Бантыш Ольга Борисовна Биосинтез пептид-нуклеотидного антибиотика микроцина С и его гомологов
реклама
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии гена Российской академии наук на правах рукописи Бантыш Ольга Борисовна Биосинтез пептид-нуклеотидного антибиотика микроцина С и его гомологов Специальность 03.01.03 молекулярная биология Диссертация на соискание учѐной степени кандидата биологических наук Научный руководитель: д.б.н. Северинов К.В. Москва - 2014 2 Оглавление Оглавление ....................................................................................................................... 2 Список сокращений и условных обозначений .......................................................... 5 Общая характеристика работы .................................................................................... 7 Актуальность темы исследования ........................................................................................................ 7 Цели и задачи исследования ................................................................................................................. 8 Научная новизна и практическая значимость работы ........................................................................ 9 Положения, выносимые на защиту .................................................................................................... 10 Степень достоверности и апробация результатов ............................................................................ 10 Личное участие автора в проведении исследований ........................................................................ 11 Обзор литературы ......................................................................................................... 12 Бактериоцины ....................................................................................................................................... 12 Микроцины ........................................................................................................................................... 13 Микроцины класса 1 ............................................................................................................................ 16 Микроцин B17 .............................................................................................................................. 16 Микроцин J25 ............................................................................................................................... 17 Микроцин С7-C51 ........................................................................................................................ 19 Микроцин С - пептид-нуклеотидный антибиотик ............................................................................ 21 История открытия микроцинов................................................................................................... 21 Расшифровка структуры микроцина С....................................................................................... 22 Гены синтеза микроцина С .......................................................................................................... 23 Роль белков микроцинового кластера ........................................................................................ 27 Возможные гомологи генов микроцинового кластера ............................................................. 28 Регуляция генов микроцинового кластера ................................................................................. 30 Механизм действия микроцина С ............................................................................................... 33 Антибактериальная активность микроцина С и его аналогов ................................................. 34 Белок MccB ........................................................................................................................................... 39 Ферментативная функция белка МссВ....................................................................................... 39 Структура белка МссВ ................................................................................................................. 42 Положение пептидного субстрата в активном центре пептид-связывающего домена ......... 45 Структура аденилирующего активного центра ......................................................................... 46 Уникальные черты активного центра белка МссВ.................................................................... 48 Конформационная подвижность активных центров ................................................................. 48 3 E1-суперсемейство ............................................................................................................................... 51 Филогенетическиое древо белков Е1-суперсемейства ............................................................. 51 Характерные структурные элементы белков Е1-суперсемейства ........................................... 53 Структурные особенности белков Е1-суперсемейства ............................................................. 54 Сравнительный структурный анализ некоторых представителей прокариотических белков E1суперсемейства ..................................................................................................................................... 58 Биологическая роль белков ThiF и MoeB .................................................................................. 58 Сравнительный структурно-функциональный анализ белков Е1-суперсемейства MccB, MoeB, ThiF .................................................................................................................................... 62 Материалы и методы .................................................................................................... 70 Бактериальные штаммы ...................................................................................................................... 70 Геномная и плазмидная ДНК .............................................................................................................. 70 Питательные среды .............................................................................................................................. 70 Отбор бактериальных колоний и их проверка на устойчивость к антибиотикам ......................... 71 Метод ПЦР............................................................................................................................................ 71 Праймеры для ПЦР .............................................................................................................................. 72 Праймеры для мутагенеза по методу Даценко-Уорнера .................................................................. 73 Электрофорез в агарозном геле .......................................................................................................... 73 Извлечение фрагментов ДНК из агарозного геля ............................................................................. 73 Расщепление ДНК рестриктазами ...................................................................................................... 74 Лигирование фрагментов ДНК ........................................................................................................... 74 Клонирование фрагментов ДНК ......................................................................................................... 74 Мутагенез по методу Даценко-Уорнера ............................................................................................ 76 Приготовление химически компетентных клеток E. coli ................................................................. 76 Трансформация компетентных клеток E. coli ................................................................................... 77 Пептиды ................................................................................................................................................ 77 Получение и очистка рекомбинантных белков ................................................................................. 78 Электрофорез белков в полиакриламидном геле (ПААГ) ............................................................... 80 Аденилирование пептидов in vitro ..................................................................................................... 81 Масс-спектрометрический анализ (MALDI-MS и MS/MS) ............................................................. 81 Тесты на чувствительность к микроцину и его аналогам ................................................................ 81 Приготовление S30 клеточных экстрактов........................................................................................ 82 Реакция аминоацилирования тРНК .................................................................................................... 82 Процессинг пептидов МссА в S30 экстрактах .................................................................................. 83 Аминопропилирование аденилированного пептида MHRIMKD-АМФ L. johnsonii in vitro ........ 83 Введение радиоактивной метки in vitro ............................................................................................. 83 Проверка токсичности аденилированного белка in vivo .................................................................. 84 4 Определение продуктов реакции с помощью ВЭЖХ ....................................................................... 84 Биоинформатический анализ белковых последовательностей........................................................ 85 Результаты работы ........................................................................................................ 87 Часть 1. Изучение ортологов белка МссВ и микроцин С-подобных соединений, закодированных в mcc-подобных оперонах бактерий, отличных от Escherichia coli ................... 87 Анализ результатов биоинформатического поиска гомологов микроцинового оперона ..... 87 Энзиматический синтез аденилированных пептидов in vitro .................................................. 89 Биологическая активность аденилированных пептидов .......................................................... 95 Активность аденилированных пептидов in vitro ....................................................................... 98 Биологическая активность аминопропилированных микроцин С-подобных соединений . 101 Филогенетическое древо МссВ-подобных аденилат-трансфераз .......................................... 103 Анализ аминокислотных последовательностей ортологов МссВ ......................................... 106 Часть 2. Получение новых антибактериальных пептид-нуклеотидных соединений с измененной пептидной частью с помощью белка МссВ E. coli ......................................................................... 111 Поиск нового субстрата для белка MccB E. coli путем трехмерного моделирования ......... 111 Тестирование различных пептидных субстратов белка МссВ in vitro .................................. 116 Биологическая активность аденилированных пептидов ........................................................ 120 Сравнение антибактериальной активности некоторых аналогов микроцина С................... 122 In vitro аденилирование белка, содержащего на своем C-конце пептид MRTGNAN.......... 124 In vivo аденилирование белка, содержащего на своем C-конце пептид MRTGNAN .......... 126 Обсуждение полученных результатов ..................................................................... 129 Выводы .......................................................................................................................... 145 Список используемой литературы .......................................................................... 146 Приложение .................................................................................................................. 154 Благодарности .............................................................................................................. 159 5 Список сокращений и условных обозначений mQ - деионизованная вода; ед. ак. - единицы активности; ед.м. - единицы массы; п.о. - пары оснований; а.к. - аминокислота; а.о. - аминокислотный остаток; Да - Дальтон, единица измерения массы молекул; АТФ - аденозинтрифосфат; АМФ - аденозинмонофосфат; цАМФ - циклический аденозинмонофосфат; НТФ - нуклеотидтрифосфат; РНК - рибонуклеиновая кислота; мРНК - матричная РНК; тРНК - транспортная РНК; ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота; SAM - S-аденозин метионин; НАД(Ф) - никотинамиддинуклеотидфосфат; Ацетил-КоА - ацетил-кофермент А; ДТТ - дитиотреитол; ПААГ - полиакриламидный гель; 6 ИПТГ - изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид; ОРС - открытая рамка считывания; ПО - программное обеспечение; ВЭЖХ - высоко эффективная жидкостная хроматография; cpm - counts per minute, количество распадов в минуту; об./мин. - обороты в минуту; Mw - молекулярный вес; мин. - минута; с - секунда; тыс. - тысяча; см. ниже - смотри ниже; др. - другой; т.е. - то есть. 7 Общая характеристика работы Актуальность темы исследования По данным Всемирной организации здравоохранения, одной из серьезнейших проблем, стоящей перед человечеством, является развитие устойчивости бактериальных патогенов к антимикробным препаратам, широко применяющимся в медицинской практике. Поиск новых потенциальных антибиотиков, а также улучшение свойств уже известных антимикробных соединений - актуальная задача, стоящая перед учеными всего мира. Одним из перспективных направлений в этой области является изучение бактериоцинов и микроцинов - антимикробных соединений на основе пептидов, синтезируемых на рибосомах, и, в частности, микроцина С. Микроцин С - пептид-нуклеотидный антибиотик, продуцируемый кишечной палочкой и активный против близкородственных видов бактерий. За синтез микроцина С и устойчивость к этому антибиотику ответственны продукты шести генов. Пять из них mccABCDE организованы в оперон, транскрибируемый с общего промотора. Ген mccA кодирует гептапептид-предшественник микцроцина С (MRTGNAN). Продукты генов mccB, mccD и mccE обеспечивают созревание микроцина: внесение пост-трансляционных модификаций в пептид МссА. При этом белок МссВ является первым и наиболее важным участником этого процесса: в ходе двустадийной реакции он аденилирует пептид МссА по С-концевому остатку аспарагина. В результате образуется микроцин С с молекулярной массой 1092 Да (МсС1092), который способен ингибировать рост бактериальных клеток. Микроцин С - это антибиотик действующий по принципу Троянского коня: он проникает в клетки за счет облегченного транспорта, обеспечиваемого пептидной частью. В цитоплазме клетки пептидная часть микроцина С разрушается под действием пептидаз широкого спектра действия. В результате чего высвобождается токсин - аспартил-аденилат, который представляет собой аналог активированной аминокислоты. Этот токсин ингибирует аспартил-тРНК-синтетазу, тем самым блокируя один из самых важных клеточных процессов - синтез белка. 8 До сегодняшнего дня единственным известным организмом, способным продуцировать микроцин С, была кишечная палочка. О существовании других микроцин С-подобных соединений не было известно. В то же время потенциальные гомологи микроцинового оперона были предсказаны ранее в статье Северинова и соавторов [84]. Данная работа посвящена исследованию пептиднуклеотидного антибиотика микроцина С и его природных гомологов из различных бактериальных организмов, а также синтетических аналогов микроцина С, которые являются ингибиторами аспартил-тРНК-синтетазы. Аминоацил-тРНКсинтетазы - это перспективные мишени для новых антибактериальных препаратов, так как обеспечивают функционирование такого важного процесса, как синтез белка в клетке. В то же время новые микроцин С-подобные соединения, изученные в данной работе, за счет измененной пептидной части, обладают способностью проникать в бактериальные клетки посредством различных транспортных путей, что открывает перспективы использования таких пептид-нуклеотидов против различных патогенов. Цели и задачи исследования Целями данной работы было: 1) подтвердить существование ранее предсказанных аналогов микроцина С, закодированных в mcc-подобных оперонах бактерий, отличных от Escherichia coli, и продемонстрировать антибактериальную активность таких соединений, а также 2) установить принципиальную возможность использования микроцин С синтазы МссВ Escherichia coli для создания новых антибактериальных пептид-нуклеотидных соединений с измененной пептидной частью. Для достижения поставленных целей были сформулированы следующие задачи исследования: 1. Получить рекомбинантные белки - гомологи микроцин С синтазы МссВ Escherichia coli из организмов Bartonella washoensis, Helicobacter pylori, Lactobacillus johnsonii, Streptococcus thermophilus, Yersinia pseudotuberculosis и 9 Synechococcus sp. и продемонстрировать их аденилат-трансферазную активность в присутствии предсказанных пептидных субстратов. 2. Наработать пептид-нуклеотиды, отличные от микроцина С E. coli и продемонстрировать их антибактериальное действие на клетки E. coli. 3. Определить набор субстратов, которые способны аденилироваться белком МссВ E. coli in vitro и провести сравнительное исследование активности полученных пептид-аденилатов. Научная новизна и практическая значимость работы В данной работе впервые была экспериментально показана функциональная активность mcc-подобных оперонов из Bartonella washoensis, Helicobacter pylori, Lactobacillus johnsonii, Streptococcus thermophilus, Yersinia pseudotuberculosis и Synechococcus sp. Также впервые продемонстрирована антибактериальная активность пептид-нуклеотидных соединений, являющихся продуктами этих оперонов. На основании анализа фермент-субстратного комплекса белка МссВ E. coli с его природным пептидным субстратом МссА, впервые были получены синтетические варианты микроцина С E. coli. Некоторые из полученных синтетических аналогов обладали повышенной антибактериальной активностью. Также впервые был разработан и апробирован высокоэффективный способ внесения пост-трансляционной модификации (аденилирования) в белковые молекулы, содержащие на своем С-конце последовательность пептида МссА E. coli (MRTGNAN), с помощью белка MccB E. coli. Этот способ можно применять в лабораторной практике для внесения специфических меток (например, радиоактивных) в белковые молекулы, а полученные новые природные и синтетические антибактериальные соединения могут быть использованы для создания новых антибактериальных препаратов на их основе. 10 Положения, выносимые на защиту 1. Экспериментально подтверждены сделанные ранее биоинформатические предсказания о существовании пептид-нуклеотидных соединений, подобных микроцину С E. coli, и закодированных в геномах Bartonella washoensis, Helicobacter pylori, Lactobacillus johnsonii, Streptococcus thermophilus, Yersinia pseudotuberculosis и Synechococcus sp., а также показано, что такие гомологи микроцина С обладают антибактериальной активностью по отношению к клеткам E. coli и действуют по механизму, аналогичному описанному ранее для микроцина С E. coli. 2. Белок МссВ E. coli аденилирует пептидные субстраты на основе пептида МссА (MRTGNAN), с заменой N-концевого остатка метионина на аминокислоты с крупными гидрофобными боковыми радикалами, также как и пептидные субстраты на основе пептида МссА (MRTGNAN), с дополнительными аминокислотами на N-конце. Удлинение пептидного субстрата до определенного предела стимулирует эффективность узнавания ферментом МссВ и антибактериальные свойства получаемых аналогов микроцина С. 3. МссВ E. coli можно использовать для концевого аденилирования белков, несущих на своѐм С-конце последовательность MRTGNAN, in vitro и in vivo. Степень достоверности и апробация результатов По результатам диссертационной работы было опубликовано 7 печатных работ, в том числе 2 статьи в международных рецензируемых журналах и 5 тезисов конференций. Результаты работы были представлены на следующих конференциях: 1) "X чтения памяти академика Юрия Анатольевича Овчинникова", 14-17 ноября, 2011, Москва, Россия; 2) "XXIV Зимняя молодежная научная школа 11 "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии", 7-9 февраля, 2012, Москва, Россия; 3) "Молекулярная и клеточная биология: прикладные аспекты", 13 апреля, 2012, Москва, Россия; 4) 22nd IUMBB & 37th FEBS Congress, 4-9 September, 2012, Seville, Spain; 5) "IX молодежная школаконференция с международным участием "Актуальные аспекты современной микробиологии", 21-23 октября, 2013, Москва, Россия. Личное участие автора в проведении исследований Автором самостоятельно выполнен основной объем исследований. Показана энзиматическая активность ортологов МссВ и антибактериальная активность полученных пептид-аденилатов, проведен анализ фермент-субстратного комплекса белка МссВ-МссА E. coli, получены синтетические аналоги микроцина С, продемонстрирована их антибактериальная активность, а также разработан система внесения пост-трансляционной модификации in vitro и in vivo в С-конец белковой молекулы. Масс-спектрометрический анализ образцов, подготовленных автором, был проведен непосредственное Серебряковой участие в Мариной Васильевной. разработке и Автор обсуждении принимал концепции биоинформатического поиска для построения филогенетического древа белков семейства MccB/PaaA, само филогенетическое древо было построено Макаровой Кирой. Автором был проведен анализ и обработка полученных результатов, подготовлен материал для публикации в научных журналах. 12 Обзор литературы Бактериоцины В составе природных сообществ в условиях жесткой конкуренции за природные ресурсы и свободное пространство совместно сосуществуют множество микроорганизмов. В условиях голодания и стресса некоторые штаммы бактерий и архей переключают свой метаболизм на продукцию целого арсенала токсических пептидов и белков. Такие соединения дают конкурентное преимущество штаммампродуцентам над другими близкородственными видами, занимающими сходную экологическую нишу [75]. Антимикробные белки и пептиды, продуцируемые на рибосомах бактериальными клетками, были названы бактериоцинами. В наши дни бактерии, синтезирующие бактериоцины, используются человеком в качестве пробиотиков. На бактериоцины возлагаются большие надежды, как на потенциальный источник новых антибиотиков для медицины. Характерным отличием бактериоцинов от других антибиотиков является специфичность их действия: обычно, бактериоцины проявляют активность против узкого круга организмов, как правило, в пределах того же вида или рода, что и организм-продуцент, тогда как классические антибиотики обладают достаточно широким спектром действия [22]. Классификация бактериоцинов достаточно сложна. Это, в первую очередь, связано с тем, что под термином "бактериоцины" скрывается большой и крайне разнообразный класс пептидных соединений с различной химической структурой и механизмом действия. Следует отметить, что, зачастую, один вид бактерий может продуцировать сразу несколько типов антибактериальных соединений. В связи с этим, имеет смысл разделить бактериоцины по происхождению, на бактериоцины Грамм-положительных и Грамм-отрицательных бактерий. Бактериоцины Грамм-положительных бактерий принято делить на 2 класса: лантибиотики (класс 1) и нелантибиотики (класс 2). Лантибиотики представляют собой маленькие пептиды длиной 19-38 а.к. с характерными пост- 13 трансляционными модификациями, такими как аминокислоты с циклической структурой, содержащие тиоэфирные связи (известные как лантионин или βметиллантионин), или D-аланин. Так как лантибиотики отличаются большим разнообразием пост-трансляционных модификаций, внутри этого класса выделяют еще дополнительно 11 подклассов. В качестве примера лантибиотиков можно привести хорошо изученный низин, а также субтилин, лактицин 3147 и другие [35]. К бактериоцинам Грамм-положительных бактерий класса 2 относятся короткие положительно заряженные термостабильные пептиды (длинной от 25 до 60 а.к.), не несущие пост-трансляционных модификаций. Бактериоцины этой группы продуцируются в основном молочно-кислыми бактериями. Бактериоцины класса 2 подразделяются на четыре подкласса. Из-за огромного разнообразия этих соединений классификация антимикробных пептидов Грамм-положительных бактерий меняется от автора к автору, в зависимости от выбранного критерия, положенного в основу классификации [35]. Большинство известных бактериоцинов Грамм-отрицательных бактерий продуцируются кишечной палочкой или другими энтеробактериями. Традиционно их делят на две группы в зависимости от их молекулярного веса: микроцины (сравнительно маленькие пептиды) и колицины (относительно крупные полипептиды). В свою очередь микроцины подразделяются на две подгруппы: микроцины класса 1 представлены пептидами с молекулярным весом менее 5 кДа и значительными пост-трансляционными модификациями. К этому классу, например, относятся микроцин С, микроцин В и микроцин J. К микроцинам класса 2 относятся пептиды с молекулярными весом от 5 до 20 кДа с незначительными пост-трансляционными модификациями или без них. Последний класс включает в себя микроцин Е, колицин V и Н47 [35]. Микроцины Микроцины - это пептиды, обладающие антибактериальным действием, которые синтезируются в ходе трансляции на рибосомах, и, в некоторых случаях, несут пост-трансляционные модификации. Микроцины - это очень гетерологичная 14 группа антимикробных пептидов. На сегодняшний день описано четырнадцать типов микроцинов, но только восемь из них были выделены, и их структуры были охарактеризованы. Гены синтеза микроцинов класса 1 (класс низкомолекулярных микроцинов) расположены на плазмидах. Зрелые микроцины этого класса со всеми модификациями имеют молекулярную массу менее 5 кДа. Представителями этого класса являются микроцин В17, микроцин С (С7-С51) и микроцин J25. Высокомолекулярные микроцины класса 2 имеют молекулярный вес от 5 до 10 кДа. Эти соединения можно разделить на два подкласса. Гены синтеза микроцинов класса 2а расположены на плазмидах, зрелые микроцины не содержат посттрансляционных модификаций и могут иметь одну-две дисульфидных связи. К микроцинам класса 2а относятся микроцин L, микроцин V и микроцин N. К классу 2б относятся микроцины, имеющие линейную структуру, которые могут нести на своем С-конце модификации. Гены синтеза этих микроцинов расположены на хромосомной ДНК. Представителями микроцинов класса 2б являются микроцин E492, микроцин M и H47. Общая организация генов микроцинового кластера имеет схожие черты. Микроцины обычно синтезируются в виде пептидного предшественника, который состоит из N-концевой сигнальной (лидерной) части и корового (основного) пептида. В некоторых случаях лидерный пептид необходим для корректного внесения пост-трансляционных модификаций и формирования зрелого микроцина [56, 69]. Часто эта N-концевая часть отсутствует в зрелом микроцине, так как удаляется в процессе его созревания и транспорта наружу из клетки, как правило, с помощью ABC-транспортера (системы транспортных белков, использующих энергию АТФ) [75]. Гены в составе микроцинового кластера могут быть организованы в один или несколько оперонов. Можно выделить ряд характерных генов, которые присутствуют практически в любом кластере: это структурный ген, кодирующий пептидный предшественник микроцина, гены, отвечающие за устойчивость клетки к эндогенному микроцину, а также гены, кодирующие систему экспорта зрелого микроцина наружу из клетки. Дополнительно к этому "базовому" набору в опероне могут также присутствовать гены, кодирующие систему пост-трансляционной модификации микроцинов (Рисунок 1). Следует иметь в виду, что строгой общепринятой системы наименования генов, 15 ответственных за синтез микроцинов, нет, хотя в большинстве случаев ген "А" кодирует пептидный предшественник микроцина [24]. Рисунок 1. Организация генов микроциновых кластеров (по Duquesne S. и соавторы с изменениями). Гены представлены в виде цветных стрелок. Ген, кодирующий пептидпредшественник микроцина, окрашен желтым. Гены, обеспечивающие устойчивость клеток к эндогенному микроцину, его экспорт и пост-трансляционную модификацию, окрашены красным, синим и зеленым соответственно. Прямые повторы, окружающие кластер MccC7/C51 показаны вертикальными линиями. Промоторы изображены в виде флажков. Названия генов приведены рядом с соответствующей стрелкой. Внутри класса 1 (А) гены, ответственные за устойчивость и экспорт, окрашены фиолетовым. Продукт гена mccE (MccC7/51 кластера) обеспечивает как устойчивость, так и внесение посттрансляционных модификаций, этот ген окрашен красно-зеленым. Внутри класса 2 (Б и В) гены с неизвестной функцией окрашены серым. Нарушенные гены перечеркнуты [24]. 16 Микроцины класса 1 К микроцинам класса 1 относят микроцин B17, микроцин J25 микроцин С (С7-С51). Мы отдельно остановимся на каждом из представителей данного класса, что позволит нам выявить общие закономерности синтеза и функционирования этих антибиотиков. Микроцин B17 Микроцин В17 представляет собой пептид длиной 43 а.к., несущий посттрансляционные модификации. Синтез микроцина В17 обеспечивается за счет совместной работы продуктов семи генов: mcbABCDEFG, расположенных на плазмиде [8]. Ген mcbA кодирует пептид-предшественник, длинна которого составляет 69 аминокислот. В процессе созревания этот пептид претерпевает посттрансляционные модификации, которые вносятся комплексом белков McbBCD. После этого в результате протеолитической активности белков TldE и TldD отщепляется N-концевой лидерный пептид длиной 26 а.к. В конечном итоге, образуется зрелый микроцин В17, который содержит четыре оксазольных и четыре тиазольных кольца, которые сформировались путем модификации четырех сериновых и четырех цистеиновых остатков (Рисунок 2). Устойчивость клетки к эндогенному микроцину обеспечивается продуктами генов mcbEFG, первые два из которых кодируют АВС-транспортер, переносящий микроцин В из клетки [57]. Рисунок 2. Структура зрелого микроцина В17. На рисунке показаны посттрансляционные модификации микроцина В17, который содержит в своем составе тиазольные (показаны красным) и оксазольные (показаны синим) кольца [6]. Зрелый антибиотик попадает в периплазматическое пространство чувствительной клетки, главным образом, посредством порина OmpF, а также 17 частично через порин OmpC. Далее из периплазматического пространства микроцин В17 доставляется в цитоплазму транспортером SbmA, расположенным в плазматической мембране [57, 50]. Этот белок функционирует как димер [19]. На основании структурной гомологии трансмембранного домена, SbmA относят в к семейству ABC-транспортеров. Тем не менее, цитоплазматический домен, ответственный за гидролиз АТФ, у этого белка отсутствует. По всей видимости, SbmA использует электрохимический градиент для транспорта веществ через внутреннюю мембрану [79]. Естественный субстрат для этого транспортера остается неизвестным, хотя показано, что посредством SbmA в клетки проникают такие антимикробные пептиды как микроцин B17, микроцин J25 [80], блеомицин [92] и пролин-богатые эукариотические антимикробные пептиды [59]. Мишенью для микроцина В17 в бактериальной клетке является ДНК-гираза [36]. Этот фермент относится к топоизомеразам типа II. Гираза может релаксировать положительно сверхспирализованную ДНК, а также обладает уникальной способностью вносить отрицательные супервитки в ДНК за счет энергии гидролиза АТФ [11]. ДНК-гираза - это жизненно важный фермент, и его ингибирование приводит к остановке репликации и гибели клеток. Точный механизм действия микроцина В не ясен, но известно, что микроцин В способен стабилизировать ковалентный комплекс гираза-ДНК в момент, в котором гираза произвела двуцепочечный разрыв ДНК и должна осуществить транспорт через него другой цепи [36]. Микроцин J25 Микроцин J25 представляет собой антимикробный пептид длиной 21 а.к. Этот пептид синтезируется на рибосомах и впоследствии претерпевает пост- трансляционные модификации. За синтез микроцина J25 ответственны 4 гена mcjABCD. Ген mcjA кодирует линейный петпид-предшественник длиной 58 аминокислот. Гены mcjB и mcjC кодируют белки, отвечающие за внесение посттрансляционных модификаций в пептид McjA и образование структуры по типу лассо. Продукт гена mcjD представляет собой ABC-транспортер, который 18 обеспечивает выброс зрелого микроцина наружу, а также устойчивость клеткипродуцента к эндогенному микроцину. Зрелый микроцин J25 обладает уникальной третичной структурой по типу лассо (Рисунок 3): в результате циклизации между аминогруппой N-концевого остатка глицина G1 и карбоксильной группой бокового радикала остатка глутамата Q8 образуется лактамное кольцо. По всей видимости, именно благодаря своей структуре этот антибиотик проявляет высокую стабильность к действию высоких температур и протеолизу [57]. Рисунок 3. Структура микроцина J25. Микроцин J25 содержит макролактамное кольцо на N-конце и линейный С-концевой участок - "хвост". С-концевой хвост располагается внутри лактамного кольца, формирующего лассо-подобную структуру. На рисунке представлена линейная последовательность и трехмерная структура (PDB: 1Q71) микроцина J25 [6]. Микроцин J25 проникает через внешнюю мембрану в периплазму Граммотрицательных бактериальных клеток посредством рецептор-FhuA-зависимого TonB пути [80]. Белок FhuA является рецептором сидерофоров, связывающих железо, а комплекс белков TonB-ExbB-ExbD, расположенных на внутренней мембране клетки, ответственен за активацию этого рецептора [57]. Как уже было сказано ранее, в транспорте микроцина J25 через плазматическую мембрану принимает участие белок SbmA [80]. Проникнув в цитоплазму клетки, микроцин J25 ингибирует фермент РНКполимеразу [83]. Антибиотик связывается с РНК-полимеразой в области вторичного канала, временно прекращая элонгацию транскрипта, но не оказывает эффекта на скорость элонгации между паузами. Таким образом, микроцин J25 как бы "закупоривает" вторичный канал РНК-полимеразы [3]. 19 Микроцин С7-C51 Микроцин С7-С51 представляет собой пептид-нуклеотидный антибиотик, который продуцируется некоторыми штаммами кишечной палочки и действует против близкородственных видов энтеробактерий. Микроцин С7 [68] и микроцин С51 [47] были независимо выделены из различных штаммов E. coli и охарактеризованы. Поначалу казалось, что это два разных антибиотика, относящихся к одному классу химических соединений. Но после проведения структурных исследований было установлено, что это одно и то же вещество [32]. В связи с этим, далее мы будем именовать это соединение общим термином "микроцин С" или сокращенно МсС. За синтез микроцина С и устойчивость клеток-продуцентов к этому антибиотику ответственны гены микроцинового кластера mccABCDEF, расположенные на плазмиде [8, 31]. Ген mccA кодирует гептапептид-предшественник микроцина С, синтезируемый на рибосомах [30]. По окончании синтеза на рибосомах, пептид MccA претерпевает пост-трансляционные модификации под действием ферментов MccB, MccE и MccD [77, 61], в результате чего образуется зрелый микроцин С с молекулярной массой 1178 Да (Рисунок 4). Зрелый МсС экспортируется из клетки с помощью белка МссС, который представляет собой транспортер семейства MFS (Major Facilitate Superfamily), встроенный в цитоплазматическую мембрану. За устойчивость клетки-продуцента к эндогенному микроцину ответственны белки MccC, MccE и MccF [31, 66]. 20 Рисунок 4. Роль различных белков в синтезе и процессинге микроцина С. Из пептидного предшественника МссА с использованием двух молекул АТФ за счет фермента МссВ синтезируется незрелый микроцин С с молекулярной массой 1120 Да (McC1120). Который под действием пептид деформилазы (Def) может преобразовываться в микроцин С с молекулярной массой 1092 Да (McC1092) или претерпевать дальнейшие пост-трансляционные модификации за счет совместной работы ферментов MccD и MccE. Такой зрелый микроцин С с молекулярной массой 1178 Да (McC1178) выбрасывается из клетки за счет работы мембранного транспортера MccC. Попав в цитоплазму клетки зрелый микроцин С деформилируется пептид деформилазой (Def) с образованием микроцина С с молекулярной массой 1149 Да (МсС1149). Протеолиз пептидной части антибиотика происходит под действием пептидаз широкого спектра PepA, PepB и PepN, в результате чего высвобождается токсин - аналог активированной аминокислоты аспартата, ингибирующий аспартил-тРНК-синтетазу. Защита от эндогенного микроцина С клеток-продуцентов осуществляется белками MccE и MccF, которые модифицируют микроциновый токсин таким образом, что он теряет свое сродство к аспартил-тРНКсинтетазе. 21 Мы рассказали про структуру микроцина С, его синтез и механизм действия в общих чертах. Далее мы разберем каждый пункт более подробно, начиная с истории открытия микроцина С. Микроцин С - пептид-нуклеотидный антибиотик История открытия микроцинов В семидесятых годах XX века, в контексте поиска новых типов антибиотических соединений, перед учеными встал вопрос изучения механизмов смены бактериальных сообществ (сукцессии) под воздействием различных химических соединений. бактериальных Даже в составе достаточно сообществ, населяющих кишечник хорошо изученных здоровых людей, или индивидуумов с патологическими состояниями, механизмы сукцессии были неизвестны. На тот момент ученые имели представление о существовании колицинов - антибактериальных белков с молекулярной массой от 40 до 80 кДа, продуцируемых некоторыми штаммами E. coli и активными против близкородственных клеток кишечной палочки, а также некоторых других энтеробактерий [15]. Но только действием колицинов нельзя было объяснить вытеснение одних штаммов другими. Накапливались противоречия, указывающие на существование других типов антибактериальных соединений, способных дать конкурентное преимущество одним бактериальным штаммам над другими в процессе борьбы за существование [38]. Для разрешения этих противоречий Асенсио и Перез-Диаз провели поиск новых низкомолекулярных антибактериальных соединений, продуцируемых энтеробактериями, населяющих кишечник, и активных против близкородственных видов [7]. В своих экспериментах исследователи использовали штаммы кишечной палочки (E. coli K12, E. coli B, E. coli W и E. coli 402), которые растили на минимальной мягкой агаризованной среде. На поверхность застывшей среды накладывали целлофановую пленку, поверх которой наносили мазки штаммов - потенциальных продуцентов антибиотика (аэробных энтеробактерий, изолированных из 22 кишечника госпитализированных детей). Через сутки наблюдали образование зон ингибирования роста на газоне клеток под соответствующим мазком на целлофане. Целлофан, использованный в эксперименте, имел такой размер пор, что не допускал диффузии соединений с молекулярной массой более 15 кДа, то есть при такой постановке эксперимента из анализа исключались колицины, имеющие молекулярную массу от 40 кДа и более. В ходе проведенных исследований, авторы выделили штаммов-продуцентов антибиотических соединений пептидной природы (некоторые из них были чувствительны к действию протеаз) с молекулярной массой от 1 до 5 кДа, которые выделяются во внешнюю среду некоторыми энтеробактериями и активны против близкородственных видов. Для таких новых антибиотических соединений авторы предложили название "микроцины" [7]. Первоначально микроцин С получил имя "микроцин 7", сообразно номеру штамма-продуцента в коллекции [16]. В дальнейшем Бакеро и Морено, занимавшиеся изучением микроцинов, в 1986 году предложили сгруппировать и переименовать микроцины в соответствии с перекрестной активностью штаммовпродуцентов и свойствами самих соединений в 4 группы: A, B, C и D. Микроцину 7 было присвоено имя "микроцин С7" [9]. Также Бакеро и соавторами была предложена номенклатура для микроциновых плазмид, несущих гены синтеза микроцина, - М плазмиды, генов синтеза микроцина - mcc-1,2..., белков, кодируемых этими генами, - Мсс1,2,..., а также аббревиатура Mc для микроцинов [8]. Кроме того микроцин С был независимо открыт группой российских ученых под руководством Хмель. Новый антибиотик был описан как микроцин группы С и назван микроцин С51 [47]. Расшифровка структуры микроцина С Расшифровкой структуры микроцина С занималась группа испанских ученых. Гарсия-Бустос и соавторы установили, что микроцин С имеет пептидную природу [28]. Также была предложена формула микроцина С: acetyl-MRTGNAD-X, где X не идентифицированная кислото-лабильная группировка, присоединенная к остатку аспартата. Несмотря на то, что группе ученых практически удалось 23 установить правильную аминокислотную последовательность микроцинового пептида, природа N-концевой блокирующей группы была определена неверно [29]. Эту задачу удалось решить группе российских ученых под руководством Хмель, которые работали над расшифровкой структуры микроцина С51 [62]. С помощью ЯМР (Ядерно-магнитного резонанса) ученые установили, что пептид MRTGNAN [30] (в составе микроцина MRTGNAD) несет формильную группировку на своем N-конце [62]. Окончательно решить структуру микроцина С удалось с помощью ЯМР в совместной работе испанских и французских исследователей, посвященной изучению микроцина С7 [32]. Учеными была определена природа N- и С-концевой блокирующих группировок: формил и аденозин монофосфат, модифицированный пропиламином (Рисунок 4). Позже было показано, что микроцин С51 имеет сходную структуру и вместе с микроцином С7 является одним соединением [12]. На этом споры и противоречия о структуре микроцина С разрешились. Гены синтеза микроцина С Как и расшифровка структуры, изучение генов синтеза микроцина С велось параллельно группами российских и испанских ученых. Уже в первых работах было показано, что гены, ответственные за синтез микроцина С, расположены на коньюгативной плазмиде [8, 46]. Также было замечено, что штаммы, несущие плазмиду, кодирующую гены синтеза микроцина, устойчивы к действию микроцина того же типа [47, 9], а синтез микроцина С не активируется SOSответом, но происходит в стационарную фазу роста, что контрастирует с известными свойствами большинства колицинов и напоминает синтез вторичных метаболитов [28, 44]. Первая попытка охарактеризовать гены синтеза микроцина С была предпринята Новоа и соавторами [68]. В штамме-природном продуценте микроцина С E. coli BM7006 было найдено несколько плазмид с различной молекулярной массой. Среди них - низкокопийная плазмида (1-2 копии на клетку), которая была названа pMccC7 (размером около 43 тыс. п.о.) и обеспечивала 24 устойчивость клеток к микроцину С. Как и другие плазмиды, кодирующие гены синтеза микроцина, pMccC7 не несла генов устойчивости к известным антибиотикам, но обладала всей достаточной информацией для самоподдержания и передачи собственных копий другим клеткам посредством конъюгации. С помощью рестрикционного анализа и транспозонных инсерций, удалось картировать гены, ответственные за продукцию микроцина С и устойчивость к этому антибиотику. Исследователи сделали вывод, что эти гены располагаются на участке ДНК размером около 5 тыс. п.о. и организованы в полицистронный оперон [68]. Плазмида, ответственная за синтез микроцина С51 (размер 38 тыс. п.о.), была описана Купериной и соавторами [47]. Это низкокопийная плазмида, несущая гены синтеза и устойчивости к микроцину, которые организованы в оперон, транскрибируемый с общего промотора. Анализ комплементирующих мутаций показал, что, как минимум, три гена участвуют в синтезе микроцина. Они были обозначены как A, B и C [47]. С развитием технологии секвенирования ДНК изучение генов микроцинового оперона значительно продвинулось вперед. Так была установлена нуклеотидная последовательность фрагмента, ответственного за синтез микроцина С и устойчивость к этому антибиотику. Было показано, что ген mccA имеет длину кодирующей части 21 п.о. Это самый маленький из известных на сегодняшний день генов. Ген кодирует пептид с последовательностью MRTGNAN, который является предшественником микроцина С [30]. Позднее Гонсалес-Пастор и соавторы провели секвенирование участка размером 6458 п.о., ответственного за синтез микроцина С (микроцина С7) и устойчивость к антибиотику [31]. Были определены открытые рамки считывания пяти генов: mccA, mccB, mccC, mccD, mccE, транскрибируемых в одном направлении, и одного гена mccF, транскрибируемого в обратном направлении относительно пяти основных генов (Рисунок 5). 25 Рисунок 5. Организация генов микроцинового кластера в виде физической карты генов, ответственных за синтез микроцина С и устойчивость к этому антибиотику, локализованных на плазмиде pMccC7. α, β, γ, δ и ε - регионы, необходимые для продукции и/или устойчивости; B, E, C, H, S, P - сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции BamHI, EcoRI, ClaI, HindIII, SalI, PstI соответственно; гены микроцинового оперона обозначены стрелками и маркированы mccA, mccB, mccC, mccD, mccE и mccF [31]. Также были предсказаны -10 элемент, последовательность Шайн-Дальгарно, Rhoнезависимый терминатор, расположенный за геном mccE, инвертированные повторы, в том числе те из них, которые локализуются в межгенном участке между mccA и mccB и предположительно играют роль в экспрессии нижележащих генов [31]. На основании анализа аминокислотной последовательности исследователи предсказали возможную роль белков, кодируемых генами микроцинового кластера: они полагали, что белки MccB и MccD необходимы для внесения модификаций в С-конец пептида МссА, причем первый, вероятно, должен аденилировать пептид, а второй ответственен за аминопропилирование остатка фосфорной кислоты. Белок MccC, по мнению авторов, должен быть ответственен за транспорт зрелого микроцина из клетки. С помощью комплементирующего теста мутантов по генам mccB, mccC, mccD и mccE, проведенного с использованием транспозонной инсерции, было установлено направление транскрипции микроцинового оперона осуществляется в направлении от гена mccA к гену mccD. Также была выявлена роль генов микроцинового оперона в обеспечении устойчивости к микроцину С. Так было показано, что за это ответственны продукты генов mccC, mccE и mccF, но в разной степени. Помимо этого, гены mccC и mccE участвуют в продукции микроцина. Поражает научная интуиция авторов, которые дали достаточно верные прогнозы, подтвержденные впоследствии экспериментально различными исследователями [31]. В 2003 году Фоменко и соавторы опубликовали работу, посвященную изучению структуры генов микроцинового кластера, из плазмиды pC51 [27]. Была 26 установлена первичная последовательность фрагмента ДНК длиной 5,7 тыс. п.о. Эта последовательность оказалась на 97-100% идентична последовательности аналогичного фрагмента, несущего гены синтеза и устойчивости для микроцина С7. В работе был проведен анализ генов микроцинового оперона: различные их комбинации были клонированы в вектор pUHP, такими конструкциями трансформировали клетки кишечной палочки, которые впоследствии тестировали на способность продуцировать антибиотик и на устойчивость к микроцину С. Пустой вектор не давал устойчивости и продукции. Конструкция, несущая гены mccC и mccE обеспечивала хорошую устойчивость к микроцину (до концентрации более 5 мкг/мл), а каждый из этих генов в отдельности - частичную устойчивость (примерно в 10 раз меньшую, по сравнению с конструкцией, несущей оба гена одновременно). Фрагмент ДНК, соответствующий гену mccF, не обеспечивал даже частичной устойчивости. Удаление гена mccB из оперона приводило к нарушению синтеза антибиотика. Клетки, трансформированные конструкцией, несущей гены mccA-mccB, получить не удалось, что объясняется токсическим эффектом антибиотика в отсутствие генов устойчивости. Клетки, трансформированные конструкцией, несущей гены mccA-mccB-mccC, при нанесении на газон чувствительных клеток E. coli TG1 или XL-1 Blue образовывали зоны ингибирования роста меньшего размера, по сравнению с плазмидой дикого типа, то есть mccA-mccB-mccC - это минимальный набор генов, необходимый для продукции микроцина С клетками. Тем не менее, устойчивость таких клеток к экзогенному зрелому микроцину оказалась незначительной. По результатам своей работы авторы сделали вывод, что гены mccA, mccB, mccD и mccE участвуют в синтезе микроцина, а гены mccC и mccE обеспечивают устойчивость к этому антибиотику [27]. Также было показано, что гены микроцин С51-кластера окружены прямыми повторами длиной 44 п.о., что, возможно, является указанием на горизонтальный перенос генов синтеза микроцина между бактериями. Более того G+C состав последовательности ДНК микроцинового кластера отличается от среднего значения, характерного для хромосомы E. coli, что также может служить указанием на аллогенную природу микроциновых генов [31]. Сходные выводы об аллогенной природе генов синтеза микроцина были сделаны в работе, в ходе 27 которой была секвенирована и аннотирована одна из микроцин С-кодирующих плазмид [85]. Роль белков микроцинового кластера Как мы уже отмечали ранее, гептапептид MccA (MRTGNAN) с молекулярной массой 763 Да, является предшественником микроцина С, то есть той пептидной основой, которая в процессе созревания претерпевает пост-трансляционные модификации (Рисунок 4) [30]. Белок МссВ играет одну из ключевых ролей в синтезе антибиотика: МссВ вносит первую и наиболее важную модификацию в пептид МссА - аденилирует пептидный предшественник с образованием продукта MRTGNAD-AMP [77]. Роль белка MccC, в отличие от других белков микроцинового оперона, изучена достаточно плохо. Белок MccC обеспечивает устойчивость клеток к микроцину С и, по всей видимости, ответственен за транспорт антибиотика из клетки через плазматическую мембрану [31]. Известно, что этот белок проявляет сходство с белками MFS-суперсемейства. MFS - это большое семейство вторичноактивных транспортеров с 12 трансмембранными участками. Представители этого суперсемейства встречаются практически во всех таксономических группах - от бактерий до человека. MFS-белки транспортируют свои субстраты через различные мембраны, играя ключевую роль во множестве клеточных процессов [51]. MccE - это двудоменный белок, который участвует в процессе созревания микроцина С, а также обеспечивает устойчивость к этому антибиотику. С- концевой домен белка MccE обладает ацетилтрансферазной активностью: он ацетилирует α-аминогруппу процессированного микроцина С (Рисунок 4), используя в качестве донора ацетильной группировки ацетил-КоА, тем самым препятствуя связыванию токсина с аминоацил-тРНК-синтетазой. Помимо устойчивости к микроцину С, С-концевой домен белка MccE также обеспечивает устойчивость клеток к его синтетическим аналогам [66, 93]. Белок MccD и N-концевой домен белка MccE работают вместе: они ответственны за один из этапов созревания микроцина С - внесение 28 аминопропильной модификации [61]. Аминопропилирование происходит в две стадии. На первом этапе белок MccD с использованием в качестве донора SAM (Sаденозин метионина) переносит 3-амино-3-карбоксипропил с сульфогруппы SAM на кислород остатка фосфорной кислоты аденилированного пептида МссА. Эта реакция сама по себе не очень эффективна и требует присутствия дополнительного белка Mtn (5'-метилтиоаденозин/S-аденозилгомоцистеин нуклеозидаза), который значительно увеличивает ее выход. На втором этапе 3-амино-3- карбоксипропилированный продукт декарбоксилируется N-концевым доменом белка MccE с образованием зрелого микроцина (Рисунок 4) [45]. Белок MccF - это необычная сериновая пептидаза, которая обеспечивает устойчивость клеток-продуцентов к микроцину С путем разрезания карбоксиамидной связи N-C, соединяющей пептидную и нуклеотидную части антибиотика (Рисунок 6) [87]. MccF узнает как полноразмерный микроцин, так и продукт его процессинга [43], а также синтетические аналоги микроцина С, в которых остаток фосфорной кислоты заменен на серную [87]. Рисунок 6. Роль белка MccF. Показана структура зрелого и процессированного микроцина C. Стрелкой обозначена связь, которая расщепляется белком MccF [87]. Возможные гомологи генов микроцинового кластера Первые предположения о существовании потенциальных гомологов генов синтеза микроцина С были сделаны для организма Helicobacter pylori [73, 37]. Впоследствии в ходе биоинформатического поиска и анализа были предсказаны потенциальные гомологи генов синтеза микроцина С в различных группах бактерий (Рисунок 7). В основу такого поиска была положена последовательность белка МссВ E. coli, как основного и самого важного участника синтеза микроцина С. Отбирались только те последовательности, в генном окружении которых в 29 непосредственной близости располагались потенциальные гомологи других генов микроцинового оперона. Также важным фактором являлось наличие последовательности Шайна-Дальгарно перед старт-кодонами открытых рамок считывания. Исследователям удалось предсказать и вручную картировать короткие гены, которые могли бы кодировать пептидные субстраты гомологов белка МссВ пептиды МссА. В качестве критерия отбора был избран С-концевой аспарагин пептидного предшественника МсС: соответствующими кодонами должны были заканчиваться открытые рамки считывания mccA-подобных генов [84]. Рисунок 7. Потенциальные гомологи генов микроцинового кластера. На рисунке показана организация локусов потенциальных генов-гомологов. Отдельные гены представлены широкими стрелками, над которыми указаны названия генов, под ними идентификаторы белковых последовательностей в базе данных PubMed. Гомологичные гены окрашены одним цветом. Справа приведены названия организмов, в которых были найдены эти локусы. Черной изогнутой стрелкой показан старт транскрипции, палочкой с шайбой - потенциальные терминаторы транскрипции [84]. 30 Как можно видеть из приведенного рисунка, потенциальные гомологи микроциновых генов встречаются среди самых разнообразных бактерий: как Грамм-положительных, так и Грамм-отрицательных, а также среди цианобактерий. Регуляция генов микроцинового кластера Кластер генов биосинтеза микроцина С представлен опероном mccABCDE, который транскрибируется с общего промотора Pmcc, расположенного недалеко от старт-кодона гена mccA (Рисунок 7) [26, 31, 63]. Ген mccF транскрибируется отдельно со своего собственного промотора [31]. Синтез микроцина С не активируется SOS-ответом (клеточным ответом на повреждение ДНК), а происходит в стационарную фазу роста [28]: за счет работы ζS фактора (продукт гена rpoS) - ключевого регулятора транскрипции многих генов, активируемых в стационарную фазу [26]. Помимо ζS, на транскрипцию микроцинового оперона оказывают влияние также некоторые глобальные регуляторы экспрессии генов. Так было замечено, что синтез микроцина С в стационарной фазе роста активируется при отсутствии глюкозы в питательной среде [63, 21]. Это объясняется тем, что промотор микроцинового оперона содержит сайт связывания для одного из важнейших регуляторов транскрипции белка CRP (cAMP receptor protein) (Рисунок 8). Рисунок 8. Нуклеотидная последовательность регуляторного участка оперона mcc. Pmcc обозначает точку начала транскрипции in vivo транскриптов mccA и mccB. Квадратными скобками обозначен сайт связывания транскрипционного фактора CRP, 31 который был определен с помощью футпринтинга в экспериментах с использованием ДНКазы I. Жирным шрифтом показаны нуклеотиды, участвующие в связывании CRP. Также приведена аминокислотная последовательность пептида MccA (жирным, в виде однобуквенного кода) над соответствующими кодонами гена mccA [63]. Белок CRP имеет также альтернативное название CAP (catabolite activator protein) - белок-активатор катаболизма. Белок CRP в комплексе с цАМФ, уровень которого в клетке повышается при дефиците глюкозы, контролирует экспрессию многих генов E. coli, которые он может как активировать, так и репрессировать. В случае микроцина С, комплекс цАМФ-CRP активирует транскрипцию микроцинового оперона [26]. Другой транскрипционный регулятор, белок H-NS, который является небольшим гистон-подобным белком, способным связываться с AT-богатыми изогнутыми участками ДНК, по всей видимости, ингибирует транскрипцию микроцинового оперона в стадию экспоненциального роста [26] [63]. Также ингибирующее действие на транскрипцию оперона mcc оказывает белок Lrp (Leucine responcible protein) - еще один глобальный регулятор транскрипции генов кишечной палочки [26]. Особый интерес вызывает недавно установленный механизм регуляции синтеза белков микроцинового оперона на уровне транскрипции и трансляции посредством формирования вторичных структур РНК. Между генами mccA и mccB расположены инвертированные повторы, которые, по всей видимости, формируют шпилечную структуру Rho-независимого терминатора [31]. С промотора Pmcc с общей точки инициации синтезируется два транскрипта разной длины: один размером около 105-107 п.о. (короткий транскрипт mccA), второй (длинный), видимо, соответствует полноразмерному микроциновому оперону (Рисунок 9). Короткий транскрипт, кодирующий пептид MccA, образуется только при наличии терминаторной шпильки в межгенном участке mccA-mccB. Интересно, что короткого транскрипта образуется приблизительно в 20 раз больше, чем длинного, а в отсутствии терминаторной шпильки продукция микроцина С снижается в 30 раз. Этот факт можно объяснить исходя из предположения, что для эффективного синтеза антибиотика клетке необходимо произвести значительные количества пептида-предшественника MccA, матрицей для синтеза которого служит короткий транскрипт, и сравнительно небольшие количества MccB и других ферментов 32 синтеза микроцина С (синтезируются с длинного транскрипта), обеспечивающих конверсию пептида-предшественника в МсС [94]. Рисунок 9. Схематическое изображение короткого транскрипта mccA и участка ДНК, включающего регуляторную область микроцинового оперона, ген mccA и начало гена mccB. На представленном фрагменте ДНК (черная линия) расположены: участок связывания белка-активатора катаболизма CAP (catabolite activator protein, он же CRP) – синий прямоугольник, последовательность Шайн-Дальгарно – зеленый прямоугольник, начало открытой рамки считывания mccB – серый прямоугольник, ген mccA – красная стрелка, точка инициации транскрипции Pmcc - отмечена изогнутой стрелкой, терминаторная шпилька – флажком, цифрами обозначены позиции нуклеотидов относительно точки инициации транскрипции. Синей линией представлена мРНК короткого транскрипта mccA, 3’-конец которого картирован с помощью 3’-RAСE (результаты картирования отмечены черными стрелками) [94]. Короткий транскрипт обладает значительно большей стабильностью по сравнению с длинным, время жизни которого соответствует среднему значению для большинства мРНК E. coli. При этом короткий транскрипт обнаруживается в рибосомальной фракции. Мутации в последовательности Шайна-Дальгарно гена mccA приводят к нарушению синтеза транскрипта, а мутации в старт-кодоне mccA к снижению синтеза. Таким образом повышенная стабильность короткого транскрипта связана с защитой его рибосомой от деградации нуклеазами. Более того, в присутствии рибосомы, связавшейся с растущей мРНК, происходит терминация транскрипции на терминаторной шпильке с образованием короткого транскрипта mccA. В отсутствии рибосомы, связанной с растущей мРНК, синтезируется полицистронный длинный транскрипт. Аналогичная система 33 регуляции была найдена в гомологичном опероне из организма Helicobacter pylori G27 [27, 94]. Механизм действия микроцина С Микроцин С - это антибиотик, который действует по принципу Троянского коня: он проникает в клетку под видом питательного субстрата, но в ходе его расщепления в цитоплазме выделяется токсин, который ингибирует рост клетки. Клетки-продуценты микроцина секретируют антибиотик во внешнюю среду. Из окружающей среды микроцин С проникает через внешнюю мембрану кишечной палочки в периплазму через порины OmpC и OmpF. Это было показано Хмель и соавторами в экспериментах, в которых клетки E. coli с нарушенными генами ompF и ompR проявляли устойчивость к действию микроцина С, напротив, клетки с ненарушенной функцией этих генов сохраняли чувствительность к антибиотику [44]. Из периплазмы транспортируется с через плазматическую помощью мембрану YejABEF-транспортера, микроцин С представителя суперсемейства ABC-транспортеров (ATP-binding cassette). Предположительно, YejABEF является АТФ-зависимой олигопептид пермеазой. Клетки E. coli, в которых нарушен один из генов оперона yejABEF, устойчивы к действию микроцина С [67]. Микроцин С является ингибитором трансляции [29]. В цитоплазме клетки микроцин С подвергается протеолизу, в результате которого высвобождается токсин (Рисунок 4) [27]. Протеолиз осуществляется за счет совместной работы нескольких ферментов. N-концевой формил, по всей видимости, удаляется за счет действия пептид деформилазы, а высвободившийся N-концевой метионин аминопептидазой или другой олигопептидазой широкого спектра действия. Показано, что наличие формила на N-конце значительно замедляет процессинг микроцина С в цитоплазме клетки, в то время как наличие аминопропильной модификации МсС способствует процессингу микроцина [61, 43]. Далее в действие вступают пептидазы широкого спектра действия PepA, PepB и PepN. Клетки, дефектные по всем трем аминопептидазам E. coli BW28357 ΔpepA ΔpepB ΔpepN, 34 устойчивы к действию микроцина С. Антибиотик не процессируется в их цитоплазме с высвобождением токсина. Продукция микроцина С в таких клетках ведет к накоплению деформилированного микроцина в цитоплазме [43]. Микроциновый токсин представляет собой аминокислоту аспартат, которая связана с остатком фосфорной кислоты в составе АМФ посредством фосфороамидатной связи. Такая молекула имитирует активированную аминокислоту, аспартил-аденилат, и связывается в активном центре аспартил-тРНК-синтетазы, препятствуя ее нормальной работе. Этот факт был продемонстрирован в работе Метлицкой и соавторов с использованием бесклеточной системы трансляции. Микроциновый токсин ингибирует избирательно аспартил-тРНК-синтетазу, а также оказывает небольшое угнетающее действие на включение аспарагина во фракцию тРНК. Непроцессированный микроцин, также как и пептиды MRTGNAN и MRTGNAD, не оказывают ингибирующего действия на трансляцию [60]. Антибактериальная активность микроцина С и его аналогов Микроцин С проявляет антибактериальную активность уже в наномолярных концентрациях. Это было показано Гарсия-Бустасом и соавторами в экспериментах на кишечной палочке [28]. Клетки E. coli GS7 растили на бедной среде М9 с добавлением тиамина. Ночную культуру добавляли в мягкий агар до концентрации клеток 108. На застывший агар наносили антибиотик микроцин С и тетрациклин (в качестве контроля) в нескольких последовательных разведениях и наблюдали образование зон ингибирования роста после 15 часовой инкубации клеток при температуре 37оС. За единицу активности микроцина С авторы приняли такое количество антибиотика, содержащееся в 25 мкл пробы, которое способно дать такую же зону ингибирования роста на газоне клеток E. coli GS7, как и 0,3 мкг тетрациклина. 1 единица активности соответствует концентрации пептида МсС равной 0,2 нмоль [28]. На штамме E. coli RYC25 (производный от E. coli GS7, но несущий плазмиду с опероном генов синтеза микроцина), показана устойчивость продуцента к микроцину С до его концентрации в среде 32 мкМ [29]. 35 Микроцин обладает бактериостатическим действием. Это было продемонстрировано на клетках E. coli: в культуральную среду к клеткам добавляли микроцин С до конечной концентрации 0,4 мкМ. В этих условиях наблюдали угнетение роста бактериальных клеток. В то же время клетки сохраняли свою жизнеспособность в течение как минимум восьми часов и при пересеве их на свежую среду без антибиотика возобновляли свой рост [29]. Микроцин С активен не только против E. coli, но и против филогенетически близких к кишечной палочке штаммов, преимущественно Грамм-отрицательных бактерий [29]. Различными группами ученых были проведены тесты на чувствительность к МсС различных бактериальных штаммов. Результаты этих тестов отображены в таблицах 1-3. Таблица 1. Антимикробная активность микроцина С (микроцина С7) [29]. Вид Escherichia coli Klebsiella pneumoniae Klebsiella oxytoca Salmonella typhi Salmonella typhimurium Salmonella sp. Shigella flexneri Shigella sp. Serratia marcescens Proteus mirabilis Proteus vulgaris Erwinia herbicola Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas maltophilia Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Bacillus amyloliquefaciens Micrococcus luteus Streptococcus agalactiae Candida albicans Rhodotorula mucilaginosa Количество чувствительных штаммов 6 1 0 2 1 4 1 2 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Всего тестировалось штаммов 7 2 1 2 1 4 1 2 1 4 1 1 3 1 4 1 1 1 1 1 1 36 Таблица 2. Чувствительность различных бактериальных штаммов к действию микроцина С. "+" - штамм, чувствительный к действию микроцина С; "-" - штамм, устойчивый к действию микроцина С [44]. Бактериальный штамм Escherichia coli B Действие МсС + Citrobacter freundii 62/82 Действие МсС + Бактериальный штамм Escherichia coli TG1 + Serratia marcescens 1060 + Salmonella typhimurium LT2 + Serratia marcescens 1010 + Salmonella enteritidis 724 + Yersinia enterocolitica 09 194 + Salmonella rostock 266 + Yersinia enterocolitica 03 159 + Shigella flexneri 2A 98 + Yersinia pseudotuberculosis 01 623 + Enterobacter aerogenes 59/26 + Yersinia pseudotuberculosis 01 2160 + Enterobacter aerogenes 3/43 - Proteus mirabilis 143 + Enterobacter cloacae A-186 - Providencia rettgeri 2692 + Hafnia alvei 3032 - Proteus vulgaris 171-2016 - Klebsiella pneumoniae K13 1470 + Proteus vulgaris 249 - Klebsiella pneumoniae K14 1193 + Pseudomonas aeruginosa TC-16 + Klebsiella pneumoniae K22 1196/49 + Micrococcus luteus B2 + Klebsiella pneumoniae K1 5054 + Bacillus megaterium TH + Citrobacter freundii CA31 + Bacillus megaterium THS + Citrobacter freundii 49/11 + Bacillus cereus B-370 - Таблица 3. Действие микроцина С (микроцина С51) на различные бактериальные клетки [47]. Все протестированные штаммы были получены из коллекции клеточных культур Института молекулярной генетики РАН, Москва. Количество протестированных штаммов указано в скобках рядом с соответствующим названием штамма. Тестируемый штамм Escherichia coli (67) Shigella flexneri (1) Salmonella (18) Klebsiella ozaenae (1) Citrobacter freundii (1) Proteus rettgeri (1) Proteus mirabilis (1) Pseudomonas aeruginosa (1) Serratia marcescens (2) Agrobacterium tumefaciens (2) Erwinia carotovora (1) Bacillus megaterium (1) Bacillus pumpilus (1) Радиус зон ингибирования роста в мм 5-25 10-12 5-15 5 4-6 10-12 3-5 4-8 8 1-2 4-5 9-10 3-4 37 Из клеток-продуцентов микроцина можно выделить несколько его форм: зрелый микроцин С с молекулярной массой 1178 Да (McC1178), несущий одновременно две модификации - пропиламин на остатке фосфорной кислоты и формил на N-конце молекулы [32], деформилированный микроцин с молекулярной массой 1149 Да (McC1149), формилированный микроцин, у которого отсутствует аминопропильная модификация с молекулярной массой 1120 Да (МсС1120), а также микроцин С, который не несет ни аминопропильной, ни формильной модификации с молекулярной массой 1092 Да (МсС1092) (Рисунок 4) [61]. Эти формы микроцина С проявляют различное антибактериальное действие при нанесении на газон чувствительных клеток кишечной палочки E. coli B и E. coli K12. Так максимальным антибактериальным эффектом обладает зрелый микроцин, удаление аминопропильной модификации или потеря формильной группировки приводит к снижению активности антибиотика. Ряд активности различных форм микроцина С можно представить следующим образом в порядке уменьшения антибактериального эффекта: 1178 > 1120 ≥ 1149 >> 1092. При этом аминопропилированный микроциновый токсин эффективней ингибирует аспартилтРНК-синтетазу, по сравнению с неаминопропилированным аналогом [61]. Следует отметить, что чувствительность клеток кишечной палочки варьирует от штамма к штамму, так клетки E. coli B значительно чувствительней к микроцину С, по сравнению с клетками K-12, что, возможно, связано с различной представленностью поринов на внешней мембране клеток, а также высокой активностью Rim-ацетилаз в клетках E. coli K-12 [34, 44, 61]. В работе Казакова и соавторов было продемонстрировано, что антибактериальным действием обладает не только микроцин С, но и его аналоги. В ходе экспериментов были использованы 114 генетических конструкций, полученных на основе вектора, содержащего полноразмерный микроциновый оперон. В ОРС (открытую рамку считывания) гена mccA были внесены точечные мутации, которые привели к заменам в каждой из аминокислотных позиций, за исключением первой позиции - метионина (Рисунок 10). Такие мутантные микроцины продуцировались кишечной палочкой и некоторые из них обладали антибактериальной активностью сопоставимой или меньшей, по сравнению с активностью микроцина С дикого типа. Механизм действия, аналогичный 38 действию микроцина С, был подтвержден в тестах на ингибирование аспартилтРНК-синтетазы in vitro с использованием 14 С-меченного аспартата. Следует отметить, что не удалось получить ни одного микроцин С-подобного соединения на основе пептида с заменой С-концевого аспарагина, что говорит о высокой специфичности фермента МссВ по отношению к С-концевой аминокислоте MccA [42]. Рисунок 10. Результаты структурно-функционального анализа 114 точечных мутантов по гену mccA. Цифрами отмечены позиции аминокислот в гептапептиде MccA, непосредственно над цифрами расположены аминокислоты, соответствующие пептиду дикого типа MRTGNAN. Аминокислоты, расположенные над соответствующим аминокислотным остатком пептида MccA, представляют такие замены, при которых образуется микроцин С-подобное соединение, аминокислоты, расположенные под соответствующим остатком МссА - представляют замены, при которых не образуется микроцин С-подобных соединений. Зеленым помечены мутации, приводящие к образованию вещества с антибактериальной активностью, синим - к образованию вещества, не обладающего антибактериальной активностью [42]. 39 Белок MccB Белок МссВ играет ключевую роль в процессе синтеза микроцина С, обеспечивая первый и ключевой этап образования биологически активного предшественника зрелого антибиотика - микроцина МсС1092. Белок МссВ взаимодействует с пептидом MccA (MRTGNAN), присоединяя в ходе энзиматической реакции молекулу АМФ к С-концевому аспарагину (Рисунок 11). Рисунок 11. Схема синтеза микроцина МсС1092 из пептида-предшественника MRTGNAN в ходе ферментативной реакции с участием фермента МссВ [77]. Ферментативная функция белка МссВ Особенности этой ферментативной реакции были достаточно подробно изучены в лаборатории Уолша (Walsh) [77]. В ходе эксперимента к рекомбинантному белку МссВ в реакционную смесь были добавлены пептид MRTGNAN (полученный методом твердофазного химического синтеза), АТФ и соли магния (магний является кофактором нуклеотид-связывающих ферментов). После инкубации реакционной смеси, продукты были разделены с помощью ВЭЖХ. Отдельные пики были проанализированы с помощью масс- спектрометрического анализа. Было выявлено, что в результате реакции образуется три продукта: АМФ, аденилированный пептид (идентифицирован по сдвигу массы пептидного пика - плюс 329 ед.м.) (Рисунок 12-5) и интермедиат - сукцинимидное производное пептида MRTGNAN (сдвиг массы - минус 18 ед.м. относительно пептидного пика) (Рисунок 12-3), образующееся в ходе циклизации С-концевого аспарагина (Рисунок 12). Также в реакционной смеси присутствовал исходный пептид, не прореагировавший с ферментом МссВ. Образование аденилированного продукта и формирование связи N-P было подтверждено с помощью ЯМР [77]. 40 Рисунок 12. Схема двустадийной реакции пост-трансляционной модификации пептида МссА ферментом МссВ. В ходе реакции происходит формирование N-P связи. На первой стадии α-карбоксильная группа С-концевого аспарагина (1) пептида MccA атакует α-фосфат первой молекулы АТФ, в результате чего образуется гидролитически лабильное соединение гептапептидил-СО-АМР (2). Далее атом азота β-карбоксамидо группы С-концевого аспарагина атакует С-концевой ацил-АМФ-ангидрид (2), с образованием кольцевого аддукта - сукцинимидного производного МссА (3) и выделением АМФ. Атом азота в составе сукцинимида представляет собой слабый нуклеофильный агент, который подвергается атаке α-фосфата второй молекулы АТФ (3) с образованием N-P связи (4). Такой продукт, по всей видимости, гораздо более подвержен нуклеофильной атаке, по сравнению с исходным карбоксамидом. На последней стадии происходит размыкание кольца в ходе нуклеофильной атаки воды (4) с образованием изоаспарагинил-производного (5) - микроцина МсС 1092. (6) Ингибитор белка МссВ MccA-N7isoAsn, пептид МссА с заменой С-концевого аспарагина на его аналог изоаспарагин [77]. В ходе реакции происходит изомеризация C-концевого остатка аспарагина в изоаспарагин под действием фермента MccB. Судя по всему, эта реакция представляет собой двустадийный процесс (Рисунок 12). На первом этапе расходуется одна молекула АТФ, в результате чего образуется интермедиат сукцинимидное производное (далее сукцинимид-МссА) (Рисунок 12-3), которое служит субстратом для второй реакции, в ходе которой расходуется вторая молекула АТФ и образуется продукт - аденилированный изоаспарагин (Рисунок 12-5). Первая реакция протекает медленнее второй, но сродство фермента МссВ к 41 первому пептидному субстрату (МссА) больше, чем ко второму (сукцинимидному производному), что приводит к накоплению в реакционной смеси сукцинимидМссА. Тот факт, что последний является именно интермедиатом, а не побочным продуктом, было подтверждено следующими экспериментами: очищенный из реакционной смеси ВЭЖХ сукцинимид-МссА, а также сукцинимид-МссА, полученный синтетически, были добавлены в реакционную смесь к ферменту МссВ. Фермент конвертировал оба соединения в конечный продукт - микроцин С 1092 [77]. В этой же работе было показано, что синтетический субстрат MccA-N7isoAsn (Рисунок 12-6) не является субстратом для фермента МссВ, но ингибирует его активность. Таким образом преобразование сукцинимидного производного в фосфоамидат идет путем нуклеофильной атаки молекулы АТФ в активном центре фермента непосредственно на замкнутую в цикл молекулу, и раскрытия цикла перед второй стадией реакции не происходит. Остается открытым вопрос о субстратной специфичности фермента МссВ. Так в работе Казакова и соавторов она была отчасти исследована in vivo [42]. В ген mccA вносились точечные мутации, приводившие к замене каждой отдельно взятой аминокислоты пептида за исключением N-концевого метионина, на остальные 19 аминокислот. Было показано, что практически в любую позицию, за исключением седьмого C-концевого остатка аспарагина, можно внести аминокислотную замену, которая приводит к синтезу активного антибиотика (Рисунок 10). Замена аспарагина в седьмом положении пептида MccA на любую другую аминокислоту полностью нарушает продукцию микроцина С [42]. Результаты Казакова и соавторов согласуются с предложенным механизмом энзиматической реакции синтеза МсС из пептида МссА ферментом МссВ [77]. Так как в ходе ферментативной реакции происходит конверсия С-концевого аспарагина в аспартат. Казалось бы заманчиво предположить, что пептид с заменой Сконцевой аминокислоты с аспарагина (N) на аспартат (D) также будет служить субстратом для фермента МссВ. Но в ходе тестов in vitro было продемонстрировано, что пептид MccA-N7D (MRTGNAD), в отличие от пептида дикого типа MRTGNAN, не взаимодействовал с ферментом МссВ и, соответственно, накопления аденилированного продукта не происходило [77]. 42 Промежуточный продукт реакции MccB с пептидом MRTGNAD должен был бы представлять собой циклическое производное, но в отличие от сукцинимида (имида янтарной кислоты), внутримолекулярный в ангидрид случае (Рисунок аспартата, 12). должен Такие образовываться соединения крайне нестабильны и легко гидролизуются. Возможно, время жизни этого интермедиата настолько мало, что он не успевает войти во вторую стадию энзиматической реакции [77] и гидролизуется с образованием исходного продукта, т.е. пептида MRTGNAD. Более того, если допустить, что интермедиат образовался и вступил во вторую стадию реакции, то образовавшийся продукт - ацил-фосфорный ангидрид (соединение эквивалентное веществу 5 на рисунке 12, но с кислородом вместо атома азота). Такие соединения в водной среде крайне нестабильны и гидролизуются практически мгновенно, в нашем случае, с образованием исходного пептида с С-концевым аспартатом. Для лучшего понимания субстратной специфичности фермента МссВ следует подробно рассмотреть его структуру и обратить внимание на организацию его каталитического центра. Структура белка МссВ Полипептидная цепь МссВ образована из 351 а.о. По принципу структурной гомологии белок МссВ можно условно разделить на 2 региона: N-концевой участок (длиной порядка 90 а.к.), для которого не установлена схожесть с известными белковыми структурами, и С-концевой участок (длинной порядка 260 а.к.), который имеет сходство с аденилирующим доменом убиквитин-подобных ферментов (ubiquitin-like protein-activation enzyme, UBL) [76]. Группа исследователей под руководством Уолша (Walsh) и Шулмана (Schulman) получила ряд кристаллов белка MccB и разрешила их структуры [76]. Белки были кристаллизованы в виде гомодимеров, имеющих удлиненную форму (полипептидные цепи, соответствующие каждому протомеру, для удобства обозначены А и В). В составе гомодимера присутствует два активных центра. 43 Каждый из них сформирован с участием обоих мономеров и содержит АТФсвязывающий и пептид-связывающий домены (Рисунок 13). Рисунок 13. Общий вид модели кристаллической структуры комплекса белка МссВ со вторым пептидным субстратом - сукцинимид-МссА. Положение Mg-ATФ на поверхности кристалла смоделировано путем наложения разрешенных кристаллических структур комплексов МссВ - сукцинимид-MccA и МссВ-Mg-АТФ. Два протомера белка изображены схематично в виде элементов вторичной структуры: α-спиралей и β-слоѐв розовым (субъединица А) и пурпурным (субъединица B). Пептидный субстрат сукцинимид-MccA и Mg-АТФ представлены в виде палочек, где атомы углерода отмечены желтым и серым соответственно. Атомы азота помечены синим, кислорода красным, фосфора - оранжевым. Ионы Mg2+ и Zn2+ представлены в виде бирюзовых и серых сфер [76]. Аденилирующий домен имеет типичную для АТФ-связыващего домена укладку Россманна. Он образован при участии двух протомеров, которые предоставляют для его формирования следующие аминокислотные остатки: А104А260, А287-А351, В90-В103 (для первого домена) и соответственно В104-В260, В287-В351 и А90-А103 (для второго домена). Пятитяжевой β-слой стабилизирован расположенным в непосредственной близости участком связывания иона цинка. Аналогичные по структуре домены встречаются в таких прокариотических белках как MoeB, ThiF, а также эукариотических Es1 UBA1, NAE1-UBA3 и SAE1-UBA2, участвующих в процессах убиквитинилирования и сумоилирования [52, 55, 88]. Второй, уникальный для МссВ, домен также образован при участии обеих субъединиц: N-концевыми аминокислотными остатками одного домена (с 1 по 87) 44 и С-концевыми остатками другого (с 261 по 287). Этот С-концевой участок, который получил название "скрещенная петля" или "кроссоверная петля" (crossover loop), является очень важным элементом третичной структуры (далее, эта структура будет разобрана подробнее). В рассмотренных кристаллических структурах этот домен участвует в формировании множества контактов с пептидным субстратом, т.е. формирует специфический, не встречающийся в большинстве других белков с подобной структурой, пептид-связывающий домен, или домен "пептидные клещи" (Рисунок 13 и 14). Таким образом, если смотреть на структуру активной единицы в целом, можно отметить, что аденилирующий домен и домен "пептидные клещи" организованы в функциональном димере на манер раковины моллюска: для формирования активной единицы каждый из протомеров предоставляет по половинке "раковины", между которыми в борозде "зажаты" субстраты реакции - АТФ и пептид [76]. Рисунок 14. Модель домена "пептидные клещи" белка МссB. Модель построена на основе суперпозиции кристаллических структур: МссВ-МссА, МссВ-сукцинимид, МссВMg-АТФ. Оба протомера А и В представлены на рисунке в розовом и пурпурном цвете соответственно. Пептид МссА (зеленый), сукцинимид-МссА (желтый) и АТФ (серый) изображены в виде палочек. Атомы азота помечены синим, кислорода - красным, фосфора - оранжевым. Ионы магния изображены в виде бирюзовой сферы. "Пептидные клещи" белка МссВ и пептидные субстраты заключены в четырехугольник, стороны которого изображены пунктирной линией [76]. 45 Уолшем и соавторами был проведен функциональный тест, который подтвердил принципиальную значимость домена "пептидные клещи" для обеспечения энзиматической активности фермента МссВ. Так было показано, что удаление N-концевого участка (87 а.к.), который составляет значительную часть домена "пептидные клещи", приводит к полной потере активности фермента при сохранении способности к димеризации. Однако, при добавлении к белковой фракции такого мутантного белка очищенного отдельно N-концевого домена (87 а.к.) in trans, энзиматическая активность такого комплекса восстанавливалась и составляла 20% от активности полноразмерного фермента [76]. Положение пептидного субстрата в активном центре пептидсвязывающего домена Следует обратить внимание на положение пептидного субстрата МссА в активном центре МссВ (Рисунок 15). Рисунок 15. Модель расположения пептидного субстрата в активном центре фермента МссВ. А. Комплекс МссА (отмечен зеленым) и МссВ. В. Комплекс сукцинимид-MccA (отмечен желтым) и МссВ. Оба протомера белка МссВ изображены на рисунке соответственно в розовом и пурпурном цвете. Пептидные субстраты показаны в виде палочек (атомы азота окрашены синим, кислорода - красным, серы - темно-желтым). Контакты на расстоянии около 5 Å (близко к радиусу водородной связи, что может свидетельствовать о возможном еѐ формировании) помечены черной пунктирной линией [76]. 46 Пептид МссА "вытянут" вдоль β-складчатого слоя аденилирующего домена таким образом, что С-конец пептида сближен с сайтом связывания АТФ. Фактически сайт связывания МссА находится в борозде, образованной щелью βскладчатого слоя аденилирующего домена с одной стороны и пептидными клещами с другой. Таким образом пептидный субстрат в активном центре контактирует с аминокислотными остатками обоих доменов. Остатки лизина К10 и глутаминовой кислоты Е26, относящиеся к домену "пептидные клещи", непосредственно взаимодействуют с аминокислотными остатками субстрата (далее аминокислотные остатки субстрата будут обозначены соответствующей латинской буквой с нижним индексом). К10 образует контакты с атомами кислорода в составе карбоксильной группы G4 и бокового радикала Т3 в комплексе МссВ-МссА и MccB-сукцинимид-MccA. Остаток Е26 формирует контакты с атомом азота бокового радикала R2 в комплексе МссB-MccA и с атомом кислорода бокового радикала Т3, а также азотами остова Т3 и R2 в комплексе MccB-сукцинимид-MccA (Рисунок 15). Тем не менее, замена остатка К10 на аланин не приводит к потере каталитической активности, а лишь ведет к снижению константы Михаэлиса [76]. N-конец пептидного субстрата расположен в полости, сформированной аденилирующим доменом. Остаток метионина M1 погружен в глубокий гидрофобный карман, где он окружен остатками I243, V245, W326 и H333, с которыми метионин вступает в гидрофобные взаимодействия. Помимо этого, карбонильная группировка метионина М1 образует водородные связи с остатками R322 и Q335 (Рисунок 15) [76]. Структура аденилирующего активного центра АТФ-связывающий сайт располагается в борозде в непосредственной близости от места связывания С-конца пептидного субстрата. В его формировании принимают участие обе субъединицы гомодимера. В координировании АТФ принимает участие нуклеотид-связывающий мотив GCGGIG. Ароматическое кольцо аденина связывается в гидрофобном кармане, образованном остатками L121, I194, A213 и L219. Рибоза и остатки фосфорной кислоты АТФ 47 координируются полярными аминокислотами N154, R157, Q158 и K170. Аргининовый палец (консервативный остаток, встречающийся в составе ГТФазных и АТФазных доменов, вероятно, принимающий участие в гидролизе нуклеотидтрифосфатов и формировании АТФ-связывающего кармана [91]) предоставляется вторым мономеров комплекса - R94 (Рисунок 16). Замена аргинина на аланин в этой позиции не приводит к потере активности фермента, но ведет к увеличению константы Михаэлиса. Рисунок 16. Структура аденилирующего активного центра. А. Представлена модель аденилирующего активного сайта белка МссВ в комплексе с Mg-АТФ (белым) и сукцинимидным субстратом (желтым). Модель получена суперпозицией комплексов МссВ-Mg-АТФ и МссВ - сукцинимид. Субстрат и аминокислотные остатки, принимающие участие в связывании, представлены в виде палочек. Атомы азота помечены синим, кислорода - красным, фосфора - оранжевым. Контакты между остатками, расположенными на расстоянии около 5 Å обозначены черными пунктирными линиями [76]. Б. Желтым показаны остатки, играющие важнейшую роль в процессе катализа - тирозин Y239 и аспартат D214, которые формируют своеобразный "мостик", под которым должен пройти пептидный субстрат (на рисунке сукцинимид-МссА изображен в виде розовых палочек) для взаимодействия с АТФ (молекула представлены белыми палочками). Ион магния координирован остатками фосфорной кислоты в составе АТФ, а также аминокислотным остатком аспарагиновой кислоты D214 (Рисунок 16, А). Этот аспартат является важнейшим участником каталитической реакции. Его замена на аланин приводит к потере энзиматической активности и способности 48 фермента конвертировать МссА в сукцинимид и, в свою очередь, сукцинимид в конечный продукт [76]. Уникальные черты активного центра белка МссВ Особенностью белка МссВ является наличие в каталитическом центре аминокислотного остатка тирозина Y239, который не характерен для других белков Е1 суперсемейства. Этот тирозин контактирует с обоими субстратами фермента МссВ: с α-фосфатом молекулы АТФ и С-концом гептапептидного субстрата. Y239 расположен в непосредственной близости от остатка глутамата D214, который принимает участие в координировании иона магния (Рисунок 16, Б). Вместе эти два аминокислотных остатка формируют своеобразный "мостик". Для взаимодействия с молекулой АТФ пептидному субстрату необходимо пройти по каналу под этим "мостиком". Тирозин Y239 играет важнейшую роль в катализе. Замена тирозина на аланин в этой позиции повышает константу Михаэлиса для обоих субстратов в 5 раз и снижает константу катализа в 600 раз [76, 77]. Конформационная подвижность активных центров Суперпозицией различных комплексов МссВ-субстрат было показано, что как пептид-связывающий, так и АТФ-связывающий сайты обладают конформационной подвижностью, что, видимо, играет важную роль в процессе катализа. Конформационная подвижность наблюдается как на локальном, так и на глобальном уровне. Так аденилирующий домен и домен "пептидные клещи" могут координировано принимать "открытую" и "закрытую" конформации (Рисунок 17, А). Для большей наглядности можно представить раковину моллюска с открывающимися и закрывающимися створками. Пронаблюдать конформационную подвижность удобно на примере перемещения остатка аспарагина N241 из зоны аденилирующего домена в зону "пептидных клещей" в ходе рабочего цикла фермента. Замена этого остатка на аланин приводит к 49 снижению константы катализа в пять раз и возрастанию константы Михаэлиса в 6 раз [76]. Рисунок 17. Конформационная подвижность белка МссВ и его субстрата МссА. А. На панели представлен результат суперпозиции белковых структур МссВ (полипептидная цепь помечена бирюзовым, Apo) и комплекса МссВ-сукцинимид (полипептидная цепь помечена розовым, MccB) в области аденилирующего домена. Положение Mg-АТФ (помещен в активный сайт) смоделировано на основе суперпозиции структур с комплексом МссВ-MgАТФ. Полипептидная цепь представлена в виде линий, ион магния бирюзовой сферы, сукцинимид и АТФ - в виде палочек в желтом и сером цвете соответственно. Атомы азота помечены синим, кислорода - красным, фосфора оранжевым. Б. Конформация С-концевого участка пептидных субстратов. Молекулы представлены в виде палочек, атомы углерода в составе комплекса МссА-МссВ помечены зеленым, МссА-МссВ-AMPCPP - синим, МссВ-сукцинимид-MccA - желтым, МссА- N7isoAsn-MccB – оранжевым [76]. Конформационная подвижность затрагивает положение молекул субстратов в составе активных сайтов. Это особенно интересно в случае пептидных субстратов, положение С-концевого участка которых сильно варьирует. Так в активном центре белка МссВ положения Сα в составе пептидного остова МссА и сукцинимид-МссА различаются на величину порядка 8 Å (Рисунок 17, Б) [76]. Возможно, именно благодаря тому, что фермент МссВ способен связывать свои пептидные субстраты в различных конформациях, аминокислотные замены в пептиде МссА в положении 2 и 4-6 не оказывают сильного влияния на продукцию микроцина in vivo, что было продемонстрировано в работе Казакова и соавторов [42]. 50 Таким образом, МссВ представляет собой уникальный белок в семействе E1белков или убиквитин-активирующих белков (Ubl-activating proteins), о которых мы расскажем ниже. В составе фермента можно выделить два активных сайта: аденилирующий и пептид-связывающий. Субстратом для МссВ является короткий пептид, который связывается с уникальным доменом "пептидные клещи". В образовании этого домена принимают участие оба мономера, входящие в состав гомодимера МссВ. Фермент катализирует две последовательные реакции аденилирования пептида, которые затрагивают С-концевой аспарагин: в ходе первой реакции из пептида МссА образуется промежуточный продукт сукцинимид-МссА, вторая реакция заканчивается образованием N-P связи (в составе молекулы микроцина МсС1092). Оба пептидных субстрата в комплексе с ферментом ориентированы своими С-концевыми участками по направлению к аденилирующему сайту. В правильном позиционировании субстрата в активном центре важную роль играют аминокислотные остатки D214 и Y239. Предположительно, обе реакции аденилирования осуществляются в одном и том же месте аденилирующего активного сайта. В правильной ориентации молекулы АТФ в активном центре, особенно ее αфосфата, важную роль играет ион магния, который координируется за счет остатка D214. Также остатки R157, Q158 и K170 совместно с магнием стабилизируют отрицательный заряд, возникающий на β-фосфате после атаки на α-фосфат Сконцевого аспарагина МссА. Наверняка неизвестно, диссоциирует ли образовавшийся в ходе первой каталитической реакции сукцинимид из комплекса с ферментом, или остается зажатым в "пептидные клещи" до второй стадии. Тем не менее, сукцинимид, добавленный в реакцию к ферменту извне, узнается и модифицируется ферментом до конечного продукта. Наиболее поразительным этапом ферментативного катализа является химическая трансформация, которая завершается переносом АМФ на атом азота сукцинимида. По всей видимости, такая реакция обеспечивается благодаря уникальной организации домена "пептидные клещи " белка МссВ. Таким образом этот домен осуществляет две последовательные реакции: в ходе первой достаточно типичной реакции кислород в составе карбоксильной группы С-концевого 51 аспарагина МссА выступает в роли нуклеофильного агента, в ходе второй - азот сукцинимидоного кольца ведет себя как слабый нуклеофильный агент, атакующий α-фосфат второй молекулы АТФ с образованием нетипичной, но гидролитически устойчивой связи N-P [76]. E1-суперсемейство Уникальные свойства МссВ можно выявить нагляднее путем сравнения структурно-функциональной организации белка МссВ и других представителей Е1суперсемейства. Белки Е1-суперсемейства получили свое название благодаря белку-участнику процесса убиквитинилирования, характерного для эукариот. Убиквитинилирование - это двустадийный процесс деградации белка посредством убиквитин- протеасомного пути [18]. Процесс модификации белка убиквитином - это каскад из трех реакций, в котором принимают участие белки Е1, Е2 и Е3. Белок Е1 инициирует процесс путем аденилирования С-концевого глицина молекулы убиквитина [18]. Примечательно, что аналогичные реакции катализируются прокариотическими гомологами белка Е1 - ThiF и MoeB, которые осуществляют аденилирование Сконцевых участков убиквитин-подобных (Ub/Ub1) белков ThiS и MoaD, соответственно, в процессе синтеза тиамина и молибденовых или вольфрамовых кофакторов (MoCo/WCo) [23,78]. Хотя результат модификации убиквитина и убиквитин-подобных белков ферментами E1-суперсемейства схож в общих чертах, сам путь биосинтеза имеет ряд принципиальных отличий. Филогенетическиое древо белков Е1-суперсемейства Сходство каталитических функций белков Е1-суперсемейства может говорить о некоторой степени эволюционного родства. Так группа биоинформатиков под руководством Аравинда (Aravind) провела исследование белковых 52 последовательностей, находящихся в доступных базах данных. На основе выравниваний последовательностей, анализа общности мотивов и структурных элементов было построено филогенетическое дерево белков Е1-суперсемейства, выделено 26 белковых семейств, содержащих в своѐм составе E1-подобный домен. Также были выделены ключевые структурные элементы и доменная архитектура, свойственные этим белкам, определены характерные гены-соседи, встречающиеся в составе существующих и предполагаемых оперонов. Результаты этого исследования суммированы на рисунке 18 [14]. Рисунок 18. Эволюционная история, доменная организация и особенности генного окружения белков Е1-суперсемейства. Индивидуальные семейства представлены на диаграмме слева в виде отдельных горизонтальных линий. Некоторые ключевые эволюционные события обозначены вертикальными линиями. Горизонтальные линии имеют цветовую маркировку, соответствующую выявленным филогенетическим распределениям. Пунктирными овалами объединены семейства, которые могли произойти от любого другого, заключенного в овал. Цветные кружки, расположенные на горизонтальных линиях, обозначают потерю этим семейством определенного 53 структурного элемента, характерного для последовательности предковой белковой формы. Типичная доменная архитектура и консервативное генное окружение семейств представлены в правой части схемы. Отдельные белковые домены изображены в виде цветных многоугольников, а цветными стрелками обозначены участки консервативного генного окружения. Разрывы внутри белковых доменов обозначают потерю одного или более характерных структурных элементов. Неактивные белковые домены на схеме перечеркнуты крест-накрест "Х". Семейства, имеющие схожую функцию, объединены скобками (справа от схемы указана эта функция). Условные обозначения: Rhod роданазный домен, CCTBP - цистеин-содержащий TBP-подобный домен, AOR - альдегид ферридоксин оксидоредуктаза, desulf - десульфураза, FMN red - флавинзависимая оксидоредуктаза, Pept - пептидаза, GNAT - ацетилтрансфераза GNAT-типа, ABC_t - ABCтранспортер, X - предсказанный пептидазный домен нового типа, Y - предсказанный металл-связывающий домен [14]. Присутствие как минимум одного представителя Е1-суперсемейства в каждом из трех доменов жизни говорит о наличии универсального общего предка этих белков. На основании имеющихся данных, можно предположить, что этот общий предок был схож с белками ThiF/MoeB, функционировал в качестве димера с симметричным аденилирующим и тиолирующим активными сайтами. Е1-домен универсального общего предка обладал набором структурных элементов, которые сохранились в ходе эволюции и встречаются среди различных представителей Е1семейств [14]. Далее мы разберем структуру Е1-домена подробнее. Характерные структурные элементы белков Е1-суперсемейства Базовым структурным элементом Е1-домена является укладка Россманна, которая в белках этого семейства претерпела некоторые модификации. Укладка Россманна представляет собой трехслойную структуру по типу α/β/α: скрученный β-слой, окруженный с обеих сторон α-спиралями. β-слои, в свою очередь, уложены параллельно, в порядке 321456 (Рисунок 19). По такому типу часто организованы белки, связывающие нуклеотиды, в том числе НАД(Ф): алкоголь дегидрогеназа, тирозин-зависимая оксидоредуктаза, лактат дегидрогеназа и др. [13]. 54 Рисунок 19. Схема укладки полипептидной цепи по Россманну. Параллельные β-тяжи формируют единый β-слой, который с обеих сторон контактирует с участками полипептидной цепи, уложенными в α-спирали. Обозначены N- и C-конец полипептидной цепи соответственно N и C, порядковый номер β-тяжа обозначен цифрами снизу начиная с N-конца полипептидной цепи. Структурные особенности белков Е1-суперсемейства Описанная выше укладка в составе Е1-белков претерпела некоторые изменения. Е1-домен организован по типу трехслойного α/β/α-сэндвича: в центре расположены восемь β-тяжей в порядке 87654123 (на рисунке и далее в тексте они обозначены соответственно S1-S8), с обеих сторон к β-слою прилегают α-спирали (Рисунок 20). 55 Рисунок 20. Топологическая диаграмма, схематически отражающая строение укладки Россманна, характерной для белков Е1-суперсемейства. Для большей наглядности приведены также структуры других белков, содержащих укладку Россманна. Красными стрелками обозначены β-тяжи (на схеме помечены в соответствии с введенной выше номенклатурой S1-S8, значком "eq" - обозначены тяжи, которые эквивалентны таковым у Е1-домена), синими и фиолетовыми спиралями - элементы укладки в αспираль, серым овалом изображен ион магния. Аминокислоты и мотивы, играющие важную роль в катализе и связывании субстрата, представлены цветными кружками. Для обозначения аминокислотных остатков использован однобуквенный код. Обозначения на схеме: R-палец - аргининовый палец; протяженная или вытянутая петля (Extended coil region), принимающая участие в связывании АТФ и катализе; глицин-богатая связывающая петля (или P-петля, P-loop) - типичная структура, встречающаяся в составе АТФ- и ГТФ-связывающих белков [81]; кроссоверная (или скрещивающаяся) петля (Ascending arm); CxxC - Zn2+-хелатирующий мотив, включающий остатки цистеина; IC остаток цистеина, принимающий участие в реакциях тиолирования; C - C-конец полипептидной цепи; N - N-конец полипептидной цепи. Схема приведена на примере структуры нативного комплекса MoeB-MoaD (PDB: 1JW9), а также алкогольдегидрогеназы печени лошади (PDB: 1A71) и белка TrmB из организма Bacillus subtilis - тРНК-метилтрансфераза (PDB: 2FCA) [14]. 56 Как можно видеть из приведенного рисунка, центральным структурным элементом Е1-домена является укладка Россманна, в образовании которой принимают участие β-тяжи (S1-S5) и α-спирали (H1-H4). Помимо этого, для Е1подобных доменов характерны дополнительные структуры, выделяющие белки Е1суперсемейства среди других групп белков, содержащих укладку Россманна. К ним относятся три хорошо изученных структурных элемента и несколько менее явных характерных последовательностей, о которых мы поговорим ниже. Первым характерным структурным элементом является диада α-спиралей, расположенных на N-конце (относительно укладки Россманна). В составе этой структуры обычно встречается консервативный остаток аргинина (Рисунок 20). Этот остаток входит в мотив эквивалентный "аргининовому пальцу" - характерной структуры, найденной в Р-петле многих НТФ-аз [91]. Аргинин в составе этой структуры помещается в активный сайт противоположной мономерной субъединицы гомо- или гетеродимера, участвуя в стабилизации заряда на сильно поляризованном пятивалентном атоме фосфора. Аргинин способствует реакции переноса остатка фосфорной кислоты на соответствующий аминокислотный остаток в процессе аденилирования субстрата [14, 48]. Вторым характерным элементом является протяженная или вытянутая (extended) петля между S2 и H2, которая содержит в своѐм составе несколько консервативных среди большинства белков Е1-семейств полярных остатков (обычно это D, N, R и K) (Рисунок 20). Эти аминокислотные остатки принимают участие в катализе реакции аденилирования наравне с "аргининовым пальцем" [14, 25, 48]. Третьей особенностью является удлинение основного домена укладки Россманна, которое включает дополнительный участок S6-S8, в котором β-тяжи S6 и S8 лежат антипараллельно (по отношению к другим β-тяжам). Эта уникальная структура включает петлю, соединяющую тяжи S6 и S7, которая была названа "кроссоверной петлей" (Рисунок 20). В составе кроссоверной петли могут встречаться один или несколько спиральных элементов. Также на ней расположен консервативный остаток цистеина, который принимает участие в реакции тиолирования [14]. 57 Помимо этого, каталитически активный Е1-домен содержит в своѐм составе консервативный остаток аспартата, расположенный на тяже S4. Его заряженная группа вовлечена в координирование иона магния и, вероятно, ответственна за правильную ориентацию комплекса Mg-АТФ, по аналогии с аспартатом в составе Уолкер Б (Walker B) мотива. Также высоко консервативный остаток аргинина, расположенный на спирали H6, формирует полярные контакты с боковой цепью Ub/Ub1-подобного субстрата, возможно, направляя полипептидную цепь субстрата в активный сайт фермента, где происходит аденилирование [14]. Два других мотива присутствуют только в некоторых семействах Е1-белков. Одним из таких мотивов является пара цистеинов CxxC, участвующая в координации иона цинка. CxxC встречается в "кроссоверной петле" и в других слабо структурированных участках полипептидной цепи, расположенных за тяжом S8, ближе к С-концу (Рисунок 20). Предположительно, ион цинка стабилизирует конформацию "кроссоверной петли", тем самым благоприятствуя связыванию Сконцевого участка Ub/Ub1-подобного субстрата в активной сайте. Этот мотив отсутствует у белков, потерявших свою каталитическую активность или не имеющих белкового субстрата (например, таких как FeeI). По всей видимости, в некоторых белках E1-суперсемейства цинк-связывающий мотив CxxC утерян или его роль выполняет другая комбинация аминокислотных остатков [14]. Еще одним загадочным случаем эволюционного консерватизма в составе Е1белков является последовательность ExxK, расположенная на спирали H5. За счет солевых мостиков остатки глутамата и лизина формируют контакт с верхушкой шпильки S7-S8, находящейся на противоположной субъединице димера. Такое взаимодействие, возможно, обеспечивает стабилизацию и правильную ориентацию субъединиц в составе димера [14]. Таким образом, фосфотрансферазная активность Е1-подобной белковой укладки представляет собой уникальное эволюционное изобретение, которое возникло независимо из "предковой" формы укладки Россманна [14]. Эволюция семейства E1-белков достаточна запутана и сложна. Здесь мы не будем углубляться в историю этого необычного белкового семейства. Но стоит отметить, что эукариотическая ветвь Е1-суперсемейства развивалась относительно независимо, взяв своѐ начало от предковой формы, в которой соседствовали два типа белковых 58 укладок Е1 и Е2 (Рисунок 18). Это связано с тем, что Е1-белки проявляют свою каталитическую активность в составе гетерокомплекса с белками Е2 [18]. Обилие таких сопряженных E1-E2 систем найдено у α-протеобактерий - вероятного предка митохондрии. Прокариотические Е1-белки функционируют в виде гомодимеров. У прокариот эта укладка получила своѐ распространение в первую очередь среди белков, связанных с метаболизмом серы (в реакциях тиолирования). Однако, по всей видимости, дополнительной функцией белков, содержащих Е1-домен, стал синтез вторичных метаболитов и антибиотиков, сопряженный, в частности, с образованием тиазольных и оксазольных колец. Среди них можно выделить относительно хорошо изученные белки (для которых получены и разрешены кристаллические структуры), такие как ThiF, MoeB и MccB. Небольшой сравнительный анализ этих белков мы проведем ниже. Сравнительный структурный анализ некоторых представителей прокариотических белков E1-суперсемейства Для сравнительного анализа мы выбрали относительно хорошо охарактеризованные белки MoeB и ThiF - паралоги белка МссВ, для которых получены и разрешены кристаллические структуры, в том числе в комплексе со своими субстратами. Эти белки, как и МссВ, относятся к прокариотической линии Е1-суперсемейства. Они сохранили черты предковой организации Е1-домена, а следовательно, все характеристические структурно-функциональные элементы. Для начала следует сказать несколько слов о биологической роли белков ThiF и MoeB. Биологическая роль белков ThiF и MoeB Белок ThiF участвует в биосинтезе тиамина у E. coli. Синтез тиамина осуществляется в ходе сложного каскада реакций, приводящего к формированию тиазольных и пиримидиновых колец. Для образования тиазольного кольца 59 необходима активность белков ThiS, ThiF, ThiG, ThiH, IscS и ThiI. Исходными субстратами для синтеза тиазольного кольца служат деокси-D-ксилулоза 5-фосфат (DXP), тирозин и цистеин. Было показано, что белок ThiF участвует в двух отдельных этапах синтеза тиазольного кольца тиамина у E. coli. На первом этапе ThiF катализирует образование интермедиата ThiS-ацил-аденилат (ThiS-COAMP) (Рисунок 21-1). Такой продукт узнается белком IscS и при участии белка ThiI (который выполняет роль посредника между IscS и ThiS) преобразуется из ThiSCOAMP в ThiS-тиокарбоксилат (Рисунок 21-2). Далее белок ThiF образует с таким продуктом ковалентный комплекс ThiF-ThiS, связанный через ацил-дисульфидную связь между атомами серы ThiS-тиокарбоксилата и остатком цистеина C184 белка ThiF (Рисунок 21-3). Из этого ковалентного комплекса, а также DXP и тирозина при участии тиазол-синтетазы (белка ThiG) формируется тиазольное кольцо тиамина (Рисунок 21). По всей видимости, белок ThiF функционирует в качестве гомодимера [23]. Рисунок 21. Схематическое представление пути биосинтеза тиамина у E. coli. Отображена роль белка ThiF: участие в реакциях аденилирования и транс-тиолирования. Условные обозначения на схеме: ATP - молекула АТФ, PPi - пирофосфат, Cysteine аминокислота цистеин [23]. Субстратом фермента ThiF является небольшой убиквитин-подобный белок ThiS длиной четырехтяжевым 66 а.к. β-слоем, Он представляет α-спиралью и собой гибким глобулу, образованную С-концевым хвостом, заканчивающимся на два глицина G-G (Рисунок 22, А) [23]. Следует отметить, что структура белка ThiS имеет черты сходства с другим убиквитин-подобный белком MoaD (схожесть последовательностей составляет 29,5%) - оба они формируют на С-конце тиокарбоксилатное производное в ходе ферментативного катализа [23, 78], а также с такими эукариотическими белками как убиквитин, SUMO и другими убиквитин-подобными белками [23]. 60 Рисунок 22. Сравнение структурной организации субстратов белков E1- суперсемейства. Представлены структуры белков (A) ThiS (PDB: 1ZUD), (Б) MoaD (PDB: 1JW9) и (В) убиквитина (PDB: 1UBI). α-спиральные участки представлены синим, β-тяжи - зеленым, петлевые участки – желтым [53]. Белок MoeB участвует в синтезе одной из важнейших биологических молекул - молибдоптеринового кофактора (Moco). Moco - это участник окислительновосстановительных реакций. Он входит в состав двух основных групп ферментов: молибдоптериновых фиксацию нитрогеназ атмосферного азота) (например, и ферментов, оксидоредуктаз [39]. осуществляющих MoeB вместе с гетеротетрамерным белковым комплексом - молибдоптерин синтетазой (MPT Synthase) осуществляет синтез молибдоптерина из Z предшественника (Рисунок 23, A). Молибдоптериновый кофактор представляет собой трициклический пираноптерин (его и называют молибдоптерин), который содержит цисдитиоленовые группировки, координирующие диоксид молибдена. Введение этих группировок в молекулу Z - предшественника осуществляется с помощью тиокарбоксилатной группы на С-конце белка MoaD. Роль MoeB заключается в регенерации тиокарбоксилатной группировки на С-конце MoaD по АТФзависимому механизму [74]. На первом этапе происходит образование ациладенилатного интермедиата на С-концевом остатке глицина белка MoaD (MoaDG81-COAMP) (Рисунок 23, Б-1), далее атом серы замещает кислород гидроксогруппы карбонила G81 с образованием тиокарбоксилатной группировки (MoaD-G81-thiocarboxylate) (Рисунок 23, Б-2,3,4). В качестве донора серы 61 выступает L-цистеин и цистеин C328 уже знакомого нам по синтезу тиамина белка IscS (Рисунок 23, Б-6). В качестве медиатора между IscS и MoaD в данном случае выступает белок YnjE [39]. Таким образом MoeB является молибдоптерин синтетазой сульфуразой [54]. Рисунок 23. Схематическое представление синтеза молибдоптерина из его предшественника Z (А) и предполагаемых реакций образования тиокарбоксилатных группировок на белке MoaD с участием фермента MoeB (Б). 1) аденилирование белка MoaD ферментом MoeB с выделением пирофосфата и образованием комплекса MoaDАМФ, 2) атака на комплекс MoaD-АМФ атомом серы персульфидной группы, связанной с комплексом IscS/YnjE сульфуртрансферазы, 3) образование промежуточного комплекса YnjE-MoaD сопровождается перестройкой молекулы MoeD-АМФ с заменой атома кислорода гидроксо-группы на серу и выделением АМФ (AMP), 4) разрыв дисульфидной связи между MoeB и YnjE с участием цистеина С187 фермента MoeB и высвобождение MoaD-тиокарбоксилата, который впоследствии участвует в реакциях синтеза молибдоптерина, 5) восстановление дисульфидной связи между MoeB и YnjE тиоредоксиновой системой in vivo (на схеме показано восстановление с использованием ДТТ (DTT) in vitro), 6) донором серы для белка IscS служит L-цистеин (L-cysteine) [39, 78]. MoaD - это небольшой белок, длиной 81 а.к. Глобулярный домен белка образован β-слоем из трех длинных и одного короткого β-тяжа. К β-складчатому 62 листу с одной стороны прилегают три α-спирали. С-концевой участок MoaD не cтруктурирован и заканчивается характерной последовательностью GG (Рисунок 22, Б). С-концевой остаток глицина G81 белка выступает в качестве акцептора серы в реакции с MoeB/IscS и донора серы для предшественника Z в реакции синтеза дитиоленовых группировок молибдоптерина [78]. Сравнительный структурно-функциональный анализ белков Е1суперсемейства MccB, MoeB, ThiF Как можно видеть из описания биологической роли белков MoeB и ThiF, характер реакций, катализируемых последними, очень похож на таковой белка МссВ: все три белка относятся к Е1-суперсемейству, катализируют реакции аденилирования небольших пептидных субстратов или белков, причем аденилирование происходит по С-концу пептидного субстрата. Главными отличиями катализируемых реакций являются характер субстрата, в случае МссВ это гептапептид с аспарагином на С-конце молекулы, в случае MoeB и ThiF - это небольшие белки, несущие последовательность из двух глицинов в своей Сконцевой части. Таким образом, отличается конечный акцептор АМФ, а следовательно и механизм реакции. Помимо этого, белки MoeB и ThiF принимают участие также в реакциях транстиолирования. Подобной активности у белка МссВ не обнаружено. Отличия в механизмах катализируемых реакций напрямую связаны с отличиями в структуре белков, наличием тех или иных структурных доменов и мотивов. Далее мы разберем наиболее существенные сходства и отличия, основываясь на структурных данных и выравнивании аминокислотных последовательностей (Приложение, Таблица 1 и Рисунок 1). Первым и самым очевидным отличием, которое легко выявляется при сравнении структур этих белков и выравниваний аминокислотных последовательностей, является их доменная организация (Рисунок 24). 63 Рисунок 24. Сравнение доменной организации белка MccB и белков Е1суперсемейства. A. Схематическое представление доменной организации белков MccB и MoeB, основанное на структурных данных. NTE - N-концевой участок МссВ, AD аденилирующий домен, X - кроссоверная петля, также на рисунке обозначен домен "пептидные клещи", сформированный N-концевым участком MccB и частью кроссоверной петли. Цифрами обозначены порядковые номера аминокислотных остатков [76]. Б. Структуры белков MccB, ThiF и MoeB E. coli. Белок MccB показан синим: темносиним окрашен Е1-домен, голубым - домен "пептидные клещи", белок ThiF показан красным, MoeB - зеленым. α-спиральные участки вторичной структуры обозначены в виде спиралей, β-тяжи в виде стрелок, петлевые участки - линиями. Использованы структуры из банка данных PDB: 3H5R, 1ZUD, 1JWA. Белок МссВ помимо Е1-домена, характерного для всех представителей Е1суперсемейства, имеет дополнительный домен "пептидные клещи", который сформирован N-концевым участком МссВ и частью кроссоверной петли. "Пептидные клещи" - это характерная особенность белка МссВ, связанная, по всей видимости, с природой пептидного субстрата и катализа. Другие представители Е1 суперсемейства, например, такие прокариотические белки как MoeB, ThiF, а также некоторые эукариотические представители Е1 - такие как UBA1 и UBA2, 64 использующие в качестве субстрата маленькие убиквитин-подобные белки, не образуют подобной "пептидным клещам" структуры [48]. Также, как и MoeB и ThiF, MccB функционирует в виде димера - обе субъединицы принимают участие в формировании субстрат-связывающих центров. Для димеризации служит одна из альфа-спиралей (α8 белков MoeB, ThiF и α10 белка MccB), богатая гидрофобными и неполярными аминокислотами, формирующими множество гидрофобных контактов, а также часть 310-спирали (310А для ThiF и MoeB и 310B для MccB) (Рисунок 25) (Приложение: Таблица 1, Рисунок1) [23]. Тем не менее, некоторые контакты, принимающие участие в димеризации ThiF и MoeB, не удалось найти у белка МссВ. Рисунок 25. Структуры гомодимеров MccB и ThiF. Каждая мономерная субъединица в составе гомодимера МссВ (PDB: 3H5N) показана желтым и розовым цветом, белка ThiF (1ZFN) - оранжевым и зеленым, причем вертикальная ось рисунка ориентирована относительно α-спиралей (α10 белка MccB и α8 белка ThiF), ответственных за димеризацию. Отдельно вынесено в прямоугольник из черной пунктирной линии участок α8-спиралей белка ThiF и показаны аминокислотные остатки, принимающие участие во взаимодействии мономеров. α-спирали изображены спиралями, β-тяжи - стрелками, неструктурированные петлевые участки - линиями, отдельные аминокислотные остатки в виде палочек (атомы азота показаны синим, кислорода - красным, фосфора оранжевым). На рисунке также отображены субстраты белков: АТФ - в виде палочек, ион Mg2+ - в виде красной сферы и Zn2+ - серой сферы. Далее мы разберем подробнее структуры субстрат-связывающих участков и особенности взаимодействий в активном центре. Пептидный субстрат как у белка МссВ, так и у белков ThiF и MoeB, своим С-концом ориентирован по направлению 65 к сайту связывания АТФ (Рисунок 26). При этом С-концевая аминокислота находится в непосредственной близости от α-фосфата, что, по всей видимости, благоприятствует реакции аденилирования. В случае MoeB и ThiF связывание субстратов MoaD и ThiS, осуществляется в основном за счет гидрофобных взаимодействий между белками, а в правильном позиционировании С-конца субстрата, мотива G-G, принимает участие консервативный остаток аргинина (R135 MoeB и R132 ThiF) (Приложение: Таблица 1). Этот аргинин также высоко консервативен среди других представителей Е1-суперсемейства, белковые субстраты которых на С-конце также несут G-G мотив [48, 55]. В случае MccB за связывание пептида MccA ответственен целый домен "пептидные клещи" совместно с некоторыми аминокислотными остатками АТФ-связывающего сайта, что, возможно, объясняется значительно более малым размером субстрата, по сравнению с убиквитин-подобными белками, и необходимостью заякоривания и правильного позиционирования МссА в активном центре фермента [76]. В пользу этой гипотезы говорит анализ положения пептидных субстратов MccA и семи Сконцевых аминокислотных остатков ThiS и MoaD в активном центре фермента МссB, которые практически совпадают, а их С-концы расположены в непосредственной близости от АТФ (Рисунок 26, Б). Рисунок 26. Сравнение структур фермент-субстратных комплексов белков MccB, MoeB и ThiF. A. Структура полученная наложением кристаллов белковых комплексов MccB-сукцинимид (PDB: 3H5R), MoeB-MoaD (PDB: 1JWA) и ThiF-ThiS (PDB: 1ZUD), АТФ помещена в комплекс MccB-сукцинимид и ThiF-ThiS путем суперпозиции из MoeB. 66 В активный центр MccB (показан розовым) позиционированы пептидные субстраты: сукцинимид-МссА (белым), ThiS (желтым), MoaD (зеленым). Также для сравнения приведены структуры комплексов MoeB-MoaD (показаны желтым и зеленым соответственно), ThiF-ThiS (показаны голубым и желтым соответственно). Б. Активные центр белка МссВ с расположенным в нѐм сукцинимидным субстратом и семью Сконцевыми остатками белков MoaD и ThiS (представлены в виде палочек белого, зеленого и желтого цвета). Отдельно черной скобкой выделен домен "пептидные клещи". Ионы Zn2+ отображены как серые сферы, АТФ в виде белых палочек. Атомы азота помечены синим, кислорода - красным, серы - желтым. Помимо этого, у MccB отсутствует консервативный остаток аргинина (R135 MoeB и R132 ThiF), характерный для ThiF, MoeB и других представителей Е-1 суперсемейства, субстраты которых несут мотив G-G на С-конце (Приложение: Таблица 1, Рисунок 1). В координации С-конца пептидного субстрата и правильной ориентации его относительно АТФ у MccB принимает участие остаток тирозина Y239, который является уникальным для МссВ. Можно предположить, что такие отличия в структуре пептид-связывающего центра обеспечены именно характером С-концевой аминокислоты пептидных субстратов. Интересно, что одним из контактов между ферментом ThiF и субстратом ThiS служит солевой мостик между остатком аргинина R230 фермента и аспартатом D7 субстрата. При структурном выравнивании и выравнивании аминокислотных последовательностей можно заметить сходный остаток аргинина R234 в белке MoeB. В то же время в MccB в аналогичной позиции расположен остаток гистидина H333, который формирует так же солевой мостик с остатком метионина МссА (Приложение: Таблица 1, Рисунок 1). Связывание АТФ у белков Е1-суперсемейства осуществляется за счет структуры, представляющей модифицированную укладку Россманна (Рисунок 27, А). Структурные мотивы и аминокислотные остатки, ответственные за связывание АТФ, сильно консервативны среди белков MccB, MoeB и ThiF (Приложение: Таблица 1, Рисунок 1) [76]. Также при структурном выравнивании белков MccB и MoeB в комплексе с АТФ можно заметить, что положение АТФ у обоих белков в активном центре практически идентично (Рисунок 27, Б). Это согласуется с 67 совпадением расположения С-концевых участков субстратов в активном центре этих белков (Рисунок 26, Б). Рисунок 27. Положение АТФ в активном центре ферментов MccB и MoeB. А. Представлены структуры белков MccB (PDB: 3H9J) и MoeB (PDB: 1JWA) в комплексе с АТФ. MccB и MoeB показаны в виде α-спиралей и β-слоев розовым и зеленым соответвтенно, АТФ представлена в виде палочек зеленым и желтым соответственно. На рисунке виден Е1-домен, содержащий β-слой, окруженный с двух сторон α-спиралями, которые формируют нуклеотид-связывающую укладку или укладку Россманна. Б. Показан результат наложения молекул АТФ, расположенных в активном центре ферментов, полученный путем суперпозиции кристаллов MccB и MoeB. Цветовая схема соответствует описанной для рисунка А. Атомы азота показаны синим, кислорода красным, фосфора - оранжевым. Следует также обратить внимание на структуры, участвующие в катализе. Как и для других белков Е1-суперсемейства, для MccB, MoeB и ThiF характерно наличие так называемого аргининового пальца - аминокислотного остатка, который предоставляется одной субъединицей гомодимера в активный центр соседней субъединицы и принимает участие в гидролизе АТФ (Рисунок 16, А) [76]. Аминокислотное окружение этого аргинина также достаточно консервативно, что, по всей видимости, необходимо для его правильной пространственной ориентации. Некоторые остатки цистеина высоко консервативны среди белков Е1суперсемейства, в частности MoeB и ThiF. Эти цистеины принимают участвуют в связывании иона Zn2+ и реакциях транстиолирования (консервативный цистеин в составе кроссоверной петли) (Приложение: Таблица 1, Рисунок 1). 68 В работе Уолша и соавторов утверждается, что остатки цистеина белка МссВ практически не участвуют в катализе. Было показано, что их замена на другую аминокислоту не приводит к потере каталитической активности фермента [76]. Лишь для остатка цистеина С123, который входит в состав P-петли Уолкер Амотива [89] и принимает участие в катализе, замена его на лейцин С123L приводит к снижению выхода продукта реакции и накоплению интермедиата сукцинимида. В то же время замена С123 на валин не оказывает такого эффекта. Следует отметить, что в других убиквитин-активирующих белках в аналогичной позиции, что и С123, стоят остатки аланина, валина или лейцина. Таким образом, каталитическая роль С123 в белке MccB, по всей видимости, неспецифическая [76]. Справедливости ради следует отметить, что в описанной работе Уолша и соавторов не проводились тесты с мутантами MccB по остаткам цистеина в положении C257, C260, C343 и C346 [76]. Именно эти цистеины занимают позицию, аналогичную Zn2+-связывающим остаткам у белков MoeB и ThiF (Приложение: Таблица 1, Рисунок 1). При структурном выравнивании белков ThiF и MccB становится очевидной роль C257, C260, C343 и C346 в координировании иона Zn2+ (Рисунок 28). Рисунок 28. Положение аминокислотных остатков в составе белков MccB и ThiF, участвующих в связывании иона Zn2+. На рисунке приведены структуры белков МссВ (PDB: 3H5R) и ThiF (PDB: 1ZUD), окрашенные сообразно элементам вторичной структуры: для белка MccB α-спирали показаны красным, β-тяжи - желтым, петлевые участки - зеленым, ион цинка в виде серой сферы; для белка ThiF голубым, пурпурным, розовым и оранжевым соответственно. Остатки цистеина, принимающие участие в 69 координировании Zn2+ показаны в виде палочек (атомы кислорода окрашены красным, азота - синим, серы - желтым). Б. Крупно показано положение ионов цинка и остатков цистеина при структурном выравнивании белков ThiF и MccB. Цветовые обозначения соответствуют приведенным на рисунке А. Таким образом, несмотря на большое сходство белка MccB с другими представителями Е1-суперсемейства, в белке МссВ присутствует также ряд ключевых отличий, обеспечивающих его ферментативную функцию. Самыми крупными отличиями являются: 1) наличие домена "пептидные клещи", в формировании которого принимает участие видоизмененная кроссоверная петля; 2) отсутствие консервативного среди белков Е1-суперсемейства остатка аргинина, который в МссВ заменен на изолейцин I220; 3) участие тирозина Y239 в ориентации С-конца пептида МссА по направлению к α-фосфату АТФ; 4) отсутствие консервативных остатков цистеина, принимающих участие в катализе. Такие различия, возможно, связаны с характером пептидного субстрата: в отличие от остальных убиквитин-активирующих белков, субстратом для МссВ является небольшой гептапептид с С-концевым аспарагином, а не мотивом из двух глицинов G-G. Также МссВ катализирует две последовательных реакции аденилирования, тогда как остальные известные представители Е1-суперсемейства используют одну молекулу АТФ, катализ у которых часто сопряжен с реакциями транстиолирования. Стоит также обратить внимание, что белок МссВ на филогенетическом дереве (Рисунок 18) группируется с такими белками как PaaA, Rv319, GodD, ответственными за синтез вторичных метаболитов, антибиотиков или небольших сигнальных пептидов. Для этих белков также характерна потеря цистеина, принимающего участие в реакциях тиолирования, но сохранены структуры, необходимые для реакции аденилирования. Тот факт, что путем биоинформатического поиска были предсказаны возможные гомологи микроцинового оперона и, в частности, белка МссВ, позволяет предположить существование аналогичных систем синтеза микроцин С-подобных антибиотиков и в других бактериях [84]. А относительная лабильность активного центра по отношению к последовательности пептидного субстрата МссА открывает возможности поиска и получения новых антибактериальных соединений на основе MccB-MccA-системы. 70 Материалы и методы Бактериальные штаммы В работе были использованы следующие штаммы E. coli: BW25113 (lacI q rrnB T14 ΔlacZ WJ16 hsdR514 ΔaraBAD AH33 ΔrhaBAD LD78); E.coli ΔABN (то же, что BW25113, но ΔpepAΔpepBΔpepN ::Tn5::Km); E. coli BL21 (DE3) (F– ompT gal dcm lon hsdSB(rB- mB-) λ(DE3 [lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5]); E. coli DH5α Φ80lacZΔM15 (F– Δ(lacZYA-argF) U169 recA1 endA1 hsdR17 (rK–, mK+) phoA supE44 λ– thi-1 gyrA96 relA1); E. coli B; E. coli B ΔyejB; E.coli B ΔsbmA. А также штаммы других микроорганизмов: Lactobacillus johnsonii NCC 533, Synechococcus sp. CC9605. Геномная и плазмидная ДНК В работе была использована геномная ДНК бактерий Bartonella washoensis Sb944nv, Streptococcus thermophilus LMD-9, Yersinia pseudotuberculosis IP 32953, а также плазмидная ДНК HPP12 и pHPM8 из Helicobacter pylori. Питательные среды В качестве жидкой питательной среды использовали среду LB (бактотриптон 1%, дрожжевой экстракт - 0,5%, NaCl - 1%), минимальную среду М63 (KH2PO41,36%, (NH4)2SO4- 0,2% , FeSO4x7H2O - 0,5 мг/л, глюкоза - 0,2%, MgSO4 - 1 мМ). Для получения твѐрдых сред добавляли 1,3% агара, для мягкого агара M63 - 0,65% агара. Для приготовления компетентных клеток использовали супер-питательную среду SOB: 2% бактотриптон, 0,5% дрожжевой экстракт, 10 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 71 после стерилизации среды автоклавированием добавляли 10 мМ MgSO4. Для приготовления питательной среды SOC использовали среду SOB с добавлением стерильного раствора глюкозы до конечной концентрации 20 мМ. Отбор бактериальных колоний и их проверка на устойчивость к антибиотикам Для отбора клеток и проверки их устойчивости к антибиотикам аликвоты клеток высевали на селективную среду. Антибиотики добавляли до концентраций: канамицин - 50 мкг/мл, ампициллин – 50 мкг/мл, хлорамфеникол – 34 мкг/мл. Метод ПЦР В реакционную смесь объѐмом 20 мкл добавляли 2 мкл 10Х буферного раствора (200 мМ Трис-HCl, рН 8.8, 100 мМ КСl, 100 мМ (NH4)2SO4, 20 мМ MgSO4, 10% Triton X-100), 2 мкл 2,5 мМ раствора дезоксирибонуклеотидтрифосфатов, по 1 мкл 10 мкМ прямого и обратного праймеров, 1 мкл ДНК-матрицы, фермент – термостабильная Taq-ДНК-полимераза (2,5 ед. ак.) и доводили объем реакционной смеси до конечного с помощью mQ. В качестве матрицы использовали либо плазмидную или геномную ДНК (10 нг), либо колонии клеток E. coli, которые скалывали одноразовым наконечником автоматической пипетки и помещали в пробирку с реакционной смесью для ПЦР. В некоторых случаях, когда необходимо было провести ПЦР с геномной ДНК, небольшие количества клеточных осадков нагревали в 100 мкл mQ до температуры 95 oC в течение 5 минут. Далее 1 мкл полученных клеточных лизатов использовали в качестве матрицы для ПЦР. Для амплификации фрагментов ДНК длиннее 1000 п.о. использовали коммерческий набор Long PRC Enzyme mix (Thermo Scientific) в соответствии с рекомендациями производителя. 72 Программа ПЦР включала 25-30 циклов, состоящих из 3-х этапов: 1) плавление (95°С, 30 с.), 2) отжиг (50-65°С, в зависимости от температуры плавления праймера, 30 с. - 1 мин.), 3) амплификация (72°С, время определялось сообразно длине фрагмента. Было принято, что за 1 мин. синтезируется 1000 п.о.). Время амплификации в последнем цикле увеличивали до 5-10 мин. Полученные ПЦР-продукты хранили при – 20°С. Праймеры для ПЦР Название Последовательность праймеров 5'-3' MccB_Y.ps._for ATCCATGGTGAGAATACAATTAAATCG MccB_Y.ps._rev TAGCGGCCGCATGTTCATAGCGGAACTC YejA_for TATCGACTCGCTGATCAACC YejE_rev CCAAAATCGCTTTCGCTG MBP_for GATGAAGCCCTGAAAGACGCGCAG G4MccA_for ATTTAAGAATTCGGAGGAGGAGGAATGCGTACTGGTAATGC G4MccA_rev TAATATAAGCTTTTAGTTTGCATTACCAGTACGCATTCC H.p._MccB_NcoI_for AACCATGGGCAAGAAAAGAATGGCTGAG H.p._MccB_HindIII_rev TTAAGCTTTAAATTATGATTAGAGCAAAATG S.th._MccB_NdeI_for AACATATGAAATACAAAACAAGCTTAAC S.th._MccB_BamHI_rev TTGGATCCTTAATCATCTAGTGTGCCACC MccB_syn_for AAAAACCCATATGCAATTACAACTTAAG MccB_syn_rev AAAAATCGCTCAGCTGAATCAAAGATAG MBP-pepN_ColD_NdeI_for ATATCATATGAAAATCGAAGAAGGTAAAC MBP-pepN_ColD_XhoI_rev AATTCTCGAGTTAGTTTGCATTACCAGTACG MccB_ColD_NcoI_for AAAACCATGGATTATATATTGGGTCGC MccB_ColD_SalI_rev ATTAGTCGACTTACATTCTATTTCCACACACAG MBP_ColD_XhoI_rev AATTCTCGAGTTAGAATTCTGAAATCCTTCCC MccB_P12_NcoI_for ATCCATGGGACAGTGTTATCAAACTAGTT MccB_P12_XhoI_rev TACTCGAGTAAATTATGATTAGAGCAAAATAC LacJ_MccB_NcoI_for ATCCATGGGCTTTTAC LacJ_MccB_XhoI_rev ATCTCGAGTTCTCCATGACTACATATCTCGC MccB_Bw_NdeI_for CATATGGAACAGCAATATATTTTGGG MccB_Bw_XhoI_rev CTCGAGTTGTTTTGTTCCACAAACTTTGC 73 Праймеры для мутагенеза по методу Даценко-Уорнера Название YejB_Del_For1 YejB_Del_Rev1 SbmA_Del_For SbmA_Del_Rev Последовательность праймеров 5'-3' ATGGGCGCTTACCTGATTCGCCGTCTGTTGCTGGTGATCGTGTAGGCTG GAGCTGCTTC TTAACGTCCCTCAAAATCAATACGCGGATCAACCAGCGTCATATGAAT ATCCTCCTTAG TGTTAAAACGATAAGAAGTTAGCAGGAGTGCATATGTTACACGTCTTG AGCGATTG GGTTACTTCCTGAATTTTGTCACCATCCAGCTCATGATTCCGGGGATCC GTCGACCTG Электрофорез в агарозном геле ДНК пробы смешивали с буфером для нанесения, содержащего 50% глицерина и 0,025% бромфенолового синего, и наносили на гель (0,8-2,0% агарозы) под слой электрофорезного буфера ТАЭ (40 мМ Трис, 20 мМ уксусная кислота, 1 мМ ЭДТА рН 8.4). Электрофорез проводили при напряжении электрического тока 60-150 В. Извлечение фрагментов ДНК из агарозного геля При помощи скальпеля под ультрафиолетовой лампой из геля вырезали фрагмент, содержащий необходимую полосу ДНК, и помещали его в одноразовую пластиковую пробирку. Для выделения ДНК использовали набор для выделения фрагментов ДНК из агарозы, "DNA Extraction Kit" фирмы «QUAGEN», и точно следовали указаниям, приведенным в методическом руководстве. 74 Расщепление ДНК рестриктазами Рестрикцию проводили в объеме 100 мкл, в каждом случае добавляя по 10 мкл соответствующего десятикратного буфера FastDigest buffer (Thermo Scientific), ДНК фрагмент, 1 мкл эндонуклеазы рестрикции FastDigest (Thermo Scientific), инкубируя смесь при 37 0С 1 час. После реакции в некоторых случаях проводили тепловую инактивацию ферментов (20 мин., 75 °С). Лигирование фрагментов ДНК Реакцию лигирования фрагментов с совместимыми липкими концами проводили с использованием коммерческого набора Rapid DNA ligation kit (Thermo Scientific) в следующих условиях: на 10 мкл объема лигазной смеси брали 2 мкл 5х буфера Rapid ligation buffer, 1 мкл T4 ДНК-лигазы и ДНК вектора со вставкой в соотношении 1:3 или 1:1, в зависимости от размера клонируемого фрагмента. До конечного объема реакционную смесь доводили с помощью mQ. Клонирование фрагментов ДНК ОРС, кодирующие ортологи белка МссВ E. coli, были амлифицированы с помощью метода ПЦР с использованием геномной ДНК или плазмидной ДНК и праймеров: MccB_Y.ps._for и MccB_Y.ps._rev (Y. pseudotuberculosis IP 32953); S.th._MccB_NdeI_for и MccB_Bw_NdeI_for и S.th._MccB_BamHI_rev MccB_Bw_XhoI_rev (S. (B. thermophilus washoensis LMD-9); Sb944nv); H.p._MccB_NcoI_for и H.p._MccB_HindIII_rev (H. pylori, плазмида pHPM8); MccB_P12_NcoI_for и MccB_P12_XhoI_rev (H. pylori, плазмида HPP12); или с использованием клеточных лизатов и праймеров: LacJ_MccB_NcoI_for и LacJ_MccB_XhoI_rev (клеток L. johnsonii NCC533); MccB_syn_for и MccB_syn_rev (клеток Synechococcus sp. CC9605). Полученные ДНК-фрагменты клонировали в 75 экспрессионный вектор pET28a(+) с использованием следующих сайтов рестрикции: NdeI и BamHI (S. thermophillus LMD-9), NcoI и HindIII (H. pylori pHMG8), NcoI и XhoI (H. pylori pHPP12 и L. johnsonii NCC533), NdeI и XhoI (B. washoensis Sb944nv), NdeI и BlpI (Synechococcus sp. CC9605) и NcoI и NotI (Y. pseudotuberculosis IP 32953). ОРС mccB E. coli был клонирован в вектор pET32b и использованием сайтов рестрикции NcoI и BamHI (Тихонов А.А.). Фрагмент гена mccB (кодоны с 2 по 347) Y. pseudotuberculosis был клонирован в вектор pET22MBP, кодирующий белок MBP, между сайтами узнавания эндонуклеаз рестрикции XhoI и BamHI (Дубилей С.А.). Плазмидный вектор p28MBP, кодирующий белок MBP слитый с С-конца с последовательностью, кодирующей полноразмерный пептид MccA Synechococcus sp. CC9605, был предоставленн доктором Сатишем Найром (Dr. Satish Nair). Для получения фрагмента ДНК, кодирующего пептид GGGGMRTGNAN, мы использовали праймеры G4MccA_for и G4MccA_rev, с помощью которых был проведен ПЦР без добавления матрицы, тем самым амплифицировались димеры праймеров. Такой праймер-димер был очищен и клонирован в вектор pMAL-c2X между сайтами узнавания эндонуклеаз рестрикции EcoRI и HindIII. Полученный вектор был назван pMAL-MBP-pepN, а кодируемый вектором белок - MBP-pepN. ОРС mccB E. coli была амплифицирована с помощью метода ПЦР, с использованием праймеров MccB_ColD_NcoI_for и MccB_ColD_SalI_rev, и клонирована в вектор pCOLADuet-1 между сайтами узнавания эндонуклеаз рестрикции NcoI и SalI (MCS1). Такая генетическая конструкция была названа pCOL-MccB. ОРС mbp-pepN E. coli была амплифицирована с помощью метода ПРЦ, с использованием праймеров MBP-pepN_ColD_NdeI_for и MBP- pepN_ColD_XhoI_rev, и клонирована в вектор между сайтами узнавания эндонуклеаз рестрикции NdeI и XhoI (MCS2). Такая генетическая конструкция была названа pCOL-MBP-pepN. Аналогично была получена генетическая конструкция, кодирующая одновременно ОРС mbp-pepN и mccB: для клонирования использовали вектор 76 pCOL-MccB. Полученная генетическая конструкция была названа pCOL-MccBMBP-pepN. В конструкции pCOL-MccB-MBP-pepN ОРС, кодирующая белок MBPpepN, также была заменена на ОРС, кодирующую MBP без дополнительных Сконцевых последовательностей. Для этого ОРС mbp была амплифицирована методом ПЦР, с использованием праймеров MBP-pepN_ColD_NdeI_for и MBP_ColD_XhoI_rev, и клонирована в вектор pCOL-MccB между сайтов узнавания эндонуклеаз рестрикции NdeI и XhoI. Такая генетическая конструкция была названа pCOL-MccB-MBP. Мутагенез по методу Даценко-Уорнера Для инактивации генов yejB и sbmA в клетках E. coli B мы использовали метод, разработанный Даценко и Уорнером [20], с использование плазмидных ДНК: pKD46, pKD3, pKD13 и pCP20 и следующих праймеров: YejB_Del_For1, YejB_Del_Rev1, SbmA_Del_For, SbmA_Del_Rev. Приготовление химически компетентных клеток E. coli Для приготовления химически компетентных клеток использовался кальциевый метод. В 100 мл теплого SOB инокулировали 500 мкл (1:200) ночной культуры. Клетки помещали на качалку и инкубировали при 37 oC до достижения оптической плотности 0,3-0,4. После этого клетки резко охлаждали на водяной бане со льдом и далее все операции проводили на льду. Охлажденную культуру переносили в заранее охлажденные центрифужные пробирки и центрифугировали в течение 10 минут при 4 ºC, 3000 об./мин. Супернатант декантировали, осадок ресуспендировали в 45 мл холодного 0,1 М CaCl2 и инкубировали в течение 40 мин. Затем центрифугировали еще раз при тех же условиях. Осадки аккуратно ресуспендировали в 2 мл 0,1 М CaCl2 и затем добавляли стерильный 50%-ый 77 раствор глицерина до конечной концентрации ~20-25%. Далее клетки разделяли на аликвоты по 200 мкл и переносили на -70 ºС. Трансформация компетентных клеток E. coli 200 или 50 мкл замороженной суспензии клеток E. coli размораживали во льду в течение 30 минут. Добавляли ДНК (5 мкл лигазной смеси или 10-15 нг плазмидной ДНК, соответственно). Инкубировали во льду 30 мин. Затем выдерживали клетки при 42 С в течение 40 сек (heat shock) и сразу охлаждали во льду в течение 15 минут. Добавляли подогретую (37 oC) жидкую среду SOC до 0,5 мл и инкубировали при легком покачивании при 37°С 60 минут. На чашки Петри с агаризованной средой LB, содержащей соответствующий антибиотик, засевали по 100 мкл суспензии. Чашки Петри помещали в термостат на 37 °С на ночь. Пептиды Пептиды были получены методом твердофазного химического синтеза. Пептиды синтезированы ООО "Syneuro" (Москва, Россия) с чистотой 98%, а также GenScript USA Inc. (США) с чистотой более 85%. Лиофилизированные пептиды были разведены в mQ до концентрации 15 мМ, и хранились при температуре -20 °C. Для получения рекомбинантного пептида МссА Synechococcus sp. CC9605, компетентные клетки E. coli BL21(DE3) были трансформированы вектором p28MBP. Клетки растили при 37 оС на питательной среде LB с добавлением глюкозы до конечной концентрации 1% и антибиотика канамицина до достижения оптической плотности культуры 0,6 при длине волны 600 нм. После чего клеточная культура была центрифугирована при 3000g, клеточные осадки ресуспендированы в 200 мл свежей питательной среды LB с добавлением канамицина и 0,3 мМ ИПТГ, и растили при температуре 18 oC в течение ночи. После чего клетки были отделены от питательной среды 78 центрифугированием при 3500g в течение 15 мин. при +4оС и ресуспендированы в буфере CB (20 мM Трис-HCl, pH 7.4, 200 мM NaCl, 1 мM ЭДТА, 1 мM азид натрия, 0,01 M β-меркаптоэтанол и 0,1 мM ингибитора протеаз ПМСФ). Клетки были разрушены обработкой ультразвуком. Клеточные лизаты центрифугировали 30 мин. при 30000g и температуре +4оС, после чего надосадочную жидкость смешивали с 500 мкл предварительно уравновешенной амилозной смолы (Amilose Resin, NEB), и инкубировали смолу в течение 40 мин. при температуре +4оС и медленном помешивании. Далее смолу переносили в одноразовую пластиковую колонку, давали стечь клеточному лизату под действием силы тяжести, после чего смолу промыли несколькими мл буфера CB. Белки элюировали с колонки в 5 фракциях элюции объемом 500 мкл с помощью буфера CB с добавлением 10 мМ мальтозы. Фракции элюции, содержащие белок нужного размера, были объединены в одну. Белок диализовали против буфера 50 мM Трис-HCl, pH 8.0, 0,1 мM ЭДТА с добавлением 5 мМ ДТТ при температуре +4 oC, после чего обработали протеазой вируса табачной мозаики TEV (AcTEV, Invitrogen) согласно протоколу фирмы-производителя. Образовавшийся пептид отделили от остальных белков, находящихся в реакционной смеси, с помощью фильтрации с использованием фильтрационных колонок Ultracel-30K Amicon Ultra Centrifugal Filter (Millipore). После чего пептид сушили с помощью вакуумного испарителя. Сухой осадок перерастворили в mQ и хранили при -20 оС. Получение и очистка рекомбинантных белков Белок были экспрессированы в клетках E. coli BL21(DE3). Для получения растворимых белков-ортологов МссВ H. pylori, L. johnsonii NCC533, Synechococcus sp. CC9605, Y. pseudotuberculosis IP 32953 и B. washoensis Sb944nv генетические конструкции, кодирующие их открытые рамки считывания, были коэкспрессированы с вектором pG-KJE8 (Chaperone Plasmid Set, TAKARA BIO INC.), кодирующим шапероны GroEL/GroES, DnaK, DnaJ и GrpE. Клетки E. coli BL21(DE3) растили при температуре 37 oC в 200 мл 79 питательной среды LB, с добавлением 1% глюкозы и необходимого антибиотика, до достижения культурой оптической плотности 0,6 при длине волны 600 нм. После чего клетки центрифугировали при 3000g, клеточные осадки ресуспендировали в 200 мл свежей питательной среды LB с добавлением соответствующего антибиотика и индуктора 0,1 мМ ИПТГ. К клеткам, несущим плазмиду pG-KJE8, также добавляли индукторы синтеза шаперонов: 5 нг/мл тетрациклина и 2 мг/мл арабинозы. Клетки растили при температуре 18оС в течение 20 часов при постоянном помешивании со скоростью 200 об./мин. После чего клетки отделяли от питательной среды центрифугированием (+4оС, 3500g, 15 мин.). Клеточные осадки ресуспендировали в соответствующем буфере для нанесения на колонку, и разрушали клетки путем обработки ульстразвуком. Клеточные лизаты центрифугировали (30000g, +4 о С, 30 мин.), надосадочную жидкость смешивали с соответствующей смолой и инкубировали 1 час при температуре +4 оС при помешивании со скоростью 8 об./мин. Смолу переносили в чистую одноразовую колонку и давали жидкости стечь под действием силы тяжести. Далее смолу промывали несколькими объемами соответствующего буфера для промывки. Белки элюировали в 5 последовательных фракций элюции объемом 0,5 мл. Фракции, содержащие достаточное количество белка, смешивали со 100% глицерином в соотношении 1:1 и хранили при температуре -20оС. Рекомбинантный белок МссВ, а также его ортологи из H. pylori, L. johnsonii NCC533, Synechococcus sp. CC9605, Y. pseudotuberculosis IP 32953 и B. washoensis Sb944nv, были слиты с последовательностью из 6 остатков гистидина, для очистки с помощью аффинной хроматографии на Ni-смоле (His Bind Resin, Novagen). Для аффинной хроматографии использовали следующие буферные растворы: буфер для нанесения на колонку (20 мM Трис-HCl, pH 8.0, 500 мМ NaCl, 10 мM MgCl2), буфер для промывки (20 мM Трис-HCl, pH 8.0, 500 мM NaCl, 10 мM MgCl2, 50 мM имидазол), буфер для элюции (20 мM ТрисHCl, pH 8.0, 500 мM NaCl, 10 мM MgCl2, 200 мM имидазол). Белок MBP, а также рекомбинантные белки, слитые с MBP, очищали из клеточных лизатов с помощью аффинной хроматографии с использованием амилозной смолы (Amilose Resin, NEB). Для аффинной хроматографии 80 использовали следующие буферные растворы: буфер для нанесения на колонку (20 мM Трис-HCl, pH 7.4, 200 мM NaCl, 1 мM ЭДТА, 1 мM азид натрия, 0,01 M β-меркаптоэтанол и 0,1 мM ингибитора протеаз ПМСФ), буфер для промывки (20 мM Трис-HCl, pH 7.4, 200 мM NaCl, 1 мM ЭДТА, 1 мM азид натрия, 0,01 M β-меркаптоэтанол и 0,1 мM ингибитора протеаз ПМСФ), буфер для элюции (20 мM Трис-HCl, pH 7.4, 200 мM NaCl, 1 мM ЭДТА, 1 мM азид натрия, 0,01 M βмеркаптоэтанол и 0,1 мM ингибитора протеаз ПМСФ, 10 мМ мальтозы). Электрофорез белков в полиакриламидном геле (ПААГ) Для электрофоретического разделения белков в полиакриламидном геле использовали 6% концентрирующий гель (на 1 мл: 200 мкл 30% акриламида (29% акриламид + 1% бисакриламид), 130 мкл 1М Трис-HCl pH6.8, 10 мкл 10% ДСН (додецилсульфат натрия), 10 мкл 10% персульфата аммония и 2 мкл TEMED) и 13% разделяющий гель (на 5 мл: 1,7 мл смеси 40% акриламида + 0.6% бисакриламида, 1,9 мл 1М Трис-HCl pH8.7, 50 мкл 10% ДСН (додецилсульфат натрия), 50 мкл 10% персульфата аммония, 5 мкл TEMED). Образцы для нанесения на гель разводили в 1x буфере Лаеммли (на 20 мл 5x: 8 мл Трис-HCl 1М pH6.8, 1.4 мл β-меркаптоэтанола 14М, 10 мл глицерола, 2 г ДСН и дистиллированной H2O 20 мл). Перед нанесением образцы денатурировали в течение 5 минут при 95oC. Электрофорез проводили в 1хТГБ (25 мМ Трис-HCl pH 8.3, 250 мМ Глицин, 0.1% ДСН), при напряжении электрического тока 120 В до входа образцов в разделяющий гель. Затем напряжение повышали до 160 В. Электрофорез проводили в камере Mini-PROTEAN 3 Cell (Bio-Rad). После электрофореза гель окрашивали в горячей краске для окраски белковых гелей (на 500 мл: 0.2 мг Кумасси-R250 бриллиантовый синий, 30 мл HClO4 и дистиллированной H2O до 500 мл) в течение 10 мин. и отмывали горячей дистиллированной водой. 81 Аденилирование пептидов in vitro Реакцию обычно проводили в объеме 100 мкл: 7,5 мM Трис-HCl, pH 8.0, 5 мM MgCl2, 4 мM АТФ (если необходимо), 2,5 мM TCEP (Tris(2carboxyethyl)phosphine hydrochloride) и 225 мкM соответствующего пептида MccA (концентрация рекомбинантного пептида, соответствующего полноразмерному МссА Synechococcus sp. CC9605, была в 10 раз меньше, по сравнению с концентрациями пептидов, полученных методом твердофазного химического синтеза) и 5 мкM фермента МссВ. Реакции инкубировались в течение 20 часов при температуре 23 оС. В качестве отрицательного контроля выступали аналогичные реакции, но без добавления АТФ. По окончании инкубации, реакционные смеси хранили при температуре -20 оС. Масс-спектрометрический анализ (MALDI-MS и MS/MS) Масс-спектрометрический анализ образцов был проведен Серебряковой М. на приборе Ultraflextreme MALDI-ToF-ToF mass spectrometer (Bruker Daltonik), оборудованный твердотельным Nd лазером (355 нм). MH+ молекулярные ионы были измерены в режиме отражения; аккуратность измерения моноизотопного масс-пика составила 0.5 ppm. На стальной мишени смешивались 1 мкл пробы для анализа с 0.5 мкл матрицы (2,5-dihydroxybenzoic acid, Sigma- Aldrich). Тесты на чувствительность к микроцину и его аналогам В качестве штамма-индикатора использовали наиболее чувствительные к микроцину клетки E. coli B, а также изогенные штаммы E. coli B ΔyejB или E. coli B ΔsbmA. Чашку с агаризованной средой M63 заливали мягким агаром, содержащим ~ 108 клеток E. coli. Для этого в расплавленный мягкий агар (0,65%, 50oC) 82 добавляли 50-100 мкл ночной культуры клеток E. coli B, выращенных на среде M63 с питательными добавками. После застывания топ-агара на его поверхность наносили аликвоту очищенной фракции МсС (или его аналогов) или реакционных смесей, содержащих аденилированные пептиды, и инкубировали 3-5 часов при 37oC. Наличие антибактериальной активности в препарате определяли по диаметру (или площади) зон ингибирования роста клеток. Приготовление S30 клеточных экстрактов Клетки, чувствительные к микроцину С, E. coli BW25113, а также изогенный штамм ΔABN (дефектрый по генам пептидаз pepA, pepB и pepN) [43], устойчивый к действию микроцина С, растили в 200 мл питательной среды LB при температуре 37 оС, до достижения культурой клеток оптической плотности 0,5 при длине волны 600 нм. Клетки были отделены от питательной среды центрифугированием и промыты буфером (20 мM Трис-HCl, pH 8.0, 10 мM MgCl2, 100 мM KCl), после чего клетки ресуспендировали в том же буфере с добавлением ДТТ до конечной концентрации 1 мМ и разрушили путем обработки ультразвуком. Клеточные лизаты центрифугировали при 30000g и температуре +4 оС в течение 30 мин. Надосадочную жидкость отобрали, определили концентрацию белка с помощью реактива Бредфорда (Bio-Rad), разделили на аликвоты и хранили при температуре 70 оС. Реакция аминоацилирования тРНК 4 мкл S30 экстрактов (концентрация белка 2 мг/мл) смешали с 2 мкл реакционных смесей, содержащих аденилированные пептиды (см. выше), или 0,1 мМ микроцина С 1092 (положительный контроль) и инкубировали в течение 15 минут, для прохождения протеолитического процессинга пептидной части антибиотика. Через 15 минут к экстрактам был добавлен реакционный буфер (30 мM Трис-HCl, pH8.0, 30 мM KCl, 8 мM MgCl2, 1 мM ДТТ, 3 мM ATФ, 5 мг/мл 83 тотальной тРНК (тРНК из E. coli MRE 600, Roche Diagnostics) и 40 мкM 14 C-Asp. Такие смеси инкубировали в течение 5 минут при комнатной температуре. Продукты реакции осадили на бумажные фильтры (Whatman 3MM paper, SigmaAldrich) холодной 10% трихлоруксусной кислотой и подготовили для сцинтилляционного счетчика. Процессинг пептидов МссА в S30 экстрактах По 2,5 мкл 5 мМ пептидов MRTGNAN и MDHIGFN смешали с 5 мкл S30 экстрактов E. coli BW25113. Реакции инкубировали 0, 5, 15 и 60 минут при комнатной температуре. Реакции останавливали перенесением 1 мкл реакционной смеси в 99 мкл 0,5% трихлоруксусной кислоты. Такие смеси были проанализированы с помощью масс-спектрометрии. Аминопропилирование аденилированного пептида MHRIMKDАМФ L. johnsonii in vitro 50 мкМ аденилированного пептида MHRIMKD-АМФ L. johnsonii смешали с ферментами MccD, MccE и белком Mtn до конечной концентрации 5 мкМ, 1 мкМ и 5 мкМ соответственно. Реакции проводили в буфере 100 мM Трис-HCl pH 7.5, 50 мM NaCl, 10 мM MgCl2 и 200 мкM SAM при температуре 25оС в течение 16 часов. Реакцию ингибировали охлаждением до -20оС. Образование продуктов реакции подтверждали с помощью масс-спектрометрии. Введение радиоактивной метки in vitro Реакции были поставлены в объѐме 50 мкл: 7.5 мM Трис-HCl pH8.0, 10 мM MgCl2, 4 мМ ДТТ, 4 мкМ МссВ E. coli, 2,5 мМ АТФ и 0,75 мкМ [α-32P]-АТФ (3000 84 Кю/ммоль). В реакционные смеси были добавлены субстраты: 4 мкМ MBP-pepN или 200 мкМ пептида MRTGNAN. Контрольные реакции не содержали субстрат для МссВ E. coli. Реакции инкубировали при температуре 23оС в течение 24 часов. Для того чтобы удостовериться, что за время инкубации белок МссВ аденилировал свои субстраты, аликвоты по 10 мкл реакционных смесей были помещены на поверхность мягкого агара, содержащего клетки E. coli B, клетки инкубировали несколько часов при 37оС (как описано выше) и детектировали образование зон ингибирования роста клеток под действием реакционных смесей, содержащих пептид MRTGNAN. Далее аликвоты по 10 мкл реакционных смесей были нанесены на денатурирующий 10% ПААГ и разделены в электрическом поле. После чего гель окрасили с помощью Кумасси R-250 бриллиантового синего, сфотографировали и сделали радиоавтограф. Проверка токсичности аденилированного белка in vivo Клетки E. coli BL21(DE3) трансформировали генетическими конструкциями pCol-MccB-MBP и pCol-MccB-MBP-pepN и растили на питательной среде LB (с добавлением канамицина и 1% глюкозы) при температуре 37оС и постоянном помешивании ночь. Далее аликвоты клеточной культуры переносили в свежую среду LB с добавлением канамицина и 0,1 мМ ИПТГ до достижения конечной оптической плотности культуры 0,1 при длине волны 600 нм. Далее клетки растили при температуре 37оС и постоянном помешивании в течение 7 часов. Через каждые 30 минут в отбирали 100 мкл клеточной культуры для измерения ее оптической плотности при длине волны 600 нм. Определение продуктов реакции с помощью ВЭЖХ Продукты реакции аденилирования белками MccB своих пептидных субстратов анализировали с помощью обратно-фазовой С-18 ВЭЖХ. Из реакционных смесей предварительно удаляли белки путем осаждения 85 подкисленным ацетонитрилом (к реакционной смеси добавляли равный объем охлажденного 100% ацетонитрила с добавлением 0,1% трифторуксусной кислоты, тщательно перемешивали и инкубировали смеси на льду в течение 10 минут, после чего отделяли белковый осадок от растворимой пептидной фракции центрифугированием при 30000g, +4оС в течение 15 мин. Надосадочную жидкость отбирали в чистую пробирку и сушили с помощью вакуумного роторного испарителя SpeedVac. Осадки перерастворяли в mQ). Разделение продуктов реакции проводили с помощью ВЭЖХ хроматографа Breeze (Waters) с использованием С-18 хроматографической колонки (4.6x150 мм, XSELECT HSS C-18 3.5 мкм, Waters) при скорости тока растворителя 2 мл/мин и градиенте растворителя 0-10% Б в течение 10 мин., затем 10-50% Б за 40 мин. (растворитель A: 0,1% трифторуксусная кислота; растворитель Б: 100% ацетонитрил). Соответствие хроматографических пиков продуктам и реагентам реакции проверяли с помощью масс-спектрометрии. Для аналитических целей мы использовали прибор Милихром-02 (Эконова). Разделение проводили на С-18 колонке (2х75 мм, заполненной сорбентом ProntoSIL 120-5-C18 AQ (Bischoff Analysentechnik und Geräte GmbH, Германия)) при скорости тока растворителя 150 мкл/мин. (растворитель A: 0,005 М HClO4, 0,2 M LiClO4; растворитель Б: 100% ацетонитрил). Анализ хроматографических пиков проводили с помощью ПО Мультихром (Эконова). Биоинформатический анализ белковых последовательностей В работе использовали полные и частичные геномные нуклеотидные последовательности, а также белковые последовательности, доступные на вебсайте Национального Центра (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). последовательностей биотехнологической Для использовали поиска информации гомологичных программу BLAST (США) белковых [4]. Множественное выравнивание белковых последовательностей проводили при помощи программы ClustalW [49] и Expresso (T-Coffee) [65]. Анализ кристаллических белковых структур проводили с помощью ПО PyMol. 86 Построением филогенетических деревьев занималась Макарова К. Было проанализировано 2262 полностью секвенированных генома бактерий и архей, находящихся в базе данных Refseq [72] на момент февраль-март 2013. 87 Результаты работы Часть 1. Изучение ортологов белка МссВ и микроцин С-подобных соединений, закодированных в mcc-подобных оперонах бактерий, отличных от Escherichia coli Анализ результатов биоинформатического поиска гомологов микроцинового оперона До сегодняшнего дня единственным известным организмом, способным продуцировать микроцин С, была кишечная палочка. О существовании других микроцин С-подобных соединений не было известно. В то же время потенциальные гомологи микроцинового оперона были предсказаны в статье Северинова и соавторов [84]. В нашей работе мы поставили себе целью подтвердить сделанные ранее предсказания. Для исследований были выбраны микроорганизмы, несущие на плазмидах или в своем геноме потенциальные гомологи генов микроцинового кластера и относящиеся как к группе Граммотрицательных бактерий (Bartonella, Helicobacter, Yersinia), так и к Граммположительным (Lactobacillus, Streptococcus) и цианобактериям (Synechococcus) (Рисунок 29). 88 Рисунок 29. Гены микроцинового кластера E. coli и их потенциальные гомологи, кодируемые другими бактериями. В верхнем ряду представлена схема генов микроцинового кластера E. coli. Отдельные гены показаны толстыми цветными стрелками (mccA – красным, mccB – желтым, mccC – зеленым, mccD – розовым, mccE – фиолетовым, mccF – синим), под которыми расположены их идентификаторы в базе данных белковых последовательностей. Ниже представлены кластеры генов-гомологов из различных микроорганизмов. Относительный размер ОРС mccA не соблюден. Серыми стрелками в опероне Y. pseudotuberculosis показаны гены (сходны с метилтрансферазами и yqcI/ycgG генами), не имеющие гомологии с известными генами микроцинового кластера E. coli. Потенциальный гомолог mccB из Y. pseudotuberculosis содержит дополнительный участок (показан коричневым), кодирующий метилазный домен. В опероне Synechococcus sp. CC9605 также есть гены (кодируют ABC-транспортер, окрашены бирюзовым), не имеющие гомологов среди генов микроцинового кластера E. coli. Потенциальные гены mccA, как правило, располагаются в непосредственной близости от ОРС предполагаемого гомолога МссВ. Кодируемые ими пептиды содержат на С-конце остаток аспарагина, аналогично МссА E. coli (Таблица 4). При этом предсказанные пептиды имеют длину 7 аминокислот, аналогично МсcА E. coli, в случае Bartonella, Helicobacter, Lactobacillus и Streptococcus, а у Yersinia и Synechococcus длина этих пептидов значительно больше. 89 Таблица 4. Последовательности предсказанных пептидов МссА, закодированных в оперонах гомологичных микроциновому оперону E. coli, найденных у различных бактерий. Для каждого микроорганизма, название которого указано в левой колонке, приведена аминокислотная последовательность предсказанного пептида МссА (правая колонка). Пептидная последовательность приведена с использованием однобуквенного кода аминокислот, С-концевой аспарагин выделен жирным шрифтом. Организм MccA Escherichia coli pMccC7 плазмида MRTGNAN Bartonella washoensis Sb944nv MDHIGFN Helicobacter pylori плазмиды HPP12 и MKLSYRN pHPM8 Lactobacillus johnsonii NCC 533 MHRIMKN Streptococcus thermophilus LMD-9 MKGTILN Yersinia pseudotuberculosis IP 32953 MYQVGIILSIKCN MHQSEIKLTKRLKIKRVDVNKVKEQQKKVLECGAATCGG Yersinia pseudotuberculosis PB 1/+ GSN MTQPNDRQLSNEELSDVAAGLFRRTFFKPRTSRKTLLQP Synechococcus sp. CC9605 KRLDKVAKNQLWADMMN Энзиматический синтез аденилированных пептидов in vitro Как известно, центральным участником процесса синтеза антибиотика микроцина С является белок МссВ, который вносит первую и наиболее важную пост-трансляционную модификацию - аденилирует пептид MccA по C-концевой аминокислоте с образованием активного антибиотика – пептид-аденилата МсС1092 (MRTGNAD-АМФ). В своей работе мы применили метод in vitro синтеза МсС1092 с использованием химически синтезированного пептида MRTGNAN, рекомбинантного очищенного фермента МссВ и АТФ, описанный ранее в работе Уолша и соавторов [77]. Мы успешно воспроизвели этот метод в нашей лаборатории и получили продукт аденилирования пептида MRTGNAN. 90 Образование аденилированного продукта контролировали с помощью ВЭЖХ и масс-спектрометрического анализа (Рисунок 30). Рисунок 30. Продукты реакции in vitro аденилирования предсказанных пептидов MccA гомологами MccB. В качестве пептидного субстрата MccA для предполагаемых белков гомологов MccB использовали пептиды, закодированные в соответствующих оперонах. В случае E. coli (A), B. washoensis Sb944nv (Б), H. pylori плазмида HPP12 (В), L. johnsonii NCC 533 (Г), S. thermophilus LMD-9 (Д), Y. pseudotuberculosis PB1/+ (Е) использовались полноразмерные пептиды. В случае Synechococcus sp. CC9605 использовались как полноразмерные пептиды (Ж), так и укороченные варианты длиной 25 (З) и 20 (И) аминокислот. Продукты реакций анализировали с помощью MALDI-TOF масс-спектрометрии. На нижнем спектре каждой панели представлены результаты, 91 полученные после инкубации пептидов вместе с АТФ и соответствующим ферментом МссВ. Верхние спектры на каждой панели – контроли, реакции без добавления АТФ. Массы исходных пептидов и продуктов реакции (сдвиг массы +329 ед.м. относительно массы исходного пептида, соответствует присоединению молекулы АМФ) обозначены цифрами над соответствующими пиками. Звездочкой обозначены пики, соответствующие массе интермедиатов - сукцинимидных производных МссА пептидов (сдвиг массы -18 ед.м. относительно массы исходного пептида, что соответствует отщеплению воды в процессе циклизации аспарагина (Рисунок 12) [77]). Мы клонировали ОРС предполагаемых гомологов МссВ из H. pylori (плазмид pHPM8 и HPP12), S. thermophilus LMD-9, L. johnsonii NCC 533, B. washoensis Sb944nv, Y. pseudotuberculosis IP32953 и Synechococcus sp. CC9605 в векторы для гетерологичной экспрессии в системе E. coli BL21 (DE3) и получили очищенные рекомбинантные белки. Полноразмерный белок гомолог МссВ из организма Y. pseudotuberculosis IP32953 плохо нарабатывался в данной системе. Этот белок в отличие от других исследуемых гомологов, помимо Е1-домена и пептид связывающего N-концевого участка, характерных для МссВ E. coli, содержит на своем С-конце не охарактеризованный метилазный домен. Мы предположили, что низкий уровень синтеза этого белка может быть связан с тем, что дополнительный метилазный домен оказывает влияние на укладку белка в экспрессионной системе E. coli. В связи с этим мы получили укороченную версию гомолога МссВ из Y. pseudotuberculosis, в которой отсутствовал С-концевой домен. Такой белок обладал хорошей растворимостью и синтезировался в клетках кишечной палочки на достаточном уровне. Мы приняли решение использовать укороченную версию белка для дальнейших экспериментов. Предсказанные пептидные субстраты гомологов МссВ были получены методом твердофазного химического синтеза. Исключение составил предполагаемый пептидный субстрат гомолога МссВ из организма Synechococcus sp., который имеет длину 56 а.к. Такой длинный пептид достаточно сложно синтезировать химически. Поэтому он был получен в виде предшественника – рекомбинантного слияния с белком MBP (Maltose binding protein). Такой химерный белок обрабатывали TEV протеазой, в результате чего отщеплялся пептид длиной 58 а.к., который отличался от предсказанного субстрата 92 МссА из организма Synechococcus sp. тем, что не содержал N-концевого метионина и нес три дополнительные аминокислоты (SGS) на N-конце. Полученные рекомбинантные гомологи белка МссВ тестировали на способность аденилировать предсказанные пептидные субстраты в условиях, оптимизированных для фермент-субстратной пары МссВ-MccA E. coli. В качестве отрицательного контроля использовали реакционные смеси без добавления АТФ. Следует отметить, что количество рекомбинантного пептида из организма Synechococcus sp. CC9605 было как минимум в 10 раз меньше по сравнению с количествами синтетических пептидов, что связано с трудностями получения такого пептида в гетерологичной системе экспрессии в E. coli и его частичной протеолитической деградацией анализировали помощью с в процессе MALDI-TOF очистки. Продукты масс-спектрометрии; реакций результаты представлены на рисунке 30. Как видно из рисунка, предсказанные гептапептидные гомологи МссА из B. washoensis Sb944nv (MDHIGFN), S. thermophilus LMD-9 (MKGTILN) и L. johnsonii NCC 533 (MHRIMKN) узнаются и аденилируются соответствующими ферментами-гомологами МссВ (Рисунок 30, Б, Г, Д). В работе Северинова и соавторов также предсказан оперон генов синтеза микроцина C, находящийся в геноме Bartonella henselae str. Houston-1, который отличается от аналогичного оперона из организма B. washoensis Sb944nv в первую очередь тем, что кодирует МссА-подобный пептид с последовательностью MDYRNYNA [84]. При этом аминокислотные последовательности белковортологов MccB из этих двух организмов очень похожи (идентичность 85%). Мы протестировали этот пептид в реакции с белком-ортологом МссВ из организма B. washoensis Sb944nv, но не обнаружили продуктов реакции аденилирования. Предсказанный пептид MKLSYRN, кодируемый геном, расположенным на плазмидах H. pylori pHPM8 и HPP12, аденилируется белком МссВ, кодируемым плазмидой HPP12 (Рисунок 30, В), но не узнается аналогичным белком, кодируемым плазмидой pHPM8. При сравнении нуклеотидных последовательностей двух генов mccB мы выявили, что в старт-кодоне гена mccB, кодируемого плазмидой pHPM8, произошла замена аденина A на гуанин G, сделавшая этот старт-кодон не функциональным. В результате, трансляция этого 93 белка начинается со старт-кодона, расположенного ниже, но в той же рамке (Рисунок 31). Рисунок 31. Сравнение нуклеотидных последовательностей гомологичных участков микроцин С-подобных оперонов расположенных на плазмидах HPP12 и pHPM8 из H. pylori. На рисунке представлено нуклеотидное выравнивание участков ДНК, кодирующих ген mccA (показан серым) и начальный участок гена mccB (показан желтым), сделанное с помощью ПО ClustalW. Аннотированные стартовые кодоны выделены жирным шрифтом с подчеркиванием. Нуклеотидные позиции, полностью совпадающие между двумя последовательностями, помечены звездочкой, нуклеотидные замены - точкой или пробелом, инсерция нуклеотида обозначена тире. Красным отмечена открытая рамка считывания, аннотированная группой исследователей под руководством Сары МакИнтир как кодирующая пептидный предшественник антибиотика (микроцина) [73]. Поэтому аннотированное начало гена-гомолога mccB, расположенного на плазмиде pHPM8, отличается от начала гена-гомолога mccB с плазмиды HPP12: в белке, кодируемом первым геном, отсутствует часть N-концевого домена (46 аминокислот) необходимого для связывания пептидного субстрата МссВ [76]. Этим может объясняться отсутствие энзиматической активности у рекомбинантного фермента MccB, кодируемого плазмидой pHPM8. На основании полученных результатов, мы сделали вывод, что оперон, кодирующий гомологи 94 генов микроцинового кластера, расположенный на плазмиде pHPM8 не функционален, а ген-гомолог mccB должен рассматриваться как псевдоген. Обычно размер пептидных субстратов для предполагаемых гомологов МссВ составляет 7 аминокислотных остатков. Исключениями являются предсказанные опероны из Synechococcus sp. и Y. pseudotuberculosis, которые предположительно кодируют удлиненные пептидные субстраты. Мы показали, что белок-гомолог МссВ из организма Synechococcus sp. CC9605 узнает и аденилирует полноразмерный субстрат MccA длиной 58 аминокислот (Рисунок 30, Ж). Однако, нам не удалось получить аденилированного продукта в реакции с предсказанным МссА из Y. pseudotuberculosis IP32953 длиной в 13 а.к. (Таблица 4) [84] (данные не представлены). Следует отметить, что предсказанный пептид был сильно гидрофобным и практически не растворялся в воде. В более поздней аннотации генома близкородственного организма Y. pseudotuberculosis PB1/+ (NC_010634.1), у которого также предсказаны вероятные гомологи генов микроциного оперона, предложена альтернативная открытая рамка считывания, кодирующая потенциальный пептид гомолог MccA длиной 42 а.к. (YP_001872354.1) (Таблица 4). Аналогичный ген можно найти в геноме Y. pseudotuberculosis IP32953 недалеко от предполагаемого гомолога mccC. Мы получили такой пептид методом химического синтеза и использовали его в качестве субстрата для рекомбинантного белка-гомолога МссВ Y. pseudotuberculosis IP32953. В результате реакции нам удалось получить аденилированный продукт (Рисунок 30, Е). Таким образом мы подтвердили более позднее биоинформатическое предсказание и опровергли сделанное ранее предсказание для фермент-субстратной пары MccA-MccB Y. pseudotuberculosis. Все другие предсказания фермент-субстратных пар оказались верными (за очевидным исключением тех случаев, когда mcc опероны содержали псевдогены). Важно отметить, что все МссВ-подобные белки были строго специфичны по отношению к пептидному субстрату, так мы наблюдали аденилирование только аутогенного (соответствующего ферменту) пептида; пептиды, имеющие аллогенное происхождение, не распознаются и не аденилируются (данные не представлены). Практически во всех реакциях, в которых мы наблюдали образование аденилированного продукта, на масс-спектрах также обнаруживался пик с массой 95 на 18 ед.м. меньшей массы исходного пептида (Рисунок 30). Этот пик соответствует образованию соответствующего МссА, интермедиата что является - сукцинимидного указанием на то, производного что механизм энзиматической реакции у всех исследованных гомологов сходен с описанным для МссВ E. coli [77], т.е. является универсальным. Биологическая активность аденилированных пептидов Наличие аденилировать функциональных соответствующие МссВ-подобных пептидные ферментов, субстраты, говорит способных в пользу функциональной активности оперонов, гомологичных оперону генов синтеза микроцина С E. coli. Известно, что микроцин С, продуцируемый кишечной палочкой, активен против близкородственных видов бактерий, большей частью других энтеробактерий, в том числе и самих E. coli, которые не несут генов микроцинового кластера. Аналогично, можно предположить, что микроцин Сподобные соединения, продуцируемые описанными выше бактериями, также активны против близкородственных видов или представителей других родов, занимающих общую экологическую нишу с бактериями-продуцентами микроцина. В виду отсутствия технической возможности протестировать антибактериальную активность полученных аденилированных пептидов на близкородственных штаммах, не несущих ортологов генов микроцинового оперона, мы приняли решение протестировать эти микроцин С-подобные соединения на клетках E. coli. Аденилированные пептиды - аналоги микроцина С были получены in vitro в реакциях, подробно описанных выше. В качестве отрицательного контроля использовались аналогичные реакции без добавления АТФ. По окончании инкубации мы наносили по 10 мкл реакционной смеси на свежий газон клеток E. coli B (Таблица 5). В качестве отрицательного контроля использовали изогенный штамм E. coli B, в котором был делетирован ген yejB, кодирующий одну из субъединиц транспортера YejABEF, отвечающего за вход микроцина С в клетку [67]. 96 Таблица 5. Антибактериальная активность McC1092-подобных соединений, полученных in vitro. Аденилированные пептиды (последовательность приведена во второй колонке) были получены в реакции in vitro между соответствующими пептидами МссА и ферментами MccB. Происхождение субстрата и фермента указано в первой колонке "Источник". Для рекомбинантного MccA из Synechococcus sp. CC9605 три гетерологичные N-концевые аминокислоты отмечены жирным шрифтом. Продукты реакции наносили на газоны трех штаммов клеток E. coli B. Знаком "+" отмечены случаи, когда наблюдалось образование четких зон ингибирования роста, знаком "-" - случаи, когда появления зон ингибирования роста клеток не наблюдалось. Знаком "*" показаны результаты, полученные с использованием синтетических пептидов, соответствующих 25 и 20 С-концевым аминокислотам МссА Synechococcus sp. CC9605. В графе, отмеченной "Microcin B”, показаны результаты, полученные при нанесении на газоны зрелого микроцина В E. coli (использовался, как контроль на SbmA-зависимый, YejABEFнезависимый транспорт). Верхним апострофом обозначены пробы, в которых количество исходного пептида, взятого для реакции аденилирования, было, как минимум, на порядок меньше по сравнению с остальными реакциями. E. coli B E. coli B ΔyejB E. coli B ΔsbmA MRTGNAD-AMP (+) (-) (+) B. washoensis Sb944nv MDHIGFD-AMP (-) (-) (-) H. pylori P12 MKLSYRD-AMP (+) (-) (+) L. johnsonii NCC 533 MHRIMKD-AMP (+) (-) (+) S. thermophilus LMD-9 MKGTILD-AMP (+) (-) (+) Y. pseudotuberculosis PB1/+ MHQSEIKLTKRLKIKRVDVNKVKE QQKKVLECGAATCGGGSD-AMP (-) (-) (-) Synechococcus sp. CC9605 SGSTQPNDRQLSNEELSDVAAGLF RRTFFKPRTSRKTLLQPKRLDKVA KNQLWADMMD-AMP (-)' (-)' (-)' Synechococcus sp. CC9605* SRKTLLQPKRLDKVAKNQLWADMM D-AMP (+) (+) (-) Synechococcus sp. CC9605* LQPKRLDKVAKNQLWADMMD-AMP (-) (-) (-) E. coli Microcin B (+) (+) (-) Источник E. coli Аденилированный пептид 97 Как можно видеть из таблицы 5, реакции, содержащие аденилированные пептиды из E. coli, S. thermophilus LMD-9, L. johnsonii NCC 533 и H. pylori, ингибируют рост клеток E. coli B дикого типа. При этом размер зон ингибирования роста варьирует незначительно (10 мм ± 2 мм). Мы не наблюдали образования зон ингибирования роста при нанесении продуктов реакции на мутантные клетки E . coli B ΔyejB, что указывает на сходный с МсС1092 E. coli механизм проникновения аденилированных пептидов МссА из S. thermophilus LMD-9, L. johnsonii NCC 533 и H. pylori через транспортер YejABEF [67]. Продукты реакций аденилирования пептидов МссА из B. washoensis Sb944nv и Y. pseudotuberculosis IP32953 не образовывали зон ингибирования роста на газонах клеток E. coli B. В связи с этим, мы предположили, что эти микроцин Сподобные соединения либо не проникают в клетку, либо не подвергаются протеолизу в цитоплазме кишечной палочки с высвобождением токсина, ингибирующего аспартил-тРНК-синтетазу. Продукт аденилирования полноразмерного рекомбинантного пептида МссА (динной 58 а.к.) из организма Synechococcus sp. CC9605 при нанесении на газон клеток кишечной палочки, также не ингибировал рост E. coli B (Таблица 5). Следует заметить, что количества рекомбинантного полноразмерного пептида в реакционной смеси было на порядок меньше количеств синтетических пептидов, использованных в реакциях с другими МссВ-подобными белками. Таким образом отсутствие зон ингибирования роста может быть связано с разницей в концентрациях аденилированных продуктов. В связи с этим мы решили протестировать укороченные версии пептида МссА Synechococcus sp. CC9605, полученные методом твердофазного химического синтеза. Для этого синтетические пептиды, соответствующие С-концевым участкам МссА Synechococcus sp. CC9605 длиной 25, 20, 15 и 10 а.к., были добавлены к соответствующему рекомбинантному ортологу МссВ в присутствие АТФ. Анализ продуктов реакции с помощью массспектрометрии показал, что ортолог МссВ узнает и аденилирует только два из четырех пептидов, длиной 20 и 25 а.к. (Рисунок 30, З, И, данные для пептидов длиной 10 и 15 а.к. не представлены). Реакционная смесь, содержавшая аденилированный пептид длиной 25 а.к., приводила к образованию зон ингибирования роста как на газоне клеток дикого типа, так и на мутантных клетках 98 E. coli B ΔyejB (Таблица 5). Следовательно, это микроцин С-подобное соединение, вероятно, проникает в клетку альтернативным путем, обеспечивающим транспорт удлиненных пептидов. Одним из известных транспортеров такого типа является белок SbmA, который служит для входа в клетку другого, значительно более крупного, по сравнению с микроцином С, антибиотика, - микроцина В [80]. Мы решили протестировать мутантные клетки E. coli B ΔsbmA на чувствительность к исследуемым микроцин С-подобным соединениям. Как видно из результатов, приведенных в таблице 5, гептапептидные микроцин С-подобные соединения и МсС1092 при нанесении на газон таких клеток образовывали зоны ингибирования роста. В то же время эти клетки проявляли устойчивость к действию аденилированного пептида длиной 25 а.к. из Synechococcus sp. CC9605. Как и ожидалось, E. coli B ΔsbmA также оказались устойчивыми к действию микроцина В. Таким образом микроцин С-подобное соединение с пептидной частью длиной 25 а.к. проникает в клетки посредством транспортера SbmA. Продукты реакции аденилирования пептида длиной 20 а.к. из организма Synechococcus sp. CC9605 не приводили в образованию зон ингибирования роста на газонах тестируемых штаммов (Таблица 5). По всей видимости, длина такого продукта уже слишком велика, чтобы проникнуть через транспортер YejABEF, но слишком мала, чтобы транспортироваться в цитоплазму посредством белка SbmA. Как следует из данных таблицы 5 транспортер YejABEF не специфичен к последовательности пептидной части микроцин С-подобных соединений. Активность аденилированных пептидов in vitro Чтобы убедиться, что механизм действия изучаемых аденилированных пептидов аналогичен механизму действия микроцина С, мы протестировали их способность ингибировать аспартил-тРНК-синтетазу in vitro. Для этого мы добавляли аликвоты реакционных смесей, содержащих соответствующие аденилированные пептиды, к S30 экстрактам клеток E. coli BW25113. В качестве отрицательного контроля добавляли реакционные смеси без АТФ. После чего экстракты инкубировали в течение 15 минут. В случае микроцина С E. coli этого 99 времени достаточно для того, чтобы произошел процессинг и высвободившийся токсин связался с аспартил-тРНК-синтетазой [43, 60]. Активность аспартил-тРНКсинтетазы регистрировали путем измерения количества включения радиоактивно меченного аспартата 14С-Asp во фракцию тРНК (Рисунок 32). Рисунок 32. Ингибирование аспартил-тРНК-синтетазы различными аналогами МсС1092. MccA-подобные пептиды после аденилирования соответствующими ферментами МссВ смешивали с S30 экстрактами E. coli BW25113 и инкубировали в течение 15 минут для процессинга и связывания токсина с аспартил-тРНК-синтетазой. На диаграмме представлено относительное включение 14 С-Asp во фракцию тРНК: cpm не растворимой в кислоте фракции при добавлении реакции, содержащей аденилированный продукт, нормировали на cpm не растворимой в кислоте фракции при добавлении реакций без АТФ (отрицательный контроль). Как видно из приведенного рисунка, добавление реакционной смеси, содержащей MccA, MccB E. coli и АТФ уменьшает включение 14С-Asp во фракцию тРНК аспартил-тРНК-синтетазой приблизительно на один порядок относительно контроля (добавление MccA и MccB без АТФ). Сопоставимое уменьшение включения 14 С-Asp во фракцию тРНК наблюдалось при использовании МссА- подобных пептидов и МссВ ферментов из других микроорганизмов. Исключение составили реакционные смеси, содержащие аденилированные пептиды из B. washoensis Sb944nv и Y. pseudotuberculosis, которые слабо ингибировали 100 активность аспартил-тРНК-синтетазы (соответственно, около 50% и 90% от уровня включения радиоактивной метки в отрицательных контролях). Мы предположили, что низкая ингибирующая активность аденилированных пептидов из B. washoensis Sb944nv и Y. pseudotuberculosis связана с замедленным, по сравнению с микроцином С, протеолитическим процессингом пептидной части этих соединений в S30 экстрактах E. coli BW25113. Это предположение проверили, оценив скорость процесса деградации не модифицированных пептидов МссА B. washoensis Sb944nv и E. coli в S30 экстрактах E. coli BW25113 с помощью массспектрометрии (Рисунок 33). Рисунок 33. Сравнение скорости протеолиза пептидов МссА из E. coli и B. washoensis Sb944nv в клеточных экстрактах E. coli. Смесь пептидов была добавлена к S30 клеточным экстрактам, полученным из E. coli BW25113. В определенные моменты времени (отмечены справа на рисунке) отбирались аликвоты и анализировались с помощью MALDI-TOF масс-спектрометрии. Представлены полученные масс-спектры. Над пиками исходных пептидов показаны их массы в Да (Mw E.coli(MRTGNAN) = 763 Да, MwB.washoensis(MDHIGFN) = 833 Да). Сдвиги масс, соответствующие отщеплению аминокислот со стороны N-конца, показаны в виде горизонтальных линий, в центре которых приведено название отщепленного аминокислотного остатка с использованием однобуквенного кода. 101 Из приведенного рисунка следует, что после первых 5 минут инкубации с приблизительно одинаковой эффективностью у обоих пептидов (MwE.coli(MRTGNAN) = 763 Да, MwB.washoensis(MDHIGFN) = 833 Да) отщепляется Nконцевой метионин (MwE.coli(RTGNAN) = 632 Да, MwB.washoensis(DHIGFN) = 702 Да). Через 15 минут инкубации в клеточном экстракте пик с молекулярной массой 632 Да, соответствующий пептиду МссА E. coli с отщепленным N-концевым метионином (RTGNAN), практически не идентифицируется, также как и другие продукты его протеолитической деградации. Эти данные соответствуют известной скорости деградации микроцина С и временем необходимым для ингибирования аспартил-тРНК-синтетазы [43, 60]. Напротив, через 15 минут после начала эксперимента пептид MDHIGFN (Mw = 833 Да) B. washoensis Sb944nv и его производное DHIGFN (Mw = 702 Да), потерявшее N-концевой метионин, сохраняются в клеточном экстракте и не претерпевают дальнейшего протеолиза. Масс-спектрометрические пики, соответствующие дальнейшей протеолитической деградации пептида B. washoensis Sb944nv за счет действия N-концевых пептидаз, обнаруживаются только через 60 минут инкубации с клеточным экстрактом. Полученные данные следует рассматривать как качественные, а не количественные. Тем не менее, эти результаты объясняют низкий уровень ингибирования ферментативной активности аспартил-тРНК-синтетазы микроцин С-подобным соединением, полученным на основе пептида MDHIGFN, в предыдущих экспериментах (Рисунок 32). Биологическая активность аминопропилированных микроцин Сподобных соединений Процесс созревания микроцина С E. coli сопряжен с внесением нескольких пост-трансляционных модификаций в MccA пептид MRTGNAN: аденилирование пептида по С-концевой аминокислоте ферментом МссВ и аминопропилирование получившегося аденилированного пептида ферментами MccD и MccE (Рисунок 4). Такой аминопропилированный микроцин МсС1149 по сравнению с вариантом, не подвергшимся аминопропилированию (МсС1092), проявляет значительно большую 102 антибактериальную активность по отношению к E. coli, а микроциновый токсин (негидролизуемый аспартил-аденилат), содержащий аминопропильную группировку, ингибирует аспартил-тРНК-синтетазу приблизительно в 10 раз эффективнее [61]. аденилированного Мы решили пептида сравнить антибактериальную MHRIMKD-АМФ L. johnsonii активность и его аминопропилированного аналога, полученного энзиматически in vitro. Для этого мы провели очистку аденилированного пептида MHRIMKD-АМФ, образовавшего в ходе ферментативного синтеза в реакции с L. johnsonii МссВ in vitro, с помощью ВЭЖХ. Чистоту образца подтвердили масс-спектрометрически. Полученный пептид-аденилат модифицировали в реакции с ферментами MccD и MccE E. coli in vitro (ферменты для аминопропилирования любезно предоставлены Дубилей С. А. и Куликовским А. Д.). В качестве контроля использовалась аналогичная реакция но без добавления SAM, который служит донором ацетильной группировки в реакции аминопропилирования. Образование продуктов реакции подтвердили с помощью масс-спектрометрического анализа. Аминопропилированный пептид-аденилат (реакционные смеси с добавление SAM) и не аминопропилированный контроль (реакционные смеси без добавления SAM) наносили на газон E. coli B в четырех последовательных разведениях (5 мкМ, 2,5 мкМ, 1,25 мкМ и 0,63 мкМ пептидного антибиотика). После нескольких часов инкубации клеток при температуре 37 oC наблюдали образование зон ингибирования роста (Рисунок 34). Рисунок 34. Сравнение антибактериальных активностей микроцин С-подобных соединений L. johnsonii, несущих аминопропильную модификацию и без неѐ. На рисунке представлена фотография газона клеток E. coli B, на поверхность которого были нанесены указанные микроцин С-подобные соединения в нескольких разведениях. Ряд L.j.McC1258 демонстрирует зоны ингибирования роста, образовавшиеся при нанесении на газон E.coli B контрольной реакции (без добавления SAM), содержащей аденилированный пептид MHRIMKD-АМФ с молекулярной массой 1258 Да. В ряду L.j.McC1315 показаны 103 зоны ингибирования роста, образовавшиеся при нанесении на газон E.coli B реакционных смесей, содержащих аминопропилированный пептид MHRIMKD-АМФ с молекулярной массой 1315 Да. Концентрации антибактериальных соединений в образцах, нанесенных на газон клеток, указаны над фотографией. Как следует из приведенного рисунка, аминопропилированный аналог микроцина С L. johnsonii проявляет как минимум в 4 раза большую антибактериальную активность, по сравнению с не аминопропилированным MHRIMKD-АМФ. Филогенетическое древо МссВ-подобных аденилат-трансфераз По результатам наших исследований, нам удалось показать аденилаттрансферазную активность МссВ-подобных белков, схожесть механизма катализа реакции аденилирования пептидов и антибактериальное действие аденилированных продуктов реакции. Таким образом мы подтвердили сделанные ранее предсказания [84]. Накопление новой информации в базах данных аминокислотных и нуклеотидных последовательностей и постоянное их обновление, дали нам основание предположить, что мы сможем обнаружить новые потенциальные гомологи генов синтеза микроцина С, а, следовательно, и новые антибактериальные соединения. В связи с этим, мы решили провести повторный биоинформатический поиск гомологов микроцинового оперона. Белок MccB является представителем суперсемейства ThiF/HesA/MoeB/E1 фосфотрансфераз или E1-суперсемейства [14]. Это суперсемейство имеет сложную эволюционную историю и настолько дивергировало, что филогенетическая реконструкция, основанная только представляется возможной. В на связи аминокислотном с этим, для выравнивании установления не степени эволюционного родства между отдельными семействами мы анализировали также доменную организацию и генное окружение каждого представителя, попавшего в выборку. Исследователями, проводившими ранее филогенетический анализ представителей Е1-суперсемейства, было показано, что два семейства белков MccB и PaaA (белок, участвующий в биосинтезе антибиотика пантоцина А) 104 филогенетически близки (Рисунок 18) [14]. В то время как МссВ аденилирует Nконцевой аспарагин своего субстрата МссА, белок PaaA из организма Pantoea agglomerans также модифицирует остаток аспарагина, но расположенный внутри аминокислотной последовательности пептидного субстрата [40, 41]. Филогенетическое древо гомологов белков MccB и PaaA было построено Макаровой К. путем систематического анализа последовательностей полностью секвенированных бактериальных геномов (на момент февраль-март 2013 года) (Рисунок 35). Рисунок 35. Филогенетическое древо предсказанных членов семейства MccB/PaaA и их генное окружение. Не укорененное филогенетическое дерево было построено с помощью ПО FastTree [71] методом максимального правдоподобия на основании множественного аминокислотного выравнивания консервативных блоков (136 информативных позиций) домена ThiF/HesA/MoeB/E1. Этой же программой были 105 вычислены бутстреп-значения, которые указаны слева от соответствующих узлов. Филогенетическое дерево было укоренено путем создания внешней группы (показана в виде серого треугольника сверху) последовательностей, которые не были связаны с функцией продукции микроцина (бутстреп-значение указано слева и выделено цветом). В конце каждой ветви дерева отмечен идентификационный номер (GI - универсальный идентификатор последовательностей) белковой последовательности в базе данных NCBI и полное название организма, из которого происходит эта последовательность. Красным цветом выделены GI белков MccB и PaaA, их пептидные субстраты и организмы, в геномах которых они закодированы. Белки, которые исследовались в данной работе, показаны синим. В некоторых случаях предполагаемый ортолог белка МссВ имеет дополнительный домен, название которого указано в скобках справа от организма. Ген, расположенный в том же предсказанном опероне, и, предположительно, ответственный за транспорт антибиотика из клетки, чаще всего кодирует транспортер MFS-типа. Мы указали тип такого белка справа от названия соответствующего организма в тех случаях, когда подобный ген присутствует в предсказанном опероне. Знаком "+" отмечены случаи, когда в предсказанных оперонах есть еще дополнительные гены, возможно, связанные с биосинтезом микроцин С-подобных соединений. Справа от филогенетического дерева представлены аминокислотные последовательности пептидов-предшественников: красным - микроцина С и пантоцина (звездочкой помечены остатки аспарагина, которые аденилируются), синим - подтвержденные МссА-подобные пептиды, коричневым предсказанные пептиды, гены которых расположены выше соответствующих генов семейства mccB/paaA. На схеме использовались следующие сокращения, для классов белков, кодируемых предсказанными генами: белки-транспортеры: ABC-транспортер семейства ABC (ATP-binding cassette), MFS - транспортер семейства MFS (major facilitate superfamily), DMT - транспортер семейства DMT (divalent metal transporter); белки, ответственные за устойчивость: zincin – Zn2+ - зависимые протеазы (zincin superfamily Zndependent proteases), S8 - семейство сериновых протеаз S8, MccF – сериновые протеазы S66 семейства, GNAT – ацетилтрансферазы семейства GNAT; белки, участвующие в созревании микроцина: ThiF-like - белки семейства ThiF/HesA/MoeB/E1, MTase семейство SAM-зависимых метилтрансфераз, McbC - оксидоредуктаза микроцина В. Важнейшим критерием отбора последовательностей было наличие Nконцевого участка, который формирует большую часть пептид-связывающего домена "пептидные клещи", характерного для MccB [76]. Этот домен играет ключевую роль в ферментативном катализе МссВ. Вторым важным критерием 106 было наличие в генном окружении последовательностей, которые могли бы кодировать потенциальные гомологи других белков, участвующих в синтезе микроцинов и/или устойчивости к ним. В первую очередь это белки-транспортеры семейства MFS, ответственные за выброс микроцина С из клетки-продуцента (Рисунок 35). Перечисленные признаки не характерны для представителей внешней группы, куда попали белки, осуществляющие, например, синтез тиаминовых или молибдоптериновых кофакторов (такие как ThiF и MoeB). Мы предполагаем, что практически все гомологи, вошедшие в представленное филогенетическое древо, участвуют в синтезе микроцин С-подобных соединений или других модифицированных пептидных антибиотиков. Проанализировав генное окружение предсказанных гомологов MccB, мы попытались предсказать короткие ОРС, возможно, кодирующие пептиды-предшественники микроцинов. Критерием отбора в данном случае были: расположение в непосредственной близости от гомолога mccB или других генов оперона, наличие перед геном сильной последовательности Шайн-Дальгарно, наличие С-концевого или внутреннего аспарагина в пептидной последовательности, кодируемой этой ОРС (отмечены коричневым на рисунке 35). Аминокислотные последовательности пептидов, протестированных в нашей работе, а также последовательность пептида-предшественника пантоцина А представлены на рисунке 35 (окрашены красным и синим). Таким образом мы сделали новое биоинформатическое предсказание, о существовании оперонов, кодирующих гены синтеза микроцин С-подобных соединений и других антибиотиков, синтезируемых на рибосомах и несущих пост-трансляционные модификации. Анализ аминокислотных последовательностей ортологов МссВ МссВ является представителем Е1-суперсемейства, которое объединяет белки, содержащие Е1-укладку наподобие белка Е1 - одного из трех участников процесса убиквитинилирования у эукариот. Е1-укладки - это модифицированная укладка Россманна - нуклеотид связывающая укладка, широко распространенная среди представителей различных таксономических групп [14]. Укладка Россманна 107 является наиболее консервативной частью белков Е1-суперсемейства. Еѐ характерные элементы легко выявляются при выравнивании аминокислотных последовательностей различных Е1-паралогов, что видно на примере белков MccB, MoeB и ThiF (Приложение: Рисунок 1). Характерным отличием белка МссВ E. coli от других представителей Е1-суперсемейства является наличие домена "пептидные клещи", сформированного N-концевой частью белка (1-87 а.к.) и С-концевым участком кроссоверной петли (Рисунок 24), а именно: пятью β1-β5-тяжами, четырьмя α1-α3 и α9-спиралями и одной 310A-спиралью. Домен "пептидные клещи" можно условно подразделить на два региона: один, образованный β1, β5-тяжами и тремя α1-α3-спиралями, формирует внешнюю его часть (Рисунок 36). Второй состоит из небольшого β-слоя из β2-β4-тяжей и α9-спирали кроссоверной петли соседней субъединицы и формирует внутреннюю часть домена, прилегающую к активному центру. Он напрямую или опосредовано участвует в процессе катализа (Рисунок 36). Рисунок 36. Общий вид домена пептидные клещи белка MccB E. coli. На рисунках А-В в трех проекциях представлена укладка элементов вторичной структуры, формирующих домен "пептидные клещи" белка МссВ (PDB: 3H9G) в комплексе с субстратом (заключены в многоугольник из серой линии на панели А). Полипептидные цепи окрашены в соответствии с элементам вторичной структуры и цепью гомодимера: αспирали, β-тяжи и петлевые участки одного протомера показаны красным, желтым и зеленым; аналогичные структуры, относящиеся ко второму протомеру, показаны голубым, фиолетовым и пурпурным. Субстрат MccA-N7isoAsn (аналог пептида МссА, см. рисунок 12-6) на рисунке отмечен как MccA и представлен в виде палочек розового цвета (атомы кислорода окрашены красным, азота - синим, серы - желтым). α-спирали, β-тяжи и 310-спираль на рисунке пронумерованы в соответствие с введенной ранее номенклатурой и обозначены греческой буквой с номером или 310А. 108 Мы провели выравнивание аминокислотных последовательностей подтвержденных ортологов белка МссВ с помощью сервиса Expresso (T-coffee), скорректировав выходные данные по известной и хорошо охарактеризованной структуре белка МссВ E. coli. Результаты выравнивания представлены на рисунке 37. Рисунок 37. Выравнивание аминокислотных последовательностей ортологов белка МссВ. Выравнивание представлено в формате Clustal W. Слева указаны названия организмов, в геноме которых закодированы эти белки. Справа - порядковый номер последней аминокислоты в строке. Прямоугольниками выделены охарактеризованные элементы вторичной структуры: зеленым - β-тяжи, красным - α-спирали, красным пунктирным - 310-спирали. Желтым цветом отмечены аминокислотные остатки, участвующие в связывании АТФ; салатовым - связывании пептидного субстрата; розовым 109 - остатки, принимающие участие в катализе; голубым - Zn2+-связывающие остатки цистеина; красным - аминокислоты, ответственные за димеризацию; зеленым выделены позиции, совпадающие по характеру аминокислотного остатка (темно-зеленым - если такое совпадение наблюдается между белком МссВ E. coli и другим ортологом). Жирным выделены позиции, которые мы посчитали консервативными, красным шрифтом остатки, для которых мы предполагаем структурную роль. Позиции, консервативные среди всех семи ортологов из различных организмов, изученных в работе, отмечены звездочкой над соответствующей аминокислотой. Позиции, в которых наблюдалось совпадение характера аминокислотных остатков по их физико-химическим свойствам, отмечены точкой. Как видно из приведенного рисунка, среди ортологов МссВ, использующих гептапептидные субстраты, во многих позициях наблюдается совпадение характера аминокислотного остатка (гидрофобная, полярная, заряженная и др.). Наиболее близкой к МссВ E. coli является последовательность MccB из B. washoensis. Напротив, ортологи из H. pylori, L. jihnsonii и S. thermophilus значительно ближе друг к другу, чем к МссВ E. coli. Эти данные, как и следовало ожидать, согласуются с приведенным филогенетическим древом (Рисунок 35). В то же время, ортологи МссВ из Synechococcus sp. и Y. pseudotuberculosis, использующие в качестве субстрата удлиненные пептиды, проявляют большое сходство аминокислотных последовательностей между собой. При этом отличия этих последовательностей от других ортологов с гептапептидными субстратами значительные, особенно в N-концевой области и районе предполагаемой кроссоверной петли (данные не представлены). Это, вероятнее всего, связано с различием в длине используемого пептидного субстрата, а, следовательно, различиями в структурах, участвующих в его связывании. Здесь следует отметить, что аминокислотные последовательности пептидных субстратов настолько разнообразны, что нам не удалось выявить у них ни одной консервативной позиции за исключением последней С-концевой аминокислоты, по которой проходит аденилирование. В отличие от других гомологов, последовательность МссВ из Y. pseudotuberculosis содержит на С-конце не охарактеризованный метил- трансферазный домен (Рисунок 29). Также, у этого белка отсутствует Zn2+связывающий мотив C-X-X-C, который у белков Е1-суперсемейства выполняет 110 структурную роль, хотя такие случаи известны и для других представителей Е1суперсемейства [14]. Аргининовый палец, характерный мотив, участвующий в процессе катализа (Приложение 1: Таблица 1) сохраняется в белках-ортологах МссВ E. coli, B. washoensis, Synechococcus sp. и Y. pseudotuberculosis в виде последовательности YSRN для первых двух представителей и YDRH для второй пары (Рисунок 37). Для ортологов МссВ из L. johnsonii, S. thermophilus и H. pylori этот мотив, по всей видимости, представлен последовательностью N/EFKN, в котором роль остатка аргинина, вероятно, играет лизин (Рисунок 37). Интересно, что у многих белков, обладающих АТФазной или ГТФазной активностью, содержащих аналогичный мотив "аргининовый палец", замена этого аргинина на лизин приводит к значительному снижению каталитической активности [10, 82]. При этом особую роль в процессе катализа отводят гуанидиновой группировке аргинина [64]. Таким образом, если наши предположения верны, то эти ортологи МссВ, возможно, одни из первых известных белков, адаптировавших остаток лизина вместо аргинина для каталитической функции в составе мотива аналогичного мотиву "аргининовый палец". Аминокислотные остатки, принимающие участие в связывании пептидного субстрата белком МссВ E. coli отмечены салатовым на рисунке 37. Среди ортологов МссВ, узнающих и аденилирующих гептапептидные субстраты, в сходных позициях можно обнаружить аналогичные аминокислотные остатки, причем наибольшее совпадение наблюдается среди тех позиций, которые у Е. coli ответственны за связывание N-концевого метионина пептидного субстрата МссА в активном центре МссВ. Белок МссВ E. coli функционирует в виде гомодимера. Димеризация осуществляется за счет взаимодействий между аминокислотными остатками, расположенными предположительно, на α10-спирали. принимают Аналогичные участие в остатки, димеризации, которые найдены также, у всех исследованных ортологов МссВ (Рисунок 37, выделены красным цветом). Таким образом, мы предполагаем, что изученные ортологи МссВ также функционируют в качестве гомодимеров. 111 Часть 2. Получение новых антибактериальных пептиднуклеотидных соединений с измененной пептидной частью с помощью белка МссВ E. coli Как видно из описанных выше результатов, наиболее вариабельной частью белков МссВ является аминокислотная последовательность, которая ответственна за формирование домена "пептидные клещи". Именно этот участок играет важную роль в связывании пептидного субстрата. По всей видимости, такая гетерогенность объясняется характером пептидного субстрата MccA, который может варьировать по длине и аминокислотной последовательности от организма к организму. Белок MccB за счет своей конформационной подвижности представляет собой достаточно лабильную систему, способную распознавать различные субстраты. Это, в частности, подтверждается экспериментами Казакова и соавторов, в которых тестировали субстратную специфичность белка MccB E. coli по отношению к пептидам МссА, закодированным мутантными вариантами гена mccA. В работе систематически вводили замены каждой из шести аминокислот МссА за исключением первого метионина и исследовали способность клеток, содержавших мутантные mcc опероны, производить микроцин. Было получено несколько антибактериальных соединений (мутантные микроцины С), активность которых была сопоставима или немного меньше, чем у микроцина С дикого типа [42]. В нашей работе мы хотели изучить эффект замены N-концевого метионина пептида МссА, который не возможно было проверить с использованием подхода, описанного у Казакова и соавторов. Поиск нового субстрата для белка MccB E. coli путем трехмерного моделирования В упомянутой работе Казакова и соавторов исследования субстратной специфичности МссВ проводились in vivo с помощью генно-инженерных методов 112 [42]. Уолш и соавторы получили кристалл белка MccB E. coli в виде апокомплекса и в комплексе с различными субстратами [76]. Мы провели анализ опубликованных кристаллических структур белка МссВ с помощью ПО PyMol, уделив особое внимание положению первой и последней аминокислот пептида MRGTNAN в активном центре фермента. Как описано в статье Уолша и соавторов, остаток метионина M1 пептида МссА находится в гидрофобном кармане, сформированном аденилирующим доменом фермента. В формировании гидрофобных взаимодействий с метионином M1 принимают участие остатки I243, V245, W326 и H333. Помимо этого, карбонильная группировка М1 образует водородные связи с остатками R322 и Q335 (Рисунок 15). Мы предположили, что замена метионина М1 в пептиде МссА на гидрофобный аминокислотный остаток не нарушит описанных взаимодействий, а получившийся пептидный субстрат также будет взаимодействовать с ферментом МссВ. Прежде чем приступать к экспериментальной части, мы провели предварительный анализ возможных замен на кристаллизованном комплексе белка MccB c его пептидным субстратом с помощью ПО PyMol (Рисунок 38). Рисунок 38. Анализ структуры комплекса фермента МссВ с пептидным субстратом. А. Общий вид гомодимера МссВ в комплексе с пептидным субстратом МссА (PDB: 113 3H9Q). Пептид МссА показан в активном центре только одной из двух субъединиц (выделен красным овалом). Б. Положения пептида дикого типа (MRTGNAN) и моделирование положений его мутантных аналогов в активном центре фермента МссВ. Показана первая аминокислота пептида МссА, расположенная в гидрофобном кармане. Аминокислотные остатки, участвующие в связывании метионина MRTGNAN (1) изображены в виде сфер. Смоделировано положение N-концевой части пептидов, полученных заменой метионина МссА на 2) фенилаланин, 3) лейцин, 4) изолейцин, 5) валин и 6) глицин. На рисунках использована следующая цветовая схема: субъединицы МссВ показаны зеленым и голубым, МссА - в виде белых палочек, атомы кислорода, азота и серы представлены красным, синим и желтым соответственно. Как видно из приведенного рисунка, алифатическая цепь бокового радикала метионина MRTGNAN погружена в гидрофобный карман в активном центре МссВ (Рисунок 38, Б-1). Мы предположили, что аминокислоты с сопоставимо длинной алифатической цепью бокового радикала также будут формировать гидрофобные взаимодействия с аминокислотными остатками, образующими стенки гидрофобного кармана. Так боковой радикал лейцина и изолейцина хорошо позиционируются в полость гидрофобного кармана (Рисунок 38, Б-3,4). Аналогичную ситуация наблюдается с пептидом FRTGNAN (Рисунок 38, Б-2), где в качестве N-концевой аминокислоты выступает фенилаланин. В случае замены метионина МссА на валин или аланин, степень проникновения N-концевой аминокислоты в полость кармана значительно ниже (Рисунок 38, Б-5). А в случае замены метионина M1 на глицин, N-конец пептидного субстрата в гидрофобный карман не позиционируется (Рисунок 38, Б-6). При анализе комплекса фермента МссВ с субстратом MccA можно заметить, что пептид MRTGNAN лежит в борозде, сформированной двумя субъединицами белка МссВ [76]. При этом N-конец МссА обращен наружу, в сторону "выхода" из этой борозды на поверхность фермента, контактирующего с внешней средой (Рисунок 39). 114 Рисунок 39. Положение субстрата МссА в активном центре белка MccB. А. Общий вид гомодимера белка МссВ в комплексе с пептидным субстратом. Мономерные субъединицы МссВ окрашены зеленым и синим, показаны в виде сетчатых поверхностей и элементов вторичной структуры. МссА изображен в виде палочек розового цвета (выделен красным овалом). Б. Часть активного центра МссВ со связанным пептидным субстратом со стороны N-конца МссА. Субъединицы гомодимера окрашены синим и зеленым и изображены в виде сплошной поверхности. Атомы кислорода, азота и серы окрашены красным, синим и желтым соответственно. Представленные рисунки получены наложением разрешенных кристаллических структур белка МссВ (PDB: 3H5N, 3H9J) с помощью ПО PyMol. Мы предположили, что удлинение пептида с N-конца, возможно, не будет препятствовать его связыванию с ферментом, а дополнительные аминокислотные остатки в таком случае будут расположены на поверхности фермента вдали от активного центра. Дополнительным указанием на существование удлиненных пептидов, полученные способных нами взаимодействовать результаты с ферментом экспериментов с МссВ, микроцин послужили С-подобными соединениями из организмов Synechococcus sp. и Y. pseudotuberculosis. На основании проведенного анализа, для дальнейших биохимических тестов мы выбрали ряд пептидов (Таблица 6), которые можно разбить на несколько групп: 1) пептиды с заменой первой аминокислоты метионина MRTGNAN на другую гидрофобную аминокислоту с алифатическим или ароматическим боковым радикалом, а также неполярный глицин; 2) пептиды с заменой М1 на заряженную или полярную аминокислоту; 3) пептиды с удлиненной с N-конца аминокислотной цепью; 4) пептиды с заменой С-концевой аминокислоты аспарагин на близкую по 115 структуре или химической природе аминокислоту, такую как аспартат или глутамин. Таблица 6. Аденилирование различных пептидов ферментом МссВ in vitro и антибактериальная активность полученных McC1092-подобных соединений. В столбце "Пептид" перечислены пептиды, протестированные в экспериментах. В столбце "Образование аденилированного продукта" знаком (+) помечены те пептиды, которые аденилируются ферментом МссВ, знаком (-) - пептиды, которые в реакцию с МссВ не вступают. В столбце "Антибактериальный эффект на клетки E. coli B wt" или "Антибактериальный эффект на клетки E. coli B ΔyejB" знаком (+) отмечено образование зон ингибирования роста на газоне клеток, а знаком (-) - отсутствие образования зон ингибирования роста при нанесении на его поверхность продуктов реакции взаимодействия соответствующего пептида с ферментом МссВ. Знаком "N/A" обозначены случаи, когда нам не удалось выделить достаточные количества аденилированного пептида, следовательно, достоверно судить об антибактериальной активности такого микроцин С-подобного соединения мы не можем. Образование аденилированного продукта Антибактериальный эффект на клетки E. coli B wt Антибактериальный эффект на клетки E. coli B ΔyejB MRTGNAN + + - GMRTGNAN + + - GGMRTGNAN + + - GGGMRTGNAN + + - GGGGGGMRTGNAN + + - GRTGNAN - - - GGGGGGRTGNAN - - - ARTGNAN - - - VRTGNAN + N/A N/A LRTGNAN + + - IRTGNAN + + - FRTGNAN + + - GGFRTGNAN + + - NRTGNAN - - - DRTGNAN - - - QRGTNAN - - - ERTGNAN - - - KRTGNAN - - - MRAGNAN + + - Пептид 116 MRLGNAN + + - MRTWNAN + + - MRTGNAD - - - MRTGNAQ - - - biotin-MRTGNAN + + - biotin-GMRTGNAN + + - Тестирование различных пептидных субстратов белка МссВ in vitro Для проверки биоинформатических предсказаний применили метод синтеза аденилированных пептидов in vitro. В реакционную смесь к ферменту МссВ добавили АТФ и один из отобранных пептидов, полученных методом твердофазного химического синтеза. Продукты реакции проанализировали с помощью ВЭЖХ и масс-спектрометрии. Результаты масс-спектрометрического анализа представлены на рисунке 40 и суммированы в таблице 6. 117 Рисунок 40. Продукты реакций аденилирования in vitro синтетических пептидов ферментом MccB E. coli. Пептиды вместе с АТФ (нижняя панель) были добавлены к ферменту МссВ. В качестве отрицательного контроля использовали аналогичную реакцию без добавления АТФ (верхняя панель). Продукты реакции анализировали с помощью MALDI-TOF масс-спектрометрии, результаты которой представлены на 118 рисунке. Массы исходных пептидов и продуктов реакции (сдвиг массы +329 ед.м. относительно массы исходного пептида, соответствует присоединению молекулы АМФ) обозначены цифрами над соответствующими пиками. Звездочкой показаны пики, соответствующие массе интермедиата - сукцинимидного производного пептида (сдвиг массы -18 ед.м. относительно массы исходного пептида, соответствует отщеплению воды в процессе циклизации аспарагина (Рисунок 12) [77]). Аминокислотная последовательность пептидов приведена в верхнем правом углу соответствующего массспектра. Как и ожидалось, пептид дикого типа MRTGNAN (положительный контроль) узнается и модифицируется ферментом МссВ с образованием аденилированного продукта с молекулярной массой 1092 Да (Рисунок 40). В качестве дополнительных контролей мы протестировали три пептида (MRAGNAN, MRLGNAN, MRTWNAN), описанных в статье Казакова и соавторов [42]. Полученные нами данные по аденилированию этих пептидов ферментом МссВ in vitro (Рисунок 40) согласуются с результатами работы этих авторов, которые наблюдали синтез соответствующих аденилатов in vivo. Пептиды с заменой Сконцевой аминокислоты аспарагина на близкую по размерам (аспартат) или физико-химическим свойствам (глутамин) аминокислоту (MRTGNAD, MRTGNAQ) при инкубации с ферментом МссВ не образуют аденилированного продукта (Таблица 6). Эти данные также согласуются с известной специфичностью белка МссВ к аспарагину, расположенному на C-конце субстрата МссА [76, 77]. Пептиды с заменой метионина M1 на неполярные фенилаланин, лейцин и изолейцин (FRTGNAN, LRTGNAN и IRTGNAN) аденилируются ферментом МссВ (Рисунок 40). Пептид VRTGNAN модифицируется ферментом МссВ незначительно: пик, соответствующий аденилированному продукту на массспектре едва заметен, также как и пик, соответствующий сукцинимидному интермедиату реакции (Рисунок 40). Пептиды, содержащие на месте N-концевого метионина неполярную аминокислоту с относительно небольшим размером бокового радикала (ARTGNAN, GRTGNAN), ферментом не модифицируются. Также не аденилируются пептиды, несущие полярную или заряженную аминокислоту на месте метионина M1 (NRTGNAN, DRTGNAN, QRTGNAN, ERTGNAN, KRTGNAN) (Таблица 6). 119 Пептиды аналогичные пептиду дикого типа, но содержащие дополнительные остатки глицина на N-конце (GMRTGNAN, GGMRTGNAN, GGGMRTGNAN, GGGGGGMRTGNAN), узнаются и аденилируются ферментом МссВ E. coli, так же как и удлиненный на два остатка глицина пептид, несущий вместо метионина фенилаланин (GGFRTGNAN). Таким образом, присутствие дополнительных аминокислотных остатков на N-конце пептидов не препятствует их взаимодействию с ферментом MccB. Для того чтобы оценить степень сродства различных пептидных субстратов к ферменту МссВ, мы провели измерение выходов продуктов реакции аденилирования с помощью метода ВЭЖХ. Для эксперимента мы выбрали такую концентрацию фермента МссВ, который при заданных условиях реакции (смотри материалы и методы) конвертирует пептид дикого типа в его аденилат, менее, чем на 100%. Выход реакции оценивали по площади хроматографического пика с максимумом поглощения при длине волны 260 нм, соответствующего времени выхода аденилированного продукта. Количество исходного пептида в реакционной смеси рассчитывали с помощью метода, описанного в работе Барама и соавторов [1]. Соответствие каждого хроматографического пика тому или иному компоненту реакционной смеси (исходный пептид, аденилированный сукцинимидное пептид) производное подтверждали с исходного помощью пептида и масс-спектрометрии. Результаты измерений для некоторых пептидов представлены в таблице 7. 120 Таблица 7. Относительный выход конечного продукта в реакции аденилирования различных пептидных субстратов ферментом МссВ. Реакционные смеси, содержащие пептидный субстрат, МссВ и АТФ инкубировали в заданных условиях. Затем из реакционной смеси удаляли белки путем их осаждения холодным подкисленным ацетонитрилом. Надосадочные жидкости сушили, перерастворяли в воде и наносили на аналитическую С-18 микроколонку. Детекцию хроматографических пиков вели при длине волны 210 и 260 нм. Расчет площади хроматографических пиков осуществляли с помощью ПО Мультихром. Значения, полученные для каждого пептида в отдельности, нормировались на значения, полученные для пептида дикого типа. Относительный выход аденилированного продукта Пептид MRTGNAN GMRTGNAN GGMRTGNAN GGGMRTGNAN GGGGGGMRTGNAN FRTGNAN GGFRTGNAN 1.00 2.96 6.56 8.48 5.88 0.52 11.26 Из полученных результатов следует, что выход реакции аденилирования больше с пептидами, (GMRTGNAN, удлиненными GGMRTGNAN, с N-конца GGGMRTGNAN, на несколько глицинов GGGGGGMRTGNAN), по сравнению с пептидом дикого типа. Замена N-концевого метионина на фенилаланин (FRTGNAN) в пептиде МссА приводит к снижению выхода аденилированного продукта, а удлинение такого пептида на два глицина с его Nконца (GGFRTGNAN) увеличивает выход аденилированного продукта. Биологическая активность аденилированных пептидов Мы предположили, что как и в случае микроцин С-подобных соединений из различных микроорганизмов, аденилированные мутантные описанных пептиды будут выше, обладать полученные нами антибактериальной активностью схожей с МсС1092. Реакционные смеси, содержащие такие аденилированные продукты, были получены in vitro в реакциях, подробно описанных выше. В качестве отрицательного контроля использовалась аналогичная 121 реакция без добавления АТФ. По окончании инкубации 10 мкл реакционной смеси наносили на газон клеток E. coli B. В качестве контроля использовали штамм E. coli B ΔyejB. Через несколько часов инкубации в термостате наблюдали образование зон ингибирования роста на газоне клеток E. coli (Таблица 6). Как следует из приведенной таблицы 6, клетки E. coli B wt чувствительны ко всем микроцин С-подобным соединениям, полученным в наших экспериментах in vitro, за исключением аденилированного пептида VRTGNAN, количество которого в реакционной смеси было, по всей видимости, слишком мало для ингибирования роста бактериальных клеток. Напротив, клетки мутантные по одному из генов, кодирующих мультисубъединичный мембранный транспортер YejABEF, устойчивы к действию таких аденилированный пептидов. Таким образом, синтезированные аналоги микроцина С проникают внутрь бактериальной клетки посредством той же транспортной системы, что и микроцин С. Размеры зон ингибирования роста различались в зависимости от аминокислотной последовательности аденилированного пептида. Это может быть связано как с различной эффективностью аденилирования пептидных субстратов ферментом МссВ (неодинаковая концентрация пептид-аденилата в пробах), а также с различной эффективностью проникновения в чувствительные клетки и процессинга в цитоплазме синтетических микроцинов. В работе Уолкера и Альтмана на примере E. coli и некоторых других Граммотрицательных бактерий было показано, что введение биотиновой модификации в пептиды размером до 31 а.к., облегчает их транспорт в клетку посредством биотинового транспортера [90]. Мы продемонстрировали, что введение биотиновой модификации на N-конец пептида (Рисунок 40) не приводит к смене транспортного пути в клетку таких аденилированных продуктов (Таблица 6). Биотинилированные аналоги микроцина С проникают в клетку через внутреннюю мембрану также посредством белка YejABEF. 122 Сравнение антибактериальной активности некоторых аналогов микроцина С Выходы продуктов реакции модификации синтетических пептидов ферментом МссВ различались от пептида к пептиду. Для количественного сравнения антибактериальной активности аденилированных пептидов с McC1092 мы провели очистку продуктов реакции с помощью ВЭЖХ. Для этого реакция аденилирования пептидов белком МссВ была поставлена в объеме 500 мкл. Затем продукты реакции разделили с помощью С18 обратно-фазовой хроматографии. Пики, соответствующие аденилированным пептидным продуктам, собрали в отдельные фракции (Рисунок 41, А), чистоту которых подтвердили с помощью масс-спектрометрии. Очищенные аденилированные продукты нанесли на газон клеток E. coli B в нескольких последовательных разведениях. В качестве стандарта использовали аденилированный пептид дикого типа MRTGNAN (Рисунок 41, Б, В). Рисунок 41. Сравнение антибактериальной активности аденилированных пептидов. А. Разделение продуктов реакции аденилирования пептида GGMRTGNAN ферментом МссВ с помощью С18 обратно-фазовой хроматографии ВЭЖХ. На верхней панели представлены хроматографические пики разделения реакционной смеси, соответствующие исходному пептиду (1) и его аденилированному продукту (2). На нижней панели хроматографические пики, образующиеся при разделении контрольной реакционной смеси (без добавления АТФ). Б. Антибактериальная активность аденилированных пептидов, удлиненных с N-конца на 1, 2, 3 и 6 глицинов по сравнению с 123 аденилированным пептидом дикого типа MRTGNAN. В. Антибактериальная активность аденилированного пептида, содержащего фенилаланин вместо N-концевого метионина пептида МссА, а также его удлиненного аналога. На газоны клеток E. coli B наносили по 10 мкл водного раствора аденилированного пептида в пяти последовательных разведениях (концентрации указаны слева от чашки) в трех независимых повторностях. Приведенные активность результаты аденилированных GGGMRTGNAN, а также продемонстрировали, пептидов GGFRTGNAN что антибактериальная GMRTGNAN, больше GGMRTGNAN, таковой МсС1092, антибактериальное действие которого на клетки E. coli B сопоставимо с действием аденилированных пептидов GGGGGGMRTGNAN и FRTGNAN. Результаты трех независимых измерений площади зон ингибирования роста E. coli представлены на Площадь зоны ингибирования роста (мм2) рисунке 42. 160 140 120 100 80 60 40 20 0 Рисунок 42. Размер зон ингибирования роста клеток E. coli B wt при концентрации аденилированных пептидов 2 мкМ. На газоны бактериальных клеток наносили по 10 мкл водного раствора предварительно очищенного ВЭЖХ аденилированного пептида. После нескольких часов инкубации клеток при температуре 37 oC наблюдали образование зон ингибирования роста. 124 Как следует из рисунка 42, удлинение пептида дикого типа с N-конца уже на один остаток глицина приводит к увеличению его антибактериальной активности почти в 4 раза. Далее, по мере увеличения длины аденилированного пептида его антибиотическая активность постепенно падает. Так размер зоны ингибирования роста бактериальных клеток при нанесении на их газон аденилированного пептида длиной 13 аминокислот (GGGGGGMRTGNAD-АМФ) лишь в два раза больше, по сравнению с микроцином 1092 (пептидом MRTGNAD-АМФ). Аденилированный пептид с заменой N-концевой аминокислоты метионин на фенилаланин (FRTGNAD-АМФ) проявляет схожую антибактериальную активность с McC1092. Удлинение пептидной части такого антибиотика на два остатка глицина с его Nконца (GGFRTGNAD-АМФ) приводит к увеличению антибактериальной активности почти в 3,5 раза, по сравнению с пептидом дикого типа (MRTGNADАМФ). In vitro аденилирование белка, содержащего на своем C-конце пептид MRTGNAN Мы показали, что фермент МссВ способен аденилировать пептиды длиной до 13 аминокислот, содержащие на своем С-конце последовательность MRTGNAN. В связи с этим, мы решили проверить, существует ли предельная длина пептидного субстрата, который модифицировать способен белок, модифицировать несущий на своѐм МссВ: С-конце будет ли МссВ последовательность MRTGNAN. Для этого мы создали генетическую конструкцию, кодирующую белок MBP (Maltose binding protein) слитый с С-концевой последовательностью MRTGNAN через линкер из четырех остатков глицина. Между С-концевым пептидом GGGGMRTGNAN и MBP в таком белке расположен сайт узнавания протеазы Фактор Xa (Рисунок 43, А). Получившийся химерный белок мы назвали MBP-pepN. 125 Рисунок 43. Аденилирование белка MBP-pepN ферментом МссВ in vitro и in vivo. А. Схематическое представление рекомбинантного белка MBP-pepN, у которого на Сконце расположена последовательность GGGGMRTGNAN (выделена подчеркиванием), состоящая из пептида МссА и небольшого линкера из четырех остатков глицина. Перед этой последовательностью расположен сайт узнавания для протеазы Фактор Xa (место расщепления помечено стрелкой). Молекулярная масса пептида, образующегося при обработке белка протеазой Фактор Xa, равна 1467,5 Да. Б. Результаты разделения продуктов реакции аденилирования белка MBP-pepN ферментом МссВ в присутствии [α32 P]-АТФ в денатурирующем ПААГ с помощью электрофореза. Представлены радиоавтограф (1) и окрашенный Кумасси фрагмент того же полиакриламидного геля. Сверху расположена белковая полоса соответствующая белку MBP-pepN (Mw = 43,9 кДа), снизу - ферменту МссВ (Mw = 39,4 кДа). В. Результаты масс-спектрометрического анализа продуктов реакции аденилирования белка MBP-pepN ферментом MccB in vitro. Очищенный из реакционной смеси с помощью аффинной хроматографии белок MBPpepN обработали протеазой Фактор Xa и проанализировали продукты протеолиза с помощью MALDI-TOF. В контрольной реакции без добавления АТФ (верхняя панель) наблюдали пик соответствующий С-концевому пептиду MBP-pepN. В реакции с добавлением АТФ (нижняя панель) пик соответствующий С-концевому пептиду, его аденилированному (сдвиг массы +329 ед.м.) и сукцинимидному (помечен звездочкой, сдвиг массы -18 ед.м.) производному. Г. Результаты масс-спектрометрического анализа продуктов реакции аденилирования белка MBP-pepN ферментом MccB in vivo. С 126 помощью MALDI-TOF анализировали продукты протеолиза Фактором Xa очищенного рекомбинантного белка MBP-pepN из клеток E. coli BL21 (DE3), экспрессирующих его отдельно (верхняя панель) или вместе с белком MccB (нижняя панель). На следующем этапе в гетерологичной экспрессионной системе E. coli мы получили очищенный рекомбинантный белок MBP-pepN, который добавили к ферменту МссВ в присутствие [α-32P]-АТФ. В качестве отрицательного контроля использовали аналогичную реакцию, но без добавления субстрата MBP-pepN. По окончании инкубации реакционные смеси нанесли на денатурирующий ПААГ и разделили продукты реакции с помощью электрофореза (Рисунок 43, Б). Как видно из приведенного выше рисунка, в присутствии субстрата MBP-pepN фермент МссВ переносит радиоактивную метку с молекулы АТФ на белок MBP-pepN. Таким образом, пептид MRTGNAN способен узнаваться и аденилироваться ферментом МссВ даже при наличии у него на N-конце такой крупной молекулы как MBP (с молекулярным весом около 40 кДа). Чтобы убедиться, что аденилирование происходит по С-концевому аспарагину (пептида MRTGNAN) белка MBP-pepN, полученный результат подтвердили также с помощью метода масс-спектрометрии. Для этого очищенный рекомбинантный белок MBP-pepN инкубировали с МссВ и АТФ в течение нескольких часов. Отрицательным контролем в данном случае служила аналогичная реакция, но без добавления АТФ. После инкубации, отделили белок MBP-pepN от остальных компонентов реакционной смеси с помощью аффинной хроматографии с использованием амилозной смолы. Очищенный белок обработали протеазой Фактор Xa и проанализировали продукты протеолиза с помощью масс-спектрометрии (Рисунок 43, В). Как видно из рисунка, белок MBPpepN, очищенный из реакционной смеси с добавлением АТФ, модифицировался ферментом МссВ по его С-концу. In vivo аденилирование белка, содержащего на своем C-конце пептид MRTGNAN Убедившись в способности фермента МссВ распознавать и модифицировать in vitro крупные белковые молекулы с С-концевой последовательностью 127 MRTGNAN, мы решили протестировать аналогичные свойства МссВ in vivo. Для этого мы получили генетическую конструкцию на основе вектора pCOLADuet, кодирующую белок МссВ и MBP-pepN одновременно. Такой конструкцией трансформировали клетки E. coli BL21 (DE3) и индуцировали синтез белков с помощью ИПТГ (Изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид). В качестве контроля использовали аналогичную конструкцию, в которой отсутствовала ОРС, кодирующая фермент МссВ. Через 5 часов после начала индукции из клеток выделили рекомбинантный белок MBP-pepN с помощью аффинной хроматографии с использованием амилозной смолы. Очищенный белок подвергли протеолитическому расщеплению протеазой Фактор Xa. Продукты протеолиза проанализировали с помощью масс-спектрометрии. Результаты эксперимента представлены на рисунке 43, Г. Из этого рисунка следует, что белок MBP-pepN аденилируется ферментом МссВ in vivo. Мы проанализировали динамику роста клеток E. coli BL21 (DE3), несущих плазмиду pCOLADuet, содержащую две ОРС, кодирующих фермент МссВ и белок MBP-pepN. В контрольном эксперименте мы использовали аналогичные клетки и генетические конструкции, с той лишь разницей, что одна из открытых рамок считывания кодировала белок MBP без С-концевой последовательности MRTGNAN. Бактериальные клетки, несущие обе плазмиды, растили в одинаковых условиях с добавлением глюкозы в питательную среду до достижения оптической плотности жидкой культуры около 1 при длине волны 600 нм. Затем культуру клеток развели в 10 раз: аликвоты клеток перенесли в свежую жидкую культуральную среду с добавлением ИПТГ до достижения оптической плотности культуры при длине волны 600 нм менее 0.1. Далее наблюдали изменения оптической плотности культуры в течение 7 часов. Результаты наших наблюдений суммированы на рисунке 44. 128 Рисунок 44. Кривые роста клеток E. coli BL21 (DE3), экспрессирующих белки MccB, MBP и MBP-pepN. На графике представлена зависимость оптической плотности жидкой культуры клеток E. coli BL21 (DE3) при длине волны λ=600 нм от времени. Клетки, несущие плазмиду pCOLADuet, кодирующую белки MccB и MBP-pepN, обозначены на графике MccB+MBP-pepN в легенде справа. Клетки, несущие аналогичную плазмиду, но кодирующую белок MBP без С-концевой последовательности MRTGNAN, обозначены MccB+MBP. Концентрации индуктора ИПТГ в приведенном эксперименте составляла 0,1 мМ. Как видно из приведенного рисунка, бактериальные клетки, экспрессирующие МссВ и MBP с С-концевой последовательностью MRTGNAN, растут значительно медленнее контрольной культуры клеток (экспрессирующих вместо MBP-pepN белок MBP). Это, по всей видимости, связано с угнетением роста клетокпродуцентов микроциновым токсином, который образуется в результате аденилирования белка MBP-pepN ферментом МссВ и последующего протеолиза аденилированного С-концевого пептида MRTGNAD-АМФ. 129 Обсуждение полученных результатов В первой части нашей работы мы подтвердили сделанные ранее биоинформатические предсказания, о существовании микроцин С-подобных соединений, гены синтеза которых закодированы в геномах или на плазмидах разнообразных бактерий. Мы протестировали четыре предсказанных пептида из организмов H. pylori, S. thermophilus, L. johnsonii и B. washoensis в реакциях с соответствующими ортологами МссВ и обнаружили, что каждый из них аденилируется «своим» ферментом. Полученные аденилированные продукты ингибировали рост клеток E. coli дикого типа по механизму, аналогичному описанному ранее для микроцина С. Как минимум три из четырех микроцин Сподобных соединений (из H. pylori, S. thermophilus, L. johnsonii) проникают в клетки E. coli посредством транспортера YejABEF. Все четыре соединения подвергаются протеолитическому расщеплению (процессингу) в цитоплазме E. coli с высвобождением токсина, ингибирующего аспартил-тРНК-синтетазу. Следует отметить, что в процессе синтеза микроцина С E. coli белок МссВ катализирует образование N-P связи (фосфороамидатной) между аспартатом пептида MRTGNAD и АМФ. Таким образом в результате протеолиза высвобождается токсин, который представляет негидролизуемый аналог активированной аминокислоты аспартат. В своей работе мы напрямую не показали образование аналогичной химической связи N-P в аналогах микроцина С, синтезируемых изученными MccB аденилтрансферазами. Тем не менее, на основании косвенных данных, таких как образование сходных интермедиатов (сукинимидное производное исходного пептида) и продуктов реакции (аденилированный пептид), а также совпадение внутриклеточных мишеней (аспартил-тРНК-синтетаза), мы предполагаем сходное строение молекул микроцина С и его аналогов, изученных в данной работе. Микроцин С-подобное соединение из организма B. washoensis оказалось наименее активным как в тестах in vivo, так и в экспериментах по изучению ингибирования аспартил-тРНК-синтетазы в экстрактах E. coli. По всей видимости, это связано с повышенной стабильностью гексапептида DHIGFN, образующегося 130 после удаления N-концевого метионина, в цитоплазме клеток E. coli к протеолитическому процессингу. Данный факт согласуется с известными свойствами основной аминопептидазы E. coli PepN [2], которая с большей эффективностью удаляет N-концевую аминокислоту, если за ней следует положительно заряженная аминокислота, и хуже - если за ней следует отрицательно заряженная аминокислота [2, 17]. Остальные три МссА-подобных пептида из H. pylori, S. thermophilus, L. johnsonii во втором положении с N-конца несут положительно заряженную аминокислоту, что, вероятно, благоприятствует их протеолизу аминопептидазой РepN. Аналогично аденилированному пептиду МссА из организма B. washoensis, мы наблюдали повышенную устойчивость к протеолитической деградации (низкий уровень ингибирования аспартил-тРНКсинтетазы) аденилированного пептида из организма Y. pseudotuberculosis. Мы предполагаем, что и в данном случае это связанно со специфичностью аминопептидаз E. coli. Возможно, эти антибиотики обладают значительно большей активностью при попадании в цитоплазму соответствующего вида бактерий за счет увеличенной скорости процессинга аминопептидазами другой специфичности. В согласии с этой точкой зрения, оба эти аденилированных пептида быстро расщепляются в клеточном лизате, полученном из одного из штаммов бактерий рода Yersinia (Дубилей С.А., личное сообщение). Одним из интересных и довольно неожиданных результатов нашей работы стало подтверждение функциональной активности in vitro ортологов белка МссВ из Synechococcus sp. и Y. pseudotuberculosis, которые используют в качестве субстрата удлиненные МссА-подобные пептиды, длина которых значительно превышает семь аминокислотных остатков, характерных для МссА E. coli. Это дало нам основание предполагать, что белок МссВ E. coli, а, возможно, и другие его ортологи, также способны распознавать удлиненные пептидные субстраты. Мы предполагаем, что физиологическая функция всех экспериментально подтвержденных нами микроцин С-подобных соединений аналогична функции микроцина С E. coli, и что эти антибиотики активны против штаммов и видов, близкородственных бактериям-продуцентам. К сожалению, на данный момент для большинства микроцин С-подобных соединений нам не удалось установить, какие именно виды бактерий, обитающих в естественной среде совместно со штаммами- 131 продуцентами микроцина, чувствительны к полученным нами новым антибиотикам. Тем не менее, в ходе нашей работы были получены данные о том, что некоторые штаммы H. pylori и Synechococcus sp. чувствительны к действию микроцина С E. coli, что показывает, что пептид-аденилаты могут обладать более широким спектром действия, чем считалось до сих пор. Микроцин С E. coli проникает в клетку посредством транспортера внутренней мембраны YejABEF. Наличие ортологов этого транспортера в геномах других бактерий может служить указанием, что эти микроорганизмы могут быть чувствительны к действию микроцина С. Гены, кодирующие белки близкородственные компонентам YejABEF Е. coli были найдены в геномах Y. pseudotuberculosis и H. pylori. В то же время в геномах B. washoensis, S. thermophilus и L. johnsonii мы не смогли обнаружить генов, гомологичных yejABEF. Если такие организмы окажутся чувствительны к действию микроцин С-подобных соединений, то у них, вероятно, должны существовать альтернативные пути транспорта антибиотика в клетку. Так, несмотря на то, что и в геноме Synechococcus sp. также не обнаруживаются гомологи yejABEF, некоторые штаммы синенококка чувствительны к действию микроцина С E. coli. Интересно, что аденилированный пептид длиной 25 а.к. (Таблица 5) соответствующий C-концевому фрагменту МссА Synechococcus sp. CC9605 проникает в клетки E. coli посредством транспортера SbmA. Возможно, отсутствие ингибирования роста E. coli аденилированным полноразмерным пептидом из Synechococcus sp. CC9605 длиной 58 а.к. связано с неспособностью этого пептида проникнуть в клетку ни посредством YejABEF, ни SbmA. Учитывая полученные нами данные по биологической активности и транспорту удлиненный вариантов МссА E. coli можно предположить, что максимальная длина пептидных субстратов, способных транспортироваться системой YejABEF лежит между 13 и 25 а.к. Способность аденилированных пептидов с различной аминокислотной последовательностью (совпадают только N- и С-концевые аминокислоты) проникать через этот транспортер может говорить об отсутствии строгой специфичности этого транспортера к транспортируемых пептидных субcтратов. аминокислотной последовательности 132 Кластер генов, ответственных за синтез микроцина С E. coli включает оперон mccABCDE и ген mccF, которые обеспечивают продукцию зрелого аминопропилированного McС1178 и устойчивость к эндогенному и экзогенному микроцину. Известно, что минимальный набор генов необходимый и достаточный для продукции антибиотика составляют три гена mccABC [31]. Аналогичный набор генов входит в состав ранее предсказанных и верифицированных нами оперонов H. pylori, S. thermophilus, L. johnsonii и B. washoensis. Таким образом оперон из трех генов mccABC является минимальным и, вероятно, предковым, а гены mccDEF более поздним эволюционным приобретением, которое могло возникнуть в результате дупликации и дальнейшей дивергенции паралогов (гомологи генов mccE и mccF присутствуют в геномах многих бактериальных видов, но не связаны с генами синтеза микроцина). Наличие аминопропильной модификации увеличивает эффективность связывания микроцинового токсина в активном центре аспартил-тРНК-синтетазы E. coli примерно на порядок, вероятно, за счет электростатического взаимодействия между отрицательно заряженными остатками аспартата и глутамата фермента и положительно заряженной аминогруппой пропиламина [61]. Аналогичные остатки аспартата и глутамата можно обнаружить в аспартил-тРНК-синтетазах, закодированных в геномах H. pylori, S. thermophilus, L. johnsonii и B. washoensis. Следовательно можно предположить, что аминопропилированные микроцин С-подобные соединения из этих организмов также могли бы обладать повышенной антибактериальной активностью. Химерный аминопропилированный пептид MHRIMKD-АМФ (созданный на основе пептидаденилата из L. johnsonii) обладает повышенной активностью по отношению к кишечной палочке. Этот результат показывает, что ферментная пара MccD/MccE E. coli, осуществляющая реакцию аминопропилирования пептид-aденилата E. coli, не специфична в отношении последовательности пептида и может быть использована для создания не существующих в природе вариантов с повышенной биоактивностью. Оперон генов, ответственных за синтез микроцин С-подобных соединений из организма Synechococcus sp., обладает рядом уникальных свойств. Во-первых, он содержит две копии генов mccA. Во-вторых, в качестве транспортной системы, выбрасывающей микроциновый антибиотик из клетки, вероятно, выступает группа 133 белков, относящаяся к классу ABC-транспортеров (Рисунки 29 и 35), которая отличается от системы экспорта микроцинов посредством MFS-транспортера, характерного для организмов, кодирующих синтез аденилатов коротких пептидов. Возможно, это связано с необходимостью транспорта из клетки-продуцента Synechococcus sp. микроцина, длина пептидной части которого значительно превышает «стандартные» семь аминокислотных остатков. В опероне генов синтеза микроцин С-подобного соединения синенококка также присутствуют гены гомологичные генам mccD и двум доменам mccE E. coli. Мы предполагаем, что пептид МссА из организма Synechococcus sp. помимо аденилирования ферментом МссВ, подвергается также дальнейшим пост-трансляционным модификациям, например, аминопропилированию, повышающими базовый уровень активности. В недавно опубликованной работе Паз-Йепес (Paz-Yepes) и соавторов было продемонстрировано, что штамм Synechococcus sp. CC9605, геном которого кодирует гены синтеза микроцин-подбного соединения, ингибирует рост двух других штаммов рода Synechococcus, не содержащих таких генов. Мутации в генах mccA и mccB снимают ингибирование [70]. Synechococcus sp. CC9605 устойчив к действию микроцина С E. coli. В свою очередь клетки синенококков, чувствительные к микроцину С E. coli, т.е. не содержащие генов синтеза микроцина, при трансформации генетической конструкцией, кодирующей микроциновый оперон Synechococcus sp. CC9605, приобретают устойчивость к микроцину С E. coli. Также эти штаммы становятся устойчивыми к угнетающему их рост действию Synechococcus sp. CC9605 [70]. Опубликованные в этой работе данные еще раз подтверждают верность сделанных нами предположений о физиологической функции ортологов генов синтеза микроцина С, как инструмента внутри- и межвидовой борьбы бактерий. Тем не менее, наши попытки идентифицировать с помощью MALDI-TOF анализа масс-пик, соответствующий микроцин С-подобному соединению, в культуральных средах из Synechococcus sp. CC9605 закончились неудачей. Возможно, это связано с тем, что удлиненный микроциновый пептид-предшественник МссА синенококка в процессе созревания антибиотика подвергается дополнительным пост-трансляционным модификациям, включающим и протеолитическую деградацию его пептидной части, а конечный 134 продукт имеет значительно меньшие размеры, по сравнению с размерами исходного пептида. Согласно результатам биоинформатического анализа, белки группы MccB/PaaA, которые, вероятно, способны аденилировать небольшие пептидные субстраты, широко распространены среди различных таксономических групп бактерий, в том числе паразитов человека, растений и животных (Рисунок 35). Тем не менее, мы не исключаем, что в наше филогенетическое древо не попали некоторые представители таких ферментов, по причине сильной дивергенции и отсутствия в открытых базах данных нуклеотидных последовательностей прилегающих к кодирующим их генам. Мы предполагаем, что некоторые из обнаруженных нами коротких пептидов (представлены на рисунке 35), содержащих остатки аспарагина, являются субстратами для соответствующих ферментов группы MccB/PaaA. Такие пептиды кодируются короткими генами, расположенными в непосредственной близости от генов, кодирующих белки MccB/PaaA. Одним из способов экспериментального подтверждения правильности биоинформатического предсказания может служить описанный нами энзиматический метод проверки специфичности субстрат-ферментной пары предполагаемых гомологов MccB-MccA in vitro. Тем не менее, для многих представителей группы MccB/PaaA, приведенных на филогенетическом дереве, нам не удалось идентифицировать гены, которые могли бы кодировать потенциальные пептидные субстраты. Это может быть связано с тем, что в некоторых случаях аденилирование может осуществляться по другой аминокислоте, отличной от аспарагина, или же тем, что ОРС пептидного субстрата расположена вне предполагаемого оперона в другом месте генома. Такой случай отсутствия сцепленности генов пептидного субстрата и фермента модификации был описан для тиазол-содержащего бактериоцина бацилл [33]. Белок МссВ E. coli - это представитель Е1-суперсемейства, характерной особенностью которого является Е1-укладка, представляющая собой модифицированную укладку Россманна (Рисунок 20). Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей ортологов МссВ, протестированных в нашей работе, показал, что именно Е1-домен, ответственный за связывание АТФ, является наиболее консервативной частью этих белков. Следует отметить, что 135 белок МссВ E. coli не проявляет сродства к другим нуклеотидам, отличным от АТФ (данные не представлены), в то время как ортологи МссВ из Synechococcus sp. и Y. pseudotuberculosis способны с разной степенью эффективности использовать в качестве субстратов нуклеозид трифосфаты, отличные от АТФ (Дубилей С.А., личное сообщение). При анализе аминокислотных выравниваний ортологов МссВ, нам не удалось обнаружить значимых замен, изменяющих консервативные участки, ответственные обеспечивать за способность связывание ортологов нуклеотидов, МссВ которые Synechococcus могли бы и Y. sp. pseudotuberculosis взаимодействовать с другими нуклеотидами. Чтобы дать ответ на этот вопрос, потребуются дополнительные исследования, включая структурный анализ. Белок МссВ E. coli и родственные белки обладает рядом уникальных свойств, что позволяет выделить их в отдельную группу среди белков Е1-суперсемейства. Самой значимой отличительной особенностью является наличие домена "пептидные клещи", принимающего участие в связывании пептидного субстрата МссА [76]. Этот домен формируется за счет N-концевого участка белка МссВ и части кроссоверной петли (Рисунок 36). Аналогичные структуры отсутствуют у характерных представителей прокариотической ветви белков Е1-суперсемейства, таких как ThiF и MoeB (Приложение: Рисунок 1). На основании выравнивания аминокислотных последовательностей белков, протестированных в этой работе, их можно разделить на две группы: 1) ортологи МссВ, использующие в качестве субстрата гептапептиды, в эту группу входят белки, закодированные в геномах B. washoensis, S. thermophilus, L .johnsonii и на плазмидах E. coli и H. pylori; 2) ортологи МссВ, использующие в качестве субстрата удлиненные аналоги МссА, закодированные в геномах Synechococcus sp. и Y. pseudotuberculosis. Основываясь протестированных на выравнивании ортологов МссВ, аминокислотных последовательностей мы выявить постарались некоторые структурно-функциональные закономерности. Так как последовательности первой группы белков оказались наиболее близки друг к другу, внимание было уделено именно им. В первую очередь, нас интересовали консервативные позиции аминокислотных остатков, формирующих домен "пептидные клещи". Внутри белков этой группы консервативные и полуконсервативные позиции, как правило, 136 соотносятся с элементами вторичной структуры, такими как α-спирали и β-тяжи (Рисунок 37). Это соответствует известной закономерности, согласно которой эволюция аминокислотных последовательностей (ортологов и паралогов) идет в сторону сохранения третичной структуры белка, так как именно третичная структура обеспечивает Накопление функциональную аминокислотных замен активность в ходе белковой эволюции молекулы. первичной последовательности идет, как правило, в первую очередь в петлевых или междоменных участках, не играющих значительной роли в катализе или поддержании правильной архитектуры белка [86]. Максимальное количество отличий между последовательностями МссВ можно найти в той части, которая ответственна за формирование домена "пептидные клещи". По всей видимости, это связано с различиями в аминокислотной последовательности узнаваемых пептидных субстратов и, следовательно, разнонаправленным давлением отбора. Нам все же хотелось выявить некоторые характерные черты домена "пептидные клещи", по которым мы смогли бы отделить белки группы MccB/PaaA от других представителей Е1-суперсемейства, так как отличия в структуре укладки Россманна для этих белков минимальны. Поэтому, чтобы определить, являются ли консервативные и полуконсервативные аминокислотные позиции значимыми, или их появление связано лишь со случайным совпадением, мы изучили их положение в кристалле MccB E. coli. Консервативный среди ортологов МссВ первой группы остаток тирозина Y3 участвует в формировании гидрофобного ядра, координирующего вокруг себя β1 и β5-тяжи, а также α2 и α3-спирали, удерживающего внешнюю часть домена "пептидные клещи" в правильной ориентации (Рисунок 36). Этот остаток тирозина Y3, расположенный на β1-тяже, формирует гидрофобные взаимодействия с остатками P80, I78, F69, F45, тем самым удерживая вместе α3 - спираль и β5-тяж, остаток F69 в свою очередь образует контакт с тирозином Y51 и участвует в правильной ориентации α2-спирали. Также тирозин Y3 формирует водородные связи с аминогруппой лизина K73 за счет взаимодействия боковых радикалов, а также с остатком серина S49 за счет взаимодействия аминогруппы и карбоксигруппы боковых цепей (Рисунок 45, А). 137 Рисунок 45. Положение некоторых аминокислотных остатков в белке МссВ E. coli. Мономерные субъединицы в составе гомодимера белка МссВ (PDB: 3H9G) окрашены розовым и голубым соответственно и представлены в виде элементов вторичной структуры. Пептидный субстрат МссА, расположенный в активном центре фермента МссВ, показан в виде белых палочек. Консервативные и полуконсервативные аминокислотные остатки представлены в виде палочек желтого цвета, рядом с которыми черным жирным шрифтом указаны их названия (в виде однобуквенного кода) и позиция в белке МссВ. Аминокислотные остатки, предположительно, взаимодействующие с этими консервативными или полуконсервативными аминокислотными остатками выделены в виде палочек, цвет которых соответствует цвету мономера, на котором они расположены. Желтой пунктирной линией показаны расстояния между остатками, если они составляют менее 4Å (то есть предположительно формируют связь того или иного типа). Атомы кислорода окрашены красным, азота - синим, серы - тѐмно-желтым. Гидрофобное ядро, сформированное контактами между остатками F77 и V9, L72, F71, V20, а также V20 и V29, I38, F71, удерживает вместе такие элементы вторичной структуры, как α1, α3-спирали и β3 и β4-тяжи (Рисунок 45, Б). 138 Гидрофобные взаимодействия между остатками L72 и I78 ориентируют β5-тяж возле α3, а взаимодействия между остатками V9, L5 и A42 удерживают вместе β1тяж и α1-спираль (Рисунок 45, В). Остатки W35, L32, алифатическая часть E36, K40, K278 и R13, а также I275, I279, L281, I282, Y43, I46, I39, I11 и V20 удерживают вместе β2, β3-слои, α1-спираль и спираль α9 соседней субъединицы гомодимера (Рисунок 45, Г). Таким образом гидрофобные взаимодействия обеспечивают поддержание правильного положения элементов вторичной структуры домена "пептидные клещи". При этом среди ортологов МссВ первой группы гидрофобные аминокислотные остатки, формирующие такие контакты, в подавляющем большинстве случаев не строго консервативны, и на их месте может располагаться любой другой остаток, имеющий алифатические или ароматические радикалы. Интересно, что остатки глицина G21 и G23 консервативны среди различных представителей ортологов МссВ первой группы (Рисунок 37). На этом участке, расположенном между β3 и β4, происходит поворот полипептидной цепи (Рисунок 45, Д). Консервативный остаток изолейцина I60 формирует гидрофобные контакты с остатками F65 и алифатической цепью K40. В свою очередь остаток фенилаланина F65 образует контакты с остатками L55, Y51 и T41, а Y51 координирует остаток глутамата E62 путем образования водородных связей. Также водородные связи формируются между аспартатом D64 и аспарагином N37. Таким образом за счет взаимодействий между боковыми радикалами различной природы удерживаются вместе три α-спирали (α1 - α3), формирующих внешнюю часть домена "пептидные клещи" (Рисунок 45, Е). Консервативный остаток аспарагина N75 формирует водородные связи с также консервативным остатком глутамина Q27 и главной цепью фенилаланина F71. Карбокси-группа основной цепи K25, по всей видимости, формирует водородную связь с аминогруппой остатка лизина Q27. Благодаря этим взаимодействиям правильным образом ориентируется α3-спираль, β3-тяж и петлевой участок между β2 и β3, на котором расположены аминокислотные остатки, участвующие в связывании пептидного субстрата и катализе (Рисунок 45, Ж). 139 Боковая группировка консервативного остатка аспарагина N283, который располагается на α9-спирали соседнего мономера, формирует водородные связи с атомом кислорода и азота основной цепи остатка изолейцина I11 β2-тяжа, тем самым удерживает в правильной ориентации соседний остаток лизина K10, который принимает участие в катализе [76] (Рисунок 45, З). В связывании пептидного субстрата участвуют аминокислотные остатки, расположенные на небольшом β-слое, сформированном β2 -β4. Одним из наиболее примечательных остатков является глутамат E26, который формирует водородные связи с азотом гуанидиновой группировки аргинина R2 и спиртовой группировкой серина S3 субстрата МссА [76]. Аналогичного остатка глутамата не удалось найти среди ортологов белка МссВ, что, вероятно, связано с различиями первичной последовательности пептидных субстратов МссА у разных ортологов (Рисунок 37). Также в связывании аргинина R2 MccA принимает участие остаток Y14, образуя водородную связь между гидроксо-группой Y14 и гуанидиновой группировкой R2. Этот остаток тирозина также не является консервативным среди белков МссВ (Рисунок 37). В поддержании правильной ориентации Y14 принимают участие гидрофобные взаимодействия с остатками Y28 и L19. Эти остатки расположены на β-листе, сформированном β2-β4-тяжами, и удерживаются за счет связей E26, S16 и Y28 (Рисунок 45, И). Все аминокислотные остатки, которые принимают участие в поддержании правильной конформации домена "пептидные клещи" MccB E. coli, на рисунке 37 выделены красным цветом. Большинство из них являются консервативными или полуконсервативными среди ортологов МссВ первой группы. На основании проделанного анализа, мы предполагаем, что ортологи белка МссВ из B. washoensis, H. pylori, L. johnsonii и S. thermophilus имеют схожую третичную структуру, аналогичную укладке белка MccB E. coli. Внутри первой группы ортологов МссВ на основании схожести аминокислотных последовательностей можно выделить две подгруппы: MccB из E. coli и B. washoensis, и белки МссВ из организмов H. pylori, L .johnsonii и S. thermophilus. Мы предполагаем, что эволюция внутри группы ортологов МссВ, использующих в качестве субстрата гептапептиды, шла путем дивергенции от предковой формы на, как минимум, две филогенетические ветви. 140 Вторая группа ортологов МссВ имеет наибольшее количество отличий в части последовательности, формирующей домен "пептидные клещи", что, вероятно связано с различиями в длине пептидных субстратов, которая значительно превышает семь аминокислот. В то же время нами установлено, что длина пептида, способного связываться с ортологом МссВ из организма Synechococcus sp. может быть как минимум в 2 раза меньше природного МссА (20 а.к. против 56 а.к.) (Таблица 5). Таким образом размер С-концевой части пептидного субстрата, участвующего во взаимодействии с этим ферментом МссВ, может быть значительно меньше длины полноразмерного субстрата. Мы не знаем наверняка степень схожести третичной структуры белков МссВ E. coli и Synechococcus sp., а также того, имеют ли удлиненные пептиды МссА из организмов Y. pseudotuberculosis и Synechococcus sp. вторичную или третичную укладу, как, например, убиквитин-подобные белки (Рисунок 22). Более того, белок МссВ из Y. pseudotuberculosis помимо N-концевого участка, характерного для белков группы МссВ, включает также дополнительный метилазный домен. Аналогичная доменная архитектура найдена у пока что неизученного гомолога МссВ из Bacillus amyloliquefaciens DSM 7. Одним из путей эволюционного процесса, который хорошо прослеживается при переходе от прокариот к эукариотическим организмам, является рекомбинация отдельных доменов. Таким образом путем комбинации или надстройки новых доменов, выполняющих различные функции, возникают белки с новыми функциями. При этом местами, подвергающимися наименьшему эволюционному давлению, являются петлевые участки, соединяющие отдельные домены или элементы вторичной структуры [86]. Можно предположить, что гомологи МссВ из Y. pseudotuberculosis и B. amyloliquefaciens являются более поздними эволюционными изобретениями, как минимум, по сравнению с филогенетической ветвью, включающей гомологов МссВ, использующих удлиненные пептидные субстраты (более 7 а.к.). Также можно предположить, что эти два фермента участвуют в биохимическом пути синтеза пост-трансляционно модифицированных пептидов несколько отличающимся от пути синтеза микроцина С E. coli. Во второй части нашей работы мы показали, что белок МссВ E. coli способен узнавать и аденилировать пептидные субстраты, аминокислотная 141 последовательность которых отлична от последовательности MRTGNAN пептида МссА. Мутантные аналоги МссА, использованные в работе, отбирались на основе анализа разрешенного кристаллического комплекса МссВ с субстратами (МссА и АТФ), полученного в лаборатории Уолша [76], и трехмерного моделирования. Уолш и соавторы показали, что N-концевой метионин пептида МссA в активном центре фермента помещается в гидрофобном кармане, сформированном на Е1домене МссВ. Метионин удерживается за счет гидрофобных взаимодействий и нескольких водородных связей [76]. Мы предположили, что замена N-концевого метионина MccA на сходную по свойствам и размерам гидрофобную аминокислоту, не будет препятствовать связыванию такого мутантного субстрата с ферментом. Мы оценивали эффективность связывания мутантной аминокислоты в гидрофобном кармане качественно по степени перекрывания Ван-дер-Вальсовых радиусов с помощью ПО PyMol. По результатам моделирования, мы построили ряд аминокислотных замен, в котором, на наш взгляд, должна уменьшаться эффективность связывания мутантных пептидов в этом кармане: Met ≈ Phe ≥ Ile ≈ Leu >> Val > Ala >> Gly. В этом же ряду уменьшается гидрофобность аминокислотных остатков [58]. Исключение составляет метионин и валин, гидрофобность которых практически одинаковая. Главным отличием этих двух остатков является размер бокового радикала. Так метионин имеет "вытянутый" боковой радикал, который хорошо проникает в гидрофобный карман и располагается на расстоянии Ван-дер-Вальсовых радиусов от остатков I243, V245, W326 и H333, которые, по предположению Уолша и соавторов, обеспечивают его удержание в этом кармане [76]. Напротив, валин имеет "разветвленный" боковой радикал. Степень его проникновения в гидрофобный карман мала. Боковой радикал валина в составе пептида VRTGNAN находится на расстоянии более 4Å от остатков H333 и алифатической цепи Q335 и R322. Мы предполагаем, что по этой причине, пептид VRTGNAN связывается в активном центре фермента МссВ довольно слабо. Как результат, в тестах in vitro пептид VRTGNAN аденилируется ферментом МссВ в следовых количествах. Боковые радикалы аминокислотных остатков аланина и глицина в составе пептидов ARTGNAN и GRTGNAN слишком удалены от гидрофобного кармана МссВ на расстояние более 4Å. Это позволяет предполагать, что такие пептиды с ферментом МссВ в этой части активного центра 142 не связываются, в результате их аденилированные продукты в реакции с МссВ не образуются. Напротив, пептиды FRTGNAN, IRTGNAN и LRTGNAN аденилируются ферментом МссВ in vitro в количествах, достаточных для детектирования продукта реакции с помощью как масс-спектрометрии, так и ВЭЖХ. Мы также смоделировали положение в гидрофобном кармане зараженных и полярных аминокислот, расположенных на N-конце мутантного пептида МссА, в составе пептидов KRTGNAN, QRTGNAN, ERTGNAN, NRTGNAN и DRTGNAN. Размер алифатической части радикала этих пяти аминокислотных остатков достаточен для глубокого проникновения в карман, но полярные группировки этих радикалов, должны препятствовать формированию гидрофобных взаимодействий и снижать стабильность фермент-субстратного комплекса. Как результат, такие пептиды не аденилируются ферментом МссВ in vitro. Фермент МссВ функционирует в качестве гомодимера. Его активный центр сформирован на границе двух мономерных субъединиц, в борозде между которыми осуществляется связывание пептида МссА. С-конец MccA обращен к сайту связывания АТФ, а N-конец - наружу, к "выходу" из этой борозды [76]. Мы предположили, что по аналогии с ортологами МссВ из организмов Synechococcus sp. и Y. pseudotuberculosis, которые аденилируют пептиды длиной 56 и 42 а.к., фермент MccB E. coli также будет способен аденилировать пептидные субстраты, удлиненные с N-конца. Предпосылками для этого также послужила известная конформационная подвижность активного центра МссВ (Рисунок 17) [76]. В подтверждение наших предположений, фермент МссВ аденилировал пептиды МссА, удлиненные с N-конца на 1, 2, 3 и 6 остатков глицина. Аналогично аденилировался пептид GGFRTGNAN, который также содержит два дополнительных остатка глицина на N-конце и фенилаланин на месте метионина MccA. Причем в реакции МссВ с удлиненными пептидами выход аденилированного продукта больше по сравнению с пептидом дикого типа (MRTGNAN) и мутантным пептидом FRTGNAN. Таким образом удлинение пептида до определенной степени благоприятствует образованию аденилированного продукта реакции, что, вероятно, объясняется повышенной эффективностью связывания с ферментом. Пептид GGGGGGRTGNAN не 143 аденилировался ферментом МссВ E. coli in vitro. Мы полагаем, что такой пептид, также как и GRTGNAN, не связывается в гидрофобном кармане МссВ, а следовательно, не модифицируется ферментом. Таким образом для взаимодействия пептида МссА или его аналогов с ферментом МссВ необходимо наличие гидрофобной аминокислоты в седьмом положении относительно С-конца пептида. Пептид с заменой С-концевой аминокислоты аспарагина пептида MRTGNAN на схожую по размерам и/или биохимическим свойствам аминокислоту, такую как аспартат или глутамин, не аденилируется ферментом МссВ в реакции in vitro. Эти данные согласуются с работой Казакова и соавторов [42]. При этом оба аминокислотных остатка при моделировании на кристалле МссВ в комплексе с пептидным субстратом МссА хорошо позиционируются в активный центр белка, не нарушая существующих взаимодействий. Таким образом стерических препятствий для связывания субстрата MRTGNAD и MRTGNAQ, на первый взгляд, не существует. Следовательно, неспособность фермента МссВ аденилировать такие пептиды связана, вероятно, с механизмом катализа этой реакции. Способность фермента МссВ аденилировать удлиненные пептидные субстраты натолкнула нас на мысль, что не существует принципиальных ограничений по длине пептидного субстрата. Эти предположения подтвердились в опытах с аденилированием химерного белка MBP, слитого с С-концевой последовательностью MRTGNAN. Мы полагаем, что С-концевой пептид MRTGNAN связывается в активном центре белка МссВ. Небольшой пептидный линкер позволяет белковой глобуле MBP-pepN расположиться снаружи от димера, не создавая стерических препятствий для связывания С-концевого участка. Таким образом, с помощью белка МссВ можно вносить пост-трансляционную модификацию (аденилирование) в белки, которые содержат на своем С-конце последовательность MRTGNAN. Этот механизм можно использовать в лабораторной практике для внесения меток (в том числе радиоактивных) в белковые молекулы. Все полученные аденилированные мутантные пептиды МссА, также как и МсС1092 (аденилированные пептид MRTGNAN) обладали антибактериальной активностью по отношению к клеткам E. coli B, но не оказывали никакого эффекта 144 на клетки E. coli B ΔyejB. Таким образом, полученные аналоги микроцина С используют аналогичный способ транспорта в клетки E. coli посредством транспортера YejABEF. При этом активность FRTGNAD-АМФ оказалась примерно равной активности МсС1092. Активность же аденилированных пептидов, удлиненных на несколько остатков глицина с N-конца, оказалась большей по сравнению с антибактериальной активностью МсС1092, причем она падала в ряду GMRTGNAD-АМФ > GGMRTGNAD-АМФ ≈ GGFRTGNAD-АМФ > GGGMRTGNAD-АМФ >> GGGGGGMRTGNAD-АМФ > FRTGNAD-АМФ ≈ MRTGNAD-АМФ. Опираясь на косвенные признаки, мы предполагаем, что удлиненные пептиды более эффективно проникают в клетки E. coli посредством транспортера YejABEF, но, несомненно, данное предположение требует дальнейшей проверки. Следует также отметить, что антибактериальная активность аденилированного пептида GMRTGNAD-АМФ почти в 4 раза выше активности McC1092. Следовательно, нам удалось модифицировать природный антибиотик таким образом, чтобы значительно улучшить его антибактериальные свойства. Также данные, полученные нами в экспериментах с пептидами МссА различной длины из Synechococcus sp., показывают, что варьируя длину пептидной части микроцинового антибиотика можно изменять пути его входа в бактериальную клетку. А отсутствие чувствительности фермента МссВ к длине пептидного субстрата открывает возможность получения антибиотиков с желаемыми свойствами: способными проникать в клетку как посредством транспортера YejABEF, так и SbmA. Известно, что наиболее частой мутацией E. coli, приводящей к развитию устойчивости к микроцину С, является мутация в опероне yejABEF [67]. Вероятность возникновения двойной мутации в клетке по генам пептидных транспортеров yejABEF и sbmA, приводящей к полному нарушению транспорта пептид-аденилатов, одновременно маловероятна. Таким образом используя смесь микроцин С-подобных соединений с различной длиной пептидной части, можно получать антимикробные препараты, устойчивость к которым будет развиваться со значительно меньшей скоростью по сравнению с микроцином С дикого типа. 145 Выводы 1. Экспериментально подтверждены сделанные ранее биоинформатические предсказания о существовании пептид-нуклеотидных соединений, подобных микроцину С E. coli, и закодированных в геномах Bartonella washoensis, Helicobacter pylori, Lactobacillus johnsonii, Streptococcus thermophilus, Yersinia pseudotuberculosis и Synechococcus sp. 2. Полученные природные гомологи микроцина С из Bartonella washoensis, Helicobacter pylori, Lactobacillus johnsonii, Streptococcus thermophilus, Yersinia pseudotuberculosis и Synechococcus sp. обладают антибактериальной активностью по отношению к клеткам E. coli, и действуют по механизму, аналогичному описанному ранее для микроцина С E. coli. 3. Белок МссВ E. coli аденилирует пептидные субстраты на основе пептида МссА (MRTGNAN), с заменой N-концевого остатка метионина на аминокислоты с крупными гидрофобными боковыми радикалами. 4. Белок МссВ E. coli эффективно аденилирует пептидные субстраты на основе пептида МссА (MRTGNAN), с дополнительными аминокислотами на Nконце. Удлинение пептидного субстрата до определенного предела стимулирует эффективность узнавания ферментом МссВ и антибактериальные свойства получаемых аналогов микроцина С. 5. МссВ E. coli можно использовать для концевого аденилирования белков, несущих на своѐм С-конце последовательность MRTGNAN, in vitro и in vivo. 146 Список используемой литературы 1. Азарова И.Н. Предсказание объемов удерживания и УФ-спектров пептидов в обращенно-фазовой ВЭЖХ // Биоорганическая химия. - 2006. - Vol. 32. - P. 1-8. 2. Addlagatta A. Structural basis for the unusual specificity of Escherichia coli aminopeptidase N // Biochemistry. - 2008. - Vol. 47. - P. 5303-5311. 3. Adelman K. Molecular mechanism of transcription inhibition by peptide antibiotic Microcin J25 // Mol Cell. - 2004. - Vol. 14. - P. 753-762. 4. Altschul S.F. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs // Nucleic Acids Res. - 1997. - Vol. 25. - P. 3389-3402. 5. Armougom F. Expresso: automatic incorporation of structural information in multiple sequence alignments using 3D-Coffee // Nucleic Acids Res. - 2006. Vol. 34. - P. W604-608. 6. Arnison P.G. Ribosomally synthesized and post-translationally modified peptide natural products: overview and recommendations for a universal nomenclature // Nat Prod Rep. - 2013 - Vol. 30. - P. 108-160. 7. Asensio C. A new family of low molecular weight antibiotics from enterobacteria // Biochem Biophys Res Commun. - 1976. - Vol. 69. - P. 7-14. 8. Baquero F. Microcin plasmids: a group of extrachromosomal elements coding for low-molecular-weight antibiotics in Escherichia coli // J Bacteriol. - 1978. - Vol. 135. - P. 342-347. 9. Baquero F. The microcins // FEMS Microbiology Letters. - 1984. - Vol. 23. - P. 117–124. 10. Barilla D. The tail of the ParG DNA segregation protein remodels ParF polymers and enhances ATP hydrolysis via an arginine finger-like motif // Proc Natl Acad Sci U S A. - 2007. - Vol. 104. - P. 1811-1816. 11. Bates A.D. Energy coupling in type II topoisomerases: why do they hydrolyze ATP? // Biochemistry. - 2007. - Vol. 46. - P. 7929-7941. 147 12. Blond A. Structure-activity relationship of the antibiotic nucleotide-peptide microcin C51 // in Proceedings 26th European Peptide Symposium - 11 Sep. - 15 Sep. 2000. - Montpellier, France. - 601–602 p. 13. Branden C. Introduction to Protein Structure / Garland Publishing Inc., 1999. 410 p. 14. Burroughs A.M. Natural history of the E1-like superfamily: implication for adenylation, sulfur transfer, and ubiquitin conjugation // Proteins. - 2009. - Vol. 75. - P. 895-910. 15. Cascales E. Colicin biology // Microbiol Mol Biol Rev. - 2007. - Vol. 71. - P. 158-229. 16. Chabbert Y. Analyse bacteriologique des complexes de colicines produits par 14 souches d'Escherichia coli antibiotiques // Annales de l'Institut Pasteur (Paris). 1950. - Vol. 79. - P. 51-59. 17. Chandu D. PepN is the major aminopeptidase in Escherichia coli: insights on substrate specificity and role during sodium-salicylate-induced stress // Microbiology. - 2003. - Vol. 149. - P. 3437-3447. 18. Ciechanover A. Ubiquitin-mediated proteolysis: biological regulation via destruction // Bioessays. - 2000. - Vol. 22. - P. 442-451. 19. Corbalan N. Functional and structural study of the dimeric inner membrane protein SbmA // J Bacteriol. - 2013 - Vol. 195. - P. 5352-5361. 20. Datsenko K.A. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K12 using PCR products // Proc Natl Acad Sci U S A. - 2000. - Vol. 97. - P. 66406645. 21. Diaz-Guerra L. appR gene product activates transcription of microcin C7 plasmid genes // J Bacteriol. - 1989. - Vol. 171. - P. 2906-2908. 22. Drider Djamel R.S. Prokaryotic Antimicrobial Peptides: From Genes to Applications / Springer Science+Business Media, 2011. - 451 p. 23. Duda D.M. Structural analysis of Escherichia coli ThiF // J Mol Biol. - 2005. Vol. 349. - P. 774-786. 24. Duquesne S. Microcins, gene-encoded antibacterial peptides from enterobacteria // Nat Prod Rep. - 2007. - Vol. 24. - P. 708-734. 148 25. Dye B.T. Structural mechanisms underlying posttranslational modification by ubiquitin-like proteins // Annu Rev Biophys Biomol Struct. - 2007. - Vol. 36. - P. 131-150. 26. Fomenko D. Regulation of microcin C51 operon expression: the role of global regulators of transcription // Res Microbiol. - 2001. - Vol. 152. - P. 469-479. 27. Fomenko D.E. Microcin C51 plasmid genes: possible source of horizontal gene transfer // Antimicrob Agents Chemother. - 2003. - Vol. 47. - P. 2868-2874. 28. Garcia-Bustos J.F. Microcin 7: purification and properties // Biochem Biophys Res Commun. - 1984. - Vol. 119. - P. 779-785. 29. Garcia-Bustos J.F. Structure and mode of action of microcin 7, an antibacterial peptide produced by Escherichia coli // Antimicrob Agents Chemother. - 1985. Vol. 27. - P. 791-797. 30. Gonzalez-Pastor J.E. The smallest known gene // Nature. - 1994. - Vol. 369. - P. 281. 31. Gonzalez-Pastor J.E. Structure and organization of plasmid genes required to produce the translation inhibitor microcin C7 // J Bacteriol. - 1995. - Vol. 177. P. 7131-7140. 32. Guijarro J.I. Chemical structure and translation inhibition studies of the antibiotic microcin C7 // J Biol Chem. - 1995. - Vol. 270. - P. 23520-23532. 33. Haft D.H. A strain-variable bacteriocin in Bacillus anthracis and Bacillus cereus with repeated Cys-Xaa-Xaa motifs // Biol Direct. - 2009. - Vol. 4. - P. 15. 34. Han M.J. Comparative analysis of envelope proteomes in Escherichia coli B and K-12 strains // J Microbiol Biotechnol. - 2012 - Vol. 22. - P. 470-478. 35. Hassan M. Natural antimicrobial peptides from bacteria: characteristics and potential applications to fight against antibiotic resistance // J Appl Microbiol. 2012 - Vol. 113. - P. 723-736. 36. Heddle J.G. The antibiotic microcin B17 is a DNA gyrase poison: characterisation of the mode of inhibition // J Mol Biol. - 2001. - Vol. 307. - P. 1223-1234. 37. Hofreuter D. Characterization of two cryptic Helicobacter pylori plasmids: a putative source for horizontal gene transfer and gene shuffling // J Bacteriol. 2002. - Vol. 184. - P. 2755-2766. 149 38. Ikari N.S. Interaction in the germfree mouse intestine of colicinogenic and colicinsensitive microorganisms // Proc Soc Exp Biol Med. - 1969. - Vol. 130. - P. 12801284. 39. Iobbi-Nivol C. Molybdenum enzymes, their maturation and molybdenum cofactor biosynthesis in Escherichia coli // Biochim Biophys Acta. - 2013 - Vol. 1827. - P. 1086-1101. 40. Jin M. Structural and functional analysis of pantocin A: an antibiotic from Pantoea agglomerans discovered by heterologous expression of cloned genes // Angew Chem Int Ed Engl. - 2003. - Vol. 42. - P. 2898-2901. 41. Jin M. The biosynthetic gene cluster of Pantocin a provides insights into biosynthesis and a tool for screening // Angew Chem Int Ed Engl. - 2003. - Vol. 42. - P. 2902-2905. 42. Kazakov T. Amino acid residues required for maturation, cell uptake, and processing of translation inhibitor microcin C // J Bacteriol. - 2007. - Vol. 189. P. 2114-2118. 43. Kazakov T. Escherichia coli peptidase A, B, or N can process translation inhibitor microcin C // J Bacteriol. - 2008. - Vol. 190. - P. 2607-2610. 44. Khmel I.A. Isolation and characterization of Escherichia coli strains producing microcins of B and C types // FEMS Microbiol Lett. - 1993. - Vol. 111. - P. 269274. 45. Kulikovsky A. The molecular mechanism of aminopropylation of peptidenucleotide antibiotic microcin C // J Am Chem Soc. - 2014 - Vol. 136. - P. 1116811175. 46. Kurepina N.E. [Microcin R51 and a plasmid determining its synthesis] // Mol Gen Mikrobiol Virusol. - 1990. - Vol. - P. 12-17. 47. Kurepina N.E. Cloning and mapping of the genetic determinants for microcin C51 production and immunity // Mol Gen Genet. - 1993. - Vol. 241. - P. 700-706. 48. Lake M.W. Mechanism of ubiquitin activation revealed by the structure of a bacterial MoeB-MoaD complex // Nature. - 2001. - Vol. 414. - P. 325-329. 49. Larkin M.A. Clustal W and Clustal X version 2.0 // Bioinformatics. - 2007. - Vol. 23. - P. 2947-2948. 150 50. Lavina M. Identification, mapping, cloning and characterization of a gene (sbmA) required for microcin B17 action on Escherichia coli K12 // J Gen Microbiol. 1986. - Vol. 132. - P. 1685-1693. 51. Law C.J. Ins and outs of major facilitator superfamily antiporters // Annu Rev Microbiol. - 2008. - Vol. 62. - P. 289-305. 52. Lee I. Structural insights into E1-catalyzed ubiquitin activation and transfer to conjugating enzymes // Cell. - 2008. - Vol. 134. - P. 268-278. 53. Lehmann C. Structure of the Escherichia coli ThiS-ThiF complex, a key component of the sulfur transfer system in thiamin biosynthesis // Biochemistry. 2006. - Vol. 45. - P. 11-19. 54. Leimkuhler S. Characterization of Escherichia coli MoeB and its involvement in the activation of molybdopterin synthase for the biosynthesis of the molybdenum cofactor // J Biol Chem. - 2001. - Vol. 276. - P. 34695-34701. 55. Lois L.M. Structures of the SUMO E1 provide mechanistic insights into SUMO activation and E2 recruitment to E1 // Embo J. - 2005. - Vol. 24. - P. 439-451. 56. Madison L.L. The leader peptide is essential for the post-translational modification of the DNA-gyrase inhibitor microcin B17 // Mol Microbiol. - 1997. - Vol. 23. - P. 161-168. 57. Mathavan I. The role of bacterial membrane proteins in the internalization of microcin MccJ25 and MccB17 // Biochem Soc Trans. - 2012 - Vol. 40. - P. 15391543. 58. Matthews B.W. Hydrophobic Interactions in Proteins / Autor // Encyclopedia of life science. - 2001.- Available from: http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1038/npg.els.0002975/abstract. 59. Mattiuzzo M. Role of the Escherichia coli SbmA in the antimicrobial activity of proline-rich peptides // Mol Microbiol. - 2007. - Vol. 66. - P. 151-163. 60. Metlitskaya A. Aspartyl-tRNA synthetase is the target of peptide nucleotide antibiotic Microcin C // J Biol Chem. - 2006. - Vol. 281. - P. 18033-18042. 61. Metlitskaya A. Maturation of the translation inhibitor microcin C // J Bacteriol. 2009. - Vol. 191. - P. 2380-2387. 62. Metlitskaya A.Z. Structure of microcin C51, a new antibiotic with a broad spectrum of activity // FEBS Lett. - 1995. - Vol. 357. - P. 235-238. 151 63. Moreno F. The regulation of microcin B, C and J operons // Biochimie. - 2002. Vol. 84. - P. 521-529. 64. Nadanaciva S. Importance of F1-ATPase residue alpha-Arg-376 for catalytic transition state stabilization // Biochemistry. - 1999. - Vol. 38. - P. 15493-15499. 65. Notredame C. T-Coffee: A novel method for fast and accurate multiple sequence alignment // J Mol Biol. - 2000. - Vol. 302. - P. 205-217. 66. Novikova M. MccE provides resistance to protein synthesis inhibitor microcin C by acetylating the processed form of the antibiotic // J Biol Chem. - 2010 - Vol. 285. - P. 12662-12669. 67. Novikova M. The Escherichia coli Yej transporter is required for the uptake of translation inhibitor microcin C // J Bacteriol. - 2007. - Vol. 189. - P. 8361-8365. 68. Novoa M.A. Cloning and mapping of the genetic determinants for microcin C7 production and immunity // J Bacteriol. - 1986. - Vol. 168. - P. 1384-1391. 69. Oman T.J. Follow the leader: the use of leader peptides to guide natural product biosynthesis // Nat Chem Biol. - 2010 - Vol. 6. - P. 9-18. 70. Paz-Yepes J. Role of a microcin-C-like biosynthetic gene cluster in allelopathic interactions in marine Synechococcus // Proc Natl Acad Sci U S A. - 2013 - Vol. 110. - P. 12030-12035. 71. Price M.N. FastTree 2--approximately maximum-likelihood trees for large alignments // PLoS One. - 2010 - Vol. 5. - P. e9490. 72. Pruitt K.D. NCBI reference sequences (RefSeq): a curated non-redundant sequence database of genomes, transcripts and proteins // Nucleic Acids Res. 2007. - Vol. 35. - P. D61-65. 73. Quinones M. Sequence and gene expression analyses of plasmid pHPM8 from Helicobacter pylori reveal the presence of two operons with putative roles in plasmid replication and antibiotic activity // Plasmid. - 2001. - Vol. 46. - P. 223228. 74. Rajagopalan K.V. Biosynthesis and processing of the molybdenum cofactors // Biochem Soc Trans. - 1997. - Vol. 25. - P. 757-761. 75. Rebuffat S. Microcins in action: amazing defence strategies of Enterobacteria // Biochem Soc Trans. - 2012 - Vol. 40. - P. 1456-1462. 152 76. Regni C.A. How the MccB bacterial ancestor of ubiquitin E1 initiates biosynthesis of the microcin C7 antibiotic // Embo J. - 2009. - Vol. 28. - P. 1953-1964. 77. Roush R.F. Maturation of an Escherichia coli ribosomal peptide antibiotic by ATP-consuming N-P bond formation in microcin C7 // J Am Chem Soc. - 2008. Vol. 130. - P. 3603-3609. 78. Rudolph M.J. Crystal structure of molybdopterin synthase and its evolutionary relationship to ubiquitin activation // Nat Struct Biol. - 2001. - Vol. 8. - P. 42-46. 79. Runti G. Functional characterization of SbmA, a bacterial inner membrane transporter required for importing the antimicrobial peptide Bac7(1-35) // J Bacteriol. - 2013 - Vol. 195. - P. 5343-5351. 80. Salomon R.A. The peptide antibiotic microcin 25 is imported through the TonB pathway and the SbmA protein // J Bacteriol. - 1995. - Vol. 177. - P. 3323-3325. 81. Saraste M. The P-loop--a common motif in ATP- and GTP-binding proteins // Trends Biochem Sci. - 1990. - Vol. 15. - P. 430-434. 82. Scheffzek K. GTPase-activating proteins: helping hands to complement an active site // Trends Biochem Sci. - 1998. - Vol. 23. - P. 257-262. 83. Semenova E. Structure-activity analysis of microcinJ25: distinct parts of the threaded lasso molecule are responsible for interaction with bacterial RNA polymerase // J Bacteriol. - 2005. - Vol. 187. - P. 3859-3863. 84. Severinov K. Low-molecular-weight post-translationally modified microcins // Mol Microbiol. - 2007. - Vol. 65. - P. 1380-1394. 85. Smajs D. Complete sequence of low-copy-number plasmid MccC7-H22 of probiotic Escherichia coli H22 and the prevalence of mcc genes among human E. coli // Plasmid. - 2008. - Vol. 59. - P. 1-10. 86. Studer R.A. Residue mutations and their impact on protein structure and function: detecting beneficial and pathogenic changes // Biochem J. - 2013 - Vol. 449. - P. 581-594. 87. Tikhonov A. The mechanism of microcin C resistance provided by the MccF peptidase // J Biol Chem. - 2010 - Vol. 285. - P. 37944-37952. 88. Walden H. Insights into the ubiquitin transfer cascade from the structure of the activating enzyme for NEDD8 // Nature. - 2003. - Vol. 422. - P. 330-334. 153 89. Walker J.E. Distantly related sequences in the alpha- and beta-subunits of ATP synthase, myosin, kinases and other ATP-requiring enzymes and a common nucleotide binding fold // Embo J. - 1982. - Vol. 1. - P. 945-951. 90. Walker J.R. Biotinylation facilitates the uptake of large peptides by Escherichia coli and other gram-negative bacteria // Appl Environ Microbiol. - 2005. - Vol. 71. - P. 1850-1855. 91. Wendler P. Structure and function of the AAA+ nucleotide binding pocket // Biochim Biophys Acta. - 2012 - Vol. 1823. - P. 2-14. 92. Yorgey P. Posttranslational modifications in microcin B17 define an additional class of DNA gyrase inhibitor // Proc Natl Acad Sci U S A. - 1994. - Vol. 91. - P. 4519-4523. 93. Zeng Y. Characterization of two seryl-tRNA synthetases in albomycin-producing Streptomyces sp. strain ATCC 700974 // Antimicrob Agents Chemother. - 2009. Vol. 53. - P. 4619-4627. 94. Zukher I. Ribosome-controlled transcription termination is essential for the production of antibiotic microcin C // Nucleic Acids Res. - 2014- Vol. 42. - P. 11891-11902. 154 Приложение Таблица 1. Сравнение структурных элементов белков Е1-суперсемейства. Таблица основана только на опубликованных данных различных авторов, получивших и разрешивших кристаллы белков MccB, MoeB и ThiF. Белок, представитель Е1суперсемейства MccB [76] MoeB [48] ThiF [23, 53] среди прокариот PBD 3H5A, 3H5N, 1JW9; 1JWA; 1JWB 1ZKM; 1ZFN; 1ZUD идентификатор 3H9G, 3H9Q, 3H9J, 351 а.к.// 7 а.к. 249 а.к.// 81 а.к. 253 а.к.// 66 а.к. MccB2-MccA2 MoeB2-MoaD2 ThiF2-ThiS2 Доменная 2 домена: домен 1 домен: Е1-домен 1 домен: Е1-домен организация "пептидные Через Через гидрофобные взаимодействия 3H5R Длина фермента// субстрата Комплекс с субстратом клещи" и Е1-домен Димеризация Структуры описаны не гидрофобные поверхности гомодимере MoeB в с участием: 1) расположенных обоих антипараллельно α8-спиралей мономеров участвующие во от (остатки, взаимодействии: V190, P192, V193, V196, T199, L200, A202, L203, E204, I206, K207); 2) петель между α1 и α2, α8 и β7 одной субъединицы (L15, I18, I212) и петель между β5 и β6 другой субъединицы (F154); 3) 310-спирали и петли между ними (L65, S66, L68, Q69, I72); 4) стекинга триптофана между β8 остатками каждой из мономерных субъединиц (W229); 5) остатков P192 и I72 одной субъединицы и L45 и Y46 другой. Через полярные взаимодействия и 155 образование водородных связей между аминокислотными остатками на разных субъединицах: 1) K207 и S227; 2) K225 и D17, E213. Вторичная 13 β-тяжей, 10 α- 8 β-тяжей, 8 α-спиралей, 8 β-тяжей, 8 α-спиралей, 2 310- структура спиралей, 2 310-спирали (310А и спирали (310А и 310B). фермента спирали (310A-D). 310B). 8 β6-β13 формируют 8 β-тяжей формируют протяженный β-слой, окруженный с один протяженный один протяженный β- обеих сторон 8 α-спиралями. β-слой, слой, окруженный с В N-концевой части расположена обеих сторон α- вариация укладки Россманна, где 4 310- окруженный с 8 обеих сторон 7 α- спиралями. спиралями (α4-α10) В и 3 310 -спиралями расположена (310B-310D). укладки Россманна, где Такая правильное N-концевой части вариация структура правильное чередование представляет собой βαβαβ вариант укладки между β2 и α4 вставкой (Е1- из двух 310-спиралей: Россманна укладка). β-тяжей формируют один чередование βαβαβ нарушается между β2 и α4 вставкой из двух 310-спиралей: 310А и 310В. нарушается 310А и 310В. Связывание пептидного субстрата Аминокислотные остатки Пептид в В комплексе MoeB- В комплексе ThiF-ThiS: борозде, MoaD: C-концевой гидрофобные взаимодействия между структуры, сформированной фрагмент MoaD (76-81) белками осуществляются за счет принимающие АТФ- участвует в связывании поверхностей связывающим с центром поворотом цепи перед α3, петлей MoeB. С-конец MoaD перед α6, R70, тяжами β5-β8 и α7- доменом вытянут вдоль β5 MoeB. спиралью белка ThiF и β3, β4, D7, белкового "пептидные Центральная часть β5 L58 и С-концевым участком (60-66) субстрата клещи". образована белка ферментами пептидного предпочтительно водородные связи и солевой мостик субстрата небольшими между R230 ThiF и D7 ThiS. аминокислотам (G, A, R132 непосредственной S). правильной ориентации активного близости R135 принимает участие центра фосфата АТФ. в пептидного В ориентации участие и связан в связывании пептидного доменом или и С-конец находится в от α- заякоривании активным правильной активного субстрата центра при связывании принимают С-конца участие субстрата пептидного в его сформированных: Также ThiS. принимает при основании образуются участие в связывании С-конца субстрата в в его непосредственной близости от α-фосфата АТФ. 156 аминокислотные основании остатки: непосредственной - связывание С- концевой части - в близости от α-фосфата АТФ. K10, E26; -формирование гидрофобного кармана для метионина МссА I243, V245, W326, H333, R322, Q335. Связывание АТФ Аминокислотные В комплексе MccB- остатки, MccA-ATP: принимающие связан участие в связывании АТФ АТФ в В комплексе MoeB- Аденин связан в гидрофобном MoaD-ATP: АТФ связан кармане с остатками I34, L107, T126, в T131, непосредственной счет близости субстрата MoeD. гидроксо-группой Аденин связан кислородом остова L107 за счет в образования водородной связи с N6 конца субстрата MccA. В неспецифически гидрофобных за близости С- С-конца R106 непосредственной от от D59, взаимодействий, T131 и формировании гидрофобном кармане, аденина. Рибоза связана с остатками АТФ- заякоривание АТФ G35 и G37 P-петли, 2'-гидроксил связывающего осуществляется за счет связан с D59, 3'-гидроксил с D59 и центра принимают рибозы и трифосфата. α- K83. α-фосфат координируется за участие фосфат расположен счет глубоко в АТФ- радикалов R70 и D127. β-фосфат связывающем пакете, взаимодействует с R70, Q71, K83. γ- основной фосфат формирует солевой мостик с обе субъединицы. Аденин связан в гидрофобном кармане: формирует L121, контакт с G41 P-петли, I194, A213, L219. С R73 образует контакты рибозой с атомами кислорода α- и фосфатами и формируют взаимодействует полярные контакты фосфатом, а S69 и N70 остатки связывают γ-фосфат. N154, β-фосфатов, остова G38 и боковых R70. K86 с β- R157, Q158, K170. Вторичные структуры, принимающие участие в связывании АТФ (жирным шрифтом отмечены консервативные остатки, в скобках - координаты аминокислотного остатка на соответствующей первичной последовательности белка) Глицин мотив богатый (или Р- В петле между α6 и В петле между α3 и β1: В петле между α3 и β1: β6: LIVGLGGLG (35-43) LIIGLGGLG (32-40) 157 петля) VILGCGGIG (обеспечивает вход (119 - 127) АТФ в активный сайт )[89] Консервативный Петля между β7 и Петля между β2 и 310A- Петля между β2 и 310A-спиралью: DXD-мотив 310B-спиралью: спиралью: DFD (62-64) DDD (59-61) (участвует в DND (146-148) связывании рибозы) Cвязывание β- и γ- 310B-спираль: 310A-спираль: 310A-спираль: фосфата TNLTRQ (153-158) SNLQRQ (69-74) SNLQRQ (66-71) Связывание Mg2+ D214 D130 D127 Аргининовый R94, YSRNF R14, YNRQI (12-16) R11, YSRQI (9-13) палец (92-96) АТФ и стабилизация пирофосфата Особые структуры 2+ Связывание Zn C257, C260, C343, C172, C175, C244, C247 C169, C172, C240, C243 Не просматривается на Участок между β6 и α8 (174-186). кристалле Важна длина петли. Остаток W174 C346 Кроссоверная Входит в состав петля домена "пептидные (координаты) клещи" принимает участие в реакции аденилирования, остаток C184 - в формировании ThiF-ThiS ацидилсульфида Аминокислотные Аргининовый остатки, палец участвующие катализе в Аргининовый R94 R14 палец предоставляется предоставляется второй субъединицей. второй Конформационные субъединицей. изменения Y239 связывает α- активном центре малы фосфат АТФ и С- (заметны конец МссА. R14), напротив, С-конец MoaD подвижен. в самом движения достаточно Аргининовый предоставляется субъединицей. палец R11 второй 158 Рисунок 1. Выравнивание первичных аминокислотных последовательностей белков MccB, MoeB и ThiF. Аминокислотные последовательности представлены с использованием однобуквенного кода, элементы вторичной структуры обозначены прямоугольниками: зеленым - β-тяжи, красным - α-спирали, красной пунктирной линией 310-спирали. Желтым помечены аминокислотные остатки участвующие в связывании АТФ; зеленым - связывании пептидного субстрата МссА (светло-зеленым) и убиквитинподобных белков (темно-зеленым); красным - димеризации; розовым - остатки, участвующие в катализе; коричневым - цистеины кроссоверной петли; голубым цистеины, связывающие Zn2+. Жирным шрифтом показаны консервативные аминокислотные остатки. Слева от выравнивания расположены названия белков, справа отображена позиция аминокислотного остатка. Выравнивание сделано с помощью сервиса Expresso (T-Coffee) [5]. 159 Благодарности Автор хотел бы высказать большую признательность своему научному руководителю - Северинову Константину Викторовичу, за чуткое руководство, ценные критические замечания, возможности для саморазвития и личностного роста, а также предоставленные свободы мысли, действий и самореализации. Также автор выражает благодарность всему научному коллективу лаборатории Молекулярной генетики микроорганизмов, в особенности Гилярову Дмитрию за помощь в подготовке текста диссертации и обсуждении результатов, Серебряковой Марине за масс-спектрометрический анализ проб, ценные советы и критический взгляд на получившиеся результаты, а также Дубилей Светлане и Куликовскому Алексею за поддержание автора в активном тонусе. Также автор хотел бы выразить особую признательность всему преподавательскому составу кафедры Молекулярной биологии МГУ им. М.В.Ломоносова, за приложенные самоотдачу, терпение и труд в процессе обучения студентов, за те фундаментальные знания, которые они вложили в головы своих студентов, и любовь к науке, которую они привили. Автор также хотел уделить особое внимание и высказать слова благодарности своим друзьям и одногруппникам за поддержку, жаркие научные дискуссии и взаимную помощь в постановке экспериментов и анализов, в особенности Гордиенко Евгению, за ценные консультации и советы в области биоинформатики, а также Горкун Анастасии за помощь в подготовке текста диссертации и моральную поддержку. Работа была выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской федерации, договор № 14.B25.31.0004, а также программы Президиума РАН "Молекулярная и клеточная биология" (номер государственной регистрации: 01201355171).
