положительный

ОТЗЫВ
официального оппонента Юминовой Н.В. на диссертационную работу Малкина Геннадия
Андреевича по теме: «Особенности размножения хантавирусов в культурах клеток»,
представленной на соискание ученой степени кандидата биологических наук по
специальности 03.02.02 - вирусология.
Геморрагическая
лихорадка с почечным синдромом (ГЛПС) - не трансмиссивный
зооноз, в России занимает ведущее место среди природноочаговых
инфекций. Возбудители
ГЛПС в составе рода Хантавирус принадлежат
к обширному семейству Буньявирусов.
К
настоящему
роль шести хантавирусных
и
времени
геновариантов
доказана
этиологическая
в структуре заболеваемости
ГЛПС: в европейской части России и странах
Европы - вирусы Пуумала (ПУУ) и генотипы вируса Добрава/Белград
Сочи;
В
генотипов
(ДОБ) -Куркино
и
российских регионах Дальнего Востока и странах Азии - вирус Сеул (СЕУ), вирус
Хантаан (ХТН) и его геновариант Амур. Естественными хозяевами хантавирусов являются
грызуны и насекомоядные, в организме которых вирус длительное время коэволюцинировал.
Хантавирусы с трудом адаптируются к размножению в организме лабораторных животных' а
также в клеточных культурах, что вероятно объясняет более чем тридцатилетний
период
безуспешных попыток изолировать возбудитель ГЛПС, вирусная природа которого уже была
доказана
выдающимися
отечественными
А.А. Смородинцевым
вирусологами
и
МЛ.Чумаковым.
Возможность использования
клеточных культур для культивирования
хантавирусов
стала активно изучаться после успешной адаптации вируса Хантаан, изолированного
лабораторных
мышах,
к культуре
несмотря на многочисленные
клеток карциномы
легких
человека,
на
А549. Однако,
исследования, подбор клеточной культуры чувствительной для
изоляции штаммов хантавирусов, а также пригодной в качестве субстрата для производства
вакцин
против
инактивированные
ГЛПС
является
одной
из
актуальных
проблем.
Известно,
что
хантавирусные вакцины про изводятся в Китае, КНДР и Южной Корее на
основе вирусов Хантаан и Сеул, но они не обладают защитным действием
против вируса
Пуумала - основного возбудителя ГЛПС у жителей европейской части России, на которую
приходится
более
98% всей заболеваемости,
разработкой культуральной
выбором чувствительных
регистрируемой
в России.
Трудности
с
вакцины против хантавируса Пуумала связаны с ограниченным
к размножению этого вируса клеточных культур и низкого уровня
репродукции вируса в ранее использовавшихся клеточных культурах.
В связи с изложенным, заявленная цель диссертационной
уточнение
спектра перевиваемых
линий клеток, способных
работы Г.А.Малкина -
поддерживать
размножение
хантавирусов, вызывающих ГЛПС (Пуумала, Добрава, Хантаан и Сеул), выявление наиболее
пермиссивной клеточной культуры и условий эффективной репликации в них хантавирусов,
включая изоляцию штаммов от природных носителей - представляется высоко актуальной.
Задачи, поставленные для выполнения намеченной цели, автором были полностью решены.
Автором выполнен большой объем исследований включающий: адаптацию хантавирусов
5 видам
перевиваемых
патогенных
клеточных
хантавирусов
получения
вирусного
инактивированной
в пермиссивных
субстрата,
морфологических
При
клеточных
пригодного
динамики
культурах;
для
представительной
характеристик
этом
прослеживается
результатов
определение
размножения
оптимизацию
изготовления
условий
цельновирионной
вакцины против ГЛПС; изоляция штаммов хантавирусов в 3-х клеточных
культурах с использованием
клеток.
культур;
к
на
вируса Пуумала при длительном пассировании в культуре
протяжении
большой
личный
определяется
выборки полевого материала; определение
всех
вклад
высоким
этапов
выполнения
автора.
работы,
Обоснованность
научно-методическим
уровнем
и
несомненно,
достоверность
работы
и большим
объемом материалов исследования.
Диссертация
Министерством
рукописи.
оформлена
образования
Диссертация
в
соответствии
и науки Российской
изложена
с
требованиями,
Федерации,
на 106 страницах
и представлена
машинописного
введения, обзора литературы, 4 глав собственных исследований,
включая выводы,
а также списка сокращений
источника, иллюстрирована
установленными
на правах
текста, состоит из
обсуждения, заключения,
и списка литературы,
содержащего
104
11 таблицами и 22 рисунками.
Обзор литературы даёт представление о современном состоянии проблемы хантавирусов
и хан-гавирусных инфекций в целом, в том числе дан анализ применения клеточных культур
в хантавирусологии.
Вторая, третья, четвёртая
и пятая главы посвящены
результатам
собственных
исследований.
Во второй главе представлены материалы и методы исследования, которые указывают
на
широкий
диапазон
методов:
серологических,
вирусологических,
молекулярно-
биологических и электронной микроскопии, которые были использованы в работе.
В третьей главе представлены
клеточных
линиях различного
результаты репликации
происхождения.
патогенных хантавирусов
Главу предваряет
сравнительная
в
оценка
эффективности методов индикации размножения хантавирусов в клеточных культурах. По
результатам
проведенных
патогенных хантавирусов
Vero
Е6,
исследований
впервые
установлена
Пуумала и Добрава/Белград,
к размножению
в перевиваемых
клетках
возможность
изолированных
почки
овцы
адаптации
в культуре клеток
и почки
теленка.
2
Установлено, что штаммы вирусов Пуумала и Добрава/Белград
пассажей размножаются
Vero
Е6.
в культуре VERO
Установлены
закономерности
после 3-4 последовательных
на уровне пермиссивной
размножения
вирусов,
клеточной культуры
возбудителей
ГJШС,
в
пермиссивных клеточных культурах и определены оптимальные условия сбора вирусного урожая.
Показано, что штаммы, представляющие
Добрава/Сочи
и Добрава/Куркино
вирусы Пуумала, Хантаан, Сеул, а также генотипы
отличаются по размеру и форме фокусов, образуемых в
культурах Vero и Vero Е6, что позволяет рассматривать
фенотипический
эти различия как отличительный
признак.
Четвертая глава посвящена изоляции штаммов от природных носителей в трех видах
культур клеток. На большом объеме исследований показана низкая эффективность изоляции
хантавирусов: из 65 биоматериалов удалось изолировать 3 штамма и только в культуре Vero
Е6. По результатам иммунологического
типирования определена их видовая принадлежность
к вирусам ДОБ/Куркино и ДОБ/Сочи. Два штамма были депонированы в Государственную
коллекцию вирусов.
В пятой главе представлены
морфологические
характеристики
вируса Пуумала в
культуре Vero Е6, а также дается описание культуры клеток на разных сроках инфекции.
Автором
впервые
показано,
что
морфология
вирионов
хантавируса
Пуумала,
адаптированного
к размножению в клеточных культурах, существенно отличается от ранее
представленных
характеристик
адаптированного
значимость
этого вируса. Уточнен размер вирионов вируса Пуумала,
к размножению
для
в клеточных
усовершенствования
культурах,
методов
что
имеет
концентрирования
практическую
и
очистки
вируссодержащих препаратов.
В
обсуждении
представлен
развернутый
анализ
полученных
диссертантом
результатов. Выводы логично вытекают из представленных в диссертации результатов.
Основные результаты работы полностью отражены в печати. По теме диссертации
опубликованы
7 научных работ, из них 1 - в зарубежном
журнале, индексируемом
в
международных библиографических базах, 5 публикаций в российских журналах, входящих в
Перечень рецензируемых журналов, рекомендованных ВАК, а также глава в монографии.
В Государственной коллекции вирусов депонированы 2 штамма, представляющие генотипы
Добрава/Сочи и Добрава/Куркино, выделенные в культуре Vero Е6.
Принципиальных
замечаний, которые могли бы повлиять на положительную
оценку
работы, нет.
Материалы диссертационной
работы представляют значительную научно-практическую
ценность, которая определяется получением новых научных данных, касающихся биологии
3
хантавирусов,
адаптацией
возбудителей
этих вирусов
ГЛПС
и
раскрывающих
к размножению
закономерности,
в несвойственных
связанные
биологических
с
системах,
изоляции новых штаммов хантавирусов. Получены новые данные, уточняющие морфологию
вируса Пуумала. Решены практические вопросы оптимизации условий получения активного
вирусного
выбора
субстрата
методов
для цельновирионных
контроля
остаточной
инактивированных
инфекционности
вакцин против ГЛПС и
(безопасности)
вакцинного
препарата.
Таким образом, диссертация
методическому
Г.А.Малкина
и методологическому
по актуальности
избранной
уровню, новизне, достоверности
темы, высокому
и обоснованности
полученных результатов, теоретической и практической значимости отвечает требованиям п.
9 «Положения
о порядке
при суждения
предъявляемым
ВАК России к
учёных
диссертациям
степеней»
от 24.09.2013
г. N'!!842,
на соискание ученой степени кандидата
биологических наук по специальности 03.02.02 - Вирусология, а её автор Малкин Геннадий
Андреевич заслуживает при суждения искомой степени.
Доктор биологических наук
Полное
название
места
Юминова Н.В.
работы:
Федеральное
государственное
бюджетное
научное
учреждение Научно-исследовательский
институт вакцин и сывороток им.И.И.Мечникова
Должность:
по
заместитель
директора
науке
ФГБНУ
НИИ
вакцин
и
сывороток
ИМ.И.И.Мечникова.
Почтовый адрес: 105064, г.Москва, Малый Казённый пер., д.5а.
Тел.: 8 (910) 422-97-06
Электронная почта: [email protected]
Ученый секретарь ФГБНУ НИИ
вакцин и сывороток им. И.И. Ме
К.б.Н.
Андронова Н.И.
4