инструкции по применению episcreen plus

ИНСТРУКЦИИ ПО ПРИМЕНЕНИЮ
EPISCREEN PLUS™
ИССЛЕДОВАНИЕ НА НЕЙТРАЛЬНУЮ АЛЬФА - ГЛЮКОЗИДАЗУ (25 ТЕСТОВ ) ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ УСТРОЙСТВО IN VITRO ДЛЯ КОЛИЧЕСТВЕННЫХ
ИЗМЕРЕНИЙ СОДЕРЖАНИЯ АЛЬФА - ГЛЮКОЗИДАЗЫ В СПЕРМЕ
(СЕМЕННОЙ ПЛАЗМЕ ) ЧЕЛОВЕКА
Ингибирование: Глюкоза ингибирует альфа-глюкозидазу,
связываясь с моносахарид-связывающим участком альфаглюкозидазы8. Этот процесс ингибирования представляет собой
явление, зависящее от pH и дозы, и является принципом, лежащим
в основе подготовки контрольных проб спермы (семенной плазмы).
ТИПЫ ОБРАЗЦОВ
Анализ можно проводить на свежих или
замороженных/размороженных пробах спермы и семенной плазмы.
Идентификатор документа: FP09 I87 R01_Rus B.2 Обновление: 22/01/2016
МАТЕРИАЛЫ В СОСТАВЕ НАБОРА
СОКРАЩЕНИЯ
С помощью одного набора EpiScreen PlusTM можно оценить
ферментативную активность не менее 25 проб (включая коррекцию
фона пробы).
CLSI
CV
IVD
LOD
LOQ
OD
PNP
PNPG
SDS
WHO
Clinical and Laboratory Standards Institute (Институт
клинических и лабораторных стандартов)
Coefficient of Variation (Коэффициент вариации)
(Диагностическое устройство in vitro)
Limit Of Detection (Предел обнаружения)
Limit Of Quantification (Предел количественного
определения)
Optical Density (Оптическая плотность)
Para (4)-Nitrophenol (Пара (4)-нитрофенол)
Para (4)-Nitrophenyl-alpha-D-glucopyranoside (Пара (4)нитрофенил-альфа-D-глюкопиранозид)
Sodium dodecyl sulfate (Додецилсульфат натрия)
World Health Organization (Всемирная организация
здравоохранения (ВОЗ))
МАТЕРИАЛЫ, НЕ ВХОДЯЩИЕ В СОСТАВ НАБОРА
НАЗНАЧЕНИЕ
EpiScreen PlusTM представляет собой диагностическое устройство
лабораторного применения для диагностики in vitro (IVD),
предназначенное для количественного определения уровня альфаглюкозидазы в сперме (семенной плазме) человека. С помощью
одного набора EpiScreen PlusTM можно оценить ферментативную
активность не менее 25 проб. Предназначено только для
применения специалистами.
ОБЩАЯ ИНФОРМАЦИЯ
Активность альфа-глюкозидазы в объеме спермы, а конкретнее – ее
нейтрального изофермента, зависит от секреции эпидидимисом1. У
пациентов с азооспермией и нормальным уровнем андрогенов в
периферической крови активность нейтральной альфа-глюкозидазы
в семенной плазме является надежным маркером эпидидимального
вклада в эякулят.
У мужчин с азооспермией и двухсторонней непроходимостью между
эпидидимисом и семявыбрасывающим протоком активность альфаглюкозидазы в семенной плазме сильно снижена2. Напротив, если
азооспермия вызвана задержкой созревания сперматозоидов или
непроходимостью между эпидидимисом и сетью яичка или в самой
сети яичка, активность альфа-глюкозидазы находится в норме.
Таким образом, оценка уровня нейтральной альфа-глюкозидазы в
семенной плазме нормально вирилизированных мужчин с
азооспермией может служить методом различения основных причин
этого состояния3, 4.
Низкая активность нейтральной альфа-глюкозидазы в семенной
плазме у пациентов с олигозооспермией может отражать частичную
непроходимость эпидидимиса, связанную с инфекционным или
воспалительным заболеванием2, 5. Ферментативная активность у
пациентов с нормальной концентрацией сперматозоидов
коррелирует с результатами окрашивания по Шору шейки и хвоста
сперматозоида, которые отражают изменения в мембране
сперматозоида, вызываемые эпидидимальной секрецией5.
Анализ EpiScreen Plus
бесплодия у мужчин.
 Реагент 1 (5 мл): реакционный буфер (pH 6,8), содержащий 1%
SDS
 Реагент 2 (0,25 мл): 50X раствор субстрата (PNPG в ДМСО)
 Реагент 3 (5 мл): раствор ингибитора (реакционный буфер,
содержащий глюкозу)
 Реагент 4 (60 мл): останавливающий буфер (0,02 М NaOH)
 Реагент 5 (1 мл): основной раствор стандарта (5 мМ PNP)
 Реагент 6 (60 мл): буфер для разбавления стандартов (0,02 М
NaOH + 0,1% SDS)
Сертификат анализа и паспорт безопасности (MSDS)
предоставляются по запросу или могут быть загружены с
нашего веб-сайта (www.fertipro.com).
TM
может помочь в диагностике и лечении
ПРИНЦИПЫ АНАЛИЗА
Принцип теста основан на следующей реакции:
PNPG + альфа-глюкозидаза --> альфа-D-глюкопиранозид +
PNP (желтый)
При указанных условиях (pH=6,8; T=37°C), 1 МЕ альфа-глюкозидазы
за одну минуту высвобождает из субстрата PNPG 1 мкМ PNP 7.
Желтую окраску PNP можно регистрировать
спектрофотометрически на 405 нм. Активность альфа-глюкозидазы
выражается как МЕ/л (или мМЕ/мл).
Реакционный буфер содержит SDS, который селективно ингибирует
кислотную форму альфа-глюкозидазы, источником которой
является предстательная железа. Это позволяет выполнять
специфическое определение активности нейтрального фермента6.
Спектрофотометр для чтения планшетов, фотометр (с фильтром на
405 нм), термомешалка или теплая водяная баня, пипеточный
дозатор, пробирки Eppendorf на 1,5 мл, микротитровальный
планшет
ХРАНЕНИЕ, ТРАНСПОРТИРОВКА И СТАБИЛЬНОСТЬ
Переносит транспортировку или кратковременное хранение при
повышенной (до 5 суток при 37°C) и чрезвычайно низкой (до 2 суток
при -18°C) температурах. Набор EpiScreen PlusTM необходимо
хранить при 2-8°C в защищенном от (солнечного) света месте, срок
хранения составляет 24 месяца. Не используйте после истечения
срока годности. Срок хранения вскрытых бутылей составляет 13
месяцев.
ХАРАКТЕРИСТИКИ АНАЛИЗА
Параметры валидации вычислялись согласно последним указаниям
CLSI9,10.
Диапазон измерения: 2,32-144 мМЕ/мл
CV в пределах одного анализа: 3,08% Чувствительность: 96.0 %*
CV для разных анализов: 10,52%
Специфичность: 93,6% *
Точность в пределах одного устройства: Нижний пул: 0,96 мМЕ/мл;
Верхний пул: 3,70 мМЕ/мл
Отсечка: 6,35 мМЕ/мл;
20 мМЕ/эякулят (с коррекцией на объем эякулята)
Нижний предел нормального диапазона значений для нейтральной
альфа-глюкозидазы составляет 20 мМЕ/эякулят
Информация по создающим помехи веществам отсутствует.
* вазэктоминизированные/нормозоосперические
ПРОВЕРКИ ПЕРЕД ПРИМЕНЕНИЕМ
Не используйте этот продукт, если нарушена герметичность
контейнера или в случае обнаружения дефектов изготовления. В
процессе хранения при температуре 2-8°C в реагенте 1 возможно
выпадение осадка, который исчезает при предварительном
прогреве до 37°C.
МЕТОД
Перед применением подождите прогрева реагентов 1, 2 и 3 до 37°C
в течение 30 мин. Для оптимального прогрева проб рекомендуем
использовать водяную баню с терморегулятором или термомешалку
для реакционных пробирок. НЕ проводите инкубацию в воздушном
инкубаторе, поскольку это может отрицательно повлиять на
результаты анализа.
Примечание: Организация WHO (ВОЗ) рекомендует применять
для коррекции фона только две внутренние контрольные пробы.
Поскольку вариации фона в пробах спермы достаточно велики (+/20%), рекомендуем приготовить для каждой пробы спермы
(семенной плазмы) отрицательную контрольную пробу для
внесения правильных и воспроизводимых коррекций фона.
Выполните следующие действия:
ODпроба с ингибитором (отрицательный контроль) = 0,060;
1. Для каждой подлежащей анализу пробы спермы (семенной
плазмы):
 приготовьте реакционный раствор: 3 мкл раствора
субстрата (реагент 2) в 147 мкл реакционного буфера
(реагент 1)
 приготовьте ингибирующий раствор (= для отрицательного
контроля): 3 мкл раствора субстрата (реагент 2) в 147 мкл
раствора ингибитора (реагент 3)
2. Дозируйте пипеткой по 20 мкл каждой пробы спермы (семенной
плазмы) в две пробирки Eppendorf на 1,5 мл
3. Добавьте 130 мкл реакционного раствора в один реакционный
сосуд и 130 мкл ингибирующего раствора – в другой
4. Проведите инкубацию на вихревой мешалке в течение 2 ч при
37°C
5. В процессе инкубации проб спермы (семенной плазмы)
постройте кривую стандартов PNP следующим образом:
Приготовьте стандарт с самой высокой концентрацией (200
мкМ), разбавив 100 мкл основного раствора стандарта (реагент
5) в 2400 мкл буфера для разбавления стандарта (реагент 6).
Используйте этот раствор для приготовления других стандартов
согласно таблице 1. Сам по себе реагент 6 служит стандартом
для 0 (пустая проба).
Тангенс угла наклона кривой стандартов = 0,0097
Таблица 1: Кривая стандартов PNP
Стандарт 200 мкМ
(мкл)
Реагент 6 (мл)
Конечная концентрация
(мкМ)
375
125
150
250
250
100
125
375
50
25
475
10
0
500
0
1. Δ OD пробы = 0,845 – 0,045 = 0,800
Δ OD пробы с ингибитором (отрицательный контроль) = 0,06 –
0,045 = 0,015
2. Значение OD пробы с коррекцией фона = 0,800 – 0,015 = 0,785
3. Концентрация PNP = 0,785 / 0,0097 = 80,93 мкМ
4. Активность фермента = 80,93 x 0,479 = 38,76 мМЕ/мл
Рассчитанную активность фермента можно умножить на объем
эякулята, чтобы оценить ферментативную активность всего
эякулята.
Примечание: Кривая стандартов состоит из точек в диапазоне 0-200
мкМ, поскольку значения для большей части проб спермы попадают
в этот диапазон. Однако линейность кривой подтверждена вплоть
до 300 мкМ. При желании оператор может изменить кривую, начав с
300 мкМ, что соответствует ферментативной активности в 144
мМЕ/мл. Если неизвестные пробы обладают большей активностью,
рекомендуем разбавить их и повторить тест для подтверждения
экспериментальных данных.
КОЭФФИЦИЕНТ КОРРЕКЦИИ
Этот коэффициент получается исходя из коэффициента
разбавления пробы для времени инкубации (120 мин).
В анализе используются пробы спермы объемом 20 мкл, которые
разбавляются до 1150 мкл (20 мкл пробы спермы + 130 мкл
реакционного буфера + 1000 мкл останавливающего буфера), что
дает коэффициент разбавления 57,5.
Одна ферментативная единица определяется как образование
определенного количества PNP за минуту. Поэтому для вычисления
активности за минуту коэффициент разбавления нужно разделить
на 120. Это дает коэффициент коррекции 0,479.
6. Через 2 ч инкубации проб (реакционных и ингибитора для
отрицательного контроля) остановите реакцию, добавив 1 мл
останавливающего буфера (реагент 4) и перемешайте на
вихревой мешалке.
7. Дозируйте пипеткой по 200 мкл всех проб и стандартов
(приготовленных на шаге 5) в микротитровальный планшет
8. Измерьте поглощение на 405 нм
ПРЕДУПРЕЖДЕНИЯ И МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ
Этот тест является вспомогательным средством для диагностики и
для других биологических тестов; интерпретация результатов
должна осуществляться в рамках клинических результатов и
данных анамнеза. Необходимо исключить другие причины
недостаточности эпидидимальной секреции, как, например,
гипоандрогению или тяжелую тестикулярную атрофию.
ИНТЕГРАЦИЯ ДАННЫХ
Все материалы необходимо утилизировать безопасным образом
согласно местным/национальным нормативам.
КРИВАЯ СТАНДАРТОВ
БИБЛИОГРАФИЯ
1. Вычислите значения Δ OD (значение OD стандарта - значение
OD пустой пробы (0-стандарт))
2. Отложите на графике значения Δ OD (ось Y) в зависимости от
концентраций стандартов (ось X) и выполните линейную
регрессию для вычисления тангенса угла наклона.
Коэффициент детерминации (R2) должен быть ≥ 0,99.
1. Cooper TG, Yeung CH, Nashan D, Jöckenhovel F, and Nieschlag E. (1990)
Improvement in the assessment of human epididymal function by the use of
inhibitors in the assay of alpha-glucosidase in seminal plasma. Int. J. Androl., 13:
297-305
Ниже приведен пример.
Standard curve PNP
y = 0.0097x
R² = 0.9999
2.500
OD 405 nm
2.000
2. Guerin JF, Ben Ali H, Rollet J, Souchier C, and Czyba JC. (1986) Alphaglucosidase as a specific epididymal enzyme marker. Its validity for the etiologic
diagnosis of azoospermia. J. Androl., 7: 156-162
3. Casano R, Orlando C, Caldini AL, Barni T, Natali A, and Serio M. (1987)
Simultaneous measurement of seminal L-carnitine, alpha 1-4-glucosidase and
glycerylphosphorylcholine in azoospermic and oligospermic patients. Fertil. Steril.,
47: 324-328
4. Cooper TG, Yeung CH, Nashan D, and Nieschlag E. (1988) Epididymal markers
in human infertility. J. Androl., 9: 91-101
1.500
5. Haidl G, Badura B, Hinsch KD, Ghyczy M, Gareiss J, Schill WB. (1993)
Disturbances of sperm flagelle due to failure of epididymal maturation and their
possible relationship to phospholipids. Hum. Reprod., 7: 1070-1073
1.000
0.500
0.000
0
50
100
150
200
250
PNP Concentration (µM)
НЕИЗВЕСТНАЯ АКТИВНОСТЬ ФЕРМЕНТА
1. Вычислите значения Δ OD для всех реакционных проб и проб
ингибитора (отрицательный контроль): (значение OD пробы
спермы - значение OD пустой пробы (0-стандарт))
2. Вычислите значение OD с учетом коррекции фона для проб
спермы (семенной плазмы): Вычтите значение Δ OD для пробы
отрицательного контроля с ингибитором из значения Δ OD,
соответствующего реакционной пробе
3. Вычислите соответствующую концентрацию PNP, разделив
значение OD с учетом коррекции фона на тангенс угла наклона
кривой стандартов
4. В итоге активность фермента (мМE/мл) получается умножением
значения PNP на 0,479 (см. ниже раздел «Коэффициент
коррекции»).
Пример
Данные анализа:
OD пустой пробы (0-стандарт) = 0,045;
ODпроба = 0,845;
6. Paquin R, Chapdelaine P, Dubé JY, Tremblay RR (1984) Similar biochemical
properties of human seminal plasma and epididymal alpha-1,4-glucosidase. J.
Androl., 5: 227-282
7. WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen,
5th edition. Measurement of neutral alpha-glucosidase in seminal plasma. pp. 134136
8. Yao X, Mauldin R, Byers L. (2003) Multiple sugar binding sites in α-glucosidase.
Biochim. Biophys. Acta, 1645: 22-29
9. Shrivastava A, Vipin B, Gupta VB (2011) Methods for the determination of limit of
detection and limit of quantitation of the analytical methods. Chron. Young Sci. 2:
21-25
10. Chesher D. (2008) Evaluating Assay Precision. Clin Biochem. Rev., 29: S23-S
11. Eertmans F, Bogaert V, Van Poecke T, and Puype B. (2014) An Improved
Neutral a-Glucosidase Assay for Assessment of Epididymal Function - Validation
and Comparison to the WHO Method. Diagnostics. 4: 1-11
ТЕХНИЧЕСКАЯ ПОДДЕРЖКА
FertiPro NV
Industriepark Noord 32
8730 Beernem
Belgium (Бельгия)
ТЕХНИЧЕСКАЯ ПОДДЕРЖКА В РФ
FerroTrust LTD
Ул. К. Маркса, 8, офис 411-418
620026, Екатеринбург, Россия
Телефон (343) 269-40-45; 261-60-29
Электронная почта: [email protected]
EPI_PLUS