Механизмы клеточной устойчивости к ингибитору трансляции
advertisement
На правах рукописи Тихонов Антон Алексеевич Механизмы клеточной устойчивости к ингибитору трансляции микроцину С и родственным соединениям Специальность 03.01.03 — молекулярная биология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва - 2012 Работа выполнена в лаборатории регуляции экспрессии генов мобильных элементов прокариот Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной генетики Российской академии наук и лаборатории молекулярной генетики микроорганизмов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биологии гена Российской академии наук. Научный руководитель: Северинов Константин Викторович доктор биологических наук, профессор Гельфанд Михаил Сергеевич доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт проблем передачи информации им. А.А. Харкевича Российской академии наук, заместитель директора по научным вопросам Официальные оппоненты: Каменский Пётр Андреевич кандидат биологических наук, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова», ведущий научный сотрудник Кафедры молекулярной биологии Биологического факультета Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук Защита диссертации состоится 26 октября 2012 года в 11 часов на заседании Диссертационного совета Д 002.037.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биологии гена Российской академии наук по адресу: 119334, Москва, ул. Вавилова, д. 34/5. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, д 32. Автореферат разослан ____ сентября 2012 года. Ученый секретарь диссертационного совета канд. фарм. наук Л.С. Грабовская 2 Общая характеристика работы Актуальность работы. Одной из важнейших проблем современной медицины является возникновение и распространение штаммов патогенных бактерий, устойчивых к антибиотикам. Количество инфекций, плохо поддающихся терапии антибиотиками, растет во всех развитых странах. Помимо очевидных мер, таких как контроль за применением антибиотиков и соблюдение правил больничной гигиены, главным способом борьбы с устойчивыми бактериями является применение новых лекарственных средств. До недавнего времени в качестве основного подхода к разработке новых антибактериальных агентов фармацевтические компаний применяли модификацию уже используемых антибиотиков. Однако этот подход теряет эффективность, поскольку бактерии быстро вырабатывают устойчивость к большинству производных существующих соединений. Более перспективным способом разработки антибиотиков является поиск новых природных антибактериальных агентов, неродственных соединениям, применяемым в медицине. С другой стороны природные антибактериальные агенты играют важную роль в экологии микробных сообществ. Например, 20% изолятов Escherichia coli из кишечника человека вырабатывают один или несколько микроцинов — пептидных антибиотиков с небольшой молекулярной массой (<10 кДа). Поэтому, всестороннее исследование структуры, механизмов действия, биологической роли природных антибиотиков, а также механизмов устойчивости к этим соединениям является важной научной и практической задачей. Диссертационная работа посвящена исследованию природного антибиотика микроцина С (McC). Это соединение вырабатывается E. coli и подавляет рост многих видов энтеробактерий в микромолярных концентрациях. McC представляет собой линейный гептапептид к C-концевому аспартилу которого через N-ацил-фосфорамидную связь присоединен модифицированный остаток АМФ. Внутриклеточной мишенью соединения является аспартил-тРНК-синтетаза. Гены, обеспечивающие синтез McС, организованы в кластер. Было показано, что гены mccC, mccE и mccF микроциновго кластера обеспечивают устойчивость клеток E. coli к производимому антибиотику. Механизмы действия продуктов 3 генов mccC и mccE были подробно изучены в нашей лаборатории, в то время как механизм устойчивости, который обеспечивается геном mccF, не был известен. Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы было выяснение молекулярного механизма действия продукта гена mccF, за счет которого клетки E. coli приобретают устойчивость к McС и родственным соединениям, а также поиск функциональных гомологов белка MccF в других микроорганизмах. Для достижения цели были поставлены следующие задачи: 1) Установить MccF-зависимый механизм устойчивости к McС. 2) Определить структуру MccF. Охарактеризовать аминокислотные остатки, ответственные за узнавание субстрата и каталитическую активность. 3) На основании полученных данных о механизме действия и структуре MccF предсказать функциональных гомологов MccF в других микроорганизмов. 4) Определить, способны ли предсказанные гомологи обеспечивать устойчивость клеток к McC и родственным антибиотикам. Научная новизна и практическая значимость работы. Был установлен механизм MccFзависимой устойчивости клеток E. coli к McС. Было показано, что MccF является сериновой пептидазой, которая детоксифицирует антибиотик за счет гидролиза С-N связи, расположенной между α-карбоксильной группой С-концевого аспартила микроцинового пептида и модифицированным остатком АМФ. Кроме того, MccF гидролизует ингибиторы аминоацил-тРНК-синтетаз (ARS), сходные по структуре с активной формой McC — аминоацил-сульфамоил-аденозины (aaSA). Была определена кристаллическая структура MccF в комплексе с McС и его аналогами. Были найдены аминокислотные остатки, ответственные за специфическое распознавание субстрата и реакцию гидролиза. В частности, в MccF была обнаружена петля, аминокислотные остатки которой определяют специфичность пептидазы к аденилированным соединениям. На основании полученных структурных данных было предсказано, что ряд гомологов MccF также обладает специфичностью к аденилированным субстратам. Экспериментально было показано, что некоторые из найденных ферментов действительно гидролизуют McC и 4 aaSA, а также обеспечивают устойчивость клеток к этим соединениям в физиологических условиях. Для одного из гомологов из Bacillus cereus была определена трехмерная структура и охарактеризованы аминокислотные остатки, ответственные за связывание субстрата и каталитическую активность. Результаты исследования существенно расширяют представления о биохимии сериновых пептидаз и механизмах лекарственной устойчивости бактерий. Физиологическая функция обнаруженной нами группы пептидаз, представители которой обладают высокой специфичностью к аденилированным соединениям, остается неизвестной. За исключением нескольких ингибиторов ARS, современной науке неизвестны природные вещества похожие по строению на субстраты MccF. Поэтому поиск физиологических функций ферментов MccFгруппы является интересной задачей для будущих исследований. Публикации а апробация работы. По результатам работы опубликовано три статьи в международных рецензируемых журналах. Часть результатов работы представлена на конференции «ASBMB annual meeting», april 24 – 28, 2010, Anaheim, USA. Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из следующих разделов: общая характеристика работы, литературный обзор, материалы и методы, результаты работы, заключение, выводы, публикации в журналах, список литературы, список сокращений. Работа изложена на 94х страницах машинописного текста. Работа содержит 30 рисунков и 4 таблицы. Список цитируемых литературных источников включает 146 наименований. 5 Содержание работы Cтруктура и механизм действия McC. МсС представляет собой модифицированный Nформилированный линейный гептапептид (fMRTGNAD). Альфа-карбоксильный атом С- концевого остатка аспарагиновой кислоты пептида соединен с остатком аденозина через Nацил-фосфорамидную связь. К фосфорамиду присоединена аминопропильная группа. McC проникает в чувствительные клетки энтеробактерий (в том числе E. coli) через ABC транспортер YejABEF, который узнает пептидную часть соединения. В цитоплазме клетки 6 N-концевых аминокислотных остатков McC отщепляются в результате совместного действия пептид-деформилазы и олигопептидаз A, B и N. В результате образуется негидролизуеемый аналог аспартил‐аденилата — процессированный МсС (pMcC) (рис. 1). Это соединение ингибирует аспартил‐тРНК‐синтетазу (концентрация полумаксимального ингибирования для AspRS E. coli — 30 нМ), что приводит к остановке трансляции и роста клеток. Рис. 1. Химические структуры микроцина С, его процессированной формы, аспартил-АМФ, fMRTGNAX-SA и aaSA. Буквой R обозначена боковая цепь аминокислоты. Продукция MccF обеспечивает устойчивость клеток к McС. В лаборатории Филлипа Морено было показано, что клетки, несущие ген mccF на плазмиде, приобретают устойчивость к McC1 . Чтобы убедится в том, что продукт гена mccF действительно защищает клетки от 1 González‐Pastor, J.E., et al., Structure and organization of plasmid genes required to produce the translation inhibitor microcin C7. J Bacteriol, 1995. 177(24): p. 7131‐40. 6 McC, мы заклонировали последовательность mccF в экспрессионный вектор pET19b. Были подобраны условия экспрессии mccF, при которых большая часть продуцируемого белка находилась в растворимой форме. Культуру клеток E. coli BL21(DE3), несущих плазмиду pET19b-mccF, добавляли в расплавленный агар (0,7%) и заливали в чашки Петри. После застывания агара на газон клеток наносили 2 мкл 100 мкМ раствора McC. В качестве контрольных культур мы использовали клетки E. coli Bl21(DE3), несущие pET19b без вставки (отрицательный контроль), и плазмиду pET19b-mccE, где mccE — это ранее охарактеризованный нами ген устойчивости к McC (положительный контроль) 2 . После нескольких часов инкубации чашек в термостате вокруг точек нанесения раствора антибиотика возникает зона ингибирования роста клеток. Размер этой зоны соответствует уровню устойчивости клеток к соединению. Как показано на рис. 1Б, продукция MccF делает клетки устойчивыми к McC, что выражается в отсутствии зоны ингибирования роста. В соответствии с предыдущими данными, продукция MccE также обеспечивает устойчивость клеток к McC, а клетки, несущие pET19b, чувствительны к нему. Кроме McC мы протестировали альбомицин, который ингибирует сериновую тРНКсинтетазу, и три синтетических аналога McC: MRTGNAD-SA, MRTGNAE-SA, MRTGNAL-SA. Данные химически синтезированные соединения состоят из 6 первых аминокислотных остатков микроцинового пептида и присоединенного с С-конца аспартил- (MRTGNAD-SA), глутамил- (MRTGNAE-SA) и лейцил-сульфамоил-аденозина (MRTGNAL-SA). В результате процессинга синтетических аналогов McC в цитоплазме E. coli высвобождаются aaSA, которые ингибируют соответствующие ARS: DSA ингибирует AspRS, ESA — GluRS, а LSA — LeuRS 3 (рис. 1). Опыт показал, что MccF обеспечивает устойчивость клеток только к MRTGNAD-SA и MRTGNAE-SA ( рис. 2A). Чтобы понять, защищает ли MccF клетки от pMcC и aaSA, мы повторили эксперимент, но в качестве антибиотиков применили LSA и аналог pMcC — DSA (рис. 1). Оказалось, что клетки, которые производят MccF, устойчивы к DSA, но чувствительны к LSA (рис. 2Б). 2 Novikova, M., et al., MccE Provides Resistance to Protein Synthesis Inhibitor Microcin C by Acetylating the Processed Form of the Antibiotic. Journal of Biological Chemistry, 2010. 285(17): p. 12662‐12669. 3 Van de Vijver, P., et al., Synthetic Microcin C Analogs Targeting Different Aminoacyl­ tRNA Synthetases. J Bacteriol, 2009. 191(20): p. 6273‐6280. 7 Таким образом, MccF обеспечивает устойчивость клеток E. coli к McC и его синтетическим аналогам, ингибирующим AspRS и GluRS, но не обеспечивает устойчивости к альбомицину и синтетическому аналогу McC, который ингибирует LeuRS. MccF детоксифицирует McС in vitro. Для того, чтобы выяснить, способен ли MccF инактивировать McC и родственные соединения in vitro, были проведены два опыта. В первом опыте был протестирован эффект MccF на реакцию аминоацилирования в экстрактах клеток E. coli, обработанных McC и aaSA. В S30 экстракты E. coli добавляли McC или DSA, затем добавляли очищенный рекомбинантный MccF, после чего через равные промежутки времени отбирали пробы для проведения реакции аминоацилирования тРНКAsp. В качестве контролей использовали клеточные экстракты без добавления антибиотиков и MccF. Для того, чтобы из McC в результате процессинга образовался ингибитор AspRS pMcC, перед добавлением MccF экстракт инкубировали с McC в течении 15 минут. Так как для проявления ингибирующей активности DSA процессинг не нужен, DSA и MccF добавляли в клеточный экстракт одновременно. Во обоих случаях первую пробу для проведения реакции аминоацилирования отбирали сразу после добавления MccF. Как показано на рис. 2В, добавление McC или DSA приводит к ингибированию реакции аминоацилирования тРНКAsp. При добавлении MccF к экстрактам, содержащим антибиотики, уровень аминоацилирования тРНКAsp полностью восстанавливается (рис. 2В). Таким образом, устойчивость клеток, которые производят MccF, скорее всего связана с инактивацией McC внутри клетки. C помощью этого подхода мы выяснили, что MccF не способен инактивировать LSA in vitro, что находится в соответствии с данными, полученными в экспериментах in vivo (рис. 2Г). Также, этим способом было показано, что MccF c низкой эффективностью детоксифицирует SSA, но не действует на ASA, ISA, KSA, FSA, GSA и PSA (данные не представлены). В другом опыте инкубировали очищенный MccF с McC, а затем наносили реакционную смесь на газон чувствительных к McС клеток E. coli. В качестве контроля McC инкубировали без добавления фермента. Контрольная реакция подавляла рост клеток, в то время как обработанный MccF антибиотик не действовал на клетки (рис 4Б). Таким образом, рекомбинантный MccF инактивирует McC не только в клеточном экстракте, но и в системе, состоящей из очищенных компонентов. 8 Рис. 2. MccF детоксифицирует McC и его аналоги in vivo и in vitro. (А и Б) Площадь зон ингибирования роста вокруг (A) 2 мкл 100 мкМ McС, 10 мкМ альбомицина и 350 мкМ MRTGNAD‐SA, MRTGNAE‐SA и MRTGNAL‐SA или (Б) 10 мМ DSA и LSA, нанесенных на газон клеток E. coli BL21(DE3), несущих указанные плазмиды. (В и Г) Аминоацилирование тРНК в S30 экстрактах E. coli, содержащих или не содержащих MccF. Реакции с добавлением McC, DSA или LSA инкубировали указанное время, а затем проводили реакцию аминоацилирования. (В) Аминоацилирование тРНКAsp. (Г) Аминоацилирование тРНКLeu. Показаны типичные результаты одного из нескольких проведенных экспериментов. MccF является сериновой пептидазой. Для выяснения природы активности MccF был проведен биоинформатический поиск гомологичных белков. Оказалось, что MccF принадлежит к семейству S66 сериновых пептидаз; ближайшим гомологом этого фермента в E. coli является LD-карбоксипептидаза (LdcA). Этот фермент отщепляет С-концевой D-аланин от тетрапептида — продукта распада муреина клеточной стенки бактерии. В лаборатории Матиаса Бочтлера были охарактеризованы 9 аминокислотные остатки, составляющие каталитическую триаду LdcA4. C помощью выравнивания последовательностей MccF и LdcA были найдены аминокислотные остатки MccF, соответствующие каталитической триаде LdcA (рис. 3). Мы предположили, что MccF является сериновой пептидазой. Чтобы проверить это предположение были поставлены следующие эксперименты. Рис. 3. Выравнивание последовательностей MccF и LdcA из E. coli, а также гомолога MccF из Agrobacterium radiobacter. Аминокислотные остатки каталитической триады помечены звездочками. Мы заменили остаток Ser118 из предсказанной каталитической триады MccF на аланин и показали, что клетки, продуцирующие белок с заменой, чувствительны к DSA и McC так же, как и контрольные клетки, несущие плазмидный вектор без вставки (рис. 4А). 4 Korza, H.J. and M. Bochtler, Pseudomonas aeruginosa LD­Carboxypeptidase, a Serine Peptidase with a Ser­His­Glu Triad and a Nucleophilic Elbow. Journal of Biological Chemistry, 2005. 280(49): p. 40802‐40812. 10 Очищенный рекомбинантный MccFSer118-Ala также не способен инактивировать McC в in vitro системе, состоящей из очищенных компонентов (рис. 4Б). Таким образом, в полном соответствии с нашим предположением, замена остатка предсказанной каталитической триады полностью дезактивирует MccF. Для дополнительного подтверждения пептидазной природы активности MccF мы обработали фермент специфическим необратимым ингибитором сериновых пептидаз — фенилметилсульфонил-флоридом (PMSF). После обработки PMSF MccF инкубировали с McC in vitro. Как видно на рис. 4Б в таких условиях MccF не подавляет антибактериальную активность McC. Совокупность полученных результатов позволяет сделать заключение, что MccF инактивирует McC и DSA за счет активности сериновой пептидазы. Рис. 4. Рекомбинантный MccF детоксифицирует McC в in vitro системе, составленной из очищенных компонентов. (А) Площадь зон ингибирования роста вокруг 2 мкл 100 мкМ раствора McC или 10 мМ раствора DSA, нанесенных на газон клеток E. coli BL21(DE3), которые производят MccF, MccF с заменой Ser118-Ala, а также клеток, несущих pET19 вектор. (Б) Площадь зон ингибирования роста вокруг точек нанесения продуктов реакции инкубации McC с очищенным MccF, MccF, обработанным 4 мM PMSF, или с MccFSer118-Ala. MccF гидролизует амидную связь между пептидной и нуклеотидной частями MccF. Для того чтобы выяснить молекулярный механизм действия MccF мы проанализировали продукты реакции MccF с McC in vitro с помощью МАЛДИ масс-спектрометрии. Масс-спектр препарата McC содержит два масс-иона, соответствующих McC (m/z = 1177) и форме McC, не содержащей N-концевой формильной группы (m/z =1149). После инкубации с MccF эти массионы не детектируются, а вместо них появляются новые масс-ионы со значениями m/z равным 11 404, 764 и 792 (рис. 5А). Последние две массы соответствуют гептапептиду McC — MRTGNAD и его формилированной форме, соответственно. Идентификация была подтверждена с помощью тандемного масс-спектрометрического анализа масс-иона с m/z = 764 с последующим анализом спектра фрагментации. Масс-ион с m/z = 404 соответствует нуклеотидной части McC, то есть фосфорамидаденозину, модифицированному аминопропильной группой. Для подтверждения этой идентификации мы провели масс-спектрометрический анализ продуктов инкубации MccF c деформилированным McC, не содержащим в своем составе аминопропильной группы. Спектр исходного препарата микроцина содержит один масс-ион со значением m/z = 1092. После обработки MccF вместо этого иона появляются масс-ионы со значениями m/z равными 764 и 367 (рис. 5Б). Как описано выше, более тяжелый масс-ион представляет собой деформилированную пептидную часть McC, а масс-ион с m/z = 367 соответствует нуклеотидной части без аминопропильной группы. Таким образом мы подтвердили, что массион с m/z = 404 в спектре продуктов реакции MccF с McC соответствует нуклеотидной части антибиотика, а масс-ионы cо значениями m/z равными 764 и 792 являются гептапептидом McC и его формилированной формой, соответственно. На основании этих результатов можно заключить, что в результате действия MccF происходит гидролиз C-N связи между альфакарбонильным атомом С-концевой аминокислоты пептидной части и нуклеотидной частью McC. Сходные результаты были получены при инкубации MccF c синтетическими аналогами McC — MRTGNAD-SA и MRTGNAE-SA (данные не представлены). Инкубация MccF с DSA и ESA приводит к образованию высокотоксичного сульфамоиладенозина. Мы провели масс-спектометрический анализ продуктов инкубации MccF с различными aaSA. Действие фермента на DSA приводит к исчезновению масс-иона исходного вещества (m/z = 462) и появлению масс-иона с m/z = 367, который соответствует сульфамоиладенозину (SA) (рис. 5В). Тот же масс-ион появляется в результате инкубации MccF c ESA и SSA, в то время как масс-ионы исходных соединений пропадают из спектра (рис. 5Д и Е). Инкубация MccF с LSA не приводит к изменению масс-спектра этого соединения (рис. 5Г), что соответствует данным, полученным в ходе in vivo и in vitro экспериментов. Мы предполагаем, что, по аналогии с McC, MccF гидролизует DSA, ESA и SSA по амидной связи, соединяющей карбонильный атом аминокислотного остатка и SA (рис. 7). Масса отщепляемых 12 в этой реакции аминокислотных остатков слишком мала для их идентификации при помощи МАЛДИ-MC. Так как MccF гидролизует McC и аналог его процессированной формы — DSA, мы считаем, что pMcC также расщепляется данным ферментом по амидной связи (рис. 7). Неожиданный результат был получен при нанесении продуктов реакции DSA и ESA с McсF на газон клеток E. coli. Образец контрольной реакции c ESA (без добавления MccF) не подавляет рост клеток, тогда как при нанесении образца контрольной реакции с DSA образуется небольшая зона ингибирования роста. Нанесение продуктов реакции MccF с DSA или ESA приводит к образованию зоны ингибирования роста клеток большей площади, чем зона под образцом контрольной реакции c DSA. При инкубации MccFSer118-Ala антибактериальная активность DSA не изменяется (рис. 6А). Таким образом, пептидазная активность MccF приводит к высвобождению из DSA/ESA соединения с высокой токсичностью. При МАЛДИ-МС анализе продуктов реакции мы не обнаружили других массионов, кроме масс-иона SA. По литературным данным SA обладает высокой антибактериальной активностью 5 . Поэтому мы предположили, что именно MccF-зависимое образование SA в наших условиях вызывает повышение антибактериального эффекта DSA и ESA. Нанесение одного наномоля химически-синтезированного SA на газон чувствительных к McC клеток E. coli приводит к возникновению зоны ингибирования роста равной по размеру “крупной” зоне, которая образуется при нанесении одного наномоля DSA, обработанного MccF (рис. 6Б). Из этих данных следует, что при гидролизе DSA и ESA под действием MccF возникает высокотоксичный сульфамоил-аденозин (SA). Другие продукты данной реакции — глутаминовая и аспарагиновая кислоты, как и ожидалось, не подавляют рост клеток (данные не представлены). Мы изучили действие SA на устойчивые к McC культуры E. coli, продуцирующие MccE, MccF и AspRS, и обнаружили, что ни один из перечисленных белков не обеспечивает устойчивости к SA (как синтетическому, так и образованному в результате действия MccF) (рис. 6Б). Отсюда следует, что SA и McC имеют разные механизмы действия, а белки, которые обеспечивают устойчивость к McC, не защищают клетку от SA. 5 Bloch, A. and C. Coutsogeorgopoulos, Inhibition of protein synthesis by 5'­ sulfamoyladenosine. Biochemistry, 1971. 10(24): p. 4394‐4398. 13 Рис. 5. Масс-спектрометрический анализ продуктов инкубации рекомбинантного MccF с МсС, МсС без аминопропильной группы и различными aaSA. (A) МсС, (Б), МсС без аминопропильной группы, (В) DSA, (Г) LSA, (Д) ESA и (E) SSA инкубировали с рекомбинантным MccF. В качестве контроля использовали реакции без MccF. По оси абсцисс отмечены значения m/z. Рис. 6. При MccF-зависимом гидролизе DSA и ESA образуется токсичный сульфамоил-аденозин. (A) Площадь зон ингибирования роста вокруг точек нанесения продуктов реакции DSA или ESA с очищенным MccF, MccF после обработки 4 мМ PMSF и MccFSer112-Ala. (Б) Площадь зон ингибирования роста вокруг 1 мкл 10 мМ растворoв SA, DSA и раствора DSA, обработаннoго MccF, на газонах клеток E. coli Bl21(DE3), несущих указанные плазмиды. 14 Таким образом, нами был установлен механизм MccF-зависимой устойчивости к McC. МccF расщепляет C-N связь, расположенную между аминоацильной и нуклеотидной частями McC и его процессированной формы. Кроме того, MccF расщепляет по той же связи некоторые aaSA, содержащие аминокислоты с полярными отрицательно заряженными боковыми цепями, но не расщепляет aaSA c гидрофобными аминокислотными радикалами (рис. 7). С помощью описанных выше методов мы показали, что LdcA — ближайший гомолог MccF, закодированный в геноме E. coli, не защищает клетку от McC и aaSA и не гидролизует субстраты MccF in vitro (данные не представлены). Рис. 7. Химические структуры McC, pMcC, DSA. Стрелкой помечена амидная связь, гидролиз которой катализирует MccF. Общая структура MccF. Структура MccF была определена с разрешением в 1,2 ангстрема методом одноволновой аномальной дисперсии с использованием кристаллов белка, меченного селеноцистеном. Было обнаружено, что MccF формирует гомодимеры. Мономер MccF состоит из двух доменов. N-концевой домен, состоящий из остатков Pro7-Thr164, образован четырьмя паралельными бета-тяжами, которые окружены альфа-спиралями. C-концевой домен, который состоит из остатков Lys209-Ser341, представляет собой два бета-листа, к одному из которых примыкают три альфа-спирали. Домены соединены друг с другом длинной петлей, которая образована аминокислотными остатками Arg165–Gly208. Петля образует большое количество связей с доменами белка (рис. 8). Общая структура MccF идентична опубликованной структуре LdcA из Pseudomonas aeruginosa 6 . Однако в структуре LdcA отсутствует петля, соединяющая N- и С-концевые 6 Korza, H.J. and M. Bochtler, Pseudomonas aeruginosa LD­Carboxypeptidase, a Serine Peptidase with a Ser­His­Glu Triad and a Nucleophilic Elbow. Journal of Biological Chemistry, 2005. 280(49): p. 40802‐40812. 15 домены. Таким образом, этот элемент структуры уникален для MccF. В дальнейшем мы будем называть петлю между двумя доменами каталитической петлей. Аминокислотные остатки Ser118, Glu243 и His311, которые составляют каталитическую триаду MccF, расположены в кармане между двуми доменами одного мономера. Один из карбоксилатных кислородов Glu243 образует водородную связь с N1 положением боковой цепи His311. Взаимное расположение аминокислотных остатков позволяет гидроксилу Ser118 акцептировать протон радикала His311 с образованием алкоксидного аниона, который, в свою очередь, способен к нуклеофильной атаке пептидной связи. Таким образом, топология активного центра подтверждает наш вывод о том, что MccF является сериновой пептидазой. Также была определена кристаллическая структура MccF с заменой каталитического серина на аланин. Структуры MccFSer118-Ala и MccF дикого типа были почти идентичны друг другу. Следовательно, потеря активности Ser118-Ala мутанта в ходе in vitro и in vivo экспериментов, описанных выше, вызвана исчезновением необходимого для катализа нуклеофильного гидроксила, а не нарушением конформации фермента. Поэтому мы заключили, что кристаллы комплексов MccFSer118-Ala мутанта с субстратами могут являться хорошей моделью для исследования субстратного связывания фермента дикого типа. Рис. 8. Кристаллическая структура MccF. (A) Мономер MccF, отмечены домены, каталитическая петля и аминокислотные остатки каталитической триады. (Б) Димер MccF. Структура MccF в комплексе с pMcC. Для изучения молекулярных механизмов узнавания субстрата полученной структуре была определена структура комплекса MccFSer118-Ala электронная плотность, 16 соответствующая и pMcC. В процессированному микроцину, находится в районе активного центра. По номенклатуре Шектера и Бергера для сериновых пептидаз, мы определяем сайты связывания аденина и боковой цепи аспартила субстрата как, соответственно, P1 и P1’ сайты MccF 7 . Узнавание нуклеотида в P1 сайте фермента опосредовано стэкинг взаимодействиями c индольным кольцом остатка Trp186, расположенного в каталитической петле. 2’- и 3’-гидроксилы рибозы субстрата связаны водородными взаимодействиями с карбоксильными кислородами Glu277. В дополнение к этому 2’-OH группа образует пару водородных связей с боковой цепью остатка Arg246, который, в свою очередь, взаимодействует с остатком Ser183. В P1’ сайте MccF один из карбоксильных кислородов боковой цепи аспарагина связан с атомом азота боковой цепи остатка Lys247. Второй карбоксильный кислород взаимодействует с амидной группой радикала Asn220, атомом кислорода боковой цепи Thr221 и гуанидиновой группой остатка Arg254, который расположен в парном мономере MccF (рис. 9). Фосфорамидатная группа взаимодействует с атомами пептидного остова фермента. Карбонильный кислород субстрата образует водородые связи с амидными группами остатков Asp119 и Gly92, соответсвенно, а один из кислородов фосфорамидной группы контактирует к альфа-амидным азотом Gly91 Эти взаимодействия позволяют стaбилизировать оксианион промежуточного комплекса при гидролизе пептидной связи субстрата. Аминопропильная группа pMcC не образует контактов с MccF, поэтому мы предполагаем, что она не участвует а связывании с ферментом. Рис. 9. Структура активного центра MccFSer118-Ala в комплексе с pМсС, Атомы углерода фермента показаны желтым, а атомы углерода в составе pMcC - зеленым. Важность остатка Trp180 для связывания субстрата в P1 сайте MccF и остатков Asn220, Lys247 для связывания субстрата в P1’ сайте была подтверждена с помощью сайт 7 Schechter, I. and A. Berger, On the size of the active site in proteases. I. Papain. Biochem Biophys Res Commun, 1967. 27(2): p. 157‐62. 17 специфического мутагенеза с последующей проверкой ферментативной активности мутантных белков. Было показано, что замена Trp186 на аланин приводит к полной потере ферментативной активности. Одиночные аланиновые мутанты MccF по положениям 220 и 247 обладали пониженной каталитической эффективностью по сравнению с ферментом дикого типа, а двойная аланиновая мутация по этим положениям полностью инактивировала фермент. В кристаллических структурах мутантных белков топология активного центра остается неизменной. Поэтому изменение активности фермента связано с исчезновением необходимых для связывания субстрата боковых цепей аминокислот, а не общим нарушением структуры MccF. Филогенетический анализ S66 семейства пептидаз. Гомологи S66 семейства сериновых пептидаз были найдены с помощью программы PSI-BLAST среди набора полных микробных геномов из базы данных Refseq. Было обнаружено 587 гомологичных последовательностей. Для уменьшения вырожденности выборки близкие последовательности кластеризовали и отобрали из каждой группы по одному гомологу. Затем было проведено множественное параллельное выравнивание отобранных последовательностей с помощью программы MUSCLE. На основании выравнивания было и построено филогенетическое дерево (рис. 10). Белки MccF и LdcA расположены на двух ветвях филогенетического дерева, разделенных множеством ветвей разного порядка. В дальнейшем мы будем называть ветвь, содержащую MccF из E. coli, MccF-кладой. Представители этой клады содержат в своей последовательности участок, гомологичный каталитической петле MccF из E. coli. На месте остатка Trp186 в каталитической петле MccF из E. coli все белки MccF-клады несут остаток ароматической аминокислоты. Представители двух соседних клад — YocD и BA_3275 — также содержат длинную междоменную петлю с консервативным ароматическим остатком на месте Trp186 E. coli MccF. Согласно выравниванию, другие представители семейства S66 сериновых пептидаз содержат на месте каталитической петли MccF более короткую последовательность, в которой нет консервативных остатков ароматических аминокислот. Так как Trp186 в MccF из E. coli взаимодействует с пуриновым кольцом субстрата и, таким образом, определяет специфичность MccF предположили, к аденилированным соединениям, мы что белки, составляющие YocD, BA_3275 и MccF-клады S66 пептидаз способны связывать и гидролизовать аденилированные субстраты. Следует отметить, что 18 подавляющее большинство геномов, в которых закодированы эти белки, не содержат кластеров гомологов генов синтеза микроцина С. Таким образом, физиологическая функция белков MccF, YocD и BA_3275 клад не связана с защитой клеток, синтезирующих аналоги McC, от производимых ими антибиотиков. Три перечисленные клады формируют группу большего порядка на филогенегетическом дереве. Интересно, что в одном бактериальном геноме могут быть закодированы несколько гомологов MccF из разных клад. К таким бактериям относится группа видов B. cereus. В нее входях B. cereus, B. anthracis, B. thuringiensis, B. mycoides, B. pseudomycoides и B. weihenstephanensis. Большинство отсеквенированных геномов этих видов бактерий кодируют белки из MccF, YocD и BA_3275клад, а также близкого гомолога LdcA E. coli. Рис. 10. Фрагмент филогенетического дерева S66 семейства сериновых пептидаз. Клады MccF, YocD и Ba_3275 отмечены фоновым цветом. Ветвь гомологов MccF, содержащая клады MccF, YocD и Ba_3275, выделена пунктирной линией. Фиолетовым отмечены MccF из E. coli и B. anthracis, оранжевым — остальные белки, субстратную специфичность которых определяли in vivo. 19 Функциональный анализ гомологов MccF. Чтобы проверить белки из YocD, BA_3275 и MccF-клад на MccF-подобную активность, мы провели следующий эксперимент. Гены, кодирующие представителей каждой клады, заклонировали в экспрессионный вектор pMSCG7. Среди белков входящих в MccF-кладу мы выбрали белки из B. anthracis и Vibrio cholerae. Из YocD-клады были выбраны белки, закодированные в геномах B. antracis и Listeria monocytogenes. Из представителей клады BA_3275 мы выбрали белки из B. anthracis, A. radiobacter и S. pneumoniae (рис. 10). Полученными плазмидами трансформировали клетки E. coli BL21(DE3) и определяли чувствительность клеток с плазмидами к McC и нескольким aaSA (DSA, ASA, GSA, FSA и PSA) по методу, описанному в части «Продукция MccF обеспечивает устойчивость клеток к McC». Для более точного измерения каждый антибиотик наносили на газон клеток в нескольких концентрациях. В качестве контроля мы использовали клетки, которые производят MccF из E. coli, а также клетки, несущие экспрессионный вектор без вставки. В соответствии с раннее полученными данными продукция MccF из E. coli обеспечивает устойчивость клеток ко всем использованным концентрациям McC и DSA, но не к ASA, GSA, FSA и PSA. Сходными оказались спектры чувствительности клеток, которые производят белки MccF-клады из B. anthracis и V. cholerae, хотя рост культуры V. cholerae подавлялся самой высокой из использованных концентрацией McC (1 мМ). Продукция YocD из B. anthracis и L. monocytogenes не влияет на чувствительность клеток E. coli к McC и DSA, но делает клетки полностью или частично устойчивыми к ASA, GSA, FSA и PSA. Клетки E. coli, производящие BA_3275 из S. pneumoniae, частично устойчивы к McС, DSA, FSA, GSA и ASA, но чувствительны к PSA. Сходным спектром чувствительности обладают клетки, которые производят BA_3275 из B. anthracis. По сравнению с клетками, которые производят BA_3275 из S. pneumoniae, эти клетки более устойчивы к PSA и менее устойчивы к ASA. Гомолог MccF из BA_3275–клады, закодированный к геноме A. radiobacter, не влияет на чувствительность клеток к использованным антибиотикам. Результаты этого эксперимента сведены в таблице 1. Таким образом, за исключением гомолога MccF из A. radiobacter, все проверенные белки способны детоксифицировать негидролизуемые аналоги аминоацил-АМФ in vivo в клетках E. coli. Хотя механизм действия исследуемых ферментов не установлен, гомология с MccF из E. coli, и способность к детоксификации aaSA in vivo позволяют предположить, что эти белки являются сериновыми пептидазами, которые гидролизуют амидную связь между аминоацильной и 20 нуклеотидной частями McС и cходных соединений. Следует отметить, что внутри каждой клады проверенные белки имеют сходную специфичность к используемым субстратам. Так, представители MccF–клады гидролизуют aaSA c полярными отрицательно-заряженными радикалами, гомологи YocD гидролизуют aaSA c гидрофобными боковыми цепями, а белки, входящие в BA_3275-кладу, неспецифичны и с низкой эффективностью гидролизуют все используемые соединения. Для более подробного изучения мы выбрали гомолог MccF из B. anthracis, который принадлежит к MccF-кладе (рис. 9). Клада MccF YocD BA_3275 Организм McC DSA GSA ASA FSA PSA Escherichia coli R R S S S S Bacillus anthracis R R S S S S Vibrio cholerae PR R S S S S Bacillus anthracis S S PR R R R Listeria monocytogenes S PR R R R R Streptococcus pneumonae PR PR PR PR PR S Bacillus cereus PR PR PR R PR PR S S S S S S Agrobacterium radiobacter Таблица 1. Устойчивость клеток, производящих указанные гомологи MccF, к McC, DSA, GSA, ASA, FSA и PSA. R — клетки полностью устойчивы к антибиотику (зона ингибирования роста отсутствует). PR — клетки частично устойчивы к антибиотику (зона ингибирования роста меньше, чем в случае контрольных клеток, несущих экспрессионный вектор без вставки). S —клетки чувствительны к антибиотику так же, как и контрольные клетки. Исследование гомолога MccF из B. cereus. Чтобы проверить, способен ли BaMccF гидролизовать aaSA в системе in vitro, мы инкубировали очищенный рекомбинантный фермент с McС, DSA и ESA. Реакционную смесь концентрировали и наносили на газон чувствительных к McС клеток E. coli. В качестве контролей мы использовали реакцию с MccF из E. coli (EcMccF) (положительный контроль), а также инкубировали антибиотики в буфере без добавления ферментов (отрицательный контроль). Как и ожидалось, после инкубации в буфере McС и DSA подавляли рост клеток, тогда как ESA на клетки не действовал. Инкубация McС как с EcMccF, так и c BaMccF приводила к исчезновению антибактериальной активности соединения. При нанесении на газон DSA, обработанного EcMccF или BaMccF образовывалась зона ингибирования роста, значительно превышающая по размеру зону ингибирования роста, которая образуется под действием DSA, инкубированного в буфере без 21 ферментов. Ту же картину мы наблюдали в реакциях, содержащих ESA (рис. 11Б). Нам известно, что исчезновение антибактериальной активности McС под действием EcMccF обусловлено гидролизом данного соединения по C-N связи между аминоацильной группой и модифицированным остатком АМФ. EcMccF-зависимый гидролиз ESA и DSA идет по той же связи, однако в этом случае одним из продуктов реакции является высокотоксичный сульфамоил-аденозин, который вызывает появление крупных зон ингибирования роста на газоне клеток E. coli. Так как действие BaMccF на McC, DSA и ESA не отличается от действия EcMccF в проведенных экспериментах, мы предполагаем, что MccF из B. anthracis и E. coli гидролизуют McC и родственные соединения по одному механизму. С помощью выравнивания представителей S66 семейства пептидаз были найдены аминокислотные остатки, составляющие каталитическую триаду BaMccF — Ser112, Glu235, His303. Мы заменили остатки Ser112 и His303 из предсказанной каталитической триады BaMccF на аланины и показали, что клетки, продуцирующие белок с заменами, чувствительны к DSA и McC так же, как и контрольные клетки, несущие экспрессионный вектор без вставки (рис. 11А). В соответствии с этим, инкубация очищенного рекомбинантного BaMccFSer112-Ala, His303-Ala не влияла на антибактериальные свойства McС, DSA и ESA (рис. 11Б). Эти результаты подтверждают наше предположение о том, что BaMccF является аналогичной EcMccF сериновой пептидазой. Чтобы выяснить, инактивирует ли BaMccF субстраты EcMccF в физиологических условиях, мы удалили ген, кодирующий гомолог BaMccF, из штамма B. cereus ATCC4342. Этот штамм является близким родственником штамма B. anthracis str. Ames, в геноме которого закодирован BaMccF. Гены mccF двух штаммов расположены в сходном геномном окружении, а последовательности BaMccF из этих организмов совпадают на 95%. Ночные культуры B. cereus ATCC4342 ΔmccF и B. cereus ATCC4342 дикого типа развели в 100 раз средой LB и провели измерение скорости роста культур как в присутствии 0,5 мМ DSA, так и без добавления антибиотика. Как видно на рис. 11В при выращивании в богатой среде B. сereus ΔmccF растет также быстро как и клетки дикого типа. Добавление DSA приводит к замедлению роста обеих культур, однако клетки дикого типа растут значительно быстрее клеток ΔmccF. Отсюда мы заключаем, что ген mccF экспрессируется в B. cereus и понижает чувствительность клетки к DSA. Таким образом, BaMccF способен инактивировать субстраты EcMccF в физиологических условиях. Следует отметить, что рост клеток с удаленным mccF не 22 полностью подавляется добавлением DSA. Так как гомологи MccF из клады BA_3275 инактивируют DSA in vivo в клетках E. coli, мы предполагаем, что за наблюдаемый уровень устойчивости клеток B. cereus ATCC4342 ΔmccF к DSA отвечает белок из клады BA_3275, закодированный в геноме этого штамма. Рис. 11. (А) BaMccF обеспечивает устойчивость клеток к McС и DSA за счет пептидазной активности. Площадь зон ингибирования роста вокруг 2 мкл 10, 50, 100 и 1000 мкМ растворов МсС или 10 мМ раствора DSA, нанесенных на газон клеток E. coli BL21(DE3), несущих указанные плазмиды. (Б) BaMccF гидролизует McC, DSA и ESA in vitro. Площадь зон ингибирования роста вокруг точек нанесения продуктов реакций McC, DSA и ESA с очищенными рекомбинантными EcMccF, BaMccF, и BaMccFSer112-Ala/His303-Ala на газон клеток E. coli BL21(DE3). (В) BaMccF способен инактивировать DSA в физиологических условиях. Кривые роста клеток B. cereus ATCC4342 ΔmccF и клеток дикого типа в богатой среде с добавлением или без добавления 500 мкМ DSA. 23 Выводы 1) МссF является сериновой пептидазой, которая обеспечивает устойчивость клеток E. coli к McС за счет гидролиза амидной связи между пептидной и нуклеотидной частями антибиотика. Кроме McC, MccF гидролизует aaSA с полярными отрицательно заряженными аминоацильными группами. 2) Определена структура MccF и выяснена молекулярная природа узнавания субстрата. Специфичность MccF к аденилированным субстратам опосредована остатком ароматической аминокислоты, расположенном в петле между двумя доменами белка. 3) В S66 семействе пептидаз найдена группа гомологов MccF, которые содержат междоменную петлю с консервативным ароматическим остатком. Показано, что некоторые представители этой группы гидролизуют McС и aaSA. Гомолог MccF из B. anthracis обладает сходным с MccF из E. coli механизмом действия и в физиологических условиях защищает клетки от химического аналога McC. Список работ, опубликованных по теме диссертации Статьи в научных журналах: 1) Tikhonov A, Kazakov T, Semenova E, Serebryakova M, Vondenhoff G, Van Aerschot A, Reader JS, Govorun VM, Severinov K. The mechanism of Microcin C resistance provided by the MccF peptidase. Journal of Biological Chemistry. 2010 Dec 3; 285(49): 37944-52. 2) Agarwal V, Tikhonov A, Metlytskaya A, Severinov K, and Nair S. Structure and function of a serine carboxypeptidase adapted for degradation of the protein synthesis antibiotic microcin C7. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 2012 Mar 20; 109(12): 4425-30. 3) Nocek B; Tikhonov A; Babnigg G; Minyi Gu; Zhou M; Makarova KS; Vondenhoff G; Aerschot AV; Kwon K; Anderson WF; Severinov K; Joachimiak A. Structural and functional characterization of microcin C resistance peptidase MccF from Bacillus anthracis. Journal of Molecular Biology. 2012 Jul 20; 420(4-5): 366-83. Тезисы международных конференций: 1) ASBMB Annual Meeting 2010. Self immunity and resistance mechanisms against trojan horse antibiotic - Microcin C7. Vinayak Agarwal, Anton Tikhonov, Maria Novikova, Konstantin Severinov and Satish Nair. April 2010 24
