Метод иммуноблоттинга для выявления антител к коронавирусу

Л А Б О РАТ О Р Н А Я Д И А Г Н О С Т И К А
УДК 619: 616-076
Метод иммуноблоттинга
для выявления антител к коронавирусу
при диагностике инфекционного
перитонита кошек
Ю.О. Терехова1, В.В. Цибезов1, Н.А. Рахманина2, О.А. Верховский1
1
2
АНО «Научно6исследовательский институт диагностики и профилактики болезней человека и животных» (Москва).
Ветеринарная клиника «Кибела» (Москва).
Ключевые слова: антитела, инфекционный перитонит кошек, иммуноблоттинг
Сокращения: АЧС — африканская чума свиней,
ВТГС — вирус трансмиссивного гастроэнтерита
свиней, ДСН — додецилсульфат натрия, ИПК (FIP) —
инфекционный перитонит кошек (feline infectious
peritonitis), ИФА — иммуноферментный анализ,
М.м. — молекулярная масса, МФА — метод флуоресцирующих антител, ПААГ-ДСН — полиакриламидный гель с додецилсульфатом натрия, ПВДФ —
поливинилиденфторид, ПЦР — полимеразная цепная реакция, РНГА — реакция непрямой гемагглютинации, ТГС — трансмиссивный гастроэнтерит
свиней, ФСБ — фосфатно-солевой буфер, ФСБТ —
фосфатно-солевой буфер, содержащий 0,1 % Твин-20,
ЭК — энтерит кошек
Введение
Инфекционный перитонит кошек — тяжелое заболевание животных семейства кошачьих. Клинически ИПК проявляется в инфузионной форме, сопровождающейся скоплением экссудата в брюшной
и/или плевральной полостях, и в неинфузионной (сухой) с гранулематозным поражением внутренних органов, без накопления экссудата в полостях тела, причем обе формы заболевания приводят к летальному исходу [2, 10].
Возбудителем ИПК является РНК-содержащий вирус, относящийся к семейству Coronaviridae, роду
Coronavirus, входящий в группу таксономически близких коронавирусов (вирус ЭК, ВТГС и коронавирус собак) [2, 4, 9]. Вирус ИПК образуется в результате мутации авирулентного кишечного вируса ЭК [12]. При
этом вирус часто приобретает вирулентность, способность поражать моноциты и макрофаги и вызывать
тяжелый перитонит [10]. Сложность диагностики ИПК
при использовании как методов обнаружения непосредственно возбудителя (ИФА, МФА, ПЦР), так и методов выявления антител (РНГА, МФА, ИФА) связана с высоким антигенным родством коронавирусов,
в частности, вирусов ЭК и ИПК и, соответственно,
практически идентичным спектром синтезируемых
антител [13]. Кроме того, некоторые изоляты вируса
ИПК являются авирулентными и не вызывают развития заболевания [6]. Эти обстоятельства не позволяют однозначно интерпретировать результаты определения вируса ИПК, например, методом ПЦР, а так-
26
же определения уровня специфических антител к вирусу методом ИФА. Более важным прогностическим и диагностическим показателем служит не сам
факт наличия антител к коронавирусу, а их высокие
титры с тенденцией быстрого увеличения, что прямо
коррелирует с тяжестью клинического проявления
болезни [5].
В нашей предыдущей работе установлено, что использование ВТГС в качестве антигена позволяет детектировать антитела к коронавирусам кошек методом непрямого ИФА и подтверждена зависимость
тяжести заболевания ИПК от титра определяемых
антител [1].
Цель исследования
Изучить возможность использования метода иммуноблоттинга для выявления антител к различным белкам коронавируса и диагностики инфекционного перитонита кошек.
Материалы и методы
Антиген. В качестве антигена применяли очищенный вирус ТГС, полученный по ранее описанной методике [1].
Биологический материал. Сыворотки крови получали от здоровых, подозрительных по заболеванию
и клинически больных кошек. Диагноз на ИПК подтверждали клиническими или патоморфологическими исследованиями. Уровень антител к коронавирусу
в сыворотке крови животных определяли методом непрямого твердофазного ИФА и в РНГА [1].
Электрофорез и иммуноблоттинг. Для постановки иммуноблоттинга вирусный антиген смешивали
в соотношении 1:1 с лизирующим буфером (0,125 М
трис-HCl, pH 6,8, 5 % ДСН, 0,5 % b-меркаптоэтанола, 10,8 % глицерина, 0,01 % бромфенолового синего) и прогревали 5 мин при 100°С. Электрофорез проводили в пластинах 12%-го полиакриламидного геля размером 70 х 100 х 0,75 на приборе Mini-PROTEAN
III (Bio-Rad, США) в восстанавливающих условиях при
постоянном напряжении 200 V. Белки в гелях окрашивали в течение 1 ч 0,1 %-м раствором Кумасси яркоголубого (CBB R-350) в водном растворе, содержащем 10 % уксусной кислоты и 45 % метанола.
После электрофоретическогого разделения вирусные белки из геля переносили на ПВДФ-мембрану
Immobilon-P (Millipore, США) на приборе Multiphor II
Метод иммуноблоттинга для выявления антител к коронавирусу
при диагностике инфекционного перитонита кошек
Результаты
Для проведения исследований использовали панель
индивидуальных проб сыворотки крови, полученных
от клинически здоровых кошек и от животных с различным содержанием антител к коронавирусу. Испытуемые пробы были распределены по соответствующим группам в зависимости от полученных результатов в непрямом твердофазном ИФА (табл.).
1. Характеристика испытуемых проб (n=115)
Группа животных (число животных в группе)
Титр в ИФА
1 (n=15)
Не определяется (< 1:50)
2 (n=17)
< 1:200
3 (n=52)
1:200…1:800
4 (n=17)
1:800…1:3200
5 (n=14)
> 1:3200
На рисунке представлены результаты иммуноблоттинга по выявлению вирусных антигенов сыворотками крови кошек различных исследуемых групп. Все
сыворотки крови здоровых животных, отрицательные
в ИФА, оказались отрицательными и в данном тесте
(полоса 3). В сыворотках крови с низким титром вирус-специфических антител (< 1:200, полосы 4 и 5) выявлялся только один белок N вируса ТГС, однако по
мере повышения титров антикоронавирусных антител
увеличивался и спектр детектируемых вирусных антигенов (полосы 6…8). В сыворотках крови с высокими титрами антител (> 1:3200, полосы 10…13) обнаруживались все основные структурные белки коронавирусов (N, S, M). Дополнительные иммуноспецифические белки на иммуноблоте, по-видимому, являются
продуктами протеолитической деградации основных
вирусных белков.
В процессе исследования было установлено оптимальное разведение сыворотки крови для исследования в иммуноблоттинге — 1:100. Увеличение концентрации сыворотки крови приводило к увеличению фоновой окраски мембран; при более высоком
разведении снижалась чувствительность анализа.
Сравнительный анализ результатов иммуноблоттинга, полученных при использовании свежеприготовленных ПФДФ-мембран и аналогичных препаратов, хранившихся при 4oС, показал, что иммунохимическая
активность вирусных антигенов на высушенных мембранах сохраняется не менее 6 мес с момента изготовления.
Обсуждение
Метод иммуноблоттинга в настоящее время широко используют в качестве дополнительного теста
при серодиагностике различных заболеваний человека и животных. Так, для постановки окончательного диагноза на АЧС, иммуноблоттинг является обязательным подтверждающим тестом: любую ИФАположительную или сомнительную сыворотку,
которая не дает четких результатов с белками АЧС
при иммуноблоттинге, считают отрицательной по наличию антител к вирусу АЧС [7, 15]. Аналогичные рекомендации действуют при диагностике синдрома
приобретенного иммунодефицита человека, когда
диагноз может быть поставлен только при наличии
в исследуемой сыворотке антител ко всем основным
белкам возбудителя [3, 8].
В нашей предыдущей работе показано, что наличие
высоких титров антител к коронавирусу (> 1:3200)
в сыворотках кошек, как правило, связано с интенсивным развитием инфекционного процесса и служит серьезным основанием для постановки диагноза на ИПК [1]. В настоящей работе мы продемон-
Рисунок. Иммуноблоттинг для выявления антител к коронавирусу.
А — окраска суммарных белков в геле Кумасси G?250: 1 — маркеры
молекулярной массы 200, 150, 120, 100, 85, 70, 60, 50, 40, 30, 25, 20, 15,
10 кД, 2 — вирус ТГС, стрелками отмечено положение основных белков
вируса ТГС;
Б — обработка вирусных антигенов после электропереноса на ПВДФ
мембрану сыворотками крови кошек: 3 — сыворотка крови клинически
здоровой кошки, 4…13 — сыворотки крови, положительные в ИФА, титр
1:200 (4, 5), титр 1:400 (6, 7), титр 1:800 (8), титр 1:1600 (9), титр 1:3200
(10, 11), титр 1:6400 (12, 13).
27
РВЖ • МДЖ • № 4/2012
(LKB, Швеция) в буфере для электропереноса (0,025 М
трис-HCl, 0,193 М глицин, 20 % метанол, рН 8,35) [11]
при постоянной силе тока 200 мА в течение 1 ч при
комнатной температуре. Мембраны блокировали в
растворе ФСБТ, содержащем 3 % Top Block (Yuro,
Швейцария) в течение 16 ч при 4ОС, высушивали на
воздухе и хранили при 4ОС.
Для специфического определения вирусных белков мембраны разрезали на полоски, соответствующие электрофоретическим трекам, и инкубировали
с исследуемыми сыворотками крови кошек (разведение 1:100 в ФСБТ, содержащем 3 % Top Block) в течение 1 ч при 37 ОС. Мембраны отмывали 4 раза
в течение 15 мин ФСБТ, добавляли меченые пероксидазой антитела к IgG кошки (разведение 1:10000
в ФСБТ, содержащем 3 % Top Block) и инкубировали 1 ч при 37ОС [1]. После отмывания мембраны обрабатывали 3,3’-диаминобензидином (0,05 %-й раствор в ФСБ с 0,01 % H2O2).
Ю.О. Терехова, В.В. Цибезов, Н.А. Рахманина, О.А. Верховский
стрировали, что метод иммуноблоттинга позволяет эффективно выявлять основные антигены коронавируса специфическими антителами, присутствующими в сыворотке крови инфицированных кошек.
Кроме того, увеличение спектра детектируемых коронавирусных антигенов прямо коррелирует со значениями титров антител, выявляемых методом ИФА,
а в сыворотках крови животных с подтвержденным
диагнозом ИПК и высоким титром антител к коронавирусу обнаруживается весь спектр вирусных
антигенов. Аналогичную картину иммунного ответа наблюдают при экспериментальном заражении
кошек вирусом ЭК, когда первыми выявляют антитела к белку N, а антитела к другим вирусным белкам детектируются только к 40…50-у дню после
заражения [14].
Таким образом, при сопоставлении результатов иммуноблоттинга и ИФА с анамнезом и патоморфологической картиной можно заключить, что изменение
специфичности сыворотки крови по отношению к основным структурным белкам коронавируса имеет
важное диагностическое значение при постановке диагноза на ИПК. Так, при выявлении антител к высокомолекулярным белкам (М.м. > 85 кД) коронави-
руса и прежде всего к S- белку в сыворотке крови
кошек, диагноз на ИПК можно считать подтвержденным. Детекция одного N-белка (М.м. 45 кД) коронавируса в иммуноблоттинге не позволяет поставить
диагноз на ИПК, и его можно считать отрицательным. Однако наличие антител к N-белку совместно
с антителами к другим низкомолекулярным белкам
(М.м. < 45 кД) свидетельствует о возможном инфицировании животного и в этом случае, как и в случае
ИФА, анализ следует повторить через 1…2 недели.
Выводы
На основании полученных в настоящей работе
результатов был сделан вывод о том, что метод иммуноблоттинга может быть эффективно использован в качестве подтверждающего теста для диагностики ИПК. Установлено, что вирусные антигены, перенесенные на ПВДФ-мембрану, сохраняют антигенную активность в течение длительного времени,
а сама мембрана обладает высокой прочностью и
эластичностью, что позволяет создать на основе иммуноблоттинга диагностическую тест-систему для
практического использования в ветеринарных лабораториях.
Библиография
1.
Терехова Ю.О., Цибезов В.В., Рахманина М.М., Элизбарашвили Э.И., Рахманина Н.А., Верховский О.А. Иммуноферментный метод выявления антител к коронавирусу для диагностики инфекционного перитонита кошек // Российский ветеринарный журнал. Мелкие домашние и дикие животные, 2012; 1: 24—28.
2.
Сергеев В.А., Непоклонов Е.А., Алипер Т.И. Вирусы и вирусные вакцины. — М.: Библионика, 2007.
3.
Guan M. Frequency, causes, and new challenges of indeterminate results in Western blot confirmatory testing for antibodies to
human immunodeficiency virus // Clin Vaccine Immunol., 2007; 14(6):
649—659.
4.
Horzinek M.C., Lutz H., Pedersen N.C. Antigenic relationships
among homologous structural polypeptides of porcine,feline, and canine
coronaviruses // Infect. Immun., 1982; 37(3): 1148—1155.
5.
Kai K., Yukimune M., Murata T., Uzuka Y., Kanoe M., Matsumoto H. Humoral immune responses of cats to feline infectious peritonitis virus infection // J. Vet. Med. Sci., 1992; 54(3): 501—507.
6.
Pastor M.J., Laviada M.D., Sanchez-Vizcaino J.M., Escribano J.M. Detection of African Swine Fever Virus Antibodies by Immunoblotting Assay // Can. J. Vet. Res., 1989; 53: 105—107.
7. Pedersen N.C., Evermann J.F., McKeirnan A.J., Ott R.L. Pathogenicity studies of feline coronavirus isolates 79—1146 and 79—1683
// Am. J. Vet. Res., 1984; 45: 2580—2585.
8. Piot P. Human immunodeficiency virus infection and acquired
immuno deficiency syndrome: A global overview. In: Goldman L.,
Ausiello D., eds. Cecil Medicine. — Philadelphia, Pa.: Saunders Elsevier, 2007.
9.
Spaan W., Cavanagh D., Horzinek M.C. Coronaviruses:
structure and genome expression // J Gen Virol., 1988; 69 (Pt 12):
2939—2952.
10.
Stoddart C.A., Scott F.W. Intrinsic resistance of feline peritoneal macrophages to coronavirus infection correlates with in vivo
virulence // J. Virol., 1989; 63(1): 436—440.
11. Towbin H., Staehelin T., Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets:
procedure and some applications // Biotechnology, 1992; 24:
145—149.
12.
Vennema H., Poland A., Foley J., Pedersen N.C. Feline infectious peritonitis viruses arise by mutation from endemic feline enteric
coronaviruses // Virology, 1998; 30, 243(1): 150—157.
13.
Vennema H., Poland A., Floyd Hawkins K., Pedersen N.C.
A comparison of the genomes of FECVs and FIPVs and what they tell
us about the relationships between feline coronaviruses and their
evolution // Feline Pract., 1995; 23: 40—44.
14.
Vogel L., van der Lubben M., Te Lintelo E.G., Bekker C.P.,
Geerts T., Schuijff L.S., Grinwis G.C., Egberink H.F., Rottier P.J. Pathogenic characteristics of persistent feline enteric coronavirus infection in cats // Vet. Res., 2010; 23, 41(5): 71.
15. World Organization of Animal Health (OIE). African swine fever.
Manual of Standards for diagnostic test and vaccines, 2008.
SUMMARY
Yu.O. Terekhova, V.V. Tsibezov, N.A. Rakhmanina, O.A. Verkhovsky. Immunoblotting Assay for Detection
of Coronaviruruses Antibodies for Feline Infectious Peritonitis (FIP) Diagnosis. An immunoblotting assay (West8
ern blotting) has been adapted for the detection of feline infectious peritonitis (FIP) virus antibodies. It is highly
specific, sensitive and easy to interpret method which can be used for confirmation of the diagnosis for FIP.
28