Иммуногистохимический и морфометрический анализ содержания
advertisement
Иммунопатология, аллергология, инфектология Immunopathology, allergology, infectology 2012, №2:5154 ИММУНОДЕРМАТОЛОГИЯ Иммуногистохимический и морфометрический анализ содержания Толлподобных рецепторов 2 и 4, клеток Лангерганса и субпопуляций Тлимфоцитов в пораженной коже больных псориазом О.Р. Катунина, А.В. Резайкина ФГБУ «Государственный научный центр дерматовенерологии и косметологии» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации Immunohistochemical and morphometric analysis of the quantity of Tolllike receptors 2 and 4, Langerhans cells and Tlymphocyte subpopulations in psoriatic skin O.R. Katunina, A.V. Rezaykina MHSD Research center for dermatovenereology and cosmetology, Moscow, Russia Аннотация Summary Иммуноморфологическим методом установлено повы шение экспрессии толлподобных рецепторов TLR2 и TLR4 и содержания клеток Лангерганса в коже больных псориазом. Эти факты существенно расширяют представ ления о патогенезе псориаза и определяют новый вектор исследований, направленных на поиск этиологического фактора и оптимизацию существующих методов систем ной терапии псориаза. Increased expression of Tolllike receptors TLR2 and TLR4 and the content of Langerhans cells in the skin of patients with psoriasis were detected by immunomorphological method. These findings significantly expand the understanding of the pathogenesis of psoriasis and define a new vector research aimed at finding the etiological factors and optimization of existing methods for the systemic treatment of psoriasis. Ключевые слова Keywords Псориаз, иммуногистохимическое исследование, TLR2, TLR4, клетки Лангерганса. Psoriasis, immunohistochemistry, TLR2, TLR4, Langerghans cells Псориаз – эритемазносквамозный дер матоз мультифакторного генеза, характе ризующийся гиперпролиферацией эпидер мальных клеток, нарушением кератиниза ции и выраженной воспалительной реакци ей в дерме, изменениями в различных орга нах и системах [1]. В настоящее время общепризнанным поло жением является то, что возникновение воспа ления в коже у больных псориазом начинается с активации клеток кожи. Роль активирован ных клеток кожи заключается не только в ини циации «доиммунного» воспалительного про цесса в ответ на проникновение неизвестного антигена, но и в привлечении клеток иммунной системы. Иммунная система начинает участво вать в развитии воспалительного процесса на много позже (через 23 недели) после внедрения через кожу неизвестного патогена. За это время патогены (микроорганизмы, вирусы и т.д.) не «путешествуют» свободно по организму, так как структуры кератиноцитов распознают их первыми как «чужое» [2, 3]. В середине 90х го дов ХХ века C.A.Jr Janeway определил это «чу жое» как патоген ассоциированные молекуляр ные структуры (Pathogen associated molecular Иммунопатология, Аллергология, Инфектология 2012 N°2 51 О.Р. Катунина, А.В. Резайкина patterns (PAMPs)), отсутствующие у многокле точных микроорганизмов [4]. Распознавание PAMPs осуществляется с по мощью, так называемых, толл – подобных ре цепторов (TLRs) [5], присутствующих на по верхности кератинцоитв. Кроме кератиноци тов полным спектром TLRs обладают такие клетки дермы как макрофаги. Стимуляция TLRs способствует образованию временной сиг нальной многокомпонентной структуры, по буждающей геном клетки к выработке цитоки нов, молекул адгезии и костимулирующих мо лекул, регулирующих активацию адаптивного иммунитета [3,4]. В том случае, когда активированные клет ки кожи не могут самостоятельно уничто жить патоген и обеспечить прерывание «до иммунного» воспаления, в процесс включа ются клетки иммунной системы. Дендритные антигенпрезентирующие клетки (АПК), свя зывают АГ, обрабатывают его, подготавливая к презентации Тклеткам, и доставляют в регио нарный лимфатический узел [6]. Одной из раз новидностей АПК являются белые отросчатые эпидермоциты или клетки Лангерганса, отно сящиеся к типу незрелых дендритных клеток (immaturation dendritic cells). Таким образом, исследование экспрессии TLRs клетками кожи, количества клеток Лан герганса, иммунной системы (лимфоцитов) имеет важное значение для углубленного пони мания механизма развития иммунного воспа ления в коже у больных псориазом. Целью работы явилось изучение содержа ния, распределения в пораженной коже боль ных псориазом CD4+, CD8+лимфоцитов и экспрессии толлподобных рецепторов 2, 4, 9 (TLR2, TLR4, TLR9), клеток Лангерганса (CD1a) с оценкой их морфометрических параметров. Материалы и методы У 30 больных псориазом (12 женщин и 18 мужчин) в возрасте от 19 до 68 лет проведены иммуногистохимические исследования кожи. У больных наблюдался псориаз среднетяже лой и тяжелой степени (индекс PASI >10) c короткими периодами ремиссии, отмечались неудовлетворительные результаты от прово димой терапии. Контрольную группу составили 10 здоровых добровольцев, не имевших клинических при знаков заболеваний кожи. Биоптаты брали из центра очагов пораже ния под местной анестезией 2% раствором ли 52 докаина, подвергали стандартной гистологичес кой обработке, пропитывали парафином, зали вали в парафиновые блоки, из которых изго тавливали срезы толщиной 5 мкм, растягивали их на предметных стеклах. Для иммуногистохи мических исследований использовали предмет ные стекла с полилизиновым покрытием Vision biosystems plus slides (Великобритания). Изучение количества и распределения в структурах кожи CD4+ и CD8+ лимфоцитов, CD1a+ клеток Лангерганса, толлподобных ре цепторов 2, 4 и 9 классов (TLR2, TLR4 и TLR9) проводили непрямым иммунопероксидазным иммуногистохимическим методом. Использо вали мышиные моноклональные антитела против CD4, CD8, СD1a человека производ ства фирмы Vision biosystems novocastra (Ве ликобритания), кроличьи поликлональные антитела против TLR2, TLR4, TLR9 человека производства фирмы Abbiotec (США). Визу ализация реакции осуществлялась DABхро могеном. Постановку иммуногистохимичес кой реакции осуществляли согласно прото колам, прилагаемым к используемым антите лам. Полученные гистологические и иммуноги стохимические препараты заключали под по кровное стекло и изучали с помощью светово го микроскопа Leica DM4000В (Германия). Морфометрический анализ проводили с применением компьютерной программы ана лиза изображения ImageJ. Для этого в каж дом срезе цифровой фотокамерой с высоким разрешением Leica DFC320 (Германия) фото графировали по 5 полей зрения в эпидермисе на отрезке длиной 0,5мм, в дерме площадью 0,15мм 2, в которых проводили подсчет клеток с положительной реакцией, затем рассчиты вали среднее значение показателя. Экспрес сию толлподобных рецепторов определяли измерением площади эпидермиса и сосудов дермы с положительной реакцией клеток в квадратных микометрах (мкм 2). Содержание толлподобных рецепторов на стенках сосудов выражали в процентах по отношению к общей площади поля зрения. Статистическая обработка данных. Стати стический анализ проводили с применением па кета прикладных программ STATISTICA 8. Про верка на нормальность распределения осуще ствлялась с помощью критерия ШапироУилк са. Описательная статистика количественных признаков представлена в виде медиан, в скоб ках приведены границы интерквартильных от резков (в формате Ме [Q1÷Q3]). Оценка корре Immunopathology, Allergology, Infectology 2012 N°2 Иммунодерматология: Иммуногистохимический и морфометрический анализ содержания Толл/подобных рецепторов... ляционных связей осуществлялась с помощью коэффициента ранговой корреляции Спирме на. Различия считали статистически значимы ми при значении уровня достоверности ниже 0,05 (р < 0,05). Результаты и обсуждение У больных псориазом в очагах поражения выявлено достоверное увеличение площади эк спрессии TLR2 и TLR4 до 990,2 мкмІ [817,7÷1099,2] и 968,5мкмІ [750,5÷1093,6] соот ветственно. В дерме площадь сосудов с положи тельной экспрессией TLR2 и TLR4 была повы шена до 7,1% [5,3÷9,1] и 8,2% [5,7÷10,4] соот ветственно. Кроме того, экспрессия TLR2 и TLR4 обнаружена на клетках макрофагально го и гистиоцитарного ряда воспалительных инфильтратов, на эпителиоцитах потовых желез и наружного корневого влагалища во лосяных фолликулов. В биоптатах кожи, полученных от здоровых лиц, площадь экспрессии TLR2 в эпидермисе составила 213,2 мкмІ [191,3 ÷ 223,0], TLR 4 – 217,3мкмІ [191,5÷22,9]. В дерме у здоровых лиц экспрессия TLR2 и TLR4 отмечалась на эндоте лии кровеносных сосудов, клетках макрофа гального и гистиоцитарного ряда, располагаю щихся вокруг сосудов сосочкового слоя дермы, на эпителиоцитах потовых желез и наружного корневого влагалища волосяных фолликулов. Площадь сосудов с положительной экспрессией TLR2 и TLR4 у здоровых лиц составила 2,5% [1,9÷3,3] и 2,3% [1,9÷2,4] соответственно. Реакция с моноклональными антителами к TLR9 была отрицательной в эпидермисе и дерме, как у больных псориазом, так и у здоровых лиц. Количество клеток Лангерганса у больных псориазом было статистически достоверно выше по сравнению с показателями здоровых лиц, как в эпидермисе, так и в дерме, и состави ло 30,2 [25,6 ÷ 37,0]/0,5мм и 40,3 [27,2 ÷ 47,6]/ 0,15мм2 соответственно. Таким образом, установлено статистичес ки значимое повышение экспрессии TLR2, TLR4 и количества клеток Лангерганса в коже больных псориазом. Имеющиеся клиничес кие признаки воспаления (индекс PASI) под тверждают наличие активированного состоя ния клеток кожи у больных псориазом, обус ловленное, наряду с другими факторами, TLR2 и TLR4. Функции toll – рецепторов в эм бриогенезе и в стерильных условиях неизвес тны. Можно полагать, что увеличение эксп рессии TLR2 и TLR4 компонентами кожи свя зано с проникновением патогена. Следова тельно, инициация «доиммунного» воспа ления в коже у больных с участием активи рованных кератиноцитов, макрофагов, эн дотелиоцитов вполне могла быть опосредо вана TLR2 и TLR4. Исследование клеток иммунной систе мы, в частности, CD4+ и CD8+ лимфоци тов показало, что у больных псориазом они обнаруживались между кератиноцитами на разных уровнях эпителиального пласта, их количество составило 1,6 [1,2 ÷ 2,0]/0,5мм и 22,8 [18,0 ÷ 30,6]/0,5мм соответственно. В дерме CD4+ и CD8+ лимфоциты определя лись преимущественно в составе периваску лярных инфильтратов в количестве 52,2 [35,4 ÷61,0]/0,5мм 2 и 42,9 [33,6÷ 57,2]/0,15мм 2 соответственно. В биоптатах кожи, полученных от здоро вых лиц, CD4+ и CD8+ лимфоциты отсут ствовали в эпидермисе, и в небольшом коли честве обнаруживались вокруг сосудов сосоч кового слоя дермы, где их количество соста вило 11,0 [10,4÷11,4]/0,15мм2 и 8,9 [7,2÷ 9,4]/ 0,15мм2 соответственно. При корреляционном анализе установлена прямая связь между повышенным уровнем CD4+ и СD8+ лимфоцитов в эпидермисе (r= 0,46; р<0,05). Повышение уровня CD4+ Т лимфоцитов в дерме было связано с повыше нием CD8+ Т лимфоцитов (r = 0,72; р< 0,05) и CD1a+ клеток Лангерганса в эпидермисе (r = 0,43; р< 0,05) и дерме (r = 0,51; р< 0,05) . По вышение уровня CD8+ лимфоцитов в эпидер мисе коррелировало с содержанием CD8+ лимфоцитов в дерме (r = 0,48; р< 0,05). Уве личение содержания CD8+ лимфоцитов в дерме было связано с увеличением CD1a+ кле ток Лангерганса (r = 0,56; р< 0,05) в дерме. Таким образом, у больных псориазом уста новлено статистически значимое повышение количества CD4+ и CD8+ лимфоцитов в коже. При этом в эпидермисе лимфоциты были пред ставлены преимущественно CD8+ клетками, в дерме CD4+ CD8+ лимфоцитами. Полученные результаты по определению морфометрических параметров различных компонентов кожи, иммунной системы (лим фоцитов) и корреляционных связей позволяют заключить, что развитие патологического про цесса в коже с участием иммунной системы у больных псориазом инициируют активирован ные компоненты кожи путем увеличения эксп Иммунопатология, Аллергология, Инфектология 2012 N°2 53
