Набор для выявления вируса инфекционного бронхита

Набор для выявления
вируса инфекционного
бронхита
(количественный)
Вир-12-100, на 100 реакций
1
Содержание
Компоненты набора .................................................. 3
Область применения ................................................. 3
Гарантия ..................................................................... 3
Описание .................................................................... 4
Меры предосторожности ......................................... 4
Необходимое оборудование .................................... 4
Важные замечания .................................................... 5
Выделение РНК ........................................................ 5
Необходимые контрольные образцы ...................... 6
Этап I. Постановка обратной транскрипции .......... 7
Этап II. Постановка ПЦР .......................................... 8
Этап III. Анализ результатов .................................... 9
Проблемы и рекомендации..................................... 10
Контроль качества ................................................... 10
Хранение и стабильность ....................................... 11
Служба технической поддержки ........................... 11
Информация для заказов......................................... 11
2
Компоненты набора
Компоненты
количество
Этап обратной транскрипции
1,1 мл
2X Микс Транскрипция
55 мкл
М-MLVобратная транскриптаза
Этап ПЦР
1,4 мл
2X Микс ПЦР
55 мкл
H-Taq полимераза
Набор калибровочных образцов от 7х 100 мкл
10 до 107 копий.
2 мл
Вода
Область применения
Набор предназначен для выявления геномной РНК вируса
инфекционного бронхита, выделенной из биологических
образцов и смывов, и оценки количества вирионов в
исследуемых образцах. Анализ основан на методе ПЦР в
реальном времени. Чувствительность набора до 103/мл
геном эквивалентов в исходной пробе. Набор рассчитан на
проведение 100 реакций, включая контроли.
Гарантия
Фрактал Био гарантирует изготовление всех продуктов
согласно описанию в руководстве. Покупатель должен
определить соответствие продукта для конкретного его
использования. Если продукт не дает заявленного
результата по любой причине, за исключением
неправильного использования, мы бесплатно произведем
3
замену продукта или вернем покупателю его полную
стоимость. Мы сохраняем за собой право изменять или
модифицировать любой продукт в целях улучшения его
качеств и дизайна. Если у Вас возникли вопросы по
применению продукта или оценке результата, вы можете
обращаться в Службу технической поддержки (см. на
обороте).
Описание
Процедура анализа состоит из трѐх этапов: 1) постановка
обратной транскрипции, 2) проведение ПЦР с
флуоресцентной детекцией в реальном времени, 3) анализ
результатов. Для детекции используется канал R6G (макс.
поглощения 520 нм, макс. флуоресценции 550 нм).
Меры предосторожности
При приготовлении смесей используйте индивидуальные
средства защиты. Компоненты набора не обладают
токсическими и другими свойствами, за счѐт которых
возможно негативное воздействие на человека.
Необходимое оборудование
Термостат
Амплификатор для ПЦР в реальном времени
Микроцентрифуга
Ламинарный и ПЦР-бокс
Набор дозаторов
Одноразовые наконечники с фильтрами для дозаторов
4
Одноразовые
полипропиленовые
микропробирки
объѐмом 0,2 (0,5) мл
Штативы для наконечников и микропробирок
Халат и одноразовые перчатки
Важные замечания
При работе с РНК необходимо использовать только
одноразовые пластиковые расходные материалы,
имеющие специальную маркировку “RNase-free”,
“DNase-free”.
Для приготовления смесей и добавления нуклеиновых
кислот используйте только наконечники с фильтрами.
Работать только в одноразовых перчатках.
Всѐ лабораторное оборудование, в том числе дозаторы,
лабораторная посуда, а также все рабочие растворы,
должны быть строго стационарным.
Выделение РНК, приготовление смеси для обратной
транскрипции необходимо проводить в ламинарном
боксе.
Приготовление реакционных смесей для ПЦР
необходимо проводить в ПЦР-боксе.
Выделение РНК
При выделении РНК не рекомендуется использовать
наборы на основе силики или диатомовой земли. Наиболее
подходящие варианты - наборы с микроцентрифужными
колонками
или
на
основе
фенол-хлороформной
экстракции.
5
При выделении из суспензии клеток используйте не
более
100
мкл
суспензии.
Перед
выделением
рекомендуется 3-4 раза заморозить-разморозить образец.
После чего осадить клеточные стенки центрифугированием
при 12000 об./мин в течение 5 мин. Для выделения РНК
использовать супернатант.
Обязательно проводите отрицательный контроль (К) – выделение РНК из воды. Этот же образец используйте
при постановках обратной транскрипции и ПЦР.
При использовании набора “ФБиоНуклео” (Фрактал
Био) для выделения РНК, рекомендуется элюировать РНК
в 15 мкл буфера ЕБ или воды. Таким образом, для
постановки обратной транскрипции следует использовать
весь полученный элюат (10 мкл).
Необходимые контрольные образцы
Этап выделения РНК
Отрицательный контрольный образец (выделение
РНК из воды)
Этап постановки обратной транскрипции:
Отрицательный контрольный образец (вода или
продукт выделение РНК из воды)
Этап постановки ПЦР:
Отрицательный контрольный образец (вода или
продукт обратной транскрипции с воды)
6
3-4 калибровочных образца (входят в состав
набора)
Калибровочные образцы всегда добавляйте последними,
после закрытия пробирок с пробами.
Этап I. Постановка обратной транскрипции.
1.
Смешайте компоненты, входящие в набор, в
указанных ниже пропорциях:
Компонент
Количество
2X Микс Транскрипция
10 мкл
РНК матрица
10 мкл
Перемешайте,
осадите
капли
кратковременным
центрифугированием
2.
Инкубируйте смесь 5 мин. при +70 °С, перенесите
пробирку в лед и соберите капли кратковременным
центрифугированием.
3.
Добавьте 0,5 мкл обратной транскриптазы M-MLV.
4.
Инкубируйте смесь в течение 30 мин. при +37°С.
5.
Остановите реакцию прогреванием смеси в течение
10 минут при +70°С. Перенесите смесь в лѐд и
инкубируйте 5 минут.
6.
Добавьте 30 мкл ТЕ буфера или воды. Таким
образом, итоговый объѐм смеси будет 50 мкл.
Полученная кДНК может быть непосредственно сразу же
использована для ПЦР. Храните синтезированную кДНК
при -20 °С.
7
Этап II. Постановка ПЦР.
1.
Смешайте компоненты, входящие в набор, в
указанных ниже пропорциях:
Компонент
2Х Микс
H-Taq
полимераза
Вода
На 1
реакцию
(мкл)
12,5
0,5
На 5
реакций
(мкл)
62
2,5
7
35
На N реакций
12,5х(N+1) мкл
0,5х(N+1) мкл
7х(N+1) мкл
Важно! ПЦР смесь на несколько реакций (более пяти)
готовится на одну реакцию больше, чем нужно, чтобы
избежать недостатка смеси из-за погрешности пипеток и
потерь на наконечниках.
H-Taq полимеразу следует убрать на -20 °С сразу после
использования.
2.
Перемешайте подготовленную смесь на вортексе и
осадите капли кратковременным центрифугированием (2-3
сек).
3.
После приготовления смеси перенесите по 20 мкл в
каждую пробирку для ПЦР.
4.
Внесите в первую пробирку с ПЦР смесью 5 мкл
отрицательного контрольного образца (К-).
5.
Внесите по 5 мкл каждого образца кДНК в пробирки
с ПЦР смесью. Закройте крышки пробирок.
6.
Для построения калибровочного графика проведите
реакции с входящими в набор калибровочными образцами
(КО). Указанное на образцах количество копий содержится
8
в 5 мкл. Таким образом, на реакцию необходимо брать 5
мкл. Для построения графика нет необходимости брать все
калибраторы. Берите 3-4 в том диапазоне, в котором будут
давать результат Ваши исследуемые пробы.
ВАЖНО: Пробирки с калибровочными образцами,
входящие в набор, открывайте только после раскапывания
и закрытия крышек пробирок всех исследуемых проб.
7.
Поместите пробирки в амплификатор и запустите
программу амплификации:
95°С - 3 минуты
50 циклов 60°С - 30 секунд
95°С - 20 секунд
Для приборов компании “BioRad”
установить на этапе 60 °С – 30 секунд.
съѐмку
следует
Этап III. Анализ результатов.
По
каналу
R6G
регистрируется
сигнал,
свидетельствующий о накоплении продукта амплификации
кДНК проб.
Определите пороговые циклы (Ct) для каждой из проб. При
этом Сt для отрицательного контроля (К-) по каналу R6G
должно быть >50.
Постройте калибровочный график в соответствии с
инструкцией
к
используемому
программному
обеспечению. Определите количество копий кДНК в
исследуемых пробах по калибровочному графику.
ВНИМАНИЕ: Калибровочные образцы показывают
количество пар копий. Таким образом, получаемый
результат даѐтся в количестве пар копий.
9
Проблемы и рекомендации
Сt для калибровочных Убедитесь, что не вышел срок
образцов не определено годности.
Обратитесь
к
(Сt >50).
производителю
Сt для проб меньше 17
Разведите кДНК в 10-1000 раз
и повторите анализ.
Сt для отрицательного Возможно,
установлены
контроля <40
некорректные параметры для
расчѐта.
Контаминация.
Проведите мероприятия по
очистке
оборудования
и
помещения от контаминантов.
Смените
реактивы.
Не
открывайте
пробирку
с
контрольным образцом до
приготовления отрицательного
контроля и анализируемых
проб.
Контроль качества
Тестирование набора проводилось на клеточной культуре,
содержащей инактивированный вирус инфекционного
бронхита, в соответствии с протоколом, описанным выше.
Выделение РНК проводилось с помощью набора
“ФБиоНуклео” (Фрактал Био).
10
Хранение и стабильность
Набор может храниться до 6 месяцев без изменения
качественных характеристик при температуре -20°С.
Служба технической поддержки
В случае появления вопросов обращайтесь в службу
технической поддержки: [email protected]
Информация для заказов
Наименование
Кат.номер
Набор для выявления вируса
инфекционного бронхита,
количественный (на 50 реакций)
Набор для выявления вируса
инфекционного бронхита,
количественный (на 100 реакций)
Набор «ФБиоНуклео» для выделения
нуклеиновых кислот из
биологического материала (на 4
выделения)
Набор «ФБиоНуклео» для выделения
нуклеиновых кислот из
биологического материала (на 50
выделений)
11
Вир-12-50
Вир-12-100
НК-1-4
НК-1-50
Произведено: ООО “Фрактал Био”, 190020, г. СанктПетербург, ул. Бумажная, д. 17
сайт: fractalbio.com
E-mail: [email protected]
Контактный телефон/факс: (812) 495-96-95
Дата изготовления:
12