметить, что проявившие себя штаммы оказывали существенное влияние на морфологические признаки
тест-объекта: вблизи зоны нарастания воздушный мицелий патогена паутинистый, частично лизирован, наблюдалось образование валика.
Таблица 4 – Антагонистическая активность бактериальных штаммов рода Bacillus, обладающих высоким
показателем подвижности, в отношении гриба F. sporotrichiella var. poae при температуре +25 ºС
Штамм
Рост мицелия патогена от посевного блока, мм
инкубация, сутки
7-е
12-е
74,0±1,4
74,0±0
Контроль
5-е
51,0±0,7
20-е
74,0±0
Orf 1 Bacillus sp.
28,0±1,4
32,5±6,4
34,0±2,8
35,0±4,2
D 10 Bacillus sp.
29,5±0,7
35,5±0,7
37,5±2,1
39,0±2,8
D 1-1 Bacillus sp.
25,0±0
25,0±0
25,5±0,7
30,0±2,8
Fa 4-1 B. subtilis
26,5±0,7
34,0±5,6
44,5±0,7
54,5±17,7
Fa 4-2 Bacillus sp.
14,0±1,4
27,0±2,8
25,0±2,8
31,0±1,4
D 7-1 B. subtilis
30,0±1,4
35,5±3,5
35,0±1,4
33,5±0,7
Far 8 Bacillus sp.
21,5±0,7
24,0±1,4
24,0±1,4
28,0±2,8
Fz 9 Bacillus sp.
28,5±2,1
33,5±4,9
25,0±2,8
33,0±4,2
Б (2-1) B. licheniformis
27,5±3,5
26,5±4,5
27,0±5,7
28,0±5,7
Б-5 B. licheniformis
21,0±1,4
21,0±1,4
22,5±0,7
23,5±0,7
Б-12 B. licheniformis
20,5±0,7
20,5±0,7
21,5±0,7
22,0±0
При температуре +10 ºС антибиотическую активность по отношению к F. sporotrichiella var. poae
показали только штаммы из рода Pseudomonas, образующие стерильную зону антагонистического действия.
Максимальную активность, с удерживанием антибиотической зоны свыше 40 дней инкубации, проявили
штаммы 12-2 Pseudomonas sp. и 14-3 Pseudomonas sp. (табл. 5).
Таблица 5 – Антагонистическая активность бактериальных штаммов рода
Pseudomonas, образующих стерильную зону, в отношении гриба
Fusarium sporotrichiella var. poae при температуре +10 ºС
Вариант
Sgc-1 Pseudomonas sp.
12-2 Pseudomonas sp.
Sgrc-1 P. fluorescens
14-3 Pseudomonas sp.
Oif 2-1 Pseudomonas sp.
Диаметр зоны ингибирования, мм
инкубация, сутки
5-е
20-е
40-е
48,0±1,4
11,5±0,7
0
51,0±0
18,0±7,0
14,5±3,5
54,5±0,7
23,0±2,8
0
50,0±0
18,0±0
10,5±2,1
52,5±2,1
16,0±2,8
0
Штаммы бактерий из рода Bacillus при низкой температуре антагонистической активности не проявили.
Выводы. В результате первичного скрининга штаммов грибов и бактерий антагонистов к возбудителю фузариоза сои F. sporotrichiella var. poae при двух температурных режимах +25,0 и +10,0 ºС наибольшую эффективность показали 12 штаммов антагонистов, среди которых 5 штаммов грибов: Tk-1
Trichoderma koningii, T-4 Trichoderma sp., Sm-1 Sordaria macrospora, A-1 Basidiomycetes, Хk-1 Chaetomium
olivacium, а также 7 штаммов бактерий: 12-2 Pseudomonas sp., 14-3 Pseudomonas sp., Sgrc-1 P. fluorescens,
Far 8 Bacillus sp., 11-1 Bacillus sp., Б-5 B. licheniformis, Б-12 B. licheniformis.
На последующих этапах работы предстоит продолжить исследования потенциальных биоагентов в
лабораторных и полевых условиях.
Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РФФИ № 09-08-00726-а.
Литература
1. Боронин, А. М. Ризосферные бактерии рода Pseudomonas, способствующие росту и развитию
растений / А.М. Боронин // Соросовский образовательный журнал. – 1998. – № 10. – С. 25-31.
2. Ван дер Планк, Я. Е. Устойчивость растений к болезням / Я. Е. Ван дер Планк. – М.: Колос, 1972.
– 255 с.
3. Егоров, Н. С. Выделение микробов-антагонистов и биологические методы учета их антибиотической активности / Н.С. Егоров. – М.: Изд-во Московского университета, 1957. – 79 с.
4. Huang, H.C. Penetration and infection of Sclerotinia sclerotiorum by Coniothyrium minitans / H. C.
Huang, J. A. Hoes // Canada J. Bot. – 1976. – V. 54. – P. 406-410.
5. Пестинская, Т. В. О взаимоотношениях грибов обитающих в почве / Т.В. Пестинская // Ботан.
журн. – 1958. – Т. 43, № 9. – С. 1270-1277.
6. Асатурова, А. М. Скрининг штаммов бактерий, проявляющих антагонизм к возбудителям фузариоза подсолнечника / А. М. Асатурова, Л. В. Маслиенко // Болезни и вредители масличных культур: Сб.
науч. работ / ВНИИ маслич. культур. – Краснодар, 2006. – С. 82-89.