ФГБУ “НИИР им. В.А. Насоновой” РАМН НОВЫЕ ПОДХОДЫ К ОПРЕДЕЛЕНИЮ АНТИНУКЛЕАРНЫХ АНТИТЕЛ ПРИ СИСТЕМНЫХ АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ Е.Н. Александрова, Ж.Г. Верижникова, А.А. Новиков Москва 2013 Антинуклеарные антитела (АНА) – гетерогенная группа аутоантител, реагирующих с различными компонентами ядра и цитоплазмы клеток ОСНОВНЫЕ ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ЛАБОРАТОРНЫЕ ТЕСТЫ В РЕВМАТОЛОГИИ АНТИНУКЛЕАРНЫЕ АНТИТЕЛА (АНА) РЕВМАТОИДНЫЙ ФАКТОР (РФ) АНТИТЕЛА К ЦИТРУЛЛИНИРОВАННЫМ БЕЛКАМ (АЦБ) АНТИНЕЙТРОФИЛЬНЫЕ ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКИЕ АНТИТЕЛА (АНЦА) АНТИФОСФОЛИПИДНЫЕ АНТИТЕЛА (АФЛ) Международные рекомендации по методам клиническому значению антинуклеарных антител определения и Клиническое значение антинуклеарных антител • Диагностический критерий ряда аутоиммунных РЗ (системная красная волчанка, системная склеродермия, синдром Шегрена, полимиозит/дерматомиозит, смешанное заболевание соединительной ткани, лекарственная волчанка, аутоиммунный гепатит) • Характеристика клинико-лабораторных субтипов системных РЗ • Оценка активности патологического процесса • Оценка прогноза системных РЗ • Предикторы развития аутоиммунных РЗ у бессимптомных пациентов Антинуклеарные антитела: LE-клетки LE (lupus erythematosus)-клетки: нейтрофилы, фагоцитировавшие ядерный материал Низкая чувствительность и специфичность для диагностики СКВ В 1950-х г.г. начинается разработка иммунофлюоресцентных тестов для диагностики СКВ Hargraves et al., 1948 Антинуклеарный фактор (АНФ) 1. «Золотым стандартом» и первичным скрининговым методом определения АНА в сыворотке крови является непрямая реакция иммунофлюоресценции (НРИФ) с использованием в качестве субстрата криостатных срезов мышиной или крысиной печени (почек), либо клеток линии HЕp-2 (эпителиальные клетки рака гортани человека). 2. Применение стандартизованных HEp-2 клеток предпочтительнее, так как позволяет существенно повысить чувствительность метода и достоверно описать различные типы свечения ядра. При тестировании АНА методом НРИФ их традиционно обозначают как антинуклеарный фактор (АНФ). 3. Оценка результатов НРИФ проводится с указанием максимального титра обнаружения АНФ в исследуемых сыворотках, а также интенсивности и типа иммунофлюоресценции. 4. Характер свечения отражает присутствие различных типов АНА, в определенной степени специфичных для ряда аутоиммунных РЗ. Схема постановки НРИФ для определения АНФ Титры АНФ в норме и патологии Норма < 1:40 при использовании криостатных срезов печени или почек лабораторных животных Норма <1:160 при использовании HЕp-2 клеток человека Идентификация 95% больных аутоиммунными ревматическими заболеваниями и здоровых лиц АНФ-HЕp-2 в титре 1:40 выявляется у 25-30%, 1:80 у 10 – 15%,1:160 и выше у 5% здоровых людей. Частота обнаружения АНФ повышается с возрастом, особенно у женщин. Родственники больных аутоиммунными ревматическими заболеваниями имеют титры АНФ ≥1:40 в 25-30% случаев. Уровни позитивности АНФ-HЕp-2: Низко позитивные титры: 1:80/1:160 – 1:320 Умеренно позитивные титры: 1:640 Высоко позитивные титры: >1:1280 E.M.Tan и соавт., Arthritis Rheum 1997; 40: 1 601-1611 ХАРАКТЕРИСТИКА АНФ Тип свечения Тип аутоантител Связь с заболеваниями Гомогенное Антитела к ДНК (двух и односпиральной), ДНП, гистонам (H1, H2A,H2B, H3, H4) СКВ, лекарственная волчанка, любые аутоиммунные заболевания Периферическое (краевое) Антитела к дс ДНК СКВ Крапчатое Антитела к Sm, РНП, SS-A/Ro, SS-B/La, Jo-1 СКВ, СЗСТ, синдром Шегрена, ПМ/ДМ Сетчатое крапчатое Антитела к Scl-70 ССД (диффузная форма) Дискретное крапчатое Антитела к центромере CREST синдром, синдром Рейно Нуклеолярное Антитела к РНК-полимеразе 1, PM/Scl, U3РНП ССД (диффузная форма) ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ Y.Shoenfield, M.E. Gershvin, P.L. Meroni; Autoantibodies, 2nd Edition, Elsevier, 2007. Высокая чувствительность Возможность автоматизации Значительный процент ложноположительных и ложноотрицательных результатов Типы тест-систем на основе ИФА в зависимости от используемых антигенов: 1) экстракт ядер HEp2 клеток (1-е поколение тестсистем) 2) экстракт ядер HEp2 клеток с экстраантигенами (2-е поколение тест-систем) 3) рекомбинантные антигены ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТИНУКЛЕАРНЫХ АНТИТЕЛ С ПОМОЩЬЮ СУСПЕНЗИОННЫХ МИКРОЧИПОВ (МУЛЬТИПЛЕКСНАЯ ТЕХНОЛОГИЯ XMAP) SSB RiboP Scl70 Sm YY RNP SSA dsDNA SSA Sm Control SSB RNP CenB Scl70 dsDNA •ANA Screen* •dsDNA•Chromatin •Ribosomal Protein •SS-A (52 and 60) •SS-B•Sm•Sm/RNP •RNP (A and 68) •Scl-70 •Jo-1 •Centromere B НРИФ vs. ИФА vs. Multiplex Позиция ACR и EULAR в отношении определения АНФ • Тестирование АНФ с помощью НРИФ при использовании в качестве субстрата HEp-2 клеток человека (содержащих 100-150 различных аутоантигенов)- «золотой стандарт» и первичный скрининговый метод определения АНА в сыворотке крови • Другие скрининговые методы определения АНА (ИФА, мультиплексные технологии, устанавливающие наличие в сыворотках антител к ограниченному количеству очищенных/рекомбинантных антигенов или смеси ядерных антигенов с измененными либо утраченными эпитопами, увеличивают процент ложноотрицательных результатов и не могут заменить тестирование АНФ с помощью НРИФ • Лаборатории, проводящие скрининговое определение АНА с использованием различных методов твердофазного анализа ( ИФА, мультиплексные диагностические платформы) должны предоставить данные о такой же или более высокой чувствительности и специфичности этих техник по сравнению с АНФ-НРИФ. • У пациентов с положительными результатами определения АНФ рекомендуется проведение подтверждающих тестов на специфические АНА к отдельным ядерным антигенам (нДНК, Sm, SSA/Ro, SSB/La, Scl-70, РНП), используя методы ИФА, иммуноблота (ИБ), двойной иммунодиффузии (ДИД), контриммуноэлектрофореза (КИЭФ) и др. • Некоторые типы АНА (антицентромерные, PCNA, антитела к митотическому аппарату клетки-NUMA) обнаруживаются только методом НРИФ на HEp-2 клетках, что исключает необходимость их дальнейшего исследования с помощью подтверждающих тестов. • Методы определения АНА, анти-ДНК, анти-Sm и др. должны быть валидированы согласно национальным (CDC) или международным ( WHO) стандартам. • В бланках выдачи результатов анализа следует указывать метод определения АНА. НЕДОСТАТКИ НЕПРЯМОЙ РЕАКЦИИ ИММУНОФЛЮОРЕСЦЕНЦИИ - ОСНОВНОГО СКРИНИНГОВОГО МЕТОДА ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИНУКЛЕАРНЫХ АНТИТЕЛ Y.Shoenfield, M.E. Gershvin, P.L. Meroni; Autoantibodies, 2nd Edition, Elsevier, 2007. » СУБЪЕКТИВНАЯ ОЦЕНКА РЕЗУЛЬТАТОВ ТЕСТА » НЕОБХОДИМОСТЬ ИНТЕНСИВНОГО ОБУЧЕНИЯ ДЛЯ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ ТИПОВ СВЕЧЕНИЯ » ОТСУТСТВИЕ КВАЛИФИЦИРОВАННОЙ ЭКСПЕРТНОЙ ОЦЕНКИ » ПОЛУКОЛИЧЕСТВЕННАЯ ОЦЕНКА РЕЗУЛЬТАТОВ СВЕЧЕНИЯ В ТИТРАХ » ОТСУТСТВИЕ СТАНДАРТИЗАЦИИ СУБСТРАТОВ, РЕАГЕНТОВ, МИКРОСКОПА http://www.euroimmun.us Автоматизированные системы интерпретации клеточных флюоресцентных тестов способствуют стандартизации и улучшению воспроизводимости НРИФ при определении АНА у больных РЗ http://www.aklides.com/ http://www.immcodiagnostics.com http://www.aesku.com Цель исследования Сравнительный анализ автоматизированной и визуальной интерпретации результатов НРИФ-HEp-2 при определении антинуклеарных антител (АНА) в сыворотках больных ревматическими заболеваниями (РЗ). *Работа выполнена в рамках договора о научно-практическом сотрудничестве ФГБУ «НИИР им. В.А. Насоновой» РАМН (директор – академик Е.Л. Насонов), ГБОУ ВПО «ЯГМА» (ректор – профессор А.В. Павлов) и компании MEDIPAN GMBH (директор – Д. Роггенбук) по теме НИОКР ФГБУ «НИИР им. В.А. Насоновой» РАМН «Значение мультиплексных молекулярно-клеточных технологий в лабораторной диагностике ревматических заболеваний», регистрационный номер 01201180902 (2012-2016 г.г.). Материалы и методы Исследованы сыворотки 1178 больных (185 – СКВ, 148 - СШ, 181 – ССД, 44 – ПМ/ДМ, 60 – перекрестным синдромом, 35 - антифосфолипидным синдромом, 525 – другими РЗ), наблюдавшихся в ФГБУ «НИИР им. В.А. Насоновой» РАМН в 2012 г. АНА определяли методом НРИФ-НЕр-2 с помощью коммерческого набора реагентов AKLIDES®ANA («Medipan GmbH», Германия) согласно инструкции фирмы-изготовителя. Обработку результатов НРИФ-HЕp-2 проводили: -с использованием автоматизированной платформы AKLIDES («Medipan GmbH», Германия) на основе многопараметрического анализа внутриклеточных структур - методом визуальной оценки образцов флюоресценции под микроскопом AXIOSKOP 40 (“Zeiss”, Германия) двумя экспертами Согласованность позитивных/негативных результатов выявления АНА по данным автоматизированной и визуальной оценки НРИФ-HEp-2 Автоматизированная интерпретация n (%) Визуальная интерпретация n (%) Позитивный ≥ 1:160 (%) Негативный < 1:160 (%) n (%) Позитивный ≥ 1:160 (%) 784 (66,6%) 158 (13,4 %) 942 (80,0%) Негативный < 1:160 (%) 60 (5,1%) 176 (14,9 %) 236 (20,0%) n (%) 844 (71,6%) 334 (28,4 %) 1178 Позитивные/негативные результаты определения АНФ на анализаторе AKLIDES и рутинным методом совпадали в 81,5% случаев (позитивные – у 66,6%, негативные – у 14,9% пациентов) (κ=0,5). Чувствительность определения АНА с помощью автоматизированной платформы AKLIDES была выше, чем при использовании визуальной микроскопической техники (80,0% и 71,6%, соответственно, p<0,05). А.А. Новиков, 2012 Ж.Г. Верижникова, 2013 г. Сравнение результатов автоматизированной и визуальной интерпретации типов свечения в сыворотках 784 АНФ-позитивных больных РЗ (I) Тип свечения Автоматизированная интерпретация n (%) 295 (37,6%) Визуальная интерпретация n (%) 61 (7,8%) 253 (32,3%) 100 (12,8%) 24 (3,1%) 9 (1,1%) 44 (5,6%) 43 (5,5%) Недифференцированное 168 (21,4%) 0 Homogeneous + Speckled (смешанное) 0 571 (72,8%) ИТОГО: 784 784 Homogeneous (гомогенное) Speckled (крапчатое) Nucleolar (нуклеолярное) Centromere (центромерное) Автоматизированным методом наиболее часто определялось гомогенное и крапчатое свечение (в 37,6% и 32,3% случаев); у 21,4% больных встречался недифференцированный тип свечения. Визуальным методом в сыворотках большинства пациентов (72,8%) выявлялся смешанный тип свечения АНФ. А.А. Новиков, 2012 г. Ж.Г. Верижникова, 2012 г. Сравнение результатов автоматизированной и визуальной интерпретации типов свечения в сыворотках АНФ-позитивных больных РЗ (II) √ Смешанное свечение (n=571) распознавалось анализатором AKLIDES как гомогенное у 231 (40,5%) больных, крапчатое - у 187 (32,7%), нуклеолярное - у 14 (2,4%), центромерное - у 5 (0,9%), недифференцированное - у 134 (23,5%). √ При визуальном исследовании образцов флюоресценции (n=168) с недифференцированным типом свечения в 134 (79,8%) из них было идентифицировано смешанное, в 10 (5,9%) – гомогенное, в 24 (14,3%) – крапчатое свечение. √ Совпадение по типам свечения при автоматизированной и визуальной интерпретации результатов НРИФ-HEp-2 у 179 больных РЗ (после исключения недифференцированного и смешанного свечения) наблюдалось в 143 (80,0%) случаях; согласованность типов свечения была «хорошей» (κ=0,7). А.А. Новиков, 2012 г. Ж.Г. Верижникова, 2013 г. Взаимосвязь между титрами АНФ и интенсивностью сигналов флюоресценции Титры Интенсивность свечения <1:160 1:160 1:320 1:640 ≥ 1:1280 «0 / ±» «0 / ±», «+» и «++» «+» и «++» «++» и «+++» «+++» и «++++» Степень соответствия 72,2% 99,6% 80,7% 83,2% 100% Степень согласованности титров и интенсивности свечения АНФ у 1178 больных РЗ оценивалась как «хорошая» (κ=0,45). Ж.Г. Верижникова, 2013 г. Причины несовпадения результатов определения АНА при автоматизированной и визуальной обработке НРИФ-HEp-2 Расхождения в оценке отрицательных/низких титров АНФ и интенсивности сигнала флюоресценции Учет цитоплазматического свечения системой AKLIDES Возможные артефакты, связанные с некачественной окраской препаратов Комбинация различных типов свечения в одном образце (смешанное свечение) Наличие редких типов свечения (антител к ядерной мембране, аппарату Гольджи и др.) ВЫВОДЫ • Непрямая реакция иммунофлюоресценции (НРИФ) с использованием в качестве субстрата клеток линии HЕp-2 (НРИФ-HEp-2) - «золотой стандарт» и первичный скрининговый метод определения антинуклеарных антител (АНА) в сыворотках больных РЗ • В рутинной практике автоматизированная платформа «AKLIDES» позволяет: 1) эффективно идентифицировать позитивные и негативные результаты определения АНА сопоставимо с «классическим» визуальным методом интерпретации НРИФ-HEp-2 2) прогнозировать максимальный конечный титр АНА в сыворотках больных РЗ по интенсивности сигнала флюоресценции. • Для подтверждения результатов автоматизированной оценки типов ядерного свечения и уточнения титров АНА рекомендуется дополнительное экспертное визуальное исследование позитивных образцов флюоресценции. БЛАГОДАРЮ ЗА ВНИМАНИЕ