Липидная стратегия повышения биодоступности нуклеозидных

Липидная стратегия повышения биодоступности нуклеозидных
ингибиторов обратной транскриптазы ВИЧ
Студент 6 курса Виноградова Д.В., доцент, к.х.н. Шастина Н.С.
Московский государственный университет тонких химических
технологий им. М.В. Ломоносова
В последнее время огромное внимание уделяется поиску новых лекарственных
средств против вирусных и раковых заболеваний. С каждым днем количество больных
людей увеличивается и появляются новые вирусы. Особое внимание уделяется ВИЧинфекции, за необычайно короткое время она стала проблемой номер один для
Всемирной организации здравоохранения. Как выяснилось, данный вирус, являющийся
причиной СПИДа, поражает клетки иммунной системы человека, делая их неспособными
защищать организм от заболеваний. Большинство разрешенных к применению лекарств
против СПИДа блокируют цикл размножения ВИЧ, действуя либо на обратную
транскриптазу, либо на вирусную протеазу. Огромную роль в решении этой проблемы
играют препараты нуклеозидной природы. Они похожи на природные нуклеозиды,
поэтому обратная транскриптаза пытается использовать их при синтезе вирусной ДНК,
что приводит к ошибкам в ее работе и остановке роста цепи ДНК. Но наряду с высокой
эффективностью нуклеозидных препаратов имеются недостатки: низкая биодоступность,
слабая мембранотропность, токсичность и формирование резистентных вирусных
штаммов.
Для преодоления перечисленных выше недостатков в качестве терапевтических
агентов разрабатывают пролекарственные соединения на основе нуклеозидов. Данный
подход
является
перспективным
способом
повышения
анти-ВИЧ-активности
используемых в медицинской практике нуклеозидов, уменьшения их цитотоксичности,
улучшения проникновения в клетку и предотвращения формирования резистентности
вируса к таким препаратам.
Ингибиторы обратной транскриптазы ВИЧ
Репликация
ВИЧ
в
инфицированных
клетках
осуществляется
обратной
транскриптазой (ОТ), причем РНК- и ДНК-зависимая ДНК-полимераза кодируется
вирусным поли-геном [1]. ОТ синтезирует двухцепочечную ДНК из вирусного (+) РНКгенома. ОТ ВИЧ отличается от клеточных ДНК-полимераз в двух отношениях. Вопервых, ОТ ВИЧ использует многие модифицированные дезоксинуклеозидтрифосфаты
(dNTPs). Во-вторых, ОТ ВИЧ не хватает формальной «проверочно-считывающей»
активности (т.е. механизма выявления и вырезания ошибочно встроенных нуклеотидов).
Эти характеристики важны с фармацевтической точки зрения и оценки использования
ингибиторов на основе нуклеозидных аналогов как антиретровирусных препаратов. Таким
образом, ОТ – основная мишень для препаратов, действующих как ингибиторы
репликации ретровируса. Нуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы (NRTIs) в
настоящее время исследуются и используются in vitro, в клинических испытаниях и в
терапии. Зидовудин (AZT), ставудин (d4T), зальцитабин (ddC), диданозин (ddI),
ламивудин (3TC), абакавир и тенофовир (РМРА) используются в терапии.
После фосфорилирования клеточными киназами данные соединения включаются в
синтезируемую цепь вирусной ДНК с помощью обратной транскриптазы [2]. Поскольку
они не имеют гидроксильную группу в 3’-положении, никакие дополнительные
нуклеозиды/ нуклеотиды не могут быть присоединены к ним, и синтез вирусной ДНК
прекращается. Но во время антиретровирусной терапии появление лекарственной
устойчивости вирусов ограничивает эффективность нуклеозидных лекарств [1]. Это
ограничение представляет собой главную причину неспособности контролировать ВИЧинфекцию.
Наиболее
распространенные
терапевтические
стратегии
против
вирусной
инфекции были основаны на применении аналогов нуклеозидов как отдельно, так и
вместе с другими противовирусными агентами [3]. Один раз фосфорилированные до 5’трифосфатной
формы,
нуклеотидные
аналоги
являются
сильнодействующими
специфическими ингибиторами вирусных ферментов, необходимых для вирусной
репликации. Кроме того, на клеточном уровне, основные проблемы, связанные с
использованием
таких
препаратов,
представлены
как
их
ограниченным
фосфорилированием в некоторых клетках (например, антиретровирусные препараты в
макрофагах), так и токсическими побочными эффектами соответствующих трифосфатов.
По этой причине, образование этих молекул должно быть ограничено низкими
концентрациями с тем, чтобы селективно ингибировать вирусные ферменты. Таким
образом, требуются альтернативные стратегии, которые уменьшают токсичность
препарата,
повышают
противовирусную
эффективность
и
улучшают
фармакокинетические свойства этих препаратов, позволяющие пролонгировать интервалы
применения.
Чтобы преодолеть слабое клеточное проникновение нуклеозид-5’-фосфатов,
необходимо приготовить защищенные фосфоэфиры нуклеозида, который сможет
преодолеть клеточную стенку, а затем подвергнуться метаболизму до простого
нуклеотида [4]. Для этого используются различные подходы, цель которых –
способствовать
пассивной
диффузии
через
клеточные
мембраны
и
увеличить
биодоступность фосфорилированных нуклеозидов. В идеале, попытки должны быть
направлены
на
достижение
стабильности
во
внеклеточной
среде
и
быстрый
внутриклеточный гидролиз с высвобождением фосфата. В большинстве случаев, будучи
биологически активным, фосфат активируется до дифосфата и трифосфата.
Препараты на основе AZT
Наиболее хорошо изученным агентом является 3’-азидо-3’-дезокситимидин (AZT,
зидовудин),
который
был
первоначально
синтезирован
как
потенциальный
противоопухолевый агент, и утвержден FDA в качестве первого анти-ВИЧ препарата,
ингибирующего обратную транскриптазу вируса [5]. Анти-ВИЧ-активность этого
соединения обусловлена его способностью внутриклеточно конвертироваться в AZT-5’трифосфат, который терминирует синтез вирусной ДНК. На сегодняшний день AZT
остается важным компонентом высокоактивной антиретровирусной терапии и широко
используется в медицине. Однако, эффективность AZT-терапии страдает от некоторых
клинических ограничений. Во-первых, AZT имеет короткий период полугидролиза в
плазме крови (0.5-3 ч) и требует многочисленных (т.е. 2-3 раза в день) приемов препарата.
Во-вторых, значительно увеличивающаяся от доз токсичность, связанная с применением
AZT, приводит к анемии и лейкопении. Кроме того, применение AZT также может
вызвать появление лекарственно-устойчивых штаммов из-за длительного подавления
репликации
вируса,
что
приводит
к
уменьшению
эффективности
лечения.
Пролонгирование действия AZT с использованием стратегии получения полимерного
пролекарства AZT (конъюгата полимер-AZT) потенциально может продлить период
полугидролиза
и
уменьшить
высокую
дозу.
Полимеры
являются
инертными
макромолекулами, ковалентно связанными с AZT для изменения его фармокинетических
и фармакодинамических свойств. Как фармакологически неактивное производное,
пролекарство требует химического и/или ферментативного преобразования внутри
клетки-мишени, чтобы высвободить исходный активный препарат.
Механизм действия препаратов нуклеозидной природы
Нуклеозиды и нуклеотиды продемонстрировали широкое применение в качестве
противовирусных и противораковых препаратов [4, 6, 7]. Природные эндогенные
нуклеозиды должны фосфорилироваться до соответствующих 5’-трифосфатов, которые
будут включены в ДНК, синтезирующуюся в клетках. Первый шаг фосфорилирования,
ведущий к образованию 5’-монофосфата, обычно катализируется нуклеозидкиназами,
кодируемыми клеткой-хозяином или вирусом, заражающим клетку-хозяина (рис. 1).
Преобразование нуклеозидмонофосфатов в 5’-ди- и трифосфаты проводится с
помощью нуклеотид- и нуклеозиддифосфокиназ соответственно. Таким образом,
клеточные киназы и вирусно-кодируемые киназы играют важную роль в метаболизме
компонентов нуклеиновых кислот и репликации клеток и вирусов. На основе
метаболитного или антиметаболитного подхода в качестве конкурентов природных 2’дезоксинуклеозид-5’-трифосфатов были разработаны аналоги нуклеозидов, такие как
2’,3’-дидезоксинуклеозиды
(ddNs).
В
силу
своего
сходства
с
природными
2’-
дезоксинуклеозидами ddNs фосфорилируются до соответствующих 5’-трифосфатов и
включаются в растущую цепь ДНК посредством ДНК-полимеразы, приводя к обрыву
цепи. Таким образом, ddNs есть в сущности пролекарства, так как они должны быть
фосфорилированы
внутриклеточно,
чтобы
быть
биологически
активными.
Терапия с участием долгосрочного применения ddNs, таких как 3’-азидо-3’дезокситимидин (AZT), приводит к снижению активности первого фосфорилирующего
фермента, тимидинкиназы и, таким образом, к устойчивости вирусного штамма. Этот тип
устойчивости наблюдается не только в клетках-хозяина у пациентов, подвергшихся ddNтерапии, но и также в зараженных клетках. Данный устойчивый механизм делает ddNs
менее
эффективными,
так
как
их
активация
тормозится
на
этапе
первого
фосфорилирования. Кроме того, для противовирусных ациклических нуклеозидов, таких
как ацикловир и пенцикловир, влияние вируснокодируемой тимидинкиназы на активацию
нуклеозидов до трифосфатов ограничивает спектр активности этих препаратов такими
вирусами, как вирус простого герпеса и вирус ветряной оспы. Таким образом, вирусы,
которые не кодируют свои нуклеозидкиназы, как например гепатит B, не попадают в
сферу деятельности этих противовирусных нуклеозидов. Кроме того, такие ddNs, как
AZT, имеют побочные эффекты, например, анемию и нейропению. Как известно,
токсические эффекты приводят к прекращению ddN-терапии. Некоторые другие ddNs,
такие
как
2’,3’-дидезоксиуридин,
являются
неподходящими
субстратами
для
тимидинкиназы или других клеточных киназ, и, следовательно, не превращаются в
соответствующие трифосфаты.
Разработка липофильных производных противовирусных препаратов
Нуклеозидные
анти-ВИЧ-препараты
составляют
основу
высокоактивной
антиретровирусной терапии, препятствуют работе обратной транскриптазы вируса,
конкурируя с природными субстратами и терминируя растущую цепь вирусной ДНК [8].
Однако применяемые в терапии вирусных заболеваний нуклеозидные препараты наряду с
высокой эффективностью действия имеют существенные недостатки, связанные с их
низкой биодоступностью, слабой способностью к трансмембранному транспорту,
необходимостью использования высоких доз этих лекарственных соединений, что
сказывается на проявлении ими токсических свойств, формировании резистентных
вирусных штаммов.
Эти недостатки стимулируют поиск и изучение различных подходов к структурной
модификации данных химиотерапевтических агентов. Одним из путей является создание
конъюгатов
анти-ВИЧ-нуклеозидов
с
веществами
липидной
природы:
жирными
по
являются
кислотами, диглицеридами и фосфолипидами.
Такие
липофильные
пролекарственные
соединения
сами
себе
фармакологически неактивными, в организме же они подвергаются ферментативному
гидролизу, приводящему к высвобождению фармакологически активного соединения –
противовирусного нуклеозида. Данный подход, во-первых, позволяет значительно
улучшить биотранспортные характеристики лекарственных средств за счет придания им
гидрофобных свойств (рис. 2). Во-вторых, дает возможность нацеливания анти-ВИЧнуклеозидов на лимфатическую систему (увеличение их лимфотропности), что
обусловлено путями метаболизма соединений липидной природы в организме человека,
при этом лимфатический транспорт позволяет избежать первичного метаболизма этих
соединений в печени, таким образом повышая их биодоступность. Кроме того, он
обеспечивает направленное воздействие модифицированных препаратов на вирусы, так
как последние локализуются и распределяются в организме главным образом в
лимфатической системе.
Пролекарственные соединения на основе жирных кислот
Для создания пролекарственных
соединений на основе жирных кислот
используется два подхода (рис. 3). При
использовании
первого
подхода
фармакологически активное вещество
присоединяют к гидрофобной матрице
через
сложноэфирную
(соединение
1).
связь
Липофильность
препарата в этом случае увеличивается,
однако отсутствие свободной карбоксильной группы препятствует связыванию таких
соединений с альбумином, осуществляющим транспорт жирных кислот в крови.
Пролекарственные соединения, в которых
фармакологически активная молекула
находится в ω-положении модифицированной жирной кислоты (соединение 2), могут
связываться с альбумином сыворотки крови и в виде комплекса попадать в гепатоциты.
Таким образом, появляется возможность доставки лекарственных препаратов в клетки
печени.
Пролекарственные соединения на основе фосфолипидов
В большинстве случаев фармакологически активное вещество связывают с фосфатной
группой фосфолипида, получая конъюгаты 3, однако в последнее время создаются
пролекарственные соединения 4, в которых молекула лекарственного препарата замещает
собой жирнокислотную цепь (рис. 4). Данный пролекарственный подход широко
применяется для создания конъюгатов фармакологически активных нуклеозидов.
Последние
подвергаются
в
организме
фосфорилированию
до
трифосфатов,
а
использование фосфолипидов в качестве переносчиков позволяет ускорить процесс
фосфорилирования за счет того, что первая фосфатная группа уже имеется в молекуле
пролекарственного
Осуществлен
соединения.
также
синтез
липонуклеотидов, в которых аналоги
нуклеозидов присоединены к ди- и
триацилглицерофосфатам,
увеличивает
что
терапевтическое
воздействие лекарства на организм.
Фосфолипидный
применен
к
подход
нуклеозидным
был
агентам,
которые связывали с моно-, ди- или
трифосфодиацилглицеринами (рис.5) [9,
10].
Большинство
нуклеозидов,
модифицированных
таким
образом,
обладали
противовирусной или противоопухлевой активностью, но имели слабую абсорбцию и
плохие фармакокинетические свойства.
Среди них можно отметить 5-фторуридин, 1-β-D-арабинофуранозилцитозин (AraC), 1-β-D-арабинофуранозилурацил, непланоцин A, 3’-азидо-3’-дезокситимидин (AZT),
2’,3’-дидезоксицитидин и 3’-дезокситимидин.
Пролекарственные соединения на основе диглицеридов
Важную роль играют пролекарственные соединения на основе диглицеридов.
Панкреатические липазы тонкого кишечника, осуществляющие гидролиз сложноэфирных
связей в молекулах триглицеридов, в первую очередь гидролизуют связи в положениях 1
и 3 глицеринового остова (рис.6), во 2-ом положении этот процесс идет с очень
незначительной скоростью. Для того чтобы высвобождение лекарственного средства не
происходило в просвете кишечника, при создании липофильных пролекарственных
соединений фармакологически активные вещества вводятся во 2-ое положение
глицеринового остова.
Рис.7. Сравнение путей метаболизма природных триглицеридов, а также конъюгатов
диглицеридов с лекарственными соединениями во 2 и 1 положении глицеринового остова.
Данный подход, основанный на увеличении липофильности фармакологически
активных соединений посредством их конъюгирования с липидами, содержащими остатки
длинноцепных жирных кислот, позволяет нацелить лекарственные средства на
лимфатическую систему и, как следствие, на вирусы и опухоли, которые часто
локализуются в ней, что особенно актуально для анти-ВИЧ-препаратов, а также на В- и Тлимфоциты, что важно при использовании иммуномодулирующих средств. Кроме того,
данная стратегия позволяет избежать первичного метаболизма лекарственных препаратов
в печени и, следовательно, добиться увеличения их биодоступности.
Гидролиз триглицеридов под действием липазы до моноглицеридов и свободных
жирных кислот с последующей абсорбцией представлен на рис. 7 [9]. Панкреатическая
липаза – наиболее важный фермент, действующий на триглицериды.
Пронуклеотидные производные ингибиторов вирусных полимераз
Несмотря на то, что H-фосфонаты нуклеозидов давно используются в качестве
синтетических интермедиатов для получения олигонуклеотидов, их потенциал в качестве
пронуклеотидов после внутриклеточного окисления был оценен намного позже (рис. 8)
[6]. Внутриклеточное фосфорилирование нескольких клеточных компонентов является
ключевым процессом в жизненном цикле клетки, катализируемым различными
ферментами, такими как нуклеозид- и нуклеотидкиназы, протеинкиназы и т.д. [11].
Фосфорилирование белков, в частности, в настоящее время широко признано как
наиболее
важный
путь
для
регулирования функций белков в
эукариотических
клетках,
связанный с переходом клеточной
активности от одной стадии к
другой
и,
регулирующий
клеточную
таким
образом,
экспрессию
пролиферацию
дифференцировку.
Оно
гена,
и
является
основным механизмом, посредством которого клетки отвечают на внеклеточные сигналы,
такие как гормоны и факторы роста, в данном случае контролируются все события в
различных стадиях клеточного цикла. Внутриклеточное фосфорилирование также
регулируется с помощью дефосфорилирования под действием многочисленных фосфатаз,
некоторые из них очень специфичны.
Многие лекарства, такие как AZT или гуаниновые аналоги ацикловира,
используемые против вирусных инфекций, являются молекулами-предшественниками
(пролекарствами), которые должны метаболизироваться в активную форму под действием
клеточных или вирусных ферментов [12]. Их эффективность может быть ограничена
недостаточной концентрацией активной формы из-за внутриклеточного метаболизма.
Генный перенос может помочь улучшить как эффективность, так и селективность этих
препаратов с помощью специфического введения и экспресии гена в клетке-мишени.
AZT – важное противовирусное пролекарство, используемое при лечении ВИЧ.
Противовирусная активность AZT обеспечена трифосфатом AZT (AZTTP), который
действует как терминатор цепи во время обратной транскрипции вирусной РНК. После
проникновения
нуклеозидного
аналога
AZT
в
клетку,
клеточные
ферменты
фосфорилируют AZT до его трифосфата постадийно. Первый фермент на этом пути –
клеточная тимидинкиназа (ТК), которая использует АТФ для катализа фосфорилирования
AZT до его 5’-мнофосфата (AZTMP). Второй фермент – тимидилаткиназа (TMPK),
которая
преобразует
AZTMP
до
дифосфата
AZT
(AZTDP),
субстрат
для
нуклеозиддифосфокиназы, который, как полагается, катализирует фосфорилирование
AZTDP до AZTTP. Пролекарство AZT легко преобразуется в AZTMP, который затем
накапливается в клетке, что приводит к низкой внутриклеточной концентрации AZTDP и
AZTTP (рис.9).
Создание
пролекарственных
соединений
нуклеозидных
препаратов,
способствующих доставке в клетку-мишень моно-, ди- или трифосфатной формы
нуклеозида, позволяет разрабатывать стратегии увеличения их быстродействия, что ведет
к снижению применяемой дозы, а следовательно, побочных эффектов на организм. Таким
образом, большой арсенал модифицирующих веществ липидной природы, а также
получение пронуклеотидных производных ингибиторов обратной транскриптазы ВИЧ
служат основой поиска препаратов с наибольшей эффективностью терапевтического
действия.
Список литературы
1. Selmi B., Deval J., Boretto J., Canard B. Nucleotide analogue binding, catalysis and
primer unblocking in the mechanisms of HIV-1 reverse transcriptase-mediated resistance
to nucleoside analogues// Int. Med. Press. 2003. № 8. P. 143-154.
2. Munjal Y.P. Emerging HIV Drug. Resistance - How to Beat It?// Postgraduate Med. 2007.
V.21. C.31.
3. Rossi L., Serafini S., Franchetti P. Targeting nucleotide dimers containing antiviral
nucleosides// Curr. Med. Chem. 2005. № 4. P. 37-54.
4. Wagner C.R., Iyer V.V., McIntee E.J. Pronucleotides: toward the in vivo delivery of
antiviral and anticancer nucleotides// Inc. Med. Res. Rev. 2000. V. 20. № 6. P. 417-451.
5. Li W., Chang Y., Zhan P., Zhang N., Liu X., Pannecouque C., De Clercq E. Synthesis, in
vitro and in vivo release kinetics, and anti-HIV activity of a sustained-release prodrug
(mPEG-AZT) of 3’-azido-3’-deoxythymidine (AZT, Zidovudine)// Chem.Med.Chem.
2010. № 5. P. 1893 – 1898.
6. Balzarini J., Haller-Meier F., De Clercq E., Meier C. Antiviral activity of cyclosaligenyl
prodrugs of acyclovir, carbovir and abacavir// Antivir. Chem. Chemother. 2001. № 12. P.
301–306.
7. Chiacchio U., Corsaro A., Iannazzo D., Piperno A., Pistarà V., Procopio A., Rescifina A.,
Romeo G., Romeo R., Siciliano M.C.R., Valveric E. Enantioselective synthesis of
isoxazolidinyl nucleosides containing uracil, 5-fluorouracil, thymine and cytosine as new
potential anti-HIV drugs// ARKIVOC. 2002. № 11. P. 159-167.
8. Шастина Н.С, Баранова Е.О., Дьякова Л.Н., Лоншаков Д.В., Швец В.И. Липидная
стратегия повышения биодоступности нуклеозидных ингибиторов обратной
транскриптазы ВИЧ // Вестник МИТХТ. 2011. Т. 6. № 2. С. 71-80.
9. Lambert D.M. Rationale and applications of lipids as prodrug carriers// Eur. J. .Pharm.Sci.
2000. V.11. № 2. P. 15-27.
10. Meier C., Jessen H.J., Balzarini J. Nucleoside diphosphate prodrugs// Nucleic. Acids.
Symp. Ser. 2008. № 52. P. 83–84.
11. Cieoelak J., Sobkowski M., Jankowska J. Nucleoside phosphate analogues of biological
interest, and their synthesis via aryl nucleoside H-phosphonates as intermediates// Acta
Biochim. Pol. 2001. V. 48. № 2. P. 429-442.
12. Wohrl B.M., Loubiere L. Expressing engineered thymidylate kinase variants in human
cells to improve AZT phosphorylation and human immunodeficiency virus inhibition// J.
Gen. Virol. 2005. № 86. P. 757-764.