Обзор биотехнологий

Обзор биотехнологий
Современные подходы к разработке
оригинальных препаратов
моноклональных антител
Карабельский Александр
к.б.н., зав. лаб. молекулярной генетики
доц. каф. ТРБ СПХФА
02.08.2013
ПРЕПАРАТЫ РЕКОМБИНАНТНЫХ
БЕЛКОВ (BIOTHERAPEUTICS)
www.biocad.ru
2
R&D “CHAIN”
Выбор и
наработка
антигена
Поиск
лидерных
кандидатов
Оптимизация
кандидатов
Оптимизация
технологии
производства
3
МИШЕНИ ДЛЯ РАЗРАБОТКИ АНТИТЕЛ
ПЕРВЫЕ
мишени
НОВЫЕ
МИШЕНИ
“Low-hanging fruits”
•
малоизученные “неочевидные” белки.
Нет строгой корреляции
ген/белок/заболевание
•
хорошо изученные, но “сложные для
разработчика” белки (интегральные
серпентиновые рецепторы)
Способы поиска новых мишеней
Комплексный анализ сигнальных
путей и их взаимодействий
 геном+протеом+экзом+транскриптом+интерак
том…+ “симптом”
 использование фенотипических клеточных
тестов, в т.ч. с использованием МКА к мишеням
Совместные проекты с НИИ
 Поддержка исследований, направленных на
валидацию мишеней
Novartis + Dana Farber Cancer Institute
Merck + Harvard Medical School
 Создание научных центров
Prizer  Сenter for Technology Innovation
4
ПРОТИВОРАКОВЫЕ АНТИТЕЛА
ИЗВЕСТНЫЕ АНТИГЕНЫ-МИШЕНИ
5
ПРОТИВОРАКОВЫЕ АНТИТЕЛА
МЕХАНИЗМЫ ДЕЙСТВИЯ
6
ПРОТИВОРАКОВЫЕ АНТИТЕЛА
FDA APPROVED
7
ТИПЫ МКА. СТРУКТУРА МОЛЕКУЛЫ
www.biocad.ru
8
МКА. ЭФФЕКТОРНЫЕ СВОЙСТВА
Fab
связывание с
антигеном
Fc
эффекторные свойства
www.biocad.ru
9
ТИПЫ МКА. МЕХАНИЗМЫ ДЕЙСТВИЯ
www.biocad.ru
10
ТИПЫ МКА. МЕХАНИЗМЫ ДЕЙСТВИЯ
Rituximab
Infliximab and Adalimumab
Blocking of TNF ligand- receptor
interaction
ADCС by macrophages
and NK
Signalling leading
to apoptosis
Macrophage or NK
Tocilizumab
Blocking of IL6 receptor- ligand
interaction
IL6 ligand
TNF receptor
Infliximab or
adalimumab
IL6 receptor
B-cell
CD20
Immune or
endothelian cell
Rituximab
Immune or
endothelian cell
Soluble TNF ligand
Complement-mediated lysis
B-клеточная лимфома.
лейкемия, ревматоидный артрит
Ревматоидный артрит,
псориаз, болезнь Крона
Ревматоидный артрит,
псориаз, болезнь Крона
СТРАТЕГИИ ПОИСКА И ВЫБОРА МКА
Гибридомы, трансгенные животные
Дисплейные методы: фаговый и клеточный дисплей, бесклеточные системы
www.biocad.ru
12
ГИБРИДОМЫ
PROBLEM
13
ТРАНСГЕННЫЕ
ЖИВОТНЫЕ
14
ДИСПЛЕЙНЫЕ МЕТОДЫ. АНАЛИЗ
БИБЛИОТЕК ГЕНОВ
МЕТОДЫ ДИСПЛЕЯ  ОДИН МОЛЕКУЛЯРНЫЙ КОМПЛЕКС ДНК И ПРОДУКТ ЭКСПРЕССИИ
ГЕНА (ОДНОВРЕМЕННАЯ РАБОТА С ДНК И БЕЛКАМИ)
Gene
library
Panning
Screening
Enrichment
Affinity
Deselection
www.biocad.ru
Non-specific binding
15
PANNING
NGS
16
ФАГОВЫЙ ДИСПЛЕЙ, PANNING
Standart
Innovations
Использование синтетических и
иммунных библиотек
Работа в форматах scFV, Fab
Использование библиотек различной
природы
Тандем: фаговый дисплей/клеточный
дисплей (на FACS) – работа в
форматах scFv, Fab, IgG
NGS: deep sequеncing – на всех этапах
разработки для дизайна экспериментов,
предсказания влияния замен, создания
новых библиотек, статистической
обработки in vitro экспериментов
Технологии отбора фаговых частиц на
“сложных” антигенах
PACE – эволюция в пробирке
M13
Химеры АТ с pIII, pIV или
pVIII
17
ИСТОЧНИКИ АНТИТЕЛ
Синтетическая и природная наивные Fab
библиотеки антител человека
Иммунизация мышей, кроликов, ламы.
20000
15000
10000
5000
0
Время нед
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Максимальное структурное разнообразие антител
Около 1010 репертуар на основе 2 VH and 2 Vl цепей
Улучшенная стабильность, экспрессия и
унифицированный дизайн кандидатов в сравнении с
природными антителами
Высокая специфичность, биологическая стабильность и меньшая
иммуногенность в сравнении с синтетическими антителами
Иммунные библиотеки около 108 репертуар фаговых дисплейных
библиотек.
Большое число стабильных, высокоспецифичных,
неиммуногенных терапевтических кандидатов
18
КЛЕТОЧНЫЙ ДИСПЛЕЙ, SCREENING
Возможные
области
применения
Innovations
Поиск кандидатов из библиотек
различной природы
Матурация антител в формате IgG
для увеличения аффинности
Возможность анализа небольших
библиотек для одновременного
подбора оптимальных свойств
Диплей библиотек для модификации
нежелательных PTM в CDR
Подбор стабильности, оптимальной pI
Оптимизация отбора: выбор
кандидатов без систем экспрессии
Дрожжевой дисплей: высокий
уровень продукции некоторых
антител; возможность получать АТ
со значительно увеличенной ADCC
(Merck)
-
Бактерии
Дрожжи
Клетки
млекопитающих
19
ТЕХНОЛОГИИ ОТБОРА
АНТИТЕЛ (ИНФЕКЦИОННОЕ
ЗАБОЛЕВАНИЕ)
20
БИСПЕЦИФИЧЕСКИЕ АНТИТЕЛА
ПЕРСПЕКТИВЫ
Первое
биспецифиче
ское мАТ
мАТ на этапах
исследований
Клинические исследования на
ранних стадиях биспецифических
антител CD3+: CD19, CEA, CD20,
gp100
Клинические исследования на
ранних стадиях биспецифических
антител “однотипных белков”:
EGFR-HER3, HER2-HER3, Ang2VEGFR, IL-4-IL12
Поиск оптимальной технологии
создания биспецифических молекул
на основе полноразмерных антител
и их доменов
www.biocad.ru
21
ОПТИМИЗАЦИЯ АНТИТЕЛ
Увеличение эффективности
лечения и снижение риска
возникновения побочных
эффектов
Аффинность и
специфичность
VL
Снижение иммуногенности
Увеличение
термодинамической
стабильности, растворимости и
устойчивости к агрегации
VH
CL
CH1
Уменьшение числа побочных
эффектов, увеличение
эффективности лечения
Модулирование эффекторных
свойств ADCC, CDC, ADCP за
счет изменения аффинности к
FcγRs, C1q
Увеличение эффективности
противораковой терапии (или терапии
аутоиммунных заболеваний за счет
отсутствия эффекторных свойств)
CH2
CH3
Увеличение уровня
продукции
и стабильности ГЛФ
Увеличение времени полужизни в
плазме крови за счет увеличения
аффинности к FcRn
Снижение частоты инъекций и
оптимальной дозы
22
СНИЖЕНИЕ ПОТЕНЦИАЛЬНОЙ
ИММУНОГЕННОСТИ. ГУМАНИЗАЦИЯ
Simple
Complex
 Направленная гуманизация
– ограниченное
число вариантов
CDR-grafting
SDR-grafting
Resurfacing
Superhumanization
Human-string content optimization
 Рандомная гуманизация
– большое число
вариантов
www.biocad.ru
23
СТАБИЛЬНОСТЬ И АГРЕГАЦИЯ
АНАЛИЗ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
Увеличение продуктивности
Оптимальная доза
Создание ГЛФ
Время полужизни
Хранение ГЛФ
Иммуногенность
Стабильность

Предсказание:
•
Гермлайнинг
•
Поиск и анализ консенсусов

Модификации:

Внесение стабилизирующих мутаций:
“солевые мостики”, S-S связи


Агрегация

Сложно обеспечить оценку в
высокопроизводительном формате

Зависит от условий культивирования клеток,
очистки
 Направленный точечный мутагенез известных сайтов,
снижающих агрегацию белков
Причины и решения:
Элиминация нежелательных аминокислот:
заряженные аминокислоты в гидрофобном ядре
каркасной части
•
Суммарный подход: анализ сиквенсов – анализ
возможных структур – создание библиотек
оптимальных вариантов и их скрининг
•
www.biocad.ru
Взаимодействие белков в ненативной форме –
чем выше стабильность, тем меньше агрегация 
увеличение стабильности
Взаимодействие белков в нативном состоянии
за счет гидрофобных участков  изменение
изоэлектрической точки
24
ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА
АНТИТЕЛ
Оценка аффинности к антигену  матурация
Неспецифическое связывание, кросс-реактивность
Конкурентный анализ
Функциональные клеточные тесты: пролиферативный тест,
агонизм, антагонизм, интернализация, ADCC, CDC
Конвертация в полноразмерный формат для Fab-кандидатов
Предсказание сайтов посттрансляционных модификаций (PTM)
Оценка потенциальной иммуногенности последовательностей и 
Гуманизация последовательностей
Изменение фармакокинетических показателей
Оценка стабильности, гермлайнинг
Оценка агрегационной способности, изменение изоэлектрической точки
Оптимизация уровня экспрессии генов (системы экспрессии, копийность,
сила промоторов, энхансеры, метаболическая модификация клеточных
линий и т.п.)
Кодон-оптимизация
www.biocad.ru
25
ОПТИМИЗАЦИЯ КАНДИДАТОВ
Standart
Innovations
Исходная
библиотека
Исходная
библиотека
Скрининг
Скрининг
Суббиблио
тека
Одна
характеристика
Кандидат
n-циклов
Кандидат
In silico
анализ
Скрининг
Пул
кандидатов
для выбора
самых
стабильных
ЛИДЕР (оптимальный по всем
характеристикам)
Суббиблио
тека
ЛИДЕР
Несколько
ключевых
характеристик
26
Upstream process development
01.12.12
27
Downstream process development
1. Affinity capture: MabSelect SuRe
Viral inactivation (low pH)
2. Polishing step: Capto adhere
Viral filtration
Ultrafiltration / Diafiltration
Final product
01.12.12
28
28
IN VITRO ПРОЕКТЫ
Внедрение новых
технологий, поиск
и создание
мишеней
Поиск кандидатов на
выбранную мишень
 Сотрудничество с
ВУЗами РФ по поиску
кадров, подготовке
специалистов,
ведению совместных
научных проектов
 Использование метода
фагового дисплея для
поиска Fab c высокой
аффинностью из
библиотек различной
природы
 Собственный
научный центр
“полного цикла”
 Использование
синтетических, наивных
и иммунных библиотек
для поиска антител
 Получение и
валидация антигенов
в транзиентных
культурах (CHO,
HEK293)
 Иммунизация
животных и создание
библиотек генов
 Максимальная
автоматизация
процессов скрининга
кандидатов антител
 Клеточный дисплей на
клетках млекопитающих
Оптимизация кандидатов
 Конвертация в полноразмерные
антитела и экспрессия в клетках
млекопитающих
 Панель клеточных тестов для
оценки функциональных свойств
антител
 Использование методов
направленного мутагенеза для
гуманизации и матурации
антител
 Создание комбинаторных и
рандомно модифицированных
библиотек и выбор лучших
кандидатов
 Библиотека Fc-фрагментов для
изучения и изменения
эффекторных свойств АТ
 Создание биспецифических
антител, химерных белков
www.biocad.ru
Создание технологии
производства
 Создание интегративных
высококопийных векторов для
получения клеточных линий
продуцентов
 Инжиниринг клеточных линий для
увеличения выхода белка (секреция,
пролиферация, гликоинжиниринг,
метаболический инжиниринг)
 Кодон-оптимизация генов
 Поиск оптимальных систем
экспрессии
 DOE – оптимизация способа
культивирования
 Создание уникальных культуральных
сред, сорбентов для очистки белков
 Максимальная автоматизация
рутинных процессов выделения и
анализа
29
Библиотеки генов
•
•
•
•
•
Наивные
•
Иммунные
Синтетические
•
Комбинаторные
•
Постселекционные
Клетки (МКЛ)
Экзом сетов •
генов
•
Транскриптом •
Геном
Белки
Поли-АТ
Протеом
Метаболом
IN SILICO ПРОЕКТЫ
Анализ
даных
Техн.
поддержка
•
•
•
Интеграция процессов
Хранение и операции с
данными
Передача данных
Алгоритмы
и утилиты
• Структура белков
- Матурация и гуманизация
- Предсказание стабильности, PTM,
агрегации
• Кодон-оптимизация генов
• Дизайн экспериментов
• Анализ последовательностей, библиотек и
геномов
• Приложения для удаленного доступа и
контроля
30
31
31